WO2021172000A1 - 卵巣悪性腫瘍の検出方法及び検出試薬 - Google Patents

卵巣悪性腫瘍の検出方法及び検出試薬 Download PDF

Info

Publication number
WO2021172000A1
WO2021172000A1 PCT/JP2021/004736 JP2021004736W WO2021172000A1 WO 2021172000 A1 WO2021172000 A1 WO 2021172000A1 JP 2021004736 W JP2021004736 W JP 2021004736W WO 2021172000 A1 WO2021172000 A1 WO 2021172000A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tfpi2
ovarian
antibody
cancer
amount
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/004736
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
悦子 宮城
憲昭 荒川
則久 大竹
昇平 明庭
Original Assignee
公立大学法人横浜市立大学
東ソー株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大学法人横浜市立大学, 東ソー株式会社 filed Critical 公立大学法人横浜市立大学
Priority to JP2022503238A priority Critical patent/JPWO2021172000A1/ja
Priority to CA3172404A priority patent/CA3172404A1/en
Priority to US17/802,354 priority patent/US20230122642A1/en
Priority to BR112022016212A priority patent/BR112022016212A2/pt
Priority to EP21760051.9A priority patent/EP4113119A4/en
Priority to AU2021227181A priority patent/AU2021227181A1/en
Priority to CN202180016885.2A priority patent/CN115151821A/zh
Publication of WO2021172000A1 publication Critical patent/WO2021172000A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G01N2333/8114—Kunitz type inhibitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an ovarian malignant tumor and a reagent for detecting tissue factor pathway inhibitor 2 (Tissue Factor Pathway Inhibitor 2; TFPI2).
  • tissue factor pathway inhibitor 2 Tissue Factor Pathway Inhibitor 2; TFPI2
  • Ovarian cancer is estimated to be about 280,000 new cases worldwide and about 10,000 in Japan (GLOBOCAN 2018), and is the most deadly cancer among gynecologic malignancies.
  • the current diagnosis of ovarian cancer is mainly based on diagnostic imaging and CA125, and malignant / benign is estimated by blood tests using multiple markers such as CA19-9. Diagnosis is being carried out.
  • CA125 which is a typical ovarian cancer marker, has excellent sensitivity in detecting ovarian cancer, it may vary significantly even in benign tumors including menstruation, peritonitis, and endometriosis.
  • HE4 Human epididymis protein 4
  • CA125 Human epididymis protein 4
  • HE4 and CA125 have a low correlation, benign and malignant discrimination accuracy in ovarian tumors can be obtained by obtaining an estimated ovarian malignant tumor (Risk of Ovarian Malignancy Algorithm: ROMA) from the measured values of both markers and menopausal information. Is further improved (Non-Patent Document 1).
  • Tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) is a placenta-derived serpin protease inhibitor that is the same protein as placental protein 5 (PP5) and contains three Knitz-type protease inhibitor domains. It was clarified that TFPI2 is specifically produced from a clear cell cancer cell line in an ovarian cancer cell line, and that gene expression in a tissue of an ovarian cancer patient is specifically improved only in a clear cell cancer patient (Patent Document 1). A method for detecting clear cell ovarian cancer by measuring medium TFPI2 has been disclosed (Patent Documents 2 and 3, Non-Patent Documents 2 and 3).
  • HGSC high-grade serous carcinoma
  • TFPI2 TFPI2 has been reported (Non-Patent Document 4).
  • TFPI2 it has been unclear whether TFPI2 can be applied to distinguish between ovarian malignancies with diverse histological types, including borderline malignancies, and benign ovarian tumors.
  • An object of the present invention is to provide a method for differentiating and detecting an ovarian malignant tumor from a benign ovarian tumor and a reagent that can be used for the method.
  • the present inventors have diligently studied and found that the blood TFPI2 level is significantly improved in ovarian malignant tumor patients as compared with ovarian benign tumor patients, and that TFPI2 can detect ovarian malignant tumors with high specificity.
  • the present invention includes the following aspects.
  • [1] A method for differentiating and detecting an ovarian malignant tumor (excluding highly atypical serous cancer) from a benign ovarian tumor, which comprises measuring the amount of TFPI2 in a sample.
  • the method according to [1] wherein an ovarian malignant tumor (excluding highly atypical serous cancer) is detected when the measured value of the TFPI2 amount exceeds a preset reference value.
  • [3] The method according to [1] or [2], wherein the amount of TFPI2 is the sum of the amount of TFPI2 processing polypeptide and the amount of intact TFPI2.
  • [5] The method according to [4], wherein the antibody is an antibody that recognizes Kunitz domain 1 of TFPI2.
  • [6] The method according to any one of [1] to [3], wherein the measurement is performed using a mass spectrometry method.
  • the present invention provides a method for distinguishing an ovarian malignant tumor from a benign ovarian tumor and detecting it easily and with high accuracy, and a reagent that can be used for the method.
  • the vertical axis represents the amount of TFPI2 or CA125 in blood.
  • the vertical axis represents the CA125 measured value
  • the horizontal axis represents the TFPI2 measured value.
  • the vertical axis represents the amount of TFPI2 or CA125 in blood.
  • the vertical axis represents the CA125 measured value
  • the horizontal axis represents the TFPI2 measured value.
  • a method for differentiating and detecting an ovarian malignant tumor of the present invention (excluding highly atypical serous cancer) from a benign ovarian tumor
  • the first aspect of the present invention is an ovarian malignant tumor (however, highly atypical). It is a method for differentiating and detecting a benign ovarian tumor (excluding precervical cancer), and includes measuring the amount of TFPI2 in a sample. This is a method based on the increased presence of TFPI2 in biological samples such as blood of ovarian malignancies as compared to benign ovarian tumors. Measurement of the amount of TFPI2 in a sample is usually performed in vitro.
  • an ovarian malignant tumor can be differentiated from a benign ovarian tumor and detected with high specificity.
  • the method of the present invention includes the stage of differentiating and detecting an ovarian malignant tumor from a benign ovarian tumor, and does not include a final judgment act regarding the diagnosis of the ovarian malignant tumor.
  • the doctor diagnoses an ovarian malignant tumor and formulates a treatment policy by referring to the detection results by the method of the present invention.
  • the ovarian malignant tumor detected in the present invention refers to a malignant tumor and a borderline malignant tumor, and various tumors contained therein are targeted, and are not particularly limited except for highly atypical serous cancer.
  • Malignant tumors include non-invasive low-grade serous cancer, low-grade serous cancer, mucinous cancer, endometrioid cancer, clear cell cancer, malignant Brenner tumor, serous mucinous cancer, and undifferentiated cancer (low atypia).
  • Epithelial tumors such as degree intimal stromal sarcoma, highly atypical degree intimal stromal sarcoma), mixed epithelial mesenchymal tumors (carcinosarcoma / carcinosarcoma); pure stromal tumors (rich cell fibers) Sexual cord stromal such as tumor, fibrosarcoma, malignant steroid cell tumor), pure type cord tumor (adult type granule membrane cell tumor, juvenile granule membrane cell tumor, Sertri cell tumor, sex cord tumor with cricoid tubules) Tumors; mixed sex cord interstitial tumors such as Sertri-Lommetial tumors and other sex cord interstitial tumors; undifferentiated embryonic cell tumors / disgerminoma / egg sac tumors, germogenic cancers (fetal cancers) ) ⁇ Multi-embryonic tumor ⁇ Immature malformation (G3) ⁇ Mature malformation with malignant addition Embroidered tumor
  • clear cell cancer, low-grade serous cancer, endometrial cancer and mucinous cancer are preferable examples. Further, clear cell cancer, endometrial cancer and mucinous cancer are given as more preferable examples. Borderline malignant tumors include serous, mucinous, intimal, clear cell, glandular fibrous, superficial papillary, Brenner's tumors, serous mucinous and other epithelial; granules with serous and micropapillary patterns.
  • stromal tumors such as membrane cells, Sertri / stromal cell tumors (medium differentiated type), steroid cell tumors (unclassifiable type), ginando blastoma; immature malformations (G1, G2), carcinoids, thyroid tumors Embryonic cell tumors such as sex carcinoids; gonad blastoma (pure type); etc.
  • the TFPI2 measured in the present invention is not particularly limited, and may be, for example, intact TFPI2 (hereinafter, also referred to as “I-TFPI2”), TFPI2 processing polypeptide (hereinafter, also referred to as “NT-TFPI2”), or both. There may be.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence based on the cDNA of human TFPI2.
  • the signal peptide from the starting methionine to the glycine at the 22nd residue is a signal peptide.
  • “Intact TFPI2” refers to a peptide represented by residues 23 to 235 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • NT-TFPI2 refers to a peptide fragment containing Knitz domain 1 located on the N-terminal side of intact TFPI2, as described in Patent Document 3. More specifically, NT-TFPI2 is a peptide containing at least the sequence from aspartic acid at the 23rd residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to histidine at the 131st residue or cysteine at the 130th residue, or the above-mentioned peptide. A peptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity with the sequence. The identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • this polypeptide may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added in the above sequence.
  • the number is preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, and even more preferably 2 to 5.
  • other peptide fragments may be provided on both sides of the sequence, it is preferable that the antibody does not have an antigenic determinant (epitope) for an antibody that recognizes the Knitz domain 3 of TFPI2.
  • test sample examples include blood components such as whole blood, blood cells, serum, and plasma, cell or tissue extract, urine, cerebrospinal fluid, peritoneal lavage fluid, and ascites.
  • the ovarian tissue biopsy sample may be the test target, in which case the extract or culture supernatant of the biopsy sample is measured.
  • a body fluid such as a blood component or urine as a sample because it can be performed easily and non-invasively.
  • the blood component is used as a sample. Is particularly preferable.
  • the dilution ratio of the sample may be appropriately selected from undiluted to 100-fold dilution according to the type and condition of the sample to be used.
  • a method for detecting TFPI2 and another tumor marker for ovarian cancer (ovarian other than TFPI2). It may be used in combination with a method for detecting a cancer marker, also referred to as "another ovarian cancer marker").
  • the combination is not particularly limited.
  • the method of detecting TFPI2 and the method of detecting other ovarian cancer markers are performed simultaneously or separately to detect ovarian malignancies (excluding high-grade serous cancer). How to distinguish and detect benign ovarian tumors, (B) A method of first detecting TFPI2 is applied to a sample to be measured, and another ovarian cancer marker is detected in a sample determined to be negative as a result.
  • Ovarian malignant tumor (however, highly atypical) A method for differentiating and detecting benign ovarian tumors (excluding cervical cancer), (C) A method of first detecting another ovarian cancer marker is applied to a sample to be measured, and then a method of detecting TFPI2 is applied to a sample judged to be negative as a result.
  • a method for differentiating and detecting benign ovarian tumors (excluding cervical cancer) is preferable in that the reagent used for detection is not wasted.
  • ovarian cancer markers which are detected by a method for differentiating and detecting an ovarian malignant tumor (excluding highly atypical serous cancer) of the present invention from a benign ovarian tumor, are appropriately selected from conventionally known markers.
  • cancer antigen 125 Cancer Antique 125, CA125
  • cancer antigen 546 CA546
  • cancer antigen 72-4 CA72-4
  • cancer antigen 130 CA130
  • cancer antigen 602 CA602
  • Sialyl Tn antigen Siallyl Tn antigen, SLN
  • cancer-related galactose metastasis enzyme Galactosyltransphase Assisted with Tumor, GAT
  • lysophosphatidic acid LisoPhosphatidic Acid4epid, LPA
  • CA125 which is the most widely used marker for other ovarian cancers, has established clinical usefulness, and thus treats ovarian malignancies of the present invention (excluding high-grade serous cancer) in the ovary. It is preferred as another ovarian cancer marker used in a method of differentiating and detecting benign tumors. Further, even if only one other ovarian cancer marker is detected in the method for differentiating and detecting an ovarian malignant tumor (excluding high-grade serous cancer) of the present invention from a benign ovarian tumor. Well, there may be two or more.
  • the time for collecting the sample in the present invention is not particularly limited. For example, it may be anytime from preoperative time when a pelvic mass is confirmed by diagnostic imaging etc. and a detailed examination is performed because it is suspected to be an ovarian malignant tumor, to follow-up after a definitive diagnosis of ovarian malignant tumor by postoperative pathological examination. Any sample collected at any stage, such as before and after a definitive diagnosis and before and after the start of treatment, can be used in the method of the present invention.
  • the TFPI2 amount may be any of the intact TFPI2 amount, the NT-TFPI2 amount, or the total of the intact TFPI2 amount and the NT-TFPI2 amount, but the total of the intact TFPI2 amount and the NT-TFPI2 amount is sufficient for ease of measurement. It is more preferable from the viewpoint of compatibility with high sensitivity and specificity.
  • the reference value used for the determination may be either a measured value or a converted concentration value.
  • the converted concentration value refers to a value converted from a measured value based on a calibration curve prepared using TFPI2 as a standard sample.
  • the standard value (Cutoff value) for distinguishing ovarian malignancies (excluding highly atypical serous cancers) from benign ovarian tumors is ovarian benign tumors and ovarian malignancies (excluding highly atypical serous tumors). Can be appropriately set to the measured values indicating the optimum sensitivity and specificity by measuring the receiver operating characteristic (ROC) curve analysis.
  • ROC receiver operating characteristic
  • the amount of NT-TFPI2 or the amount of intact TFPI2 in the sample may be measured individually, or the values may be summed to obtain the total amount.
  • the total amount of NT-TFPI2 and intact TFPI2 in the sample may be measured by a measuring system capable of measuring the total amount at one time.
  • the NT-TFPI2 amount may be indirectly measured from the total amount obtained by both measurements and the measured amount of intact TFPI2 alone.
  • the method for measuring the amount of NT-TFPI2 and / or the amount of intact TFPI2 is not particularly limited. For example, a method using an antigen-antibody reaction using an antibody that recognizes NT-TFPI2 and / or intact TFPI2, and a method using mass spectrometry can be exemplified.
  • A A competitive method using a labeled measurement target and an antibody that recognizes the measurement target, and utilizing that the labeled measurement target and the measurement target contained in the sample competitively bind to the antibody.
  • B A method using surface plasmon resonance in which a sample is brought into contact with a chip on which an antibody that recognizes an antibody to be measured is immobilized, and a signal that depends on the binding between the antibody and the measurement target is detected.
  • C A fluorescence polarization immunoassay method utilizing an antibody that recognizes a fluorescence-labeled measurement target and increasing the degree of fluorescence polarization by binding the antibody to the measurement target.
  • (D) A sandwich method in which two types of antibodies having different epitopes, one of which recognizes a measurement target (one of which is a labeled antibody), is used to form a complex of the two antibodies and the measurement target.
  • (E) A method in which a measurement target in a sample is concentrated with an antibody that recognizes the measurement target as a pretreatment, the measurement target is separated from the antibody, and the measurement target is detected by a mass spectrometer or the like.
  • the methods (d) and (e) are simple and highly versatile, the method (d) is more preferable in treating a large number of samples because the techniques related to reagents and devices are sufficiently established.
  • a method for measuring the total amount of NT-TFPI2 and intact TFPI2 using an antibody that recognizes both NT-TFPI2 and intact TFPI2 (NT + I-TFPI2 measurement system).
  • Antibodies that recognize both NT-TFPI2 and intact TFPI2 are from aspartic acid at the 23rd residue of the TFPI2 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 to histidine at the 131st residue or cysteine at the 130th residue.
  • An antibody that binds to an antigenic determinant in the region of TFPI2 is preferable, and an antibody that recognizes Knitz domain 1 of TFPI2 as an antigenic determinant is more preferable.
  • the sandwich method described above usually two types of antibodies having different epitopes are used.
  • (B) A method for measuring the amount of intact TFPI2 alone using an antibody that does not recognize NT-TFPI2 but recognizes intact TFPI2 (I-TFPI2 measurement system).
  • the antibody that does not recognize NT-TFPI2 but recognizes the epitope TFPI2 is preferably an antibody that recognizes the Knitz domain 3 of TFPI2 as an antigenic determinant.
  • the sandwich method described above usually, the antibody uses two types having different epitopes, and at least one type uses an antibody that does not recognize NT-TFPI2 but recognizes intact TFPI2, and the other.
  • the type may be an antibody that does not recognize NT-TFPI2 and recognizes an epitope TFPI2, or an antibody that recognizes both NT-TFPI2 and an epitope TFPI2.
  • NT-TFPI2 by subtracting the amount of intact TFPI2 measured by the I-TFPI2 measurement system of (B) from the total amount of NT-TFPI2 and intact TFPI2 measured by the NT + I-TFPI2 measurement system of (A).
  • D A method for measuring the amount of NT-TFPI2 alone using an antibody that does not recognize intact TFPI2 but recognizes NT-TFPI2.
  • the antibody that recognizes NT-TFPI2 without recognizing the intact TFPI2 include an antibody that specifically recognizes the peptide sequence at the C-terminal portion of NT-TFPI2.
  • the sandwich method described above for example, the antibody is used as a solid phase antibody, and the antibody that recognizes Kunitz domain 1 as an antigenic determinant is used as a detection antibody.
  • NT-TFPI2 measured by the methods (C) and (D) described above A single amount may be used as a criterion for judgment, but sufficient sensitivity and specificity can be obtained even if the total amount of NT-TFPI2 and intact TFPI2 measured by the method (A) is used as a criterion for judgment. The latter is more preferable because it is easy to obtain an antibody and measurement is easy in one step.
  • Antibodies that recognize NT-TFPI2 and / or intact TFPI2 are oligopeptides consisting of NT-TFPI2 polypeptides or proteins, intact TFPI2 polypeptides or TFPI2 protein partial regions, NT-TFPI2 polypeptides or TFPI2 protein intact or partial regions. It can be obtained by immunizing an animal using a polypeptide or the like encoding the above as an immunogen.
  • the protein or the oligopeptide or polypeptide does not reflect the three-dimensional structure of TFPI2 in vivo, or its structure may change during the preparation process.
  • the obtained antibody may not have high specificity or binding force to the desired in vivo TFPI2, and even if a measurement system is constructed using this antibody, it is contained in the sample as a result. It may not be possible to accurately quantify the TFPI2 concentration.
  • the intact or partial region of the TFPI2 polypeptide or intact TFPI2 protein is expressed in the body of an immune animal. It is more preferable because an antibody having high specificity and binding force (that is, high affinity) to TFPI2 in a sample can be obtained because an immune response is elicited.
  • the animal used for immunization is not particularly limited as long as it has an antibody-producing ability, and may be a mammal normally used for immunization such as a mouse, a rat or a rabbit, or a bird such as a chicken.
  • TFPI1 known as a homologue of TFPI2 is also present in the blood. Therefore, it is desirable to use an antibody that specifically recognizes only TFPI2 without crossing with TFPI1.
  • the antibody that recognizes TFPI2 may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable.
  • the establishment of hybridoma cells that produce an antibody that recognizes TFPI2 may be appropriately selected from the methods for which techniques have been established. As an example, selection of hybridoma cells in which B cells are collected from an animal immunized by the method described above, the B cells and myeloma cells are fused electrically or in the presence of polyethylene glycol, and a desired antibody is produced by a HAT medium. By monocloning the selected hybridoma cells by the limiting dilution method, hybridoma cells that produce a monoclonal antibody that recognizes TFPI2 can be established.
  • the monoclonal antibody that recognizes TFPI2 used in the present invention may be selected based on the affinity for GPI (glycosylphospatidylinositol) anchor type TFPI2 or secretory type TFPI2 derived from the host expression system.
  • the host is not particularly limited, and may be appropriately selected from microbial cells such as Escherichia coli and yeast, insect cells, and animal cells that are usually used by those skilled in the art for protein expression, but disulfide bonds or sugar chains are added. It is preferable to use a mammalian cell as a host, which can express a protein having a structure similar to that of the natural TFPI2 by post-translational modification such as. Examples of mammalian cells include conventionally used human fetal kidney-derived cells (HEK) 293T cell lines, monkey kidney cell COS7 strains, Chinese hamster ovary (CHO) cells, and cancer cells isolated from humans. Be done.
  • HEK human fetal kidney-derived cells
  • Purification of the antibody used in the present invention may be carried out by appropriately selecting from the methods for which the technique has been established. As an example, after culturing the antibody-producing hybridoma cells established by the method described above, the culture supernatant is collected, and if necessary, the antibody is concentrated by ammonium sulfate precipitation, and then protein A, protein G, protein L, etc. are fixed. The antibody can be purified by affinity chromatography and / or ion exchange chromatography using the proteinated carrier.
  • the antibody purified by the above-mentioned method may be labeled with an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase, and the technique for labeling has been sufficiently established. It may be done by using a method.
  • a method of measuring the amount of TFPI2 by using the mass spectrometry method will be specifically described below.
  • major proteins such as albumin, immunoglobulin, and transferrin, which are abundant in blood, are removed by Agent Human 14 or the like as a pretreatment step, and then further separated by ion exchange, gel filtration, reverse phase HPLC, or the like. It is preferable to draw.
  • the measurements are tandem mass spectrometry (MS / MS), liquid chromatography / tandem mass spectrometry (LC / MS / MS), matrix-assisted laser desorption / ionization flight time mass spectrometry (matrix assisted laser destruction ionization time-of-fly mass spectrometry). , MALDI-TOF / MS), surface enhanced laser ionization mass spectrometry (SELDI-MS) and the like.
  • the method of the present invention for differentiating and detecting an ovarian malignant tumor (excluding highly atypical serous cancer) from a benign ovarian tumor can be applied to a method for treating an ovarian malignant tumor. That is, according to the present invention, it is a method for treating an ovarian malignant tumor in a patient.
  • a method is provided that includes (i) identifying a patient as having a measured value of TFPI2 amount exceeding a preset reference value, and (ii) treating the identified patient.
  • the measurement of the amount of TFPI2 may be performed using an antibody that specifically recognizes NT-TFPI2 and / or intact TFPI2, or may be performed using a mass spectrometry method. good.
  • Examples of the treatment in the step (ii) include surgical treatment, drug therapy, radiation therapy, and the like, but the treatment is not particularly limited.
  • a reagent for differentiating and detecting an ovarian malignant tumor (excluding highly atypical serous cancer) of the present invention from a benign ovarian tumor The second aspect of the present invention is NT-TFPI2 and / or It is a reagent for differentiating and detecting an ovarian malignant tumor (excluding high-grade serous cancer) containing an antibody that recognizes intact TFPI2 from a benign ovarian tumor.
  • an antibody that recognizes NT-TFPI2 and intact TFPI2 is more preferable.
  • an antibody that binds to an antigenic determinant in the region from aspartic acid at the 23rd residue to histidine at the 131st residue or cysteine at the 130th residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is more preferable. ..
  • the antibody contained in the reagent of the present invention may be the antibody itself, may be labeled, or may be immobilized on a solid phase.
  • the reagent of the present invention can be prepared by the methods shown in (I) to (III) below.
  • (I) First, of the two types of antibodies (hereinafter referred to as "antibody 1" and "antibody 2") that recognize TFPI2 and have different epitopes used in the sandwich method, antibody 1 is used as an immunoplate, magnetic particles, or the like.
  • B / F (Bound / Free) is bound to a separable carrier.
  • the bonding method may be a physical bond using a hydrophobic bond, or a chemical bond using a linker reagent capable of cross-linking between two substances.
  • the surface of the carrier is blocked with bovine serum albumin, skim milk, a commercially available blocking agent for immunoassay, a chemically synthesized polymer for suppressing protein adsorption, or the like in order to avoid non-specific binding. This is used as the primary reagent.
  • (III) Label the other antibody 2 and prepare a solution containing the obtained labeled antibody as a secondary reagent.
  • Substances labeled with antibody 2 include enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase, fluorescent substances, chemical luminescent substances, substances that can be detected by a detector such as radioisotope, or substances that have a specific binding partner such as avidin to biotin. Etc. are preferable.
  • a buffer solution capable of performing an antigen-antibody reaction satisfactorily for example, a phosphate buffer solution, a Tris-HCl buffer solution, or the like is preferable.
  • the reagent of the present invention produced in this manner may be freeze-dried if necessary.
  • the antibody 1 is bound to the carrier in the same manner as in (I) to (II) described above to produce a blocking treatment, and the labeled antibody 2 is applied to the antibody-immobilized carrier.
  • the reagent may be prepared by further adding the containing buffer solution.
  • the methods shown in (IV) to (VI) below may be used.
  • the primary reagent prepared in (II) and the sample are brought into contact with each other for a certain period of time at a certain temperature.
  • the reaction conditions may be a temperature range of 4 ° C. to 40 ° C. for 5 to 180 minutes.
  • the unreacted substance is removed by B / F separation, and then the secondary reagent prepared in (III) is brought into contact with the secondary reagent for a certain period of time at a certain temperature to form a sandwich complex.
  • the reaction conditions may be a temperature range of 4 ° C.
  • the amount of reagent components such as antibodies contained in the reagent of the present invention may be appropriately set according to various conditions such as the amount of sample, the type of sample, the type of reagent, and the measurement method. Specifically, for example, when 20 ⁇ L of serum or plasma is used as a sample and the amount of TFPI2 is measured by the sandwich method as described later, an antibody that binds 20 ⁇ L of the sample to a carrier per reaction system that reacts with the antibody. The amount may be 100 ng to 1000 ⁇ g and the labeled antibody amount may be 2 ng to 20 ⁇ g.
  • the reagent of the present invention can also be used for measurement by a conventional method, and can also be used for measurement using an automatic immunodiagnosis device.
  • measurement using an automatic immunodiagnosis device can be performed without being affected by intrinsic measurement interfering factors and competing enzymes contained in the sample, and TFPI2 in the sample can be quantified in a short time. ,preferable.
  • Another aspect of the present invention is the manufacture of reagents for NT-TFPI2 and / or intact TFPI2 for differentiating and detecting ovarian malignancies (excluding highly atypical serous tumors) from benign ovarian tumors. It is used. Another aspect of the present invention is the use of NT-TFPI2 and / or intact TFPI2 in differentiating and detecting ovarian malignancies (excluding highly atypical serous cancers) from benign ovarian tumors. Another aspect of the invention is NT-TFPI2 and / or intact TFPI2, which is used to distinguish and detect ovarian malignancies (except for highly atypical serous tumors) from benign ovarian tumors. ..
  • Another aspect of the present invention is for differentiating and detecting ovarian malignancies (excluding high-grade serous cancers) of antibodies that recognize NT-TFPI2 and / or intact TFPI2 from benign ovarian tumors. Use in the manufacture of reagents.
  • Another aspect of the present invention is in differentiating and detecting ovarian malignancies (excluding high-grade serous cancers) of antibodies that recognize NT-TFPI2 and / or intact TFPI2 from benign ovarian tumors. It is used.
  • Another aspect of the invention recognizes NT-TFPI2 and / or intact TFPI2, which is used to distinguish and detect ovarian malignancies (except for highly atypical serous tumors) from benign ovarian tumors. It is an antibody to be used.
  • the antibody in these aspects is an antibody that binds to an antigenic determinant in the region from aspartic acid at the 23rd residue to histidine at the 131st residue or cysteine at the 130th residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Is preferable.
  • TFPI2 measuring reagent was prepared as follows using the TFPI2 antibody obtained by the DNA immunoprescription method.
  • An anti-TFPI2 monoclonal antibody (TS-TF04) was physically adsorbed on a water-insoluble ferrite-containing carrier at room temperature for a whole day and night so as to reach 100 ng / carrier, and then a 100 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 1% BSA was added.
  • TS-TF04 an anti-TFPI2 monoclonal antibody
  • An alkaline phosphatase-labeled anti-TFPI2 antibody was prepared using an alkaline phosphatase labeling kit (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) using an anti-TFPI2 monoclonal antibody (TS-TF01).
  • a TFPI2 measurement reagent was prepared by adding 100 ⁇ L of a solution (Tris buffer solution containing 3% BSA, pH 8.0) and freeze-drying. The prepared TFPI2 measurement reagent was sealed and sealed under nitrogen filling, and stored at 4 ° C. until measurement.
  • Table 1 shows the breakdown of the clinical specimens used in this example. 33 cases of benign ovarian tumor serum and 38 cases of ovarian malignant tumor (excluding high-grade serous cancer) serum were collected by the same protocol at the Department of Obstetrics and Gynecology, Yokohama City University, and were informed outlets. Provided with consent and approval of the Yokohama City University Ethics Committee.
  • a fully automatic enzyme immunoassay device AIA-2000 manufactured by Tosoh Corporation: Manufacturing and Sales Notification No. 13B3X90002000009 was used.
  • the measurement of TFPI2 by the fully automatic enzyme immunoassay device AIA-2000 was carried out according to the following procedure. (1) 20 ⁇ L of the sample and 80 ⁇ L of the diluted solution containing the surfactant were automatically dispensed into the container containing the TFPI2 measurement reagent prepared in Example 1. (2) Perform an antigen-antibody reaction for 10 minutes at a constant temperature of 37 ° C. (3) After B / F separation, wash 8 times with a buffer solution containing a surfactant.
  • a calibration curve was prepared using a commercially available TFPI2 recombinant protein (R & D) as a standard product, and the TFPI2 concentration in the sample was calculated.
  • the CA125 was measured using the E-test TOSOHII CA125 measuring reagent (manufactured by Tosoh Corporation, approval number 20700AMZ00504000).
  • FIG. 1 BoxPlot of blood TFPI2 value and blood CA125 measurement value is shown in FIG. Both TFPI2 and CA125 were found to be statistically significantly higher in ovarian malignancies (excluding highly atypical serous cancers) than in benign ovarian tumors (Man-Whitney). U test, p ⁇ 0.0001).
  • the ROC analysis result is shown in FIG.
  • the area under the curve (AUC) of TFPI2 is 0.7644
  • the AUC of CA125 is 0.7699
  • TFPI2 has good ovarian malignancies (excluding high-grade serous cancer) detection performance (excluding high-grade serous cancer) comparable to CA125. It was shown to have benign tumors and ovarian malignancies (excluding high-grade serous cancers).
  • Example 3 Comparison of benign and malignant discrimination performance between TFPI2 and CA125
  • the cutoff value (191 pg / mL) of TFPI2 is the concentration at which Youden index (specificity + sensitivity -1) is the maximum value from the ROC analysis result of Example 2. And said.
  • the cutoff value (35 U / mL) used in clinical practice was used.
  • Table 2 shows the discrimination performance (sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, positive likelihood ratio, negative likelihood ratio) of each marker calculated using the 2 ⁇ 2 contingency table.
  • TFPI2 has been shown to be superior in specificity, positive predictive value and positive likelihood ratio to CA125, while CA125 has been shown to be more sensitive than CA125.
  • Example 4 Correlation analysis of TFPI2 and CA125 Based on the results of Example 2, the result of analyzing the correlation between TFPI2 and CA125 in benign ovarian tumors or malignant ovarian tumors (excluding high-grade serous cancer) Is shown in FIG. No significant correlation was found between TFPI2 and CA125 in either benign ovarian tumors or malignant ovarian tumors (excluding high-grade serous cancer), suggesting that they are independent indicators.
  • Table 3 shows the breakdown of the clinical specimens used in this example. 77 cases of benign ovarian tumor serum and 274 cases of malignant ovarian tumor (excluding high-grade serous cancer) were samples collected by the same protocol at the Department of Obstetrics and Gynecology, Yokohama City University, and were informed outlets. Provided with consent and approval of the Yokohama City University Ethics Committee.
  • a fully automatic enzyme immunoassay device AIA-900 manufactured by Tosoh Corporation, manufacturing and sales notification number: 13B3X9002002000122 was used.
  • the measurement of TFPI2 by the fully automatic enzyme immunoassay device AIA-900 was carried out according to the following procedure. (1) 20 ⁇ L of the sample and 80 ⁇ L of the diluted solution containing the surfactant were automatically dispensed into the container containing the TFPI2 measurement reagent prepared in Example 1. (2) Perform an antigen-antibody reaction for 10 minutes at a constant temperature of 37 ° C. (3) After B / F separation, wash 8 times with a buffer solution containing a surfactant.
  • TFPI2 integrity nmol / (L ⁇ s)
  • R & D TFPI2 recombinant protein
  • the measurement of CA125 was carried out using an E-test "TOSOH" II (CA125) measuring reagent (manufactured by Tosoh Corporation, approval number: 20700AMZ00504000). BoxPlot of blood TFPI2 value and blood CA125 measurement value is shown in FIG. Both TFPI2 and CA125 were found to be statistically significantly higher in ovarian malignancies (excluding highly atypical serous cancers) than in benign ovarian tumors (Man-Whitney). U test, p ⁇ 0.0001).
  • the ROC analysis result is shown in FIG.
  • the area under the curve (AUC) of TFPI2 is 0.749
  • the AUC of CA125 is 0.761
  • TFPI2 is a good ovarian malignancies comparable to CA125 (excluding high-grade serous cancer) detection performance (ovary). It was shown to have benign tumors and ovarian malignancies (excluding high-grade serous cancers).
  • Example 6 Comparison of benign / malignant discrimination performance between TFPI2 and CA125 in the additional sample
  • the cutoff values of TFPI2 and CA125 used were the same as those in Example 3 (TFPI2: 191 pg / mL, CA125: 35 U / mL).
  • Table 4 shows the discrimination performance (sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, positive likelihood ratio, negative likelihood ratio) of each marker calculated using the 2 ⁇ 2 contingency table. Similar to Example 3, TFPI2 was shown to be superior to CA125 in specificity, positive predictive value and positive likelihood ratio, while CA125 was shown to be superior in sensitivity to TFPI2.
  • Example 7 Correlation analysis of TFPI2 and CA125 in additional samples Based on the results of Example 5, the correlation between TFPI2 and CA125 in benign ovarian tumors or malignant ovarian tumors (excluding high-grade serous cancer) The result of the analysis is shown in FIG. No significant correlation was found between TFPI2 and CA125 in either benign ovarian tumors or malignant ovarian tumors (excluding high-grade serous cancer), suggesting that they are independent indicators.
  • the present invention provides a method for differentiating and detecting an ovarian malignant tumor (excluding highly atypical serous cancer) from a benign ovarian tumor by a simple blood test with a relatively small burden on the patient. This is expected to contribute to the treatment of ovarian malignancies, which do not have effective tumor markers and rely on diagnostic imaging, and is extremely useful in industry.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。患者由来の検体中のＴＦＰＩ２量を測定することを特徴とする、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法。また、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド及びインタクトＴＦＰＩ２を特異的に認識する抗体を卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する試薬に含める。

Description

卵巣悪性腫瘍の検出方法及び検出試薬
　本発明は、組織因子経路インヒビター２（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｐａｔｈｗａｙ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　２；ＴＦＰＩ２）を測定対象とする卵巣悪性腫瘍の検出方法及び検出試薬に関する。
　卵巣がんは全世界約２８万人、日本約１万人の新規罹患者とされており（ＧＬＯＢＯＣＡＮ２０１８）、婦人科悪性腫瘍の中で最も死亡数が多いがんである。現状の卵巣がん診断は画像診断とＣＡ１２５を主としＣＡ１９－９等の複数マーカーによる血液検査で悪性・良性を推測し、悪性疑いの場合、手術による卵巣摘出、摘出病片の病理検査による確定診断を実施している。しかし、代表的な卵巣癌マーカーであるＣＡ１２５は卵巣がんの検出においては優れた感度を有するが、月経や腹膜炎、子宮内膜症を含む良性腫瘍などでも大幅に変動する場合がある。その結果、卵巣がん症例に対する治療対応の遅れや疾患の偽陽性判定による良性疾患の過剰治療、それに伴う患者のＱＯＬの低下が問題となっている。従って、ＣＡ１２５を補完する新規卵巣がんマーカーの開発が進められている。
　ヒト精巣上体蛋白４（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ４：ＨＥ４）は２０１７年に本邦で保険適用された新規卵巣がんマーカーである。ＨＥ４はＣＡ１２５に比べて感度は劣るものの、子宮内膜症やその他良性疾患における陽性率が低く高い特異度を有するマーカーとされている。更に、ＨＥ４とＣＡ１２５は相関が低いことから、両マーカーの測定値と閉経情報等から卵巣悪性腫瘍推定値（Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：ＲＯＭＡ）を求めることで、卵巣腫瘍における良性と悪性の鑑別精度がさらに向上するとされている（非特許文献１）。しかしながら、様々な体外診断用医薬品企業から製品化されているＣＡ１２５はその測定値が企業毎に差異が生じることが指摘されている。その一因として各企業が測定試薬に採用する抗体や濃度算出に用いる標準品の差異が挙げられており、正確なＲＯＭＡを算出するためにはＣＡ１２５測定値の試薬間差を考慮しなければならないことが課題とされている。したがって、患者負担の少ない血液検査による簡便かつ正確な卵巣悪性腫瘍の検出方法が切望されている。
　組織因子経路インヒビター２（ＴＦＰＩ２）は、胎盤タンパク質５（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５；ＰＰ５）と同一のタンパク質であり、３つのクニッツ型プロテアーゼインヒビタードメインを含む胎盤由来セリンプロテアーゼインヒビターである。ＴＦＰＩ２は卵巣癌細胞株において明細胞癌細胞株から特異的に産生され、卵巣癌患者組織における遺伝子発現は明細胞癌患者のみで特異的に向上することが明らかにされ（特許文献１）、血中ＴＦＰＩ２の測定により卵巣明細胞癌を検出する方法が開示された（特許文献２および３、非特許文献２および３）。
　一方、別の研究グループから卵巣悪性腫瘍の１つである高異型度漿液性がん（ＨＧＳＣ）と卵巣良性腫瘍の血漿のプロテオーム解析の結果、ＨＧＳＣ群で測定中央値が上昇するタンパク質群の一つとしてＴＦＰＩ２が報告されている（非特許文献４）。しかし今日まで、ＴＦＰＩ２が境界悪性腫瘍を含む多様な組織型を有する卵巣悪性腫瘍と卵巣良性腫瘍の鑑別に適用できるかは不明であった。
特許第５２２４３０９号 特許第６０７４６７６号 国際公開第２０１６／０８４９１２号
Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ３６．２（２０１５）,１０４５－１０５３ Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．， ２０１３，１２（１０），４３４０－４３５０ ＰｌｏＳ ｏｎｅ １１．１０ （２０１６）: ｅ０１６５６０９. Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ９（２０１９）： １１５０
　本発明は、卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。
　本発明者らは鋭意検討し、血中ＴＦＰＩ２値は卵巣良性腫瘍患者と比較して卵巣悪性腫瘍患者で有意に向上することを見出し、ＴＦＰＩ２が高い特異度をもって卵巣悪性腫瘍を検出しうることに想到し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］検体において、ＴＦＰＩ２量を測定することを含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法。
［２］前記ＴＦＰＩ２量の測定値が、予め設定した基準値を超えた場合に、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）が検出されたとする、［１］に記載の方法。
［３］前記ＴＦＰＩ２量が、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記ＴＦＰＩ２量の測定が、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により行われるものである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、［４］に記載の方法。
［６］質量分析法を用いて測定を行う、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［７］さらにＴＦＰＩ２以外の卵巣癌マーカーを検出する方法を組み合わせて行うものである、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬。
　本発明により、卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して、簡便かつ高い精度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬が提供される。
卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍患者群におけるＴＦＰＩ２又はＣＡ１２５測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ　Ｐｌｏｔ）を示した図。縦軸は血中ＴＦＰＩ２又はＣＡ１２５量を表す。 卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍群の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示した図。 卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍患者群におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５との測定値の相関を示した図。縦軸はＣＡ１２５測定値、横軸はＴＦＰＩ２測定値を表す。 卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍患者群におけるＴＦＰＩ２又はＣＡ１２５測定値のボックスプロットを示した図。縦軸は血中ＴＦＰＩ２又はＣＡ１２５量を表す。 卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍群のＲＯＣ曲線を示した図。 卵巣良性腫瘍群と卵巣悪性腫瘍患者群におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５との測定値の相関を示した図。縦軸はＣＡ１２５測定値、横軸はＴＦＰＩ２測定値を表す。
＜１＞本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法
　本発明の第一の態様は、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法であり、検体においてＴＦＰＩ２量を測定することを含む。これは、卵巣良性腫瘍と比べて、卵巣悪性腫瘍の血液等の生体試料中においてＴＦＰＩ２の存在が上昇することに基づく方法である。検体におけるＴＦＰＩ２量の測定は、通常インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で行われる。この方法により、後述する実施例が示す通り、高い特異度で卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出することができる。
　なお、本発明の方法は、卵巣悪性腫瘍を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する段階までを含むものであり、卵巣悪性腫瘍の診断に関する最終的な判断行為は含まれない。医師は、本発明の方法による検出結果等を参照して、卵巣悪性腫瘍を診断したり治療方針を立てたりする。
　本発明において検出される卵巣悪性腫瘍は、悪性腫瘍と境界悪性腫瘍を指し、これらにそれぞれ含まれる種々の腫瘍が対象となり、高異型度漿液性がんを除くほかは特に限定されない。
　悪性腫瘍としては、非浸潤性低異型度漿液性癌、低異型度漿液性癌、粘液性癌、類内膜癌、明細胞癌、悪性ブレンナー腫瘍、漿液粘液性癌、未分化癌（低異型度類内膜間質肉腫、高異型度類内膜間質肉腫）、混合型上皮性間葉系腫瘍（線肉腫・癌肉腫）などの上皮性；純粋型間質性腫瘍（富細胞性線維腫・線維肉腫・悪性ステロイド細胞腫瘍）、純粋型性索腫瘍（成人型顆粒膜細胞腫・若年型顆粒膜細胞腫・セルトリ細胞腫・輪状細管を伴う性索腫瘍）などの性索間質性腫瘍；セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、その他の性索間質性腫瘍などの混在型性索間質性腫瘍；未分化胚細胞腫瘍／ディスジャーミノーマ・卵黄嚢腫瘍、体芽性癌（胎児性癌）・多胎芽腫・未熟奇形腫（Ｇ３）・悪性添加を伴う成熟奇形腫線維肉腫・絨毛癌・混在型胚細胞腫瘍などの胚細胞腫瘍；癌種、肉腫；悪性リンパ腫；二次性（転移性）腫瘍等が挙げられる。これらの中でも、明細胞癌、低異型度漿液性癌、類内膜癌及び粘液性癌が好ましい例示としてあげられる。また、明細胞癌、類内膜癌及び粘液性癌が更に好ましい例示としてあげられる。
　境界悪性腫瘍としては、漿液性・微少乳頭状パターンを伴う漿液性、粘液性、類内膜、明細胞、腺線維種、表在性乳頭状、ブレンナー腫瘍、漿液粘液性などの上皮性；顆粒膜細胞、セルトリ・間質細胞腫瘍（中分化型）、ステロイド細胞腫瘍（分類不能型）、ギナンドブラストーマなどの性策間質性腫瘍；未熟奇形腫（Ｇ１、Ｇ２）、カルチノイド、甲状腺腫性カルチノイドなどの胚細胞腫瘍；性腺芽腫（純粋型）；等が挙げられる。
　本発明において測定されるＴＦＰＩ２は、特に限定はなく、例えばインタクトＴＦＰＩ２（以降、「Ｉ－ＴＦＰＩ２」とも記す）、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド（以降、「ＮＴ－ＴＦＰＩ２」とも記す）、又はそれらの両方であってもよい。
　配列番号１に、ヒトＴＦＰＩ２のｃＤＮＡに基づくアミノ酸配列を示す。配列番号１において、開始メチオニンから２２残基目のグリシンまではシグナルペプチドである。
　「インタクトＴＦＰＩ２」とは、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目から２３５残基目で表されるペプチドをいう。
　また、「ＮＴ－ＴＦＰＩ２」は、特許文献３に記載されるように、インタクトＴＦＰＩ２のＮ末端側に位置するクニッツドメイン１を含むペプチド断片をいう。より具体的には、ＮＴ－ＴＦＰＩ２は、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの配列を少なくとも含むペプチド、または、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである。前記同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。また、このポリペプチドは、前記配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。なお、数個とは、好ましくは２～２０個、より好ましくは２～１０個、さらに好ましくは２～５個をいう。また、前記配列の両側に他のペプチドフラグメントを有していてもよいが、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３を認識する抗体の抗原決定基（エピトープ）を有しないことが好ましい。
　本発明における患者由来の検体（被検試料）は、全血、血球、血清、血漿などの血液成分、細胞または組織の抽出液、尿、脳脊髄液、腹腔洗浄液、腹水などが挙げられる。また、卵巣組織生検サンプルを検査対象としてもよいが、その場合は生検試料の抽出液または培養上清を測定する。血液成分や尿などの体液を検体として用いると、簡便かつ非侵襲的に行うことができるため好ましく、検体採取の容易性、他の検査項目への汎用性を考慮すると、血液成分を検体として用いるのが特に好ましい。検体の希釈倍率は無希釈から１００倍希釈の中から使用する検体の種類や状態に応じて適宜選択すればよい。
　本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法において、ＴＦＰＩ２を検出する方法と卵巣癌の他の腫瘍マーカー（ＴＦＰＩ２以外の卵巣癌マーカー、「他の卵巣癌マーカー」とも記す）を検出する方法とを組み合わせて用いてもよい。その組み合わせ方は、特に制限されない。本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法における、ＴＦＰＩ２を検出する方法と他の卵巣癌マーカーを検出する方法との組み合わせ方の一例として、
（Ａ）測定対象検体に対し、ＴＦＰＩ２を検出する方法と他の卵巣癌マーカーを検出する方法とを、同時にまたは別個に行ない、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、
（Ｂ）測定対象検体に対し、まずＴＦＰＩ２を検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、他の卵巣癌マーカーを検出する方法で、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、
（Ｃ）測定対象検体に対し、まず他の卵巣癌マーカーを検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、ＴＦＰＩ２を検出する方法で、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法、
があげられるが、（Ｂ）または（Ｃ）の方法が、検出の際用いる試薬に無駄が生じなくなる点で好ましい。
　本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法で検出する、他の卵巣癌マーカーは、従来知られているマーカーから適宜選択すればよく、一例として、癌抗原１２５（Ｃａｎｃｅｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ　１２５、ＣＡ１２５）、癌抗原５４６（ＣＡ５４６）、癌抗原７２－４（ＣＡ７２－４）、癌抗原１３０（ＣＡ１３０）、癌抗原６０２（ＣＡ６０２）、シアリルＴｎ抗原（Ｓｉａｌｙｌ　Ｔｎ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＳＬＮ）、癌関連ガラクトース転移酵素（Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｔｕｍｏｒ、ＧＡＴ）、リゾホスファチジン酸（ＬｙｓｏＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ　Ａｃｉｄ、ＬＰＡ）、ヒト精巣上体タンパク質４（Ｈｕｍａｎ　Ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４、ＨＥ４）が挙げられる。このうち、特に他の卵巣癌マーカーとして最も汎用されているＣＡ１２５は臨床的有用性が確立している点で、本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法で使用する他の卵巣癌マーカーとして好ましい。また、本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法において検出される他の卵巣癌マーカーは、１種のみであってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。
　また、本発明における検体の採取時期は、特に限定されない。例えば、画像診断等で骨盤内腫瘤が確認され卵巣悪性腫瘍疑いとなって精密検査が施行される術前時から、術後の病理検査により卵巣悪性腫瘍と確定診断後の経過観察時にかけていつでもよく、確定診断前後、治療開始前後など、いずれの段階で採取した検体であっても、本発明の方法に供することができる。
　本発明の検出方法では、測定により得たＴＦＰＩ２量が、予め設定した基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を超えた場合に、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）が卵巣良性腫瘍と鑑別して検出されたと判定することが好ましい。ここで、ＴＦＰＩ２量は、インタクトＴＦＰＩ２量、ＮＴ－ＴＦＰＩ２量、又はインタクトＴＦＰＩ２量及びＮＴ－ＴＦＰＩ２量の合計のいずれでもよいが、インタクトＴＦＰＩ２量及びＮＴ－ＴＦＰＩ２量の合計が測定のしやすさと十分な感度・特異度との両立の観点からより好ましい。
　判定に用いる基準値は、測定値もしくは換算濃度値のいずれでもよい。なお、換算濃度値は、ＴＦＰＩ２を標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。
　卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して判定する基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、卵巣良性腫瘍と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）をそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。
　以下、ＴＦＰＩ２の測定方法について説明する。
　本発明において、検体中のＮＴ－ＴＦＰＩ２量又はインタクトＴＦＰＩ２量を個別に測定してもよく、またその値を合計して合計量としてもよい。また、検体中のＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の合計量を一度に測定できる測定系で測定してもよい。あるいは、後述するように、両方の測定による合計量とインタクトＴＦＰＩ２単独の測定量とから間接的にＮＴ－ＴＦＰＩ２量を測定してもよい。
　本発明の方法において、ＮＴ－ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は特に制限されない。例えば、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した方法や、質量分析法を利用した方法が例示できる。
（ａ）標識した測定対象及び測定対象を認識する抗体を用い、標識した測定対象及び検体に含まれる測定対象が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
（ｂ）測定対象を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
（ｃ）蛍光標識した測定対象を認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
（ｄ）エピトープの異なる２種類の、測定対象を認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体と測定対象との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
（ｅ）前処理として測定対象を認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その測定対象を抗体より分離し、質量分析装置等により検出する方法。
　（ｄ）、（ｅ）の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では（ｄ）の方法が試薬及び装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。
　抗原抗体反応を利用してＮＴ－ＴＦＰＩ２量及び／又はインタクトＴＦＰＩ２量を測定する方法は、具体的に以下のものが挙げられる。
（Ａ）ＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体を用いて、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を測定する方法（ＮＴ＋Ｉ－ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体は、配列番号１で表されるＴＦＰＩ２アミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体であることが好ましく、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を抗原決定基として認識する抗体であることがさらに好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用いる。
（Ｂ）ＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、インタクトＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法（Ｉ－ＴＦＰＩ２測定系）。なお、前記ＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン３を抗原決定基として認識する抗体であること好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる２種類を用い、うち少なくとも１種類はＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を用い、もう１種類はＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識せずインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体であってもＮＴ－ＴＦＰＩ２とインタクトＴＦＰＩ２の両方を認識する抗体であってもよい。
（Ｃ）（Ａ）のＮＴ＋Ｉ－ＴＦＰＩ２測定系で測定したＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量から、（Ｂ）のＩ－ＴＦＰＩ２測定系で測定したインタクトＴＦＰＩ２単独量を減じることにより、ＮＴ－ＴＦＰＩ２単独の量を算出する方法。
（Ｄ）インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて、ＮＴ－ＴＦＰＩ２単独の量を測定する方法。なお、前記インタクトＴＦＰＩ２を認識せずＮＴ－ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、例えば、ＮＴ－ＴＦＰＩ２のＣ末端部分のペプチド配列を特異的に認識する抗体が挙げられる。前述したサンドイッチ法を用いる場合は、例えば、当該抗体を固相抗体とし、クニッツドメイン１を抗原決定基として認識する抗体を検出抗体とする。
　本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法においては、前述した（Ｃ）や（Ｄ）の方法で測定したＮＴ－ＴＦＰＩ２単独の量を判定の基準に用いてもよいが、（Ａ）の方法で測定したＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２の合計量を判定の基準に用いても十分な感度と特異度が得られるうえ、抗体の取得しやすさや測定が一段階で簡便なことから、後者がより好ましい。
　ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２ポリペプチドまたはタンパク質、インタクトＴＦＰＩ２ポリペプチド又はＴＦＰＩ２タンパク質の部分領域からなるオリゴペプチド、ＮＴ－ＴＦＰＩ２ポリペプチド又はＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することで得ることができる。前記タンパク質または前記オリゴペプチドやポリペプチドは生体内のＴＦＰＩ２の立体構造を反映していない、あるいは調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られた抗体が、所望の生体内のＴＦＰＩ２に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、本抗体を用いて測定系を構築しても結果として検体中に含まれるＴＦＰＩ２濃度を正確に定量できなくなる可能性がある。
　一方、免疫原としてＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いることで、免疫動物の体内でＴＦＰＩ２ポリペプチド又はインタクトＴＦＰＩ２タンパク質のインタクトまたは部分領域が発現され免疫応答が惹起されるため、検体中のＴＦＰＩ２に対して高い特異性及び結合力（すなわち高親和性）を有した抗体が得られるためより好ましい。
　免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。
　さらに、血中にはＴＦＰＩ２の相同体として知られるＴＦＰＩ１も存在する。したがって、ＴＦＰＩ１と交叉せずＴＦＰＩ２のみを特異的に認識する抗体を用いることが望ましい。
　ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。
　ＴＦＰＩ２を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、ＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。
　本発明で用いるＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体の選定は、宿主発現系に由来する、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型ＴＦＰＩ２または分泌型ＴＦＰＩ２に対する親和性に基づいて行えばよい。
　なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のＴＦＰＩ２に近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株、サル腎臓細胞ＣＯＳ７株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒトから単離された癌細胞などが挙げられる。
　本発明で用いられる抗体の精製は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で樹立した、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養後、その培養上清を回収し、必要に応じ硫酸アンモニウム沈殿による抗体濃縮後、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬなどを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体の精製が可能である。
　なお、前述したサンドイッチ法で抗原抗体反応を行なう際に用いる標識した抗体は、前述した方法で精製した抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。
　本発明の方法において、質量分析法を利用してＴＦＰＩ２量を測定する方法について、以下に具体的に説明する。
　検体が血液である場合は、前処理工程として血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等の主要タンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ　Ｈｕｍａｎ　１４等で除去した後、イオン交換、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣ等でさらに分画することが好ましい。または、抗ＴＦＰＩ２抗体を用いた免疫的手法によりＴＦＰＩ２のみを特異的に回収することも可能である。
　測定は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィ・タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、表面増強レーザーイオン化質量分析（ｓｕｒｆａｃｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＳＥＬＤＩ－ＭＳ）等により行うことができる。
　本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法は、卵巣悪性腫瘍を治療する方法に適用することができる。すなわち、本発明により、患者における卵巣悪性腫瘍を治療する方法であって、
（ｉ）ＴＦＰＩ２量の測定値が予め設定した基準値を超えるものとして患者を同定する工程、及び
（ｉｉ）前記同定された患者に対して治療を施す工程、を含む方法が提供される。
　前記工程（ｉ）の同定において、ＴＦＰＩ２量の測定は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を特異的に認識する抗体を用いて行われてもよいし、質量分析法を用いて行われてもよい。
　前記工程（ｉｉ）の治療としては、外科的治療、薬物療法、放射線療法等が挙げられるが特に限定されない。
＜２＞本発明の卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬
　本発明の第二の態様は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体を含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬である。係る抗体としては、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及びインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体がより好ましい。より具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体がさらに好ましい。
　本発明の試薬を前述したサンドイッチ法に利用する場合は、前記抗体としてエピトープの異なる２種類の抗体を含むことが好ましい。
　本発明の試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固相に固定化されていてもよい。
　本発明の試薬のうち、前述したサンドイッチ法の一態様である２ステップサンドイッチ法に利用する場合について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
　まず、本発明の試薬は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す方法で作製することができる。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＴＦＰＩ２を認識する、エピトープの異なる２種類の抗体（以下、「抗体１」及び「抗体２」とする）のうち、抗体１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
（ＩＩ）担体に前記抗体１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤、タンパク質吸着抑制用化学合成ポリマーなどでブロッキング処理を行ない１次試薬とする。
（ＩＩＩ）他方の抗体２を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、又はビオチンに対するアビジンなど特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液などが好ましい。このようにして作製した本発明の試薬は必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
　なお、１ステップサンドイッチ法の場合は、前述した（Ｉ）～（ＩＩ）同様に担体に抗体１を結合させブロッキング処理を行なったものを作製し、前記抗体固定化担体に、標識した抗体２を含む緩衝液をさらに添加して試薬を作製すればよい。
　次に、前述した方法で得られた試薬を用いて、２ステップサンドイッチ法でＴＦＰＩ２を検出し測定するには、以下の（ＩＶ）から（ＶＩ）に示す方法で行なえばよい。
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＴＦＰＩ２溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＴＦＰＩ２を定量する。
　本発明の試薬に含まれる抗体等の試薬成分の量は、検体量、検体の種類、試薬の種類、測定の手法等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。具体的には、例えば、後述するように検体として血清や血漿を２０μＬ使用して、サンドイッチ法によりＴＦＰＩ２量の測定を行う場合、当該検体２０μＬを抗体と反応させる反応系当たり、担体へ結合させる抗体量が１００ｎｇから１０００μｇであってよく、標識抗体量が２ｎｇから２０μｇであってよい。
　本発明の試薬は、用手法での測定にも利用可能であり、自動免疫診断装置を用いた測定にも利用可能である。特に自動免疫診断装置を用いた測定は、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく測定が可能で、かつ短時間に検体中のＴＦＰＩ２が定量可能であるため、好ましい。
　本発明の別の側面は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２の、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬の製造における使用である。
　本発明の別の側面は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２の、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出することにおける使用である。
　本発明の別の側面は、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するために使用される、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２である。
　本発明の別の側面は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体の、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬の製造における使用である。
　本発明の別の側面は、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体の、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出することにおける使用である。
　本発明の別の側面は、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するために使用される、ＮＴ－ＴＦＰＩ２及び／又はインタクトＴＦＰＩ２を認識する抗体である。
　これらの側面における前記抗体としては、配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体が好ましい。
　以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞　ＴＦＰＩ２測定試薬の調製
　特許文献３の方法に従い、ＤＮＡ免疫法により得られたＴＦＰＩ２抗体を用いてＴＦＰＩ２測定試薬を以下の通り調製した。
（１）水不溶性フェライト含有担体に抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ－ＴＦ０４）を１００ｎｇ／担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて５３℃・４時間ブロッキングを行なうことで、抗ＴＦＰＩ２抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＳ－ＴＦ０１）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて、アルカリフォスファターゼ標識抗ＴＦＰＩ２抗体を調製した。
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に、（１）で調製した１２個の抗体固定化担体を入れた後、（２）で調製したアルカリフォスファターゼ標識抗体を１μｇ／ｍＬ含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）１００μＬを添加し、凍結乾燥を実施することで、ＴＦＰＩ２測定試薬を作製した。なお、作製したＴＦＰＩ２測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで４℃で保管した。
＜実施例２＞　臨床検体の評価
　本実施例で使用した臨床検体の内訳を表１に示す。卵巣良性腫瘍血清３３例と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）血清３８例は横浜市立大学産婦人科にて同一プロトコルにて収集された検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けて提供された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　評価用装置は全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００（東ソー社製：製造販売届出番号１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００９）を用いた。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００によるＴＦＰＩ２の測定は、以下の手順で行った。
（１）サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例１で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）Ｂ／Ｆ分離後、界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４－メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加し、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４－メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ＴＦＰＩ２　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。
　市販ＴＦＰＩ２組み換えタンパク（Ｒ＆Ｄ社）を標準品として検量線を作成し、検体中のＴＦＰＩ２濃度を算出した。ＣＡ１２５の測定はＥテストＴＯＳＯＨＩＩ ＣＡ１２５測定試薬（東ソー社製、承認番号２０７００ＡＭＺ００５０４０００）を用いて測定した。
　血中ＴＦＰＩ２値および血中ＣＡ１２５測定値のＢｏｘＰｌｏｔを図１に示す。ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５はいずれも卵巣良性腫瘍と比較して卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）では統計的有意差を持って高値を示すことが明らかとなった（マン＝ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．０００１）。
　ＲＯＣ解析結果を図２に示す。ＴＦＰＩ２の曲線下面積（ＡＵＣ）は０．７６４４、ＣＡ１２５のＡＵＣは０．７６９９となり、ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に匹敵する良好な卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）検出性能（卵巣良性腫瘍と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）の鑑別性能）を有することが示された。
＜実施例３＞ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の良性悪性鑑別性能の比較
　ＴＦＰＩ２のカットオフ値（１９１ｐｇ／ｍＬ）は実施例２のＲＯＣ解析結果よりＹｏｕｄｅｎ　ｉｎｄｅｘ（特異度＋感度－１）が最大値となる濃度とした。ＣＡ１２５は臨床現場で使用されているカットオフ値（３５Ｕ／ｍＬ）を用いた。２×２分割表を用いて算出した各マーカーの鑑別性能（感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、陽性尤度比、陰性尤度比）を表２に示す。ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に比べて特異度、陽性的中率および陽性尤度比に優れることが示された、一方、ＣＡ１２５はＴＦＰＩ２に比べて感度に優れることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜実施例４＞　ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関解析
　実施例２の結果を基に、卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関を解析した結果を図３に示す。ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５は卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）のいずれにおいても有意な相関は認められず、独立した指標となることが示唆された。
＜実施例５＞　追加臨床検体の評価
　本実施例で使用した臨床検体の内訳を表３に示す。卵巣良性腫瘍血清７７例と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）血清２７４例は横浜市立大学産婦人科にて同一プロトコルにて収集された検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けて提供された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　評価用装置は全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－９００（東ソー社製、製造販売届出番号：１３Ｂ３Ｘ９０００２００００１２）を用いた。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－９００によるＴＦＰＩ２の測定は、以下の手順で行った。
（１）サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例１で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）Ｂ／Ｆ分離後、界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４－メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加し、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４－メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ＴＦＰＩ２　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。
　市販ＴＦＰＩ２組み換えタンパク（Ｒ＆Ｄ社）を標準品として検量線を作成し、検体中のＴＦＰＩ２濃度を算出した。ＣＡ１２５の測定は、Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＣＡ１２５）測定試薬（東ソー社製、承認番号：２０７００ＡＭＺ００５０４０００）を用いて測定した。
　血中ＴＦＰＩ２値および血中ＣＡ１２５測定値のＢｏｘＰｌｏｔを図４に示す。ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５はいずれも卵巣良性腫瘍と比較して卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）では統計的有意差を持って高値を示すことが明らかとなった（マン＝ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．０００１）。
　ＲＯＣ解析結果を図５に示す。ＴＦＰＩ２の曲線下面積（ＡＵＣ）は０．７４９、ＣＡ１２５のＡＵＣは０．７６１となり、ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に匹敵する良好な卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）検出性能（卵巣良性腫瘍と卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）の鑑別性能）を有することが示された。
＜実施例６＞　追加検体におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の良性悪性鑑別性能の比較
　ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５のカットオフ値は、実施例３と同じ値（ＴＦＰＩ２：１９１ｐｇ／ｍＬ、ＣＡ１２５：３５Ｕ／ｍＬ）を用いた。２×２分割表を用いて算出した各マーカーの鑑別性能（感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、陽性尤度比、陰性尤度比）を表４に示す。実施例３と同様に、ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５に比べて特異度、陽性的中率および陽性尤度比に優れることが示された、一方、ＣＡ１２５はＴＦＰＩ２に比べて感度に優れることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜実施例７＞　追加検体におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関解析
　実施例５の結果を基に、卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）におけるＴＦＰＩ２とＣＡ１２５の相関を解析した結果を図６に示す。ＴＦＰＩ２とＣＡ１２５は卵巣良性腫瘍または卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）のいずれにおいても有意な相関は認められず、独立した指標となることが示唆された。
　本発明により、簡便かつ患者負担が比較的少ない血液検査で卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法が提供される。これは、有効な腫瘍マーカーが存在せず画像診断に依存している卵巣悪性腫瘍診療への貢献が期待され、産業上非常に有用である。

Claims (8)

  1. 　検体において、ＴＦＰＩ２量を測定することを含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出する方法。
  2. 　前記ＴＦＰＩ２量の測定値が、予め設定した基準値を超えた場合に、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）が検出されたとする、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＴＦＰＩ２量が、ＴＦＰＩ２プロセシングポリペプチド量及びインタクトＴＦＰＩ２量の合計である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記ＴＦＰＩ２量の測定が、配列番号１のアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いた抗原抗体反応により行われるものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記抗体が、ＴＦＰＩ２のクニッツドメイン１を認識する抗体である、請求項４に記載の方法。
  6. 　質量分析法を用いて測定を行う、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　さらにＴＦＰＩ２以外の卵巣癌マーカーを検出する方法を組み合わせて行うものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　配列番号１に示すアミノ酸配列の２３残基目のアスパラギン酸から１３１残基目のヒスチジン又は１３０残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、卵巣悪性腫瘍（但し、高異型度漿液性がんを除く）を卵巣良性腫瘍と鑑別して検出するための試薬。
PCT/JP2021/004736 2020-02-26 2021-02-09 卵巣悪性腫瘍の検出方法及び検出試薬 WO2021172000A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022503238A JPWO2021172000A1 (ja) 2020-02-26 2021-02-09
CA3172404A CA3172404A1 (en) 2020-02-26 2021-02-09 Method and reagent for detecting malignant ovarian tumors
US17/802,354 US20230122642A1 (en) 2020-02-26 2021-02-09 Method and reagent for detecting malignant ovarian tumors
BR112022016212A BR112022016212A2 (pt) 2020-02-26 2021-02-09 Método para detectar tumor ovariano maligno, e, uso de um anticorpo
EP21760051.9A EP4113119A4 (en) 2020-02-26 2021-02-09 METHOD AND REAGENT FOR DETECTING MALIGNANT OVARIAN TUMORS
AU2021227181A AU2021227181A1 (en) 2020-02-26 2021-02-09 Method and reagent for detecting malignant ovarian tumors
CN202180016885.2A CN115151821A (zh) 2020-02-26 2021-02-09 卵巢恶性肿瘤的检测方法和检测试剂

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020030210 2020-02-26
JP2020-030210 2020-02-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021172000A1 true WO2021172000A1 (ja) 2021-09-02

Family

ID=77490489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/004736 WO2021172000A1 (ja) 2020-02-26 2021-02-09 卵巣悪性腫瘍の検出方法及び検出試薬

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230122642A1 (ja)
EP (1) EP4113119A4 (ja)
JP (1) JPWO2021172000A1 (ja)
CN (1) CN115151821A (ja)
AU (1) AU2021227181A1 (ja)
BR (1) BR112022016212A2 (ja)
CA (1) CA3172404A1 (ja)
WO (1) WO2021172000A1 (ja)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050037389A1 (en) * 2003-06-03 2005-02-17 Santin Alessandro D. Gene expression profiling of uterine serous papillary carcinomas and ovarian serous papillary tumors
US20050095592A1 (en) * 2002-02-13 2005-05-05 Jazaeri Amir A. Identification of ovarian cancer tumor markers and therapeutic targets
JP2007506965A (ja) * 2003-09-24 2007-03-22 オンコセラピー・サイエンス株式会社 Ｔｆｐｉ−２タンパク質を用いた卵巣子宮内膜症の診断法
JP2012145500A (ja) * 2011-01-13 2012-08-02 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 上皮性卵巣癌鑑別マーカー
JP2013061321A (ja) * 2011-08-19 2013-04-04 Yokohama City Univ 組織因子経路阻害因子２（ｔｆｐｉ２）測定による卵巣明細胞腺癌の検査方法および検査薬
JP5224309B2 (ja) 2010-02-22 2013-07-03 公立大学法人横浜市立大学 卵巣明細胞腺癌に特異的に発現しているタンパク質とその応用
WO2016084912A1 (ja) 2014-11-27 2016-06-02 公立大学法人横浜市立大学 卵巣明細胞腺癌の検査方法及び検査薬
EP3657170A1 (en) * 2018-11-20 2020-05-27 Philipps-Universität Marburg Method for the early detection and diagnosis of primary and relapsed ovarian carcinoma (oc)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6760562B2 (ja) * 2016-09-30 2020-09-23 公立大学法人横浜市立大学 卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報提供方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050095592A1 (en) * 2002-02-13 2005-05-05 Jazaeri Amir A. Identification of ovarian cancer tumor markers and therapeutic targets
US20050037389A1 (en) * 2003-06-03 2005-02-17 Santin Alessandro D. Gene expression profiling of uterine serous papillary carcinomas and ovarian serous papillary tumors
JP2007506965A (ja) * 2003-09-24 2007-03-22 オンコセラピー・サイエンス株式会社 Ｔｆｐｉ−２タンパク質を用いた卵巣子宮内膜症の診断法
JP5224309B2 (ja) 2010-02-22 2013-07-03 公立大学法人横浜市立大学 卵巣明細胞腺癌に特異的に発現しているタンパク質とその応用
JP2012145500A (ja) * 2011-01-13 2012-08-02 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 上皮性卵巣癌鑑別マーカー
JP2013061321A (ja) * 2011-08-19 2013-04-04 Yokohama City Univ 組織因子経路阻害因子２（ｔｆｐｉ２）測定による卵巣明細胞腺癌の検査方法および検査薬
JP6074676B2 (ja) 2011-08-19 2017-02-08 公立大学法人横浜市立大学 組織因子経路阻害因子２（ｔｆｐｉ２）測定による卵巣明細胞腺癌の検査方法および検査薬
WO2016084912A1 (ja) 2014-11-27 2016-06-02 公立大学法人横浜市立大学 卵巣明細胞腺癌の検査方法及び検査薬
EP3657170A1 (en) * 2018-11-20 2020-05-27 Philipps-Universität Marburg Method for the early detection and diagnosis of primary and relapsed ovarian carcinoma (oc)

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOLTENBERG A, FURGYIK S: "PLACENTAL PROTEINS (PP 5, PP 12 AND PP 14) IN OVARIAN TUMORS A PRELIMINARY REPORT", ACTA OBSTETRICIA AND GYNECOLOGICA SCANDINAVICA., MUNKSGAARD, COPENHAGEN., DK, vol. 66, no. 03, 1 January 1987 (1987-01-01), DK, pages 213 - 215, XP000990701, ISSN: 0001-6349 *
FRONTIERS IN ONCOLOGY, vol. 9, 2019, pages 1150
INABA N, ISHIGE H, IJICHI M, SATOH N, OHKAWA R, SEKIYA S, SHIROTAKE S, TAKAMIZAWA H, RENK T, BOHN H: "IMMUNO HISTOCHEMICAL DETECTION OF PREGNANCY SPECIFIC PROTEIN SP-1 AND PLACENTA SPECIFIC TISSUE PROTEINS PP-5 PP-10 PP-11 AND PP-12 IN OVARIAN ADENO CARCINOMAS", ONCODEVELOPMENT BIOLOGY AND MEDICINE, ELSEVIER, AMSTERDAM,, NL, vol. 3, no. 5-6, 1 January 1982 (1982-01-01), NL, pages 379 - 390, XP009140970, ISSN: 0167-1618 *
J. PROTEOME RES., vol. 12, no. 10, 2013, pages 4340 - 4350
PLOS ONE, vol. 10, 2016, pages e0165609
See also references of EP4113119A4
TUMOR BIOLOGY, vol. 2, 2015, pages 1045 - 1053
ZHANG, QING ET AL.: "A multiplex methylation- specific PCR assay for the detection of early- stage ovarian cancer using cell -free serum DNA", CYNECOLOGIC ONCOLOGY, vol. 130, 2013, pages 132 - 139, XP028569267, DOI: 10.1016/j.ygyno.2013.04.048 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3172404A1 (en) 2021-09-02
CN115151821A (zh) 2022-10-04
US20230122642A1 (en) 2023-04-20
BR112022016212A2 (pt) 2022-10-04
JPWO2021172000A1 (ja) 2021-09-02
EP4113119A1 (en) 2023-01-04
AU2021227181A1 (en) 2022-09-22
EP4113119A4 (en) 2024-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11193936B2 (en) Method and reagent for detecting ovarian clear cell adenocarcinoma
EP3742166B1 (en) Renal cancer detection method and test drug
JP5856956B2 (ja) 血液検査方法
WO2021172000A1 (ja) 卵巣悪性腫瘍の検出方法及び検出試薬
JP6760562B2 (ja) 卵巣明細胞癌患者の予後を予測するための情報提供方法
WO2021246153A1 (ja) 膵臓がんの検出方法及び検出試薬
WO2023013673A1 (ja) 悪性腫瘍関連血栓塞栓症の検出方法及び検出試薬
US8741288B2 (en) Protein markers for detecting liver cancer and method for identifying the markers thereof
WO2021100621A1 (ja) がんの骨転移を検出する方法及び検出試薬
JP2024117619A (ja) 子宮体癌患者の予後を予測するための情報提供方法
US20130095483A1 (en) Predictive biomarkers for breast cancer

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21760051

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022503238

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3172404

Country of ref document: CA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112022016212

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021227181

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20210209

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021760051

Country of ref document: EP

Effective date: 20220926

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112022016212

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20220815