WO2021167352A1 - 폐암의 방사선 치료 예후 예측을 위한 생체 표지자 - Google Patents

폐암의 방사선 치료 예후 예측을 위한 생체 표지자 Download PDF

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lung cancer
rip1
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metastasis
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박종국
엄홍덕
황상구
송지영
조정현
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한국원자력의학원
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Definitions

  • the present invention relates to a method of providing information for diagnosing metastasis of lung cancer treated with radiation, and more particularly, to a method of providing information for diagnosing metastasis of lung cancer treated with RIP1 expression level.
  • Lung cancer is a type of cancer in developed countries whose major causes are smoking and pollution. It started to increase rapidly in Europe and America in the 20th century, and more than 1.3 million people worldwide die from lung cancer every year, the highest cause of cancer deaths. is playing an important role. In the case of the Republic of Korea, it has been reported that about 100,000 new cancer patients and 50,000 cancer patients die every year. Moreover, the incidence of cancer has been increasing in recent years, and cancer is currently the second leading cause of death among adults in Korea. In particular, lung cancer accounts for about 12% of cancers occurring in Korean adults and ranks third in incidence after gastric and liver cancers, and the incidence is increasing in both men and women every year.
  • lung cancer has already metastasized to other organs at the time of diagnosis or has progressed locally even if there is no metastasis, and despite various treatments such as radical resection, chemotherapy, and radiation therapy, the 5-year survival rate is due to recurrence and metastasis after treatment. It is a tumor with a very low cure rate that stays at around 5% and ranks first in mortality due to cancer. Therefore, it is necessary to develop a treatment/therapeutic agent that can minimize side effects and increase the treatment rate.
  • radiation therapy is an effective cancer treatment along with surgery or chemical drug therapy, and is used for the purpose of killing cancer cells by treating a cancer tissue part of a patient with radiation.
  • the expression of RIP1 is increased in lung cancer by radiation treatment, which is confirmed to increase the invasion (invasion) and metastasis (migration) in lung cancer.
  • one object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing lung cancer metastasis by radiotherapy.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing lung cancer metastasis induced by radiation, which includes an agent for measuring the expression level of RIP1.
  • RIP1 is considered to be a kinase that plays an important role in determining cell life and death.
  • RIP1 has a total of three domains: a serine/threonine kinase domain required for necroptosis, an intermediate domain containing a homozygous interaction motif, and a death domain for apoptotic activity.
  • Ubiquitination of RIP1 promotes cell survival, and di-ubiquitination causes apoptosis in the cell.
  • RIP1 has multiple domains, activation of RIP1 can lead to various results, such as NF- ⁇ B, mitogen-activated protein kinase (MAPK), apoptosis or necroptosis.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • Necrostatin-1 blocks RIP1 kinase activity to prevent necroptosis induced by apoptosis.
  • RIP3 regulates programmed necroptosis and increases RIP1 recruitment in the necrosome.
  • RIP1 and RIP3 kinases are also involved in the phosphorylation of RIP1 and RIP3.
  • RIP1 was estimated as a candidate for radiation-induced radiation-induced protein in lung cancer, and it was identified that RIP1 had the function of increasing the invasiveness and metastasis of lung cancer cells by radiation treatment. In addition, it was confirmed that proteins such as NF- ⁇ B, STAT-3, Src and IL-1 ⁇ were activated in response to radiation.
  • proteins including RIP1 induce EMT through the EGFR/NF- ⁇ B-RIP1-Src-STAT3-IL-1 ⁇ signaling pathway by irradiation, and the activated EMT is the movement of cancer cells. And it was confirmed that it is a factor that promotes resistance such as metastasis.
  • the present invention has completed the present invention by confirming the possibility that RIP1 can be used as a diagnostic biomarker since it is possible to diagnose the metastasis of lung cancer induced by radiotherapy to the extent of RIP1 expression.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object provides a method for providing information for metastasis diagnosis of lung cancer subjected to radiation therapy, and may include the following steps:
  • step (c) comparing the expression level of step (a) with the expression level of step (b).
  • the method may further include determining that the metastatic potential of lung cancer is high.
  • the "expression level of RIP1" means the protein expression level of RIP1 or the mRNA expression level of RIP1.
  • the "patient sample” may refer to a sample derived from a patient who has undergone radiation treatment (irradiation).
  • a sample capable of specifying overexpression of RIP1 as a biomarker for diagnosing lung cancer metastasis, and may include a sample such as a patient's tissue cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the present invention by comparing the expression level of RIP1 in the normal control with the expression level of RIP1 in a lung cancer patient who received radiation therapy or a patient with early lung cancer who received radiation therapy with mild symptoms, a patient suspected of lung cancer metastasis induced by radiation therapy or In early stage lung cancer patients with mild symptoms, it is possible to diagnose whether lung cancer has metastasized to other parts of the body.
  • the terms "irradiation”, “radiation therapy”, “IR irradiation, treatment and/or treatment” refer to a local treatment method that damages the DNA of malignant cells. Normal cells have a greater capacity to repair this damage than tumor cells. Irradiation refers to a treatment using such a difference, and includes a method of treatment using radiation in a conventional sense. Irradiation can be divided into radical (red) radiation therapy, adjuvant radiation therapy, and palliative radiation therapy depending on the purpose of treatment. Radiation is a treatment that uses high-energy radiation to kill cancer cells, but since it affects not only cancer cells but also normal tissues around them, side effects may occur due to treatment. One of the biggest problems with these side effects is cancer metastasis.
  • the measurement of the RIP1 expression level may be to measure the amount of protein or mRNA.
  • the RIP1 expression level was measured by Western blotting, antigen-antibody reaction, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, immunohistochemistry, rocket immunoelectrophoresis,
  • the protein expression may be measured using tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, or the like.
  • the measurement of the protein amount can use an antigen-antibody reaction, and the specific by the antigen-antibody reaction is Western blotting, antigen-antibody reaction, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radiation Specification by immunodiffusion method, Octeroni immunodiffusion method, immunohistochemistry, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS or protein chip is preferable.
  • the RIP1 expression level was also measured by reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase). protection assay), Northern blotting, a DNA chip, etc. may be a measurement of the expression level of mRNA.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • Northern blotting a DNA chip, etc.
  • the agent for measuring the mRNA expression level of a gene is preferably a primer pair or a probe, and since the nucleic acid information of the genes is known to GeneBank, etc., those skilled in the art can use a primer or probe that specifically amplifies a specific region of these genes based on the sequence. can design.
  • the measurement of the expression level of steps (a) and (b) is any selected from the group consisting of EGFR, NF- ⁇ B, STAT-3, Src, IL-1RI, IL-1RII and IL-1 ⁇ It may further include one or more.
  • the expression level of any one or more selected from the group consisting of EGFR, NF- ⁇ B, STAT-3, Src, IL-1RI, IL-1RII and IL-1 ⁇ from a lung cancer patient sample that has received radiation treatment is further increased measuring;
  • step (c) comparing the measured expression level of step (a) with the expression level of step (b).
  • the EGFR, NF- ⁇ B, STAT-3, Src, IL-1RI, IL-1RII and IL-1 ⁇ including all of the expression levels thereof may be measured.
  • the above-mentioned EGFR, NF- ⁇ B, STAT-3, Src, IL-1RI, IL-1RII, and IL-1 ⁇ all showed increased expression by radiation treatment compared to the normal control group. Therefore, by measuring the above-mentioned factors along with the measurement of RIP1, it is possible to more accurately determine the metastasis of lung cancer following radiotherapy.
  • receptor-interacting protein 1 can be used as a diagnostic biomarker for diagnosing radiation-induced lung cancer metastasis.
  • any one or more selected from the group consisting of EGFR, NF- ⁇ B, STAT-3, Src, IL-1RI, IL-1RII and IL-1 ⁇ may be further included.
  • biomarker refers to a molecular marker for the purpose of predicting the diagnosis of lung cancer metastasis induced by radiation, and is a sign of normal or abnormal progression in an individual or a marker of a disease or other condition in an individual. is used interchangeably to refer to a target molecule that is or represents it. More particularly, it is an anatomical, physiological, biochemical or molecular parameter associated with the presence of a particular physiological state or progression. Biomarkers are detectable and can be measured by various methods including laboratory assays and medical imaging.
  • the above-mentioned expression level measurement for any one or more selected from the group consisting of EGFR, NF- ⁇ B, STAT-3, Src, IL-1RI, IL-1RII and IL-1 ⁇ is the amount of the aforementioned protein or mRNA. It could be to measure.
  • the present invention provides a kit for diagnosing lung cancer metastasis induced by radiation comprising an agent for measuring the expression level of RIP1 (Receptor-interacting protein 1).
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit.
  • the diagnostic kit may further include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the kit may further include an agent for measuring the expression level of any one or more selected from the group consisting of EGFR, NF- ⁇ B, STAT-3, Src, IL-1RI, IL-1RII and IL-1 ⁇ .
  • the ELISA kit may be a diagnostic kit comprising essential elements necessary for performing ELISA.
  • the ELISA kit includes an antibody, an interacting protein, a ligand, nanoparticles or an aptamer that specifically binds to the protein or peptide fragment.
  • Antibodies are antibodies with high specificity and affinity for each marker protein and little cross-reactivity with other proteins, and are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibody, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg, conjugated with an antibody) and substrates thereof or capable of binding the antibody. other materials and the like.
  • kit may further include a user's manual describing optimal conditions for performing the reaction.
  • Instructions include a brochure in the form of a pamphlet or leaflet, a label affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit.
  • the manual includes information published or provided through an electronic medium such as the Internet.
  • the present invention provides a method for inhibiting metastasis of lung cancer that has undergone radiation therapy, comprising the steps of:
  • step (c) comparing the expression level of step (a) with the expression level of step (b);
  • step (d) when the expression level of step (a) is high, administering a therapeutically effective amount of a therapeutic agent for lung cancer or a metastasis inhibitor.
  • the subject for administering the therapeutic agent or the metastasis inhibitor refers to a human or non-human mammal diagnosed with lung cancer and in need of treatment thereof.
  • Said therapeutically effective amount may comprise (a) a decrease in the severity or persistence of a symptom or indication; (b) inhibition of tumor growth and metastasis, or an increase in tumor necrosis, tumor shrinkage and/or tumor disappearance; (c) delay in tumor growth and pathogenesis; (d) inhibition of tumor metastasis; (e) prevention of tumor growth recurrence and the like.
  • the EGFR, NF- ⁇ B, STAT-3, Src, IL-1RI, IL-1RII and IL-1 ⁇ including all of the expression levels thereof may be measured.
  • the above-mentioned EGFR, NF- ⁇ B, STAT-3, Src, IL-1RI, IL-1RII, and IL-1 ⁇ all showed increased expression by radiation treatment compared to the normal control group. Therefore, by measuring the above-mentioned factors along with the measurement of RIP1, it is possible to more accurately determine the metastasis of lung cancer following radiotherapy.
  • Such a lung cancer therapeutic agent or metastasis inhibitor is, for example, a DNA alkylating agent such as mechloethamine, chlorambucil, phenylalanine, mustard, cyclophosphamide. (cyclophosphamide), ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), streptozotocin, busulfan, thiotepa, cisplatin ) and carboplatin;
  • dactinomycin actinomycin D
  • doxorubicin as anti-cancer antibiotics
  • daunorubicin daunorubicin, idarubicin, mitoxantrone
  • pyrisamycin plicamycin
  • mitomycin and C Bleomycin As anti-cancer antibiotics, dactinomycin (actinomycin D), doxorubicin (adriamycin), daunorubicin, idarubicin, mitoxantrone
  • the present invention provides an information providing method for diagnosing lung cancer metastasis by radiation therapy, thereby effectively predicting whether lung cancer metastasis occurs, thereby improving the survival rate of lung cancer patients.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a signal transduction system of cancer metastasis that occurs by ionizing radiation (IR) treatment in lung cancer.
  • IR ionizing radiation
  • Figure 2 shows the results of analyzing the invasiveness and metastasis of lung cancer cells by IR treatment.
  • FIG. 3 shows the results of analysis of signal transduction related to RIP1 expression and EMT (epithelial-mesenchymal transition) generation by IR treatment.
  • Example 1 Radiation (IR) induced lung cancer cell line culture (A549 IR)
  • Human A549 lung cancer cells were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% heat inactivated fetal bovine serum, and maintained at 37° C. under 5% CO 2 .
  • Lung cancer cells (A549) (5 ⁇ 10 5 ) were seeded in 60 mm dishes and cultured overnight, and IR exposure (10 Gy) using a 137 Cs radiation source (Atomic Energy of Canada, Ltd., Mississauga, ON, Canada). By doing this, an IR-treated lung cancer cell line (A549 IR (10Gy)) was obtained.
  • Example 2 Analysis of the effect of RIP1 expression in radiation-induced lung cancer cells on the migration and invasion of cancer cells
  • Example 1 Infiltration and migration analysis of the IR-treated lung cancer cells (A549 IR) obtained in Example 1 was performed, and an experiment was performed to confirm the factors expressed by IR.
  • Matrigel coated transwells (Matrigel coated transwells, Corning NY, USA) were used, and to analyze cell migration, collagen coated transwells (Collagen coated transwells, Corning) were used. NY, USA) was used.
  • the IR-treated lung cancer cell line (A549 IR, 200ul) obtained in Example 1 was seeded in the upper chamber by 1x10 4 in the medium in Matrigel-coated trendwell and collagen-coated transwell, respectively, and 0.1% BSA ( A serum-free medium supplemented with bovine serum albumin) was added. After incubating each transwell at 37° C. under 5% CO 2 for 18 hours, cell staining was performed with a deep quick solution (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA) to confirm invasion and cell migration. , the results are shown in FIGS. 2A and 2B.
  • FIGS. 2A and 2B it was confirmed that the permeability and metastasis of the cells of the IR-treated lung cancer cell line were increased.
  • FIG. 2C the cell viability was confirmed to be almost similar to that of the lung cancer cell line (control group) that was not treated with radiation.
  • the IR-treated lung cancer cell line (A549 IR) cultured in Example 1 was seeded, harvested 24 hours later, protein was extracted, and Western blot was performed to perform RIP1, ratio The expression of mentin, MMP2, MMP9 and ⁇ -action was confirmed, and the results are shown in FIG. 2D.
  • treatment with IR in lung cancer cell lines increased the expression of RIP1, and increased the expression of vimentin, MMP2, and MMP9.
  • Example 3 Analysis of RIP1 expression and EMT expression according to radiation treatment using a lung cancer cell line
  • A549 lung cancer cell line (control) and IR-treated A549 lung cancer cell line each were seeded with 1 ⁇ 10 6 in a 60 ⁇ dish, and after harvesting cells 24 hours later, proteins were extracted, and then, Western blot was performed to perform RIP1, vimentin, and MMP2. , MMP9, p-EGFR, EGFR, ⁇ -action, p-Src, Src, p-STAT3, the expression of STAT3 was confirmed, the results are shown in Figure 3A.
  • the expression of RIP1, vimentin, p-EGFR, and p-STAT3 was strong in the case of the lung cancer cell line treated with IR compared to the control group, and even in the case of p-Src, MMP2 and MMP9, IR irradiation was performed. It was confirmed that the expression was increased afterwards.
  • Lung cancer cell line A549 control group
  • 10% FBS medium was put into the lower chamber, and cells passing through the transwell were stained after 24 hours to confirm cell infiltration, and the results are shown in FIGS. 3C and 3D.
  • lung cancer cell line A549 control and IR-treated lung cancer cell line A549 (IR) were seeded at 1 ⁇ 10 6 in a 60 ⁇ dish with EGFR inhibitor (EGFR inh), Src inhibitor (Src inh) and STAT3 inhibitor (STAT3 inh).
  • EGFR inh EGFR inhibitor
  • Src inhibitor Src inh
  • STAT3 inh STAT3 inhibitor
  • FIGS. 3C and 3D it was confirmed that cell invasion and cell migration were inhibited when the IR-treated lung cancer cell line was treated with a Scr inhibitor or a STAT3 inhibitor.
  • Example 5 Analysis of signaling mechanisms of RIP1 affecting cell mobility of IR-treated lung cancer cell lines
  • siRNA treatment of RIP1 significantly reduced the invasive and metastatic capacity of cells.
  • siRNA treatment also reduced the expression of EMT-related factors.
  • RIP1 affects the activation mechanism of NF- ⁇ B (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated Bcells) and cell mobility.
  • FIGS. 6A and 6B changes in cell invasion and cell migration caused by NF- ⁇ B inhibitor treatment were confirmed by performing invasion and migration analysis, and EMT marker expression was observed by performing western blot.
  • IR-treated When the lung cancer cell line was treated with an NF- ⁇ B inhibitor, it was confirmed that cell invasion and cell migration were reduced, and RIP1 expression was decreased.
  • FIG. 6C the cell viability was confirmed to be almost similar to that of the lung cancer cell line (control group) that was not treated with radiation.
  • Example 7 Activation of Inflammatory Response in IR-treated Lung Cancer Cell Lines and Association analysis of NF- ⁇ b
  • RIP1 not only functions as a kinase, but is also involved in the inflammatory response. According to recent studies, it has been reported that the inflammatory response is related to the proliferation and metastasis of cancer cells. In the present invention, the relationship between inflammatory response activation and NF- ⁇ B in the IR-treated lung cancer cell line was confirmed.
  • lung cancer cell line A549 control group
  • IR-treated lung cancer cell line A549 IR
  • NF- ⁇ B after inhibitor treatment IR / NF- ⁇ B inh
  • Quantitative amounts of the expressed IL-1 ⁇ were analyzed using their activated IL-1 ⁇ protein antibody, and the results are shown in FIG. 7C .
  • IL-1 ⁇ Interleukin 1 ⁇
  • IL-1 ⁇ a representative marker of the inflammatory response
  • Example 8 Effects of RIP1 NF- ⁇ B Activation Mechanism and Cell Mobility according to IL-1Ra Treatment
  • IR-induced IL-1 ⁇ promotes cancer cell migration and invasion through EMT induction.
  • Immunoblot analysis was performed on samples treated with or without IL-Ra (an antagonist of IL-1 ⁇ ) under IR irradiation conditions, and the results are shown in FIG. 8 a .
  • IR showed a decrease in E-cadherin along with an increase in vimentin and MMP-2/9 expression.
  • the treatment of IL-Ra can exhibit a therapeutic effect by inhibiting this action in the underlying mechanism of RIP.
  • Example 9 In vivo, in vitro Phase IR-induced expression of IL-1 ⁇ and its receptor IL-1ri/II
  • IL-1RI/II in vivo, A549 cells were injected subcutaneously into nude mice and developed into xenografts, then exposed to IR (10 Gy) and then sacrificed 48 h after the mice were sacrificed and xenografted. Tissues were collected for immunohistochemistry (IHC) analysis, and IHC data showed that the expression levels of IL-1 ⁇ and its receptor IL-1RI/II were upregulated in IR-treated xenograft tissue. The scoring of the above results is shown in FIG. 9C . Quantitative analysis of IHC results showed that IL-1 ⁇ and IL-1RI/II were up-regulated at least 2-fold in IR-treated tissues compared to non-IR-treated xenografts.
  • IHC immunohistochemistry
  • the metastasis of lung cancer is increased by radiotherapy.
  • This increase in metastasis includes RIP1, EGFR, NF- ⁇ B, STAT-3, Src, IL-1RI, IL-1RII and IL-1 ⁇ . It was confirmed that the signal transduction system is involved.
  • RIP1 is inhibited during radiation therapy, it was confirmed that the side effects caused by radiation therapy were eliminated by suppressing cancer metastasis and penetration.

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Abstract

본 발명은 (a) 방사선 치료를 받은 폐암 환자시료로부터 RIP1 (Receptor-interacting protein 1) 발현량을 측정하는 단계; (b) 정상대조군 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (a)의 발현량과 상기 단계 (b)의 발현량을 비교하는 단계; 를 포함하는 방사선 치료가 된 폐암의 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

Description

폐암의 방사선 치료 예후 예측을 위한 생체 표지자
본 발명은 방사선 치료된 폐암의 전이를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 RIP1 발현량으로 방사선 치료된 폐암의 전이를 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
폐암은 흡연, 공해 등이 가장 큰 원인인 선진국형 암으로, 20세기에 들어서면서 구미 각국에서 급격히 증가하기 시작하여 전 세계적으로 매년 130만 명 이상이 폐암으로 사망하며, 암으로 인한 사망에서 가장 높은 비중을 차지하고 있다. 대한민국의 경우에도, 매년 10여만 명의 암 환자가 새로 발생하고 5만 여명의 암 환자가 사망하고 있는 것으로 보고되었다. 더욱이 암의 발생 빈도는 최근 들어 더욱 증가하는 추세로 현재 암은 우리나라 성인 사망 원인의 2위를 차지하고 있다. 특히, 폐암은 한국 성인에서 발생하는 암중에서 약 12%를 차지하며 위암, 간암에 이어 제3위의 발생률을 보이며 매년 남녀 모두에서 발생률이 증가하고 있다. 또한, 폐암은 진단 당시 이미 다른 장기로 전이를 하였거나 전이가 없는 경우에도 국소적으로 진행되어 근치적절제술, 항암화학요법, 방사선치료 등의 다양한 치료법에도 불구하고 치료 후 재발과 전이에 의해 5년 생존율이 5% 정도에 머무르는 완치율이 매우 낮은 종양으로 암에 의한 사망률 1위를 차지하고 있어, 부작용을 최소화하고 치료율을 높일 수 있는 치료법/치료제 개발이 필요한 실정이다.
현재 방사선 치료는 외과적 수술이나 화학적 약물요법과 함께 효과적인 암 치료법으로서, 환자의 암 조직 부분에 방사선을 처리하여 암세포를 사멸시킬 목적으로 사용되고 있다.
그러나, 방사선 치료 후 대부분 암세포가 제거되지만 그 중 잔류하는 암세포는 방사선에 의해 저항성을 획득하는 경우가 있으며, 이 경우 암의 재발 및 전이를 유도하여 암 환자의 치료에 어려움을 유발하는 주요 원인이 된다고 보고되고 있다.
이러한 배경 하에서, 암세포에 방사선 처리 후 증가하는 암 전이 인자를 발굴하고, 이를 억제하는 치료제/치료법 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명에서 방사선 치료에 의해 폐암에서 RIP1의 발현이 증가하며, 이는 폐암에서 침윤성(invasion) 및 전이성(migration)을 증가시키는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명의 하나의 목적은 방사선 치료에 의한 폐암 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 하나의 목적은 RIP1의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방사선에 의해 유발되는 폐암 전이 진단용 키트를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않은 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
이하, 본 발명에 따른 방사선 치료된 폐암의 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 대하여 상세히 설명한다.
RIP1은 세포의 생사를 결정짓는데 중요한 작용을 하는 키나아제로 여겨지고 있다. RIP1에는 네크롭토시스에 필요한 세린/트레오닌 키나아제 도메인, 동형성 상호 작용 모티브를 포함하는 중간 도메인, 그리고 아폽토시스 활성을 위한 사멸 도메인(death domain)까지 총 3개의 도메인이 있다. RIP1의 유비퀴틴화는 세포생존을 촉진하고, 디유비퀴틴화는 반대로 세포 내에서 세포사멸을 일으키게 된다. RIP1에는 여러 개의 도메인이 존재하기에 RIP1의 활성화는 NF-κB, 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK), 아폽토시스나 네크롭토시스 등 다양한 결과를 초래할 수 있다. 네크로스타틴-1(nec-1)은 RIP1 키나아제 활성을 차단하여 사멸수용에 의해 유도되는 네크롭토시스를 막는다. RIP3은 프로그램된 네크롭토시스를 조절하고, 네크로좀에서의 RIP1 모집(recruitment)을 늘인다. RIP1과 RIP3 키나아제 외에도 여러 다른 키나아제들이 RIP1과 RIP3의 인산화에 관여하기도 한다.
본 발명은 폐암에서 방사선에 의해 유도되는 방사선 유도 단백질로서 RIP1을 후보로 추정하였고, RIP1이 방사선 치료에 의한 폐암 세포의 침윤성 및 전이성을 증가시키는 기능을 가진 것을 규명하였다. 이에 추가적으로 NF-κB, STAT-3, Src 및 IL-1β 등의 단백질들이 방사선에 반응하여 활성화되는 것을 확인하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, RIP1을 포함한 단백질들은 방사선 조사에 의해 EGFR/NF-κB-RIP1-Src-STAT3-IL-1β 신호 전달 경로를 통하여 EMT를 유도하는 바, 활성화된 EMT는 암세포의 이동 및 전이 등의 내성을 증진시키는 요인이 됨을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명은 방사선 치료에 의해 유발되는 폐암의 전이 가능성을 RIP1 발현 정도로 진단이 가능하므로, RIP1를 진단 바이오 마커로 사용할 수 있는 가능성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 방사선 치료가 된 폐암의 전이 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 방법을 제공하며, 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 방사선 치료를 받은 폐암 환자시료로부터 RIP1 (Receptor-interacting protein 1) 발현량을 측정하는 단계;
(b) 정상대조군 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (a)의 발현량과 상기 단계 (b)의 발현량을 비교하는 단계.
본 발명에 따른 방사선 치료가 된 폐암의 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, (d) 상기 단계 (a)의 발현량이 상기 단계 (b)의 발현량 보다 동등 이상일 경우, 방사선 치료가 된 폐암의 전이능이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, "RIP1의 발현량"은 RIP1의 단백질 발현량 또는 RIP1의 mRNA 발현량을 의미한다.
상기 “환자시료”는 방사선 치료(방사선 조사)를 받은 환자로부터 유래한 시료를 말할 수 있다. 예를 들어, 폐암 전이 진단을 위하여 바이오 마커로서 RIP1의 과발현을 특정할 수 있는 시료를 말하며, 환자의 조직 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 정상 대조군에서의 RIP1의 발현량을 방사선 치료를 받은 폐암 환자 또는 증상이 경미한 방사선 치료를 받은 폐암 초기 환자에서의 RIP1의 발현량과 비교함으로써 방사선 치료에 의해 유도된 폐암 전이 의심 환자 또는 증상이 경미한 폐암 초기 환자의 실제 폐암의 타 부위로 전이 여부를 진단할 수 있다. 즉, 환자의 시료로부터 RIP1의 발현량을 측정하고, 정상인의 시료, 방사선 치료를 받지 않은 폐암 시료와 같은 RIP1 발현량이 정상 수치에 해당하는 시료로부터 RIP1의 발현량을 측정하여 양자를 비교한 후, 환자의 시료 내 RIP1의 발현량이 정상의 시료의 것보다 동등 이상으로 발현되면 폐암 전이를 예측할 수 있는 것이다.
본 발명에서 용어, "방사선 조사", “방사선 치료”, “IR 조사, 처리 및/또는 치료” 는 악성 세포의 DNA를 손상시키는 국소 치료 방법을 의미한다. 정상 세포는 종양 세포에 비해 이런 손상을 수선하는 능력이 더 크다. 방사선 조사는 이런 차이를 이용하는 치료를 의미하여, 통상적으로 의미하는 방사선을 이용하여 치료하는 방법을 포함한다. 방사선 조사는 치료 목적에 따라 근치(적)방사선치료, 보조적 방사선치료, 고식적 방사선치료로 나눌 수 있다. 방사선은 고에너지 방사선을 이용하여 암세포를 죽이는 치료법이나, 암세포뿐만 아니라 주위에 있는 정상 조직에도 영향을 미치므로, 치료에 따른 부작용이 발생하기도 한다. 이러한 부작용의 가장 큰 문제 중 하나로 암의 전이를 들 수 있다.
상기 RIP1 발현량 측정은 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 RIP1 발현량 측정은 웨스턴 블라팅, 항원-항체 반응, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 면역조직화학(immunohistochemistry), 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등을 이용하여 단백질의 발현을 측정하는 것일 수 있다. 상세하게는, 상기 단백질 양의 측정은 항원-항체 반응을 이용할 수 있고, 상기 항원-항체 반응에 의한 특정은 웨스턴 블라팅, 항원-항체 반응, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 면역조직화학(immunohistochemistry), 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩에 의한 특정인 것이 바람직하다.
상기 RIP1 발현량 측정은 또한 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등에 mRNA의 발현 수준의 측정일 수 있다.
유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a) 및 (b)의 발현량의 측정은 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
구체적으로, (a) 방사선 치료를 받은 폐암 환자시료로부터 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현량을 더 측정하는 단계;
(b) 정상대조군 시료로부터 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현량을 더 측정하는 단계; 및
(c) 상기 측정된 단계 (a)의 발현량과 상기 단계 (b)의 발현량을 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β을 모두 포함하여 이들의 발현량을 측정하는 것일 수 있다. 폐암 환자의 시료에서는 상기 언급된 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β 모두가 방사선 치료에 의해 발현이 정상 대조군보다 증가하는 결과를 나타낸다. 따라서, RIP1의 측정과 함께 위 언급한 인자들을 더 포함하여 측정함으로써 방사선 치료에 따른 폐암의 전이 가능성에 대해 보다 더 정확히 판단할 수 있다.
따라서, RIP1(Receptor-interacting protein 1)은 방사선에 의해 유발되는 폐암 전이를 진단하기 위한 진단용 바이오 마커로서 이용될 수 있다. 이에 추가적인 진단용 바이오 마커로 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, “바이오 마커”는 방사선에 의해 유도된 폐암 전이 진단의 예측을 목적으로 하는 분자 표지를 의미하는 것으로서, 개인에서 정상 또는 비정상적 진행의 표지(sign) 또는 개인에서 질병 또는 다른 상태의 표지이거나 그것을 나타내는 표적 분자를 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용된다. 더욱 상세하게는, 특정 생리학적 상태 또는 진행의 존재와 관련된 해부, 생리, 생화학 또는 분자학적 파라미터이다. 바이오 마커는 실험실 검정법 및 의료용 영상을 포함하는 다양한 방법에 의하여 검출가능하고, 측정이 가능하다.
상기 언급한 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 발현량 측정은 앞서 언급한 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하는 것일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 하나의 양태는, 본 발명은 RIP1(Receptor-interacting protein 1)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방사선에 의해 유발되는 폐암 전이를 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다. 바람직하게, 상기 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
상기 키트는 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
예를 들어, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다.
또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 방사선 치료가 된 폐암의 전이를 억제하는 방법을 제공하며, 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 방사선 치료를 받은 폐암 환자 시료로부터 RIP1 (Receptor-interacting protein 1) 발현량을 측정하는 단계;
(b) 정상대조군 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계;
(c) 상기 단계 (a)의 발현량과 상기 단계 (b)의 발현량을 비교하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (a)의 발현량이 높은 경우, 치료학적으로 유효량의 폐암 치료제 또는 전이 억제제를 투여하는 단계.
상기 치료제 투여 또는 전이 억제제를 투여하기 위한 대상체는 폐암으로 진단되고 이의 치료를 필요로 하는 사람 또는 비-사람 포유동물을 의미한다.
상기 치료학적 유효량은 (a) 증상 또는 징후의 중증도 또는 지속성에서의 감소; (b) 종양 성장 및 전이의 저해, 또는 종양 괴사, 종양 수축 및/또는 종양 소멸에서의 증가; (c) 종양 성장 및 발병에서의 지연; (d) 종양 전이의 저해; (e) 종양 성장 재발의 예방 등을 포함하는 것이다.
바람직하게는 상기 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β을 모두 포함하여 이들의 발현량을 측정하는 것일 수 있다. 폐암 환자의 시료에서는 상기 언급된 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β 모두가 방사선 치료에 의해 발현이 정상 대조군보다 증가하는 결과를 나타낸다. 따라서, RIP1의 측정과 함께 위 언급한 인자들을 더 포함하여 측정함으로써 방사선 치료에 따른 폐암의 전이 가능성에 대해 보다 더 정확히 판단할 수 있다.
이러한 폐암 치료제 또는 전이 억제제는 예를 들어, DNA 알킬화제(DNA alkylating agent)로 메칠로에타민(mechloethamine), 클로람부실(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 시크로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부술판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin); 항암 항생제(anti-cancer antibiotics)로 다티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토산트론 (mitoxantrone), 피리사마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin) 및 C 브레오마이신(C Bleomycin); 및 식물 알카로이드(plant alkaloid)로 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파크리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테산(topotecan) 및 이리도테산(iridotecan) 등을 예시할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 방사선 치료에 의한 폐암 전이를 진단하기 위한 정보 제공방법을 제공함으로써, 폐암 전이 발생 여부를 효율적으로 예측하여 폐암 환자의 생존률을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
또한, 방사선 치료에 의해 유도된 폐암 전이를 억제할 수 있는 특이적 치료제의 개발에 있어 특정 타겟으로 활용할 수 있어, 임상의에 의한 향후 치료의 효과적인 프로토콜을 계획 및 수행하는데 관한 정확한 기초 정보를 제공할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 폐암에 IR(Ionizing radiation) 처리에 의해 발생하는 암 전이의 신호 전달 체계를 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 IR 처리에 의한 폐암세포의 침윤성 및 전이성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 IR 처리에 의한 RIP1 발현 및 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 발생에 관한 신호전달을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 RIP1 발현 억제시(네크로스타틴 처리) IR 처리에 의한 암의 전이가 억제되는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 RIP1 발현 억제시(RIP1에 대한 siRNA 처리) IR 처리에 의한 암의 전이가 억제되는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6는 NF-κB 억제시 IR 처리에 의한 암의 전이가 억제되는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 NF-κB 억제시 IR 처리에 의한 암의 전이가 억제되고 IL-1β 등의 발현이 감소되는 것을 확인한 결과를 나타내는 것이다.
도 8은 IL-1Ra 처리에 따른 RIP1의 NF-κB 활성화 기작 및 세포 이동성에 대한 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 IR 유도 IL-1β 및 이의 수용체 IL-1ri/II의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 방사선(IR) 유도 폐암세포주 배양(A549 IR)
인간 A549 폐암 세포를 10% heat inactivated fetal bovine serum을 보충한 RPMI-1640 배지에서 배양하였으며, 5% CO 2 하에서 37℃로 유지시켰다.
폐암 세포(A549)(5 Х 10 5)를 60mm 디쉬에 시딩(seeding)하고 하룻밤 동안 배양하고, 137Cs 방사선원 (Atomic Energy of Canada, Ltd., Mississauga, ON, Canada)을 사용하여 IR 노출(10Gy) 시킴으로써, IR 처리된 폐암세포주(A549 IR(10Gy))들을 얻었다.
이하 실시예에서는 실시예 1에서 배양된 세포를 사용하여 실험을 수행하였다.
실시예 2: 방사선 유도 폐암 세포내에서의 RIP1 발현이 암세포의 이동 및 침윤에 미치는 영향 분석
실시예 1에서 얻어진 IR 처리된 폐암 세포(A549 IR)의 침윤 및 이동 분석을 실시하였으며, IR에 의해 발현되는 인자를 확인하는 실험을 수행하였다.
IR 처리에 따른 폐암 세포의 세포 침윤을 분석하기 위해 마트리겔 코팅된 트랜드웰(Matrigel coated transwells, Corning NY, USA)을 사용하였으며, 세포 이동을 분석하기 위해 콜라겐 코팅된 트랜스웰 (Collagen coated transwells, Corning NY, USA)을 사용하였다.
실시예 1에서 얻은 IR 처리된 폐암 세포주(A549 IR, 200ul)을 마트리겔 코팅된 트랜드웰 및 콜라겐 코팅된 트랜스웰에 의 배지에서 각각 1x10 4씩 상부 챔버에 시딩하고, 하부 챔버에서는 0.1% BSA(bovine serum albumin)이 보충된 무혈정 배지를 넣었다. 각각의 트랜스웰을 37℃에서 5% CO 2하에서 18시간 동안 배양 후, 딥 퀵 솔루션(deep quick solution) (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA)으로 세포 염색을 수행하여 침윤 및 세포 이동을 확인하였으며, 그 결과를 도 2A 및 2B에 나타내었다.
도 2A 및 2B에서 확인할 수 있는 바와 같이, IR 처리된 폐암세포주의 세포의 침투성 및 전이성이 증가한 것으로 확인되었다. 한편, 도 2C에서 확인할 수 있는 바와 같이 세포 생존률은 방사선을 처리하지 않은 폐암세포주(대조군)와 거의 유사한 수준인 것으로 확인되었다.
또한, IR 처리에 의한 RIP1의 발현 분석을 위해, 실시예 1에서 배양된 IR 처리 폐암세포주(A549 IR)들을 시딩하고, 24시간 후에 수확한 후 단백질을 추출하고, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9 및 β-action의 발현을 확인하여, 그 결과를 도 2D에 나타내었다.
도 2D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 폐암 세포주에 IR의 처리는 RIP1의 발현을 증가시켰으며, 비멘틴, MMP2, MMP9의 발현을 증가시켰다.
이에, 방사선 처리가 폐암 세포에서 RIP1의 발현을 증가시키고, 세포의 전이 및 침투능에 영향을 미치는 것을 확인하여 방사선 치료가 폐암의 전이에 영향을 줄 수 있음을 확인하고 관련 인자로 RIP1을 확인하였다.
실시예 3: 폐암 세포주 이용하여 방사선 처리에 따른 RIP1 발현 및 EMT 발현 분석
세포내에서의 RIP1과 EMT의 연관성을 규명하기 위해, 폐암세포주에서 RIP1과 EMT 관련 단백질의 발현 분석을 수행하였다.
A549 폐암세포주(대조군) 및 IR 처리된 A549 폐암세포주 각각을 60π 접시에 1Х10 6으로 시딩 후 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9, p-EGFR, EGFR, β-action, p-Src, Src, p-STAT3, STAT3의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 3A에 나타내었다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, 대조군과 대비하여 IR 처리한 폐암세포주의 경우 RIP1, 비멘틴, p-EGFR, p-STAT3의 발현이 강하게 나타났으며, p-Src, MMP2 및 MMP9의 경우에도 IR 조사 후 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, IR 처리에 의해 RIP1의 발현에 따라 EMT 관련 분자들의 발현이 변화하였고, 이는 RIP1과 EMT 관련 분자들은 상호 연관성을 가짐을 확인하였다. RIP1과 EMT 관련 분자들의 상호 연관성은 RIP1이 EMT 발생을 유도할 수 있음을 규명하였다.
실시예 4: IR에 의한 EGFR, Scr 및 STAT3 신호전달의 활성화 분석
EGFR, Scr 및 STAT3 신호전달 기작은 세포 이동성 신호전달 기작 중에서 중요한 신호전달 기작임을 상기 실시예에서 확인하였고, EGFR, Scr 및 STAT3 신호전달 기작을 확인하여, 이러한 EGFR, Scr 및 STAT3 신호전달이 IR에 의해 활성화 되는지를 확인하는 실험을 수행하였다.
폐암세포주 A549(대조군)과 IR 처리된 폐암세포주 A549(IR)을 마트리겔 코팅된 트랜드웰에 5Х10 4씩 상부 챔버에 넣고, EGFR, Scr 및 STAT3 억제제 각각으로 처리하였다. 그런 다음, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 침윤을 확인하였으며, 그 결과를 도 3C 및 3D에 나타내었다.
또한, 폐암세포주 A549(대조군)과 IR 처리된 폐암세포주 A549(IR)을 60π 접시에 1×10 6으로 시딩한 EGFR 억제제(EGFR inh), Src 억제제(Src inh) 및 STAT3 억제제(STAT3 inh)로 처리하고, 이들에 IR을 처리 후(IR-EGFR inh, IR-Src inh 및 IR-STAT3 inh), 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9, p-Src, Src, p-STAT3, STAT3, β-action의 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 3B(EGFR 억제제), 도 3C(Src 억제제) 및 도 3D(STAT3 억제제)에 나타내었다.
도 3C 및 3D에 나타낸 세포 침윤 및 전이 분석 결과를 살펴보면, IR 처리된 폐암세포주에 Scr 억제제 또는 STAT3 억제제 처리시 세포 침윤 및 세포 이동이 억제되는 것을 확인하였다.
또한, 도 3B, 3C 및 3D에 나타낸 바와 같이, IR이 처리된 EGFR 억제제, STAT3 억제제 및 Src 억제제 처리 시, RIP1 발현과 신호전달 기작에 대하여 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰하였다. 그 결과, EGFR 억제, STAT3 억제 및 Src 억제 시, RIP1 발현이 감소하였고, 각각 EGFR, Src, STAT3의 신호전달이 감소하는 것을 확인하였다.
이상의 결과로부터, IR 처리된 폐암세포주에서 발현되는 RIP1에 의해 EGFR의 인산화가 유도되며, EGFR 인산화에 의해 하위 분자인 Src-STAT3의 활성 화가 일어나며, EMT 유도에 의해 세포 이동성이 증가함을 규명하였다.
실시예 5: IR 처리된 폐암 세포주의 세포 이동성에 영향을 미치는 RIP1의 신호전달 기작 분석
RIP1 키나아제의 억제제인 네크로스타틴을 이용하여 이의 기능을 억제한 후, IR 처리된 폐암세포주의 EMT의 활성화 변화를 관찰하였다.
폐암세포주 A549(대조군)과 IR 처리된 폐암세포주 A549(IR)을 마트리겔 코팅된 트랜드웰에 5Х10 4씩 상부 챔버에 넣고, 네크로스타틴으로 처리하였다. 그런 다음, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 침윤을 확인하였으며, 그 결과를 도 4A 및 4B에 나타내었다.
도 4A 및 도 4B에 나타낸 바와 같이, RIP1의 키나아제 억제제인 네크로스타틴 처리 후, 침윤, 이동 분석을 수행하여 세포 침윤 및 세포 이동을 관찰하였고, 그 결과 네크로스타틴에 의해 IR 처리된 폐암 세포주에서 침윤 및 이동이 감소한 것을 확인하였다. 한편, 도 4C에서 확인할 수 있는 바와 같이 세포 생존률은 방사선을 처리하지 않은 폐암세포주(대조군)와 거의 유사한 수준인 것으로 확인되었다.
또한, 폐암세포주 A549(대조군)과 IR 처리된 폐암세포주 A549(IR)을 60π 접시에 1Х10 6으로 시딩한 후 네크로스타틴으로 처리하고, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9, p-EGFR, EGFR, β-action, p-Src, Src, p-STAT3, STAT3의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 4D, 4E 및 4F에 나타내었다.
또한, 도 4D 및 4E에 나타낸 바와 같이, RIP1의 키나아제 억제 시, RIP1 발현을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰한 바, 키나아제 효과 억제 시, RIP1의 발현 감소, 비멘틴, MMP2, MMP9, p-EGFR, p-Src, p-STAT3 활성이 감소한 것을 확인하였다.
또한, 상기 RIP1의 발현을 억제할 수 있는 상업 판매용 siRNA를 처리하여 위 실험과 동일 실험을 수행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5A 및 5B에서 확인할 수 있는 바와 같이, RIP1의 siRNA 처리는 세포의 침투능 및 전이능을 크게 감소시켰다. 또한, 도 5C 및 5D에서 확인할 수 있는 바와 같이, siRNA의 처리는 EMT 관련 인자의 발현 또한 감소시켰다.
상기 결과로부터, IR 처리된 폐암세포주에서, RIP1에 의한 EMT 활성에 의해 암세포 이동성 증가를 확인하였다. 또한, RIP1의 억제는 이러한 EMT 활성을 억제하고 세포의 침투능 및 전이능을 감소시킴으로써 폐암의 전이를 예방 및 치료할 수 있음을 보여주었다.
실시예 6: IR 처리된 폐암 세포주에서 RIP1의 NF-κB 활성화 기작 및 세포 이동성에 대한 영향
RIP1이 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated Bcells) 활성화 기작 및 세포 이동성에 영향을 주는지에 대한 실험을 수행하였다.
폐암세포주 A549(대조군)과 IR 처리된 폐암세포주 A549(IR)을 마트리겔 코팅된 트랜드웰에 5Х10 4씩 상부 챔버에 넣고, NF-κB 억제제로 처리하였다. 그런 다음, 하부 챔버에는 10% FBS 배지를 넣고, 24시간 후에 트랜스웰을 통과한 세포를 염색하여 세포 침윤을 확인하였으며, 그 결과를 도 6A 및 6B에 나타내었다.
도 6A 및 6B에 나타낸 바와 같이, NF-κB 억제제 처리에 의한 세포 침윤 및 세포 이동의 변화를 침윤 및 이동 분석을 수행하여 확인하였고, EMT 마커 발현을 웨스턴 블롯을 수행하여 관찰한 결과, IR 처리된 폐암 세포주에 NF-κB 억제제 처리 시 세포 침윤 및 세포 이동이 감소하였고 RIP1 발현이 감소하였음을 확인하였다. 한편, 도 6C에서 확인할 수 있는 바와 같이 세포 생존률은 방사선을 처리하지 않은 폐암세포주(대조군)와 거의 유사한 수준인 것으로 확인되었다.
또한, 폐암세포주 A549(대조군)과 IR 처리된 폐암세포주 A549(IR)을 60π 접시에 1Х10 6으로 시딩한 후 NF-κB 억제제로 처리하고, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 RIP1, 비멘틴, MMP2, MMP9, p-IκBα, p-P65, p50, p105의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 6D에 나타내었다. 도 6D에서 확인할 수 있는 바와 같이, NF-κB의 억제는 세포의 전이 및 침투성을 감소시키며, RIP1 및 관련 단백질의 발현 감소와 관련되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: IR 처리된 폐암 세포주에서 염증반응 활성화 및 NF-κb의 연관성 분석
RIP1는 키나아제의 기능만 있는 것이 아니라 염증반응에도 관련되어 있음이 알려져 있다. 최근 연구에 의하면, 염증반응은 암세포의 증식 및 전이에 연관되어 있다고 보고되고 있다. 본 발명에서는 IR 처리된 폐암세포주에서 염증 반응 활성화와 NF-κB의 관계를 확인하였다.
폐암세포주 A549(대조군)과 IR 처리된 폐암세포주 A549(IR)을 60π 접시에 1Х10 6으로 시딩한 후 NF-κB 억제제로 처리하고, 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 p-IκBα, p-P65, p105, IL-1β, β-action의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 7A에 나타내었다.
또한, 폐암세포주 A549(대조군)과 IR 처리된 폐암세포주 A549(IR)을 60π 접시에 1Х10 6으로 시딩한 후 24시간 후에 세포를 수확한 후에 단백질을 추출하고, 그런 다음, 웨스턴 블롯을 수행하여 IL-1β, β-action의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 7B에 나타내었다.
또한, 폐암세포주 A549(대조군)과 IR 처리된 폐암세포주 A549(IR)을 마트리겔 코팅된 트랜드웰에 5Х10 4씩 상부 챔버에 넣고, NF-κB 억제제 처리한 후(IR/ NF-κB inh), 이들의 활성화된 IL-1β 단백질의 항체를 이용하여 발현된 IL-1β의 정량적인 양을 분석하였으며, 그 결과를 도 7C에 나타내었다.
도 7A, 7B 및 7C에 나타낸 바와 같이, IR 처리에 의해 염증반응의 대표적 마커인 IL-1β(Interleukin 1β)이 증가함을 확인하였으며, NF-κB 억제제를 처리한 경우 IL-1β 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
이러한 결과에 따라, IR 처리에 의해 폐암세포주에서 염증반응 유전자 중 하나인 IL-1β의 발현을 증가시켰음을 확인하였다. 또한, 앞서 확인된 결과들로부터 IL-1β의 발현 증가는 RIP1에 의해 세포 이동성 및 염증반응 관련 유전자의 발현이 증가와 관련이 있음을 알 수 있다.
또한, IR 처리에 의한 RIP1의 증가는 IL-1β 발현과 이의 상위 단백질인 NF-κB 활성화를 촉진시켰으며, EMT 유도 및 암의 이동 및 침윤을 유도하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 8. IL-1Ra 처리에 따른 RIP1의 NF-κB 활성화 기작 및 세포 이동성에 대한 영향
IR 유도 IL-1β가 EMT 유도를 통해 암세포 이동과 침입을 촉진하는 것을 확인하였다.
구체적으로, IR에 의한 NF-kB 및 RIP1의 상향 조절이 암세포 이동과 침입을 촉진한다는 것을 감안하여 IL-1β의 IR 유발 상향 조절이 IR에 의한 암세포 이동에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하였다.
IR 조사 조건에서 IL-Ra (IL-1β의 길항제)를 처리하거나 처리하지 않은 샘플의 면역 블롯 분석을 수행하여, 그 결과를 도 8의 a에 나타내었다.
도 8의 a에서 확인할 수 있는 바와 같이, IR이 vimentin 및 MMP-2/9 발현의 증가와 함께 E-cadherin의 감소를 나타내었다. 그러나, IL-Ra의 처리는 RIP의 하부 기전에서 이러한 작용을 억제함으로써 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
또한, 도 8의 b에서 확인할 수 있는 바와 같이, IR 처리는 A549 세포의 이동/침습을 2 배 이상 증가 시켰는데, IL-Ra에 의해 이러한 작용이 거의 완전히 차단되었다. 이러한 결과는 IL-1β가 IR 유도 이동/침습과 관련된 중요한 새로운 구성 요소임을 보여준다.
실시예 9. In vivo, In vitro 상 IR 유도 IL-1β 및 이의 수용체 IL-1ri/II의 발현
IR이 IL-1RI/II의 발현 수준의 변화를 주는지 여부를 확인하였다.
도 9의 A 및 B에서 확인할 수 있는 바와 같이, 10 Gy IR의 처리는 in vitro 및 in vivo에서 IL-1RI/II를 유도하였다. 구체적으로, In vitro에서 세포 용해물을 사용한 면역 블롯팅 분석은 IR 처리가 IL-1RI 및 II 모두의 수준을 증가 시킴을 보여주었다.
또한, 생체 내에서 IL-1RI/II의 유도를 평가하기 위해 A549 세포를 누드 마우스에 피하 주사하고 이종 이식으로 발전시킨 다음 IR (10 Gy)에 노출 시킨 후 마우스를 48 시간 후에 희생하고, 이종 이식 조직은 면역 조직 화학 (IHC) 분석을 위해 수집한 결과, IHC 데이터는 IR 처리된 이종 이식 조직에서 IL-1β와 그 수용체 IL-1RI/II의 발현 수준이 상향 조절되었음을 보여주었다. 상기 결과를 스코어링 한 것을 도 9의 C에 나타내었다. IHC 결과의 정량적 분석은 IR 처리되지 않은 이종 이식 조직에 비해 IR 처리된 조직에서 IL-1β 및 IL-1RI/II가 2 배 이상 상향 조절되었음을 보여주었다.
이러한 결과는 도 9의 D에 나타낸 바와 같이, IR이 NF-kβ-RIP1-IL-1β-IL1RI/II-EMT의 새로운 신호 전달 경로를 활성화하여 암세포 이동과 침입을 유도 할 수 있음을 보여준다.
상기 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에서는 방사선 치료에 의해 폐암의 전이가 증가하는데 이러한 전이 증가에는 RIP1과 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β의 신호 전달 체계가 관여하는 것을 확인하였다. 또한, 방사선 치료시 RIP1이 억제되는 경우 암의 전이 및 침투능을 억제함으로써 방사선 치료에 의한 부작용을 해소하는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. (a) 방사선 치료를 받은 폐암 환자시료로부터 RIP1 (Receptor-interacting protein 1) 발현량을 측정하는 단계;
    (b) 정상대조군 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (a)의 발현량과 상기 단계 (b)의 발현량을 비교하는 단계; 를 포함하는 방사선 치료가 된 폐암의 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (d) 상기 단계 (a)의 발현량이 상기 단계 (b)의 발현량 보다 동등 이상일 경우, 방사선 치료가 된 폐암의 전이능이 높은 것으로 판단하는 단계;를 더 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 RIP1 발현량 측정은 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하고;
    상기 (b) 단계에서 정상대조군 시료로부터 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계;를 더 포함하고,
    상기 (c) 단계에서, 상기 (a) 및 (b)에서 측정된 (a)의 발현량과 상기 단계 (b)의 발현량을 비교하는 단계;를 더 포함하는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 단계 (a) 및 (b)의 발현량의 측정은 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β을 모두 측정하는 것인, 방법.
  6. RIP1의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방사선에 의해 유발되는 폐암 전이 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 키트는 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것인, 키트.
  8. 방사선 치료가 된 폐암의 전이를 억제하는 방법:
    (a) 방사선 치료를 받은 폐암 환자 시료로부터 RIP1 (Receptor-interacting protein 1) 발현량을 측정하는 단계;
    (b) 정상대조군 시료로부터 RIP1 발현량을 측정하는 단계;
    (c) 상기 단계 (a)의 발현량과 상기 단계 (b)의 발현량을 비교하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (a)의 발현량이 높은 경우, 치료학적으로 유효량의 폐암 치료제 또는 전이 억제제를 투여하는 단계.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하고;
    상기 (b) 단계에서 정상대조군 시료로부터 EGFR, NF-κB, STAT-3, Src, IL-1RⅠ, IL-1RⅡ 및 IL-1β로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계;를 더 포함하고,
    상기 (c) 단계에서, 상기 (a) 및 (b)에서 측정된 (a)의 발현량과 상기 단계 (b)의 발현량을 비교하는 단계;를 더 포함하는 것인, 방법.
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