WO2021186088A1 - Nuevos bacteriófagos inhibidores biológicos de la nitrificación y utilización de los mismos - Google Patents

Nuevos bacteriófagos inhibidores biológicos de la nitrificación y utilización de los mismos Download PDF

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bacteriophage
phage
soil
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Sergio Atares Real
Joaquin Romero Lopez
Ignasi SALAET MADORRAN
Maria FERRER GINES
Tula del Carmen YANCE CHAVEZ
Carlos FUERTES DOÑATE
Marcos CABALLERO MOLADA
Pablo QUIRÓS FERNÁNDEZ
María Teresa MUNISE PÉREZ
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Fertinagro Biotech, S.L.
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Definitions

  • the present invention relates to new nitrification inhibitor bacteriophages and the use thereof.
  • the invention provides new nitrification inhibitor bacteriophages, or variants thereof, capable of inhibiting the proliferation and / or growth of nitrifying microorganisms present in the soil, responsible for the nitrification of agricultural soils, in particular capable of to inhibit the proliferation and / or growth of ammonia-oxidant bacteria (AOB), such as Nitrosomonas sp, Nitrosomonas aestuarii, Nitrosomonas communis, Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas halophila, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas nitrosa , Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas ureae, Nitrosopira sp, Nitrosopira multiformis, Nitrosopira tenuis.
  • AOB ammonia-oxidant bacteria
  • Nitrogen (N) provided through mineral and organic fertilizers has had a very beneficial impact on society, allowing a very important increase in food production (Erisman et al., (2008) “How a century of ammonia synthesis changed the world ”, Nature Geoscience1: 636-639).
  • Nitric nitrogen due to its high solubility and negative ionic nature, has a very small retention coefficient in the soil.
  • the organic matrix of the soil also negatively charged, does not have the capacity to retain this compound. Thus, it travels through the soil at a high speed, leaving a small time window to be absorbed by plants or fixed by soil microorganisms. In a short time it moves to deep areas, where it is no longer accessible to root absorption and is finally lost in underground water masses. Due to this characteristic, its use is beginning to be restricted or even prohibited in areas considered vulnerable.
  • ammonia nitrogen has a positive charge and is stable in the soil complex. Remains retained with very little leaching loss. In this way, it greatly increases its residence time and, as a consequence, the time during which it is available to plants. On the other hand, the contamination of the underground water masses is reduced due to the little loss by leaching.
  • the main point to take into account in the use of ammonium is that, in the soil, it is gradually transformed into nitric nitrogen by microorganisms with nitrifying capacity. In this regard, the nitrification process occurs in two steps, in the first step the ammonia is oxidized to nitrite and, in the second, the nitrite is oxidized to nitrate.
  • these two steps are performed by different microorganisms.
  • the vast majority of bacteria involved in the two steps are autotrophic, being able to manufacture organic molecules using the energy obtained from inorganic sources, in this case ammonia or nitrite.
  • the first group is known as ammonia-oxidant bacteria (AOB) and includes various types of bacteria that obtain their energy by generating a reducing potential from the oxidation of ammonia, using said energy to fix carbon dioxide (Bock and Wagner, 2006, "Oxidation of inorganic nitrogen compounds as an energy sourceln", Dworkin M, Falkow S (eds). The Prokaryotes Springer Verlag: New York; 457-495).
  • AOB ammonia-oxidant bacteria
  • these AOB bacteria are considered obligate autotrophic organisms, that is, they can only grow by fixing their own CO2 from the Calvin cycle.
  • Ammonia is their only source of energy, their main metabolic product is nitrite and the reaction they carry out is shown in equation (1).
  • Nitrosomonas is the most frequently identified genus associated with this step, but other genera such as Nitrosococcus and Nitrospira are capable of doing so. There are also subgenera such as Nitrosolobus and Nitrosovibrio that can autotrophically oxidize ammonia (Watson et al., 1981, "The family nitrobacteraceae, in The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria", ed. MP Starr et al. ., pp. 1005-1022, Springer, New York).
  • the second group of ammonia oxidizing microorganisms was isolated in 2005 (Kónneke et al., 2005, "Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon", Nature .; 437: 543-546). These microorganisms are not bacteria, but archaea, specifically Ammonia Oxidizing Archaeas (AOA). Like AOBs, AOAs they oxidize ammonia to nitrite, but the enzymatic pathways are quite different and the overall reaction as well, as shown in equation (2).
  • AOAs are also believed to be predominantly autotrophic, but fix C0 2 using the 3-hydroxypropionate / 4-hydroxybutyrate pathway (Walker et al., 2010, “Nitrosopumilus maritimus genome reveal unique mechanisms for nitrification and autotrophy in globally distributed marine crenaea ", Proc Nati Acad Sci USA; 107: 8818-8823).
  • the biodiversity of AOAs with the capacity to perform this function is much broader than in the case of AOBs.
  • This first step of the nitrification process (oxidation of ammonia to nitrite) is the limiting step, and therefore, the one that will determine the speed at which ammonium is transformed into nitrate, with all the problems that this entails in an agricultural environment.
  • this is not the only associated negative effect, since, in addition to the net production of nitrite, AOBs are also capable of producing nitrous oxide (N2O), a gas with 298 times more capacity to generate greenhouse effect than CO2.
  • Fertilizer technology has tried to slow down the rate of nitrification by developing fertilizers that include chemical compounds capable of inhibiting nitrification in so-called stabilized fertilizers.
  • Such compounds deactivate the enzyme responsible for the first stage of nitrification (ammonium monooxygenase, AMO), keeping the Nh in the soil for a longer time (Ruser and Schulz, 2015, “The effect of nitrification inhibitors on the nitrous oxide (N2O) release from agricultural soils - a review ”, J. Plant Nutr. Soil Sci. 178, 171-188; Gilsanz et al., 2016,“ Development of emission factors and efficiency of two nitrification inhibitors, DCD and DMPP ”, Agriculture, Ecosystems and Environment 216, 1-8.).
  • AMO ammonium monooxygenase
  • Dicyandiamide DCD
  • DMPP 3,4-dimethylpyrazole phosphate
  • EP1378499B1 which describes the use of the nitrification inhibitor 3,4-dimethylpyrazole phosphate in combination with nitrogen fertilizers
  • EP1546285A1 which describes the use of dicyandiamide as a nitrification inhibitor.
  • chemical inhibitors can also present problems, due to the possibility of their absorption by plants while they remain in the soil, being currently an important challenge to know how these inhibitors are degraded in the soil and if this type of products go to the plant.
  • Bacteriophages are considered non-living biological entities consisting of a nucleic acid surrounded by a protein capsid. As obligate parasites of bacteria, they are unable to reproduce without their host.
  • the first proposed phage therapy to treat infections was as early as 1919, almost a decade before the discovery of penicillin (Chanishvili N., "Phage therapy - history from Twort and d'Herelle through Soviet experience to current approaches ", Adv Virus Res 2012; 83: 3-40). Later, with the development of antibiotics, this type of strategy was abandoned due to the enormous technical difficulties of the moment. Today, with technological development and the problems associated with antibiotics, it is re-emerging as a tool with great potential.
  • Bacteriophages are simple and incredibly diverse. They are widely distributed in all ecosystems, specifically it is estimated that, on average, there are 1.5x10 8 phages / g of soil in the soil (Kevin E. et al; 2003, “Elevated Abundance of Bacteriophage Infecting Bacteria in Soil ”, Applied and Environmental Microbiology, p. 285-289 Vol. 69) and up to 10 10 phages / g can be counted in certain soils.
  • bacteriophages are highly specific; that is, each virus has limited infectivity from a few species to only a few strains of the same species. This characteristic is very relevant, since it greatly reduces possible collateral effects by not greatly affecting the microbiological flora to which they are not directed.
  • phage therapy is self-dosing.
  • the application of chemical inhibitors requires minimum concentrations of inhibitory substances and their stability so that they continue to perform their function.
  • Phages are self-replicating entities in their target bacteria. Few bacteria will lead to few infections and the generation of a limited number of new phages. The more bacteria there are and the more they are multiplying, the more pronounced the phage parasitization will be and the number of viruses will undergo exponential growth, multiplying the desired effect.
  • phages are considered to be the most abundant biological entity on Earth and they play a fundamental role in the regulation of bacterial populations. For example, phages are responsible for the death of approximately 20% to 40% of all bacteria on the sea surface every 24 hours (Wittebole X. et al; 2014, “A historical overview of bacteriophage therapy as an alternative to antibiotics for the treatment of bacterial pathogens ”, Virulence; 5: 226-235). The effect of these interactions between bacteria and bacteriophages at the soil level is also widely described.
  • the soil provides an enormous range of niches that are occupied by many species of microorganisms, leading to a similar diversity in the variety of viruses that parasitize these microorganisms.
  • viral abundance is significantly correlated with bacterial abundance (Williamson et al., 2007, "Incidence of lysogeny within temperate and extreme soil environments", Environ Microbiol 9: 2563-2574). This indicates that the presence and abundance of susceptible hosts is a key factor controlling viral abundance.
  • host organisms When host organisms are present, particularly in large numbers, new viruses can be continuously produced and released into the soil matrix through lytic infections. In the absence of susceptible hosts, the abundance of extracellular viruses is controlled by the physical and chemical properties of the soil environment.
  • the object of the invention is to avoid the use of chemical compounds and to eliminate the disadvantages of the known products of the prior art, which can lead to adverse effects to avoid nitrification of agricultural soils, providing new nitrification-inhibiting bacteriophages according to SEQ ID NO: 1, here called Phi-NF1 bacteriophages (deposited in the German collection DSZ with deposit number DSM 33308), capable of inhibiting the proliferation and / or growth of specific nitrifying bacteria present in the soil, in particular capable of to inhibit the proliferation and / or growth of ammonia-oxidant bacteria (AOB), in particular and preferably Nitrosomonas sp, Nitrosomonas aestuarii, Nitrosomonas communis, Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas halophila, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas nitrosa, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas ureae, Nitros
  • the invention also encompasses variants of said bacteriophages, provided that said variants retain the phenotypic characteristics of the original bacteriophage.
  • a variant of the bacteriophage of SEQ ID NO: 1 is understood to be one that has a sequence identity, compared to SEQ ID NO: 1, of at least 70%, where the variant has the phenotypic characteristics of the bacteriophage of SEQ ID NO: 1 from which it comes.
  • bacteriophage Phi-NF1 deposited in the German collection DSZ with deposit number DSM 33308
  • AOB ammonia-oxidant bacteria
  • Nitrosomonas sp Nitrosomonas aestuarii
  • Nitrosomonas communis Nitrosomonas europaea
  • Nitrosomonas eutropha Nitrosomonas halophila
  • Nitrosomonas marina Nitrosomonas nitrosa, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas ureapirae sp , Nitrosopira multiformis, Nitrosopira tenuis.
  • Phi-NF1 according to SEQ ID NO: 1, or a variant thereof as defined herein, it is applied by fertigation at a dose of between 10 8 and 10 13 units. Phi-NF1 / liter of irrigation water.
  • the bacteriophage Phi-NF1 according to SEQ ID NO: 1, or a variant thereof as defined herein can be formulated together with liquid or solid nitrogen fertilizers at a dose of between 10 11 and 10 16 Phi- units. NF1 / kg nitrogen.
  • Fig. 1 graph showing the variation of the pH in an "in vitro" culture, infective capacity of phage 1 N.e;
  • Fig. 2 graph showing the variation of the pH in an "in vitro” culture, infective capacity of phage 2 N.e
  • Fig. 3 graph showing the variation of the pH in an "in vitro” culture, infective capacity of the phage 3 N.m;
  • Fig. 4 graph showing the variation of the pH in an "in vitro" culture, infective capacity of the phage 4 N.m;
  • Fig. 5 transmission electron microscopy (TEM) image showing the morphology of the phages on Nitrosomonas europaea (a) and Nitrosopira multiformis (b);
  • Fig. 6A Reduction of the amount of ammonia in a culture of Nitrosomonas europaea infected or not with Phi-NF1;
  • Fig. 6B Reduction of the amount of ammonia in a culture of Nitrosopira multiformis infected or not with Phi-NF1;
  • Fig. 6C Reduction of the amount of ammonia in a culture of Nitrosomonas nitrosa infected or not with Phi-NF1;
  • Fig. 6D Reduction of the amount of ammonia in a culture of Nitrosomonas communis infected or not with Phi-NF1;
  • Fig. 7 Result of the in vivo test of the activity of the phage Phi-NF1 as a biological inhibitor of nitrification: A) Control soil treated only with ammonium sulfate; B) Earth treated with ammonium sulfate + Phi-NF1.
  • Bacteria and culture media and obtaining viral concentrates from natural samples a. Bacteria:
  • the bacterial species Nitrosomonas europaea (ATCC 25978) and Nitrosopira multiformis (ATCC 25196) were used as hosts for the isolation of lytic viruses. Later, once the viruses were isolated, other AOBs were also used to test the phage infection spectrum, such as Nitrosomonas nitrosa (DSM 28438) and Nitrosomonas communis (DSM 28436). b.
  • Culture medium (recommended by the German DSMZ type culture collection): Culture medium, OAB: 535 mg NH 4 CI, 54 mg KH 2 P0 4 , 74 mg KCI, 49 mg MgS0 4 x 7 H 2 0, 147 mg CaCl 2 x 2 H 2 0.584 mg NaCl, 1 ml trace element solution, 1,000 ml distilled water.
  • the culture medium was sterilized in an autoclave and the pH was adjusted to 7.8 - 8.2 with a sterile 10% solution of KHC0 3 .
  • the natural samples for obtaining viral concentrates were urban wastewater samples from municipal treatment plants (a medium where a high presence of nitrifying bacteria is described), both inlet wastewater (ARE) (untreated), and outlet wastewater. (ARS) (after going through a secondary treatment in a treatment plant).
  • Nitrifying bacteria are slow-growing microorganisms (between 22-28 days) and also never reach a sufficient growth to cause a measurable turbidity in the liquid culture medium. Therefore, the monitoring of bacterial growth was carried out by measuring pH. As mentioned, the culture medium is at a pH between 7.8 and 8.2, ideal for the development of these microorganisms.
  • the following tables 1 and 2 show the evolution of the experiments to search for infective bacteriophages for Nitrosomonas europaea and Nitrosopira multiformis. Both tables show the pH for 7 days in several actively growing cultures of the species Nitrosomonas europaea (Ne) and Nitrosopira multiformis (Nm). At time 0, concentrated virus samples (cvARE or cvARS) are added to the cultures (except in control situations) in order to achieve infection in one of the cultures and, therefore, obtain one or more virulent bacteriophages against these ammonium oxidizing species. At time 4, the pH of all cultures is readjusted back to pH 8.
  • the ideal situation to isolate the possible viruses in each positive sample would be to use the technique of obtaining lysis plaques on solid medium. Once the possible viruses in each sample have been identified, the most virulent one can be selected. This situation is not very viable considering the growth rate of nitrifying bacteria in solid medium. For this reason, the individualization of the most virulent virus in each sample in liquid medium is proposed through selection for repeated infection. In this method, viruses from an infection are used to re-infect new cultures. This process is repeated during different cycles, so that the most efficient viruses infecting the target bacteria will be more and more prevalent in each new cycle. After a relevant number of cycles, only the most active virus will be in the sample.
  • the Phage 1 Ne and Phage 2N.e samples are used to make successive infections (5) of Nitrosomonas europaea.
  • the Phage 3N.e and Phage 4Nm samples are used to make successive infections (5) of Nitrosopira multiformis.
  • the bacteria begin to multiply, acidifying the medium, and causing a decrease of 2.66 points of pH after 5 days.
  • the 3 Nm Phage is capable of infecting bacteria from day 0, causing bacterial death, and therefore, the non-acidification of the medium.
  • the bacteria begin to multiply, acidifying the medium, and causing a decrease of 4.5 pH points after 5 days.
  • the 4 N.m Phage is capable of infecting bacteria from day 0, causing bacterial death, and therefore, the non-acidification of the medium.
  • the images obtained in the MET were those of bacteriophages of the Podoviridae family, with an icosahedral capsid of about 50 nm in diameter and a short tail.
  • the 4 bacteriophages had the same morphology (Fig. 5).
  • Phage DNA extraction was performed with each of the 4 bacteriophages and, after viral genome sequencing and bioinformatic analysis, it could be seen that all 4 were actually the same bacteriophage.
  • This data is very interesting, since bacteriophages usually have a very limited host range, most of them are specific at the strain level. In this case, it is the bacteriophage of SEQ ID NO: 1, called Phi-NF1, with a very broad host spectrum, capable of infecting different genera such as Nitrospira and Nitrosomonas. Infective capacity in other species
  • a tube was used where the bacteria continued to multiply freely (Ne).
  • Phi-NF1 phage a direct sample and decimal dilutions of the same were added to the rest of the tubes, so that the phage was successively diluted 10 times more in each tube, from a direct sample with 2 ml of 10 ® phage in 20 ml of culture (the final concentration of phage in the tube is 10 7 Phi-NF1 Units / ml), to the -8 dilution, where There should no longer be any bacteriophage.
  • Phi-NF1 is capable of infecting the culture of N. europaea at concentrations as low as 10 Phi-NF1 Units / ml.
  • Phi-NF1 not only presents a broad host spectrum for ammonium oxidizing nitrifying bacteria, but also has a significant infective potential, being capable of infecting N. europaea in vitro with a viral concentration of 10 units of Phi-NF1 / ml. (This test was repeated 2 times with each of the nitrifying bacteria mentioned above, giving identical results).
  • Container “B” is also treated with 6 ml of Phi-NF1 phage suspension (60 ml / Kg).
  • the phage suspension has a titer of 10 7 PFU / ml.
  • the soil samples to be analyzed are collected at a depth of between 1 and 5 cm.
  • the bacteriophage Phi-NF1 is effective as an ecological inhibitor of nitrification, specifically of ammonium-oxidizing bacteria.
  • nitrate levels are increasing very little by little. This behavior is due to the action of Phi-NF1 bacteriophages, capable of lysing and destroying an important part of the bacterial population capable of oxidizing ammonium to nitrite. Until day 25 of the experiment, the nitrate levels did not exceed those of ammonium, with a difference of 14 days with respect to the control test. It seems clear that the bacteriophage Phi-NF1 acts efficiently as an ecological inhibitor of nitrification, indirectly facilitating, through the lysis of an important part of the ammonium-oxidizing bacteria, a greater presence of ammonium and for more days.

Abstract

La invención proporciona nuevos bacteriófagos y variantes de los mismos pertenecientes a la familia Podoviridae, capaces de inhibir la proliferación y/o el crecimiento de los microorganismos nitrificantes presentes en el suelo, responsables de la nitrificación de los suelos agrícolas, en particular capaces de inhibir la proliferación y/o el crecimiento de las bacterias amoniaco-oxidantes, tales como Nitrosomonas sp, Nitrosomonas aestuarii, Nitrosomonas communis, Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas halophila, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas nitrosa, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas ureae, Nitrosospira sp, Nitrosospira multiformis, Nitrosospira tennis.

Description

Nuevos bacteriófagos inhibidores biológicos de la nitrificación y utilización de los mismos
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a nuevos bacteriófagos inhibidores de la nitrificación y a la utilización de los mismos.
Más concretamente, la invención proporciona nuevos bacteriófagos inhibidores de la nitrificación, o variantes de los mismos, capaces de inhibir la proliferación y/o el crecimiento de los microorganismos nitrificantes presentes en el suelo, responsables de la nitrificación de los suelos agrícolas, en particular capaces de inhibir la proliferación y/o el crecimiento de las bacterias amoniaco-oxidantes (AOB, por sus siglas en inglés), tales como Nitrosomonas sp, Nitrosomonas aestuarii, Nitrosomonas communis, Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas halophila, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas nitrosa, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas ureae, Nitrosospira sp, Nitrosospira multiformis, Nitrosospira tenuis.
El nitrógeno (N) aportado a través de los fertilizantes minerales y orgánicos ha tenido un impacto muy beneficioso en la sociedad, permitiendo incrementar de manera muy importante la producción de alimentos (Erisman et al., (2008) “How a century of ammonia synthesis changed the world”, Nature Geoscience1:636-639). La síntesis de amoniaco a partir del nitrógeno del aire y su posterior transformación en fertilizantes nitrogenados, junto con la utilización de otros medios de producción, ha impulsado el incremento del rendimiento de la mayoría de los cultivos hasta los niveles actuales.
No obstante, en los últimos años el avance en el conocimiento de los procesos constituyentes del ciclo del nitrógeno ha provocado también una gran preocupación al constatarse la dificultad de incrementar la producción de alimentos sin generar importantes pérdidas de nitrógeno reactivo (nitrato, óxidos de nitrógeno, amoniaco) en los sistemas intensivos, tanto a los cuerpos de agua como a la atmósfera (Galloway et al., "Toxicity of Nitrification Inhibitors on Dehydrogenase Activity in Soils", International Journal on Advanced Science, Engineering and Information Technology, vol. 1, no. 1, pp. 98-103, 2011). Se estima que la Agricultura genera entre el 56 y el 70% del óxido nitroso (N2O) emitido a la atmósfera, siendo además muy elevada la contribución de este gas de efecto invernadero (GEI) a la huella de carbono de los cultivos agrícolas destinados a la alimentación (Smith et al., 2007, “Greenhouse gas mitigation in agricultura”, Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom y New York).
La mayoría de los sistemas agrícolas modernos se han convertido en entornos con elevadas tasas de nitrificación donde la nitrificación es tan rápida que la mayor parte del NH4 + procedente de entradas externas (fertilizantes minerales) se nitrifica en pocas semanas (a menudo, 2 semanas) (Subbarao et al. 2006, “Scope and strategies for regulation of nitrification in agricultural systems - challenges and opportunities”, Critical Reviews in Plant Science 25:303-335). El nitrato resulta vulnerable a las pérdidas, ya sea a través de la lixiviación o de la desnitrificación (Sahrawat, 2008, “Factors affecting nitrification in soils”, Communications in Soil Science and Plant Analysis. 39: 1436-1446).
El nitrógeno nítrico, por su alta solubilidad y su naturaleza iónica negativa, tiene un coeficiente de retención en el suelo muy pequeño. La matriz orgánica del suelo, cargada también negativamente, no tiene capacidad para retener este compuesto. Así, transita por el suelo a una alta velocidad, dejando un margen de tiempo pequeño para ser absorbido por las plantas o fijado por los microorganismos del suelo. En poco tiempo se moviliza hacia zonas profundas, donde deja de ser accesible a la absorción radicular y se pierde finalmente en las masas de agua subterráneas. Debido a esta característica, su uso está empezando a ser restringido o incluso prohibido en zonas consideradas vulnerables.
En cambio, el nitrógeno amoniacal posee una carga positiva y es estable en el complejo del suelo. Permanece retenido con muy poca pérdida por lixiviación. De esta forma, aumenta en gran medida su tiempo de residencia y, como consecuencia, el tiempo durante el cual está disponible para las plantas. Por otro lado, se reduce la contaminación de las masas de agua subterránea debido a la poca perdida por lixiviación. El principal punto a tener en cuenta en el uso del amonio es que, en el suelo, es transformado paulatinamente a nitrógeno nítrico por los microorganismos con capacidad nitrificante. A este respecto, el proceso de nitrificación se produce en dos pasos, en el primer paso oxidándose el amoniaco a nitrito y, en el segundo, oxidándose el nitrito a nitrato. Excluyendo alguna excepción, estos dos pasos son realizados por microorganismos diferentes. La gran mayoría de bacterias implicadas en los dos pasos son autotróficas, pudiendo fabricar moléculas orgánicas utilizando la energía obtenida de fuentes inorgánicas, en este caso amoníaco o nitrito.
En el primer paso de la nitrificación, el de oxidación del amoniaco, se distinguen dos grupos muy diferentes de microorganismos.
El primer grupo es el conocido como bacterias amoniaco-oxidantes, (AOB, por sus siglas en inglés) e incluye diversos tipos de bacterias que obtienen su energía mediante la generación de un potencial reductor a partir de la oxidación del amoniaco, utilizando dicha energía para fijar el dióxido de carbono (Bock and Wagner, 2006, “Oxidation of inorganic nitrogen compounds as an energy sourceln”, Dworkin M, Falkow S (eds). The Prokaryotes Springer Verlag: New York; 457-495).
En general, estas bacterias AOB se consideran organismos autótrofos obligados, es decir, solo pueden crecer mediante la fijación de su propio CO2 a partir del ciclo de Calvin. El amoníaco es su única fuente de energía, su principal producto metabólico es el nitrito y la reacción que llevan a cabo se muestra en la ecuación (1).
NH3 + 02 NO2- + 3H+ + 2e- (1)
Nitrosomonas es el género identificado con mayor frecuencia asociado a este paso, pero otros géneros como Nitrosococcus y Nitrosospira son capaces de realizarlo. También existen subgéneros como Nitrosolobus y Nitrosovibrio que puede oxidar de forma autótrofa el amoniaco (Watson et al., 1981, “The family nitrobacteraceae, in The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria”, ed. M. P. Starr et al., pp. 1005-1022, Springer, New York).
El segundo grupo de microorganismos oxidantes de amoniaco se aisló en 2005 (Kónneke et al., 2005, “Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon”, Nature.; 437:543-546). Estos microorganismos no son bacterias, sino arqueas, concretamente Arqueas Oxidantes de Amoníaco (AOA). Al igual que las AOB, las AOA oxidan el amoníaco a nitrito, pero las vías enzimáticas son bastante diferentes y el global de la reacción también, como se muestra ver en la ecuación (2).
NH3 + 1 ,5 02 N02- + H20 + H+ (2)
Las AOA también se cree que son predominantemente autótrofas, pero fijan el C02 usando la vía del 3-hidroxipropionato/4-hidroxibutirato (Walker et al., 2010, “Nitrosopumilus maritimus genome reveáis unique mechanisms for nitrification and autotrophy in globally distributed marine crenarchaea”, Proc Nati Acad Sci USA;107:8818-8823). La biodiversidad de las AOA con capacidad de realizar esta función es mucho más amplia que en el caso de las AOB. Así, se ha identificado esta capacidad en un filo entero de Arqueas, las Thaumarchaeota (Treusch et al., 2005, “Novel genes for nitrite reducíase and Amo-related proteins indícate a role of uncultivated mesophilic crenarchaeota in nitrogen cycling”, Environ Microbiol 7: 1985-1995).
Atendiendo a la variedad de microorganismos con capacidad de llevar a cabo este primer paso de la nitrificación, muchos estudios se han centrado en su distribución en los múltiples hábitats. Se ha demostrado que la abundancia y diversidad de las AOA y las AOB está claramente afectada por factores ambientales como el pH (Li et al., 2015, pH regulates ammonia-oxidizing bacteria and archaea in paddy soils in Southern China”, Appl Microbiol Biot, 1-11 (2015); Zhang et al. , 2012, “Ammonia-oxidizing archaea have more important role than ammonia-oxidizing bacteria in ammonia oxidation of strongly acidic soils”, ISME J 6, 1032-1045), la salinidad (Bernhard et al., 2010, “Abundance of ammonia-oxidizing archaea and bacteria along an estuarine salinity gradient in relation to potential nitrifcation rates”, Appl Environ Microb 76, 1285-1289; Mosier & Francis, 2008, “Relative abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in the San Francisco Bay estuary”, Environ Microbiol 10, 3002-3016), la cantidad de nitrógeno amoniacal y de materia orgánica (Liu et al., 2013, “Spatial distribution and factors shaping the niche segregation of ammonia-oxidizing microorganisms in the Qiantang River, China”, Appl Environ Microb 79, 4065-4071; Verhamme et al., 2011, “Ammonia concentration determines diferential growth of ammonia-oxidising archaea and bacteria in soil microcosms”, ISME J 5, 1067-1071; Sun et al., “Distribution and abundance of archaeal and bacterial ammonia oxidizers in the sediments of the Dongjiang River, a drinking water supply for Hong Kong”, Microbes Environ 28, 457 (2013)). Dado que el amoniaco es el sustrato de la oxidación, la cantidad de amonio se considera un factor principal a la hora de afectar a la distribución de este tipo de microorganismos. Así, los estudios de Verhamme (supra) y muchos otros posteriores han demostrado que, en suelos agrícolas (no ácidos) con cantidades relevantes de amonio, son las AOB los microorganismos dominantes en cuanto a la nitrificación se refiere.
Este primer paso del proceso de nitrificación (oxidación de amoniaco a nitrito) es el paso limitante, y por tanto, el que marcará la velocidad a la que el amonio es transformado en nitrato, con todos los problemas que esto conlleva en un medio agrícola. Sin embargo, éste no es el único efecto negativo asociado, puesto que, además de la producción neta de nitrito, las AOB también son capaces de producir óxido nitroso (N2O), un gas con 298 veces más capacidad de generar efecto invernadero que el CO2. La tecnología de los fertilizantes ha tratado de retardar la velocidad de nitrificación mediante el desarrollo de fertilizantes que incluyen compuestos químicos capaces de inhibir la nitrificación en los denominados fertilizantes estabilizados. Tales compuestos desactivan la enzima responsable de la primera etapa de la nitrificación (amonio monooxigenasa, AMO), manteniendo durante más tiempo el Nh en el suelo (Ruser y Schulz, 2015, “The effect of nitrification inhibitors on the nitrous oxide (N2O) release from agricultural soils - a review”, J. Plant Nutr. Soil Sci. 178, 171-188; Gilsanz et al., 2016, “Development of emission factors and efficiency of two nitrification inhibitors, DCD and DMPP”, Agriculture, Ecosystems and Environment 216, 1-8.). La diciandiamida (DCD) y el 3,4-dimetilpirazol fosfato (DMPP), que están siendo utilizados en los últimos años, han demostrado ser eficientes en la reducción de emisiones de óxidos de nitrógeno en diferentes condiciones climáticas. Este efecto sobre la nitrificación producido por los dos inhibidores está correlacionado con una reducción de la lixiviación del nitrógeno disuelto cuando se utiliza cualquiera de ellos, así como a una reducción en la emisión de gases contaminantes.
A este respecto, véase por ejemplo la EP1378499B1, donde se describe el uso del inhibidor de nitrificación 3,4-dimetilpirazol fosfato en combinación con fertilizantes nitrogenados ola EP1546285A1, que describe el uso de diciandiamida como inhibidor de la nitrificación. Sin embargo, el uso de inhibidores químicos también puede presentar problemas, debido a la posibilidad de su absorción por parte de las plantas mientras permanecen en el suelo, siendo actualmente un reto importante el conocer cómo se degradan en el suelo estos inhibidores y si este tipo de productos pasan a la planta. Marsden et al. (“Plant acquisition and metabolism of the synthetic nitrification inhibitor dicyandiamide and naturally-occurring guanidine from agricultural soils”, Plant and Soil, 395 (1-2), 201- 214, 2015) demostraron que el DCD puede pasara plantas de gramínea y metabolizarse parcialmente en la misma, siendo un posible vehículo para su transmisión a la cadena alimentaria. En el caso del DMPP, también se ha comprobado que puede quedar en el suelo durante un tiempo mayor al de su efecto inhibitorio (Guardia et al., “Fate of 15N- labelled ammonium nitrate with or without the new nitrification inhibitor DMPSA in an irrigated maize crop”, Soil Biology & Biochemistry. 116: 193-202, 2018) lo que puede ser negativo si es absorbido por la planta.
El efecto de diferentes inhibidores sobre el conjunto de microorganismos del suelo también se ha podido demostrar mediante el análisis de actividades enzimáticas, como la actividad deshidrogenasa o la actividad dimetilsulfoxido reductasa (Tindaon et al., 2010; Tindaon et al., 2011 , “Side Effects of Nitrification Inhibitors on Non Target Microbial Processes in Soils”,. Jurnal TANAH TROPIKA (Journal of Tropical Soils). 16. 7-16. 10.5400/jts.2011.16.1.7.)
Los bacteriófagos son considerados entidades biológicas no-vivas consistentes en un ácido nucleico envuelto por una cápside proteica. Como parásitos obligados de bacterias, son incapaces de reproducirse sin su huésped. La primera terapia con fagos propuesta para tratar infecciones fue tan pronto como en el año 1919, casi una década antes del descubrimiento de la penicilina (Chanishvili N., “Phage therapy--history from Twort and d’Herelle through Soviet experience to current approaches”, Adv Virus Res 2012; 83: 3-40). Posteriormente, con el desarrollo de los antibióticos, este tipo de estrategias fue abandonado debido a las enormes dificultades técnicas del momento. Hoy en día, con el desarrollo tecnológico y los problemas asociados a los antibióticos, está resurgiendo como una herramienta con mucho potencial.
Los bacteriófagos son simples e increíblemente diversos. Están ampliamente distribuidos en todos los ecosistemas, concretamente se estima que, de media, en el suelo hay 1,5x108 fagos/g de suelo (Kevin E. et al; 2003, “Elevated Abundance of Bacteriophage Infecting Bacteria in Soil”, Applied and Environmental Microbiology, p. 285-289 Vol. 69) pudiendo contarse hasta 1010 fagos/g en determinados suelos.
Las ventajas de una terapia con fagos respecto a los antibióticos en medicina son extrapolares a la utilización de este tipo de tecnología versus moléculas inhibidoras aplicadas en otros campos, tales como los inhibidores de la nitrificación en agricultura.
Así, los bacteriófagos son altamente específicos; es decir, cada virus tiene capacidad de infección limitada desde unas pocas especies hasta únicamente algunas cepas de una misma especie. Esta característica es muy relevante, puesto que reduce enormemente los posibles efectos colaterales al no afectar en gran medida a la flora microbiológica a la que no van dirigidos.
Igualmente, la terapia con fagos es autodosificada. La aplicación de inhibidores químicos requiere unas concentraciones mínimas de sustancias inhibidoras y una estabilidad de éstas para que sigan realizando su función. Los fagos son entidades autorepl ¡cativas en su bacteria diana. La presencia de pocas bacterias implicará pocas infecciones y la generación de una cantidad de nuevos fagos limitada. Cuantas más bacterias haya y más se estén multiplicando, más pronunciada será la parasitación por los fagos y el número de virus sufrirá un crecimiento exponencial, multiplicando el efecto deseado.
Por otra parte, el uso de bacteriófagos no deja residuos químicos contaminantes, puesto que no dejan de ser materia orgánica. Estas entidades tienen una vida media limitada en el suelo en ausencia de su hospedador. Esta vida media está sujeta a diferentes variables como pueden ser temperatura, la humedad, la composición del suelo, etc.
Existe abundante documentación sobre el uso de este tipo de tecnología especialmente en el campo de la lucha contra las plagas, donde se ha llevado a cabo el máximo desarrollo. Existe una necesidad bien reconocida de desarrollar nuevas estrategias de control amigables con el medio ambiente para combatir las enfermedades bacterianas de los cultivos. Las medidas de control actuales que involucran el uso de químicos tradicionales o antibióticos están perdiendo su eficacia debido al desarrollo natural de resistencias bacterianas a estos agentes. Además, existe una conciencia cada vez mayor de que su uso no es respetuoso con el medio ambiente. Los bacteriófagos han recibido un interés creciente en la investigación en los últimos años como un medio realista y respetuoso con el medio ambiente para controlar enfermedades bacterianas en los cultivos, estando algunos productos basados en bacteriófagos ya están disponibles en el mercado. Este control biológico con bacteriófagos posee ventajas sobre los controles químicos, ya que los cócteles de bacteriófagos hechos a medida se pueden adaptar para atacar las bacterias específicas que causan enfermedades, adaptándose fácilmente a la resistencia bacteriana que puede desarrollarse con el tiempo.
La utilización de fagos como herramienta se puede presentar inicialmente como una situación forzada promovida en el ámbito del suelo. El estudio de las interacciones entre virus y sus bacterias diana en los distintos hábitats revela que este tipo de interacciones ecológicas son muy abundantes de forma natural en los diferentes ecosistemas. Se considera que los fagos son la entidad biológica más abundante de la Tierra y que juegan un papel fundamental en la regulación de las poblaciones bacterianas. Por ejemplo, los fagos son los responsables de la muerte de aproximadamente entre el 20% y el 40% de todas las bacterias de la superficie marina cada 24 horas (Wittebole X. et al; 2014, “A historical overview of bacteriophage therapy as an alternative to antibiotics for the treatment of bacterial pathogens”, Virulence; 5: 226-235). También está ampliamente descrito el efecto de estas interacciones entre bacterias y bacteriófagos a nivel de suelo. El suelo proporciona un increíble rango de nichos que son ocupados por muchas especies de microorganismos, conduciendo a una diversidad parecida en la variedad de virus que parasitan a estos microorganismos. En los suelos agrícolas, la abundancia viral está significativamente correlacionada con la abundancia bacteriana (Williamson et al., 2007, “Incidence of lysogeny within températe and extreme soil environments”, Environ Microbiol 9:2563-2574). Esto indica que la presencia y abundancia de hospedadores susceptibles es un factor clave que controla la abundancia viral. Cuando los organismos hospedadores están presentes, particularmente en grandes cantidades, pueden producirse y liberarse nuevos virus continuamente en la matriz del suelo a través de infecciones líticas. En ausencia de hospedadores susceptibles, la abundancia de virus extracelulares está controlada por las propiedades físicas y químicas del entorno del suelo. El efecto de este balance virus-bacteria ha sido demostrado, por ejemplo, con fagos que parasitan bacterias del género Rizobium (Kleczkowska J; 1971, “Genetic changes in rhizobium bacteria and in their bacteriophages during coexistence”, Plant Soil 35(1):47-56). Otra demostración de la alta frecuencia de este tipo de infecciones en el suelo y de la importancia ecológica que tienen quedó demostrada en los experimentos llevados a cabo por Alien et al en 2010. En habitas con altas cantidades de carbono orgánico soluble, la masa microbiológica no crece aunque se incorporen más sustratos consumibles; en cambio, la aplicación de sustancias anti-fagos genera un incremento sustancial del número de microorganismos. De esta forma se demuestra que estas poblaciones en el suelo estaban en equilibrio controlado gracias a la presencia permanente de los fagos.
Así, la invención tiene como objeto evitar el uso de compuestos químicos y eliminar las desventajas de los productos conocidos de la técnica anterior, que pueden conllevar efectos adversos para evitar la nitrificación de los suelos agrícolas, proporcionando nuevos bacteriófagos inhibidores de la nitrificación de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, denominados aquí bacteriófagos Phi-NF1 (depositados en la colección alemana DSZ con número de depósito DSM 33308), capaces de inhibir la proliferación y/o el crecimiento de bacterias nitrificantes específicas presentes en el suelo, en particular capaces de inhibir la proliferación y/o el crecimiento de las bacterias amoniaco-oxidantes (AOB), en particular y de forma preferente Nitrosomonas sp, Nitrosomonas aestuarii, Nitrosomonas communis, Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas halophila, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas nitrosa, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas ureae, Nitrosospira sp, Nitrosospira multiformis, Nitrosospira tenuis.
La invención abarca también a variantes de dichos bacteriófagos, siempre que dichas variantes conserven las características fenotípicas del bacteriófago original. En este contexto, se entiende por variante del bacteriófago de SEQ ID NO: 1 aquella que tiene una identidad de secuencia, en comparación con la SEQ ID NO: 1, de al menos un 70%, donde la variante las características fenotípicas del bacteriófago de SEQ ID NO: 1 del cual procede.
Es igualmente objeto de la invención el uso del bacteriófago de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, o de una variante del mismo tal como se define aquí, denominado aquí bacteriófago Phi-NF1 (depositado en la colección alemana DSZ con número de depósito DSM 33308), para inhibir la proliferación y/o el crecimiento de bacterias nitrificantes específicas presentes en el suelo, en particular para inhibir la proliferación y/o el crecimiento de bacterias amoniaco-oxidantes (AOB), en particular, y de forma preferente, Nitrosomonas sp, Nitrosomonas aestuarii, Nitrosomonas communis, Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas halophila, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas nitrosa, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas ureae, Nitrosospira sp, Nitrosospira multiformis, Nitrosospira tenuis.
Así, en una realización preferente del uso del bacteriófago Phi-NF1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, o de una variante del mismo tal como se define aquí, se aplica por fertirrigación a una dosis de entre 108 y 1013 unidades Phi-NF1/litro de agua de riego.
Igualmente, del bacteriófago Phi-NF1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, o una variante del mismo como se define aquí, se puede formular conjuntamente con fertilizantes nitrogenados líquidos o sólidos a una dosis de entre 1011 y 1016 unidades Phi-NF1/kg de nitrógeno.
A continuación, se describe la invención en base a los siguientes ensayos y ejemplos de realización de la misma y en referencia a las siguientes figuras, en las cuales:
Fig. 1 : gráfico mostrando la variación del pH en un cultivo “in vitro”, capacidad infectiva del fago 1 N.e;
Fig. 2: gráfico mostrando la variación del pH en un cultivo “in vitro”, capacidad infectiva del fago 2 N.e; Fig. 3: gráfico mostrando la variación del pH en un cultivo “in vitro”, capacidad infectiva del fago 3 N.m;
Fig. 4: gráfico mostrando la variación del pH en un cultivo “in vitro”, capacidad infectiva del fago 4 N.m;
Fig. 5: imagen de microscopía electrónica de transmisión (MET) mostrando la morfología de los fagos sobre Nitrosomonas europaea (a) y Nitrosospira multiformis (b); Fig. 6A: Reducción de la cantidad de amonio en un cultivo de Nitrosomonas europaea infectado o no con Phi-NF1 ;
Fig. 6B: Reducción de la cantidad de amonio en un cultivo de Nitrosospira multiformis infectado o no con Phi-NF1 ;
Fig. 6C: Reducción de la cantidad de amonio en un cultivo de Nitrosomonas nitrosa infectado o no con Phi-NF1 ;
Fig. 6D: Reducción de la cantidad de amonio en un cultivo de Nitrosomonas communis infectado o no con Phi-NF1 ;
Fig. 7: Resultado del ensayo in vivo de la actividad del fago Phi-NF1 como inhibidor biológico de la nitrificación: A) Tierra de control tratada sólo con sulfato de amonio; B) Tierra tratada con sulfato de amonio + Phi-NF1.
Bacterias y medios de cultivo y obtención de concentrados víricos de muestras naturales a. Bacterias:
Se utilizaron como huéspedes para el aislamiento de virus líticos las especies bacterianas Nitrosomonas europaea (ATCC 25978) y Nitrosospira multiformis (ATCC 25196). Posteriormente, una vez aislados los virus, también fueron utilizadas para testar el espectro de infección de los fagos otras AOB, como por ejemplo Nitrosomonas nitrosa (DSM 28438) y Nitrosomonas communis (DSM 28436). b. Medio de cultivo (recomendado por la colección alemana de cultivos tipo DSMZ): Medio de cultivo, OAB: 535 mg NH4CI, 54 mg KH2P04, 74 mg KCI, 49 mg MgS04 x 7 H20, 147 mg CaCI2 x 2 H20, 584 mg NaCI, 1 mi solución elementos traza, 1.000 mi de agua destilada.
El medio de cultivo fue esterilizado en autoclave y se ajustó el pH a 7,8 - 8,2 con una solución estéril al 10% de KHC03.
Condiciones del cultivo: El cultivo se lleva a cabo en oscuridad a una temperatura de 30°C y a una agitación constante de 60 r.p.m. c. Obtención de mezclas de virus concentrados de muestras naturales:
Las muestras naturales para la obtención de concentrados víricos fueron muestras de agua residual urbana procedente de depuradoras municipales (medio donde está descrita una elevada presencia de bacterias nitrificantes), tanto agua residual de entrada (ARE) (sin tratar), como agua residual de salida (ARS) (tras pasar por un tratamiento secundario en estación depuradora).
Para conseguir un concentrado vírico que probar posteriormente ante las bacterias nitrificantes, se juntaron muestras de agua residual de entrada o ARE y muestras de agua residual de salida o ARS. Para conseguir la fracción vírica de estas muestras y concentrar las partículas fágicas, se siguieron los siguientes pasos:
• Centrifugación a 200xg durante 10 minutos y recuperado del sobrenadante, para eliminar materia orgánica y crecimiento bacteriano; · Filtrado del sobrenadante por filtros PES de 0,22 pm de tamaño de poro y baja absorción proteica;
• Concentración de la fracción vírica del agua residual mediante un protocolo de concentración de partículas víricas por polietilenglicol. Después de este proceso se obtuvieron dos muestras de concentrados víricos, una procedente de agua residual de entrada a la depuradora (cvARE) y una procedente del agua residual de salida de la depuradora (cvARS)
Aislamiento de bacteriófagos virulentos frente a bacterias nitrificantes
Las bacterias nitrificantes son microorganismos de crecimiento lento (entre 22-28 días) y además nunca llegan a alcanzar un crecimiento suficiente como para provocar una turbidez cuantificable en el medio de cultivo líquido. Por ello, el seguimiento del crecimiento bacteriano fue realizado mediante la medida del pH. Como se ha mencionado, el medio de cultivo se encuentra a un pH entre 7,8 y 8,2, idóneo para el desarrollo de estos microorganismos.
A medida que aumenta la población bacteriana en un sistema cerrado, y debido a la nitrificación del amonio, el pH del medio se va acidificando, hasta llegar a un punto incompatible con la vida de los propios microorganismos. Así, cuando el pH comienza a bajar por debajo de 7, se vuelve a llevar a pH 7, 8-8,2 mediante la adicción de una solución estéril al 10% de KHC03.
Para llevar a cabo el proceso de aislamiento de fagos se plantean las cuatro situaciones siguientes:
1- Infección de Nitrosomonas europea con cvARE
2- Infección de Nitrosomonas europea con cvARS
3- Infección de Nitrosospira multiformis con cvARE
4- Infección de Nitrosospira multiformis con cvARS
A un crecimiento activo de 25 mi bacteria ( N . europea o N. multiformis.), se añadieron 200 pl de un concentrado vírico (cvARE o cvARS), cada combinación se valora por triplicado (t1 , t2, t3). En el caso en que la infección sea positiva, los bacteriófagos lisarán las bacterias, provocando un parón total en el descenso del pH (o incluso un ligero aumento del mismo debido a la ruptura de las paredes bacterianas). Dicho parón en el descenso del pH contrasta con los controles en crecimiento activo, cuyo pH continúa disminuyendo normalmente. Los concentrados víricos que no contengan bacteriófagos líticos para estos microorganismos, no tendrán ningún efecto en la población bacteriana y, por tanto, el pH seguirá disminuyendo como en la situación control.
En las siguientes tablas 1 y 2 se muestra la evolución de los experimentos de búsqueda de bacteriófagos infectivos para Nitrosomonas europaea y Nitrosospira multiformis. Ambas tablas muestran el pH durante 7 días en varios cultivos en crecimiento activo de las especies Nitrosomonas europaea (N.e) y Nitrosospira multiformis (N.m). En el tiempo 0, se añade a los cultivos (excepto en las situaciones control), las muestras concentradas de virus (cvARE o cvARS) con el fin de conseguir la infección en alguno de los cultivos y, por tanto, obtener así uno o varios bacteriófagos virulentos ante estas especies oxidantes del amonio. En el tiempo 4, el pH de todos los cultivos es reajustado de nuevo a pH 8. En el caso en que haya habido infección fágica, las bacterias estarán muertas, por lo que el pH se mantendrá estable o bien ascenderá ligeramente debido a la lisis bacteriana. Tabla 1 Evolución de cultivos de Nitrosomonas Europaea y Nitrosospira multifirmis tratados con muestras concentradas de fagos naturales procedentes de Agua residual de entrada en la depuradora
Figure imgf000015_0001
Tabla 2 Evolución de cultivos de Nitrosomonas Europaea y Nitrosospira multifirmis tratados con muestras concentradas de fagos naturales procedentes de Agua residual de salida de la depuradora.
Figure imgf000015_0002
Como se puede ver en la tabla 1, dos de los triplicados de infección de Nitrosomonas europea han estabilizado el pH y éste no se modifica con el tiempo. Esto significa que podría haber presencia de uno o varios fagos líticos para esa bacteria en esas réplicas t1 y t2 procedentes de cvARE.
Como se puede ver en la tabla 1 , uno de los triplicados de infección de Nitrosospira multiformis ha estabilizado el pH en 7,1 frente al control que ha quedado en 6,32. Esto significa que podría haber presencia de uno o varios fagos líticos para esa bacteria en esa réplica (t1) procedente de cvARE.
Como se puede ver en la tabla 2, los tres triplicados de infección de Nitrosomonas europea han reducido la velocidad de disminución del pH. Esto significa que podría haber presencia de uno o varios fagos líticos para esa bacteria en esas réplicas t1 , t2 y t3 procedentes de cvARS. Como se puede ver en la tabla 2 dos de los triplicados de infección de Nitrosospira multiformis ha estabilizado el pH en 7,2 frente al control que ha quedado en 6,87. Esto significa que podría haber presencia de uno o varios fagos líticos para esa bacteria en esas réplicas (t1 y t2) procedente de cvARS.
Dado que, en principio, es imposible saber si, en las pruebas donde ha habido infección, ésta se debe a la presencia de un fago infectivo o de varios, se pretende individualizar los posibles fagos presentes en las diferentes muestras.
La situación ideal para aislar los posibles virus existentes en cada muestra positiva sería utilizar la técnica de obtención de calvas de lisis en medio sólido. Una vez individualizados los posibles virus que haya en cada muestra se puede seleccionar el más virulento. Esta situación es poco viable teniendo en cuenta la velocidad de crecimiento de las bacterias nitrificantes en medio sólido. Por ello, se plantea la individualización del virus más virulento de cada muestra en medio líquido mediante la selección por infección reiterada. En este método, los virus procedentes de una infección se utilizan para infectar de nuevo cultivos nuevos. Este proceso se repite durante diferentes ciclos, de forma que los virus más eficientes infectando la bacteria diana serán cada vez más mayoritarios en cada nuevo ciclo. Después de un número relevante de ciclos, solo el virus más activo estará en la muestra.
Para desarrollar este proceso, se mezclan las réplicas positivas de cada una de las combinaciones y se filtran con un filtro de 0,22 pm para obtener suspensiones fágicas puras. De esta forma se obtienen 4 mezclas de fagos:
• Fago 1 N.e (procedente de la infección de Nitrosomonas europea con cvARE)
• Fago 2 N.e (procedente de la infección de Nitrosomonas europea con cvARS)
• Fago 3 N.m (procedente de la infección de Nitrosomonas multiformis con cvARE)
• Fago 4 N.m (procedente de la infección de Nitrosomonas multiformis con cvARS)
Las muestras Fago 1 N.e y Fago 2N.e se utilizan para hacer infecciones sucesivas (5) de Nitrosomonas europaea. Las muestras Fago 3N.e y Fago 4 N.m se utilizan para hacer infecciones sucesivas (5) de Nitrosospira multiformis. Una vez obtenido el bacteriófago más virulento de cada muestra, se demostró su capacidad infectiva. Se partió de dos cultivos de Nitrosomonas europaea (N.e) y otros dos de Nitrosospira multiformis (N.m) de 50 mi cada uno y ambos en crecimiento activo. Estos 4 cultivos se separaron en 2 cultivos de 25 mi cada uno, quedando uno de ellos como control y otro para infectar con el bacteriófago correspondiente. Realizándose un seguimiento del pH durante 5 días.
A continuación, se muestra un esquema del experimento:
Control 1 N.e
Cultivo 1 de N e (50 mi)
Figure imgf000017_0001
Fago 1N.e
Figure imgf000017_0002
_ Control 2 N.e
Cultivo 2 de N.e (50 mi)
^ N.e + Fago 2N.e
Seguimiento de pH durante 5
Control 1 N.m días
Cultivo 1 de N.m (50 mi)
Figure imgf000017_0004
N.m + Fago 3N.m
Figure imgf000017_0005
Control 2 N.m
Cultivo 2 de N.m (50 mi)
Figure imgf000017_0006
Fago 4N.m
Figure imgf000017_0003
Los resultados de este experimento se muestran en las figuras 1 a 4.
Como se observa en la Fig. 1, y en referencia al control, las bacterias comienzan a multiplicarse, acidificando el medio, y provocando una disminución de 1,78 puntos de pH al cabo de 5 días. En cambio, el Fago 1 N.e es capaz de infectar a las bacterias desde el día 0, provocando muerte bacteriana, y por tanto, la no acidificación del medio.
Como se observa en la Fig. 2, y en referencia al control, las bacterias comienzan a multiplicarse, acidificando el medio, y provocando una disminución de 2,98 puntos de pH al cabo de 5 días. En cambio, el Fago 2 N.e es capaz de infectar a las bacterias desde el día 0, provocando muerte bacteriana, y por tanto, la no acidificación del medio.
Como se observa en la Fig. 3, y en referencia al control, las bacterias comienzan a multiplicarse, acidificando el medio, y provocando una disminución de 2,66 puntos de pH al cabo de 5 días. En cambio, el Fago 3 N.m es capaz de infectar a las bacterias desde el día 0, provocando muerte bacteriana, y por tanto, la no acidificación del medio.
Como se observa en la Fig. 4, y en referencia al control, las bacterias comienzan a multiplicarse, acidificando el medio, y provocando una disminución de 4,5 puntos de pH al cabo de 5 días. En cambio, el Fago 4 N.m es capaz de infectar a las bacterias desde el día 0, provocando muerte bacteriana, y por tanto, la no acidificación del medio.
Microscopía electrónica
Una vez observado el efecto virulento de los fagos sobre Nitrosomonas europaea y Nitrosospira multiformis, se comprobó la morfología de los mismos en un microscopio electrónico de transmisión (MET).
Para conseguir un número suficiente de fagos de forma que fueran visibles en MET, se concentraron 100 mi de cada fago por medio de concentradores de proteínas hasta llevarlos a 1 mi.
Las imágenes que se obtuvieron en el MET fueron las de bacteriófagos de la familia Podoviridae, con cápside icosaédrica de unos 50 nm de diámetro y cola corta. Los 4 bacteriófagos tenían la misma morfología (Fig. 5).
Secuenciación
Se realizó una extracción de ADN fágico con cada uno de los 4 bacteriófagos y, tras la secuenciación del genoma vírico y el análisis bioinformático, pudo verse que los 4 eran en realidad el mismo bacteriófago. Este dato es muy interesante, ya que habitualmente los bacteriófagos tienen un rango de huésped muy limitado, la mayoría son específicos a nivel de cepa. En este caso, se trata del bacteriófago de SEQ ID NO: 1 , denominado Phi-NF1 , con un muy amplio espectro de huésped, capaz de infectar a géneros diferentes como son Nitrosospira y Nitrosomonas. Capacidad infectiva en otras especies
Tras demostrar la capacidad infectiva de estos bacteriófagos, observar al microscopio que eran iguales en morfología y demostrar mediante secuenciación que es un único bacteriófago de amplio el espectro de huésped para bacterias oxidantes del amonio, se plantea la posibilidad de infectar nuevas especies nitrificantes con este fago Phi-NF1.
Para ello, se ensayaron otras especies oxidantes del amonio tales como Nitrosomonas nitrosa (DSM 28438) y Nitrosomonas communis (DSM 28336), infectando con el fago de estudio y realizando un seguimiento de la evolución del amonio en el medio de cultivo. Esta evolución del amonio en el medio de cultivo es otra forma de ver si el virus está infectando o no las bacterias nitrificantes que se ensayan, por este motivo esta prueba se lleva a cabo también con las especies ensayadas anteriormente ( Nitrosomonas europaea y Nitrosospira multiformis) mediante la evolución del pH.
Como se puede observar en las figuras 6A, 6B, 6C y 6D, la aplicación de una dosis de 107 unidades de Phi-NF1/ml elimina completamente el consumo de amonio del medio. Esto es debido a que elimina cada una de las especies testadas en los diferentes experimentos.
Dosis infectiva del bacteriófago Phi-NF1 in vitro
Dado que las bacterias AOB no se multiplican con tanta facilidad como otros microorganismos y además presentan una gran dificultad para crecer en medio sólido, para calcular “in vitro ” el potencial infectivo del fago se llevó a cabo un experimento similar a la técnica conocida como NMP (“número más probable”) partiendo de un concentrado con 108 Unidades de Phi-NF1/ml (contaje aproximado realizado por microscopía electrónica de transmisión). Este concentrado resultó de concentrar 10 veces la suspensión fágica presente en un cultivo de Nitrosomonas europaea infectado previamente por el fago Phi-NF1. El ensayo se realizó en tubos estériles con 20 mi de cultivo en fase exponencial de crecimiento de Nitrosomonas europaea a pH 8.
Como control, se empleó un tubo donde la bacteria seguía multiplicándose libremente (N.e). Al resto de tubos se les fue añadiendo el fago Phi-NF1, una muestra directa y diluciones decimales del mismo, de manera que el fago se diluye sucesivamente 10 veces más en cada tubo, desde una muestra directa con 2 mi de fago 10® en 20 mi de cultivo (la concentración final de fago en el tubo es 107 Unidades de Phi-NF1/ml), hasta la dilución -8, donde ya no debería de haber ningún bacteriófago. Los tubos donde no hay infección deberían un pH muy similar al pH del tubo control (alrededor de pH 6), mientras que los tubos donde se haya producido la infección vírica, tendrían un pH muy cercano a 8 (entre 7,5 - 8,2). Los resultados de este ensayo de muestran en la siguiente tabla 3: Tabla 3: Nitrosomas europea en fase exponencial de crecimiento (20 mi)
Figure imgf000020_0001
El resultado de esta prueba de capacidad infectiva del fago, demuestra que Phi-NF1 es capaz de infectar al cultivo de N. europaea en concentraciones tan bajas de 10 Unidades de Phi-NF1/ml.
Los tubos donde no hay infección presentarán un pH muy similar al pH del tubo control (alrededor de pH 6), mientras que los tubos donde se haya producido la infección vírica, habrá un pH muy cercano a 8 (entre 7,5 - 8,2). Por tanto, Phi-NF1 no sólo presenta un amplio espectro de huésped para bacterias nitrificantes oxidantes del amonio, sino que, además, posee un importante potencial infectivo, siendo capaz de infectar in vitro a N. europaea con una concentración vírica de 10 Unidades de Phi-NF1/ml. (Dicha prueba fue repetida 2 veces con cada una de las bacterias nitrificantes mencionadas anteriormente, dando idénticos resultados).
Ensayo in vivo de la actividad del fago Phi-NF1 como inhibidor biológico de la nitrificación
Ensayos en tierra Para comprobar el efecto del fago Phi-NF1 como inhibidor ecológico de la nitrificación, se realiza un primer experimento (por triplicado) en 2 recipientes estériles (A y B) con 100 g de tierra (en la cual existe una importante actividad nitrificante) en cada uno. A ambos recipientes se añaden 15 mg de sulfato de amonio (150 mg/kg). En el recipiente “B” además, se añaden 6 mi de una suspensión fágica de Phi-NF1 (60 ml/kg). Una vez tratados ambos suelos con sulfato de amonio y el suelo B con la suspensión de bacteriófagos, durante 29 días se mide en ambos la concentración de NH4+ y N03 por triplicado para cada punto (cada punto es la media de los tres datos). El suelo A servirá como control de la actividad nitrificante del suelo. Condiciones del experimento:
• 25°C
• Un contenedor estéril con 100 g de tierra para el control “A” y otro para el ensayo “B”.
• Tratamiento de la tierra (A y B) con 15 mg de sulfato de amonio por 100 g de tierra (150 mg/kg).
• El contenedor “B” es tratado además con 6 mi de suspensión fágica de Phi-NF1 (60 ml/Kg). La suspensión fágica presenta un título de 107 UFP/ml.
• Las muestras de tierra a analizar se recogen a una profundidad de entre 1 y 5 cm.
Los resultados se muestran en la figura 7.
Como puede verse en las gráficas de la figura 7, el bacteriófago Phi-NF1 es eficaz como inhibidor ecológico de la nitrificación, en concreto de las bacterias oxidantes del amonio.
En la muestra control “A”, puede observarse cómo, inicialmente, el tratamiento con sulfato de amonio dispara la concentración del NH4 + hasta 117,33 mg/Kg el día 5; sin embargo, a partir de este momento la concentración, de NH4 + comienza a disminuir de forma acentuada, a la vez que la concentración NOt aumenta. Esto se debe a la acción de las bacterias y las arqueas oxidantes del amonio y oxidantes del nitrito. A partir del día 11, la concentración de nitrato ya supera a la de amonio (96,8 mg/kg de amonio frente a 82,37 mg/kg de nitrato). Desde este punto hasta el final de experimento (día 29), la concentración de amonio no deja de disminuir, mientras que la curva de nitrato se comporta de forma totalmente opuesta, aumentando casi hasta el final del experimento. Por el contrario, en la muestra “B” de tierra + bacteriófago Phi-NF1, tanto la concentración de amonio como la de nitrato se comportan de forma diferente al control. Al inicio, el tratamiento con sulfato de amonio provoca en la curva del amonio un aumento similar al control, sin embargo, la concentración de nitrato permanece constante durante los primeros días. Cuando el nivel de amonio llega a los más alto el día 7 (108,80 mg/kg), comienza a disminuir, pero muy lentamente, no se produce el descenso de amonio abrupto que puede verse en el control. Así mismo, los niveles de nitrato van aumentando muy poco a poco. Este comportamiento es debido a la acción de los bacteriófagos Phi-NF1, capaces de lisar y destruir una parte importante de la población bacteriana capaz de oxidar el amonio en nitrito. Hasta el día 25 del experimento, los niveles de nitrato no superan a los de amonio, con una diferencia de 14 días respecto a la prueba control. Parece claro que el bacteriófago Phi-NF1 actúa de manera eficiente como inhibidor ecológico de la nitrificación, facilitando de forma indirecta, mediante la lisis de parte importante de las bacterias oxidantes del amonio, una mayor presencia de amonio y durante mas días.

Claims

REIVINDICACIONES
1 Un bacteriófago aislado seleccionado del grupo consistente en el bacteriófago de SEQ ID NO: 1 o una variante del mismo, manteniendo la variante las características fenotípicas del bacteriófago del que se derivan.
2 Un bacteriófago según la reivindicación 1, donde la variante tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. 3 Un bacteriófago según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque inhibe la proliferación y/o el crecimiento de bacterias amoniaco-oxidantes (AOB) seleccionadas de entre Nitrosomonas sp, Nitrosomonas aestuarii, Nitrosomonas communis, Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas halophila, Nitrosomonas marina, Nitrosomonas nitrosa, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas ureae, Nitrosospira sp, Nitrosospira multiformis, Nitrosospira tenuis.
4 Utilización de un bacteriófago según cualquiera de las reivindicaciones anteriores como inhibidor biológico de la nitrificación. 5 Utilización de un bacteriófago según cualquiera de las reivindicaciones anteriores por fertirrigación a una dosis de entre 108 y 1013unidades Phi-NF1/litro de agua de riego.
6 Utilización de un bacteriófago según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una formulación de fertilizante nitrogenado líquido o sólido a una dosis de entre 1011 y 1016 unidades Phi-NF1/kg de nitrógeno.
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