WO2021172380A1 - 核酸医薬品等の分析方法 - Google Patents

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WO2021172380A1
WO2021172380A1 PCT/JP2021/006930 JP2021006930W WO2021172380A1 WO 2021172380 A1 WO2021172380 A1 WO 2021172380A1 JP 2021006930 W JP2021006930 W JP 2021006930W WO 2021172380 A1 WO2021172380 A1 WO 2021172380A1
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bubbling
mipomersen
deterioration
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真一郎 新田
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株式会社Ｌｓｉメディエンス
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Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing an ionic substance such as a nucleic acid drug by liquid chromatography-mass spectrometry, which prevents deterioration of the mobile phase of liquid chromatography.
  • analysis in this specification includes the meaning of "measurement” which determines the amount of the substance to be analyzed qualitatively, quantitatively or semi-quantitatively.
  • Nucleic acid drugs are drugs that are manufactured by chemical synthesis and are composed of oligonucleotides in which (modified) nucleic acids are linked by about 10 to several tens of bases and act directly on the living body. Nucleic acid drugs are expected to provide a new therapeutic method for diseases that have been difficult to treat by having an action such as suppressing the expression of a specific protein directly in a living body. In addition, manufacturing and marketing approval has already been obtained for some nucleic acid drugs.
  • an analysis method by liquid chromatography-mass spectrometry is known as an analysis method for oligonucleotides (Patent Document 1), but it takes a long time to control the production of pharmaceuticals. It is desirable to use a more accurate analytical means that can analyze even in continuous analysis over a period of time without reducing the sensitivity.
  • the present invention is to continuously analyze an ionic substance such as a nucleic acid drug (hereinafter, may be simply referred to as a nucleic acid drug) in liquid chromatography-mass spectrometry while maintaining high sensitivity for a long period of time.
  • a nucleic acid drug hereinafter, may be simply referred to as a nucleic acid drug
  • the challenge is to provide the means by which they can.
  • the present inventors have conducted diligent studies to solve the above problems, and found that they are sensitive to continuous analysis over a long period of time, especially when measuring ionic substances such as nucleic acid drugs by liquid chromatography-mass spectrometry. It was found that a decrease occurs. It was also found that the decrease in sensitivity in such continuous analysis was caused by the deterioration of the basic ion pair reagent in the mobile phase. Then, it was found that the deterioration of the mobile phase can be prevented by preventing the deterioration of the basic ion pair reagent in the mobile phase, and the present invention was completed based on this knowledge.
  • An analysis method including a step of subjecting a sample containing an ionic analysis target substance to liquid chromatography using a mobile phase containing a basic ion pair reagent, and further subjecting it to mass spectrometry.
  • a method for analyzing a substance to be analyzed which comprises performing an operation for preventing deterioration of the mobile phase.
  • the method according to [1], wherein the operation for preventing the deterioration of the mobile phase includes bubbling the mobile phase with an inert gas.
  • the operation for preventing the deterioration of the mobile phase further includes controlling and controlling the bubbling of the mobile phase with the inert gas.
  • the method according to any one of [1] to [3], wherein the operation for preventing deterioration of the mobile phase includes using a mobile phase containing a basic ion pair reagent in a non-aqueous solvent.
  • the basic ion pair reagent is an amine compound.
  • the basic ion pair reagent is tetraethylammonium hydroxide (TEA-OH), tetrabutylammonium hydroxide (TBAOH), N, N-dimethylbutylamine (DMBA), octylamine (OA), tripropylamine (TPA).
  • DPAA dibutylammonium acetate
  • DAAA diamylammonium acetate
  • DHAA dihexylammonium acetate
  • nucleoside containing purine compound, purine compound analog, pyrimidine compound, or pyrimidine compound analog Nucleoside containing purine compound, purine compound analog, pyrimidine compound, or pyrimidine compound analog; nucleotide, cyclic nucleotide, nucleotide diphosphate, nucleotide triphosphate; nicotinamide adenine di Nucleotide phosphate (NAD, NADPH), flavin adenine dinucleotide (FAD, FADH), coenzyme A (coenzyme A), tetrahydromethanopterin (H4MPT), S-adenosylmethionine (SAM), and 3'-phosphoadenine- Coenzymes containing nucleosides selected from 5'-phosphosulfates; their metabolic intermediates and their reduced hydrogen acceptors and modifiers; at least one selected from oligonucleotides, sugars, and sugar chains, [1 ] To [6].
  • oligonucleotide is at least one nucleic acid drug selected from antisense, decoy, siRNA, miRNA, ribozyme, CpG oligo and aptamer.
  • sugar and the sugar chain are at least one selected from monosaccharides, disaccharides, and oligosaccharides.
  • inert gas is at least one selected from nitrogen gas, argon gas, neon gas, krypton gas, xenon gas and helium gas.
  • a mobile phase in which a basic ion pair reagent is dissolved in a non-aqueous solvent is prepared, mixed with a mobile phase containing water, and used for liquid chromatography. How to prevent deterioration of the mobile phase.
  • a mass spectrometer that analyzes the substance to be analyzed, and Mobile phase deterioration prevention device, An analyzer equipped with.
  • the analyzer according to [13], wherein the mobile phase deterioration prevention device is a mobile phase gas bubbling device.
  • the mobile phase degradation prevention device further includes means and software for managing and controlling mobile phase bubbling.
  • the mobile phase deterioration prevention device is a device that mixes a mobile phase containing a basic ion pair reagent in a non-aqueous solvent with a mobile phase containing water.
  • liquid chromatography-mass spectrometry of ionic substances such as nucleic acid drugs
  • continuous analysis for a long period of time is possible while maintaining high sensitivity.
  • FIG. 1 is a diagram showing changes in peak area values of mipomersen-MOE and mipomersen-S oligos (160 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was not performed.
  • FIG. 2 is a diagram showing the transition of the peak area ratio of mipomersen-MOE / mipomersen-S oligo (160 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was not performed.
  • FIG. 3 is a diagram showing changes in peak area values of mipomersen-MOE and mipomersen-S oligos (160 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was applied.
  • FIG. 4 is a diagram showing the transition of the peak area ratio of mipomersen-MOE / mipomersen-S oligo (160 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was applied.
  • FIG. 1 is a diagram showing changes in peak area values of mipomersen-MOE and mipomersen-S oligos (160 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was not performed.
  • FIG. 2 is a diagram showing the transition of the
  • FIG. 5 is a diagram showing the transition of the peak area value of mipomersen-MOE (240 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was not performed.
  • FIG. 6 is a diagram showing the transition of the peak area value of mipomersen-OMe (240 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was not performed.
  • FIG. 7 is a diagram showing the transition of the peak area value of mipomersen-LNA (240 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was not performed.
  • FIG. 8 is a diagram showing the transition of the peak area value of mipomersen-MOE (240 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was applied.
  • FIG. 9 is a diagram showing the transition of the peak area value of mipomersen-OMe (240 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was applied.
  • FIG. 9 is a diagram showing the transition of the peak area value of mipomersen-OMe (240 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was applied.
  • FIG. 10 is a diagram showing the transition of the peak area value of mipomersen-LNA (240 consecutive analyzes) when nitrogen bubbling was applied.
  • FIG. 11 is a diagram showing a confirmation result of the mobile phase causing deterioration.
  • FIG. 12 is a diagram showing changes in the peak area value of CS-A with and without nitrogen bubbling (52 consecutive analyzes).
  • FIG. 13 is a diagram showing changes in the peak area value of CS-E with and without nitrogen bubbling (52 consecutive analyzes).
  • FIG. 14 is a diagram showing the transition (240 consecutive analyzes) of the peak area value of the internal standard substance ( ⁇ UA-2S GlcNCOEt-6S) with and without nitrogen bubbling.
  • One aspect of the present invention is an analysis method including a step of subjecting a sample containing an ionic analysis target substance to liquid chromatography using a mobile phase containing a basic ion pair reagent, and further subjecting the sample to mass spectrometry.
  • the present invention relates to an analysis method for a substance to be analyzed (hereinafter, may be referred to as “the analysis method of the present invention”), which comprises performing an operation for preventing deterioration of the mobile phase.
  • the basic ion pair reagent used in the present invention is not particularly limited as long as it is a basic compound capable of forming an ion pair (ion pair) with an ionic analysis target substance in the mobile phase, but is basically basic such as an amine compound.
  • Compounds are preferably used.
  • the amine compound include an aliphatic amine having an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms (preferably 2 to 8 carbon atoms, 2 to 6 carbon atoms, etc.), an aromatic amine having 6 to 20 carbon atoms, and 3 carbon atoms. Examples thereof include 20 heterocyclic amines or salts thereof.
  • Examples of the salt include, but are not limited to, bromide salt, chloride salt, hydroxide salt, sulfate, nitrate, hydrochloride, acetate and the like.
  • Examples of the basic compound which is an amine compound include tetraethylammonium hydroxide (TEA-OH), tetrabutylammonium hydroxide (TBAOH), N, N-dimethylbutylamine (DMBA), octylamine (OA), and tripropylamine.
  • TPA N, N-dimethylhexylamine
  • DIPA diisopropylamine
  • MDBA propylamine
  • PA propylamine
  • TBA triethylamine
  • HA hexylamine
  • tributylamine TBA
  • N, N-Diisopropylcyclohexylamine DMCHA
  • DIEA N-diisopropylethylamine
  • TBU Tetramethylethylenediamine
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene
  • Examples thereof include, but are not limited to, dipropylammonium acetate (DPAA), dibutylammonium acetate (DBAA), diamylammonium acetate (DAAA), and dihexylammonium acetate (DHAA).
  • DPAA dipropylammonium acetate
  • DBAA dibutylammonium acetate
  • DAAA diamyl
  • the present inventors have diligently studied a means for continuous analysis while maintaining high sensitivity in liquid chromatography-mass spectrometry of an ionic analysis target substance such as a nucleic acid drug.
  • the present inventors have found a phenomenon in which the peak intensity decreases with the passage of time in liquid chromatography-mass spectrometry of an ionic analysis target substance such as a nucleic acid drug.
  • the present inventors presumed that it was necessary to prevent deterioration of the basic ion pair reagent in order to prevent a decrease in sensitivity over time in continuous analysis, and examined deterioration prevention means.
  • a more specific aspect of the present invention relates to the analytical method of the present invention, wherein the operation of preventing the deterioration of the mobile phase comprises bubbling the mobile phase with an inert gas.
  • the bubbling is not limited as long as it is possible to remove oxygen in the mobile phase, but for example, a gas bubbling device is used in which an inert gas is blown into a container holding the mobile phase to perform a bubbling treatment. Can be done.
  • the flow rate of the inert gas can be changed according to the measurement environment, the sample, the mobile phase used, the total amount of the mobile phase, etc., and is not particularly limited. For example, 0.1 to 200 mL / min per 1 L of the mobile phase is preferable.
  • the blowing of the inert gas may be continuous or intermittent, and when the amount of the inert gas blown is reduced, it may be reduced all at once or gradually.
  • the flow rate of the inert gas can be measured using, for example, the Agilent ADM1000. As a specific bubbling method, those skilled in the art should consider the size, shape, and airtightness of the container containing the mobile phase within a range that does not affect the composition of the mobile phase or the separation of liquid chromatography. The flow rate can be set as appropriate.
  • the gas bubbling device is provided with an inert gas supply pipe for blowing the supplied high-purity inert gas.
  • the inert gas supply pipe is inserted into the mobile phase container.
  • the material, shape, and installation position (depth in the mobile phase, etc.) of the inert gas supply pipe can be appropriately selected based on a conventional method.
  • the gas bubbling device may be provided with a flow rate adjusting valve for adjusting the flow rate of the inert gas flowing through the inert gas supply pipe.
  • the gas bubbling device blows the inert gas of the flow rate adjusted by the flow rate adjusting valve into the mobile phase in the mobile phase container via the inert gas supply pipe to perform the bubbling process.
  • a discharge pipe may be provided in order to discharge the oxygen-containing air discharged from the mobile phase to the outside of the container.
  • a device for managing and controlling gas bubbling by a gas bubbling device, a control computer, and the like may be further provided, and as the performance of the management / control device, bubbling may be performed or stopped at regular intervals.
  • it is further equipped with a management / control device that manages / controls the gas bubbling device based on the dissolved oxygen concentration measured by the densitometer.
  • the amount of inert gas blown by the gas bubbling device may be increased, and the gas bubbling device may be controlled so that the dissolved oxygen concentration measured by the densitometer becomes less than a predetermined value.
  • a means for managing and controlling the gas bubbling is used to control the bubbling (for example, the amount of gas to be blown or the mobile phase).
  • the step of increasing the bubbling amount is executed) and / or in the container for supplying the amount of the inert gas blown and the solvent used as the mobile phase. It may be provided with means such as software for measuring and recording the pressure of the gas. Providing such means is required, for example, as a means for ensuring the reliability of the results obtained at the time of drug development, and it is possible to meet such a request. preferable.
  • the inert gas is not limited as long as it does not affect the analysis and can discharge dissolved oxygen, but argon gas, helium gas, neon gas, krypton gas, xenon gas, nitrogen gas and the like can be used. ..
  • the inert gas may be one type or two or more types.
  • Another aspect of the analytical method of the present invention comprises using a mobile phase containing a basic ion pair reagent in a non-aqueous solvent as an operation for preventing deterioration of the mobile phase.
  • An embodiment using a mobile phase containing, but not limited to, a basic ion pair reagent in a non-aqueous solvent will be described below.
  • a mobile phase containing water and a mobile phase containing a basic ion pair reagent in a non-aqueous solvent are separately prepared in a suitable container.
  • yet another mobile phase may be used to form an appropriate mobile phase.
  • a pump having a function of sending liquid from each container is used to supply the liquid to a mixer and mix the liquid.
  • the mixer is not particularly limited as long as it has a function of mixing two or more liquids at high speed and uniformly, and examples thereof include a mixer having at least one liquid distribution / mixing unit. Specific examples of such a mixer include a gradient mixer for liquid chromatography and the like.
  • the total flow rate when sending liquid to the mixer is not particularly limited as long as two or more liquids can be contact-mixed at high speed, and those skilled in the art may appropriately adjust the flow rate according to the type and internal volume of the mixer, the type of pump, and the like.
  • the total flow rate of the liquid can be at least 0.25 times, 2.5 times, 25 times, 250 times, 2500 times, 25000 times, etc., with respect to the internal volume in the mixer.
  • the mixing ratio of the mobile phase containing water, the mobile phase containing the basic ion pair reagent in the non-aqueous solvent, and another mobile phase depends on the type of solvent, the concentration of the solution, the substance to be separated, the type of the liquid chromatography column, etc. It may be adjusted as appropriate. It is also possible to refer to the mobile phase conditions in the conventional liquid chromatography-mass spectrometry conditions using the basic ion pair reagent.
  • the non-aqueous solvent includes not only a solvent containing no water at all but also a solvent in which water is excluded as much as possible.
  • the organic solvent ratio can be 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, particularly preferably 40% or more, more preferably 60% or more, and 80%.
  • a solvent having a value of% or more is most preferable.
  • the non-aqueous solvent is not particularly limited as long as it does not affect the analysis system and the basic ion pair reagent does not deteriorate, and examples thereof include alcohols such as methanol, ethanol and propanol, and organic solvents such as acetonitrile.
  • the non-aqueous solvent one kind or two or more kinds may be used.
  • the mobile phase may be bubbling as described above for a mobile phase containing a basic ion pair reagent in a non-aqueous solvent.
  • Mobile phase A Water Mobile phase
  • Methanol Methanol / Hexafluoroisopropanol / Triethylamine
  • the first embodiment for preventing the deterioration of the mobile phase due to bubbling using an inert gas may be combined with the second embodiment for preventing the deterioration of the mobile phase using a non-aqueous solvent.
  • the order in which the first embodiment and the second embodiment are performed may be exchanged.
  • the sample used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a pharmaceutical-derived sample, a biological-derived sample, and a food-derived sample.
  • examples of the pharmaceutical-derived sample include pharmaceuticals, pharmaceutical raw materials, pharmaceutical additives, and the like.
  • Biological samples include epithelium, epithelial gland, connective tissue, bone, blood, hematopoietic organ, muscle, nerve, optic disc, auditory organ, lymphatic system, dermal system, cardiovascular system, respiratory system, urinary system, upper gastrointestinal tract.
  • Samples from any part of the body can be used, eg, whole blood, plasma, serum, breast milk, saliva, Urine, stool, sputum, semen, or vaginal, nasal, colonic, urinary or pharyngeal secretions, excretions or swabs, lacrimal duct secretions, biopsy tissue samples, brain-derived samples, liver-derived samples, kidney-derived samples, skin Derived sample, muscle-derived sample, colon-derived sample, esophageal-derived sample, stomach-derived sample, small intestine (may be a sample derived from one or more of the duodenum, air intestine, and optic disc) -derived sample, worm drop-derived sample , Colon (may be from the optic disc, ascending colon, transverse colon, descending colon, sigmoid colon, rectal tissue), anal-derived sample, bile sac-derived
  • Examples of food-derived samples include foods, food raw materials, food additives, and the like.
  • the form of the sample is not particularly limited, and may be, for example, a liquid sample or a solid sample.
  • a mixed solution, an extract, a solution, or the like can be prepared using a solvent or the like, and this can be used as a sample.
  • the solvent is not particularly limited as long as it can dissolve the sample and does not affect the subsequent separation and detection, and examples thereof include water, physiological saline, and a buffer solution.
  • the sample may be, for example, a sample containing a substance to be analyzed, or a sample containing or unknown the substance to be analyzed.
  • the sample may be subjected to appropriate pretreatment before analysis by the method of the present invention.
  • the substance to be analyzed is not particularly limited as long as it is an ionic substance, and usually includes various substances to be analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry.
  • the ionic substance refers to a compound having an ionizable group, and may be a homopolymer of a monomer having an ionizable group, a copolymer with another monomer, or a polypolymer.
  • the ion is not particularly limited as long as it is anionic, and may be a compound having a group that can be anionized.
  • the analytical method of the present invention can prevent deterioration of triethylamine and the like as a basic ion pair reagent, and can prevent deterioration of the mobile phase. Therefore, from the viewpoint that the effect of the analysis method of the present invention is preferably exhibited, anionic or amphoteric analysis target substances are preferably mentioned.
  • Such substances to be analyzed include, but are not limited to, for example, nucleosides, nucleotides, cyclic nucleotides, nucleotide diphosphates, and nucleotide triphosphates, including purine compounds, purine compound analogs, pyrimidine compounds, or pyrimidine compound analogs.
  • Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NADPH
  • flavin adenine dinucleotide FAD, FADH
  • coenzyme A coenzyme A
  • H4MPT tetrahydromethanopterin
  • SAM S-adenosylmethionine
  • 3 Included are coenzymes containing nucleosides such as'-phosphoadenine-5'-phosphosulfate, their metabolic intermediates, and their reduced hydrogen acceptors and modifiers, oligonucleotides, sugars, sugar chains and the like.
  • the molecular weight to be analyzed is not limited as long as liquid chromatography-mass spectrometry is possible.
  • the substance to be analyzed contained in the sample may be one kind or two or more kinds.
  • the oligonucleotide to be analyzed of the present invention is not particularly limited, and may be a nucleic acid which is DNA or RNA, a modified nucleic acid, or the like.
  • Preferred examples of oligonucleotides include nucleic acid drugs, including oligonucleotides used in nucleic acid drugs such as antisense, decoy, siRNA, miRNA, ribozyme, CpG oligo and aptamer. Modifications of these nucleic acids are not particularly limited, and modifications at the 2'position of the sugar portion (2'-F, 2'-O-Methyl (2'-OMe), 2'-O-Methoxyethyl (2'-MOE)).
  • the stability in the living body is enhanced by well-known methods such as (changing the oxygen atom double-bonded with sulfur atom) and methylation of the nucleic acid part (5-methylcytosine (5-mC), etc.). And so on.
  • the oligonucleotide may be, for example, 10 to 100 bases, 10 to 80 bases, 10 to 50 bases, 10 to 50 bases, 10 to 30 bases, or the like.
  • the sugar and sugar chain to be analyzed in the present invention are not particularly limited, and may be monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc., simple sugars consisting only of sugars, and other substances (proteins, lipids). It does not matter whether it is derived from a complex sugar containing (including synthetic polymers, etc.), whether it is a natural product or a synthetic product, and the like.
  • the sugars and sugar chains in the present invention may be in a state in which sugar chains such as glycoproteins, glycolipids, and proteoglycans and complex sugars are bound, but trace amounts of sugar chains and complex sugars derived from living organisms may be used.
  • the sugar and the sugar chain portion isolated and recovered may be used as the analysis target.
  • This pretreatment method can be used by those skilled in the art by appropriately selecting the method and setting the conditions according to the properties of the target substance to be analyzed and the like. Examples of these pretreatment methods include a method of cleaving a sugar chain with an enzyme such as peptide N-glycosidase F (PNGaseF), chondroitinase, and heparinase, fragmentation of a protein moiety with a protease such as trypsin or actinase, and chemical treatment.
  • PNGaseF peptide N-glycosidase F
  • chondroitinase chondroitinase
  • heparinase fragmentation of a protein moiety with a protease such as trypsin or actinase
  • sugar chains and complex sugars can be appropriately cleaved and used for analysis by using an enzyme such as exoglycosidase depending on the purpose of measurement.
  • Preferred examples of sugars to be analyzed in the present invention are glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, glucosamine, N-acetylglucosamine, galactosamine, and N-acetylgalactosamine, glucuronic acid, isulonic acid, and fructose as monosaccharides.
  • disaccharides include maltose, trehalose, sucrose, lactulose, isomaltose, lactose, lactosamine, N-acetyllactosamine, cellobiose, melibiose, glycosaminoglycan (chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratane sulfate, heparin, heparan).
  • oligosaccharides include maltooligosaccharides, isomaltooligosaccharides, lacto-oligosaccharides, lactosamine oligosaccharides, N-acetyllactosamine oligosaccharides, cellooligosaccharides, melivio-oligosaccharides, and glycosaminoglycans.
  • Examples include fragments, in which monosaccharides are polyhydroxyaldehydes and polyhydroxyketones having approximately the same number of oxygen atoms as carbon atoms, and derivatives thereof (for example, aminosaccharides having amino groups, aldehyde groups or primary hydroxy groups).
  • the portion may be a carboxylic acid having a carboxyl group, a polyhydric alcohol having an aldehyde group or a ketone group as a hydroxy group, etc.), and may refer to a polymer thereof. It also targets sialic acid, which is present at the reducing end of sugar chains and complex sugars bound to proteins, lipids, etc., and is present at the ends of sugar chains and oligosaccharides as constituents of sugar chains and complex sugars.
  • the sialic acid also includes, for example, a sialic acid derivative whose hydroxyl group has been modified such as acetylation, and the molecular weights of sugars and sugar chains that can be targeted even when they exist alone.
  • the weight average molecular weight (Da) according to the GPC-HPLC method may be, for example, 100 to 5,000 Da, 300 to 3,000 Da, 400 to 1,000 Da, or the like, though not limited.
  • LC-MS liquid chromatography
  • MS mass spectrometer
  • Any device may be used as long as it uses a liquid chromatograph device and a mass spectrometer, and the respective devices may be connected in series with each other.
  • an LC-MS system configured by connecting a liquid chromatography apparatus and a mass spectrometer in series can be preferably used.
  • the components separated by liquid chromatography can be continuously subjected to mass spectrometry.
  • tandem type LC-MS / MS, LC-MS / MS / MS and the like can also be used.
  • the liquid chromatography apparatus is not particularly limited as long as it can separate the substance to be analyzed contained in the sample by liquid chromatography, but is usually preferably an HPLC apparatus.
  • the HPLC apparatus includes a separation column and a pump that pumps the mobile phase into the separation column.
  • the HPLC apparatus may include other elements such as a degasser, an autosampler, a heater, a detector for detecting separated components, and the like. Examples of the detector include a UV detector and a fluorescence detector.
  • the detector can be connected between the column and the ion source (ionization section).
  • UHPLC liquid chromatography
  • UPLC ultra-high performance liquid chromatography
  • UHPLC means liquid chromatography capable of high-pressure liquid feeding at about 100 MPa, and refers to a device capable of analysis at higher speed / higher resolution.
  • those referred to as UHPLC, UPLC, etc. are also included.
  • These devices are common in that they include a pump that pumps the mobile phase into the separation column, and may include other elements such as a degasser, autosampler, heater, detector, and the like. Examples of the detector include a UV detector and a fluorescence detector.
  • UPLC uses a column filled with particles that can withstand high pressure, and can perform separation analysis more quickly and with high sensitivity than an HPLC device. Separation conditions by UPLC can be performed in the same manner as in the case of setting HPLC conditions, and those skilled in the art can appropriately set the conditions. In addition, when applying the conditions of a known HPLC analysis method to UPLC, the conditions can be examined using software such as ACQUITY UPLC Columns Calculator.
  • bubbling when the mobile phase of liquid chromatography is bubbling with an inert gas as a means for controlling the bubbling, the means for controlling and controlling the gas bubbling, the bubbling control, and the bubbling control, and /
  • a means such as software for performing measurement and recording of the amount of the blown inert gas, the pressure in the container for supplying the solvent used as the mobile phase, and the like may be provided.
  • Providing such means is required, for example, as a means for ensuring the reliability of the results obtained at the time of drug development, and it is possible to meet such a request.
  • Software may be used to manage such measurement records and set bubbling conditions.
  • the software that controls the measurement conditions may be able to manage the measurement records, set the bubbling conditions, or use it as a separate software. May be good.
  • the mass spectrometer may control HPLC or UHPLC conditions.
  • Software for managing measurement records and setting bubbling conditions can be used on a computer connected to the mass spectrometer.
  • the conditions of the mobile phase (separation solution) used for high performance liquid chromatography are not particularly limited as long as the substance to be analyzed can be separated and the solvent is applicable to the mass spectrometer. It is possible to do. For example, water, methanol, ethanol, isopropanol, acetonitol and the like can be used.
  • the solvent may be one type or two or more types.
  • the mobile phase may contain other components as long as the substance to be analyzed can be analyzed.
  • acetylacetone for example, acetylacetone and methanol as mobile phases.
  • acetylacetone because the poor peak shape due to the coordination bond between the phosphate group or thiophosphate group of the ionic substance and the metal ion and the elution of the carryover peak can be improved and detected.
  • EDTA which has the same effect as acetylacetone may be used.
  • methanol because the elution time of oligonucleotides, sugars, sugar chains and the like of ionic substances can be adjusted.
  • the mobile phase of liquid chromatography forms an ion pair (ion pair) with an anionic or amphoteric sample and allows triethylamine (TEA) as an ion pair reagent to allow separation on a reverse phase column.
  • TAA triethylamine
  • the concentration of the basic ion pair reagent in the mobile phase can be appropriately set according to the substance to be analyzed by those skilled in the art. For example, when triethylamine is used, the type of the substance to be analyzed and the type of column are used. It can be appropriately selected according to various conditions such as, but may be, for example, 1 to 50 mM or 1 to 20 mM.
  • an additive that does not affect the analysis can be added to the mobile phase and used.
  • Acetic acid TFE
  • THF tetrahydrofuran
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • PFP pentafluoropropanol
  • HFMIP 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-methyl-2-propanol
  • TFE trifluoroethanol
  • NFTB nonafluoro-tert-butyl alcohol
  • the conditions of the analysis column used in the liquid chromatography are not particularly limited, and can be appropriately selected according to various conditions such as the type of the substance to be analyzed and the type of the sample.
  • the separation column is not limited, and for example, a reverse phase column can be used.
  • the reverse phase column include a column using ethylene crosslinked hybrid (BEH) particles having strong resistance to an alkaline mobile phase, a column packed with an octadecylsilylated silica gel filler (ODS column), a C8 column, and a C2 column. Examples thereof include a column in which an ion exchange resin is blended.
  • a column (BEH column) packed with ethylene crosslinked hybrid particles having a particle size of 5.0 ⁇ m or less, and a BEH column having a particle size of 1.7 to 3.5 ⁇ m is more preferable.
  • conditions used for liquid chromatography are not particularly limited, and the type of substance to be analyzed and the sample so that the substance to be analyzed contained in the sample is separated from other components and eluted from the column. It can be appropriately selected according to various conditions such as the type of. That is, in the separation step, the concentration of the mobile phase such as methanol in the mobile phase can be changed. Methanol may or may not be contained in the mobile phase during the entire separation step.
  • an isocratic elution method or a gradient elution method may be appropriately selected, but it is of course necessary to sufficiently separate the contaminants that can be confirmed on the chromatogram from the object to be measured, and on the chromatogram. Although it cannot be confirmed by, it is preferable to keep the retention time long because the components derived from the matrix may adversely affect the ionization efficiency.
  • Specific gradient conditions include, for example, the conditions described in Examples described later.
  • the conditions of the gradient are not particularly limited, and for example, ethanol, isopropanol, acetonitol and the like can be used instead of methanol.
  • the separation step may include a step of increasing the methanol concentration in the mobile phase. That is, for example, the methanol concentration can be gradiented so that the methanol concentration (v / v) in the mobile phase gradually increases from the first concentration (M1) to the second concentration (M2).
  • M1 and M2 can be appropriately set according to various conditions such as the type of the substance to be analyzed and the type of contaminants.
  • the methanol concentration may be, for example, 0% or more, 1% or more, 3% or more, 5% or more, 10% or more, 20% or more, or 50% or more, and 100% or less, 99% or less, 75% or less. , 50% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, or 10% or less.
  • the methanol concentration may be, for example, 10% to 90%.
  • the methanol concentration may be gradiented so that the methanol concentration (v / v) in the mobile phase gradually increases from 0% to 100%.
  • the rate of change in methanol concentration may or may not be constant.
  • the methanol concentration may be repeatedly increased or decreased until it changes from M1 to M2.
  • the methanol concentration may change further after reaching M2.
  • the methanol concentration may be further increased, decreased, or repeatedly increased or decreased after reaching M2.
  • the methanol concentration may be repeatedly increased or decreased after reaching M2 until it changes to M1 again. For example, after reaching M2, it may decrease to 0%.
  • the concentration gradient can be formed by mixing two or more solutions with different compositions while changing the mixing ratio.
  • the combination of solutions can be appropriately selected so that the desired gradient is formed.
  • the concentration of methanol in the two or more solutions is such that the concentration of methanol in the mixed mobile phase is in the mobile phase exemplified above.
  • the concentration of methanol can be appropriately set according to the mixing ratio.
  • the pH of the mobile phase can be appropriately set according to various conditions such as the type of the substance to be analyzed and the type of contaminants.
  • the preferred range of mobile phase composition and pH can be set to increase the ionization efficiency of the substance under analysis in mass spectrometry performed following liquid chromatography. That is, specifically, it is preferable that the composition and pH of the mobile phase at the time when the substance to be analyzed is eluted from the column are set so that the ionization efficiency of the substance to be analyzed is high in mass spectrometry.
  • pH 1 to 14 is preferable
  • pH 4 to 12 is preferable
  • pH 6 to 10 is more preferable.
  • the flow velocity can be appropriately selected according to various conditions such as the inner diameter of the separation column.
  • the flow rate of the mobile phase may or may not be constant throughout the separation step. For example, it can be appropriately selected in the range of 0.001 to 2.0 mL / min according to the electrospray method (ESI).
  • the flow rate of the mobile phase in liquid chromatography may be, for example, 0.05 to 1.0 mL / min.
  • the column temperature in the liquid chromatography can be appropriately selected by those skilled in the art according to the specifications of the analysis target and the analysis column to be used. For example, it may be 10 to 90 ° C., specifically, it may be around 30 to 80 ° C.
  • Mass spectrometer As the mass spectrometer, a known mass spectrometer can be used, but a mass spectrometer that can be connected in series with the LC device is particularly preferable because it can be easily used.
  • the mass spectrometer used may be one, two or more. Two or more mass spectrometers may be connected and used in parallel.
  • the LC-MS system may be, for example, LC-MS, LC-MS / MS or LC-MS n . Specifically, for example, AB SCIEX Triple Quad® 5500, Triple Quad® 6500, Triple Quad® 6500+, QTRAP® 5500, QTRAP® 6500.
  • QTRAP registered trademark 6500+, TripleTOF (registered trademark) 5600, TripleTOF (registered trademark) 5600+, TripleTOF (registered trademark) 6600, TripleTOF (registered trademark) 6600+, etc.
  • Focus Q Exactive TM, Q Exactive TM Plus, Q Exactive TM HF, Q Exactive TM HF-X, Orbitrap ID-X Tribrid, Orbitrap Fusion TM Tribrid TM, Orbitrap Fusion (Trademark) Lumos (Trademark) Tribrid (Trademark), Orbitrap Eclipse and the like.
  • Examples of the detection method in the mass spectrometer include ion trap type, quadrupole type, quadrupole tandem type, quadrupole ion trap hybrid type, sector type, flight time type, quadrupole flight time hybrid type, and Fourier. Transform type, quadrupole Fourier transform hybrid type and the like can be mentioned. Further, an ion mobility system can be mounted on these. Examples of the ionization method in the mass spectrometer include an electrospray method (ESI), an atmospheric chemical ionization method (APCI), and a photoionization method (APPI). The detection method and the ionization method can be appropriately selected according to various conditions such as the type of the substance to be analyzed.
  • ESI electrospray method
  • APCI atmospheric chemical ionization method
  • APPI photoionization method
  • the ion ratio obtained by the analysis of the standard product and the spectrum or fragment ion spectrum obtained by the analysis of the sample (the spectrum obtained by the analysis of the sample)
  • the substance to be analyzed contained in the sample can be identified.
  • the purified or synthesized substance to be analyzed is used as a standard product, and the spectrum (including the precise mass spectrum) obtained by analyzing the standard product and the sample to be analyzed are obtained.
  • the substance to be analyzed contained in the sample can be identified by comparing with the obtained chromatogram.
  • the substance to be analyzed for which there is no standard product if it is an unknown substance to be analyzed, for example, it is confirmed by structural estimation or the like that the substance separated by liquid chromatography is the substance to be analyzed. Then, it can be added to the subject of analysis of the present invention.
  • a method for confirming an unknown substance to be analyzed can be appropriately selected and carried out by a person skilled in the art. For example, it can be confirmed that the substance is to be analyzed by isolation and purification.
  • the substance to be analyzed can be quantified based on the result of mass spectrometry.
  • the quantification of the substance to be analyzed can be carried out by a conventional method. Specifically, for example, the peak area ratio (or peak height value) obtained by dividing the detected peak area value (or peak height value) of the substance to be analyzed by the peak area value (or peak height value) of the internal standard substance having a known concentration.
  • the substance to be analyzed can be quantified based on the peak height ratio).
  • the liquid chromatography apparatus, mass spectrometer, and various elements provided therein can be appropriately selected according to various conditions such as the type of the substance to be analyzed and the type of contaminants with reference to the above-exemplified analytical conditions.
  • a further aspect of the present invention is a method for preventing deterioration of the mobile phase, which comprises bubbling the mobile phase of liquid chromatography containing a basic ion pair reagent (hereinafter, "prevention of deterioration of the first mobile phase of the present invention”. There is a “method”).
  • a further aspect of the present invention is a method for preventing deterioration of the mobile phase, which comprises a step of preparing a mobile phase in which a basic ion pair reagent is dissolved in a non-aqueous solvent, mixing it with a mobile phase containing water, and using it for liquid chromatography.
  • the method for preventing deterioration of the first mobile phase of the present invention and the method for preventing deterioration of the second mobile phase of the present invention are basic ion pair reagents in the mobile phase in liquid chromatography, liquid chromatography-mass spectrometry. It is possible to prevent the deterioration of the mobile phase by preventing the deterioration of the mobile phase.
  • the matters described in the analysis method of the present invention are all applied to the description of the method for preventing deterioration of the mobile phase of the present invention.
  • a further aspect of the present invention is a liquid chromatography device using a mobile phase containing a basic ion pair reagent for separating a sample containing an ionic analysis target substance, a mass spectrometer for analyzing the analysis target substance, and a mass spectrometer.
  • the present invention relates to an analyzer (hereinafter, may be referred to as “analyzer of the present invention”) including a mobile phase deterioration prevention device.
  • a container for supplying a mobile phase containing a basic ion pair reagent (2) A pump having a function of sending the mobile phase.
  • a liquid chromatography device that separates a sample containing a substance to be analyzed.
  • a mass spectrometer that analyzes the substance to be analyzed.
  • Another embodiment of the analyzer of the present invention further includes a means and software for managing and controlling mobile phase bubbling.
  • a container for supplying a mobile phase containing water and a container for supplying a mobile phase containing a basic ion pair reagent in a non-aqueous solvent (2)
  • a liquid chromatography apparatus that separates a sample containing a substance to be analyzed by using the generated mixed solution as a mobile phase.
  • a mass spectrometer that analyzes the substance to be analyzed.
  • a container for supplying a mobile phase containing water, a container for supplying a mobile phase containing an organic solvent, and a container for supplying a mobile phase containing a basic ion pair reagent in a non-aqueous solvent (2) A pump having a function of sending each of the above liquids to the mixing section. (3) A mixer having a function of mixing three liquids at high speed and uniformly. (4) A liquid chromatography apparatus that separates a sample containing a substance to be analyzed by using the generated mixed solution as a mobile phase. (5) A mass spectrometer that analyzes the substance to be analyzed.
  • the above description is merely an example and does not indicate the application limit of the analyzer according to the present invention. That is, the analyzer according to the present invention is not limited to the embodiments in the present specification, and various modifications can be made as long as the gist of the present invention is not exceeded.
  • Example 1 Preparation of standard solution >> (1) Materials Mipomersen (Mipomersen-LNA, Mipomersen-OMe, Mipomersen-S oligo) prepared using the following mipomersen (mipomersen-MOE) and other modified nucleic acids is a standard substance purchased from GeneDesign, Inc. Used as.
  • Mipomersen-MOE G (m) ⁇ 5 (m) ⁇ 5 (m) ⁇ T (m) ⁇ 5 (m) ⁇ a ⁇ g ⁇ t ⁇ 5 (x) ⁇ t ⁇ g ⁇ 5 (x) ⁇ t ⁇ t ⁇ 5 (x) ⁇ G (m) ⁇ 5 (m) ⁇ A (m) ⁇ 5 (m) ⁇ 5 (m) ⁇ 5 (m) ⁇ Mipomersen-LNA (Mip-LNA) G (L) ⁇ 5 (L) ⁇ 5 (L) ⁇ T (L) ⁇ 5 (L) ⁇ a ⁇ g ⁇ t ⁇ 5 (x) ⁇ t ⁇ g ⁇ 5 (x) ⁇ t ⁇ t ⁇ 5 (x) ⁇ G (L) ⁇ 5 (L) ⁇ A (L) ⁇ 5 (L) ⁇ 5 (L) ⁇ 5 (L) ⁇ 5 (L) ⁇ Mipom
  • Mipomersen-MOE, Mipomersen-LNA, Mipomersen-OMe, and Mipomersen-S oligos were dissolved in DNase and RNase-free purified water.
  • 323 ⁇ L of purified water was added to 231.8 ⁇ g of mipomersen-MOE to completely dissolve the solution, and the concentration was adjusted to 100 ⁇ mol / L, which was used as the standard solution of mipomersen-MOE.
  • 327 ⁇ L of purified water was added to 219.8 ⁇ g of mipomersen-LNA to completely dissolve the mixture to prepare a concentration of 100 ⁇ mol / L, which was used as a standard solution of mipomersen-LNA.
  • Mipomersen-OMe 238.3 ⁇ g was completely dissolved by adding 358 ⁇ L of purified water to prepare a concentration of 100 ⁇ mol / L, which was used as a mipomersen-OMe standard solution. 349 ⁇ L of purified water was added to 224.6 ⁇ g of mipomersen-S oligo to completely dissolve the mixture to prepare a concentration of 100 ⁇ mol / L, which was used as a standard solution of mipomersen-S oligo.
  • Mipomersen-MOE, Mipomersen-LNA, Mipomersen-OMe, Mipomersen-S oligo standard solution is water / methanol / HFIP / TEA / acetylacetone (50: 50: 1: 0.2: 0.01, v / v / v / v / v) Diluted 500-fold with a mass spectrometer tuning solution used for setting the optimum conditions for ionization and selecting the ions to be measured.
  • Mipomersen-MOE, Mipomersen-LNA, Mipomersen-OMe, Mipomersen-S oligo standard solution is diluted 2000 times with TE / methanol (7: 3, v / v) to prepare a mixed solution of 50 nmol / L. It was used as a standard solution for spectrum intensity monitoring.
  • Example 2 Determination of mass spectrometry conditions >> A mass spectrometer tuning solution was introduced into the ion source using a syringe pump. At that time, the mobile phase mixed using an HPLC pump (LC-20A, manufactured by Shimadzu Corporation) was introduced into the ion source together with the tuning solution.
  • HPLC pump LC-20A, manufactured by Shimadzu Corporation
  • the spray position of the ion source of the mass spectrometer (TripleTOF5600, AB SCIEX) was adjusted so that this ionic strength became the highest.
  • the declustering potential orifice voltage; DP
  • the applied high voltage ion spray voltage; IS
  • the gas pressures of GS1 and GS2 GS1, GS2
  • the temperature TEM
  • the product ion (daughter ion) was searched from the precursor ion (parent ion), and the energy voltage (CE) involved in collision cleavage was adjusted so that the ion intensity was maximized.
  • Tables 2 and 3 show the mass spectrometry conditions determined by the above method.
  • Table 2 shows the common ionization conditions.
  • Table 3 shows the mass spectrometric conditions (MS / MS conditions) for each component.
  • Mipomersen-MOE, Mipomersen-LNA, and Mipomersen-OMe used 9-valent ions and 10-valent ions as precursor ions
  • Mipomersen-S oligo used 8-valent ions and 9-valent ions as precursor ions.
  • Example 3 Setting of HPLC conditions >> Using the standard solution for spectrum intensity monitoring prepared in Example 1, HPLC conditions capable of separating mipomersen-MOE, mipomersen-LNA, mipomersen-OMe, and mipomersen-S oligo were examined.
  • the Shimadzu LC-20A system (manufactured by Shimadzu Corporation) is used as the HPLC apparatus, and the HPLC column is ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column (particle size 1.7 ⁇ m, inner diameter 2.1 mm ⁇ length 50 mm; manufactured by Waters). It was used.
  • ⁇ HPLC condition 2> In analyzing Mipomersen-MOE, Mipomersen-LNA and Mipomersen-OMe, water / methanol / HFIP / TEA (90: 10: 1: 0.2 :, v / v / v / v) (mobile phase A) as the aqueous mobile phase , Linear gradient conditions were set using methanol / water / HFIP / TEA (90: 10: 1: 0.2, v / v / v / v) (mobile phase B) as the organic solvent-based mobile phase. The flow velocity was 0.3 mL / min. Table 5 shows an example of gradient conditions.
  • Example 4 Confirmation of the effect of the presence or absence of nitrogen bubbling on the mobile phase on the measurement of mipomersen-MOE and mipomersen-S oligos >> Using ⁇ HPLC Condition 1>, the change in peak intensity in the continuous analysis of mipomersen-MOE and mipomersen-S oligos was performed with and without nitrogen bubbling (2 mL / min) in the mobile phase (1 L). confirmed. In addition, the Mipomersen-MOE peak area value / Mipomersen-S oligo peak area value was calculated as the peak area ratio, and the transition of the peak area ratio in the continuous analysis was also confirmed.
  • Fig. 1 Changes in peak area values of mipomersen-MOE and mipomersen-S oligos without nitrogen bubbling (160 consecutive analyzes) are shown in Fig. 1, peaks of mipomersen-MOE / mipomersen-S oligos without nitrogen bubbling.
  • Figure 2 shows the transition of the area ratio (160 consecutive analyzes)
  • Fig. 3 shows the transition of the peak area values of mipomersen-MOE and mipomersen-S oligo when nitrogen bubbling was applied
  • Figure 4 shows the transition of the peak area ratio of mipomersen-MOE / mipomersen-S oligo (160 consecutive analyzes).
  • Example 5 Confirmation of the effect of the presence or absence of nitrogen bubbling on the mobile phase on the measurement of mipomersen-MOE, mipomersen-LNA and mipomersen-OMe >> In the continuous analysis of mipomersen-MOE, mipomersen-LNA and mipomersen-OMe using ⁇ HPLC Condition 2>, for the purpose of confirming whether similar results can be obtained with compounds using modified nucleic acids other than Example 4. Changes in peak intensity were confirmed with and without nitrogen bubbling in the mobile phase.
  • Mobile phase A Water mobile phase B: Methanol Mobile phase C: Methanol / HFIP / TEA (100: 1: 0.2, v / v / v) (Mobile phase C should be nitrogen bubbling)
  • Mobile phase C should be nitrogen bubbling
  • Example 7 Preparation of standard solution >> (1) Materials ⁇ UA-GalNAc, 4S (Chondroitin Sulfate A) (C 14 H 19 NO 14 SNa 2 , MW: 503.34), ⁇ UA-GalNAc, 4S, 6S (Chondroitin Sulfate E) (C 14 H 18 NO) shown below. 17 S 2 Na 3 , MW: 605.39) and ⁇ UA-2S GlcNCOEt-6S (internal standard substance) (C 15 H 20 NO 17 S 2 Na 3 , MW: 619.42) are purchased from Iduron Ltd. as standard substances. used.
  • CS-A, CS-E and IS are diluted 1000-fold with water / HFIP / OA (100: 1: 0.124, v / v / v) and used to set the optimum conditions for ionization and select the ions to be measured.
  • the mass spectrometer tuning solution was used.
  • Example 8 Determination of mass spectrometry conditions >> A mass spectrometer tuning solution was introduced into the ion source using a syringe pump. At that time, the mobile phase mixed using an HPLC pump (LC-20A, manufactured by Shimadzu Corporation) was introduced into the ion source together with the tuning solution.
  • HPLC pump LC-20A, manufactured by Shimadzu Corporation
  • the declustering potential orifice voltage; DP
  • the applied high voltage ion spray voltage; IS
  • the gas pressures of GS1 and GS2 GS1, GS2
  • the temperature TEM
  • the product ion (daughter ion) was searched from the precursor ion (parent ion), and the energy voltage (CE) involved in collision cleavage was adjusted so that the ion intensity was maximized.
  • Tables 6 and 7 show the mass spectrometry conditions determined by the above method.
  • Table 6 shows the common ionization conditions.
  • Table 7 shows the mass spectrometric conditions (MS / MS conditions) for each component.
  • Example 9 Setting of HPLC conditions >> Using the standard solution for confirming the change in peak intensity prepared in Example 1, the HPLC conditions under which Chondroitin Sulfate A, Chondroitin Sulfate E and the internal standard substance could be separated were examined.
  • a Shimadzu LC-20A system (manufactured by Shimadzu Corporation) is used as the HPLC device, and an ACQUITY UPLC BEH C18 Column (particle size 1.7 ⁇ m, inner diameter 2.1 mm ⁇ length 100 mm; manufactured by Waters) is used as the HPLC column. used.
  • ⁇ HPLC condition 3> In analyzing Chondroitin Sulfate A and E, water / HFIP / OA (100: 1: 0.124, v / v / v) (mobile phase A) as the aqueous mobile phase and acetonitrile / water / HFIP / as the organic solvent mobile phase.
  • Linear gradient conditions were set using OA (75: 25: 1: 0.124, v / v / v / / v) (mobile phase B). The flow velocity was 0.2 mL / min. Table 8 shows an example of gradient conditions.
  • Fig. 12 shows the transition of the area value of Chondroitin Sulfate A with and without nitrogen bubbling (52 consecutive analyzes)
  • Fig. 13 shows the transition of the area value of Chondroitin Sulfate E with and without nitrogen bubbling (52 consecutive analyzes)
  • the internal standard with and without nitrogen bubbling
  • Figure 14 shows the transition of the peak area value of the substance ( ⁇ UA-2S GlcNCOEt-6S) (52 consecutive analyzes).
  • the peak height, peak area, peak height ratio and peak of the compound to be measured and the standard substance thereof are measured over a long period of time. Since the area ratio can be stably detected, many samples can be used for measurement at one measurement opportunity, and an accurate concentration measurement value can be obtained. Further, the present invention eliminates the need for frequent remodeling due to deterioration of the mobile phase.
  • the reagent used for the mobile phase preparation is very expensive, and it can be expected that the cost burden will be reduced and the labor time required for the preparation of the reagent of the preparer will be reduced.

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Abstract

本発明は、核酸医薬品等のイオン性の物質の液体クロマトグラフィー－質量分析において、高感度を保ったまま、長時間にわたり連続的に分析することのできる手段を提供することを課題とする。イオン性の分析対象物質を含む試料を、塩基性イオンペア試薬を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィーに付し、さらに質量分析に付す工程を含む分析方法であって、前記移動相の劣化を防止する操作を行うことを特徴とする、分析対象物質の分析方法を提供する。

Description

核酸医薬品等の分析方法
　本発明は、液体クロマトグラフィーの移動相の劣化を防止した、液体クロマトグラフィー－質量分析による核酸医薬品等のイオン性の物質の分析方法等に関する。なお、本明細書における「分析」には、分析対象物質の量を定性的、定量的または半定量的に決定する「測定」の意味が含まれる。
　近年、生体試料中に含まれる微量物質を分析することの重要性が益々高まっている。特に、疾患によって誘導、消失等の変動があるバイオマーカータンパク質の分析だけでなく、モノヌクレオチドやモノヌクレオチドの代謝物、修飾体、複数のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、糖、糖鎖等の物質のようなイオン性の物質についても、同様に高精度な分析が望まれている。生体試料中に含まれるイオン性の物質の分析としては、核酸医薬品を正確に分析する方法も求められている。
　核酸医薬品は、（修飾）核酸が十～数十塩基程度連結したオリゴヌクレオチドで構成され、直接生体に作用するもので、化学合成により製造される医薬品である。核酸医薬品は、直接生体で、特定のタンパクの発現を抑制する等の作用を持ち、これまで治療の難しかった疾病に対する新たな治療方法を提供するものとして期待されている。また、いくつかの核酸医薬品について、既に製造販売承認が得られている。
　イオン性の物質を測定する場合、例えば、オリゴヌクレオチドの分析方法としては、液体クロマトグラフィー－質量分析による分析方法が知られている（特許文献１）が、医薬品の製造管理等にあたっては、長時間にわたる連続的な分析においても感度が低下せずに分析可能な、より高精度な分析手段を用いることが望ましい。
特表2012-500394号公報
　本発明は、核酸医薬品等のイオン性の物質（以下、単に核酸医薬品等と称する場合がある）を液体クロマトグラフィー－質量分析において、高感度を保ったまま、長時間にわたり連続的に分析することのできる手段を提供することを課題とする。
　本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、核酸医薬品等のイオン性の物質を液体クロマトグラフィー－質量分析によって測定する場合において、特に長時間にわたる連続的な分析において感度低下が起こることを知見した。また、このような連続的な分析における感度低下が、移動相中の塩基性イオンペア試薬の劣化に起因していることを知見した。そして、移動相中の塩基性イオンペア試薬の劣化を防止することにより、移動相の劣化を防止できることを知見し、同知見に基づいて本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　イオン性の分析対象物質を含む試料を、塩基性イオンペア試薬を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィーに付し、さらに質量分析に付す工程を含む分析方法であって、
　前記移動相の劣化を防止する操作を行うことを特徴とする、分析対象物質の分析方法。
［２］　移動相の劣化を防止する操作が、移動相を不活性ガスでバブリングすることを含む、［１］に記載の方法。
［３］　移動相の劣化を防止する操作が、さらに移動相の不活性ガスでのバブリングを管理・制御することを含む、［２］に記載の方法。
［４］　移動相の劣化を防止する操作が、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相を用いることを含む、［１］～［３］の何れかに記載の方法。
［５］　塩基性イオンペア試薬が、アミン化合物である、［１］～［４］の何れかに記載の方法。
［６］塩基性イオンペア試薬が、水酸化テトラエチルアンモニウム（TEA-OH）、水酸化テトラブチルアンモニウム（TBAOH）、N,N-ジメチルブチルアミン（DMBA）、オクチルアミン（OA）、トリプロピルアミン（TPA）、N,N-ジメチルヘキシルアミン（DMHA）、ジイソプロピルアミン（DIPA）、N-メチルジブチルアミン（MDBA）、プロピルアミン（PA）、トリエチルアミン（TEA）、ヘキシルアミン（HA）、トリブチルアミン（TBA）、N,N-ジメチルシクロヘキシルアミン（DMCHA）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、テトラメチルエチレンジアミン（TMEDA）、1,8-ジアザビシクロ [5.4.0]undec-7-ene (DBU)、ジプロピルアンモニウムアセテート（DPAA）、ジブチルアンモニウムアセテート（DBAA）、ジアミルアンモニウムアセテート（DAAA）、およびジヘキシルアンモニウムアセテート（DHAA）から選ばれる少なくとも１種以上である、［１］～［５］の何れかに記載の方法。
［７］　イオン性の分析対象物質が、プリン化合物、プリン化合物類縁体、ピリミジン化合物、またはピリミジン化合物類縁体を含むヌクレオシド；ヌクレオチド、環状ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、ヌクレオチド三リン酸；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ、ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ、ＦＡＤＨ）、補酵素Ａ（コエンザイムＡ）、テトラヒドロメタノプテリン（Ｈ４ＭＰＴ）、Ｓ-アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、および３'-ホスホアデノシン-５'-ホスホ硫酸から選ばれるヌクレオシドを含む補酵素；それらの代謝中間体、ならびにその還元水素受容物および修飾体；オリゴヌクレオチド、糖、および糖鎖から選ばれる少なくとも１種以上である、［１］～［６］の何れかに記載の方法。
［８］　オリゴヌクレオチドが、アンチセンス、デコイ、siRNA、miRNA、リボザイム、CpGオリゴおよびアプタマーから選ばれる少なくとも１種以上の核酸医薬品である、［７］に記載の方法。
［９］　糖、および糖鎖が、単糖類、二糖類、およびオリゴ糖類から選ばれる少なくとも１種以上である、［７］に記載の方法。
［１０］　不活性ガスが、窒素ガス、アルゴンガス、ネオンガス、クリプトンガス、キセノンガスおよびヘリウムガスから選ばれる少なくとも１種以上である、［２］～［９］の何れかに記載の方法。
［１１］　塩基性イオンペア試薬を含む液体クロマトグラフィーの移動相をバブリングする工程を含む、
　移動相の劣化の防止方法。
［１２］　塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒に溶解した移動相を用意し、水を含む移動相と混合し、液体クロマトグラフィーに用いる工程を含む、
　移動相の劣化の防止方法。
［１３］　イオン性の分析対象物質を含む試料を分離する、塩基性イオンペア試薬を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィー装置、
　分析対象物質を分析する、質量分析装置、および、
　移動相の劣化防止装置、
　とを備える、分析装置。
［１４］　移動相の劣化防止装置が、移動相のガスバブリング装置である、［１３］に記載の分析装置。
［１５］　移動相の劣化防止装置が、さらに移動相のバブリングを管理・制御するための手段およびソフトウェアを含む、［１４］に記載の分析装置。
［１６］　移動相の劣化防止装置が、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相を、水を含む移動相と混合する装置である、［１３］に記載の分析装置。
　本発明によれば、核酸医薬品等のイオン性の物質の液体クロマトグラフィー－質量分析において、高感度を保ったまま、長時間にわたり連続的な分析が可能となる。
図1は、窒素バブリングを行わなかった時のミポメルセン-MOEおよびミポメルセン-Sオリゴのピーク面積値の推移（160回連続分析）を示す図である。 図2は、窒素バブリングを行わなかった時のミポメルセン-MOE／ミポメルセン-Sオリゴのピーク面積比の推移（160回連続分析）を示す図である。 図3は、窒素バブリングを施した時のミポメルセン-MOEおよびミポメルセン-Sオリゴのピーク面積値の推移（160回連続分析）を示す図である。 図4は、窒素バブリングを施した時のミポメルセン-MOE／ミポメルセン-Sオリゴのピーク面積比の推移（160回連続分析）を示す図である。 図5は、窒素バブリングを行わなかった時のミポメルセン-MOEのピーク面積値の推移（240回連続分析）を示す図である。 図6は、窒素バブリングを行わなかった時のミポメルセン-OMeのピーク面積値の推移（240回連続分析）を示す図である。 図7は、窒素バブリングを行わなかった時のミポメルセン-LNAのピーク面積値の推移（240回連続分析）を示す図である。 図8は、窒素バブリングを施した時のミポメルセン-MOEのピーク面積値の推移（240回連続分析）を示す図である。 図9は、窒素バブリングを施した時のミポメルセン-OMeのピーク面積値の推移（240回連続分析）を示す図である。 図10は、窒素バブリングを施した時のミポメルセン-LNAのピーク面積値の推移（240回連続分析）を示す図である。 図11は、劣化の原因となっている移動相の確認結果を示す図である。 図12は、窒素バブリング有無におけるCS-Aのピーク面積値の推移（52回連続分析）を示す図である。 図13は、窒素バブリング有無におけるCS-Eのピーク面積値の推移（52回連続分析）を示す図である。 図14は、窒素バブリング有無における内標準物質（ΔUA-2S GlcNCOEt-6S）のピーク面積値の推移（240回連続分析）を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について、説明する。
＜分析対象物質の分析方法＞
　本発明の一態様は、イオン性の分析対象物質を含む試料を、塩基性イオンペア試薬を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィーに付し、さらに質量分析に付す工程を含む分析方法であって、前記移動相の劣化を防止する操作を行うことを特徴とする、分析対象物質の分析方法（以下、「本発明の分析方法」ということがある）に関する。
　本発明において用いられる塩基性イオンペア試薬としては、移動相中でイオン性の分析対象物質とイオンペア（イオン対）を形成しうる塩基性化合物であれば特に限定はされないが、アミン化合物等の塩基性化合物が好ましく用いられる。
　アミン化合物としては、例えば、炭素数1～10（好ましくは炭素数2～8、炭素数2～6等）のアルキル基を有する脂肪族アミン、炭素数6～20の芳香族アミン、炭素数3～20の複素環式アミン、またはそれらの塩等が挙げられる。塩としては、限定されないが、例えば、臭化物塩、塩化物塩、水酸化物塩、硫酸塩、硝酸塩、塩酸塩、酢酸塩等が挙げられる。
　アミン化合物である塩基性化合物としては、例えば、水酸化テトラエチルアンモニウム（TEA-OH）、水酸化テトラブチルアンモニウム（TBAOH）、N,N-ジメチルブチルアミン（DMBA）、オクチルアミン（OA）、トリプロピルアミン（TPA）、N,N-ジメチルヘキシルアミン（DMHA）、ジイソプロピルアミン（DIPA）、N-メチルジブチルアミン（MDBA）、プロピルアミン（PA）、トリエチルアミン（TEA）、ヘキシルアミン（HA）、トリブチルアミン（TBA）、N,N-ジメチルシクロヘキシルアミン（DMCHA）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、テトラメチルエチレンジアミン（TMEDA）、1,8-ジアザビシクロ [5.4.0]undec-7-ene (DBU)、ジプロピルアンモニウムアセテート（DPAA）、ジブチルアンモニウムアセテート（DBAA）、ジアミルアンモニウムアセテート（DAAA）、ジヘキシルアンモニウムアセテート（DHAA）等が挙げられるが、これらに限られない。当業者であれば分析対象物質ごとに、適切な塩基性イオンペア試薬を選択し適宜条件を検討して使用することができる。塩基性イオンペア試薬は、１種または２種以上を使用してよい。
　本発明者等は、核酸医薬品等のイオン性の分析対象物質の液体クロマトグラフィー－質量分析において、高感度を保ったまま、連続的に分析する手段について、鋭意検討を行った。
　本発明者等は、核酸医薬品等のイオン性の分析対象物質の液体クロマトグラフィー－質量分析において、時間経過とともにピーク強度が低下する現象を知見した。本発明者等は、連続的な分析における経時的な感度低下を防止するために、塩基性イオンペア試薬の劣化防止が必要と推察し、劣化防止手段を検討した。
　その結果、第一の手段として、液体クロマトグラフィーの移動相を不活性ガスでバブリングし、移動相の酸素を除去することで、塩基性イオンペア試薬の劣化を防止でき、液体クロマトグラフィー－質量分析における感度低下を抑制できることを知見した。
　さらに、第二の手段として、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相を用意し、水を含む移動相と、液体クロマトグラフィーへの注入直前に混合することで、塩基性イオンペア試薬の劣化を防止でき、液体クロマトグラフィー－質量分析における感度低下を抑制できることを知見した。
　本発明は、このようにしてなされたものである。
≪劣化防止工程≫
　本発明のより具体的な一態様は、移動相の劣化を防止する操作が、移動相を不活性ガスでバブリングすることを含む、本発明の分析方法に関する。
　バブリングは、移動相中の酸素を除去することが可能な態様であれば限定されないが、例えば、移動相を保持する容器に対して、不活性ガスを吹き込んでバブリング処理を行うガスバブリング装置を用いて行うことができる。不活性ガスの流量は、測定環境、試料、使用する移動相、移動相の総量等に応じ、変更可能であり、特に限定されないが、例えば、移動相1Lあたり、0.1～200 mL/min、好ましくは0.1～20 mL/min、更に好ましくは0.1～10 mL/min等の量を挙げることができる。
　不活性ガスの吹き込みは、連続的または間欠的であってよく、不活性ガスの吹き込み量を減らすときには、一度に減らしてもよいし、段階的に減らしていってもよい。不活性ガスの流量は、例えば、Agilent社製のADM1000を使用して測定することができる。
　具体的なバブリングの方法としては、当業者であれば移動相の組成や液体クロマトグラフィーの分離に影響を与えない範囲で、移動相の入っている容器の大きさ、形状、密閉性を考慮して流量を適宜設定することができる。例えば、移動相調製直後に超音波槽を用いて脱気を行った後、不活性ガスを約100 mL/min程度で数分間バブリングを行った後、供給する不活性ガスの流量を0.1～10 mL/minに変更してもよい。
　限定されるものではないが、移動相のバブリングに用いるガスバブリング装置の一実施形態を、以下に説明する。
　ガスバブリング装置には、供給された高純度の不活性ガスを吹き込むための不活性ガス供給配管を備えられる。不活性ガス供給配管は、移動相容器内に挿入される。不活性ガス供給配管の材質、形状、設置位置（移動相中における深度等）は、常法に基づいて、適宜選択し得る。また、ガスバブリング装置には、不活性ガス供給配管に流す不活性ガスの流量を調整する流量調整弁が備えられてもよい。そして、ガスバブリング装置は、流量調整弁で調整された流量の不活性ガスを、不活性ガス供給配管を介して移動相容器内の移動相中に吹き込んでバブリング処理を行う。また、移動相より排出された酸素を含む空気を容器外に排出するために、排出配管を設けてもよい。また、ガスバブリング装置によるガスバブリングを管理・制御する装置、制御コンピューター等の手段をさらに備え、その管理・制御装置の性能として、一定時間毎にバブリングを行う、止めるの制御をしてもよい。また、濃度計で測定した溶存酸素濃度に基づいて、ガスバブリング装置を管理・制御する管理・制御装置をさらに備え、管理・制御装置は、濃度計で測定した溶存酸素濃度が所定の値以上になった場合にガスバブリング装置により吹き込む不活性ガスの量を増加させ、濃度計で測定した溶存酸素濃度が所定の値未満になるように前記ガスバブリング装置を制御してもよい。
　なお、これらのバブリングの実施において、バブリングが行われていることを管理するための手段として、ガスバブリングを管理・制御する手段に、バブリングの制御（例えば、吹き込むガスの量、または、移動相の容器中の圧力が規定値以下になった場合バブリング量を増加させる工程を実行させる）、および／または、吹き込んだ不活性ガスの量や、移動相として使用される溶媒を供給するための容器中の圧力等の測定、記録を実行させるためのソフトウェア等の手段を備えていてもよい。このような手段を備えていることは、例えば、医薬品開発時において取得された結果の信頼性を担保するための手段として記録保持が求められており、そのような要求に応えることができるため、好ましい。
　不活性ガスは、分析に影響せず、溶存酸素を排出することができるものであれば限定されないが、アルゴンガス、ヘリウムガス、ネオンガス、クリプトンガス、キセノンガス、または窒素ガス等を用いることができる。不活性ガスは、１種または２種以上であってよい。
　本発明の分析方法の別の一態様は、移動相の劣化を防止する操作として、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相を用いることを含む。
　限定されるものではないが、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相を用いる一実施形態を、以下に説明する。
　水を含む移動相と、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相とを別々に適当な容器内に用意する。これら以外に、適切な移動相を形成するために、さらに別の移動相を用いてもよい。それぞれの容器から送液する機能を有するポンプを用いて、ミキサーへ供給し、混合させる。
　ミキサーとしては、二液以上を高速かつ均一に混合する機能を有するミキサーであれば特に限定されないが、液体の分配・混合ユニットを少なくとも１つ有するミキサーを挙げることができる。そのようなミキサーとして、具体的には、液体クロマトグラフィー用グラジエントミキサー等を挙げることができる。
　ミキサーへ送液する際の総流量は、二液以上を高速で接触混合できれば特に限定されず、ミキサーの種類や内容積、ポンプの種類等により当業者が適宜調整すればよい。具体的には、液の総流量として、ミキサー内の内容積に対して、1分間に少なくとも0.25倍、2.5倍、25倍、250倍、2500倍、25000倍等の量を挙げることができる。
　水を含む移動相、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相および別の移動相との混合比は、溶媒の種類、溶液の濃度、分離対象物質、液体クロマトグラフィーカラムの種類等により適宜調整すればよい。塩基性イオンペア試薬を用いた常法の液体クロマトグラフィー－質量分析条件における移動相条件を参照することもできる。
　本明細書において、非水系溶媒とは、水を全く含まない溶媒だけでなく、可能な限り水を排除したものを含む。例えば、有機溶媒比率が40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上とすることができ、特に40%以上が好ましく、60%以上がより好ましく、80%以上である溶媒が最も好ましい。
　非水系溶媒は、分析系に影響せず、塩基性イオンペア試薬が劣化しない溶媒であれば、特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール等やアセトニトリル等の有機溶媒が挙げられる。非水系溶媒は、１種または２種以上を使用してよい。塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相について、上記の移動相のバブリングを行ってもよい。
　限定されるものではないが、移動相の一実施形態としては、例えば、以下のようなものが挙げられる。
　移動相A:水
　移動相B:メタノール
　移動相C:メタノール/ヘキサフルオロイソプロパノール/トリエチルアミン
　不活性ガスを使用したバブリングによる移動相の劣化防止をする第一の実施形態と、非水系溶媒を使用した移動相の劣化防止をする第二の実施形態とを組み合わせて実施をしてもよく、第一の実施形態と第二の実施形態とを行う順番を入れ替えて行ってもよい。
≪試料≫
　本発明に供する試料は、特に制限されず、例えば、製薬由来試料、生体由来試料、食品由来試料等が挙げられる。製薬由来試料は、例えば、製薬、製薬原料、製薬添加物等が挙げられる。生体由来試料は、上皮、上皮腺、結合組織、骨、血液、造血器、筋肉、神経、視覚器、聴覚器、リンパ系、外皮系、心血管系、呼吸器系、泌尿器系、上部消化管、下部消化管、消化腺、神経内分泌系、内分泌系、生殖器系、精子、卵といった生体のあらゆる部位に由来する試料を使用することができ、例えば、全血、血漿、血清、母乳、唾液、尿、便、喀痰、精液、または、膣、鼻、直腸、尿道もしくは咽頭の分泌物、排出物もしくはスワブ、涙管分泌液、バイオプシー組織試料、脳由来試料、肝臓由来試料、腎臓由来試料、皮膚由来試料、筋肉由来試料、心臓由来試料、食道由来試料、胃由来試料、小腸（十二指腸、空腸、回腸のいずれかまたは複数に跨る組織に由来する試料であってもよい）由来試料、虫垂由来試料、大腸（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、S状結腸、直腸のいずれかまたは複数に跨る組織に由来する試料であってもよい）由来試料、肛門由来試料、胆嚢由来試料、膵臓由来試料、尿管由来試料、脾臓由来試料、膀胱由来試料、副腎由来試料、血管由来試料、リンパ管由来試料、リンパ節由来試料、舌由来試料、眼球（硝子体、鋸状縁、毛様体筋、チン小帯、シュレム管、瞳孔、前眼房、角膜、虹彩、水晶体皮質、水晶体核、毛様体突起、結膜、下斜筋、下直筋、内側直筋、網膜の動静脈、視神経乳頭(視神経円板)、または硬膜、網膜中心動脈、網膜中心静脈、視神経、渦静脈、テノン嚢、黄斑、中心窩、強膜、脈絡膜、上直筋、網膜のいずれかまたは複数に跨る組織に由来する試料であってもよい）由来試料等が挙げられるが、これに限定されない。食品由来試料は、例えば、食品、食品原料、食品添加物等が挙げられる。試料の形態は、特に制限されず、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。固体試料の場合、溶媒等を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを試料として用いることができる。溶媒としては、試料を溶解でき、その後の分離、検出に影響しない溶媒であれば、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等が挙げられる。前記試料は、例えば、分析対象物質を含む試料でもよいし、分析対象物質を含むか不明の試料であってもよい。上記試料は、本発明の方法による分析前に、適宜前処理に供されてもよい。
≪分析対象物質≫
　分析対象物質は、イオン性の物質であれば特に限定されず、通常、液体クロマトグラフィー－質量分析の対象とされる種々の物質が含まれる。本発明においてイオン性の物質とは、イオン化されうる基を有する化合物をいい、イオン化されうる基を有するモノマーの単独重合体やその他のモノマーとの共重合体または縮重合体であってもよい。イオンは陰イオン性であれば特に限定されず、陰イオン化されうる基を有する化合物であればよい。また、陽イオン化されうる基も有する両性物質であってもよい（以下において、陰イオン性または両性の物質と称する場合がある）。特に、本発明の分析方法は、塩基性イオンペア試薬としてのトリエチルアミン等の劣化を防止でき、移動相の劣化を防止できる。したがって、本発明の分析方法の効果が好ましく発揮される観点から、陰イオン性または両性の分析対象物質が好ましく挙げられる。このような分析対象物質としては、限定されないが、例えば、プリン化合物、プリン化合物類縁体、ピリミジン化合物、またはピリミジン化合物類縁体を含むヌクレオシド、ヌクレオチド、環状ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、およびヌクレオチド三リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ、ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ、ＦＡＤＨ）、補酵素Ａ（コエンザイムＡ）、テトラヒドロメタノプテリン（Ｈ４ＭＰＴ）、Ｓ-アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、および３'-ホスホアデノシン-５'-ホスホ硫酸等のヌクレオシドを含む補酵素、それらの代謝中間体、ならびにその還元水素受容物および修飾体、オリゴヌクレオチド、糖、および糖鎖等が挙げられる。分析対象の分子量は、液体クロマトグラフィー－質量分析が可能である限り、限定されない。試料に含まれる分析対象物質は、１種または２種以上であってもよい。
　本発明の分析対象物質とされるオリゴヌクレオチドは、特に限定されず、DNA若しくはRNAである核酸、または修飾核酸等であってよい。オリゴヌクレオチドの好ましい例として核酸医薬品が挙げられ、アンチセンス、デコイ、siRNA、miRNA、リボザイム、CpGオリゴおよびアプタマー等の核酸医薬品に用いられるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。これらの核酸の修飾は、特に限定されず、糖部の2'位の修飾（2'-F、2'-O-Methyl（2'-OMe）、2'-O-Methoxyethyl（2'-MOE）等）、架橋型修飾（2',4'-BNA（2',4'-Bridged Nucleic Acid、別名LNA（Locked Nucleic Acid）等）、リン酸部のホスホロチオエート化（リン酸エステル部分の、リンと二重結合している酸素原子をイオウ原子に変えること）、核酸部のメチル化（5-methylcytosine（5-mC）等）等の自体周知の方法により生体内での安定性を高めたもの等であってよい。
　オリゴヌクレオチドとしては、限定されないが、例えば、10～100塩基、10～80塩基、10～50塩基、10～50塩基、または10～30塩基等であってよい。
　本発明の分析対象物質とされる糖および糖鎖は、特に限定されず、単糖類、二糖類、またはオリゴ糖類等であってよく、糖のみからなる単純糖質、その他の物質（タンパク質、脂質、合成高分子等を含む）を含む複合糖質のいずれに由来するか、天然物であるか合成物であるか等は問わない。本発明における糖および糖鎖には、糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンといった糖鎖や複合糖質が結合した状態のものであってもよいが、生体に由来するような微量の糖鎖や複合糖質を分析する場合には、糖および糖鎖部分を単離して回収したものを分析対象としてよい。この前処理方法は、目的とする分析対象物質の性質等に応じて、当業者であれば方法を適宜選択し、条件を設定して使用することができる。これらの前処理方法としては、例えば、ペプチドＮ-グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）、コンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼ等の酵素で糖鎖を切断する方法、トリプシンやアクチナーゼ等のプロテアーゼによるタンパク質部分の断片化、化学的にヒドラジン分解する方法、尿素および界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用した還元アルキル化等が知られているが、これらに限定されない。
　また、糖鎖や複合糖質は、測定目的に応じてエキソグリコシダーゼのような酵素を使用して、適宜切断して分析に使用することも可能である。
　本発明の分析対象物質とされる糖の好ましい例として、単糖類としてグルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、グルコサミン、N-アセチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびN-アセチルガラクトサミン、グルクロン酸、イズロン酸、フルクトース等が挙げられ、二糖類としてマルトース、トレハロース、スクロース、ラクツロース、イソマルトース、ラクトース、ラクトサミン、N-アセチルラクトサミン、セロビオース、メリビオース、グリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸等）のフラグメント等が挙げられ、オリゴ糖類としてマルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ラクトオリゴ糖、ラクトサミンオリゴ糖、N-アセチルラクトサミンオリゴ糖、セロオリゴ糖、メリビオオリゴ糖、グリコサミノグリカンのフラグメント等が挙げられ、単糖類が、炭素原子とほぼ同数の酸素原子をもつポリヒドロキシアルデヒド、ポリヒドロキシケトン、およびこれらの誘導体（例えば、アミノ基をもつアミノ糖、アルデヒド基または第一級ヒドロキシ基の部分がカルボキシル基となっているカルボン酸、アルデヒド基やケトン基がヒドロキシ基となっている多価アルコール等）等であってよく、並びに、それらの宿重合体を指すものであってよい。また、タンパク質、脂質等に結合している糖鎖や複合糖質の還元末端に存在し、糖鎖や複合糖質の構成成分として糖鎖やオリゴ糖の末端に存在するシアル酸をも対象とすることができる。このとき、シアル酸には、例えば、その水酸基がアセチル化等の修飾を受けているシアル酸誘導体も含むものとし、単体で存在する場合であっても対象とすることができる
　糖および糖鎖の分子量としては、限定されないが、例えば、GPC-HPLC法による重量平均分子量(Da)として、100～5,000Da、300～3,000Da、または400～1,000Da等であってよい。
≪液体クロマトグラフィー／質量分析≫
　本発明の分析方法における試料の測定は、液体クロマトグラフィー（LC）と質量分析装置（MS）を利用して実施する。液体クロマトグラフ装置と質量分析装置を使用したものであればよく、それぞれの装置は、互いに直列に接続されていてもよい。本発明の方法に用いられる装置としては、例えば、液体クロマトグラフィー装置と質量分析装置を直列につないで構成された、LC-MSシステムを好ましく用いることができる。LC-MSシステムを用いることにより、液体クロマトグラフィーにより分離された成分を、続けて質量分析することができる。液体クロマトグラフィーに質量分析装置を接続したLC-MSは、タンデム型のLC-MS／MS、LC－MS／MS／MS等を使用することもできる。
［液体クロマトグラフィー装置］
　液体クロマトグラフィー装置は、試料に含まれる分析対象物質を液体クロマトグラフィーにより分離できる装置であれば特に制限されないが、通常は、HPLC装置であるのが好ましい。HPLC装置は、分離カラム、および移動相を分離カラムに送り込むポンプを備える。HPLC装置は、それ以外の要素、例えば、デガッサー、オートサンプラー、ヒーター、分離された成分を検出する検出器等を備えていてもよい。検出器としては、例えば、UV検出器や蛍光検出器が挙げられる。例えば、検出器は、カラムとイオン源（イオン化部）の間に接続することができる。
　液体クロマトグラフィー（LC）は、より迅速に高感度で分離分析が可能な超高速液体クロマトグラフィー（Ultra High Performance Liquid Chromatography、以下、UHPLC、UPLC等と記載することがある）を用いてもよい。UHPLCは100 MPa程度での高圧送液が可能な液体クロマトグラフィーのことを意味し、より高速／高分離能での分析が可能な装置をさす。前記HPLCの他、本発明においては、UHPLC、UPLC等と称されるものも含まれる。これらの装置は、移動相を分離カラムに送り込むポンプを備える点において共通しており、それ以外の要素、例えば、デガッサー、オートサンプラー、ヒーター、検出器等を備えていてもよい。検出器としては、例えば、UV検出器や蛍光検出器が挙げられる。
　UPLCは、高圧に耐え得る粒子を充填したカラムを使用しており、HPLC装置に比べてより迅速に高感度で分離分析が可能である。UPLCによる分離条件はHPLCの条件設定を行う場合の検討と同様に行うことができ、当業者であれば適宜条件を設定できる。また、既知のHPLC分析法の条件をUPLCに適用する場合には、ACQUITY UPLC Columns Calculator等のソフトウェアを使用して条件検討を行うこともできる。
　液体クロマトグラフィーの移動相を不活性ガスでバブリングする場合のバブリングの実施において、バブリングが行われていることを管理するための手段として、ガスバブリングを管理・制御する手段に、バブリングの制御、および／または、吹き込んだ不活性ガスの量や、移動相として使用される溶媒を供給するための容器中の圧力等の測定、記録を実行させるためのソフトウェア等の手段を備えていてもよい。このような手段を備えていることは、例えば、医薬品開発時において取得された結果の信頼性を担保するための手段として記録保持が求められており、そのような要求に応えることができるため、好ましい。ソフトウェアを使用して、このような測定記録を管理したり、バブリング条件を設定してもよい。その場合、質量分析計、HPLCやUHPLCの装置において、測定条件を制御するソフトウェアにおいて、測定記録を管理したり、バブリング条件を設定できるようにしてもよいし、独立した別のソフトウェアとして使用してもよい。例えば、液体クロマトグラフィー装置と質量分析装置を直列につないで構成されたLC-MSシステムを使用する場合、質量分析計側でHPLCやUHPLCの条件を制御する場合があり、そのような場合には質量分析計に接続されたコンピューターにおいて測定記録の管理やバブリング条件を設定するソフトウェアを使用することができる。
［移動相］
　高速液体クロマトグラフィーに用いられる移動相（分離溶液）の条件としては、分析対象物質を分離でき、且つ、質量分析装置に適用可能な溶媒であることを満たすものであれば特に制限されずに使用することが可能である。例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトル等を使用することができる。溶媒は、１種または２種以上であってもよい。移動相は、分析対象物質を分析できる限り、他の成分を含有していてもよい。
　例えば、リン酸基やチオリン酸基を持つ様な、核酸医薬品等のイオン性の物質の測定の場合には、例えば、移動相としてアセチルアセトンとメタノールを使用して分析を行うことが好ましい。アセチルアセトンを利用することにより、イオン性の物質のリン酸基やチオリン酸基と金属イオンとが配位結合することによるピーク形状不良や、キャリーオーバーピークの溶出が改善され、検出できるため、好ましい。なお、アセチルアセトンと同様な効果を持つEDTAを使用してもよい。また、メタノールを利用することにより、イオン性の物質のオリゴヌクレオチド、糖、および糖鎖等の溶出時間を調節することができるため、好ましい。
　本発明の分析方法では、液体クロマトグラフィーの移動相は、陰イオン性または両性試料とイオンペア（イオン対）を形成させ、逆相カラムでの分離を可能とするために、イオンペア試薬としてトリエチルアミン（TEA）等の塩基性イオンペア試薬を含有する。塩基性イオンペア試薬の移動相中の濃度は、当業者であれば分析対象物質に応じて適宜設定することが可能であるが、例えば、トリエチルアミンを使用する場合、分析対象物質の種類、カラムの種類等の諸条件に応じて適宜選択することができるが、例えば、1～50 mM、または1～20 mM等であってよい。
　さらに、分離を容易にさせることや塩基性イオンペア試薬の気化を促進させる等の目的で、移動相に分析に影響しない添加剤を加えて使用することもできる。使用可能な添加剤としては、酢酸、水酸化アンモニウム、蟻酸アンモニウム（塩濃度＝100 mM以下）、酢酸アンモニウム（塩濃度＝100 mM以下）、炭酸水素アンモニウム（塩濃度＝100 mM以下）、トリフルオロ酢酸（TFA）、テトラヒドロフラン（THF）、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、ペンタフルオロプロパノール（PFP）、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-メチル-2-プロパノール（HFMIP）、トリフルオロエタノール（TFE）、またはノナフルオロ-tert-ブチルアルコール（NFTB）等が挙げられる。
［液体クロマトグラフィー条件］
　液体クロマトグラフィーに用いられる分析カラムの条件としては、特に制限されず、分析対象物質の種類、試料の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。分離カラムとしては、限定されないが、例えば、逆相カラムを用いることができる。逆相カラムとしては、例えば、アルカリ性移動相への耐性が強いエチレン架橋型ハイブリッド(BEH)粒子を用いたカラム、オクタデシルシリル化シリカゲル充填剤を充填したカラム（ODSカラム）、C8カラム、C2カラム、これらにイオン交換樹脂を配合したカラム等が挙げられる。特に、HPLCによる分析を行う場合には、粒径が5.0 μm以下のエチレン架橋型ハイブリッド粒子を充填したカラム（BEHカラム）を使用することが好ましく、1.7～3.5 μmのBEHカラムがさらに好ましい。
　液体クロマトグラフィーに用いられるその他の諸条件としては、特に制限されず、試料中に含有される分析対象物質が他の成分と分離されてカラムから溶出されるように、分析対象物質の種類、試料の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。
　すなわち、分離工程においては、移動相中のメタノール等の移動相の濃度を変化させることができる。メタノールは、分離工程の全期間において移動相に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。
　溶出法は、アイソクラティック溶出法やグラジエント溶出法を適宜選択すればよいが、クロマトグラム上で確認できる夾雑物と測定対象物を十分に分離する必要があることはもちろんのこと、クロマトグラム上では確認できないがマトリクス由来の成分がイオン化効率に悪影響を与える可能性があるため、保持時間を長く保つことが、好ましい。
　具体的なグラジエントの条件としては、例えば、後述する実施例に記載の条件が挙げられる。グラジエントの条件は特に限定されず、例えば、メタノールの代わりとしてエタノール、イソプロパノール、アセトニトル等が使用可能である。
　具体的には、分離工程は、移動相中のメタノール濃度を増大させる工程を含んでいてよい。すなわち、例えば、移動相中のメタノール濃度（v/v）が第１の濃度（M1）から第２の濃度（M2）まで徐々に増大するよう、メタノール濃度にグラジエントをかけることができる。M1およびM2は、分析対象物質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。メタノール濃度は、例えば、0%以上、1%以上、3%以上、5%以上、10%以上、20%以上、または50%以上であってよく、100%以下、99%以下、75%以下、50%以下、25%以下、20%以下、15％以下、または10%以下であってよい。メタノール濃度は、具体的には、例えば、10%～90%であってよい。具体的には、例えば、移動相中のメタノール濃度（v/v）が0%から100%まで徐々に上昇するよう、メタノール濃度にグラジエントをかけてよい。メタノール濃度の変化速度は、一定であってもよく、そうでなくてもよい。メタノール濃度は、M1からM2に変化するまでに、増減を繰り返してもよい。メタノール濃度は、M2に到達した後、さらに変化してもよい。例えば、メタノール濃度は、M2に到達した後、さらに増大してもよく、減少してもよく、増減を繰り返してもよい。例えば、メタノール濃度は、M2に到達した後、再度M1に変化するまでに増減を繰り返してもよい。例えば、M2に到達した後、0%まで減少してもよい。
　濃度のグラジエントは、組成の異なる２種またはそれ以上の溶液を、混合比率を変化させながら混合することで、形成することができる。溶液の組み合わせは、所望のグラジエントが形成されるよう、適宜選択することができる。
　２種またはそれ以上の溶液を混合して移動相を調製する場合、当該２種またはそれ以上の溶液中のメタノールの濃度は、混合後の移動相中のメタノールの濃度が上記例示した移動相中のメタノールの濃度となるよう、混合比率に応じて適宜設定することができる。
　移動相のpHは、分析対象物質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。移動相の組成およびpHの好ましい範囲は、液体クロマトグラフィーに続いて実施される質量分析において分析対象物質のイオン化効率が高くなるように設定することができる。すなわち、具体的には、分析対象物質がカラムから溶出される時点の移動相の組成およびpHが、質量分析において分析対象物質のイオン化効率が高くなるように設定されるのが好ましい。具体的な範囲としては、例えば、pH1～14がよく、pH4～12が好ましく、pH6～10付近がさらに好ましい。
　流速は、分離カラムの内径等の諸条件に応じて適宜選択できる。移動相の流速は、分離工程を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、エレクトロスプレー法（ESI）に合わせて0.001～2.0 mL/minの範囲で適宜選択することができる。液体クロマトグラフィーにおける移動相の流速は、例えば、0.05～1.0 mL/minであってよい。
　また、液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は、当業者であれば、分析対象や使用する分析カラムの仕様に合わせて適宜選択することができる。例えば、10～90℃であってよく、具体的には30～80℃付近であってよい。
［質量分析装置］
　質量分析装置は、公知の質量分析装置が使用できるが、特にLC装置に直列に接続することが可能なものは簡便に使用できるので好ましい。用いられる質量分析装置は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。２つまたはそれ以上の質量分析装置は、並列に接続して用いることができる。また、LC-MSシステムは、例えば、LC-MS、LC-MS/MSやLC-MSnであってよい。具体的には、例えば、AB SCIEX社製のTriple Quad (登録商標) 5500、Triple Quad (登録商標) 6500、Triple Quad (登録商標) 6500+、QTRAP (登録商標) 5500、QTRAP (登録商標) 6500、QTRAP (登録商標) 6500+、TripleTOF (登録商標) 5600、TripleTOF (登録商標) 5600+、TripleTOF (登録商標) 6600、TripleTOF (登録商標) 6600+等、Thermo Fisher SCIENTIFIC社製のQ Exactive (商標) Focus、 Q Exactive (商標)、Q Exactive (商標) Plus、Q Exactive (商標) HF、Q Exactive (商標) HF-X、Orbitrap ID-X Tribrid、Orbitrap Fusion (商標) Tribrid (商標)、Orbitrap Fusion (商標) Lumos (商標) Tribrid (商標)、Orbitrap Eclipse等が挙げられる。
　質量分析装置における検出方式としては、例えば、イオントラップ型、四重極型、四重極タンデム型、四重極イオントラップハイブリッド型、セクター型、飛行時間型、四重極飛行時間ハイブリッド型、フーリエ変換型、および四重極フーリエ変換ハイブリッド型等が挙げられる。さらに、これらにイオンモビリティーシステムを搭載することもできる。質量分析装置におけるイオン化法としては、エレクトロスプレー法（ESI）、大気圧化学イオン化法（APCI）、および光イオン化法（APPI）等が挙げられる。検出方式やイオン化法は、分析対象物質の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。
　質量分析により得られるスペクトルやフラグメントイオンスペクトル（精密質量スペクトルを含む）は物質固有の値であるため、標準品の分析により得られたイオン比と試料の分析により得られたスペクトルやフラグメントイオンスペクトル（精密質量スペクトルを含む）を比較して、試料に含まれる分析対象物質を同定することができる。具体的には、分析対象物質について精製された或いは合成された分析対象物質を標準品として使用し、標準品を分析して得られるスペクトル（精密質量スペクトルを含む）と分析対象とする試料から得られたクロマトグラムとを比較して、試料中に含まれる分析対象物質を同定することができる。
　また、標準品が存在しない分析対象物質については、それが未知の分析対象物質である場合には、例えば、液体クロマトグラフィーによって分離された物質が同分析対象物質であることを構造推定等によって確認した上で、本発明の分析の対象に加えることができる。未知の分析対象物質を確認する方法は当業者であれば適宜選択して実施することが可能であり、例えば、単離精製等をして分析対象物質であることを確認することができる。
　質量分析の結果に基づき、分析対象物質を定量することができる。分析対象物質の定量は、常法により行うことができる。具体的には、例えば、検出された分析対象物質のピーク面積値（またはピーク高さ値）を濃度既知の内部標準物質のピーク面積値（またはピーク高さ値）で除したピーク面積比（またはピーク高さ比）に基づいて、分析対象物質を定量することができる。
　液体クロマトグラフィー装置、質量分析装置、それらに備わる各種要素は、上記例示した分析条件を参照して、分析対象物質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。
＜移動相の劣化の防止方法＞
　本発明のさらなる一態様は、塩基性イオンペア試薬を含む液体クロマトグラフィーの移動相をバブリングすることを含む、移動相の劣化の防止方法（以下、「本発明の第一の移動相の劣化の防止方法」ということがある）に関する。
　本発明のさらなる一態様は、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒に溶解した移動相を用意し、水を含む移動相と混合し、液体クロマトグラフィーに用いる工程を含む、移動相の劣化の防止方法（以下、「本発明の第二の移動相の劣化の防止方法」ということがある）に関する。
　本発明の第一の移動相の劣化の防止方法、および本発明の第二の移動相の劣化の防止方法は、液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー－質量分析における、移動相中の塩基性イオンペア試薬の劣化を防止することで、移動相の劣化を防止することが可能である。
　なお、上記本発明の分析方法において説明された事項は、本発明の移動相の劣化の防止方法の説明に全て適用される。
＜分析装置＞
　本発明のさらなる一態様は、イオン性の分析対象物質を含む試料を分離する、塩基性イオンペア試薬を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィー装置、分析対象物質を分析する、質量分析装置、および、移動相の劣化防止装置、とを備える、分析装置（以下、「本発明の分析装置」ということがある）に関する。
　なお、上記本発明の分析方法、および移動相の劣化の防止方法において説明された事項は、本発明の分析装置の説明に全て適用される。
　限定されるものではないが、本発明の分析装置の一実施形態を、以下に説明する。
（１）塩基性イオンペア試薬を含む移動相を供給するための容器、
（２）上記移動相を送液する機能を有するポンプ、
（３）不活性ガスを移動相に吹き込んでバブリング処理を行うためのガスバブリング装置、
（４）分析対象物質を含む試料を分離する、液体クロマトグラフィー装置、
（５）分析対象物質を分析する、質量分析装置。
　本発明の分析装置の別の一実施形態として、さらに移動相のバブリングを管理・制御するための手段およびソフトウェアを含む形態が挙げられる。
　本発明の分析装置の別の一実施形態を、以下に説明する。
（１）水を含む移動相を供給するための容器と、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相を供給するための容器、
（２）上記それぞれの液を混合部に送液する機能を有するポンプ、
（３）二液を高速かつ均一に混合する機能を有するミキサー、
（４）生成した混合液を移動相として用いて、分析対象物質を含む試料を分離する、液体クロマトグラフィー装置、
（５）分析対象物質を分析する、質量分析装置。
　本発明の分析装置のさらに別の一実施形態を、以下に説明する。
（１）水を含む移動相を供給するための容器と、有機溶媒を含む移動相を供給するための容器と、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相を供給するための容器、
（２）上記それぞれの液を混合部に送液する機能を有するポンプ、
（３）三液を高速かつ均一に混合する機能を有するミキサー、
（４）生成した混合液を移動相として用いて、分析対象物質を含む試料を分離する、液体クロマトグラフィー装置、
（５）分析対象物質を分析する、質量分析装置。
　なお、上記に説明したものは、例示したものにすぎず、本発明に係る分析装置の適用限界を示すものではない。すなわち、本発明に係る分析装置は、本明細書中の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を超えない限り、さまざまな変更が可能なものである。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：標準溶液の調製》
（１）材料
　以下に示すミポメルセン（ミポメルセン-MOE）および他の修飾核酸を用いて作成したミポメルセン（ミポメルセン-LNA、ミポメルセン-OMe、ミポメルセン-Sオリゴ）は株式会社ジーンデザインより購入したものを標準物質として使用した。
・ミポメルセン-MOE（Mip-MOE）
G(m)^5(m)^5(m)^T(m)^5(m)^a^g^t^5(x)^t^g^5(x)^t^t^5(x)^G(m)^5(m)^A(m)^5(m)^5(m)
・ミポメルセン-LNA（Mip-LNA）
G(L)^5(L)^5(L)^T(L)^5(L)^a^g^t^5(x)^t^g^5(x)^t^t^5(x)^G(L)^5(L)^A(L)^5(L)^5(L)
・ミポメルセン-OMe（Mip-OMe）
G(M)^5(M)^C(M)^T(M)^C(M)^a^g^t^5(x)^t^g^5(x)^t^t^5(x)^G(M)^C(M)^A(M)^C(M)^C(M)
・ミポメルセン-Sオリゴ（Mip-S-oligo）
g^5(x)^5(x)^t^5(x)^a^g^t^5(x)^t^g^5(x)^t^t^5(x)^g^5(x)^a^5(x)^5(x)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）試薬の調製
　溶媒の調製には、メタノール（和光純薬工業社製、LC/MS用）、1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)（ナカライテスク社製、HPLC用）、Triethylamine (TEA)（Thermo Scientific社製、Sequencing grade）、アセチルアセトン（関東化学社製、特級）、Tris-EDTA buffer (TE)（ニッポンジーン社製）を使用した。
（ｉ）TE／メタノール（7:3, v/v）の調製
　TE  7容量にメタノールを3容量を混和した。
（ｉｉ）水／メタノール／HFIP／TEA／アセチルアセトン（90:10:1:0.2:0.01, v/v/v/v/v）の調製
　水90容量、メタノール10容量、HFIP  1容量、TEA  0.2容量、アセチルアセトン0.01容量を混和した。容器はアルミホイルで覆い遮光状態とした。
（ｉｉｉ）水／メタノール／HFIP／TEA（90:10:1:0.2, v/v/v/v）の調製
　水90容量、メタノール10容量、HFIP  1容量、TEA  0.2容量を混和した。容器はアルミホイルで覆い遮光状態とした。
（ｉｖ）メタノール／水／HFIP／TEA／アセチルアセトン（90:10:1:0.2:0.01, v/v/v/v/v）の調製
　メタノール90容量、水10容量、HFIP  1容量、TEA  0.2容量、アセチルアセトン0.01容量を混和した。容器はアルミホイルで覆い遮光状態とした。
（ｖ）メタノール／水／HFIP／TEA（90:10:1:0.2, v/v/v/v）の調製
　メタノール90容量、水10容量、HFIP  1容量、TEA  0.2容量を混和した。容器はアルミホイルで覆い遮光状態とした。
（ｖｉ）水／メタノール／HFIP／TEA／アセチルアセトン（50:50:1:0.2:0.01, v/v/v/v/v）の調製
　水50容量、メタノール50容量、HFIP  1容量、TEA  0.2容量、アセチルアセトン0.01容量を混和した。
（３）標準溶液の調製
　ミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNA、ミポメルセン-OMe、ミポメルセン-SオリゴはDNase, RNaseフリーの精製水に溶解した。
　ミポメルセン-MOE  231.8 μgに精製水323 μLを加えて完全に溶解し、100 μmol/L濃度に調製し、これをミポメルセン-MOE標準溶液とした。ミポメルセン-LNA  219.8 μgに精製水327 μLを加えて完全に溶解し、100 μmol/L濃度に調製し、これをミポメルセン-LNA標準溶液とした。ミポメルセン-OMe  238.3 μgに精製水358 μLを加えて完全に溶解し、100 μmol/L濃度に調製し、これをミポメルセン-OMe標準溶液とした。ミポメルセン-Sオリゴ  224.6 μgに精製水349 μLを加えて完全に溶解し、100 μmol/L濃度に調製し、これをミポメルセン-Sオリゴ標準溶液とした。
　ミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNA、ミポメルセン-OMe、ミポメルセン-Sオリゴ標準溶液は、水／メタノール／HFIP／TEA／アセチルアセトン（50:50:1:0.2:0.01, v/v/v/v/v）で500倍に希釈し、イオン化の最適条件の設定および測定するイオンの選択に使用する質量分析計チューニング溶液とした。
　ミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNA、ミポメルセン-OMe、ミポメルセン-Sオリゴ標準溶液は、TE／メタノール（7:3, v/v）で2000倍に希釈し、50 nmol/Lの混合溶液を調製し、スペクトル強度モニター用標準溶液とした。
《実施例2：質量分析条件の決定》
　シリンジポンプを用いて質量分析計チューニング溶液をイオン源に導入した。その際、HPLCポンプ（LC-20A、島津製作所製）を用いて混合した移動相をチューニング溶液と共にイオン源に導入した。
　定量に使用するプリカーサーイオン（親イオン）を確認しながら、このイオン強度が最高となるように質量分析計（TripleTOF5600、AB SCIEX）のイオン源の噴霧位置を調整した。
　噴霧位置の調整完了後、デクラスタリングポテンシャル（オリフィス電圧；DP）、印加する高電圧（イオンスプレー電圧；IS）、GS1およびGS2のガス圧（GS1、GS2）および温度（TEM）を調整した。
　次に、プリカーサーイオン（親イオン）からプロダクトイオン（娘イオン）を検索し、そのイオン強度が最大となるように、衝突開裂に関与するエネルギー電圧（CE）を調整した。
　上記方法により決定した質量分析条件を表2および3に示す。共通のイオン化条件を表2に示す。各成分の質量分析条件（MS/MS条件）を表3に示す。なお、ミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNA、ミポメルセン-OMeは9価のイオンと10価のイオンをプリカーサーイオンとして用い、ミポメルセン-Sオリゴは8価のイオンと9価のイオンをプリカーサーイオンとして用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
《実施例3：HPLC条件の設定》
　実施例1において作成したスペクトル強度モニター用標準溶液を用いて、ミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNA、ミポメルセン-OMe、ミポメルセン-Sオリゴを分離できるHPLC条件を検討した。
　HPLC装置としては、Shimadzu LC-20Aシステム（島津製作所社製）を使用し、HPLCカラムとしては、ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column（粒子径1.7 μm, 内径2.1 mm × 長さ50 mm；Waters社製）を使用した。
＜HPLC条件１＞
　ミポメルセン-MOEおよびミポメルセン-Sオリゴを分析するにあたり、水系移動相として水／メタノール／HFIP／TEA／アセチルアセトン（90:10:1:0.2:0.01, v/v/v/v/v）（移動相A）、有機溶媒系移動相としてメタノール／水／HFIP／TEA／アセチルアセトン（90:10: 1:0.2:0.01, v/v/v/v/v）（移動相B）を用いたリニアグラジエント条件を設定した。流速は0.3mL/minとした。グラジエント条件の一例を表4に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜HPLC条件2＞
　ミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNAおよびミポメルセン-OMeを分析するにあたり、水系移動相として水／メタノール／HFIP／TEA（90:10:1:0.2:, v/v/v/v）（移動相A）、有機溶媒系移動相としてメタノール／水／HFIP／TEA（90:10:1:0.2, v/v/v/v）（移動相B）を用いたリニアグラジエント条件を設定した。流速は0.3mL/minとした。グラジエント条件の一例を表5に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
《実施例4：移動相の窒素バブリング有無によるミポメルセン-MOEおよびミポメルセン-Sオリゴ測定に与える影響確認》
　＜HPLC条件１＞を用い、ミポメルセン-MOEおよびミポメルセン-Sオリゴの連続分析におけるピーク強度の変化を、移動相（1 L）に窒素バブリング（2 mL/min）を行った場合と行わない条件で確認した。また、ピーク面積比としてミポメルセン-MOEピーク面積値／ミポメルセン-Sオリゴピーク面積値を算出し、連続分析におけるピーク面積比の推移も確認した。
　窒素バブリングを行わなかった時のミポメルセン-MOEおよびミポメルセン-Sオリゴのピーク面積値の推移（160回連続分析）を図1、窒素バブリングを行わなかった時のミポメルセン-MOE／ミポメルセン-Sオリゴのピーク面積比の推移（160回連続分析）を図2、窒素バブリングを施した時のミポメルセン-MOEおよびミポメルセン-Sオリゴのピーク面積値の推移（160回連続分析）を図3、窒素バブリングを施した時のミポメルセン-MOE／ミポメルセン-Sオリゴのピーク面積比の推移（160回連続分析）を図4に示した。
　本検討結果では、図1および3に示したピーク面積値の推移より算出した近似曲線の傾きの絶対値が窒素バブリングなし＞窒素バブリングありの関係を示すことから、移動相に窒素バブリングを施すことによりミポメルセン-MOEならびにミポメルセン-Sオリゴのピーク面積の減少が抑えられることが明らかとなった。また、定量分析において主流となる内標準法を想定し、ミポメルセン-MOEとミポメルセン-Sオリゴのピーク面積比を求め近似曲線を算出した時、同様に傾きの絶対値が窒素バブリングなし＞窒素バブリングありの関係を示した。このことは、移動相に窒素バブリングを施した場合は、測定開始1本目と測定開始から160本目のピーク面積比が近しい値であることを示しており、同一のサンプルが同一の定量値として測定されることを意味する。逆に、移動相に窒素バブリングを行わなかった場合は、測定開始1本目と測定開始から160本目でピーク面積比にズレが生じ、同一サンプルにも関わらず違う定量値として測定されることを意味し、移動相に窒素バブリングを施すことの有用性が明らかとなった。
《実施例5：移動相の窒素バブリング有無によるミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNAおよびミポメルセン-OMe測定に与える影響確認》
　実施例4以外の修飾核酸を用いた化合物においても同様な結果が得られるのかを確認する目的で、＜HPLC条件２＞を用いて、ミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNAおよびミポメルセン-OMeの連続分析におけるピーク強度の変化を、移動相に窒素バブリングを施した場合と行わない条件で確認した。
　窒素バブリングを行わなかった時のミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNAおよびミポメルセン-OMeの面積値の推移（240回連続分析）を図5～7、窒素バブリングを施した時のミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNAおよびミポメルセン-OMeのピーク面積値の推移（240回連続分析）を図8～10に示した。
　本検討結果でも、ピーク面積値の推移より算出した近似曲線の傾きが窒素バブリングなし＞窒素バブリングありの関係を示すことから、移動相に窒素バブリングを施すことによりミポメルセン-MOE、ミポメルセン-LNAならびにミポメルセン-OMeのピーク面積の減少が抑えられることが明らかとなった。実施例4と同様、移動相に窒素バブリングを施すことの有用性が明らかとなった。
《実施例6：移動相組成の変更による改善アプローチ》
　＜HPLC条件2＞を用いて、ミポメルセン-MOEの連続分析におけるピーク強度の変化を、移動相に窒素バブリングを行わない条件で実施した。その後、新たに調製した有機溶媒系移動相のみを交換した場合と、新たに調製した水系移動相のみを交換した場合におけるミポメルセン-MOEのピーク強度を確認した。結果を図11に示した。
　本検討より、有機溶媒系移動相よりも水系移動相は劣化が進みやすいことが示唆される結果となった。このことは、劣化の原因となる塩基性イオンペア試薬は有機溶媒比率の高い溶液中にのみ存在する環境を作ることにより、移動相の劣化速度を緩やかにすることが可能であることが明らかとなった。よって、以下に示すような移動相条件でグラジエント分析を実施することにより改善できることが示唆された。
移動相A:水
移動相B:メタノール
移動相C:メタノール/HFIP/TEA(100:1:0.2, v/v/v)
（移動相Cは窒素バブリングを行ったほうがなお良い）
移動相Cを常に10％流し、移動相Aと移動相Bを勾配させる3液グラジエント
《実施例7：標準溶液の調製》
（１）材料
　以下に示すΔUA-GalNAc, 4S (Chondroitin Sulfate A)（C14H19NO14SNa2, MW:503.34）、ΔUA-GalNAc, 4S, 6S (Chondroitin Sulfate E)（C14H18NO17S2Na3, MW:605.39）およびΔUA-2S GlcNCOEt-6S（内標準物質）（C15H20NO17S2Na3, MW:619.42）はIduron Ltd.より購入したものを標準物質として使用した。
（２）試薬の調製
　溶媒の調製には、アセトニトリル（和光純薬工業社製、LC/MS用）、1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)（ナカライテスク社製、HPLC用）、n-Octylamine (OA)（東京化成社製）を使用した。
（ｉ）水／HFIP／OA（100:1:0.124, v/v/v）の調製
　水100容量、HFIP  1容量、OA  0.124容量を混和した。容器はアルミホイルで覆い遮光状態とした。
（ｉｉ）アセトニトリル／水／HFIP／OA（75:25:1:0.124, v/v/v/v）の調製
　アセトニトリル75容量、水25容量、HFIP  1容量、OA  0.124容量を混和した。容器はアルミホイルで覆い遮光状態とした。
（３）標準溶液の調製
　Chondroitin Sulfate A、Chondroitin Sulfate Eおよび内標準物質はミリQ（登録商標）水に溶解し以下の濃度に調製した。
・Chondroitin Sulfate A  5 mmol/L (CS-A)
・Chondroitin Sulfate E  2 mmol/L (CS-E)
・内標準物質 5 mmol/L (IS)
　CS-A、CS-EおよびISは、水／HFIP／OA（100:1:0.124, v/v/v）で1000倍に希釈し、イオン化の最適条件の設定および測定するイオンの選択に使用する質量分析計チューニング溶液とした。
　CS-A、CS-EおよびISを、水／HFIP／OA（100:1:0.124, v/v/v）で10000倍に希釈した混合溶液を調製し、連続分析におけるピーク強度変化確認用の標準溶液とした。
《実施例8：質量分析条件の決定》
　シリンジポンプを用いて質量分析計チューニング溶液をイオン源に導入した。その際、HPLCポンプ（LC-20A、島津製作所製）を用いて混合した移動相をチューニング溶液と共にイオン源に導入した。
　定量に使用するプリカーサーイオン（親イオン）を確認しながら、このイオン強度が最高となるように質量分析計（QTRAP5500、AB SCIEX）のイオン源の噴霧位置を調整した。
　噴霧位置の調整完了後、デクラスタリングポテンシャル（オリフィス電圧；DP）、印加する高電圧（イオンスプレー電圧；IS）、GS1およびGS2のガス圧（GS1、GS2）および温度（TEM）を調整した。
　次に、プリカーサーイオン（親イオン）からプロダクトイオン（娘イオン）を検索し、そのイオン強度が最大となるように、衝突開裂に関与するエネルギー電圧（CE）を調整した。
　上記方法により決定した質量分析条件を表6および7に示す。共通のイオン化条件を表6に示す。各成分の質量分析条件（MS/MS条件）を表7に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
《実施例9：HPLC条件の設定》
　実施例1において作成したピーク強度変化確認用の標準溶液を用いて、Chondroitin Sulfate A、Chondroitin Sulfate Eおよび内標準物質を分離できるHPLC条件を検討した。
　HPLC装置としては、Shimadzu LC-20Aシステム（島津製作所社製）を使用し、HPLCカラムとしては、ACQUITY UPLC BEH C18 Column（粒子径1.7 μm, 内径2.1 mm × 長さ100 mm；Waters社製）を使用した。
＜HPLC条件３＞
　Chondroitin Sulfate AおよびEを分析するにあたり、水系移動相として水／HFIP／OA（100:1:0.124, v/v/v）（移動相A）、有機溶媒系移動相としてアセトニトリル／水／HFIP／OA（75:25:1:0.124, v/v/v/v）（移動相B）を用いたリニアグラジエント条件を設定した。流速は0.2 mL/minとした。グラジエント条件の一例を表8に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
《実施例10：移動相の窒素バブリング有無によるChondroitin Sulfate A、Chondroitin Sulfate Eおよび内標準物質測定に与える影響確認》
　＜HPLC条件３＞を用い、Chondroitin Sulfate A、Chondroitin Sulfate Eおよび内標準物質（ΔUA-2S GlcNCOEt-6S）の連続分析におけるピーク強度の変化を、移動相（1 L）に窒素バブリング（10 mL/min）を行った場合と行わない条件で確認した。
　窒素バブリング有無におけるChondroitin Sulfate Aの面積値の推移（52回連続分析）を図12、窒素バブリング有無におけるChondroitin Sulfate Eの面積値の推移（52回連続分析）を図13、窒素バブリング有無における内標準物質（ΔUA-2S GlcNCOEt-6S）のピーク面積値の推移（52回連続分析）を図14に示した。
　本検討結果では、図12～14に示したピーク面積値の推移より算出した近似曲線の傾きの絶対値が窒素バブリングなし＞窒素バブリングありの関係を示すことから、移動相に窒素バブリングを施すことによりChondroitin Sulfate A 、Chondroitin Sulfate Eならびに内標準物質（ΔUA-2S GlcNCOEt-6S）のピーク面積の減少が抑えられることが明らかとなった。
　本発明の移動相の劣化の防止方法を用いることにより、質量分析系を用いた測定においては、長時間にわたって測定対象化合物およびその内標準物質のピーク高さ、ピーク面積、ピーク高さ比ならびにピーク面積比を安定して検出することが可能となるため、一度の測定機会に多くのサンプルを測定に供することができ、且つ正確な濃度測定値を得ることが可能となる。
　また、本発明により、移動相の劣化による頻繁な作り替えの必要がなくなる。当該移動相調製に使用する試薬は非常に高価であり、その経費負担の軽減ならびに、調製者の試薬調製にかかる労務時間削減も期待できる。

Claims (16)

  1. 　イオン性の分析対象物質を含む試料を、塩基性イオンペア試薬を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィーに付し、さらに質量分析に付す工程を含む分析方法であって、
    　前記移動相の劣化を防止する操作を行うことを特徴とする、分析対象物質の分析方法。
  2. 　移動相の劣化を防止する操作が、移動相を不活性ガスでバブリングすることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　移動相の劣化を防止する操作が、さらに移動相の不活性ガスでのバブリングを管理・制御することを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 　移動相の劣化を防止する操作が、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相を用いることを含む、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。
  5. 　塩基性イオンペア試薬が、アミン化合物である、請求項１～４の何れか１項に記載の方法。
  6. 　塩基性イオンペア試薬が、水酸化テトラエチルアンモニウム（TEA-OH）、水酸化テトラブチルアンモニウム（TBAOH）、N,N-ジメチルブチルアミン（DMBA）、オクチルアミン（OA）、トリプロピルアミン（TPA）、N,N-ジメチルヘキシルアミン（DMHA）、ジイソプロピルアミン（DIPA）、N-メチルジブチルアミン （MDBA）、プロピルアミン（PA）、トリエチルアミン（TEA）、ヘキシルアミン（HA）、トリブチルアミン（TBA）、N,N-ジメチルシクロヘキシルアミン（DMCHA）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、テトラメチルエチレンジアミン（TMEDA）、1,8-ジアザビシクロ [5.4.0]undec-7-ene (DBU)、ジプロピルアンモニウムアセテート（DPAA）、ジブチルアンモニウムアセテート（DBAA）、ジアミルアンモニウムアセテート（DAAA）、およびジヘキシルアンモニウムアセテート（DHAA）から選ばれる少なくとも１種以上である、請求項１～５の何れか１項に記載の方法。
  7. 　イオン性の分析対象物質が、プリン化合物、プリン化合物類縁体、ピリミジン化合物、またはピリミジン化合物類縁体を含むヌクレオシド；ヌクレオチド、環状ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、およびヌクレオチド三リン酸；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ、ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ、ＦＡＤＨ）、補酵素Ａ（コエンザイムＡ）、テトラヒドロメタノプテリン（Ｈ４ＭＰＴ）、Ｓ-アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、および３'-ホスホアデノシン-５'-ホスホ硫酸から選ばれるヌクレオシドを含む補酵素；それらの代謝中間体、ならびにその還元水素受容物および修飾体；オリゴヌクレオチド、糖、および糖鎖から選ばれる少なくとも１種以上である、請求項１～６の何れか１項に記載の方法。
  8. 　オリゴヌクレオチドが、アンチセンス、デコイ、siRNA、miRNA、リボザイム、CpGオリゴ、およびアプタマーから選ばれる少なくとも１種以上の核酸医薬品である、請求項７に記載の方法。
  9. 　糖、および糖鎖が、単糖類、二糖類、およびオリゴ糖類から選ばれる少なくとも１種以上である、請求項７に記載の方法。
  10. 　不活性ガスが、窒素ガス、アルゴンガス、ネオンガス、クリプトンガス、キセノンガスおよびヘリウムガスから選ばれる少なくとも１種以上である、請求項２～９の何れか１項に記載の方法。
  11. 　塩基性イオンペア試薬を含む液体クロマトグラフィーの移動相をバブリングする工程を含む、
    　移動相の劣化の防止方法。
  12. 　塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒に溶解した移動相を用意し、水を含む移動相と混合し、液体クロマトグラフィーに用いる工程を含む、
    　移動相の劣化の防止方法。
  13. 　イオン性の分析対象物質を含む試料を分離する、塩基性イオンペア試薬を含む移動相を用いた液体クロマトグラフィー装置、
    　分析対象物質を分析する、質量分析装置、および、
    　移動相の劣化防止装置、
    　とを備える、分析装置。
  14. 　移動相の劣化防止装置が、移動相のガスバブリング装置である、請求項１３に記載の分析装置。
  15. 　移動相の劣化防止装置が、さらに移動相のバブリングを管理・制御するための手段およびソフトウェアを含む、請求項１４に記載の分析装置。
  16. 　移動相の劣化防止装置が、塩基性イオンペア試薬を非水系溶媒中に含む移動相を、水を含む移動相と混合する装置である、請求項１３に記載の分析装置。
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