WO2021162392A1 - 아토피 피부염 동물 모델인 아바타마우스의 제조 방법 및 그의 용도 - Google Patents

아토피 피부염 동물 모델인 아바타마우스의 제조 방법 및 그의 용도 Download PDF

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mice
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박창욱
김혜리
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an avatar mouse, which is an animal model of atopic dermatitis, and a screening method for a therapeutic agent for atopic dermatitis using the same.
  • Atopic dermatitis is a long-lasting chronic dermatitis that causes itchy eczema lesions on the skin, and is common in people with a history or family history of atopic disease.
  • Atopic dermatitis can be seen as a characteristic of atopic dermatitis that when symptoms appear, the area is scratched or rubbed, and as a result, the skin symptoms worsen.
  • Atopic dermatitis patients are increasing worldwide, and until the 1970s, it was reported that about 3% of children under the age of 6 suffered from atopic dermatitis, but recently, it is estimated that 20% of children and 1 to 3% of adults also have atopic dermatitis.
  • the prevalence rate surveyed by Seoul Metropolitan Government in 2008 was reported to be 19.1% in the questionnaire and 9.2% in the actual examination by a doctor.
  • atopic dermatitis is caused by a combination of factors such as the patient's genetic predisposition and environmental factors, the patient's immunological abnormality and abnormality of the skin barrier function, which acts as a skin barrier.
  • Atopic dermatitis causes unbearable itching, which can lead to insomnia, emotional disorders, learning disabilities, a decrease in the ability to adapt to the environment, and a decrease in social activity.
  • severe itching and eczema may accompany, and it may be mistaken for not keeping the skin clean or suffering from an infectious skin disease, which may interfere with interpersonal relationships.
  • Prevention and treatment of atopic dermatitis are essential as much as there is.
  • Atopic dermatitis is a chronic disease that improves during treatment and recurs when treatment is stopped, and since each patient has slightly different triggers or exacerbation factors, it is most important to select an appropriate treatment method for each patient.
  • atopic dermatitis is a chronic allergic inflammatory disease that occurs on the skin.
  • the present inventors have invented a mouse model representing the immune response of an actual atopic dermatitis patient for screening such atopic dermatitis preventive, therapeutic or cosmetic composition, which can reflect the specific immune response as a whole. It is expected that customized treatment for
  • An object of the present invention is to provide an avatar mouse that implements a specific immune response in atopic dermatitis patients caused by house dust mites.
  • the present invention provides a method for producing the avatar mouse capable of confirming a house dust mite-specific immune response.
  • the present invention provides a screening method for a therapeutic, preventive or cosmetic composition for atopic dermatitis using the avatar mouse capable of confirming a house dust mite-specific immune response.
  • an avatar mouse which is an animal model of atopic dermatitis in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from atopic dermatitis patients are injected into immunodeficient mice.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • peripheral blood mononuclear cells may be used interchangeably with PBMC.
  • "avata mouse” refers to a patient-specific animal model, and more specifically, a patient-specific xenograft animal model prepared by stereotactically xenografting patient-derived cells or tissues into an immunodeficient animal. In other words, it is possible to provide conditions that reflect the genetic, physiological and environmental characteristics of a patient with a specific disease as it is.
  • immunodeficiency animal refers to an animal model manufactured by artificially damaging some components constituting the immune system at the genetic level so that a specific disease can develop, so that a normal immune system is not implemented.
  • An animal having a nervous system may be used as the immunodeficient animal, preferably an immunodeficient mammal may be used, and more preferably, immunodeficient mice, rats, hamsters, beavers, guinea pigs, nutria, etc. engineered to be immunodeficient.
  • rodents most preferably nude mice, NOD scid gamma (NSG) mice, non-obese diabetic (NOD) mice, Severe combined immunodeficiency (SCID) mice, NOD-SCID mice, NOG (NOD/SCID Il2rg - /- ) may be a mouse, but is not limited thereto.
  • immunodeficiency mouse refers to a nude mouse, a NOD scid gamma (NSG) mouse, a non-obese diabetic (NOD) mouse, a severe combined immunodeficiency (SCID) mouse, a NOD-SCID mouse, and a NOG (NOD) mouse.
  • NSG NOD scid gamma
  • SCID severe combined immunodeficiency
  • NOD-SCID mouse NOG mouse
  • NOG NOG mouse
  • SCID mice Severe combined immunodeficiency mice were reported by Bosma in the 1980s, and since these mice do not have a rejection response to accept human cells due to functional defects of B cells and T cells, various immune diseases including cancer, organ transplantation or infection, etc. widely used in the field.
  • NOD mice are mice deficient in innate immunity
  • SCID mice are mice deficient in acquired immunity
  • a mouse model derived therefrom is NOD-SCID mice.
  • the mouse is a functional characteristic (phenotype) of the NOD mouse, the decrease in the activity of NK cells (Natural killer cell), the secretion dysfunction of monocytes to cytokines, the complement 5 component (Complement5, C5) It shows a lack of activity, etc., and also shows the lack of functions of B cells and T cells, which are functional characteristics (phenotypes) of SCID mice.
  • NSG mice refer to immunodeficient mice that lack mature T cells, B cells and natural killer cells (NK cells).
  • mice developed and sold by Jackson Laboratory artificially regulated the cytokine pathway, and in order to further reduce mouse immunity, a new mouse obtained as a result of crossing a NOD-SCID mouse and an Il2rg null mouse (Il2rg removed mouse) am.
  • the mouse has been used in many recent studies because it enables sophisticated modeling of many areas of biology and disease.
  • the immunodeficient mice in the present invention are nude mice, NSG (NOD scid gamma) mouse, NOD (non-obese diabetic) mice, SCID (Severe combined immunodeficiency) mice, NOD-SCID mice, NOG (NOD / SCID Il2rg - / - ) may be any one selected from the group consisting of mice, and more preferably may be NSG mice. However, as long as it corresponds to one type of mouse lacking immune function, such as the mice listed above, the present invention is not limited thereto and may include all of them.
  • a disease to be prevented or treated in the present invention may be an atopic disease, specifically atopic dermatitis. More preferably, it refers to atopic dermatitis caused or likely to be caused by house dust mite (dermatophagoides farinae), but is not limited thereto.
  • the animal model mouse of the present invention is characterized by reflecting the specific immune response of atopic dermatitis, more specifically, atopic dermatitis patients sensitized by house dust mites.
  • atopic dermatitis is a chronic allergic inflammatory disease that occurs in the skin. say the reaction If a family member has other allergic diseases such as asthma or allergic rhinitis, atopic dermatitis is more likely to occur, and it can be caused by allergens such as food or house dust mites. In addition, sudden changes in indoor temperature and humidity, sweat or saliva, tight or rough clothes, rubbing or scratching the skin, stress, bacterial infection, etc. are known to exacerbate atopic dermatitis.
  • the causative agent or exacerbating factor of atopic dermatitis can be determined using a skin test or blood test, and since the treatment drug or method is applied differently depending on the cause and aggravating factor, the development of a therapeutic agent according to the cause is essential.
  • Atopic dermatitis has the characteristics of an allergic disease and an inflammatory disease at the same time, and the allergy and inflammation correspond to completely different indications. not used for the treatment of
  • the allergic reaction is an allergy-causing allergen (foreign antigen) that enters our body and activates antigen-specific Th2 cells, and B cells produce IgE antibodies by cytokines secreted by the activated Th2 cells.
  • allergen foreign antigen
  • B cells produce IgE antibodies by cytokines secreted by the activated Th2 cells.
  • the secreted IgE antibody binds to mast cells and sensitization of mast cells is induced.
  • the mast cells are activated, they secrete various chemical allergen mediators such as histamine and inflammatory cytokines, and allergic symptoms begin to appear.
  • eosinophilic allergy When eosinophil infiltration is induced and promoted in , eosinophilic hypersensitivity is induced and eosinophilic inflammation occurs, which is called eosinophilic allergy. do. Therefore, in order to exhibit an anti-allergic effect, it is possible to suppress the enhanced Th2 immune response in allergic diseases, suppress the production of IgE antibodies in B cells, or suppress the action of chemical allergen mediators such as histamine. can cope
  • the inflammatory response refers to an external symptom exhibited through an immune response caused by the immune system, that is, an innate immune cell recognizing an external antigen or an internal antigen, as an inflammatory response.
  • the inflammatory response that appears in the initial immune response by recognizing the external and internal antigens corresponds to an acute inflammatory response, and if the immune response continues to occur due to the constant presence of the antigen, it corresponds to a chronic inflammatory response.
  • anti-inflammatory drugs by suppressing the inflammatory response, it suppresses the acute inflammatory response as well as the chronic inflammatory response, and also suppresses the immune response to improve the anti-military force against the infection, thereby increasing the risk of contracting an infection.
  • the immune response of improving anti-military strength is enhanced, but on the other hand, the inflammatory response is also enhanced, thereby exacerbating the chronic inflammatory response.
  • non-steroidal anti-inflammatory drugs are not mentioned anywhere, it means that non-steroidal anti-inflammatory drugs are not used for the treatment of atopic dermatitis. This is because atopic dermatitis is not a simple inflammatory reaction, but an immune disease caused by immune hypersensitivity. Since most symptoms of atopic dermatitis appear on the skin, it can be misunderstood as a simple skin disease, but atopic dermatitis is a disease to which complex immune mechanisms are applied, such as abnormalities in the skin barrier as well as abnormalities in the overactive immune system (J Interferon Cytokine Res) 2002 Apr;22(4):407-12.).
  • the present invention relates to a humanized animal model of atopic dermatitis in which house dust mite acts as a trigger among atopic dermatitis.
  • the "house dust mite (HDM)" is a type of mite belonging to the family House dust mite of the order Scabies mite. In the West, it is called House dust mite.
  • the dust mite's body is so small that it is barely visible when placed on a black background, usually about 0.4 mm long and 0.3 mm wide.
  • the body consists of cuticles and, like most ticks, has eight legs. Allergens (allergens) produced by house dust mites are the most common cause of asthma, but also one of the causes of atopic dermatitis.
  • atopic dermatitis caused by house dust mites there are preventive methods such as maintaining indoor humidity at 40 to 50% and not using carpets, bed mattresses, cloth sofas, curtains, etc., which are habitats of mites.
  • preventive methods such as maintaining indoor humidity at 40 to 50% and not using carpets, bed mattresses, cloth sofas, curtains, etc., which are habitats of mites.
  • a mouse model that reflects such an immune response is essential in order to provide a suitable treatment for atopic dermatitis patients that cause a specific immune response to the house dust mite antigen. If the mouse model as described above is used, it will be possible to contribute to discovering a preventive, therapeutic, or cosmetic composition for atopic dermatitis caused by house dust mites.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • T cells lymphocytes
  • B cells lymphocytes
  • monocytes among white blood cells contained in human peripheral blood.
  • Peripheral blood cells with a nucleus can be extracted and cultured in vitro, which can be used in immunology, transplantation immunology, hematology, biology, such as high-throughput screening for drug discovery, vaccine development for malignant tumors and infectious diseases, etc. It is often used in research in the field of chemistry.
  • human blood should be separated within 12 to 24 hours because if PBMC separation is not performed within 12 to 24 hours after collection, cells die. The disadvantage is that this is not easy.
  • PBMC can be used to separate and inject CD3+ T cells, CD3-depleted PBMCs, CD14+ monocytes (CD14+ monocyte cells) and dendritic cells into immunodeficient mice.
  • the PBMCs injected into the avatar mouse are separated into CD3+ T cells, CD3 depleted PBMCs, CD14+ monocytes cells (CD14+ monocyte cells) or dendritic cells, respectively. It can be injected by other routes.
  • the "injection” refers to parenteral administration excluding oral administration, and includes subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intracerebral injection, Injection into the Sublingual Vein, Injection into the Sublingual Vein, Injection into the Penile Vein, Injection into the Caudal Vein, and Injection into the hindpaw Dorsal Metatarsal Vein) injection or infusion techniques.
  • CD3+ T cells can be made through intravenous injection (intravenous injection), CD3+ T cells depleted PBMC (CD3 depleted PBMC), CD14+ monocyte cells (CD14+ monocyte cells) or dendritic cells can be achieved through intradermal injection.
  • the injected PBMC may vary depending on various factors including activity, body weight, administration time, administration route, and excretion rate, and the injection amount may vary depending on the mouse's condition, body weight, disease level, drug form, administration route and period. It may be appropriately selected by those skilled in the art, although it depends on it, and the administration may be administered at one time or divided into several administrations. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • cell surface markers eg, human CD3, human CD45, human CD4, and human CD8
  • flow cytometry eg, mouse CD45
  • the flow cytometry may be analyzed or evaluated according to methods well known in the art.
  • detecting binding to a target analyte present in a blood sample can be accomplished by any of a variety of methods known in the art, examples of which include the target analyte or binding. It may include the step of detecting a detectable label attached directly or indirectly to the substance.
  • detectable label means a substance capable of generating a signal indicative of the presence of a detectable label by any suitable method, examples of which include spectroscopic, optical, photochemical, biochemical, enzymatic , electrochemical and/or immunochemical methods.
  • detectable labels can illustratively include fluorescent moieties, chemiluminescent moieties, bioluminescent moieties, electron density particles, magnetic particles, enzymes, substrates, radioactive isotopes, and chromophores.
  • the identity of a particular detectable label or labels depends on the detection process used.
  • the detection process may be, for example, enzyme immunoassay (ELISA), Western blot, immunoprecipitation, immunohistochemistry, immuno-fluorescence assay, liquid chromatography ( liquid chromatography), flow cytometry, other art-known detection methods, or combinations thereof.
  • human CD3, human CD45, human CD4, or human CD8 when positive for human CD3, human CD45, human CD4, or human CD8, it is interpreted as a humanized indicator, and when mouse CD45 is positive, it can be interpreted as a non-humanized indicator.
  • mouse CD45 when it is an antibody that can be used as an indicator for flow cytometry analysis, it is not limited thereto, and all antibodies may be included as long as they are commonly used in the art.
  • an avatar mouse that implements an immune response specific to the house dust mite of the present invention can be selected and used for drug or cosmetic screening.
  • obtaining a blood sample isolated from atopic dermatitis patient (b) obtaining PBMCs from the blood sample; and (c) injecting the PBMCs obtained above into immunodeficient NSG mice.
  • the manufacturing method of the present invention may further include isolating and injecting PBMCs from a blood sample of a patient with atopic dermatitis more preferably sensitized to a tick.
  • the preparation method of the present invention may further include obtaining a blood sample isolated from atopic dermatitis patient having a house dust mite-specific immune response.
  • the preparation method of the present invention may further include isolating CD3+ T cells, CD3+ T-cell-depleted PBMCs (CD3 depleted PBMCs), CD14+ monocytes (CD14+ monocyte cells) or dendritic cells from PBMCs. have.
  • CD3+ T cells are administered through intravenous injection, and CD3+ T cell-depleted PBMCs, CD14+ monocytes and dendritic cells are intradermally injected. It may further include the step of injecting through.
  • a screening method of a cosmetic composition for preventing, treating or improving atopic dermatitis using the avatar mouse prepared by the above method is provided.
  • the "screening" is one of numerous procedures to be passed during the process of developing a new drug, and more specifically, through screening of compounds selected from basic research, active substances and lead substances are discovered and candidate substances are confirmed says the procedure This can reduce the time and cost required to develop a new drug, and after a target disease is selected, an active new drug substance that targets it can be discovered. For example, as long as the symptoms of a skin disease, more specifically, atopic dermatitis disease, are improved or beneficially changed when a new drug as well as a preventive agent or cosmetic composition is investigated, it may be included without limitation.
  • “tailored medicine” is also referred to as order-made medicine or personalized medicine, and by individually examining the constitution or environment of each patient, a treatment suitable for this means a method of determining or a method of treatment.
  • the "preventive agent” is a candidate material screened using the avatar mouse of the present invention, and any agent that blocks the symptoms of atopic dermatitis caused by house dust mites or inhibits or delays dermatitis may include without limitation.
  • the "therapeutic agent” is a candidate material screened using the avatar mouse of the present invention, and may include, without limitation, any agent that improves or benefits a skin disease, more specifically, atopic dermatitis disease. More preferably, the atopic dermatitis disease caused by house dust mites may be improved.
  • the "cosmetic composition” is a candidate material screened using the avatar of the present invention, and may include any agent that improves the symptoms of atopic dermatitis without limitation.
  • the composition of the present invention may further include a solvent or a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the preparation of cosmetic compositions.
  • the type of solvent that can be further added to the cosmetic composition is not particularly limited, but, for example, water, saline, DMSO, or a combination thereof may be used.
  • the carrier excipient or diluent, purified water, oil, wax, fatty acid, fatty alcohol, fatty acid ester, surfactant, humectant, thickener, antioxidant, viscosity stabilizer, chelating agent, buffer, lower alcohol, etc. included, but not limited to.
  • it may include a whitening agent, a moisturizer, a vitamin, a sunscreen, a perfume, a dye, an antibiotic, an antibacterial agent, an antifungal agent.
  • oil hydrogenated vegetable oil, castor oil, cottonseed oil, olive oil, palm seed oil, jojoba oil, and avocado oil
  • wax beeswax, spermaceti, carnauba, candelilla, montan, ceresin, Liquid paraffin, lanolin can be used.
  • fatty acid stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, and oleic acid
  • fatty acid alcohol cetyl alcohol, octyl dodecanol, oleyl alcohol, panthenol, lanolin alcohol, stearyl alcohol, hexadecane All may be used, and as the fatty acid ester, isopropyl myristate, isopropyl palmitate, and butyl stearate may be used.
  • surfactant cationic surfactants, anionic surfactants and nonionic surfactants known in the art can be used, and surfactants derived from natural products are preferred as far as possible.
  • it may include a desiccant, a thickener, an antioxidant, etc. widely known in the cosmetic field, and the types and amounts thereof are as known in the art.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells isolated from atopic dermatitis subject into CD3+ T cells; and (b) injecting the CD3+ T cells into immunodeficient mice.
  • the immunodeficient mouse is a nude mouse, a NOD scid gamma (NSG) mouse, a non-obese diabetic (NOD) mouse, a severe combined immunodeficiency (SCID) mouse, a NOD-SCID mouse, and a NOG (NOD) mouse.
  • /SCID Il2rg -/- Provides a method for producing atopic dermatitis avatar mouse, which is any one selected from the group consisting of mice, wherein the injection in step (b) is an intravenous injection (intravenous injection).
  • step (a) CD3 T cells are depleted from the peripheral blood mononuclear cells (PBMC), CD3 depleted PBMCs, CD14+ mononuclear cells (CD14+)
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CD3 depleted PBMCs CD14+ mononuclear cells
  • CD14+ CD14+ mononuclear cells
  • It provides a method for producing atopic dermatitis avatar mouse further comprising injecting or injecting CD14+ monocyte cells (CD14+ monocyte cells) and dendritic cells, and peripheral blood mononuclear cells in which the CD3+ T cells are depleted injection of; Or, the injection of CD14+ monocyte cells (CD14+ monocyte cells) and dendritic cells provides a method for producing atopic dermatitis avatar mice, characterized in that intradermal injection.
  • an atopic dermatitis avatar mouse prepared by the above method.
  • atopic dermatitis is a screening method characterized in that atopic dermatitis induced by house dust mites, and the candidate substance is a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis.
  • the candidate substance provides a screening method that is a cosmetic composition for preventing or improving atopic dermatitis, wherein the cosmetic composition is a lotion, nourishing lotion, nourishing essence, massage cream, cosmetic bath water additive, body lotion, body milk, bath oil, baby Oil, baby powder, shower gel, shower cream, sunscreen lotion, sunscreen cream, suntan cream, skin lotion, skin cream, sunscreen cosmetics, cleansing milk, depilatory makeup, face and body lotion, face and body cream, Skin whitening cream, hand lotion, hair lotion, cosmetic cream, jasmine oil, bath soap, water soap, beauty soap, shampoo, hand sanitizer (hand cleaner), medical soap, medical use, cream soap, facial wash, whole body cleaner, scalp cleaner , hair rinse, cosmetic soap, tooth whitening gel, and provides a screening method that is any one selected from the group consisting of toothpaste.
  • the cosmetic composition is a lotion, nourishing lotion, nourishing essence, massage cream, cosmetic bath water additive, body lotion, body milk, bath oil, baby Oil, baby powder, shower gel, shower cream, sunscreen lotion, sunscreen
  • the present invention is an atopic dermatitis avatar mouse embodying the immune status of atopic dermatitis patients in NGS mice, a method for manufacturing an avatar mouse, an atopic dermatitis animal model that reflects a specific immune response caused by house dust mites, and a screening method for atopic dermatitis treatment using the same is about Since the present invention represents the actual immune response of atopic dermatitis patients, when the present invention is used, it is possible to effectively identify a patient-specific immune response, and thus it can be widely used in the development of a customized preventive or therapeutic agent according to the cause of atopic dermatitis.
  • FIGS. 1A to 1E are diagrams confirming the engraftment rate of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in avatar mice.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • 2A to 2D are results of confirming human T cells in the skin lymph nodes, spleen, and skin lesion tissues of avatar mice through flow cytometry.
  • 3A to 3C show the results of confirming human T cells and dendritic cells in the lymph nodes and skin lesion tissues of human PBMCs and avatar mice through flow cytometry.
  • peripheral blood mononuclear cells isolated from atopic dermatitis subjects are CD3+ T cells, CD3+ T cells-depleted peripheral blood mononuclear cells (CD3 depleted PBMC), CD14+ Separating into monocytes (CD14+ monocyte cells) or dendritic cells; and (b) injecting the cells into immunodeficient mice.
  • atopic dermatitis avatar mouse prepared by the above method; (b) a candidate for treating or improving atopic dermatitis in the first subject processing the material; And (c) when atopic dermatitis is alleviated in the first individual compared to the second individual, determining the candidate substance as a substance for treating or improving atopic dermatitis; for treatment or improvement of atopic dermatitis comprising a It relates to a method for screening a substance.
  • Example 1 Recruitment of atopic dermatitis patient group and preparation of immunodeficient NSG mice
  • the inventors of the present invention performed all experiments with the approval of the Institutional Review Board (IRB), Yonsei University College of Medicine, and a blood sample of atopic dermatitis patient sensitized to house dust mite (Dermatophagoides farina; house dust mite; HDM). was obtained.
  • immunodeficient NSG mice were purchased from JAX Corporation in the United States, and 6 6-week-old females were used for the experiment. The mice were stabilized for 1 week at a temperature of 23 ⁇ 2° C., a humidity of 55 ⁇ 5% in a laboratory animal room, and 12 hours/12 hours (dark/light cycle).
  • Example 2 Isolation of PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) from atopic dermatitis patients
  • PBMC human PBMC
  • GE Healthcare's Ficoll-Paque reagent was used to obtain human PBMC.
  • the Ficoll-Paque reagent and the blood sample obtained in Example 1 were put into a 15ml tube at a ratio of 1:1 not to be mixed, placed in a centrifuge, and separated at 2500 rpm and RT for 15 minutes. Red blood cells are collected in the bottom layer, and are separated into a buffy coat layer and a plasma layer thereon, and the plasma layer is discarded and the buffy coat layer is taken to obtain PBMC.
  • PBMCs taken above were transferred to a new tube, EDTA solution was added at a ratio of 1:1, and then placed in a centrifuge and centrifuged at 1500 rpm and RT for 10 minutes. After that, the supernatant was discarded and the remaining pellets, PBMCs, were finally obtained, and CD3+ T cells were isolated to use pathogen-induced cells causing atopic dermatitis from the PBMCs.
  • CD14+ cells were isolated from CD3-depleted PBMCs to isolate antigen presenting cells.
  • CD14+ monocytes and dendritic cells were tested according to the experimental method of the above kit using Miltenyi Biotec's CD14 MicroBeads, human kit, or Pan DC Enrichment kit. to obtain CD14+ monocytes or dendritic cells.
  • a more specific experimental method is as follows.
  • CD3-depleted PBMCs were centrifuged at 300 xg for 10 minutes, then added with MACS buffer 350 ⁇ l/10 8 cells, mixed well, and FcR Blocking Reagent 50 ⁇ l/10 8 cells. Then, 100 ⁇ l/10 8 cells of Pan DC Biotin-Antibody Cocktail were added and incubated for 5 minutes at room temperature. After that, 400 ⁇ l/10 8 cells of MACS buffer were added, and 100 ⁇ l/10 8 cells of Pan DC MicoBead-Antibody Cocktail were added and incubated at room temperature for 5 minutes again.
  • Example 3 Preparation of avatar mice implanted with huPBMC through intravenous injection and intradermal injection
  • Human PBMC cells obtained by the method of Example 2 from the blood of atopic dermatitis patients were injected into immunodeficient NSG mice through two different routes of administration.
  • 2X10 6 cells/20 ⁇ g of CD3+ T cells which are pathogenic cells, were injected through intravenous injection.
  • CD3 T cells not only CD3 T cells but also whole PBMCs can be used.
  • CD3-depleted PBMCs were injected into the back via intradermal injection into 3X10 6 cells/30 ⁇ g or CD14+ cells 3X10 6 cells/30 ⁇ g and dendritic cells.
  • 3X10 6 cells/30 ⁇ g were injected.
  • Avatar mice were prepared by injecting PBMCs of atopic dermatitis patients sensitized with house dust mites (HDM) into the immunodeficient NSG mice, which represent atopic dermatitis patient-specific immune responses using house dust mites, a major allergen of atopic dermatitis. It would be meaningful that it is a mouse model.
  • HDM house dust mites
  • the house dust mite ointment used is an atopic dermatitis challenging ointment from Biostir (Osaka, Japan) that contains a natural mite-derived ingredient (Dermatophagoides farina).
  • the ointment can be applied to induce house dust mite-specific allergic rhinitis, allergic asthma, or atopic dermatitis, and was used in the present invention to induce atopic dermatitis.
  • Example 4 Confirmation of human PBMC engraftment rate and humanized mice by flow cytometry
  • T cells were isolated from immune cells of the mouse animal model through orbital blood sampling, and the cells were aliquoted at 2.0 x 10 6 cells/tube in a FACS tube, and washed twice with 1 mL of FACS buffer at 4 °C at 100 rpm for 3 minutes. .
  • human CD45 was positive and mouse CD45 was negative over 1 to 4 weeks, and both human CD45 and human CD3 were confirmed to be positive.
  • the process of changing the engraftment rate of human PBMC cells over time was confirmed by comparing and confirming the correlation between human CD45 and human CD3 and between human CD45 and mouse CD45 as human T cell markers from the mouse cells.
  • FIGS. 1D and 1E are graphs showing the number of human CD3 and CD45 positive cells through flow cytometry over 4 weeks to confirm the engraftment rate of human PBMCs by week in the blood of avatar mice.
  • more human T cells could be identified in avatar mice that induced an inflammatory response using house dust mites compared to avatar mice that were not treated with HDM.
  • the increase in engraftment efficiency was confirmed by confirming that it increased significantly.
  • FIGS. 1D and 1E the results of confirming human T cells in the spleen, lymph nodes, and skin lesions of avatar mice treated with house dust mites and untreated avatar mice are shown in FIGS. 1D and 1E . It can be seen that this also shows the same result as the result confirmed in blood.
  • FIGS. 2A to 2D show the results in FIGS. 2A to 2D .
  • Human CD45, CD3, CD4, and CD8 were found to be positive in lymph nodes, and it was confirmed that the same trend was observed in spleen and skin lesions. As described above, it was confirmed that the human marker was positive in all tissues and the mouse CD45 as a mouse marker was negative.
  • cell; APC is shown in Figures 3a to 3c. At this time, the non-lymphocytes (non-lymphocytes) portion corresponds to the figure positioned above, and the lymphocytes (lymphocytes) portion corresponds to the figure positioned below.
  • lymphocytes and non-lymphocytes were identified in lymphocytes, and APC cells were identified in non-lymphocytes.
  • lymph nodes and skin lesions of avatar mice the same cell expression as in human PBMC was confirmed as a result of analysis (lymphocytes and non-lymphocytes) by dividing into two populations. , confirmed that a successful patient-specific atopic dermatitis animal model, i.e., a humanized avatar mouse representing the patient's immune response, was prepared. Only mice in which these characteristics are confirmed can be selected and used for screening.
  • the present invention relates to an atopic dermatitis animal model in which human T cells representing a specific immune response due to house dust mites in atopic dermatitis patients are inherent. It can be widely used in the development of customized preventive or therapeutic agents for atopic dermatitis.

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Abstract

본 발명은 아토피 피부염 동물 모델인 아바타마우스의 제조 방법 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 실제 아토피 피부염 환자의 면역 반응을 대변함으로써 보다 효과적으로 환자 특이적 면역 반응을 확인할 수 있어 맞춤형 치료가 가능한 새로운 면역 치료 시스템 개발에 널리 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

아토피 피부염 동물 모델인 아바타마우스의 제조 방법 및 그의 용도
본 발명은 아토피 피부염 동물 모델인 아바타마우스의 제조 방법 및 이를 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
아토피 피부염(atopic dermatitis)은 오래 지속되는 만성 피부염으로 가려움증이 심한 습진 병변이 피부에 생기며, 아토피 질환의 과거력이나 가족력이 있는 사람에게 흔히 볼 수 있다. 증상이 나타나면 그 부위를 긁거나 문지르게 되고 그 결과 피부 증상이 더욱 악화되는 것이 아토피 피부염의 특징으로 볼 수 있다. 아토피 피부염 환자는 전 세계적으로 증가 추세에 있으며, 1970 년대까지는 6 세 이하 어린이의 약 3 %가 아토피를 앓고 있다고 보고되었으나 최근에는 어린이의 20 %, 성인에서도 1 내지 3 % 정도 발생하는 것으로 추정된다. 우리나라의 경우 2008 년 서울시에서 조사한 유병률은 설문지에서 19.1 %, 의사의 실제 진찰에서 9.2 %로 보고되었으며, 지역, 연령, 성별, 사회문화적 특성에 따라 다양한 유병률을 보이고 있다.
아토피 피부염은 환자의 유전적인 소인과 환경적인 요인, 환자의 면역학적 이상과 피부 보호막 역할을 하는 피부장벽기능의 이상 등 여러 원인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 아토피 피부염은 견디기 힘든 가려움증을 유발하며 이로 인해 불면증, 정서장애, 학습장애, 환경 적응 능력의 감소, 사회적 활동력의 감소 등이 유발될 수 있다. 또한, 심한 가려움과 습진이 동반될 수 있는데 마치 피부를 청결히 관리하지 못하고 있거나 전염성 피부질환을 앓고 있는 것으로 오인되어 대인관계에도 지장을 초래할 수 있으며, 특히 사춘기 환자의 경우 자아 형성에도 나쁜 영향을 미칠 수 있는 만큼 아토피 피부염의 예방 및 치료가 필수적으로 요구된다.
아토피 피부염은 치료 중에는 호전되고 치료를 중단하면 다시 재발하는 상황을 반복하는 만성 질환이며, 환자마다 유발 요인이나 악화 인자가 조금씩 다르므로 환자 개개인에게 적합한 치료 방법을 선택하는 것이 무엇보다 중요하다.
이에 따라 최근 아토피 피부염을 발생 원인에 따라 보다 효과적으로 예방 또는 치료하기 위한 맞춤형 예방제 또는 치료제에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이러한 연구에 있어서는 임상실험이 필수적으로 요구되는데, 이 과정에서 여러 가지 위험 요소들이 있을 수 있고, 윤리적으로 문제가 야기될 수 있어 이를 극복하기 위한 방안으로 다양한 동물 모델들이 사용되고 있다. 한 예로 사람 피부에서의 면역 반응을 보기 위해 사람의 피부와 면역세포를 생착시키고 호중구가 고갈된 피이식체로서의 인간화된 면역결핍 마우스가 존재하지만(유럽 특허출원공개 EP 3556205호), 아토피 피부염은 피부에 발생하는 질환으로 면역 시스템이 과민화되어 발생하는 질환이기에 단순히 피부 조직에서의 면역 반응을 보는 것과는 구분되어야 할 것이다. 또 다른 마우스 모델의 예로 암 연구를 위한 환자 유래 종양 이종이식 인간화 마우스 모델(Cancer Discov. 2014 Sep;4(9):998-1013.)이 있으나, 아토피 피부염의 경우 암 관련 질병과는 다른 복잡한 면역기전을 구현해야 한다는 점에서 차이가 있다. 한국질병관리본부의 정의에 의하면, 아토피 피부염은 피부에 발생하는 만성 알레르기 염증성 질환으로, 알레르기 질환과 염증 질환의 성격을 동시에 가지며 각 질환이 각기 다른 메커니즘으로 작용하기에, 발병 기전을 명확히 규명할 필요가 있다. 현재 정상인이 아닌 아토피 피부염 환자의 면역 상태를 NSG 마우스에서 구현하는 동물 모델은 없는 실정이며, 아토피 피부염의 면역학적 특성을 그대로 구현하는 인간화 동물 모델의 제조 또한 용이하지 않다. 본 발명자들은 이러한 아토피 피부염 예방제, 치료제 또는 화장료 조성물을 스크리닝하기 위한 실제 아토피 피부염 환자의 면역 반응을 대변하는 마우스 모델을 발명하였으며, 이는 특이적 면역 반응을 총체적으로 반영할 수 있기에 가까운 미래에 아토피 피부염 질환에 대한 맞춤형 치료가 가능할 것으로 기대된다.
본 발명은 집먼지 진드기로 인한 아토피 피부염 환자의 특이 면역 반응을 구현하는 아바타마우스를 제공하고자 한다.
본 발명은 집먼지 진드기 특이적 면역 반응을 확인할 수 있는 상기 아바타마우스의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 집먼지 진드기 특이적 면역 반응을 확인할 수 있는 상기 아바타마우스를 이용한 아토피 피부염 치료제, 예방제 또는 화장료 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 아토피 피부염 환자의 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 면역결핍 마우스에 주입한 아토피 피부염 동물 모델인 아바타마우스를 제공한다. 본 명세서상에서 말초 혈액 단핵세포라는 용어는 PBMC와 혼용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, "아바타마우스"란 환자 맞춤형 동물 모델을 말하며, 보다 구체적으로 환자 유래 세포 또는 조직을 면역결핍 동물에 정위적으로 이종 이식함으로써 제조된 환자 맞춤형 동물 모델(xenograft animal model)을 의미하는데, 특정 질환을 가진 환자의 유전적, 생리적 및 환경적 특성을 그대로 반영한 조건을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, "면역결핍 동물"이란 특정 질환이 발병될 수 있도록 면역시스템을 구성하는 일부 구성요소를 유전자 수준에서 인위적으로 손상시켜서 정상적인 면역시스템이 구현되지 않도록 조작하여 제조된 동물 모델을 의미한다. 상기 면역결핍 동물로 신경계가 형성된 동물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 면역결핍 포유동물을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 면역결핍되도록 조작된 마우스, 랫트, 햄스터, 비버, 기니피그, 뉴트리아 등의 면역결핍 설치류가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 누드 마우스, NSG(NOD scid gamma) 마우스, NOD(non-obese diabetic) 마우스, SCID(Severe combined immunodeficiency) 마우스, NOD-SCID 마우스, NOG(NOD/SCID Il2rg-/-) 마우스 등이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, "면역결핍 마우스"란 누드 마우스, NSG(NOD scid gamma) 마우스, NOD(non-obese diabetic) 마우스, SCID(Severe combined immunodeficiency) 마우스, NOD-SCID 마우스, NOG(NOD/SCID Il2rg-/-) 마우스, NSG 마우스 등이 존재한다. 그 중에서, 가장 처음에 개발된 누드 마우스는 1960 년대에 흉선이 없는 상기 마우스가 활성화된 T-림프구의 결핍으로 면역거부 반응이 약하다는 것이 알려지면서, 마우스에 암세포를 이식하는 방법에 대한 연구가 활성화되었다. 1980 년대 Bosma에 의해 SCID(Severe combined immunodeficiency) 마우스가 보고되었으며, 상기 마우스는 B 세포 및 T 세포의 기능 결함이 있어 인간 세포를 받아들이는데 거부반응이 없기에 암을 비롯한 면역질환, 장기이식 또는 감염 등 여러 분야에 널리 이용되고 있다. NOD 마우스는 선천적인 면역이 결핍된 마우스이며, SCID 마우스는 후천적인 면역이 결핍된 마우스인데 이들로부터 유래된 마우스 모델이 NOD-SCID 마우스이다. 상기 마우스는 NOD 마우스의 기능적 특징(Phenotype)인 NK 세포(Natural killer cell)의 활성 저하, 단핵백혈구(Monocytes)의 사이토카인(Cytokine)으로의 분비기능장애, 보체 제5성분(Complement5, C5)의 활성 결여 등을 나타내며, SCID 마우스의 기능적 특징(Phenotype)인 B 세포와 T 세포의 기능 결여도 동시에 나타낸다. NSG 마우스는 성숙한 T 세포, B 세포 및 NK 세포(natural killer cell)가 부족한 면역 결핍된 마우스를 말한다. Jackson Laboratory에서 개발 및 판매하는 NSG 마우스는 사이토카인 경로를 인위적으로 조절하였으며, 마우스의 면역성을 더 감소시키기 위하여 NOD-SCID 마우스와 Il2rgnull 마우스(Il2rg가 제거된 마우스)의 교배시킨 결과로 얻어진 새로운 마우스이다. 상기 마우스는 생물학 및 질병의 많은 영역의 정교한 모델링이 가능하게 하여 최근 많은 연구에 이용되고 있다.
본 발명에서 상기 면역결핍 마우스는 누드 마우스, NSG(NOD scid gamma) 마우스, NOD(non-obese diabetic) 마우스, SCID(Severe combined immunodeficiency) 마우스, NOD-SCID 마우스, NOG(NOD/SCID Il2rg-/-) 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 보다 바람직하게는 NSG 마우스 일 수 있다. 그러나 상기에서 제한 열거된 마우스와 같이 면역 기능이 결핍된 마우스의 한 종류에 해당한다면 이에 제한되지 않고 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료의 대상이 되는 질환으로, 아토피성 질환일 수 있으며, 구체적으로는 아토피 피부염(atopic dermatitis)일 수 있다. 보다 바람직하게는, 집먼지 진드기(dermatophagoides farinae)로 인해 발병되었거나 발병될 가능성이 있는 아토피 피부염을 말하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 동물 모델 마우스는 아토피 피부염, 보다 구체적으로 집먼지 진드기에 의해 감작된 아토피 피부염 환자의 특이적 면역 반응을 반영한 것에 특징이 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 "아토피 피부염"이란 한국질병관리본부의 정의에 따르면 아토피 피부염은 피부에 발생하는 만성 알레르기 염증성 질환으로 소아에서 흔히 나타나고 성인이 되어서도 증상이 지속될 수 있는 만성 알레르기 염증성 피부 반응을 말한다. 가족 중에 천식, 알레르기비염 등 다른 알레르기 질환이 있는 경우 아토피 피부염이 발생할 가능성이 높으며, 식품이나 집먼지 진드기 같은 알레르겐에 의해 발생할 수 있다. 또한, 급격한 실내 온도와 습도 변화, 땀이나 침, 꽉 끼거나 거친 재질의 옷, 피부를 문지르거나 긁는 것, 스트레스, 세균 감염 등도 아토피 피부염을 악화시키는 요인으로 알려져 있다. 피부 시험이나 혈액 검사를 이용하여 아토피 피부염의 원인 물질이나 악화 요인을 판정할 수 있으며, 원인, 악화 인자에 따른 치료 약물 또는 방법이 달리 적용되기에 원인 규명에 따른 치료제의 개발이 필수적으로 요구된다. 아토피 피부염은 알레르기 질환과 염증 질환의 성격을 동시에 가지며, 상기 알레르기와 염증은 의학적으로 전혀 상이한 적응증에 해당하는 것으로 의학계에서도 항 알레르기 약제와 비스테로이드성 항염증 약제를 구분하여 비스테로이드성 소염제는 알레르기 질환의 치료에 사용하지 아니한다.
본 발명에서, 상기 알레르기 반응은 알레르기를 유발하는 알레르기항원(외부항원)이 우리 몸에 들어와 항원 특이 Th2 세포의 활성화가 이루어지고, 활성화된 Th2 세포가 분비하는 사이토카인에 의해 B 세포가 IgE 항체 생성 B 세포로 전환되어 IgE 항체 생성이 유도되어 분비되면 분비된 IgE 항체가 비만세포(mast cell)와 결합하여 비만세포의 감작이 유도되고, 이때 재차 외부에서 들어온 알레르기항원이 비만세포 표면에 결합된 IgE와 결합하면서 비만세포가 활성화되어 히스타민과 같은 여러가지 화학적 알레르기 매개물질 및 염증성 사이토카인을 분비하면서 알레르기 증상이 나타나기 시작하며 Th2 세포 및 비만세포에서 분비된 사이토카인(IL-5 등)에 의해 말초 및 조직에서 호산구의 침윤이 유도, 항진되면 호산구과다증이 유발되어 호산구성 염증이 발생하게 되는데 이를 호산구성 알레르기라고 부르며, 호산구과다증이 직접적인 원인이 되어 IL-13에 의해 알레르기성 과민반응이 유도되어 과민성을 나타나게 된다. 따라서 항알레르기 효과를 나타내기 위해서는 알레르기 질환에 있어서 항진된 Th2 면역 반응을 억제시키거나, B 세포에서 IgE 항체 생성을 억제시키거나, 히스타민과 같은 화학적 알레르기 매개물질의 작용을 억제시키는 등의 방법을 통해 대처할 수 있다.
본 발명에서, 상기 염증 반응은 면역계 즉, 선천성 면역세포가 외부항원 또는 내부항원을 인식하여 일으키는 면역 반응을 통해 나타내는 외적증상을 염증 반응이라고 한다. 이때 외부항원 및 내부항원을 인식하여 초기에 일으키는 면역 반응에서 나타나는 염증 반응이 급성 염증 반응에 해당하며, 항원이 지속적으로 존재하여 이에 따른 면역 반응이 지속적으로 계속 일어나게 되면 만성 염증 반응에 해당한다. 항염증제의 경우 염증 반응을 억제하는 것으로 만성 염증 반응 억제와 함께 급성 염증 반응도 억제하게 되며 또한 감염증에 대한 항병력 향상의 면역 반응도 억제하게 되어 감염증에 걸릴 위험이 높아지기도 하는 반면, 면역증강제의 경우 감염증에 대한 항병력 향상의 면역 반응은 증강시키나 반면에 염증 반응도 증강시켜 만성 염증 반응을 악화시키기도 한다.
본 발명에서 상기 아토피 피부염의 경우 대한 아토피 피부염 학회에서 2015년 발간된 "2015 한국 아토피 피부염 치료 가이드라인"에서도 경증 아토피 피부염에서는 "항히스타민제, 국소 칼시뉴린 억제제, 국소 스테로이드제"가 제시되어 있으며, 국소 칼시뉴린 억제제는 T 세포의 활성화를 억제하는 물질이다. 또한 중등증, 중증 아토피 피부염의 경우 전신 치료에 있어서 "사이클로스포린, 단기 전신 스테로이드제, 기타 전신면역조절제(AZA, MMF, MTX,　IFN-γ, Alitretinoin), 광선치료, 항원 특이면역 치료, 생물학적 제제"가 제시되어 있다. 비스테로이드성 소염제는 어디에도 언급되어 있지 않기에 비스테로이드성 소염제는 아토피 피부염의 치료 목적에는 사용되지 않는다는 것을 의미한다. 이는 아토피 피부염이 단순히 염증 반응이 아니라 면역 과민반응에 의한 면역질환에 해당하기 때문이다. 아토피 피부염 대부분의 증상이 피부에 나타나기 때문에 단순 피부 질환으로 오해할 수 있지만, 아토피 피부염은 피부장벽 이상뿐 아니라 과도하게 활성화된 면역계 기능 이상 등 복잡한 면역 기전이 적용되는 질환에 해당한다(J Interferon Cytokine Res. 2002 Apr;22(4):407-12.). 더 나아가, 하기 표 1의 아토피 피부염 유발 물질에 따라 면역 반응도 달라지게 된다(J Invest Dermatol. 2013 Feb;133(2):303-15.). 본 발명은 아토피 피부염 중에서도 집먼지 진드기가 유발 물질로 작용하는 아토피 피부염 인간화 동물 모델에 관한 것으로, 집먼지로 인한 아토피 피부염의 특이적 면역 반응을 구현함으로써 환자 개개인별 맞춤형 치료제 스크리닝에 이용할 수 있다.
아토피 피부염의 유발/악화인자
흡입항원 동물털, 바퀴벌레, 집먼지진드기, 곰팡이, 꽃가루, 비듬
기후 발한, 겨울, 자외선
심리적 스트레스 -
내분비 월경, 임신
음식항원 우유, 달걀, 생선, 땅콩, 콩, 밀가루
접촉항원 니켈, 코발트, 크롬
자극원 뜨거운 물, 비누, 담배, 세정제, 합성섬유, 모직
미생물 세균(황색알균, 사슬알균), 곰팡이, 바이러스(단순포진, 물사마귀)
본 발명의 일 구체예에서, 상기 "집먼지 진드기 (house dust mite; HDM)"란 옴진드기목 집먼지 진드기과에 속하는 진드기의 한 종류로서 서양에서는 House dust mite라 하여 응애(mite)의 하나로 취급하고 있다. 집먼지 진드기의 몸은 매우 작아서, 검은 배경에 놓았을 때 간신히 보일 정도 대개 길이 0.4 mm, 폭 0.3 mm 정도의 크기다. 몸체는 큐티클로 이루어져 있으며, 대부분의 진드기류처럼 8 개의 다리를 가지고 있다. 집먼지 진드기가 만들어내는 알레르기 유발물질(알레르겐)은 천식의 가장 흔한 원인 물질이기도 하지만, 아토피 피부염의 원인 중의 하나에도 해당한다. 특히, 집먼지 진드기에 의한 아토피 피부염의 경우 실내 습도를 40 내지 50 %로 유지하고, 진드기의 서식처가 되는 카펫, 침대 매트리스, 천으로 된 소파, 커튼 등은 사용하지 않는 등의 예방법이 존재한다. 그러나, 이러한 예방법에도 불구하고 집먼지 진드기 항원에 대한 특이 면역 반응을 일으키는 아토피 피부염 환자에게 적합한 치료를 하기 위해서는 이러한 면역 반응을 반영하는 마우스 모델이 필수적으로 요구된다. 상기와 같은 마우스 모델을 이용한다면 집먼지 진드기로 인한 아토피 피부염의 예방제, 치료제, 또는 화장료 조성물을 발굴하는데 기여할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, "말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)"란 인간의 말초 혈액 내에 포함된 백혈구 중 림프구(T 세포, B 세포, NK 세포)와 단핵구로 이루어진 세포로 둥근 핵을 가진 말초 혈액 세포를 말한다. PBMC는 생체 외(in vitro)에서 추출 및 배양할 수 있으며, 이는 면역학, 이식 면역학, 혈액학, 악성 종양과 전염병 등의 백신 개발, 약물 발견에 사용되는 하이 스루풋(high-throughput) 스크리닝과 같은 생물학 및 화학 분야 등의 연구에서 자주 사용되고 있다. 또한, 사람의 혈액은 채취 후 12 내지 24 시간 이내에 PBMC 분리를 실시하지 않으면, 세포가 사멸하므로 12 내지 24 시간 내에 분리를 실시해야 하며, IRB(Institutional Review Board) 승인 등의 공식 절차로 인해 혈액 수급이 용이하지 않다는 단점이 있다. 본 발명에서 PBMC는 CD3+ T 세포, CD3 고갈된 PBMC, CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 및 수상돌기세포(dendritic cell)로 분리하여 면역결핍 마우스에 주입하는 것으로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 아바타마우스에 주입되는 PBMC로는 CD3+ T 세포, CD3가 고갈된 PBMC(CD3 depleted PBMC), CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 또는 수상돌기세포(dendritic cell)로 분리되어 각기 다른 경로로 주입될 수 있다.
본 발명에서 상기 "주입"은 경구 투여를 제외한 비경구 투여를 말하며, 피하(Subcutaneous Injection), 피내(Dermal Injection), 근육내(Intramuscular Injection), 복강내(Intraperitoneal Injection), 뇌내(Intracerebral Injection), 설하정맥(Injection into the Sublingual Vein), 정맥내(Injection into the Sublingual Vein), 음경정맥내(Injection into the Penile Vein), 꼬리정맥내(Injection into the Caudal Vein) 및 뒷발허리 정맥내(Injection into the Dorsal Metatarsal Vein) 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 본 발명의 마우스에 PBMC를 주입하는 과정은 보다 바람직하게는 CD3+ T 세포는 정맥내주사(intravenous injection)를 통하여 이루어질 수 있으며, CD3+ T 세포가 고갈된 PBMC(CD3 depleted PBMC), CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 또는 수상돌기세포(dendritic cell)는 피내주사(intradermal injection)를 통하여 이루어질 수 있다.
본 발명에서 주입된 PBMC는 활성, 체중, 투여시간, 투여경로, 배출율을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 주입량은 마우스의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 투여는 한번에 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 인간 T 세포 활성화의 지표인 세포 표면 마커(예를 들어, 인간 CD3, 인간 CD45, 인간 CD4, 및 인간 CD8) 및/또는 인간 T 세포 기능 소실의 지표인 세포 표면 마커(예를 들어, 마우스 CD45)의 유세포 분석(flow cytometry)에 의하여 분석될 수 있다. 상기 유세포 분석의 경우 당업계에서 잘 알려진 방법에 따라 분석 또는 평가될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 혈액 샘플에 존재하는 표적 분석물과의 결합을 검출하는 것은 당업계에 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 달성될 수 있으며, 이러한 방법의 예로서, 표적 분석물 또는 결합된 물질에 직, 간접적으로 부착되는 검출 가능한 라벨을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 용어 "검출 가능한 라벨"은 임의의 적절한 방법에 의해 검출 가능한 표지의 존재를 나타내는 신호를 생성할 수 있는 물질을 의미하며, 이러한 방법의 예로서, 분광학적, 광학적, 광화학적, 생화학적, 효소, 전기 및/또는 면역 화학적 방법을 포함할 수 있다. 검출 가능한 표지의 예는 예시적으로 형광 부분, 화학 발광 부분, 생체 발광 부분, 전자 밀도 입자, 자성 입자, 효소, 기질, 방사성 동위 원소 및 발색단을 포함할 수 있다. 검출 가능한 특정 표지 또는 표지들의 정체성은 사용된 검출 공정에 따라 달라진다. 상기 검출 공정은 예를 들어 효소 면역 분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 면역형광측정법(immuno-fluorescence assay), 액체 크로마토그래피(liquid chromatography), 유세포 분석(flow cytometry), 기타 당업계에 공지된 검출 방법들 또는 이들의 조합을 포함하는 특정 분석 포맷에 통합된다.
본 발명의 일 구체예에서, 인간 CD3, 인간 CD45, 인간 CD4, 또는 인간 CD8 양성으로 나타난 경우 인간화된 것으로 볼 수 있는 지표로 해석하며, 마우스 CD45가 양성으로 나타난 경우 인간화가 되지 아니한 지표로 해석할 수 있다. 다만, 유세포 분석을 위하여 지표로 사용될 수 있는 항체로서 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이라면 이에 제한되지 않고 모두 포함될 수 있다. 유세포 분석으로 인한 인간화 여부의 확인을 통하여, 본 발명의 집먼지 진드기에 특이적인 면역 반응을 구현해내는 아바타마우스를 선별하여 약물 또는 화장료 스크리닝에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, (a) 아토피 피부염 환자로부터 분리된 혈액 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 혈액 샘플로부터 PBMC를 수득하는 단계; 및 (c) 상기에서 수득된 PBMC를 면역결핍 NSG 마우스에 주입하는 단계;를 포함하는 인간화 마우스 모델인 아바타마우스를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제조 방법은 보다 바람직하게는 진드기에 감작된 아토피 피부염 환자의 혈액 샘플로부터 PBMC를 분리하여 주입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 집먼지 진드기 특이적 면역 반응을 하는 아토피 피부염 환자로부터 분리된 혈액 샘플을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 PBMC로부터 CD3+ T 세포, CD3+ T 세포가 고갈된 PBMC(CD3 depleted PBMC), CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 또는 수상돌기세포(dendritic cell)로 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 CD3+ T 세포는 정맥내주사(intravenous injection)를 통해 이루어지고, CD3+ T 세포가 고갈된 PBMC(CD3 depleted PBMC), CD14+ 단핵구 세포 및 수상돌기세포는 피내주사(intradermal injection)를 통해 주입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기의 방법으로 제조된 아바타마우스를 이용하여 아토피 피부염 예방제, 치료제 또는 개선용 화장료 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 "스크리닝"이란 신약 개발 과정 중에 거치게 되는 수많은 절차들 중의 하나로, 보다 구체적으로는 기초 연구로부터 선정된 화합물 스크리닝을 통해 유효 물질 및 선도 물질을 발굴하여 후보물질을 확정하는 절차를 말한다. 이는 신약 개발에 소요되는 시간과 비용을 줄여줄 수 있으며, 대상 질병이 선정된 후 이를 표적으로 하는 신약 유효 물질을 발굴할 수 있다. 예를 들어, 신약뿐만 아니라 예방제 또는 화장료 조성물 등을 조사하였을 때 피부 질환, 보다 구체적으로는 아토피 피부염 질환으로 나타나는 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 물질이라면, 이에 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서, "맞춤형 치료의학(tailored medicine)"이란 맞춤형 의료(order-made medicine) 또는 환자 맞춤형 의학(personalized medicine)이라고도 하며, 환자 개개인의 체질이나 환경을 개별적으로 조사하여, 여기에 적합한 치료법을 결정하는 방법 또는 치료하는 방법을 의미한다.
본 발명에서, "예방제"는 본 발명의 아바타마우스를 이용하여 스크리닝되는 후보 물질로 집먼지 진드기로 인한 아토피 피부염 증상을 차단하거나, 피부염의 억제 또는 지연시키는 모든 작용제라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, "치료제"는 본 발명의 아바타마우스를 이용하여 스크리닝되는 후보 물질로 피부 질환, 보다 구체적으로는 아토피 피부염 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 작용제라면 제한없이 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 집먼지 진드기로 인한 아토피 피부염 질환이 호전되는 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 "화장료 조성물"은 본 발명의 아바타우스를 이용하여 스크리닝되는 후보 물질로 아토피 피부염 증상을 개선시키는 모든 작용제라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한, 화장수, 영양 로션, 영양 에센스, 마사지 크림, 미용목욕물 첨가제, 바디 로션, 바디 밀크, 배스 오일, 베이비 오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린 로션, 선스크린 크림, 선탠 크림, 스킨 로션, 스킨 크림, 자외선차단용 화장품, 클렌징밀크, 탈모제화장용, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민 오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누비의료용, 크림비누, 페이셜워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다. 또한, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용 가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다. 그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.
본 발명의 일 구체예에서, (a) 아토피 피부염 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 CD3+ T세포로 분리하는 단계; 및 (b) 상기 CD3+ T 세포를 면역결핍 마우스에 주사하는 단계;를 포함하는 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법을 제공하고, 상기 아토피 피부염은 집먼지 진드기로 인해 유발된 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법을 제공하고, 상기 면역결핍 마우스는 누드 마우스, NSG(NOD scid gamma) 마우스, NOD(non-obese diabetic) 마우스, SCID(Severe combined immunodeficiency) 마우스, NOD-SCID 마우스, NOG(NOD/SCID Il2rg-/-) 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법을 제공하고, 상기 (b)단계에서의 주사는 정맥내주사(intravenous injection)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법을 제공하고, 상기 (a)단계 시 상기 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)로부터 CD3 T 세포가 고갈된 말초혈액 단핵 세포(CD3 depleted PBMC), CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 또는 수상돌기세포(dendritic cell)를 분리하는 단계를 추가로 더 포함하는 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법을 제공하고, 상기 (b)단계 시 주사는 CD3+ T 세포가 고갈된 말초혈액 단핵 세포를 주사하거나 CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 및 수상돌기세포(dendritic cell)를 주사하는 단계를 추가로 포함하는 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법을 제공하고, 상기 CD3+ T 세포가 고갈된 말초혈액 단핵 세포의 주사; 또는 CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 및 수상돌기세포(dendritic cell)의 주사는 피내주사(intradermal injection)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 방법에 의해 제조된 아토피 피부염 아바타마우스를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 상기 아토피 피부염 아바타마우스로서 제 1 개체와 제 2 개체를 준비하는 단계; (b) 상기 제 1 개체에 아토피 피부염 치료, 또는 개선용 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 제 2 개체와 비교하여 제 1 개체에서 아토피 피부염이 완화된 경우에, 상기 후보 물질을 아토피 피부염 치료, 또는 개선용 물질로 판단하는 단계;를 포함하는 아토피 피부염의 치료 또는 개선용 물질의 스크리닝 방법을 제공하고, 상기 아토피 피부염은 집먼지 진드기로 인해 유발된 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법을 제공하고, 상기 후보 물질은 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물인 스크리닝 방법을 제공하고, 상기 후보 물질은 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물인 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 화장료 조성물은 화장수, 영양 로션, 영양 에센스, 마사지 크림, 미용목욕물 첨가제, 바디 로션, 바디 밀크, 배스 오일, 베이비 오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린 로션, 선스크린 크림, 선탠 크림, 스킨 로션, 스킨 크림, 자외선차단용 화장품, 클렌징밀크, 탈모제화장용, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민 오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누비의료용, 크림비누, 페이셜워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 및 치약으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 아토피 피부염 환자의 면역 상태를 NGS 마우스에서 구현한 아토피 피부염 아바타마우스로서 집먼지 진드기로 인한 특이적 면역 반응을 반영하는 아토피 피부염 동물 모델인 아바타마우스의 제조 방법과 이를 이용한 아토피 피부염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 실제 아토피 피부염 환자의 면역 반응을 대변하기에 본 발명을 이용할 경우 효과적으로 환자 특이적 면역 반응을 확인할 수 있어 아토피 피부염의 발생 원인에 따른 맞춤형 예방제 또는 치료제 개발에 널리 이용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1e는 아바타마우스에서 인간 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)의 생착률을 확인한 도이다.
도 2a 내지 도 2d는 아바타마우스의 피부 림프절, 비장 및 피부 병변 조직에서 인간 T 세포를 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 확인한 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는 인간 PBMC와 아바타마우스의 림프절 및 피부 병변 조직에서 인간 T 세포 및 수상돌기세포를 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 확인한 결과이다.
본 발명의 일 구현 예에서는 (a) 아토피 피부염 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 CD3+ T 세포, CD3+ T 세포가 고갈된 말초혈액 단핵 세포(CD3 depleted PBMC), CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 또는 수상돌기세포(dendritic cell)로 분리하는 단계; 및 (b) 상기 세포를 면역결핍 마우스에 주사하는 단계;를 포함하는 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현 예에서는 상기 방법에 의해 제조된 아토피 피부염 아바타마우스에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 (a) 상기 방법에 의해 제조된 아토피 피부염 아바타마우스로 제 1 개체와 제 2 개체를 준비하는 단계;(b) 상기 제 1 개체에 아토피 피부염 치료, 또는 개선용 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 제 2 개체와 비교하여 제 1 개체에서 아토피 피부염이 완화된 경우에, 상기 후보 물질을 아토피 피부염 치료, 또는 개선용 물질로 판단하는 단계;를 포함하는 아토피 피부염의 치료 또는 개선용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 아토피 피부염 환자군의 모집 및 면역 결핍 NSG 마우스의 준비
본 발명의 발명자들은 연세대학교 의과대학 평가위원회(Institutional Review Board, IRB)의 승인을 얻어 모든 실험을 수행하였으며, 집먼지 진드기(Dermatophagoides farina; house dust mite; HDM)에 감작되어 있는 아토피 피부염 환자의 혈액 샘플을 수득하였다. 또한, 면역결핍 NSG 마우스는 미국 JAX사에서 구입하여 생후 6 주령된 암컷 6 마리를 실험에 이용하였다. 실험동물실 온도 23±2 ℃ 습도 55±5 % 및 12 시간/12 시간 (dark/light cycle) 조건에서 1 주일 동안 상기 마우스를 안정화시켰다.
실시예 2: 아토피 피부염 환자의 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)의 분리
인간 PBMC(huPBMC)를 얻기 위하여 GE 헬스케어사의 Ficoll-Paque 시약을 이용하였다. Ficoll-Paque 시약과 실시예 1에서 수득한 혈액 샘플을 15ml 튜브에 섞이지 않도록 1:1로 넣어주고 원심분리기에 넣고 2500 rpm으로, 15 분 동안 RT 조건에서 분리시켰다. 바닥 층에는 적혈구가 모이고 그 위에 버피 코트층, 혈장층으로 분리되며, 혈장층을 버리고 버피 코트층을 취하여 PBMC를 수득하였다. 상기에서 취한 PBMC를 새로운 튜브에 옮기고 EDTA 용액을 1:1로 넣어준 후 원심분리기에 넣고 1500 rpm, 10 분 동안 RT 조건에서 원심 분리시켰다. 그 후 상층액은 버리고 남은 펠렛인 PBMC를 최종적으로 얻고 상기 PBMC에서 아토피 피부염을 일으키는 병원 유발성 세포를 이용하기 위해 CD3+ T 세포를 분리하였다. 또한, 항원전달세포를 분리하기 위해 CD3 고갈된 PBMC에서 CD14+ 세포를 분리시켰다.
상기 CD3+ T 세포를 분리하기 위해 Miltenyi Biotec 사의 Pan T Cell Isolation Kit를 이용하였다. 위 키트의 실험 방법대로 상기 PBMC에 MACS 버퍼 400 ㎕/108 cells를 넣어주고 Pan T Cell Biotion Antibody Cocktail을 100 ㎕/108 cells 넣어준 후 5 분 동안 2 내지 8 ℃에서 인큐베이션 시켰으며, 다음으로 MACS 버퍼 300 ㎕/108 cells을 넣고 Pan T Cell MicroBead Cocktail을 200 ㎕/108 cells 넣어준 후 10 분 동안 2 내지 8 ℃에서 인큐베이션 시켜주었다. 그 후 LS 칼럼을 이용하여 자기분리 해주어 CD3+ T 세포와 나머지 CD3 고갈된 PBMC를 수득하였다. 또한 CD14+ 단핵구세포(monocyte) 및 수상돌기세포(dendritic cell)를 얻기 위해서 위 실험에서 얻은 CD3 고갈된 PBMC에서 Miltenyi Biotec 사의 CD14 MicroBeads, human kit 또는 Pan DC Enrichment kit를 이용하여 위 키트의 실험 방법대로 실험을 진행하여 CD14+ 단핵구세포 또는 수상돌기세포를 수득하였다. 보다 구체적인 실험 방법은 하기와 같다.
CD3 고갈된 PBMC를 300xg, 10 분 원심분리 시켜준 후 상층액을 버리고 남은 펠렛에 MACS 버퍼 80 ㎕/107 cells 넣어주어 잘 섞은 후 CD14 MicroBeads를 20 ㎕/107 cells 넣어주어 15 분 동안 2 내지 8 ℃에서 인큐베이션 시켜주었다. 그 후 MACS 버퍼 1 내지 2 mL/107 cells 넣어주어 워싱해주고 300 xg, 10 분 동안 윈심분리 시켜주었다. 상층액을 버리고 남은 펠렛에 MACS 버퍼 500 ㎕를 넣어 잘 섞어주고 LS 칼럼을 이용해 자기분리 해주어 CD14+ 단핵구세포를 수득하였다.
수상돌기세포를 분리하기 위해서 CD3 고갈된 PBMC를 300 xg, 10 분 동안 원심분리 시켜준 후 MACS 버퍼 350 ㎕/108 cells 넣어주어 잘 섞어주고 FcR Blocking Reagent를 50 ㎕/108 cells 넣어주었다. 그 다음 Pan DC Biotin-Antibody Cocktail을 100 ㎕/108 cells 넣어준 후 5 분 동안 실온에서 인큐베이션 시켜주었다. 그 후 MACS 버퍼 400 ㎕/108 cells을 넣어주고 Pan DC MicoBead-Antibody Cocktail 100 ㎕/108 cells를 넣어준 후 다시 5 분 동안 실온에서 인큐베이션 시켜주었다. MACS 버퍼 10 mL/108 cells로 워싱해주고 300 xg, 10 분 동안 원심분리 시켜준 후 상층액을 버린 후 남은 펠렛에 MACS 버퍼 500 ㎕/108 cells를 넣어 잘 섞어주고 LS 칼럼을 이용해 자기분리 해주어 수상돌기세포를 최종적으로 수득하였다.
실시예 3: 정맥내주사(intravenous injection) 및 피내주사(intradermal injection)를 통한 huPBMC가 이식된 아바타마우스의 제조
아토피 피부염 환자의 혈액으로부터 상기 실시예 2의 방법으로 수득한 인간 PBMC 세포를 면역결핍 NSG 마우스에 두 가지 경로로 투여 경로를 달리하여 주입시켰다. 정맥내주사(intravenous injection)를 통하여 병원유발성 세포인 CD3+ T 세포를 2X106 cells/20㎍ 주입시켰으며 이 경우 CD3 T 세포 뿐만 아니라 전제적인 PBMC도 사용 가능하다. 항원 전달 세포인 피내의 수상돌기세포(dendritic cell)를 감작시키기 위하여 등에 피내주사(intradermal injection)를 통하여 CD3 고갈된 PBMC를 3X106 cells/30㎍ 또는 CD14+ 세포 3X106 cells/30㎍ 및 수상돌기세포 3X106 cells/30㎍을 주입시켰다. 상기 면역결핍 NSG 마우스에 집먼지 진드기(HDM)로 감작된 아토피 피부염 환자의 PBMC를 주입함으로써 아바타마우스를 제조하였으며, 이는 아토피 피부염의 주요 알러젠인 집먼지 진드기를 이용하여 아토피 피부염 환자 특이적 면역 반응을 대변하는 마우스 모델이라는 점에 의의가 있다할 것이다.
위 방법을 통해 만들어진 아바타마우스의 등을 제모해 준 후 3 일에 한번씩 3M 테가덤 필름으로 각질을 제거하고 집먼지 진드기 연고를 100 mg 발라주었으며, 상기의 과정을 4 주 동안 진행하였다. 사용된 집먼지 진드기 연고는 Biostir사(일본, 오사카)의 아토피 피부염 첼린지 오인트먼트(Atopic dermatitis challenging ointment)로 천연 진드기 유래성분(Dermatophagoides farina)이 포함되어 있는 연고이다. 상기 연고를 발라주어 집먼지 진드기 특이 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 또는 아토피성 피부염을 유발할 수 있으며, 본 발명에서 아토피성 피부염을 유발시키는데 사용하였다.
실시예 4: 유세포분석에 의한 인간 PBMC 생착률 및 인간화(humanized mice) 여부의 확인
상기 실시예 3에서와 같이 제조된 아토피 피부염 마우스 모델에서 PBMC 주입 후 4 주에 걸쳐 인간 PBMC의 생착률을 알아보고자 하였다. 상기 아바타마우스가 인간화되었는지를 확인하기 위하여 매주마다 일정한 간격을 두어 결과를 관찰하였다. 안와채혈을 통하여 마우스 동물 모델의 면역세포로부터 T 세포를 분리하였고, 이를 FACS 튜브에 2.0 x 106 cells/tube로 분주하였으며, FACS 버퍼 1 mL로 4 ℃에서 100 rpm으로 3 분 동안 2 회 세척하였다. 하기에서 확인하고자 하는 각 항체와 FACS 버퍼 혼합액을 만든 후 50 ㎕/tube씩 분주하고 호일을 덮고 20 분 기다린 후 다시 FACS 버퍼 1 mL로 2 번 세척해준 후 상기 버퍼 0.5 mL를 FACS 튜브에 넣고 재부유 시켜 유세포 분석기(flow cytometry)를 가동하여 분석하였다. 이때 세포 표면을 염색한 후 세포를 고정하여 투과시켜 프로토콜에 따라 Becton Dickinson FACS Canto 기기에서 시료의 유세포 분석을 수행하였으며 데이터는 FACS Diva 소프트웨어 (V5.1)를 사용하여 분석하였다. 그 결과를 도 1a에 나타내었다. 도 1a를 참조하면, 1 주 내지 4 주에 걸쳐 인간 CD45는 양성이면서 마우스 CD45는 음성인 것을 확인하였으며, 인간 CD45와 인간 CD3이 모두 양성으로 나타난 것을 확인할 수 있다. 상기 마우스의 세포로부터 인간 T 세포의 표지자로서 인간 CD45와 인간 CD3의 상관관계 및 인간 CD45와 마우스 CD45의 상관 관계를 비교 확인함으로써 시간의 흐름에 따른 인간 PBMC 세포의 생착률 변화 과정을 확인하였다.
또한, 도 1b 및 도1c는 아바타마우스의 혈액에서 주차 별 인간 PBMC 생착률을 확인하기 위하여 유세포 분석을 통하여 인간 CD3, CD45 양성 세포 수를 4 주에 걸쳐 그래프로 나타내었다. 이에 따르면, 집먼지 진드기를 이용해 염증 반응을 일으킨 아바타마우스에서 HDM을 처리하지 않은 아바타마우스에 비하여 더 많은 인간 T 세포를 확인할 수 있었으며, 집먼지 진드기를 처리한 아바타마우스에서의 인간 CD3 양성 비율이 시간이 흐를수록 현저히 증가하는 것을 확인함으로써 생착 효율의 증가를 확인하였다. 추가적으로 집먼지 진드기를 처리한 아바타마우스와 처리하지 않은 아바타마우스의 비장, 림프절, 피부 병변에서 인간 T 세포를 확인한 결과를 도 1d 및 도 1e에 나타내었다. 이 또한 마찬가지로 혈액에서 확인한 결과와 동일한 결과를 보임을 알 수 있다.
마지막으로, 4 주가 경과한 후 림프절과 비장 및 피부 병변 조직에서 상기와 같은 방법으로 유세포 분석을 시행하였으며, 그 결과를 도 2a 내지 도 2d에 나타내었다. 림프절에서 인간 CD45, CD3, CD4, 및 CD8 양성으로 나타났으며, 비장과 피부 병변에서도 동일한 경향을 띠는 것을 확인하였다. 이와 같이 모든 조직에서 인간 지표는 양성으로, 마우스 지표로서 마우스 CD45는 음성으로 나타낸 것을 확인하였으며, 추가로 인간 PBMC와 아바타마우스에서의 림프절 및 피부 병변 조직에서 인간 T 세포 및 인간 항원제시세포(antigen presenting cell; APC)를 확인한 결과를 도 3a 내지 도 3c에 나타내었다. 이 때, 비-림프구(non-lymphocytes) 부분이 위에 위치한 도면에 해당하고, 림프구(lymphocytes) 부분이 아래에 위치한 도면에 해당한다. 인간 PBMC의 FSC-SSC에서 림프구(lymphocytes)와 비-림프구(non-lymphocytes)를 나누어 분석한 결과에 따르면 림프구에서 인간 T 세포를 확인하였고, 비-림프구에서는 APC 세포를 확인하였다. 아바타마우스의 림프절과 피부 병변에서도 이와 마찬가지로 두 개의 모집단(population)으로 나누어 분석(림프구와 비-림프구)한 결과 인간 PBMC에서와 같은 세포의 발현을 확인한 바 인간 PBMC에서와 같은 세포의 발현을 확인하였으며, 이를 통해 성공적인 환자 맞춤형 아토피 피부염 동물 모델, 즉 환자의 면역 반응을 대변하는 인간화된 아바타마우스가 제조된 것을 확인하였다. 이와 같은 특성이 확인된 마우스만을 선별하여 스크리닝에 사용할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 실제 아토피 피부염 환자의 집먼지 진드기로 인한 특이적 면역 반응을 대변하는 인간 T 세포가 내재된 아토피 피부염 동물 모델에 관한 것으로, 본 발명을 이용할 경우 효과적으로 아토피 피부염의 발생 원인에 따른 특이적 면역 반응을 확인할 수 있어 아토피 피부염의 맞춤형 예방제 또는 치료제 개발에 널리 이용될 수 있다.

Claims (13)

  1. (a) 아토피 피부염 개체로부터 분리된 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 CD3+ T 세포로 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 CD3+ T 세포를 면역결핍 마우스에 주사하는 단계;를 포함하는, 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 아토피 피부염은 집먼지 진드기로 인해 유발된 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 면역결핍 마우스는 누드 마우스, NSG(NOD scid gamma) 마우스, NOD(non-obese diabetic) 마우스, SCID(Severe combined immunodeficiency) 마우스, NOD-SCID 마우스, NOG(NOD/SCID Il2rg-/-) 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (b)단계에서의 주사는 정맥내주사(intravenous injection)인 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계 시 상기 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)로부터 CD3+ T 세포가 고갈된 말초혈액 단핵 세포(CD3 depleted PBMC), CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 또는 수상돌기세포(dendritic cell)를 분리하는 단계를 추가로 더 포함하는, 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 단계 시 CD3+ T 세포가 고갈된 말초혈액 단핵 세포를 주사하거나 CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 및 수상돌기세포(dendritic cell)를 주사하는 단계를 추가로 포함하는, 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 CD3+ T 세포가 고갈된 말초혈액 단핵 세포의 주사; 또는 CD14+ 단핵구 세포(CD14+ monocyte cell) 및 수상돌기세포(dendritic cell)의 주사는 피내주사(intradermal injection)인 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 아바타마우스의 제조 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 아토피 피부염 아바타마우스.
  9. (a) 제 8항의 아토피 피부염 아바타마우스로 제 1 개체와 제 2 개체를 준비하는 단계;
    (b) 상기 제 1 개체에 아토피 피부염 치료, 또는 개선용 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 제 2 개체와 비교하여 제 1 개체에서 아토피 피부염이 완화된 경우에, 상기 후보 물질을 아토피 피부염 치료 또는 개선용 물질로 판단하는 단계;를 포함하는, 아토피 피부염의 치료 또는 개선용 물질의 스크리닝 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 아토피 피부염은 집먼지 진드기로 인해 유발된 아토피 피부염인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 후보 물질은 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물인, 스크리닝 방법.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 후보 물질은 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물인, 스크리닝 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 화장수, 영양 로션, 영양 에센스, 마사지 크림, 미용목욕물 첨가제, 바디 로션, 바디 밀크, 배스 오일, 베이비 오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린 로션, 선스크린 크림, 선탠 크림, 스킨 로션, 스킨 크림, 자외선차단용 화장품, 클렌징밀크, 탈모제화장용, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민 오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누비의료용, 크림비누, 페이셜워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 및 치약으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 스크리닝 방법.
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