WO2021180040A1 - 苯并五元环类化合物 - Google Patents

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WO2021180040A1
WO2021180040A1 PCT/CN2021/079579 CN2021079579W WO2021180040A1 WO 2021180040 A1 WO2021180040 A1 WO 2021180040A1 CN 2021079579 W CN2021079579 W CN 2021079579W WO 2021180040 A1 WO2021180040 A1 WO 2021180040A1
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stirred
solution
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王宏健
钱文远
张明
黎健
陈曙辉
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南京明德新药研发有限公司
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to a class of benzo five-membered ring compounds, and relates to a compound represented by formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the Bcl-2 protein family is the central regulator of apoptosis and programmed cell death. Cell death can occur in response to internal pressure signals or environmental signals. In the life cycle of any organism, proliferation must be balanced with apoptosis to ensure proper development and proper maturation of physiological cell and organ functions. In highly proliferative tissues such as bone marrow, the balance between proliferation and apoptosis is particularly important. Changes in the mechanism of the apoptotic pathway may lead to cancer, and resistance to apoptosis has been considered a hallmark of human cancer nearly 20 years ago. Members of the Bcl-2 protein family can inhibit or activate apoptosis.
  • the Bcl-2 family of proteins can be divided into three categories: apoptosis-inhibiting proteins, including Bcl-2, Bcl-xL and Mcl-1, etc.; pro-apoptotic proteins, including Bak, Bax, etc.; and the other category contains only BH3 Pro-apoptotic proteins of the domain, such as Bad, Puma, etc.
  • the balance between Bcl-2 and Bak protein at the cell death signal checkpoint determines cell survival or apoptosis.
  • Bcl-2 can prevent the release of cytochrome c from mitochondria to the cytoplasm, thereby inhibiting cell apoptosis; it can also inhibit changes in mitochondrial permeability, and affect the formation of macropores, thereby inhibiting apoptosis.
  • the distribution of Bcl-2 is relatively limited, mainly in early embryonic tissues, mature lymphocytes, actively proliferating epithelial cells and neurons. Increased expression in many tumors such as breast cancer, neuroblastoma, nasopharyngeal cancer, prostate cancer, bladder cancer, lung cancer, gastric cancer and colon cancer.
  • Overexpression of Bcl-2 is one of the most common changes in malignant lymphoid tumors.
  • Bcl-2 gene is a kind of proto-oncogene, which can inhibit cell death caused by many factors, including inhibiting the apoptosis of target cells caused by most chemotherapeutic drugs, making tumors resistant to drug resistance. Therefore, Bcl-2 protein inhibitors can selectively exert anti-tumor effects, and the inhibition of Bcl-2 activity can be used for the treatment of malignant hematoma and various solid tumors.
  • the present invention provides a compound represented by formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • Ring A is selected from
  • R 1 is selected from H and C 1-3 alkyl, said C 1-3 alkyl optionally substituted with an R a;
  • R 2 is selected from oxacyclohexyl
  • R 3 is selected from H, F, Cl, Br, I, NO 2 and CN;
  • R a is selected from H and
  • R 1 is selected from H and CH 3, optionally substituted with a CH 3 a R a, the other variables are as defined in the present invention.
  • R 1 is selected from H, CH 3 and Other variables are as defined in the present invention.
  • R 2 is selected from Other variables are as defined in the present invention.
  • R 3 is selected from H and NO 2 , and other variables are as defined in the present invention.
  • the above-mentioned compound is selected from
  • R 1 , R 2 and R 3 are as defined in the present invention.
  • the compound is selected from:
  • R 1 , R 2 , R 3 and L 1 are as defined in the present invention.
  • the compound is selected from:
  • R 1 , R 2 and R 3 are as defined in the present invention.
  • the compound is selected from:
  • R 1 , R 2 and R 3 are as defined in the present invention.
  • the present invention also provides a compound represented by the following formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the above-mentioned compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used in the preparation of drugs related to Bcl-2 inhibitors.
  • the above-mentioned Bcl-2 related drugs are drugs for treating malignant hematoma and solid tumors.
  • the compound of the present invention Compared with the anti-apoptotic Bcl-2 protein and the anti-apoptotic Bcl-xL protein, the compound of the present invention exhibits higher selectivity, and has a significant effect in inhibiting the activity of the anti-apoptotic Bcl-2 protein;
  • the liver microsomes of humans, SD rats, CD-1 mice and beagle dogs have better metabolic stability and small species differences; they have good pharmacokinetic properties in CD-1 mice and support oral administration Drug route; has a significant inhibitory effect on the division and proliferation of RS4; 11 cells, and can significantly inhibit tumor growth.
  • Related drugs can be used to treat a variety of diseases, such as hematological malignancies, solid tumors, autoimmune diseases, cardiovascular diseases and neurodegenerative diseases, etc., especially in the treatment of tumor diseases with greater application prospects.
  • pharmaceutically acceptable refers to those compounds, materials, compositions and/or dosage forms that are within the scope of reliable medical judgment and are suitable for use in contact with human and animal tissues. , Without excessive toxicity, irritation, allergic reactions or other problems or complications, commensurate with a reasonable benefit/risk ratio.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt of the compound of the present invention, which is prepared from the compound with specific substituents discovered in the present invention and a relatively non-toxic acid or base.
  • a base addition salt can be obtained by contacting the compound with a sufficient amount of base in a pure solution or a suitable inert solvent.
  • Pharmaceutically acceptable base addition salts include sodium, potassium, calcium, ammonium, organic amine or magnesium salt or similar salts.
  • the acid addition salt can be obtained by contacting the compound with a sufficient amount of acid in a pure solution or a suitable inert solvent.
  • Examples of pharmaceutically acceptable acid addition salts include inorganic acid salts including, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, carbonic acid, hydrogen carbonate, phosphoric acid, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, sulfuric acid, Hydrogen sulfate, hydroiodic acid, phosphorous acid, etc.; and organic acid salts, the organic acid includes, for example, acetic acid, propionic acid, isobutyric acid, maleic acid, malonic acid, benzoic acid, succinic acid, suberic acid, Similar acids such as fumaric acid, lactic acid, mandelic acid, phthalic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, citric acid, tartaric acid and methanesulfonic acid; also include salts of amino acids (such as arginine, etc.) , And salts of organic acids such as glucuronic acid. Certain specific compounds of the present invention contain basic and
  • the pharmaceutically acceptable salt of the present invention can be synthesized from the parent compound containing acid or base by conventional chemical methods. In general, such salts are prepared by reacting these compounds in free acid or base form with a stoichiometric amount of appropriate base or acid in water or organic solvent or a mixture of both.
  • the compounds of the present invention may exist in specific geometric or stereoisomeric forms.
  • the present invention contemplates all such compounds, including cis and trans isomers, (-)- and (+)-enantiomers, (R)- and (S)-enantiomers, diastereomers Isomers, (D)-isomers, (L)-isomers, and their racemic mixtures and other mixtures, such as enantiomers or diastereomer-enriched mixtures, all of these mixtures belong to this Within the scope of the invention.
  • Additional asymmetric carbon atoms may be present in substituents such as alkyl groups. All these isomers and their mixtures are included in the scope of the present invention.
  • enantiomer or “optical isomer” refers to stereoisomers that are mirror images of each other.
  • cis-trans isomer or “geometric isomer” is caused by the inability to rotate freely because of double bonds or single bonds of ring-forming carbon atoms.
  • diastereomer refers to a stereoisomer in which the molecule has two or more chiral centers and the relationship between the molecules is non-mirror-image relationship.
  • wedge-shaped solid line keys And wedge-shaped dashed key Represents the absolute configuration of a three-dimensional center, with a straight solid line key And straight dashed key Indicates the relative configuration of the three-dimensional center, using wavy lines Represents a wedge-shaped solid line key Or wedge-shaped dashed key Or use wavy lines Represents a straight solid line key Or straight dashed key
  • the term “enriched in one isomer”, “enriched in isomers”, “enriched in one enantiomer” or “enriched in enantiomers” refers to one of the isomers or pairs of
  • the content of the enantiomer is less than 100%, and the content of the isomer or enantiomer is greater than or equal to 60%, or greater than or equal to 70%, or greater than or equal to 80%, or greater than or equal to 90%, or greater than or equal to 95%, or 96% or greater, or 97% or greater, or 98% or greater, or 99% or greater, or 99.5% or greater, or 99.6% or greater, or 99.7% or greater, or 99.8% or greater, or greater than or equal 99.9%.
  • the term “isomer excess” or “enantiomeric excess” refers to the difference between the relative percentages of two isomers or two enantiomers. For example, if the content of one isomer or enantiomer is 90%, and the content of the other isomer or enantiomer is 10%, the isomer or enantiomer excess (ee value) is 80% .
  • optically active (R)- and (S)-isomers and D and L isomers can be prepared by chiral synthesis or chiral reagents or other conventional techniques. If you want to obtain an enantiomer of a compound of the present invention, it can be prepared by asymmetric synthesis or derivatization with chiral auxiliary agents, in which the resulting diastereomeric mixture is separated and the auxiliary group is cleaved to provide pure The desired enantiomer.
  • the molecule when the molecule contains a basic functional group (such as an amino group) or an acidic functional group (such as a carboxyl group), it forms a diastereomeric salt with an appropriate optically active acid or base, and then passes through a conventional method known in the art The diastereoisomers are resolved, and then the pure enantiomers are recovered.
  • the separation of enantiomers and diastereomers is usually accomplished through the use of chromatography, which uses a chiral stationary phase and is optionally combined with chemical derivatization (for example, the formation of amino groups from amines). Formate).
  • the compound of the present invention may contain unnatural proportions of atomic isotopes on one or more of the atoms constituting the compound.
  • compounds can be labeled with radioisotopes, such as tritium ( 3 H), iodine-125 ( 125 I), or C-14 ( 14 C).
  • deuterium can be substituted for hydrogen to form deuterated drugs.
  • the bond formed by deuterium and carbon is stronger than the bond formed by ordinary hydrogen and carbon.
  • deuterated drugs can reduce toxic side effects and increase drug stability. , Enhance the efficacy, extend the biological half-life of drugs and other advantages. All changes in the isotopic composition of the compounds of the present invention, whether radioactive or not, are included in the scope of the present invention.
  • substituted means that any one or more hydrogen atoms on a specific atom are replaced by a substituent.
  • the substituent may include deuterium and hydrogen variants, as long as the valence of the specific atom is normal and the compound after substitution Is stable.
  • Oxygen substitution does not occur on aromatic groups.
  • optionally substituted means that it can be substituted or unsubstituted. Unless otherwise specified, the type and number of substituents can be arbitrary on the basis that they can be chemically realized.
  • any variable such as R
  • its definition in each case is independent.
  • the group can optionally be substituted with up to two Rs, and R has independent options in each case.
  • combinations of substituents and/or variants thereof are only permitted if such combinations result in stable compounds.
  • linking group When the number of a linking group is 0, such as -(CRR) 0 -, it means that the linking group is a single bond.
  • the substituent can be bonded with any atom on the ring, for example, a structural unit It means that the substituent R can be substituted at any position on the cyclohexyl or cyclohexadiene.
  • substituents do not indicate which atom is connected to the substituted group, such substituents can be bonded via any atom.
  • a pyridyl group can pass through any one of the pyridine ring as a substituent. The carbon atom is attached to the substituted group.
  • the middle linking group L is -MW-, at this time -MW- can be formed by connecting ring A and ring B in the same direction as the reading order from left to right It can also be formed by connecting ring A and ring B in the opposite direction to the reading order from left to right
  • Combinations of the linking groups, substituents, and/or variants thereof are only permitted if such combinations result in stable compounds.
  • any one or more sites of the group can be connected to other groups through chemical bonds.
  • the connection method of the chemical bond is not positioned, and there is a H atom at the connectable site, when the chemical bond is connected, the number of H atoms at the site will correspondingly decrease with the number of chemical bonds connected to become the corresponding valence number ⁇ The group.
  • the chemical bond between the site and other groups can be a straight solid bond Straight dashed key Or wavy line Express.
  • the straight solid bond in -OCH 3 means that it is connected to other groups through the oxygen atom in the group;
  • the straight dashed bond in indicates that the two ends of the nitrogen atom in the group are connected to other groups;
  • the wavy line in indicates that the phenyl group is connected to other groups through the 1 and 2 carbon atoms;
  • C 1-3 alkyl is used to indicate a linear or branched saturated hydrocarbon group composed of 1 to 3 carbon atoms.
  • the C 1-3 alkyl group includes C 1-2 and C 2-3 alkyl groups, etc.; it can be monovalent (such as methyl), divalent (such as methylene) or multivalent (such as methine) .
  • Examples of C 1-3 alkyl include, but are not limited to, methyl (Me), ethyl (Et), propyl (including n-propyl and isopropyl), and the like.
  • C n-n+m or C n -C n+m includes any specific case of n to n+m carbons, for example, C 1-12 includes C 1 , C 2 , C 3 , C 4 , C 5 , C 6 , C 7 , C 8 , C 9 , C 10 , C 11 , and C 12 , including any range from n to n+m, for example, C 1- 12 includes C 1-3 , C 1-6 , C 1-9 , C 3-6 , C 3-9 , C 3-12 , C 6-9 , C 6-12 , and C 9-12, etc.; similarly, from n to n +m member means that the number of atoms in the ring is from n to n+m, for example, 3-12 membered ring includes 3-membered ring, 4-membered ring, 5-membered ring, 6-membered ring, 7-membered ring, 8-membered ring, 9-membered
  • the compounds of the present invention can be prepared by a variety of synthetic methods well known to those skilled in the art, including the specific embodiments listed below, the embodiments formed by combining them with other chemical synthesis methods, and those well known to those skilled in the art Equivalent alternatives, preferred implementations include but are not limited to the embodiments of the present invention.
  • the structure of the compound of the present invention can be confirmed by conventional methods well known to those skilled in the art. If the present invention relates to the absolute configuration of the compound, the absolute configuration can be confirmed by conventional technical means in the art.
  • the single crystal X-ray diffraction method uses the Bruker D8 venture diffractometer to collect the diffraction intensity data of the cultured single crystal.
  • the light source is CuK ⁇ radiation
  • the scanning method After scanning and collecting relevant data, the direct method (Shelxs97) is further used to analyze the crystal structure to confirm the absolute configuration.
  • the solvent used in the present invention is commercially available.
  • the present invention uses the following abbreviations: eq stands for equivalent; Pd 2 (dba) 3 stands for tris(dibenzylideneacetone) two palladium; Xantphos stands for 4,5-bis(diphenylphosphine)-9,9-di Methylxanthene; BAK stands for Bcl-2 homologous antagonist; BAD stands for Bcl-2 related cell death agonist; Noxa stands for Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein; GST stands for Glutathione-S transferase; HTRF stands for homogeneous time-resolved fluorescence; FAM stands for fluorescein labeling; EDTA stands for ethylenediaminetetraacetic acid; Tritonx-100 stands for Triton X-100; DMSO stands for dimethyl sulfoxide; CD 3 OD stands for deuterated methanol; prep-HPLC stands for high performance liquid preparation; RBC stands for Reaction Biology Corporation
  • triethylsilane (3.35 g, 28.8 mmol) was added to a solution of compound 3-3 (3.5 g, 14.4 mmol) in trifluoroacetic acid (20 ml) and stirred at 0°C for 2 hours , The reaction solution was poured into 20 ml of saturated sodium bicarbonate solution, stirred at room temperature for 0.5 hours and then filtered, the filter cake was collected and dried in vacuo to obtain compound 3-4.
  • N-chlorosuccinimide (1.94 g, 14.55 mmol) in portions. The mixture was stirred at 0°C for 2 hours, then warmed to 28°C, and then stirred for another 10 hours. Then N-chlorosuccinimide (129.49 mg, 969.69 mmol) was added in portions at 0°C, and the mixture was stirred for 1 hour. The mixture was then warmed to 28°C and stirred for another hour.
  • the mixture was diluted with dichloromethane (30 mL), washed with saturated aqueous ammonium chloride solution (10 mL ⁇ 2) and saturated brine (10 mL), dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under vacuum.
  • the crude product passed prep_HPLC (neutral system) (column: Kromasil Eternity XT 250*80mm*10 ⁇ m; mobile phase: [water (10 mmol ammonium bicarbonate)-acetonitrile]; B (acetonitrile)%: 35%-65%, 25min) separation and purification to obtain compound 6.
  • N-chlorosuccinimide 113.30 mg, 848.48 micromoles
  • Ammonia water (2.73 g, 21.81 mmol, 3 mL, 25% purity) was added to the mixture at 0°C.
  • the mixture was stirred at 15°C for 1 hour.
  • the reaction mixture was diluted with 5 mL of water, and extracted with ethyl acetate (20 mL ⁇ 3).
  • This experiment is based on the competition between fluorescently labeled Bak/Bad/Noxa peptides and GST-labeled Bcl family proteins.
  • the fluorescence detection method based on HTRF is to observe the degree of binding by the fluorescence ratio between Tb-labeled anti-GST and FAM-labeled peptides. This peptide binds to the surface of the Bcl family protein pocket, which is essential for its anti-apoptotic function.
  • Analysis buffer 20mM potassium phosphate, pH 7.5, 50mM sodium chloride, 1mM EDTA, 0.005% Tritonx-100 and 1% DMSO.
  • ABT-737 (or ABT-263) and ABT-199
  • the results show that, compared to the anti-apoptotic Bcl-2 protein and the anti-apoptotic Bcl-xL protein, the compound of the present invention has a significant inhibitory effect on the anti-apoptotic Bcl-2 protein, and the anti-apoptotic Bcl-xL protein
  • the inhibitory effect of ABT-199 is significantly weaker than that of ABT-199, and the target selectivity is higher.
  • RS4 Dilute RS4; 11 cell suspension to 5000 cells/well, and seed 20uls cell suspension in each well of a 384-well plate;
  • test plate put the test plate back into the incubator and incubate for 72 hours;
  • liver microsomes prepare a working solution of liver microsomes (human, SD rat, CD-1 mouse, Beagle dog) at an appropriate concentration in 100mM potassium phosphate buffer;
  • liver microsomes Dilute the liver microsomes to 0.56 mg/mL with 100 mM phosphate buffer;
  • NCF60 plate For the NCF60 plate, add 50 ⁇ L of buffer and mix well 3 times. Start timing; the plate will be shaken at 37°C for 60 minutes;
  • T60 plate For the T60 plate, mix thoroughly 3 times, and immediately move 54 ⁇ L of the mixture to the "quenched" plate at the 0 minute time point. Then add 44 ⁇ L NAPDH cofactor to the culture plate (T60). Start timing; the plate will be shaken at 37°C for 60 minutes;
  • T 1/2 represents the half-life
  • C Lint liver
  • Remaining represents the remaining proportion of the compound after 60 minutes of incubation.
  • IV intravenous injection
  • PO oral administration
  • the formulations for intravenous and intragastric administration are both 2.5% dimethyl sulfoxide, 5% ethanol, 10% castor oil polyoxyethylene ether, 20% glucose solution (concentration 5%), 62.5% water.
  • the PK time points of the intravenous injection group were 5min, 15min, 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h after administration, and the PK time points of the intravenous administration group were 15min, 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 24h.
  • the LCMS/MS method was used to analyze the compound concentration in the plasma sample, and the following pharmacokinetic parameters were calculated using WinNonlin (Phoenix TM , version 6.1) software: IV: C 0 , Cl, V d , T 1/2 , AUC 0 -last , MRT 0-last , the number of regression points; PO: C max , T max , T 1/2 , AUC 0-last , MRT 0-last , the number of regression points.
  • the pharmacokinetic data is described by descriptive statistical methods, such as mean and standard deviation.
  • C 0 represents the drug concentration at the initial time point; T 1/2 represents the half-life; Vd ss represents the apparent volume of distribution; Cl represents the plasma clearance rate; AUC 0-last represents the drug plasma exposure; MRT 0-last represents the average stay Time; C max represents the maximum drug concentration point; T max represents the peak time.
  • the compound of the present invention has good pharmacokinetic properties in CD-1 mice and supports the oral route of administration.
  • mice Balb/c nude mice, 32, 7-8 weeks old, female;
  • Tumor cells human acute lymphoblastic leukemia cell line RS4; 11, in vitro suspension culture, culture conditions are RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, 37°C 5% CO 2 incubator. When the cells are in the exponential growth phase and the saturation is 80%-90%, the cells are collected and counted;
  • Cell seeding and grouping resuspend the cells in a buffer solution of sodium dihydrogen phosphate, add basement membrane matrigel 1:1, mix well, and have a density of 5 ⁇ 107 cells/mL. 0.2mL cell suspension (containing 1 ⁇ 107 RS4; 11 cells) was inoculated subcutaneously on the right back of each mouse. When the average tumor volume reached about 120mm 3 , randomized administration was carried out according to the tumor volume;
  • test substance Weigh appropriate amount of compound 2 respectively, and the solvent formula is 2.5% dimethyl sulfoxide, 5% ethanol, 10% castor oil polyoxyethylene ether, 20% glucose solution (concentration 5%), 62.5% water;
  • mice equally divided into 4 groups (8 in each group) were given blank vehicle, compound 2 (12.5mpk, QD), compound 2 (25mpk, QD), compound 2 (50mpk, QD);
  • tumor diameter was measured with vernier calipers twice a week.
  • the anti-tumor efficacy of the compound was evaluated by TGI (%) or the relative tumor growth rate T/C (%).
  • Relative tumor proliferation rate T/C (%) T RTV /C RTV ⁇ 100 (T RTV : average RTV of the treatment group; C RTV : average RTV of the negative control group).
  • RTV relative tumor volume
  • TGI (%), reflects the tumor growth inhibition rate.
  • the calculation formula of TGI for anti-tumor curative effect is:

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Abstract

一类式(I)所示的苯并五元环类化合物或其药学上可接受的盐，其在抑制抗细胞凋亡Bcl-2蛋白活性方面具有显著作用。

Description

苯并五元环类化合物
本发明主张如下优先权：
CN202010171071.3，2020年03月12日。
发明领域
本发明涉及一类苯并五元环类化合物，涉及式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐。
背景技术
Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡、程序性细胞死亡的中枢调节因子，细胞死亡可发生在对内在压力信号或环境信号的反应中。在任何生物体的生命周期中，增殖必须与细胞凋亡相平衡，以确保适当的发育和适当成熟的生理细胞和器官功能。在骨髓等高度增殖组织中，增殖和凋亡之间的平衡尤为重要。凋亡途径机制的改变可能会导致癌症，对凋亡的抵抗已被认为是近20年前人类癌症的一个标志。Bcl-2蛋白家族的成员可以抑制或激活细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白可分为三类：抑制细胞凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1等；促进细胞凋亡蛋白，包括Bak、Bax等；还有一类为仅含BH3结构域的促细胞凋亡蛋白，如Bad、Puma等。Bcl-2和Bak蛋白在细胞死亡信号检查点之间的平衡，决定了细胞的生存或凋亡。
Bcl-2能够阻止细胞色素c从线粒体释放到细胞质，从而抑制了细胞凋亡；还能抑制线粒体通透性改变，并影响巨孔的形成，从而抑制凋亡。正常机体组织中，Bcl-2分布比较局限，主要在胚胎早期组织、成熟淋巴细胞、增生活跃的上皮细胞和神经元等部位。在乳腺癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、胃癌和结肠癌等许多肿瘤表达增强。Bcl-2的过度表达是恶性淋巴肿瘤最常见的改变之一，它破坏了凋亡前蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡。Bcl-2基因是一种原癌基因，可以抑制由多种因素所引起的细胞死亡，包括抑制大多数化疗药物所引起的靶细胞凋亡，使肿瘤发生耐药。因此，Bcl-2蛋白抑制剂可以选择性地发挥抗肿瘤作用，可以将Bcl-2活性的抑制用于治疗恶性血液瘤及多种实体瘤的治疗。
发明内容
本发明提供了式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，
Figure PCTCN2021079579-appb-000001
其中，
T为N时，
Figure PCTCN2021079579-appb-000002
选自单键；
T为C时，
Figure PCTCN2021079579-appb-000003
选自双键；
环A选自
Figure PCTCN2021079579-appb-000004
R 1选自H和C 1-3烷基，所述C 1-3烷基任选被1个R a取代；
R 2选自氧杂环己基；
R 3选自H、F、Cl、Br、I、NO 2和CN；
L 1选自单键和-C(＝O)-；
R a选自H和
Figure PCTCN2021079579-appb-000005
本发明的一些方案中，上述R 1选自H和CH 3，所述CH 3任选被1个R a取代，其他变量如本发明所定义。
本发明的一些方案中，上述R 1选自H、CH 3和
Figure PCTCN2021079579-appb-000006
其他变量如本发明所定义。
本发明的一些方案中，上述R 2选自
Figure PCTCN2021079579-appb-000007
其他变量如本发明所定义。
本发明的一些方案中，上述R 3选自H和NO 2，其他变量如本发明所定义。
本发明的一些方案中，上述化合物选自
Figure PCTCN2021079579-appb-000008
其中，R 1、R 2和R 3如本发明所定义。
本发明的一些方案中，其化合物选自
Figure PCTCN2021079579-appb-000009
其中，
T为N时，
Figure PCTCN2021079579-appb-000010
选自单键；
T为C时，
Figure PCTCN2021079579-appb-000011
选自双键；
R 1、R 2、R 3和L 1如本发明所定义。
本发明的一些方案中，其化合物选自
Figure PCTCN2021079579-appb-000012
其中，R 1、R 2和R 3如本发明所定义。
本发明的一些方案中，其化合物选自
Figure PCTCN2021079579-appb-000013
其中，R 1、R 2和R 3如本发明所定义。
本发明的一些方案中，上述结构单元
Figure PCTCN2021079579-appb-000014
选自
Figure PCTCN2021079579-appb-000015
Figure PCTCN2021079579-appb-000016
其他变量如本发明所定义。
本发明的一些方案中，上述结构单元
Figure PCTCN2021079579-appb-000017
选自
Figure PCTCN2021079579-appb-000018
Figure PCTCN2021079579-appb-000019
其他变量如本发明所定义。
本发明的一些方案中，上述结构单元
Figure PCTCN2021079579-appb-000020
选自
Figure PCTCN2021079579-appb-000021
Figure PCTCN2021079579-appb-000022
其他变量如本发明所定义。
本发明的一些方案中，上述结构单元
Figure PCTCN2021079579-appb-000023
选自
Figure PCTCN2021079579-appb-000024
Figure PCTCN2021079579-appb-000025
其他变量如本发明所定义。
本发明还有一些方案由上述变量任意组合而来。
本发明还提供了下式所示化合物或其药学上可接受的盐。
Figure PCTCN2021079579-appb-000026
Figure PCTCN2021079579-appb-000027
本发明的一些方案中，上述化合物或其药学上可接受的盐在制备Bcl-2抑制剂相关药物上的应用。
本发明的一些方案中，上述Bcl-2相关药物是用于治疗恶性血液瘤及实体瘤的药物。
技术效果
本发明化合物，相对于抗细胞凋亡Bcl-2蛋白及抗细胞凋亡Bcl-xL蛋白，展示了较高的选择性，且在抑制抗细胞凋亡Bcl-2蛋白活性方面具有显著作用；在人、SD大鼠、CD-1小鼠和比格犬的肝微粒体代谢稳定性较好，且种属差异小；在CD-1小鼠体内有良好的药代动力学性质，支持口服给药途径；对RS4；11细胞的分裂增殖有显著的抑制作用，并且能显著抑制肿瘤生长。相关药物可用于治疗多种疾病,如恶性血液瘤、实体瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病及神经退行性疾病等，尤其在治疗肿瘤疾病中具有较大的应用前景。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相 对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机胺或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。
本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。
除非另有说明，术语“对映异构体”或者“旋光异构体”是指互为镜像关系的立体异构体。
除非另有说明，术语“顺反异构体”或者“几何异构体”系由因双键或者成环碳原子单键不能自由旋转而引起。
除非另有说明，术语“非对映异构体”是指分子具有两个或多个手性中心，并且分子间为非镜像的关系的立体异构体。
除非另有说明，“(+)”表示右旋，“(-)”表示左旋，“(±)”表示外消旋。
除非另有说明，用楔形实线键
Figure PCTCN2021079579-appb-000028
和楔形虚线键
Figure PCTCN2021079579-appb-000029
表示一个立体中心的绝对构型，用直形实线键
Figure PCTCN2021079579-appb-000030
和直形虚线键
Figure PCTCN2021079579-appb-000031
表示立体中心的相对构型，用波浪线
Figure PCTCN2021079579-appb-000032
表示楔形实线键
Figure PCTCN2021079579-appb-000033
或楔形虚线键
Figure PCTCN2021079579-appb-000034
或用波浪线
Figure PCTCN2021079579-appb-000035
表示直形实线键
Figure PCTCN2021079579-appb-000036
或直形虚线键
Figure PCTCN2021079579-appb-000037
除非另有说明，术语“富含一种异构体”、“异构体富集”、“富含一种对映体”或者“对映体富集”指其中一种异构体或对映体的含量小于100％，并且，该异构体或对映体的含量大于等于60％，或者大于等于70％，或者大于等于80％，或者大于等于90％，或者大于等于95％，或者大于等于96％，或者大于等于97％，或者大于等于98％，或者大于等于99％，或者大于等于99.5％，或者大于等于99.6％，或者大于等于99.7％，或者大于等于99.8％，或者大于等于99.9％。
除非另有说明，术语“异构体过量”或“对映体过量”指两种异构体或两种对映体相对百分数之间的差值。例如，其中一种异构体或对映体的含量为90％，另一种异构体或对映体的含量为10％，则异构 体或对映体过量(ee值)为80％。
可以通过的手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚( 3H)，碘-125( 125I)或C-14( 14C)。又例如，可用重氢取代氢形成氘代药物，氘与碳构成的键比普通氢与碳构成的键更坚固，相比于未氘化药物，氘代药物有降低毒副作用、增加药物稳定性、增强疗效、延长药物生物半衰期等优势。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，取代基可以包括重氢和氢的变体，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为氧(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代。氧取代不会发生在芳香基上。术语“任选被取代的”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。
当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被0-2个R所取代，则所述基团可以任选地至多被两个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
当一个连接基团的数量为0时，比如-(CRR) 0-，表示该连接基团为单键。
当一个取代基数量为0时，表示该取代基是不存在的，比如-A-(R) 0表示该结构实际上是-A。
当一个取代基为空缺时，表示该取代基是不存在的，比如A-X中X为空缺时表示该结构实际上是A。
当其中一个变量选自单键时，表示其连接的两个基团直接相连，比如A-L-Z中L代表单键时表示该结构实际上是A-Z。
当一个取代基的键可以交叉连接到一个环上的两一个以上原子时，这种取代基可以与这个环上的任意原子相键合，例如，结构单元
Figure PCTCN2021079579-appb-000038
表示其取代基R可在环己基或者环己二烯上的任意一个位置发生取代。当所列举的取代基中没有指明其通过哪一个原子连接到被取代的基团上时，这种取代基可以通过其任何原子相键合，例如，吡啶基作为取代基可以通过吡啶环上任意一个碳原子连接到被取代的基团上。
当所列举的连接基团没有指明其连接方向，其连接方向是任意的，例如，
Figure PCTCN2021079579-appb-000039
中 连接基团L为-M-W-，此时-M-W-既可以按与从左往右的读取顺序相同的方向连接环A和环B构成
Figure PCTCN2021079579-appb-000040
也可以按照与从左往右的读取顺序相反的方向连接环A和环B构成
Figure PCTCN2021079579-appb-000041
所述连接基团、取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
除非另有规定，当某一基团具有一个或多个可连接位点时，该基团的任意一个或多个位点可以通过化学键与其他基团相连。当该化学键的连接方式是不定位的，且可连接位点存在H原子时，则连接化学键时，该位点的H原子的个数会随所连接化学键的个数而对应减少变成相应价数的基团。所述位点与其他基团连接的化学键可以用直形实线键
Figure PCTCN2021079579-appb-000042
直形虚线键
Figure PCTCN2021079579-appb-000043
或波浪线
Figure PCTCN2021079579-appb-000044
表示。例如-OCH 3中的直形实线键表示通过该基团中的氧原子与其他基团相连；
Figure PCTCN2021079579-appb-000045
中的直形虚线键表示通过该基团中的氮原子的两端与其他基团相连；
Figure PCTCN2021079579-appb-000046
中的波浪线表示通过该苯基基团中的1和2位碳原子与其他基团相连；
Figure PCTCN2021079579-appb-000047
表示该哌啶基上的任意可连接位点可以通过1个化学键与其他基团相连，至少包括
Figure PCTCN2021079579-appb-000048
这4种连接方式，即使-N-上画出了H原子，但是
Figure PCTCN2021079579-appb-000049
仍包括
Figure PCTCN2021079579-appb-000050
这种连接方式的基团，只是在连接1个化学键时，该位点的的H会对应减少1个变成相应的一价哌啶基。
除非另有规定，术语“C 1-3烷基”用于表示直链或支链的由1至3个碳原子组成的饱和碳氢基团。所述C 1-3烷基包括C 1-2和C 2-3烷基等；其可以是一价(如甲基)、二价(如亚甲基)或者多价(如次甲基)。C 1-3烷基的实例包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(包括n-丙基和异丙基)等。
除非另有规定，C n-n+m或C n-C n+m包括n至n+m个碳的任何一种具体情况，例如C 1-12包括C 1、C 2、C 3、C 4、C 5、C 6、C 7、C 8、C 9、C 10、C 11、和C 12，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如C 1- 12包括C 1-3、C 1-6、C 1-9、C 3-6、C 3-9、C 3-12、C 6-9、C 6-12、和C 9-12等；同理，n元至n+m元表示环上原子数为n至n+m个，例如3-12元环包括3元环、4元环、5元环、6元环、7元环、8元环、9元环、10元环、11元环、和12元环，也包括n至n+m中的任何一个范围，例如3-12元环包括3-6元环、3-9元环、5-6元环、5-7元环、6-7元环、6-8元环、和6-10元环等
除非另有说明，当化合物中存在双键结构，如碳碳双键、碳氮双键和氮氮双键，且双键上的各个原子均连接有两个不同的取代基时(包含氮原子的双键中，氮原子上的一对孤对电子视为其连接的一 个取代基)，如果该化合物中双键上的原子与其取代基之间用
Figure PCTCN2021079579-appb-000051
表示，则表示该化合物的(Z)型异构体、(E)型异构体或两种异构体的混合物。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
本发明的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的常规方法来确认结构，如果本发明涉及化合物的绝对构型，则该绝对构型可以通过本领域常规技术手段予以确证。例如单晶X射线衍射法(SXRD)，把培养出的单晶用Bruker D8 venture衍射仪收集衍射强度数据，光源为CuKα辐射，扫描方式：
Figure PCTCN2021079579-appb-000052
扫描，收集相关数据后，进一步采用直接法(Shelxs97)解析晶体结构，便可以确证绝对构型。
本发明所使用的溶剂可经市售获得。
本发明采用下述缩略词：eq代表当量；Pd 2(dba) 3代表三(二亚苄叉丙酮)二钯；Xantphos代表4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽；BAK代表Bcl-2同源拮抗剂；BAD代表Bcl-2相关的细胞死亡激动剂；Noxa代表Phorbol-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯诱导的蛋白；GST代表谷胱甘肽-S转移酶；HTRF代表均相时间分辨荧光；FAM代表荧光素标记；EDTA代表乙二胺四乙酸；Tritonx-100代表曲拉通X-100；DMSO代表二甲基亚砜；CD 3OD代表氘代甲醇；prep-HPLC代表高效液相制备；RBC代表反应生物学公司(Reaction Biology Corporation)；ATP代表三磷酸腺苷；MCL代表髓细胞白血病；ABT代表艾伯维公司；RS4；11代表一种急性淋巴白血病肿瘤细胞株；CTG代表发光活细胞检测系统；Bn代表苄基；SEM代表2-(三甲基硅烷基)乙氧甲基；ACN代表乙腈；CO 2代表二氧化碳；NADPH代表烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；RFU表示测量荧光。
化合物依据本领域常规命名原则或者使用
Figure PCTCN2021079579-appb-000053
软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
实施例1
Figure PCTCN2021079579-appb-000054
步骤1：化合物1-2合成
在-78℃条件下，向化合物1-1(2克,7.11毫摩尔)的四氢呋喃(20毫升)溶液中缓慢加入乙烯基溴化镁(24.8毫升，1M)。滴完后，反应液在-40℃条件下搅拌3小时。反应结束后，将混合物倒入饱和氯化铵水溶液(50毫升)中，在25℃下搅拌10分钟，乙酸乙酯萃取(50毫升×3次)，有机相用饱和食盐水(30毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，再通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝50/1至3/1)纯化得到化合物1-2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δppm 6.60-6.71(m,1H),7.91(t,J＝2.87Hz,1H),7.97-8.07(m,1H),12.65(br s,1H)。
步骤2：化合物1-3合成
向化合物1-2(359毫克，1.30毫摩尔)的DMSO(44毫升)溶液中加入碳酸钾(360.21毫克，2.61毫摩尔)和化合物1-9(300.18毫克，2.61毫摩尔)，反应液在110℃条件下搅拌16小时。反应结束后，将混合物倒入水(80毫升)中，乙酸乙酯萃取(50毫升×3次)，有机相用饱和食盐水(30毫升)洗 涤，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到残余物，再通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5/1至1/1)纯化得到化合物1-3。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δppm 1.31(qd,J＝12.26,4.38Hz,2H),1.67(br dd,J＝12.76,1.50Hz,2H),1.90(ddt,J＝11.02,7.24,3.75,3.75Hz,1H),3.33(s,2H),3.74(t,J＝6.13Hz,2H),3.87(br dd,J＝11.38,3.00Hz,2H),6.45-6.51(m,1H),7.66(t,J＝2.81Hz,1H),7.87(s,1H),9.06(br t,J＝5.19Hz,1H),11.71-12.05(m,1H)。
步骤3：化合物1-4合成
将化合物1-3(410毫克，1.16毫摩尔)，卞硫醇(215.66毫克，1.74毫摩尔)，N,N-二异丙基乙胺(448.80毫克,3.47毫摩尔)，Pd 2(dba) 3(106.0毫克,0.12毫摩尔)和Xantphos(133.96毫克,0.23毫摩尔)的甲苯(4毫升)混合物用氮气置换3次，然后混合物在氮气气氛下在110℃搅拌16小时。将反应混合物倒入水(20毫升)中，用乙酸乙酯萃取(30毫升×3次)。有机相用饱和食盐水(30毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到残余物，再通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝4/1至1/2)纯化得到化合物1-4。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝11.80-11.64(m,1H),9.13(t,J＝5.3Hz,1H),7.64-7.63(m,1H),7.62(d,J＝2.8Hz,1H),7.28(br d,J＝2.9Hz,5H),6.60-6.58(m,1H),4.14-4.13(m,2H),3.90-3.85(m,2H),3.76-3.73(m,2H),3.32-3.29(m,2H),1.92-1.88(m,1H),1.69-1.65(m,2H),1.32(br dd,J＝3.8,12.4Hz,2H)。
步骤4：化合物1-5合成
在0℃下，向化合物1-4(200毫克，0.50毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(2毫升)溶液中分批加入钠氢(44.28毫克，1.11毫摩尔,60％纯度)并搅拌0.5小时。然后在0℃下滴加2-(三甲基硅)乙氧基甲基氯(100.66毫克，603.79微摩尔，106.86微升)，并将混合物在0℃下搅拌3小时，然后升温至28℃。将混合物再搅拌12小时。用水(100毫升)稀释混合物，然后用乙酸乙酯(100毫升×2)萃取。有机相用饱和氯化铵溶液(40毫升)和饱和食盐水(30毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。再通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝25/1至1/1)纯化得到化合物1-5。
MS(ESI)m/z:528[M+H] +。
步骤5：化合物1-6合成
在0℃下，向化合物1-5(20毫克，37.90微摩尔)的乙腈(1毫升)，乙酸(0.2毫升)和水(0.4毫升)溶液中分批加入N-氯代丁二酰亚胺(15.18毫克，113.69微摩尔)，并在0℃下搅拌2小时。再在20℃下补加氯代丁二酰亚胺(0.2克)并搅拌1小时。0℃下，将反应混合物在滴加到氨水(2.3毫升，25％纯度)中，搅拌1小时后用水(10毫升)稀释，并用混合溶剂(乙酸乙酯/乙醇＝5/1，15毫升×3)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到残余物。向混合物中加入乙酸乙酯(3毫升)，并在20℃下打浆1小时，过滤，收集滤饼并真空干燥后得到化合物1-6。
MS(ESI)m/z:485[M+H] +。
步骤6：化合物1-8合成
向化合物1-6(20毫克，41.27微摩尔)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(9.49毫克，49.52 微摩尔)和4-二甲氨基吡啶(10.08毫克，82.54微摩尔)的二氯甲烷(2毫升)溶液中加入化合物1-7(25.93毫克，45.39微摩尔)和三乙胺(8.35毫克，82.54微摩尔)。将混合物在40℃下搅拌16小时。将混合物减压浓缩，再通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1至10/1)纯化得到化合物1-8。步骤7：化合物1合成
向化合物1-8(30毫克，19微摩尔)的二氯甲烷(0.3毫升)溶液中加入三氟乙酸(0.3毫升)。然后将混合物在20℃下搅拌16小时。然后将混合物在真空下浓缩并溶于甲醇(0.6毫升)，加入碳酸钾(5.3毫克，38微摩尔)，再将混合物在28℃下搅拌1小时。将混合物用二氯甲烷/甲醇(10/1，60毫升)稀释。然后将混合物用饱和氯化铵(15毫升)和饱和食盐水(10毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。粗品通过prep_HPLC(三氟乙酸体系)(色谱柱：Phenomenex luna C18 150*25mm*10μm；流动相：[水(0.225％三氟乙酸)-乙腈]；B(乙腈)％：40％-70％，8min)纯化得化合物1(三氟乙酸盐)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δppm 0.91(s,6H),1.35-1.39(m,2H),1.41-1.49(m,2H),1.68(br d,J＝11.86Hz,2H),1.97-2.02(m,4H),2.06(s,1H),2.14(br d,J＝4.16Hz,6H),2.69-2.71(m,1H),2.99(br s,2H),3.67-3.79(m,4H),3.79-3.96(m,4H),5.28-5.39(m,2H),6.08-6.19(m,1H),6.34-6.45(m,1H),6.60-6.65(m,1H),6.77-6.85(m,1H),7.01-7.05(m,2H),7.16-7.25(m,1H),7.31-7.35(m,2H),7.50(br s,2H),7.94-8.03(m,1H),8.25-8.47(m,1H),9.18-9.26(m,1H),11.60-11.72(m,1H)。
实施例2
Figure PCTCN2021079579-appb-000055
步骤1：化合物2-2合成
向化合物2-1(3.3克，12.41毫摩尔)的四氢呋喃(40毫升)溶液中加入原甲酸三甲酯(1.98克，18.61毫摩尔，2.04毫升)和对甲苯磺酸(213.69毫克，1.24毫摩尔)。将混合物在25℃下搅拌10分钟后过滤，收集滤饼并真空干燥后得到化合物2-2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝13.23(br s,1H),8.41(s,1H),7.39(s,2H)。
步骤2：化合物2-3合成
在0℃下，向化合物2-2(200毫克，724.83微摩尔)的硫酸(1.2毫升，98％)溶液中添加硝酸钾(87.94毫克，869.79微摩尔)。将该混合物在0℃下搅拌1小时。将混合物倒入冰水(5毫升)和氨水(5毫升)的混合物中，过滤，收集滤饼并减压干燥后得到化合物2-3。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝13.46(br s,1H),8.63(s,1H),8.17(s,1H)。
步骤3：化合物2-4合成
向化合物2-3(1.8克，5.61毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(18毫升)溶液中加入碳酸钾(2.33克，16.83毫摩尔)和(四氢-2H-吡喃-4-基)甲胺(1.94克，16.83毫摩尔)。将混合物在120℃搅拌16小时。将反应混合物倒入水(200毫升)中析出固体，过滤，收集滤饼并真空干燥，得到化合物2-4。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ＝9.27(br s,2H),8.27(s,1H),7.87(s,1H),4.13(t,J＝6.5Hz,2H),3.94(br dd,J＝3.8,10.9Hz,2H),3.33(dt,J＝2.0,11.8Hz,2H),1.96-1.83(m,1H),1.71(br d,J＝12.5Hz,2H),1.44-1.35(m,1H),1.34(br s,1H)。
步骤4：化合物2-5合成
将化合物2-4(700毫克，1.97毫摩尔，1eq)，卞硫醇(489.56毫克，3.94毫摩尔，461.85微升，2eq)，N,N-二异丙基乙胺(764.13毫克，5.91毫摩尔，1.0毫升)，Pd 2(dba) 3(180.47毫克，197.08微摩尔)和Xantphos(228.07毫克，394.16微摩尔)的甲苯(7毫升)溶液用氮气置换3次，然后将反应液在氮气气氛下在110℃搅拌16小时。将反应混合物倒入水(20毫升)中，用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。有机相用饱和食盐水(30毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到残余物，再通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝20/1至3/1)纯化得到化合物2-5。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ＝9.39(br s,1H),8.82(br s,1H),8.34(s,1H),7.60(s,1H),7.22(dd,J＝1.9,4.9Hz,3H),7.12-7.06(m,2H),4.22(t,J＝6.5Hz,2H),4.03(dd,J＝3.3,11.0Hz,2H),3.92(s,2H),3.42(dt,J＝2.0,11.8Hz,2H),2.05-1.93(m,1H),1.80(br dd,J＝1.8,12.9Hz,2H),1.54-1.42(m,2H)。
步骤5：化合物2-6合成
在0℃下，向化合物2-5(850毫克，2.13毫摩尔，1eq)的乙腈(32毫升)，乙酸(0.4毫升)和水(0.8毫升)溶液中分批加入N-氯代丁二酰亚胺(854.52毫克，6.40毫摩尔)，并在0℃下搅拌2小时，再在20℃下补加N-氯代丁二酰亚胺(0.2克)并搅拌1小时。0℃下，将反应混合物在滴加到氨水(27.30克，194.75毫摩尔，30.00毫升，25％纯度)中，搅拌1小时。用水(20毫升)稀释，并用混合溶剂(乙酸乙酯/乙醇＝5/1,50毫升×4)萃取。合并的有机层用盐水(20毫升×2)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到残余物。向混合物中加入乙酸乙酯(10毫升)，并在20℃下搅拌1小时，过滤，收集滤饼并真空干燥后得到化合物2-6。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝11.43(br s,2H),9.40(t,J＝6.3Hz,1H),8.38(s,1H),8.28-8.13(m,1H),6.13(br s,1H),4.27(t,J＝6.6Hz,2H),3.85(br dd,J＝3.1,11.3Hz,2H),3.26-3.23(m,2H),2.01-1.87(m,1H),1.64(br d,J＝11.2Hz,2H),1.37-1.22(m,2H)。
步骤6：化合物2合成
向化合物2-6(30毫克，84.42微摩尔)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(19.42毫克， 101.30微摩尔)和4-二甲氨基吡啶(20.63毫克，168.84微摩尔，)的二氯甲烷(2毫升)溶液中加入化合物1-7(48.21毫克，84.42微摩尔)和三乙胺(17.08毫克，168.84微摩尔，23.50微升)。将混合物在40℃下搅拌16小时。将混合物减压浓缩，再通过prep_HPLC(酸性体系)(色谱柱：Unisil 3-100 C18 Ultra 150*50mm*3μm；流动相：[水(0.225％三氟乙酸)-乙腈]；B(乙腈)％：40％-60％，10min)纯化得到化合物2(三氟乙酸盐)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝11.63(br s,1H),9.37(br s,1H),8.43(br s,1H),8.20-7.91(m,2H),7.66-7.22(m,6H),7.04(br d,J＝7.5Hz,2H),6.63(br d,J＝7.5Hz,2H),6.36(br s,1H),6.17(br s,1H),4.22(br s,2H),3.84(br d,J＝8.9Hz,2H),3.22-3.17(m,2H),3.03(br s,3H),2.74(br s,2H),2.19(br s,6H),1.95(br s,3H),1.64(br d,J＝10.8Hz,2H),1.41-1.20(m,5H),0.92(br s,6H)。
实施例3
Figure PCTCN2021079579-appb-000056
步骤1：化合物3-2合成
向化合物3-1(5克，30.84毫摩尔)的甲醇(200毫升)的溶液中加入N-溴代丁二酰亚胺(5.49克，30.84毫摩尔)，在28℃下搅拌1小时。将反应液过滤，滤饼用甲醇洗涤3次，合并滤液，减压浓缩后得到化合物3-2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝11.10(s,1H),7.51(d,J＝8.8Hz,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),6.56(br s,2H)。
步骤2：化合物3-3合成
在-78℃条件下，向化合物3-2(3.5克，14.52毫摩尔)的四氢呋喃(300毫升)的溶液中滴加二异丁基氢化铝(1M,72.60毫升)，在28℃下搅拌16小时。将反应液倒入50毫升水中，用乙酸乙酯萃取(150毫升×3)，用饱和食盐水洗(100毫升)，无水硫酸钠干燥，并减压浓缩后得到化合物3-3。
LCMS(ESI)m/z:243/245[M+H] +。
步骤3：化合物3-4合成
在0℃条件下，向化合物3-3(3.5克,14.4毫摩尔)的三氟乙酸(20毫升)溶液中加入三乙基硅烷(3.35克，28.8毫摩尔)，在0℃下搅拌2小时，将反应液倒入20毫升饱和碳酸氢钠溶液中，室温搅拌0.5小时后过滤，收集滤饼并真空干燥后得到化合物3-4。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝8.34(s,1H),7.29(d,J＝8.6Hz,1H),6.52(d,J＝8.5Hz,1H),6.16(s,2H),4.10(s,2H)。
步骤4：化合物3-5合成
向化合物3-4(1.6克,2.05毫摩尔)和化合物3-9(1.45克，12.68毫摩尔)的二氯乙烷(30毫升)溶液中缓慢加入醋酸硼氢化钠(2.99克,14.09毫摩尔)和醋酸(2.42毫升)。在25℃下搅拌16小时。将反应液倒入30毫升水中，用二氯甲烷(30毫升x3)萃取，用饱和食盐水(20毫升)洗，最后用无水硫酸钠干燥。有机相浓缩后得到粗品，经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝25/1至5/1)纯化得到化合物3-5。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝8.49(s,1H),7.42(d,J＝8.8Hz,1H),6.84(t,J＝6.1Hz,1H),6.61(d,J＝8.8Hz,1H),4.16(s,2H),3.85(br dd,J＝3.0,11.3Hz,2H),3.27(dt,J＝1.9,11.7Hz,2H),3.10(t,J＝6.5Hz,2H),1.86-1.73(m,1H),1.60(br dd,J＝1.8,12.7Hz,2H),1.23(dq,J＝4.6,12.3Hz,2H)。
步骤5：化合物3-6合成
在0℃条件下，向化合物3-5(0.76克,2.34毫摩尔)的四氢呋喃(15毫升)的溶液中分批加入钠氢(525.30毫克，13.13毫摩尔，60％纯度)并搅拌0.5小时，再加入化合物对甲氧基卞溴(0.8克,5.1毫摩尔)，在25℃下搅拌16小时，再继续在55℃下搅拌16小时。将反应液20毫升水中，用乙酸乙酯萃取(50毫升x3)，用饱和食盐水(30毫升)洗涤，最后用无水硫酸钠干燥。有机相浓缩后得到粗品，经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2/1至1/2)得到化合物3-6。
LCMS(ESI)m/z:445/447[M+H] +。
步骤6：化合物3-7合成
将化合物3-6(200.00毫克，449.09微摩尔)，苄硫醇(83.67毫克，673.63微摩尔)，Pd 2(dba) 3(41.12毫克，44.91微摩尔)，Xantphos(51.97毫克，89.82微摩尔)和二异丙基乙基胺(174.12毫克，1.35毫摩尔)的甲苯(4毫升)混合物用氮气置换3次，然后将混合物在氮气气氛下在110℃搅拌16小时。将反应混合物倒入水(10毫升)中，混合物用乙酸乙酯(10毫升×3)萃取。有机相用饱和食盐水(20毫升)洗涤，经无水无水硫酸钠干燥，过滤滤液减压浓缩，残留物通过硅胶柱层析法(石油醚/乙酸乙酯＝1/0至5/1)纯化得到化合物3-7。
MS(ESI)m/z:489[M+H] +。
步骤7：化合物3-8合成
在0℃下，向化合物3-7(150毫克，306.97微摩尔)，乙腈(3毫升)，醋酸(0.3毫升)和水(0.6毫升)混合物中分批加入的N-氯代丁二酰亚胺(122.97毫克，920.92微摩尔)。将该混合物在25℃下搅拌32小时。然后将反应混合物加入到氨水(5.46克，38.94毫摩尔，6.00毫升，25％纯度)中并将混合物在25℃搅拌2小时。将反应混合物用水(30毫升)稀释，并用乙酸乙酯(30毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(30毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液减压浓缩得到残余物，再通过薄层色谱法纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝1/2)得到化合物3-8。
MS(ESI)m/z:446[M+H] +。
步骤8：化合物3合成
向二氯甲烷(10毫升)中加入化合物3-8(0.03克，0.067毫摩尔)，化合物1-7(0.038克，0.067毫摩尔)，4-二甲氨基吡啶(0.016克，0.13毫摩尔)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.016克，0.08毫摩尔)，三乙胺(0.014克,0.13毫摩尔)，在30℃下搅拌16小时。将反应液倒入20毫升水中，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取，用饱和食盐水(20毫升×2)洗，最后用无水硫酸钠干燥。有机相浓缩后得到粗品，通过prep-HPLC(色谱柱:Phenomenex Gemini-NX C18 75*30mm*3μm；流动相:[水(0.1％三氟乙酸)-乙腈]；B(乙腈)％:52％-62％,7分钟)分离得到化合物3(三氟乙酸盐)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝11.79(s,1H),11.57(br s,1H),9.43(br s,1H),8.07(d,J＝2.6Hz,1H),7.65(d,J＝8.9Hz,1H),7.62-7.51(m,3H),7.45(d,J＝8.8Hz,1H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(t,J＝8.6Hz,4H),6.94-6.81(m,2H),6.75-6.62(m,2H),6.44(dd,J＝1.9,3.4Hz,1H),6.22(d,J＝2.0Hz,1H),4.43(s,3H),3.91-3.81(m,2H),3.72(s,3H),3.68-3.51(m,4H),3.28(br dd,J＝10.1,11.5Hz,3H),3.21-3.15(m,2H),3.03(br s,2H),2.74(br s,2H),2.20(br s,2H),2.02(br s,2H),1.82(dtt,J＝3.6,7.1,11.0Hz,1H),1.68-1.56(m,2H),1.45(br t,J＝6.1Hz,2H),1.34-1.19(m,3H),0.94(s,6H)。MS(ESI)m/z:998[M+H] +。
实施例4
Figure PCTCN2021079579-appb-000057
步骤1：化合物4-1合成
在0℃下，向化合物1-7(3克，5.25毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(30毫升)溶液中分批加入钠氢(525.30毫克，13.13毫摩尔，60％纯度)中并搅拌0.5小时。然后在0℃下滴加2-(三甲基硅)乙氧基甲基氯(1.84克，11.03毫摩尔，1.95毫升)，并将混合物在0℃下搅拌3小时，然后升温至28℃。将混合物再搅拌12小时。用水(100毫升)稀释混合物，然后用乙酸乙酯(100毫升×2)萃取。有机相用饱和氯化铵溶液(40毫升)和饱和食盐水(30毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。再通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1/1)纯化得到化合物4-1。
MS(ESI)m/z:701[M+H] +。
步骤2：化合物4-2合成
向化合物4-1(400毫克，570.31微摩尔)的甲苯(8毫升)溶液中加入三乙胺(173.13毫克，1.71毫摩尔，238.14微升)和叠氮磷酸二苯酯(204.04毫克，741.41微摩尔，160.66微升)。然后将混合物在45℃下搅拌12小时。然后加入乙醇(131.37毫克，2.85毫摩尔，166.71微升)，并在70℃下搅拌3小时，然后加入氢氧化钾(319.98毫克，5.70毫摩尔)和乙醇(2.5毫升)并在90℃下搅拌12小时。将混合物用乙酸乙酯(30毫升)稀释，然后用饱和氯化铵溶液(15毫升)，饱和食盐水(10毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。残余物通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝12/1至6/1)纯化得到化合物4-2。
MS(ESI)m/z:672[M+H] +。
步骤3：化合物4-3合成
在0℃下，向化合物2-5(56.82毫克，125.48微摩尔)的乙腈(0.80毫升)，水(0.02毫升)和醋酸(0.01毫升)溶液中分批加入N-氯代丁二酰亚胺(58.64毫克，439.17微摩尔)，并搅拌1小时。然后将混合物升温至28℃并再搅拌2小时。然后将混合物滴加到搅拌的化合物4-2(75.93毫克，112.93微摩尔)和吡啶(49.63毫克，627.39微摩尔，50.64微升)的乙腈(1.6毫升)溶液中。并在28℃下再搅拌12小时。将混合物在真空下浓缩，用二氯甲烷(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)溶解，用饱和氯化铵(10毫升)，饱和食盐水(10毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将粗品通过薄层色谱板(硅胶，石油醚/乙酸乙酯/二氯甲烷＝1/7/1.5)分离纯化得到化合物4-3。
MS(ESI)m/z:1010[M+H] +。
步骤4：化合物4合成
向化合物4-3(30毫克，29.68微摩尔)的二氯甲烷(0.3毫升)溶液中加入三氟乙酸(0.3毫升)。然后将混合物在28℃下搅拌8小时。然后将混合物在真空下浓缩并溶于甲醇(0.6毫升)，加入碳酸钾(20.51毫克，148.41微摩尔)，再将混合物在28℃下搅拌1小时。将混合物用二氯甲烷/甲醇(10/1，30毫升)稀释。然后将混合物用饱和氯化铵(10毫升×2)，饱和食盐水(10毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。残余物通过prep_HPLC(三氟乙酸体系)(色谱柱：Phenomenex luna C18 150*25mm*10μm；流动相：[水(0.1％三氟乙酸-乙腈]；B(乙腈)％：39％-69％，10min)纯化得化合物4(三氟乙酸盐)。
1H NMR(400MHz,CD 3OD)δ＝8.11(s,1H),7.78(s,1H),7.42(d,J＝8.9Hz,1H),7.30(d,J＝3.4Hz,1H),7.28-7.21(m,2H),6.95(d,J＝8.4Hz,2H),6.67-6.59(m,2H),6.15(d,J＝3.4Hz,2H),6.04(d,J＝2.3Hz,1H),3.91-3.80(m,4H),3.53(s,3H),3.35-3.25(m,4H),2.89-2.58(m,4H),2.12(br t,J＝6.0Hz,2H),1.99(br s,2H),1.88-1.77(m,1H),1.64-1.55(m,2H),1.45(br t,J＝6.1Hz,2H),1.32-1.16(m,3H),0.89(s,6H)。MS(ESI)m/z:880[M+H] +。
实施例5
Figure PCTCN2021079579-appb-000058
步骤1：化合物5-3合成
往N,N-二甲基甲酰胺(100毫升)中加入化合物5-1(10克，42.91毫摩尔)，化合物5-2(5.76克，42.91毫摩尔)和磷酸钾(18.22克，85.82毫摩尔)。反应液在100℃下搅拌3小时。反应液用水(500毫升)淬灭，乙酸乙酯(200毫升)萃取三次。合并有机相，干燥，过滤浓缩后得到化合物5-3。
MS-ESI(m/z):346.9[M+H] +。
步骤2：化合物5-4合成
往四氢呋喃(150毫升)中加入化合物5-3(14克，40.33毫摩尔)。0℃下加入纯度60％的钠氢(2.1克,52.42毫摩尔)并且搅拌0.5小时。加入2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯(10.76克，64.52毫摩尔)。反应液在0℃下搅拌1小时。反应液用饱和氯化铵水溶液(200毫升)淬灭，乙酸乙酯(150毫升)萃取三次。合并有机相干燥，过滤浓缩后得到化合物5-4。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝8.15(d,J＝2.5Hz,1H),7.79(d,J＝8.5Hz,1H),7.73(dd,J＝3.0,4.5Hz,2H),7.44(dd,J＝1.8,8.5Hz,1H),7.00(d,J＝1.8Hz,1H),6.53(d,J＝3.5Hz,1H),5.63(s,2H),3.79(s,3H),3.55-3.50(m,2H),0.80(d,J＝7.8Hz,2H),0.12(s,9H)。
步骤3：化合物5-6合成
往1,4-二氧六环(200毫升)和水(50毫升)中加入化合物5-4(12克，25.13毫摩尔)，化合物5-5(9.33克，30.13毫摩尔)，1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁二氯化钯(919.57毫克，1.26毫摩尔)和碳酸钾(6.95克，50.27毫摩尔)。反应液在氮气保护下升温至100℃下搅拌16小时。反应液用二氯甲烷(200毫升)稀释，用水(200毫升)洗涤，有机相干燥，过滤浓缩后通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝20/1至3/1)得到化合物5-6。
MS-ESI(m/z):580.5[M+H] +。
步骤4：化合物5-7合成
往甲苯(150毫升)中加入化合物5-6(4克，6.90毫摩尔)和硅胶(41.45克,689.94毫摩尔)。反应液在120℃下搅拌16小时。反应液过滤，滤液浓缩后通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝100/1至10/1)得到化合物5-7。
MS-ESI(m/z):480.5[M+H] +。
步骤5：化合物5-9合成
向乙醇(40毫升)中加入化合物5-7(2克，4.17毫摩尔)，化合物5-8(1.14克，4.59毫摩尔)和氯化锌(568.32毫克，195.3微摩尔)。在25℃下搅拌30分钟后加入氰基硼氢化钠(786.11毫克，12.51毫摩尔)。反应在50℃下搅拌2小时。反应液用水(100毫升)淬灭，二氯甲烷(100毫升)萃取三次。合并有机相干燥，过滤，浓缩后通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝15/1至1/1)得到化合物5-9。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ＝8.25(d,J＝2.5Hz,1H),7.93(d,J＝8.3Hz,1H),7.53(d,J＝2.5Hz,1H),7.43(d,J＝3.5Hz,1H),7.29(s,1H),7.19(dd,J＝1.5,8.0Hz,1H),7.02(d,J＝8.5Hz,2H),6.92(d,J＝1.5Hz,1H),6.50(d,J＝3.5Hz,1H),6.05(br s,1H),5.72(s,2H),3.90(s,3H),3.66-3.58(m,2H),2.98-2.89(m,4H),2.45(br d,J＝4.8Hz,2H),2.41(br s,2H),2.27(br s,2H),2.05(s,2H),1.62(s,3H),1.49(t,J＝6.4Hz,2H),1.03-1.00(m,6H),0.04(s,9H)。
步骤6：化合物5-10合成
向甲醇(10毫升)，四氢呋喃(10毫升)和水(5毫升)中加入化合物5-9(1.4克，1.97毫摩尔)和一水合氢氧化锂(247.4毫克，5.9毫摩尔)。反应在50℃下搅拌16小时。反应液用1N盐酸调节至pH＝6，二氯甲烷(30毫升)萃取三次。合并有机相干燥，过滤，浓缩后得到化合物5-10。
MS-ESI(m/z):698.8[M+H] +。
步骤7：化合物5-11合成
向二氯甲烷(20毫升)中加入化合物5-10(900毫克，1.29毫摩尔)，化合物2-6(503.77毫克，1.42毫摩尔)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(494.10毫克，2.58毫摩尔)，4-二甲氨基吡啶(314.88毫克，2.58毫摩尔)和三乙胺(260.81毫克，2.58毫摩尔)。反应在50℃下搅拌2小时。反应液用水(30毫升)淬灭，二氯甲烷(20毫升)萃取三次。有机相合并浓缩后得到的粗品，通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝12/1至1/2得到化合物5-11。
MS-ESI(m/z):1035.6[M+H] +。
步骤8：化合物5合成
向二氯甲烷(20毫升)中加入化合物5-11(1克，0.965毫摩尔)，三氟乙酸(5毫升)。反应液在15℃ 下搅拌16小时。反应液浓缩后加入乙醇(20毫升)，碳酸钾(1.33克，9.62毫摩尔)。20℃下搅拌2小时。反应液用水(50毫升)淬灭，二氯甲烷(30毫升)萃取三次。合并有机相浓缩后通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝25/1至8/1)得到化合物5。
MS-ESI(m/z):904.8[M+H] +。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝11.61(br s,1H),9.34(br t,J＝6.4Hz,1H),8.37(br s,1H),8.07(s,1H),7.94(d,J＝2.0Hz,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,1H),7.45(br d,J＝12.3Hz,2H),7.35(br d,J＝8.3Hz,2H),7.15-7.02(m,3H),6.71(s,1H),6.34(br s,1H),5.93(br s,1H),4.20(br t,J＝6.5Hz,2H),3.83(br d,J＝8.3Hz,2H),3.32-3.18(m,8H),2.35(br d,J＝17.6Hz,2H),2.17(br s,2H),2.04-1.97(m,3H),1.93(br s,1H),1.62(br d,J＝12.0Hz,2H),1.41(br s,2H),1.36-1.20(m,3H),0.94(s,6H)。
实施例6
Figure PCTCN2021079579-appb-000059
步骤1：化合物6-1合成
在0℃下向化合物2-3(15克，46.74毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺(50毫升)溶液中分批钠氢(2.24克，56.09毫摩尔，60％纯度)。将混合物搅拌0.5小时。然后逐滴加入碘甲烷(5.96克，41.97毫摩尔，2.61毫升)。将混合物在0℃下搅拌2小时。将混合物缓慢加入水(150毫升)中。然后将得到的浆液过滤得到粗品。粗品通过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝40/1至10/1)得到化合物6-1。
1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ＝8.62(s,1H),8.19(s,1H),4.16(s,3H)。
步骤2：化合物6-2合成
向化合物6-1(7.86克，23.47毫摩尔)的二甲基亚砜(80毫升)溶液中加入化合物1-9(8.11克，70.45毫摩尔)和二异丙基乙胺(9.11克，70.45毫摩尔，12.27毫升)。然后将混合物加热至90℃并搅拌10小时。将混合物倒入水(240毫升)中搅拌0.5小时后过滤，所得固体用二氯甲烷/甲醇(10/1， 50毫升)溶解，分别用水(40毫升×2)和饱和食盐水(30毫升)洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。粗品通过硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝2/1至1/1，每300毫升洗脱液加入100毫升二氯甲烷)得到化合物6-2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝9.20(br t,J＝6.2Hz,1H),8.23(s,1H),8.08(s,1H),4.16(t,J＝6.5Hz,2H),4.06(s,3H),3.85(br dd,J＝3.1,11.4Hz,2H),3.28-3.22(m,2H),1.92(ddd,J＝4.2,7.2,11.1Hz,1H),1.62(br d,J＝12.2Hz,2H),1.28(dq,J＝4.3,12.2Hz,2H)。
步骤3：化合物6-3合成
将化合物6-2(900毫克，2.44毫摩尔)，卞硫醇(605.52毫克，4.88毫摩尔，571.24微升)，Pd 2(dba) 3(223.22毫克，243.76毫摩尔)，Xantphos(282.09毫克，487.5毫摩尔)和二异丙基乙胺(945.13毫克，7.31毫摩尔，1.27毫升)的甲苯(10毫升)的混合物用氮气置换三次，然后将混合物在氮气下在110℃搅拌10小时。将混合物用甲苯(30毫升)稀释，然后过滤。滤液用饱和氯化铵溶液(20毫升)，和饱和食盐水(10毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。将粗品通过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3/1至2/1)纯化得到化合物6-3。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝9.20(br t,J＝6.0Hz,1H),8.13(s,1H),7.87(s,1H),7.26-7.19(m,3H),7.14(br d,J＝6.8Hz,2H),4.18(br t,J＝6.3Hz,2H),4.07(s,2H),4.00(s,3H),3.86(br d,J＝8.9Hz,2H),3.30-3.22(m,2H),1.92(br d,J＝4.4Hz,1H),1.62(br d,J＝12.8Hz,2H),1.36-1.25(m,2H)。
步骤4：化合物6-4合成
在0℃下，向化合物6-3(2克，4.85毫摩尔)的醋酸(20毫升)溶液中分批加入N-氯代丁二酰亚胺(1.94克，14.55毫摩尔)。将混合物在0℃下搅拌2小时，然后升温至28℃，然后再搅拌10小时。然后在0℃下分批加入N-氯代丁二酰亚胺(129.49毫克，969.69毫摩尔)，并将混合物搅拌1小时。然后将混合物升温至28℃并再搅拌1小时。然后在0℃下将混合物滴加到氨水(40毫升)中，并搅拌1小时，然后再将混合物在28℃下搅拌1小时。将混合物用二氯甲烷(40毫升)稀释。然后分离出有机相，水相用二氯甲烷/甲醇(10/1，20毫升×3)萃取。合并的有机相用饱和氯化铵(10毫升×2)，盐水(10毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩。残留物通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝120/1至80/1)得到化合物6-4。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝9.39(br t,J＝6.2Hz,1H),8.59(s,1H),8.28(s,1H),7.51-7.17(m,2H),4.23(br t,J＝6.5Hz,2H),4.12(s,3H),3.85(br dd,J＝3.1,11.1Hz,2H),3.28-3.21(m,2H),1.98-1.88(m,1H),1.64(br d,J＝12.6Hz,2H),1.37-1.24(m,2H)。
步骤5：化合物6合成
向化合物6-4(1.26克，2.07毫摩尔)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(595.16毫克，3.10毫摩尔)和4-二甲氨基吡啶(632.15毫克，5.17毫摩尔)的二氯甲烷(13.0毫升)溶液中加入三乙胺(523.59毫克，5.17毫摩尔，720.21微升)和化合物1-7(1.24克，2.17毫摩尔)。然后将混合物在45℃下搅拌10小时。将混合物用二氯甲烷(30毫升)稀释，并用饱和氯化铵水溶液(10毫升×2)和饱和食盐水(10毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥，在真空下浓缩。粗品通过prep_HPLC(中性体系)(色谱柱：Kromasil Eternity XT 250*80mm*10μm；流动相：[水(10毫摩尔碳酸氢铵)-乙腈]；B(乙腈)％：35％-65％，25min)分离纯化得到化合物6。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝11.55(br s,1H),9.30(br t,J＝6.3Hz,1H),8.54(br s,1H),8.04(s,1H),7.89(br s,1H),7.57(d,J＝8.8Hz,1H),7.44(br s,1H),7.35(d,J＝8.4Hz,3H),7.05(d,J＝8.3Hz,2H),6.62(dd,J＝2.1,8.8Hz,1H),6.33(br s,1H),6.16(s,1H),4.20-4.16(m,3H),4.16(br s,3H),3.83(br dd,J＝3.0,11.3Hz,2H),3.28-3.20(m,2H),2.99(br s,4H),2.76(br d,J＝3.4Hz,2H),2.29-2.10(m,6H),1.96(br s,2H),1.91(td,J＝3.6,7.6Hz,1H),1.62(br d,J＝11.1Hz,2H),1.39(br t,J＝6.3Hz,2H),1.33-1.22(m,2H),0.93(s,6H)。MS(ESI)m/z:922[M+H] +。
实施例7
Figure PCTCN2021079579-appb-000060
步骤1：化合物7-2合成
氮气保护下向化合物2-3(1.5克,4.67毫摩尔)的二甲亚砜(20毫升)溶液中加入碳酸钾(1.94克，14.02毫摩尔)和化合物7-1(1.64克，14.02毫摩尔)。反应液在120℃下搅拌16小时。向反应液加入水(100毫升)，有大量固体析出，过滤，干燥滤饼得到化合物7-2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ＝13.39(br s,1H),9.23(br t,J＝5.8Hz,1H),8.29(s,1H),8.10(s,1H),4.46-4.55(m,1H),4.07-4.16(m,1H),3.83-3.88(m,1H),3.80(br d,J＝11.8Hz,2H),3.57-3.68(m,2H),3.45-3.52(m,1H),3.34-3.39(m,1H)；LCMS(ESI)m/z:357/359[M+H] +。
步骤2：化合物7-3合成
将化合物7-2(600.00毫克，1.68摩尔)，苄硫醇(313毫克，2.52毫摩尔)，Pd 2(dba) 3(61.4毫克，84微摩尔)，Xantphos(50.2毫克，84微摩尔)和二异丙基乙基胺(651.37毫克，5.04毫摩尔)的甲苯(12毫升)混合物用氮气置换3次，然后将混合物在氮气气氛下在110℃搅拌16小时。将反应混合物倒入水(50毫升)中，混合物用乙酸乙酯(30毫升×3)萃取。有机相用饱和食盐水(30毫升) 洗涤，经无水无水硫酸钠干燥，过滤滤液减压浓缩残留物，通过硅胶柱层析法(石油醚/乙酸乙酯＝1/0至5/1)纯化得到化合物7-3。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ＝13.20(br s,1H),9.25(br t,J＝5.3Hz,1H),8.24(s,1H),7.81(s,1H),7.15-7.26(m,5H),4.52(br d,J＝11.8Hz,1H),4.13(br d,J＝7.0Hz,1H),4.10(s,2H),3.83-3.87(m,1H),3.80(br d,J＝11.3Hz,2H),3.56-3.68(m,2H),3.44-3.53(m,1H),3.33-3.37(m,1H)；MS-ESI(m/z):401[M+H] +。
步骤3：化合物7-4合成
在0℃下，向化合物7-3(450毫克，1.12毫摩尔)，乙腈(9毫升)，醋酸(0.9毫升)和水(1.8毫升)混合物中分批加入的N-氯代丁二酰亚胺(448.66毫克，3.36毫摩尔)。将该混合物在25℃下搅拌32小时。然后将反应混合物加入到氨水(16.38克，116.82毫摩尔，6.00毫升，25％纯度)中并将混合物在25℃搅拌2小时。将反应混合物用水(100毫升)稀释，并用乙酸乙酯(100毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(50毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液减压浓缩得到残余物，再通过薄层色谱法纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝1/2)得到化合物7-4。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ＝12.84(br s,1H),9.39(br t,J＝5.8Hz,1H),8.43(s,1H),8.29(s,1H),7.53(br s,2H),4.52-4.61(m,1H),4.14-4.23(m,1H),3.85-3.90(m,1H),3.78-3.85(m,2H),3.57-3.69(m,2H),3.45-3.53(m,1H),3.35-3.40ppm(m,1H)；MS(ESI)m/z:358[M+H] +。
步骤4：化合物7合成
向二氯甲烷(20毫升)中加入化合物7-4(0.3克，0.840毫摩尔)，化合物1-7(0.480克，0.840毫摩尔)，4-二甲氨基吡啶(0.206克，1.68毫摩尔)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.322克，1.68毫摩尔)，三乙胺(0.170克，1.68毫摩尔)，在45℃下搅拌16小时。将反应液倒入20毫升水中，用二氯甲烷(20毫升×3)萃取，用饱和食盐水(20毫升×2)洗，最后用无水硫酸钠干燥。二氯甲烷旋干后，粗品通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝50/1至8/1)得到化合物7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6):δ＝12.90(br s,1H),11.70(br s,1H),9.36-9.43(m,1H),8.52(br s,1H),8.22(br s,1H),8.05(br s,1H),7.49-7.63(m,3H),7.34(d,J＝8.0Hz,2H),7.03(d,J＝8.3Hz,2H),6.65(br d,J＝8.8Hz,1H),6.40(br s,1H),6.15(s,1H),5.76(s,1H),4.54(br dd,J＝8.0,3.8Hz,1H),4.11-4.23(m,1H),3.75-3.95(m,4H),3.64(br t,J＝11.0Hz,2H),3.43-3.59(m,2H),3.35-3.41(m,2H),3.07(br s,4H),2.78(br s,1H),2.23(br s,2H),2.14(br s,2H),1.92-1.99(m,2H),1.33-1.43(m,2H),0.92ppm(s,6H)；MS(ESI)m/z:910[M+H] +。
实施例8
Figure PCTCN2021079579-appb-000061
步骤1：化合物8-1合成
向化合物2-3(2.2克，6.86毫摩尔)的四氢呋喃(22毫升)的溶液中，加入碳酸钾(2.84克，20.6毫摩尔)和碘甲烷(1.36克，9.6毫摩尔)。反应液在15℃下搅拌16小时。向反应液加入饱和氯化铵溶液(50毫升)，用乙酸乙酯(30毫升x 3)萃取。合并有机相，干燥过滤浓缩后得到化合物8-1。LCMS(ESI)m/z:334/336[M+H] +。
步骤2：化合物8-2合成
向化合物8-1(790.00毫克，2.36毫摩尔)的二甲基亚砜(20毫升)溶液中加入在中加入二异丙基乙基胺(2.27克，17.56毫摩尔，3.06毫升)和四氢吡喃-4-基甲胺(2.04克，17.69毫摩尔)。在90℃下搅拌11小时。将反应混合物倒入100毫升水中，过滤，滤饼并用30毫升水洗涤，减压浓缩干燥得到残留物。残留物通过硅胶柱层析法纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/1至0/1)得到化合物8-2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝8.46(s,1H),8.02(s,1H),6.67(br t,J＝6.2Hz,1H),4.09(s,3H),3.81(br dd,J＝3.2,11.2Hz,2H),3.26-3.14(m,4H),1.79-1.65(m,1H),1.50(br d,J＝12.5Hz,2H),1.20-1.08(m,2H)。
步骤3：化合物8-3合成
将化合物8-2(840.00毫克，2.28毫摩尔)，苄硫醇(565.15毫克，4.55毫摩尔)，Pd 2(dba) 3(208.34毫克，227.51微摩尔)，Xantphos(263.28毫克，455.02微摩尔)和二异丙基乙胺(882.13毫克，6.83毫摩尔，1.19毫升)的甲苯(9毫升)混合物用氮气置换3次，然后将混合物在氮气气氛下于110℃搅拌16小时。将反应混合物用水20毫升稀释，并用乙酸乙酯(40毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(10毫升×3)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到残余物。残余物通过硅胶柱层析法纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1/4)得到化合物8-3。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝8.41(s,1H),7.65(s,1H),7.34-7.18(m,5H),6.62(t,J＝6.3Hz,1H), 4.38(s,2H),4.08(s,3H),3.80(br dd,J＝3.2,11.2Hz,2H),3.26-3.17(m,2H),3.14(t,J＝6.4Hz,2H),1.77-1.62(m,1H),1.49(br d,J＝12.7Hz,2H),1.13(dq,J＝4.3,12.3Hz,2H)。
步骤4：化合物8-4合成
在0℃下，向化合物8-3(100毫克，242.42微摩尔)的醋酸(1毫升)和水(0.25毫升)溶液中加入N-氯代丁二酰亚胺(113.30毫克，848.48微摩尔)。将混合物升至15℃并搅拌16小时。将混合物在0℃下加入氨水(2.73g，21.81毫摩尔，3毫升，25％纯度)。将混合物在15℃下搅拌1小时。用5毫升水稀释反应混合物，再用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(5毫升×3)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到残余物。残余物通过制备色谱纯化(硅胶，乙酸乙酯/乙醇＝10/1)得到化合物8-4。
MS(ESI)m/z:370[M+H] +。
步骤5：化合物8合成
向化合物8-4(33毫克，89.34微摩尔)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(20.55毫克，107.20微摩尔)和4-二甲氨基吡啶(21.83毫克，178.67微摩尔，)的二氯甲烷(2毫升)溶液中加入化合物1-7(51.02毫克，89.34微摩尔)和三乙胺(24.87微升，162.24微摩尔)。将混合物在40℃下搅拌16小时。将混合物减压浓缩，残余物通过高效液相制备分离(column:Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm；流动相:[水(0.225％三氟乙酸)-乙腈]；B(乙腈)％:38％-68％,8.5min)纯化后得到化合物8(三氟乙酸盐)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝11.83-11.55(m,1H),8.33(br s,2H),8.08-7.92(m,1H),7.67-7.42(m,3H),7.38-7.27(m,3H),7.03(d,J＝8.4Hz,3H),6.63(dd,J＝1.9,8.7Hz,1H),6.41(br s,1H),6.13(s,1H),4.04(s,3H),3.79(br dd,J＝3.0,11.3Hz,2H),3.25-3.18(m,4H),3.02(br s,4H),2.70(s,2H),2.14(br d,J＝3.4Hz,6H),1.94(br s,2H),1.84-1.70(m,1H),1.54-1.43(m,2H),1.37(br t,J＝6.4Hz,2H),1.20-1.08(m,2H),0.92(s,6H)。MS(ESI)m/z:922[M+H] +。
实施例9
Figure PCTCN2021079579-appb-000062
步骤1：化合物9-1合成
向化合物2-1(2克，7.52毫摩尔)和对甲苯磺酸(129.51毫克，0.752毫摩尔)的四氢呋喃(40毫升)溶液中，加入1,1,1-三甲氧基乙烷(1.36克，11.28毫摩尔)。反应液在20℃下搅拌1小时。向反应液加入水(50毫升)，用乙酸乙酯(30毫升)萃取三次。合并有机相，干燥过滤浓缩后得到化合物9-1。
LCMS(ESI)m/z:289/291[M+H] +。
步骤2：化合物9-2合成
在0℃下，向化合物9-1(0.9克，3.1毫摩尔)的硫酸(10毫升，98％)溶液中添加硝酸钾(345.2毫克，3.41毫摩尔)。将该混合物在0℃下搅拌1小时。将混合物倒入冰水(50毫升)和氨水(25毫升)的混合物中，过滤，收集滤饼并减压干燥后得到化合物9-2。
LCMS(ESI)m/z:334/336[M+H] +。
步骤3：化合物9-3合成
向化合物9-2(1.0克，2.99毫摩尔)的二甲基亚砜(10毫升)溶液中加入在中加入碳酸钾(1.24克，8.97毫摩尔)和四氢吡喃-4-基甲胺(1.03克，8.97毫摩尔)。在100℃下搅拌16小时。将反应混合物倒入100毫升水中，用乙酸乙酯萃取(50毫升×3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥浓缩后得到化合物9-3。
LCMS(ESI)m/z:369/371[M+H] +。
步骤4：化合物9-4合成
将化合物9-3(0.5克，1.35毫摩尔)，苄硫醇(238.02微升，2.03毫摩尔)，Pd 2(dba) 3(124毫克，135微摩尔)，Xantphos(117.54毫克，203微摩尔)和二异丙基乙胺(471.11微升，2.71毫摩尔)的 甲苯(10毫升)混合物用氮气置换3次，然后将混合物在氮气气氛下于110℃搅拌16小时。将反应混合物用水50毫升稀释，并用乙酸乙酯(40毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(30毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到残余物。残余物通过硅胶柱层析法纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1/4)得到化合物9-4。
MS(ESI)m/z:413[M+H] +。
步骤5：化合物9-5合成
在0℃下，向化合物9-4(500毫克，1.21毫摩尔)的醋酸(4毫升)和水(1毫升)溶液中分批加入的N-氯代丁二酰亚胺(647.43毫克，4.85毫摩尔)。将该混合物在25℃下搅拌32小时。然后将反应混合物加入到氨水(20毫升，116.82毫摩尔，25％纯度)中并将混合物在25℃搅拌2小时。将反应混合物用水(100毫升)稀释，并用乙酸乙酯(100毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(50毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并将滤液减压浓缩得到残余物，再通过薄层色谱法纯化(硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝1/2)得到化合物9-5。
MS(ESI)m/z:370[M+H] +。
步骤6：化合物9合成
向化合物9-5(0.1克，0.27毫摩尔)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(103.8毫克，0.54毫摩尔)和4-二甲氨基吡啶(66.1毫克，0.54毫摩尔)的二氯甲烷(10毫升)溶液中加入三乙胺(75.36微升，0.54毫摩尔)和化合物1-7(0.15克，0.27毫摩尔)。然后将混合物在45℃下搅拌10小时。将混合物用二氯甲烷(30毫升)稀释，并用饱和氯化铵水溶液(10毫升×2)和饱和食盐水(10毫升)洗涤，经无水硫酸钠干燥，在真空下浓缩。粗品通过高效液相制备分离(column:Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm；流动相:[水(0.075％三氟乙酸)-乙腈]；B(乙腈)％:45％-75％,7min)纯化后得到化合物9(三氟乙酸盐)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ＝12.72(br s,1H),11.80(br s,1H),11.38(br s,1H),9.30(br s,2H),8.52(br s,1H),8.09(br s,1H),7.66(br s,1H),7.57(br s,2H),7.39(br s,2H),7.09(br s,2H),6.72(br s,1H),6.45(br s,1H),6.19(br s,1H),3.85(br s,4H),3.73-3.48(m,5H),3.26(br s,3H),3.02(br s,2H),2.74(br s,1H),2.45-2.28(m,3H),2.19(br s,2H),2.12-1.89(m,3H),1.63(br s,2H),1.46(br s,2H),1.31(br s,2H),0.95(br s,6H)；MS-ESI(m/z):922.3[M+H] +。
生物测试数据：
实验例1：化合物对Bcl-2/Bcl-xL蛋白酶抑制作用体外测试(酶学实验)
本实验是基于荧光标记的Bak/Bad/Noxa肽与GST标记的Bcl家族蛋白结合的竞争。基于HTRF的荧光检测方法是通过Tb-标记的抗GST和FAM-标记肽之间的荧光比率来观察结合程度。这个肽结合在Bcl家族蛋白口袋的表面，这对其抗细胞凋亡的功能至关重要。
1.1实验试剂：分析缓冲液：20mM磷酸钾，pH 7.5，50mM氯化钠，1mM EDTA，0.005％Tritonx-100和1％DMSO。
1.2探针：5,6-FAM-肽
1.3靶点：
Bcl-2：RBC类别APT-11-441
人重组Bcl-2(氨基酸1-207)(基因库登记号：NM_000663)，带有C-term GST标记，MW＝49.2kDa，在大肠杆菌系统中表达。
Bcl-xL：RBC类别APT-11-442
人重组Bcl-xL(氨基酸1-209)(基因库登记号Z23115)，带有C-term GST标记，MW＝49.78kDa，在大肠杆菌系统中表达。
人重组Bcl-2(氨基酸171-327)(基因库登记号NM_021960)，带有C-term GST标签，MW＝44.4kDa，以大肠杆菌系统中表达。
1.4实验条件：
4nM Bcl-2和100nM FAM-BAK
3nM Bcl-xL和40nM FAM-Bad
1.5参照化合物
ABT-737(或者ABT-263)和ABT-199
1.6实验步骤
a)在新制备的分析缓冲液中配制Bcl酶反应溶液；
b)提供Bcl酶反应溶液；
c)先将化合物配制成100％二甲基亚砜溶液，再使用(Echo550；纳升范围)技术将化合物溶液与Bcl酶反应溶液混合，共培养10分钟；
d)加入FAM肽溶液。
e)在避光及室温的条件下，轻轻搅拌混合溶液，共培养10分钟。
f)加入抗-GST溶液。
g)在避光及室温的条件下，轻轻搅拌混合溶液，共培养1小时。
h)测试HTRF高频荧光比，计算出IC 50值。
实验结果见表1：
表1.HTRF检测IC 50测试结果
Figure PCTCN2021079579-appb-000063
结论：结果显示，相对于抗细胞凋亡Bcl-2蛋白及抗细胞凋亡Bcl-xL蛋白，本发明化合物对抗细胞凋亡Bcl-2蛋白有显著的抑制作用，对抗细胞凋亡Bcl-xL蛋白的抑制作用明显弱于ABT-199，靶点选择性更高。
实验例2：化合物对RS4；11细胞的增殖抑制作用体外测试(细胞实验)
2.1实验目标：在RS4；11细胞系上获得供试化合物的IC50值；
2.2孵化时间：72小时；
2.3实验方法：CTG(CellTiter-Glo TM发光活细胞检测系统)；
2.4实验步骤：
a.当细胞融合到80％时，收集细胞并计数；
b.稀释RS4；11细胞悬液至5000细胞/孔，在384孔板的每个孔中播种20uls细胞悬浮液；
c.将细胞板放回37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育24小时；
d.将待测化合物配成DMSO溶液，各取5μL加入待测板的指定孔中，DMSO溶液的浓度最终为0.5％；
e.采用CTG方法检测起始的细胞活力；
f.把测试板放回培养箱再孵育72小时；
g.培养72小时后，根据制造商手册完成CellTiter-Glo TM发光活细胞检测；
h.数据计算：
Figure PCTCN2021079579-appb-000064
实验结果见表2：
表2.CTG检测RS4；11细胞增殖抑制IC 50测试结果
化合物编号 RS4；11细胞增殖抑制IC 50(nM) 化合物编号 RS4；11细胞增殖抑制IC 50(nM)
化合物1 1.4 化合物7 6.8
化合物2 2.7 化合物8 6.5
化合物5 10.2 化合物9 1.9
化合物6 4.6 / /
结论：结果显示，本发明化合物对RS4；11细胞的分裂增殖有显著的抑制作用。
实验例3：体外肝微粒体代谢稳定性评价
3.1配制供试品和对照工作液：用495μL乙腈稀释5μL化合物2的二甲亚砜溶液(10mM)，得到的工作液浓度：100μM，99％乙腈；
3.2烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸辅助因子溶液制备：称取适量NADPH粉末，稀释成10mM氯化镁溶液(工作液浓度：10单位/mL；反应体系终浓度：1单位/mL)；
3.3肝微粒体制剂：在100mM磷酸钾缓冲液中制备合适浓度的肝微粒体(人，SD大鼠，CD-1小鼠，比格犬)工作液；
3.4淬灭溶液制备：使用含有200ng/mL甲苯磺丁脲和200ng/mL拉贝洛尔作为内标物(IS)的冷(4℃)乙腈作为淬灭溶液；
3.5试验操作：
a.将空“孵育”板T60和NCF60预热10分钟；
b.用100mM磷酸盐缓冲液将肝微粒体稀释至0.56mg/mL；
c.将445μL微粒体工作溶液(0.56mg/mL)转移到预热的“孵育”板T60和NCF60中，然后在37℃下持续摇动将“孵育”板T60和NCF60预孵育10分钟。将54μL肝微粒体转移到空白板上，然后在空白板上添加6μL NAPDH辅因子，然后在空白板上添加180μL淬灭液；
d.向含有微粒体的“孵育”板(T60和NCF60)中添加5μL化合物2的二甲亚砜溶液(100μM)，并充分混合3次；
e.对于NCF60板，添加50μL缓冲液并充分混合3次。开始计时；平板将在37℃下摇动60分钟；
f.在“淬火”板T0中，添加180μL淬火溶液和6μL NAPDH辅因子。确保冷却盘子以防止蒸发；
g.对于T60板，彻底混合3次，并立即在0分钟时间点将54μL混合物移到“淬火”板。然后向培养板(T60)中添加44μL NAPDH辅因子。开始计时；平板将在37℃下摇动60分钟；
h.在5、10、20、30和60min时，将180μL淬火溶液添加到“淬火”板中，混合一次，并在每个时间点将60μL样品从T60板连续转移到“淬火”板中；
i.对于NCF60：混合一次，并在60分钟的时间点将60μL样品从NCF60培养皿转移到含有淬火溶液的“淬火”平板上；
j.将所有取样板摇晃10分钟，然后在4℃下以4000rpm离心20分钟；
k.将60μL上清液移入180μL高效液相色谱仪水中，用平板摇动器搅拌10分钟；
l.在LC-MS/MS分析之前，将每个生物分析板密封并摇晃10分钟.
实验结果如表3和表4所示：
表3.化合物2体外人，SD大鼠肝微粒体代谢稳定性数据
Figure PCTCN2021079579-appb-000065
表4.化合物2体外CD-1小鼠，比格犬肝微粒体代谢稳定性数据
Figure PCTCN2021079579-appb-000066
注：T 1/2表示半衰期；C Lint(liver)表示肝微粒体固有清除率；Remaining(T＝60min)表示孵育60分钟后化合物剩余比例。
结论：结果显示，本发明化合物在人、SD大鼠、CD-1小鼠和比格犬的肝微粒体代谢稳定性较好，且种属差异小。
实验例4：小鼠体内药代动力学性质评价
通过静脉给药和口服给药，在CD-l小鼠体内评价了化合物2的药代动力学性质。IV(静脉注射)是指在颈静脉缓慢给药，PO(口服)是指通过灌胃给药。静脉和灌胃给药配方均为2.5％二甲基亚砜，5％乙醇，10％蓖麻油聚氧乙烯醚，20％葡萄糖溶液(浓度5％)，62.5％水。静脉注射组PK时间点分别为给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h，灌胃给药组PK时间点分别为给药后15min、30min、1h、2h、4h、8h、24h。在每个时间点采集约0.03mL血液。每个样本的血液转移到含有EDTA-K2的塑料微型离心管中，在4℃离心机中以4000转速离心5分钟，并在15分钟内收集血浆，血浆样品储存在聚丙烯管中。试验前，样品储存在-75±15℃的冰箱中。用LCMS/MS方法分析血浆样品中的化合物浓度，并使用WinNonlin(Phoenix TM,version 6.1)软件计算了以下药代动力学参数：IV：C 0，Cl，V d，T 1/2，AUC 0-last，MRT 0-last，回归点数；PO：C max，T max，T 1/2，AUC 0-last，MRT 0-last，回归点数。药代动力学数据采用描述性统计方法，如平均值、标准差进行描述。
统计结果如表5和表6所示：
表5.化合物2(IV，1mpk)给药CD-1小鼠药代动力学数据
Figure PCTCN2021079579-appb-000067
表6.化合物2(PO，50mpk)给药CD-1小鼠药代动力学数据
参数 C max(nmol/L) T max(h) T 1/2(h) AUC 0-last(h*nmol/L) MRT 0-last(h)
测试值 1790 3.0 4.1 12809 6.22
注：C 0表示起始时间点药物浓度；T 1/2表示半衰期；Vd ss表示表观分布容积；Cl表示血浆清除率；AUC 0-last表示药物血浆暴露量；MRT 0-last表示平均停留时间；C max表示最大药物浓度点；T max表示达峰时间。
结论：本发明化合物在CD-1小鼠体内有良好的药代动力学性质，支持口服给药途径。
实验例5：在BALB/c裸小鼠人急性淋巴白血病细胞RS4；11移植瘤模型上体内抗肿瘤作用
5.1试验动物：Balb/c nude小鼠，32只，7-8周龄，雌性；
5.2肿瘤细胞：人急性淋巴细胞白血病细胞株RS4；11，体外悬浮培养，培养条件为采用含10％胎牛血清RPMI-1640培养基，37℃ 5％CO 2培养箱中培养。当细胞处于指数生长期，饱和度为80％-90％时，收取细胞，计数；
5.3细胞接种及分组：将细胞重悬于磷酸二氢钠缓存溶液中，1:1加入基底膜基质胶，混匀，密度为5×107个细胞/mL。0.2mL细胞悬液(含1×107个RS4；11细胞)皮下接种于每只小鼠的右后背，待肿瘤平均体积达到约120mm 3时，根据肿瘤体积进行随机分组给药；
5.4受试物的配制：分别称取适量的化合物2，溶媒配方均为2.5％二甲基亚砜，5％乙醇，10％蓖麻油 聚氧乙烯醚，20％葡萄糖溶液(浓度5％)，62.5％水；
5.5将平均分成4组(每组8只)的荷瘤小鼠分别给予空白溶媒，化合物2(12.5mpk,QD)，化合物2(25mpk,QD)，化合物2(50mpk,QD)；
5.6肿瘤测量和实验指标：
每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：肿瘤体积V＝0.5×a×b 2，a表示肿瘤的长径，b表示肿瘤的短径。化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。
相对肿瘤增殖率T/C(％)＝T RTV/C RTV×100(T RTV：治疗组平均RTV；C RTV：阴性对照组平均RTV)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为RTV＝V t/V 0，其中V 0是分组给药时(即D 0)测量所得肿瘤体积，Vt为某一次测量时的肿瘤体积，TRTV与CRTV取同一天数据。
TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。抑瘤疗效TGI的计算公式为：
Figure PCTCN2021079579-appb-000068
统计结果如表7和表8所示：
表7.给药不同天数受试物对肿瘤体积(mm3)的影响
Figure PCTCN2021079579-appb-000069
表8.受试化合物对RS4；11移植瘤模型的抑瘤效果(基于给药后第32天肿瘤体积数据)
Figure PCTCN2021079579-appb-000070
Figure PCTCN2021079579-appb-000071
注*：平均值±SEM，n＝8。
结论：通过肿瘤体积和抑瘤疗效数据可知，化合物2三个剂量组都表现出显著的抑瘤效果，且呈现明显的剂量依赖性，剂量越高抑瘤效果越显著，试验期间动物状态无异常。

Claims (15)

  1. 式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐，
    Figure PCTCN2021079579-appb-100001
    其中，
    T为N时，
    Figure PCTCN2021079579-appb-100002
    选自单键；
    T为C时，
    Figure PCTCN2021079579-appb-100003
    选自双键；
    环A选自
    Figure PCTCN2021079579-appb-100004
    R 1选自H和C 1-3烷基，所述C 1-3烷基任选被1个R a取代；
    R 2选自氧杂环己基；
    R 3选自H、F、Cl、Br、I、NO 2和CN；
    L 1选自单键和-C(＝O)-；
    R a选自H和
    Figure PCTCN2021079579-appb-100005
  2. 根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R 1选自H和CH 3，所述CH 3任选被1个R a取代。
  3. 根据权利要求2所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R 1选自H、CH 3和
    Figure PCTCN2021079579-appb-100006
  4. 根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R 2选自
    Figure PCTCN2021079579-appb-100007
  5. 根据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，R 3选自H和NO 2。
  6. 根据权利要求1～5任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐，其化合物选自
    Figure PCTCN2021079579-appb-100008
    其中，R 1、R 2和R 3如权利要求1～5任意一项所定义。
  7. 根据权利要求1～5任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐，其化合物选自
    Figure PCTCN2021079579-appb-100009
    其中，
    T为N时，
    Figure PCTCN2021079579-appb-100010
    选自单键；
    T为C时，
    Figure PCTCN2021079579-appb-100011
    选自双键；
    R 1、R 2、R 3和L 1如权利要求1～5任意一项所定义。
  8. 根据权利要求1～5任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐，其化合物选自
    Figure PCTCN2021079579-appb-100012
    其中，R 1、R 2和R 3如权利要求1～5任意一项所定义。
  9. 根据权利要求1～5任意一项所述化合物或其药学上可接受的盐，其化合物选自
    Figure PCTCN2021079579-appb-100013
    其中，R 1、R 2和R 3如权利要求1～5任意一项所定义。
  10. 据权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，结构单元
    Figure PCTCN2021079579-appb-100014
    选自
    Figure PCTCN2021079579-appb-100015
    其中，R 1和R 3如权利要求1所定义。
  11. 根据权利要求10所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，结构单元
    Figure PCTCN2021079579-appb-100016
    选自
    Figure PCTCN2021079579-appb-100017
    其中，R 1和R 3如权利要求10所定义。
  12. 根据权利要求11所述化合物或其药学上可接受的盐，其中，结构单元
    Figure PCTCN2021079579-appb-100018
    选自
    Figure PCTCN2021079579-appb-100019
  13. 下式所示化合物或其药学上可接受的盐，
    Figure PCTCN2021079579-appb-100020
    Figure PCTCN2021079579-appb-100021
  14. 根据权利要求1～13任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备Bcl-2抑制剂相关药物上的应用。
  15. 根据权利要求14所述的应用，其中，所述Bcl-2相关药物是用于治疗恶性血液瘤及实体瘤的药物。
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