CN117946271A

CN117946271A - 抗ror1抗体及其用途

Info

Publication number: CN117946271A
Application number: CN202311817842.1A
Authority: CN
Inventors: 周祥山; 张苗; 曹峰崎; 王卓越; 周加滔; 张婵; 张建军; 王禧妍; 张慧; 尹彩霞
Original assignee: China Resources Biomedical Co ltd
Current assignee: China Resources Biomedical Co ltd
Priority date: 2023-12-26
Filing date: 2023-12-26
Publication date: 2024-04-30

Abstract

本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合ROR1。本发明的抗体同参比品相比有更高的亲和力，更优的内吞活性，未来有组成抗体偶联药物的潜力。

Description

抗ROR1抗体及其用途

对序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表，其并入本文以作参考。

技术领域

本公开涉及抗体领域，更具体而言涉及一种ROR1抗体。

背景技术

受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)是作用于细胞因子、生长因子、激素和其他信号分子受体的一种多基团跨膜蛋白，在多种细胞过程中起重要作用，包括生长、分化、血管生成以及多种癌症的发展进程。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptortyrosine ki nase-like orphan receptor 1,ROR1)是受体RTKs家族成员之一，其与生长因子受体的酪氨酸激酶结构域具有很高的同源性，低表达于胚胎发育过程中，而高表达于多种实体和血液恶性肿瘤中，包括各类白血病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌等。

ROR1含有2类亚型：完整的细胞膜受体型以及截短型变异体。截断型变异体主要分为无胞外结构的膜结合型ROR1与只含胞外结构的可溶型ROR1。可溶型ROR1的表达在正常人与肿瘤患者中并无差异，血清中的表达量很低或者检测不到，且与疾病的进展和严重程度无关，完整结构的膜结合型ROR1在多种肿瘤组织特异性高水平表达。研究表明，ROR1在正常成人组织的关键组织器官，如：心脏、肝脏、大脑、肺等中并不表达，但在甲状腺和消化道组织如食管、胃等组织有一定量的表达。56％的TNBC、38％的肺腺癌和50％的卵巢癌具有高水平的膜ROR1。

因此，ROR1是一种具有广谱抗癌潜力的新药靶点。近几年，靶向ROR1的基因工程抗体都已经被陆续的开发用于肿瘤免疫治疗的研究中，包括单链片段可变抗体(single-chain fragment variables,scFvs)、嵌合抗体(chime ricantibody)、Fab类抗体、抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate,ADC)、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)和双特异性抗体(bispecific antibody,BiAb)等。目前，研究进展较快的抗ROR1单抗为Oncternal Therapeutics公司的cirmtuzumab,其临床数据具有良好的抗癌效果，可以较好的抑制慢性白血病肿瘤细胞的增殖抑制、迁移和存活。

发明内容

针对上述诸问题，本公开提供了ROR1抗体、其制备方法、组合物等。本公开提供的益处广泛地适用于抗体治疗和诊断领域，并且能够与各种靶标反应的抗体联合使用。

本发明公开了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合ROR1，且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，

所述重链可变区包含：

(i)HCDR1，其中包含与SEQ ID NO：1、7、13和19之一具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或SEQ ID NO：1、7、13和19组成；

(ii)HCDR2，其中包含与SEQ ID NO：2、8、14和20之一具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：2、8、14和20组成；和

(iii)HCDR3，其中包含与SEQ ID NO：3、9、15和21之一具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：3、9、15和21组成；

所述轻链可变区包含：

(i)LCDR1，其中包含与SEQ ID NO：4、10、16和22之一具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：4、10、16和22组成；

(ii)LCDR2，其中包含与SEQ ID NO：5、11、17和23之一具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：5、11、17和23组成；和

(iii)LCDR3，其中包含与SEQ ID NO：6、12、18和24之一具有至少80％、至少85％、至少95％、或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：6、12、18和24组成。

本发明的一些实施方式中，所述的抗体或片段，其中包括以下组合：

(i)SEQ ID NO：1所示的HCDR1，SEQ ID NO：2所示的HCDR2，和SEQ ID NO：3所示的HCDR3，SEQ ID NO：4所示的LCDR1，SEQ ID NO：5所示的LCDR2，和SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或

(ii)SEQ ID NO：7所示的HCDR1，SEQ ID NO：8所示的HCDR2，和SEQ ID NO：9所示的HCDR3，SEQ ID NO：10所示的LCDR1，SEQ ID NO：11所示的LCDR2，和SEQ ID NO：12所示的LCDR3；或

(iii)SEQ ID NO：13所示的HCDR1，SEQ ID NO：14所示的HCDR2，和SEQ ID NO：15所示的HCDR3，SEQ ID NO：16所示的LCDR1，SEQ ID NO：17所示的LCDR2，和SEQ ID NO：18所示的LCDR3；或

(iv)SEQ ID NO：19所示的HCDR1，SEQ ID NO：20所示的HCDR2，和SEQ ID NO：21所示的HCDR3，SEQ ID NO：22所示的LCDR1，SEQ ID NO：23所示的LCDR2，和SEQ ID NO：24所示的LCDR3。

本发明的一些实施方式中，所述的抗体或片段，其中所述重链可变区包含与SEQID NO：25、27、29和31之一具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或者由SEQ ID NO：25、27、29和31之一组成；

其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：26、28、30和32之一具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或者由SEQ ID NO：26、28、30和32之一组成。

本发明的一些实施方式中，所述的抗体或片段，其中包括以下组合之一：

(i)重链可变区，其中包含与SEQ ID NO：25具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：25组成；

轻链可变区，其中包含与SEQ ID NO：26具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：26组成；

(ii)重链可变区，其中包含与SEQ ID NO：27具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：27组成；

轻链可变区，其中包含与SEQ ID NO：28具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：28组成；

(iii)重链可变区，其中包含与SEQ ID NO：29具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：29组成；

轻链可变区，其中包含与SEQ ID NO：30具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：30组成；

(iv)重链可变区，其中包含与SEQ ID NO：31具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：31组成；

轻链可变区，其中包含与SEQ ID NO：32具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或由SEQ ID NO：32组成。

本发明的一些实施方式中，所述的抗体或片段，其中还包括重链恒定区和轻链恒定区，其中，所述抗体重链恒定区选自IgG系列抗体，轻链恒定区选自κ或λ链，其中优选人IgG1和人κ链。

本发明的一些实施方式中，所述的抗体或片段，其中还包含重链恒定区和轻链恒定区，该重链恒定区包含与SEQ ID NO：33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，或由SEQ ID NO：33组成；该轻链恒定区包含与SEQ ID NO：34具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，或由SEQ ID NO：34组成。

本发明的一些实施方式中，所述的抗体或片段，其中所述抗体选自以下组：全抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体；

所述片段选自以下组：Fab片段、Fab’片段、F(ab)₂片段、Fv片段和ScFv。

另一方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其中包含编码所述的抗体或片段的核酸序列。

另一方面，本发明还提供了一种载体，其中包含所述的核酸分子。

另一方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其中包含所述的核酸分子或者所述的载体。

另一方面，本发明还提供了一种缀合物，其中包含与至少一个可检测的标记物偶联的所述的抗体或片段。

另一方面，本发明还提供了一种包含抗体的抗体药物缀合物，其中包括一个或多个药物部分，所述药物部分直接或经由接头共价连接至所述的抗体或片段。

另一方面，本发明还提供了一种多特异性分子，其中包含所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述多特异性分子特异性结合ROR1，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标；进一步优选地，所述多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物或试剂盒，其中包含所述的抗体或片段、或所述的核酸分子、或所述的载体、或所述的宿主细胞、或所述的缀合物、或所述的抗体药物缀合物、或所述的多特异性分子，以及药学上可接受的载体。

另一方面，本发明还提供了所述的抗体或片段、或所述的核酸分子、或所述的载体、或所述的宿主细胞、或所述的缀合物、或所述的抗体药物缀合物、或所述的多特异性分子、或所述的药物组合物或试剂盒在制备用于诊断、检测或监测与ROR1表达相关疾病的试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还提供了所述的抗体或片段、或的核酸分子、或所述的载体、或所述的宿主细胞、或所述的缀合物、或所述的抗体药物缀合物、或所述的多特异性分子、或所述的药物组合物或试剂盒在制备用于治疗与ROR1表达相关疾病或确定其预后的药物中的用途。

另一方面，本发明还提供了所述的用途，其中所述与ROR1表达相关疾病是癌症，所述癌症选自下组：白血病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌。

ROR1抗体的开发在全球范围内尚处在临床早期阶段，现暂无靶向ROR1抗体药物上市。临床早期结果显示其安全性良好、疗效显著，靶点可单药响应也可与其他多种治疗手段联用以增强肿瘤治疗疗效。因此，发展具有更高的特异性、更低的毒副作用、更优的临床药效、更方便给药方式的的抗靶向ROR1抗体是迫切而必要的，这将给患者提供更多的用药选择。本发明的单克隆抗体同参比品相比有更高的亲和力，更优的内吞活性，未来有组成抗体偶联药物的潜力。

附图说明

附图用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本公开的实施例一起用于解释本公开，并不构成对本公开的限制。

图1是ELISA检测抗人ROR1鼠抗与人ROR1蛋白的结合曲线，其中横坐标Log does是抗体摩尔浓度，单位是nM，纵坐标是酶标仪在OD450nm时的读取值；

图2是FACS检测抗人ROR1鼠抗与293F-hROR1细胞的结合曲线，其中横坐标Logdoes是抗体摩尔浓度，单位是nM，纵坐标MFI是平均荧光强度；

图3是FACS检测抗人ROR1嵌合抗体与293F-hROR1细胞的结合曲线，其中横坐标Logdoes是抗体摩尔浓度，单位是nM，纵坐标MFI是平均荧光强度；

图4是FACS检测抗人ROR1嵌合抗体内吞活性曲线。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的举例说明性实施方案，而不是全部的实施例。因此，本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题并不被解释为限制所描述的主题。

除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有值。

定义

为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

术语“抗体”或“Ab”通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。抗体的轻链可以分为κ或λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α或ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区，简称FR)间隔开的高变区(称为互补决定区，简称CDR)。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。VH上的CDR为HCDR1、HCDR2、HCDR3；VL上的CDR为LCDR1、LCDR2、LCDR3。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点/部分。氨基酸在各种区域或结构域中的分布遵循Kabat、IMGT或Chothia等常见系统中的编号定义，在本公开的具体实施例中，CDR序列的确定使用的是Kabat系统中的编号定义。

本公开中抗体也包括抗原结合部分(与术语“抗原结合片段”可互换使用)。抗原结合部分是指包含完整抗体的片段的多肽，其保留了与全长或者完整抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。在一些条件下，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如scFv)，嵌合抗体，双抗体和包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的至少一部分抗体。抗体的抗原结合部分可通过本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学切割方法)从给定抗体获得，并且可以与完整抗体相同的方式筛选特异性。

术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。

术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单分子组成的抗体分子/制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。本发明的抗体可源自不同的物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。

术语“表位”是指分子中的抗原决定簇，是指分子中被免疫系统识别(例如被抗体识别)的部分，例如被免疫系统识别的抗原上不连续的三维位点。在本发明中，所示表位例如为ROR1蛋白。

如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一物种的抗体，例如其中可变区序列源自小鼠抗体和恒定区序列来源于人抗体的抗体。

术语“人源化抗体”旨在指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列/抗原结合部分或位点已被移植到人框架序列上的抗体。此外，还可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。

术语“KD值”是抗体与其抗原之间的平衡解离常数，即koff/kon或kd/ka(通过SPR技术测定)比值。因此KD值越低(浓度越低)，抗体的亲和力越高。因此“KD值”可以用于衡量抗体与其抗原之间的结合亲和力。两分子间的的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。指特定抗体-抗原相互作用的“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出，可用任何有效的方法测量KD、Ka和Kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或KinExa来测量解离常数。

术语“ROR1”和“ROR1抗原”在本文中可互换使用，包括由细胞天然表达的或者在用ROR1基因转染的细胞上表达的人ROR1的任何变体、同等型和物种同系物。一些实施方式中，本公开的抗体对ROR1抗原的结合通过灭活ROR1而介导对表达ROR1的细胞(例如，肿瘤细胞)的杀伤。可通过下列一项或多项机制而发生对表达ROR1的细胞的杀伤：细胞死亡/凋亡诱导、ADCC和CDC。

术语“抗ROR1抗体”或“ROR1抗体”是指如本文所定义的能够与ROR1抗原结合或与表达ROR1的细胞结合的抗体。

术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。

术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然环境发生变化，或者物质与天然环境分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从该天然状态分离的高纯度的相同多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。例如，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。对于表达抗体的载体，可以使用其中抗体重链和轻链存在于不同的载体中的载体类型或者其中重链和轻链存在于同一载体中的载体类型。

术语“宿主细胞”是指可被工程化以产生目标蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养细胞，例如来源于啮齿类动物(大鼠、小鼠、豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；或人体组织或杂交瘤细胞、酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。该术语不仅涵盖特定的受试细胞，而且还涵盖这种细胞的后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在后续世代中发生，这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。

术语“同一性”指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子(或蛋白质分子)或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的间隙(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York:Oxford University Press；BiocomputingInformatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:AcademicPress；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence AnalysisinMolecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo etal,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。

术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中免疫应答的产生取决于三个因素：抗原的性质、宿主的反应性和免疫手段。

术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等人，1973,Virology52:456；Sambrook等人，2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,同上；Davis等人，1986,Basic Methodsin Molecular Biology,Elsevier；Chu et al,1981,Gene13:197。

术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”可以互换使用。当提及术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”时，它们也包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。

术语“免疫效应功能”包括免疫系统的组分所介导的任何功能，其导致抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发生，也包括抑制肿瘤的播散和转移。优选地，免疫效应功能导致杀伤肿瘤细胞。术语“癌症”是指引发医学病症的任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤如白血病。例如，与ROR1表达相关或其表达不正常所引起癌症，包括但不限于：各类白血病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌。

术语“药学上可接受的”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。

术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19^th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂、表面活性剂、佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至生物体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。

抗ROR1抗体

在一些方面，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段。

在本申请的上下文中，“抗体”可以包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化和灵长类动物化抗体、CDR移植抗体、人抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、双功能抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗独特型抗体、合成抗体、包括其突变蛋白及变体、改进的抗体；及其衍生物(包括Fc融合蛋白和其他修饰)，以及任何其他免疫反应性分子，只要其表现出与ROR1蛋白的优先缔合或结合。此外，除非上下文另外规定，否则该术语还包括所有类别的抗体(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和所有亚类(即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。在一个优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。在更优选的实施方案中，抗体是嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体或改进的嵌合单克隆抗体。

抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如Kabat)编号系统或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。

无论抗体如何产生，测试抗体与抗原(例如ROR1)结合的能力的方法在本领域中是已知的，并且包括任何抗体-抗原结合测定，例如放射免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀、SPR和竞争性抑制测定(参见例如Janeway等人、下文和美国专利申请公开号2002/0197266以及有关竞争测定的以上章节)。

根据本发明，在标准测定(例如本发明中描述的测定)中，如果抗体与预先确定靶标(例如ROR1蛋白或表达ROR1的细胞)有显著的亲和力，则所述抗体能够与所述预先确定的靶标结合，为了测试单克隆抗体与表达ROR1的活细胞的结合，可使用流式细胞术(FCM)。优选地，在流式细胞荧光分选技术(FACS)分析中，测定所述抗体与在细胞表面表达的靶标结合，如果抗体可检测地与所述靶标(ROR1蛋白或表达ROR1的细胞)结合，则所述抗体能够与所述靶标结合，具有“亲和力”。

本发明所述的ROR1特异性，是指能够与一个或更多个ROR1表位尤其是天然构象的ROR1表位相结合，特别是人ROR1特异性。

在本领域中，采用各种手段进行不改变抗体所期望的性质改造是多样化的，例如本公开中采用的将抗体的轻链和重链重新组合的方式、进行氨基酸的替换等。例如，可以将本发明中的序列，包括嵌合抗体序列或人源化抗体序列，进行保守氨基酸替换。

抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，在各抗体之间，CDR的氨基酸序列比其他的序列更多样。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此有可能通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包含来自所述特定天然存在抗体的CDR序列，其移植到来自具有不同特性之不同抗体的框架序列上(参见，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature321:522-525；和Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033)。这样的框架序列可获自包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库。这些种系是序列不同于成熟的抗体基因序列，因为它们不包含完整组装的可变基因，其是在B细胞成熟期间通过V(D)J连接而形成的。种系基因序列还将在均匀穿过可变区的个别处具有不同于高亲和力第二抗体库(secondary repertoireantibody)的序列。

小鼠抗体在人中具有高免疫原性，当重复应用时导致治疗效力降低，通过重链恒定区介导主要的免疫原性。如果对各个抗体进行嵌合或人源化，则小鼠抗体在人中的免疫原性可被降低或完全避免。

嵌合抗体是指不同部分来自不同动物物种的抗体，例如，具有来自小鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。将小鼠抗体重链和轻链的可变区与人重链和轻链的恒定区连接在一起从而获得抗体的嵌合(例如，如Kraus等，in Methods inMolecularBiology series，Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8所述)。在一个优选实施方案中，通过连接人κ轻链恒定区至小鼠轻链可变区产生嵌合抗体。在另一优选实施方案中，可通过连接人λ轻链恒定区至小鼠轻链可变区产生嵌合抗体。

而人源化抗体是指将其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列/抗原结合部分或位点移植到人框架序列上的抗体。

抗体的制备或产生

可通过多种技术产生本发明的抗体，所述技术包括常规的单克隆抗体法，例如Kohler and Milstein，Nature256：495(1975)的标准体细胞杂交技术，并且可采用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如病毒或癌基因转化B淋巴细胞或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术、体细胞杂交法，又例如通过基因工程重组技术来获得。如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子，将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，然后，在特定条件下培养转染宿主细胞，并表达本发明的抗体。

用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的其他优选动物系统是大鼠和兔系统(例如描述于Spieker-Poletetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9348(1995)，还参见Rossietal..Am.J.Clin.Pathol.124：295(2005))。小鼠中的杂交瘤生产是非常完善的方法。分离用于融合的经免疫脾细胞的免疫方案和技术是现有技术中已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。

单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术来制备，包括杂交瘤技术，重组技术，噬菌体展示技术，转基因动物或其一些组合。例如，可以使用杂交瘤和本领域公认的生物化学和遗传工程技术来生产单克隆抗体，如详细描述于An,Zhiqiang(ed.)TherapeuticMonoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,JohnWiley and Sons,1st ed.2009；Shire et.al.(eds.)Current Trends in MonoclonalAntibody Development andManufacturing,Springer Science+Business Media LLC,1sted.2010；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nded.1988；Hammerling,等人,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中，每篇文献在此全部引入作为参考。

应该理解，可以进一步改变选定的结合序列，例如以提高对靶的亲和力、使靶结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产生、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的抗体。

在一些实施方案中，生产本公开所述的抗体或片段的方法包括以下步骤：

(i)在宿主细胞中表达所述的抗体或片段；和可选地

(ii)从所述宿主细胞分离抗体或其抗原结合片段。

在一个优选的实施方案中，通过使用杂交瘤来制备抗ROR1单克隆抗体。

为了获得产生本发明抗体例如本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞并将其融合至合适的永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。就抗原特异性抗体的产生筛选产生的杂交瘤。杂交瘤的产生在本领域中是众所周知的。参见例如Harlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Publications,New York。

本发明的抗体还可以在宿主细胞转染瘤中使用例如本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)来产生。在一些实施方案中，将通过标准分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，使得所述基因可操作地连接于转录和翻译调节序列。在此上下文下，术语“可操作地连接”意在表示将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能。

可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入相同或不同的表达载体中。在一些实施方案中，可变区用于通过将其插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中来产生任何抗体同种型的全长抗体基因，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段和VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。另外或可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。可以在原核或真核宿主细胞例如哺乳动物宿主细胞(其可以装配和分泌适当折叠和免疫活性的抗体)中表达本发明的抗体。

用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括与DHFR选择标记(例如，如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.MoI.Biol.159:601-621中所述的)一起使用的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr CHO细胞)，NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。特别地，为了与NSO骨髓瘤一起使用，另一种表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达的时间段或将抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中来产生抗体。使用标准蛋白质纯化方法可从培养基中回收抗体。

在另一个优选的实施方案中，可使用带有部分人免疫系统(而非小鼠系统)的转基因或转染色体小鼠来生成抗ROR1的人单克隆抗体。

用于生成单克隆抗体的另一个策略是从所定义策略的产生抗体的淋巴细胞中直接分离编码抗体的基因，例如参见Babcocketal.，1996；Anovel strategy for generatingmonoclonal antibodies from single,isolated lymphocytes producing antibodiesof defined strategy。对于重组抗体工程的细节还参见Welschof and Krau,Recombinantantibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8and Benny K.C.Lo AntibodyEngineering ISBN 1-58829-092-1。

为了制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利US4,816,567)。通过将编码VH的核酸可操作地连接至编码重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的另一DNA分子，可将编码VH区的分离的核酸转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat等(1991),Sequences Of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但更优选是IgG1或IgG4恒定区。通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可将编码VL区的分离的核酸转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat等，同上)，并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质的另一DNA片段例如抗体恒定区或柔性接头可操作地连接。在本文中使用的术语“可操作地连接”旨在表示两个DNA片段连接成使得两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。

为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利US5,225,539；Queen等人的美国专利US5,530,101；US5,585,089；US5,693,762；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in Antibody Engineering:Methods andProtocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。或者，还可以利用转基因动物，其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库。例如，已有报道在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失可以完全抑制了内源性抗体产生，然后将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变小鼠中将导致该小鼠在遇到抗原刺激时产生人抗体(参见例如，Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551；Jakobovits等，1993，Nature362：255-258；Bruggermann等，1993，Year inImmunology 7：33；和Duchosal等，1992，Nature 355：258)。上述转基因动物的非限制性实例包括，HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)，其含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)；或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“KM小鼠TM”(参见专利申请WO02/43478)。其他抗体人源化改造的方法还包括噬菌体展示技术(Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.227：381；Marks等，J.Mol.Biol.1991，222：581-597；Vaughan等，1996，Nature Biotech 14：309)。

编码本发明抗体的核酸分子

在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本公开的上述分离的抗体或其片段的核酸序列。

本发明的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤表达的抗体(例如，如下文进一步描述的由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，编码这种抗体的核酸可以从基因文库中回收。

为了制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。通过将编码VH的核酸可操作地连接至编码重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的另一DNA分子，可将编码VH区的分离的核酸转化为全长重链基因，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可将编码VL区的分离的核酸转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质的另一DNA片段例如抗体恒定区或柔性接头可操作地连接。

缀合物

一方面，本公开提供了一种缀合物，其包含与至少一个可检测的标记物偶联的如前所述的抗体或其片段。可检测的标记物包括但不限于：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以修饰所述第一或第二标记物所提供的可检测信号，例如FRET(荧光共振能力转移，Fluorescence Resonance Energy Transfer)；(iii)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响迁移率(例如，电泳迁移率)，或者(iv)提供捕获部分，例如亲和力、抗体/抗原或离子络合。

适合作为标记物的结构例如荧光标记物、发光标记物、发色团标记物、放射性同位素标记物、同位素标记物，优选稳定的同位素标记物、同量异位素标记物(isobariclabel)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等)、颗粒标记物(尤其是金属颗粒标记物、磁性颗粒标记物、聚合物颗粒标记物)、有机小分子(例如，生物素、受体的配体或结合分子(例如，细胞黏附蛋白或卵磷脂)、可通过使用结合剂检测包含核酸和/或氨基酸残基的标记物序列等。标记物非限制性地包括硫酸钡、碘西他酸、碘番酸、胺碘苯丙酸钙、泛影酸钠、泛影葡胺、甲泛葡胺、酪泮酸钠和放射诊断剂(包括正电子发射体，(例如氟-18和碳-11)、γ发射体(例如，碘-123、碘125、锝-99m、碘-131和铟-111)、核磁共振核素(例如，氟和钆))、发光物质(例如异鲁米诺和吖啶酯)、荧光物质(例如荧光素和罗丹明)、有色物质(例如乳胶颗粒和胶体金)。

如上所述的可检测的标记可通过本领域已知的方法检测。例如，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。

抗体药物缀合物/免疫缀合物

一方面，本公开提供了一种包含抗体的抗体药物缀合物，其包括一个或多个药物部分/治疗剂，所述药物部分直接或经由接头连接(例如共价连接)至如前所述的抗体或其片段。在本申请的抗体-药物缀合物中，将抗ROR1抗体与药物缀合的接头结构没有特别限制，只要可以使用所得抗体-药物缀合物即可。

由于抗体-药物缀合物具有选择性递送一种或多种药物至靶组织(例如与肿瘤相关的抗原，如表达ROR1的肿瘤)的能力，因此，抗体-药物缀合物可以提高本发明的抗体或其抗原结合片段在治疗疾病(例如癌症)中的治疗效力。

多特异性分子

本发明的抗体或其抗原结合片段可用于形成多特异性分子(例如双特异性分子)。本发明的抗体或其抗原结合片段可以是多特异性分子(例如双特异性分子)的一部分，所述双特异性或多特异性分子包含具有不同于本发明的抗体或其抗原结合片段的结合特异性的第二功能模块(例如第二抗体)或第三功能模块(例如第三抗体)，从而能够结合至少两个不同的结合位点和/或靶分子。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可连接至能够特异性结合可用作联合治疗的潜在靶标的任何蛋白质的第二抗体或其抗原结合片段。为产生所述双特异性或多特异性分子，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。

因此，在一些方面，本发明提供了一种多特异性分子，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段。

在某些优选的实施方案中，所述多特异性分子特异性结合ROR1(例如人ROR1或猴ROR1)，并且特异性结合一个或多个其他靶标。

在某些优选的实施方案中，所述多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子(例如第二抗体)。

在某些优选的实施方案中，所述多特异性分子为双特异性抗体。

药物组合物

在一些方面，本发明涉及药物组合物，本公开提供了一种药物组合物或试剂盒，其包含如前所述的抗体或片段、如前所述的核酸分子、如前所述的载体、如前所述的宿主细胞、如前所述的缀合物、如前所述的抗体药物缀合物、如前所述的多特异性分子；以及药学上可接受的载体。

药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗ROR1抗体增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。

合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸，EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，巯基甘油，巯基乙酸，巯基山梨糖醇，丁基甲基苯甲醚，丁基化羟基甲苯和/或丙基砷酸盐。如本发明所公开的，在包含还原抗体或其抗原结合片段的一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的含有本发明公开的组合物的抗体或其抗原结合片段的溶剂中，其可被氧化。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合，从而抗体或其抗原结合片段可以被防止氧化，以延长其保质期和/或增加活性。

为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如含水媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液，或右旋糖和乳酸林格注射液、非含水媒介物例如植物来源的不挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油、抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂、等渗剂例如氯化钠或葡萄糖、缓冲剂例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂、抗氧化剂例如硫酸氢钠、局部麻醉剂例如盐酸普鲁卡因、悬浮剂和分散剂例如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮、乳化剂例如聚山梨酯80(TWEEN-80)、隔离试剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。可将用作载体的抗微生物剂添加到包含酚类或甲酚类、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。

施用、制剂和剂量

本发明的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服，静脉内，动脉内，皮下，肠胃外，鼻内，肌内，颅内，心内，心室内，气管内，口腔，直肠，腹膜内，皮内，局部，经皮和鞘内，或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，灌肠剂，注射剂，吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。

用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂(包括包衣片剂)，酏剂，混悬剂，糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。

适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液，混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水，醇，多元醇，甘油，植物油等。适用于此类制剂的等渗载体的实例包括氯化钠注射液，林格溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(包括剂量，时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期，清除率等)的经验考虑。

对于注射制剂/组合物的有效药物载剂的要求是本领域普通技术人员众所周知的(参见例如，Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers编辑，第238-250页(1982)，以及ASHP Handbook onInjectable Drugs，Toissel，第4版，第622-630页(1986))。

施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。

本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用，施用时间，化合物清除速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病症的严重程度，以及物种，患者的性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。

通常，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以各种范围施用。

在某些优选的实施方案中，涉及本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物产品。更具体地说，本发明的抗体或其抗原结合片段可以每天，每两天，每四天，每周，每十天，每两周，每三周，每月，每六周，每两个月，每十周或每三个月施用。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。

用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度为约5μg/mL至约100mg/mL的如本文所公开的抗体或其抗原结合片段。

本发明的抗体可与一种或其他更多种的治疗剂(例如，细胞毒剂、放射毒剂、抗肿瘤剂、抗血管发生剂或和免疫抑制剂)共施用本发明的抗ROR1抗体以降低对抗本发明抗体的免疫应答的诱导。所述抗体可与所述治疗剂(作为免疫复合物)相连接或者可与所述治疗剂分别施用。

在施用治疗的上下文中，如本文所用的术语“组合”或“共施用”指使用一种以上的治疗或治疗剂。术语“组合”的使用并不限制向对象施用的治疗或治疗剂的顺序。可以在向患者施用第二治疗或治疗剂之前、同时或之后施用治疗或治疗剂。优选地，以一定的顺序、量和/或在一定的时间间隔内向对象施用治疗或治疗剂以使得所述治疗或治疗剂可以一起发挥作用。在一个具体的实施方案中，以一定的顺序、量和/或在一定的时间间隔内向对象施用治疗或治疗剂以使得它们比如果以其他方式(特别是彼此独立地)施用提供增加的益处。优选的是，增加的益处是协同效应。

医药用途

本发明的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如ROR1的检测或免疫应答的增强。例如，可以将这些分子体外或离体施用于培养细胞，或例如体内施用于人受试者。

优选的受试者包括哺乳动物，例如人/患者。本发明上下文中的哺乳动物是人类、非人类灵长类动物、驯养动物如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等，实验室动物如小鼠、大鼠、兔、几内亚猪等以及圈养的动物，如动物园的动物。

治疗与ROR1表达相关的病症

在一些方面，本发明提供了治疗哺乳动物中的病症的方法，其包括向需要治疗的受试者(例如人)施用治疗有效量的本文所公开的抗体或其抗原结合片段。

如本文中所描述的那样，本公开的抗体具有可治疗性地应用杀伤细胞和/或抑制细胞的一种或更多种活性。尤其是可将杀伤细胞、抑制细胞的增殖和/或抑制细胞的集落形成用于治疗或预防癌症(包括癌症转移)。可应用抑制细胞的增殖、集落形成和/或转移，尤其是用于治疗或预防癌症转移和癌细胞的转移性扩散。

在一些方面，本公开提供了一种用于在受试者中治疗与ROR1表达相关的疾病或确定其预后的方法，包括向所需要的受试者中施用有效剂量的所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子、所述载体、所述宿主细胞、所述缀合物、所述抗体药物缀合物、所述多特异性分子、或所述药物组合物或试剂盒。

在一些方面，本公开提供了一种用于在受试者中治疗与ROR1表达相关的疾病或确定其预后的方法中的所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子、所述载体、所述宿主细胞、所述缀合物、所述抗体药物缀合物、所述多特异性分子、或所述药物组合物或试剂盒。

在一些方面，本公开提供了所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子、所述载体、所述宿主细胞、所述缀合物、所述抗体药物缀合物、所述多特异性分子、或所述药物组合物或试剂盒在制备用于治疗与ROR1表达相关疾病或确定其预后的试剂(或药物)中的用途。

在一个实施方案中，与ROR1表达相关的疾病包括肿瘤疾病，例如癌症。

抗体或其抗原结合片段可以作为单一疗法单独使用，或者可以与化学疗法或放射疗法组合使用。

抗体或其抗原结合片段可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。

术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于细胞毒性剂，细胞抑制剂，抗血管生成剂，放射疗法和放射治疗剂，靶向抗癌剂，BRM，治疗性抗体，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，放射疗法，抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体结合。更具体而言，在某些实施方案中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的不配对半胱氨酸以提供如本文所述的工程化偶联物。因此，这样的工程化缀合物被明确地考虑在本发明的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。

诊断

本发明提供了用于检测、诊断或监测增殖性病症的体外和体内方法以及筛选来自患者的细胞以鉴定肿瘤细胞包括致瘤细胞的方法。这样的方法包括鉴定用于治疗的患有癌症的个体或监测癌症的进展，包括将患者或从患者获得的样品(体内或体外)与本文所述的抗体接触，并检测样品中与结合的或游离的靶分子的结合的抗体的存在或不存在或结合水平。在一些实施方案中，抗体将包含如本文所述的可检测标记或已报道分子。

在一些方面，本公开提供了一种诊断、检测或监测与ROR1表达相关疾病的方法，包括向所需要的受试者中施用有效剂量的所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子、所述载体、所述宿主细胞、所述缀合物、所述抗体药物缀合物、所述多特异性分子、或所述药物组合物或试剂盒。

在一些方面，本公开提供了一种用于在受试者中诊断、检测或监测与ROR1表达相关疾病的方法中的所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子、所述载体、所述宿主细胞、所述缀合物、所述抗体药物缀合物、所述多特异性分子、或所述药物组合物或试剂盒。

再一方面，本公开提供了所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸分子、所述载体、所述宿主细胞、所述缀合物、所述抗体药物缀合物、所述多特异性分子、或所述药物组合物或试剂盒在制备用于诊断、检测或监测与ROR1表达相关的疾病的试剂(或者药物)中的用途。

可以通过多种测定法分析样品，例如放射免疫测定法，酶免疫测定法(例如ELISA)，竞争结合测定法，荧光免疫测定法，免疫印迹测定法，Western blot印迹分析和流式细胞术测定法。兼容的体内诊断或诊断测定可以包括本领域公知的成像或监测技术，例如本领域技术人员已知的磁共振成像，计算机化断层摄影(例如CAT扫描)，正电子断层扫描(例如PET扫描)，放射线照相术，超声波等。

本发明中所述的用于体外检测或监测ROR1表达或表达ROR1细胞水平的方法，同样可以用于非诊断目的。

优选的受试者包括哺乳动物，例如需要的人/患者。

受试者的样品为来自受试者的血液、排泄物(尿液或粪便)、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液、组织液、汗液或它们的提取物。

药物包装和试剂盒

还提供了包含一个或多个剂量的抗体或其抗原结合片段的一个或多个容器的药物包装和试剂盒。在某些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体或其抗原结合片段，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在其他实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。或者，在某些实施方案中，缀合物组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的缀合物组合物用于治疗选择的肿瘤疾病状况。

这样的试剂盒通常在合适的容器中包含工程化偶联物的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂或者其他药剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。

更具体地说，试剂盒可以具有含有本公开的抗体或其抗原结合片段的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。在提供用于缀合的组合治疗剂的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。或者，试剂盒的缀合物和任何任选的抗癌剂可以在施用于患者之前分开保存在不同的容器中。试剂盒还可以包含用于容纳无菌药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想溶剂也可以提供于另一个容器中。

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。另外，下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1人ROR1抗体的免疫及筛选

选择Balb/c和SJL小鼠(睿智化学提供)进行免疫。采用打破免疫耐受的方式，具体策略为首次免疫前腹腔注射抗鼠CD25抗体(BioXCell,clone PC-61.5.3,每只小鼠100微克/100微升)，用于去除CD4+Foxp3+的Treg细胞。初次免疫后第7天腹腔注射抗鼠CD40抗体(BioXCell,clone FGK45,每只小鼠100微克/100微升)激活CD40能够达的抗原递呈细胞。之后每隔3周进行抗原的加强免疫，共免疫两次。每次免疫程序后通过针对重组人ROR1 ECD-His蛋白(睿智化学提供)ELISA和重组过表达人ROR1细胞系(睿智化学提供)FACS来测定血清效价，直到血清效价能够满足要求。通过动物免疫中血清效价测定，选择效价最好的前2只动物进行加强免疫。

通过上述方法选择目标动物，收集脾脏进行下一步杂交瘤的融合及筛选。

实施例2杂交瘤抗体的筛选

选取两只小鼠进行细胞融合和杂交瘤制备。处死小鼠后收集脾细胞或淋巴细胞。用DMEM(来自Gibco)基础培养基1000转每分钟离心清洗细胞3次，然后将收集的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(睿智化学提供)混合，采用高效电融合进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含30％胎牛血清的1×HT DMEM培养基中，然后按微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％ CO₂、37℃培养箱中。第二天补充每孔100ul 2×HAT(来自Gibco)的DMEM培养基。

10-14天后这些培养于96孔板的细胞可用重组人ROR1 ECD-His蛋白ELISA进行初筛。在初筛中最多100个阳性克隆将被扩大培养至24孔板，进一步进行复筛。复筛得到的61个杂交瘤细胞进行下一步的表达制备，与重组人ROR1 ECD-His蛋白ELISA结果如表1。

表1

/>

实施例3鼠源抗体的生产

所选杂交瘤细胞株被进一步扩大到200毫升的培养瓶中进行生产，收集上清后用蛋白A亲层析柱按进行纯化。通过A280检测抗体浓度，通过还原性或非还原性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)检测抗体的纯度。通过前述方法获得的4种鼠源人ROR1抗体，被命名为mAb002，mAb025，mAb034和mAb056。获得的几个抗体以及它的生物特性将在以下实施例中更为详细地叙述。

实施例4ELISA检测鼠源抗体和重组蛋白的结合

利用PBS(自制)稀释人ROR1蛋白(睿智化学提供)至1μg/ml,以100μl/孔加入96孔板，4℃过夜孵育。用PBST(自制)洗板3次，并添加300μl封闭液(含1％BSA,pH7.4的PBS磷酸缓冲液，所述百分比为质量百分比)37℃封闭2小时。加入梯度稀释的mAb002，mAb025，mAb034和mAb056抗体，起始浓度为10ug/ml(66.67nM),10倍稀释，8个浓度点(包括0点),100μl/孔，37℃温育1小时。用PBST洗板3次，加入Peroxidase AffiniPure Goat Anti-MouseIgG(H+L)二抗(Jackson,115-035-166)(1:5000稀释),100μl/孔，37℃孵育1小时。用PBST洗板3次，加入100μl/孔TMB显色液，37℃孵育10分钟后，加入50μl 1N盐酸终止显色反应。96孔板置于ELISA读板机读取OD450nm值，并用GraphPad Prism6拟合曲线，计算EC50值。结果如图1所示。

实施例5：FACS检测鼠源抗体和细胞的结合

培养并处理293F-hROR1稳转细胞系(睿智化学提供)和293F-Blank细胞(睿智化学提供)。将消化收获的细胞在室温下300g离心5分钟，弃去上清后，用FACS buffer(PBS+2％FBS)洗涤2次。在96孔圆底板(Corning,货号3799)中放入1-2E5/孔的细胞，离心丢弃上清后，加入梯度稀释的mAb002，mAb025，mAb034和mAb056抗体，起始浓度为200nM,5倍稀释，8个浓度点(包括0点),100μl/孔，混匀后，在4℃中孵育1小时。4℃,300g离心5分钟，丢弃上清溶液，使用FACS buffer清洗细胞2次，加入Goat anti-Mouse IgG Fc,PE(Invitrogen,31861)二抗溶液，100μl/孔，在4℃中孵育1小时。4℃,300g离心5分钟，丢弃上清溶液，使用FACSbuffer清洗细胞2次。最后使用FACS buffer重悬细胞，在BD流式细胞仪上检测信号值，并用GraphPad Prism6拟合曲线，计算EC50值。结果如图2所示。

实施例6：人ROR1轻重链表达质粒的构建及嵌合抗体制备

上述所选鼠源抗体mAb002，mAb025，mAb034和mAb056(分别含轻、重链可变区DNA产物)分别克隆至含人IgG1重链恒定区的载体和含人K轻链恒定区的载体上，然后制备质粒后转染Expi CHO-S细胞，培养7～10天后收取培养上清，通过Protein A亲和层析纯化获得嵌合抗体，并通过超滤置换至1xPBS。通过前述方法获得的4种嵌合人ROR1抗体，被命名为cAb002，cAb025，cAb034和cAb056。几个嵌合抗体以及它的生物特性将在以下实施例中更为详细地叙述。

实施例7：抗ROR1嵌合抗体与ROR1蛋白结合亲和力测定

通过Biocore 8K测定嵌合抗体cAb002，cAb025，cAb034和cAb056与ROR1蛋白结合亲和力。嵌合抗体cAb002，cAb025，cAb034和cAb056稀释至1μg/ml，利用Protein A芯片捕获30s；结合hROR1抗原(睿智化学提供)(100、50、25、12.5、6.25、3.125、0nM)，结合90s，解离120s；Glycine pH1.5再生30s。使用Biocore 8K数据分析软件选择1：1模型拟合数据，计算抗原结合亲和力。结果如表2所示。实验结果表明，抗人ROR1人鼠嵌合抗体cAb002、cAb025、cAb034和cAb056均优于参比抗体Zilovertamab。

表2

实施例8：FACS检测抗体和细胞的结合

培养并处理293F-hROR1稳转细胞系和293F-Blank细胞。将消化收获的细胞在室温下300g离心5分钟，弃去上清后，用FACS buffer(PBS+2％FBS)洗涤2次。在96孔圆底板(Corning,货号3799)中放入1-2E5/孔的细胞，离心丢弃上清后，加入梯度稀释的嵌合抗体cAb002，cAb025，cAb034和cAb056，起始浓度为200nM,5倍稀释，8个浓度点(包括0点),100μl/孔，混匀后，在4℃中孵育1小时。4℃,300g离心5分钟，丢弃上清溶液，使用FACS buffer清洗细胞2次，加入Fluorescein(FITC)AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fc(Jackson,109-095-008)二抗溶液，100μl/孔，在4℃中孵育1小时。4℃,300g离心5分钟，丢弃上清溶液，使用FACS buffer清洗细胞2次。最后使用FACS buffer重悬细胞，在BD流式细胞仪上检测信号值，并用GraphPad Prism6拟合曲线，计算EC50值。结果如图3所示。

实施例9：FACS检测抗体内吞

对抗人ROR1人鼠嵌合抗体进行内吞活性评价。实验过程简述如下，使用Zenon^TMpHrodo^TM iFL Green Human IgG Labeling Reagent(Invitrogen，Cat.Z25611)标记待检测抗人ROR1人鼠嵌合抗体cAb002，cAb025，cAb034和cAb056，即将标记试剂与待标记抗体按照摩尔比3:1混匀后，室温、避光静置孵育15分钟。期间，取对数生长期的HEK293F-ROR1(睿智化学提供)稳定细胞株，用Accutase溶液(Invitrogen，Cat.00-4555-56)消化细胞后，转移至离心管中离心，吸弃上清后，用1xPBS洗涤两次，用HEK293T-ROR1细胞培养基重悬细胞至细胞密度为2x10⁶/mL。待抗人ROR1人鼠嵌合抗体标记完成后，加入HEK293T-ROR1稳定细胞株悬液，于37℃，5％CO₂、避光静置孵育0小时、2小时和4小时。孵育结束后，收集细胞，离心去上清，用1xPBS洗涤后，加入1xPBS重悬细胞，使用BD FACSLyric流式细胞仪进行样品检测，收集并分析数据，结果如图4所示。实验结果表明，抗人ROR1人鼠嵌合抗体cAb002、cAb025和cAb034在HEK293F-ROR1稳定细胞株上的内吞活性强于Zilovertamab。

通过引用并入

本文中提到的每个专利文献和科学文献的全部内容为所有目的通过引用并入本文。

等同性

本发明可以以其他特定方式体现，而不背离其精神或本质特征。因此，上述实施方式在所有情况下应该被当作是说明性的，而不是对本文描述的发明的限制。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是由上述描述指明，并打算将在权利要求书的等同性意义和范围之内的所有变化涵盖在其中。

Claims

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合ROR1，且包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，

所述重链可变区包含：

所述轻链可变区包含：

2.权利要求1所述的抗体或片段，其中包括以下组合：

3.如权利要求1或者2所述的抗体或片段，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO：25、27、29和31之一具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列或者由SEQ ID NO：25、27、29和31之一组成；

4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或片段，其中包括以下组合之一：

5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或片段，其中还包括重链恒定区和轻链恒定区，其中，所述抗体重链恒定区选自IgG系列抗体，轻链恒定区选自κ或λ链，其中优选人IgG1和人κ链。

6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或片段，其中还包含重链恒定区和轻链恒定区，该重链恒定区包含与SEQ ID NO：33具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，或由SEQ ID NO：33组成；该轻链恒定区包含与SEQ ID NO：34具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列，或由SEQ ID NO：34组成。

7.如上述任一项权利要求所述的抗体或片段，其中所述抗体选自以下组：全抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体；

8.一种分离的核酸分子，其中包含编码如权利要求1-7的任一项中所述的抗体或片段的核酸序列。

9.一种载体，其中包含如权利要求8所述的核酸分子。

10.一种多特异性分子，其中包含权利要求1-7中任一所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述多特异性分子特异性结合ROR1，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标；进一步优选地，所述多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子。