WO2021158045A1 - 줄기세포를 포함하는 심막 내 주입용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
줄기세포를 포함하는 심막 내 주입용 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a composition for intrapericardial injection containing stem cells and uses thereof.
- Stem cells are cells capable of differentiating into various cells constituting biological tissues, and collectively refer to undifferentiated cells obtained from each tissue of embryos, fetuses, and adults before differentiation.
- cardiac stem cells are cells residing in the heart and refer to stem cells with multifunctionality capable of differentiating into all cells constituting the heart.
- ischemic heart disease is a disease caused by insufficient blood supply to a part of the heart muscle due to narrowing of the blood vessel (coronary artery) supplying blood to the heart. It is one of the diseases that are increasing significantly. Ischemic heart disease includes angina pectoris and myocardial infarction. Various treatment methods, including drug therapy, angioplasty, and heart transplantation, have been tried to treat these diseases, but it is still not possible to effectively treat heart disease. There are insufficient ways to do this.
- the present invention has been devised to solve the problems in the prior art as described above, and it is to provide a composition for intrapericardial injection containing stem cells as an active ingredient, and uses thereof, etc. to improve the therapeutic effect of stem cells.
- the purpose is to provide a composition for intrapericardial injection containing stem cells as an active ingredient, and uses thereof, etc. to improve the therapeutic effect of stem cells. The purpose.
- the present invention provides a composition for intrapericardial injection comprising stem cells as an active ingredient.
- the stem cells may be stem cell microspheres, and the stem cell microspheres may have a diameter of preferably 10 to 500 ⁇ m, and more preferably 50 to 300 ⁇ m or less. do.
- the stem cell microspheres may preferably contain 100 to 5000 cells per unit, more preferably 300 to 3000 cells.
- the composition for intrapericardial injection may further include a hydrogel, and the hydrogel is preferably collagen, gelatin, or chondroitin. , hyaluronic acid, alginic acid, MatrigelTM, chitosan, peptide, fibrin, polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), It may be polyethylene glycol (PEG), polyacrylamide, or the like, and may be prepared by mixing one or more of the above polymer materials. However, if it is a hydrogel in an easy form for injection into the pericardium in general, it is not limited thereto.
- the fibrin gel can be prepared by mixing thrombin and fibrinogen, and the thrombin is preferably used at a concentration of 0.05 to 5 IU/mL, More preferably, it may be 0.1 to 2 IU/mL, and the fibrinogen may be used in a concentration of preferably 0.01 to 10 mg/mL, more preferably in a concentration of 0.05 to 5 mg/mL, In general, if the concentration used to make fibrin gel is not limited. And the fibrinogen may use a human-derived fibrinogen concentrate.
- the stem cells are preferably myocardial-derived stem cells (heart stem cells or cardiac progenitor cells), bone marrow-derived stem cells, adipose-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, dedifferentiated stem cells , vascular endothelial progenitor cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, etc., but is not limited thereto as long as it is a stem cell that can be used for treatment of ischemic diseases.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating ischemic heart disease comprising the composition for intrapericardial injection as an active ingredient.
- the present invention provides a method for preventing or treating ischemic disease, comprising administering to a subject a composition comprising the composition for intrapericardial injection as an active ingredient.
- the present invention provides a use for preventing or treating ischemic disease of a composition comprising the composition for intrapericardial injection as an active ingredient.
- the present invention provides the use of the composition for intrapericardial injection for producing a medicament used for ischemic disease.
- the ischemic heart disease is preferably myocardial infarction, angina pectoris, etc., but is not limited as long as it is a heart disease that can be treated due to promotion of differentiation into myocardial cells, promotion of cardiovascular formation, and the like.
- the survival rate of the animal model, the degree of engraftment of the stem cells, the differentiation of the transplanted stem cells into cardiomyocytes and vascular cells, etc. are promoted, Heart tissue damaged due to myocardial infarction is effectively regenerated by the transplanted stem cells, and blood vessel formation is promoted to effectively restore heart function. Therefore, it is expected that stem cells can be effectively used as a therapeutic agent for various ischemic heart diseases using the composition for intrapericardial injection of the present invention.
- FIG. 1 is a view showing the results of confirming the degree of recovery of cardiac function by echocardiography after transplanting cardiac stem cells into myocardium or intrapericardium in an animal model of myocardial infarction according to an embodiment of the present invention. ** indicates p ⁇ 0.01.
- FIG. 2 is a view showing the result of confirming the cardiac stem cell microspheres under a microscope according to an embodiment of the present invention.
- White bars represent 100 ⁇ m.
- FIG. 3 is a view showing the results of confirming the survival rate after transplanting cardiac stem cell microspheres into an animal model of myocardial infarction according to an embodiment of the present invention.
- FIG. 4 is a view showing the results of confirming with a fluorescence microscope whether cardiac stem cell microspheres are normally engrafted in the heart after transplantation of cardiac stem cell microspheres into the myocardial infarction animal model according to an embodiment of the present invention.
- FIG. 5A shows the result of measuring the number of cells according to DiR fluorescence intensity according to an embodiment of the present invention
- FIG. 5B shows the result of confirming the number of cardiac stem cells in the heart according to the fluorescence intensity according to an embodiment of the present invention.
- FIG. 6 is a view showing the results of comparison of engraftment rates according to the transplantation method of cardiac stem cell microspheres according to an embodiment of the present invention, wherein the white bar indicates 20 ⁇ m, and * indicates p ⁇ 0.05.
- FIG. 7 is a view showing the results of confirming the differentiation of transplanted cardiac stem cells using immunostaining according to an embodiment of the present invention.
- White bars represent 20 ⁇ m.
- FIG. 8 is a view showing the results of confirming the regeneration effect of myocardial cells according to the cardiac stem cell microsphere transplantation method according to an embodiment of the present invention using the immunostaining method.
- the white bar indicates 50 ⁇ m
- * indicates that the p value with the Control group is less than 0.05
- ** indicates that the p value with the Control group is less than 0.01
- # indicates that the p value with the CSC spheroid group is less than 0.01 indicates.
- FIG. 9 is a view showing the results of confirming the regeneration effect of cardiac blood vessels according to the cardiac stem cell microsphere transplantation method according to an embodiment of the present invention using the immunostaining method.
- the white bar indicates 50 ⁇ m
- ** indicates the p value with the Control group, indicating p ⁇ 0.01
- # indicates the p value with the CSC spheroid group, indicating p ⁇ 0.01.
- FIG. 10 is a view showing the results of confirming the degree of recovery of damaged heart tissue according to the cardiac stem cell microsphere transplantation method according to an embodiment of the present invention by H&E staining. Black bars represent 50 ⁇ m.
- FIG. 11 is a view showing the result of confirming the degree of recovery of damaged heart tissue by the MT staining method according to the cardiac stem cell microsphere transplantation method according to an embodiment of the present invention.
- Black bars indicate 50 ⁇ m
- * indicates that the p value with the Control group is less than 0.05
- ** indicates that the p value with the Control group is less than 0.01
- # indicates that the p value with the CSC spheroid group is less than 0.01 indicates.
- FIG. 12 is a view showing the results of confirming the degree of recovery of cardiac function according to the transplantation of cardiac stem cells or cardiac stem cell microspheres by echocardiography according to an embodiment of the present invention. ** indicates p ⁇ 0.01, *** indicates p ⁇ 0.001.
- FIG. 13 is a view showing the results of confirming the degree of recovery of cardiac function by echocardiography according to transplantation of cardiac stem cells/fibrin gel or cardiac stem cell microspheres/fibrin gel according to an embodiment of the present invention.
- * and # represent 0.05, ** and ## represent 0.01, and *** represents 0.001.
- the survival rate of the animal model, the degree of stem cell engraftment, and the differentiation of the transplanted stem cells into cardiomyocytes and vascular cells are promoted, It was confirmed that the heart tissue damaged due to myocardial infarction was effectively regenerated by the transplanted stem cells, and blood vessel formation was promoted, thereby remarkably improving the heart function. Therefore, it was confirmed that it can be effectively used as a cell therapeutic agent for various ischemic heart diseases.
- stem cell refers to a broad concept that collectively refers to undifferentiated cells having the ability to differentiate into various types of body tissue cells, that is, stemness. Such stem cells can be largely divided into embryonic stem cells, adult stem cells, gamete, cancer stem cells, etc. that can be manufactured using embryos. . Double cardiac stem cells (cardiac stem cells) are stem cells that exist in the heart and refer to stem cells with multifunctionality capable of differentiating into all cells constituting the heart.
- spheroid refers to a spherical cell mass produced by three-dimensional culture (3D culture) of cardiac stem cells.
- ischemic heart disease is a disease caused by insufficient blood supply to a part of the heart muscle due to narrowing of a blood vessel (coronary artery) supplying blood to the heart. It is characterized by abnormalities in the heart due to insufficient supply of oxygen and nutrients necessary for the heart due to insufficient blood supply. Unstable angina), variant angina, and acute myocardial infarction.
- prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of ischemic heart disease by administering the composition according to the present invention.
- treatment refers to any action in which symptoms of ischemic heart disease are improved or advantageously changed by administration of the composition according to the present invention.
- the term “individual” refers to a subject to which the composition of the present invention can be administered, and the subject is not limited.
- the term “pharmaceutical composition” may be characterized in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders, or beverages, and the pharmaceutical composition is intended for humans.
- the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
- Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, dyes, fragrances, etc., for oral administration, and in the case of injections, buffers, preservatives, pain-freezing agents A topical agent, solubilizer, isotonic agent, stabilizer, etc.
- the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
- a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
- it in the case of oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple doses. there is.
- examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like can be used.
- fillers, anti-agglomeration agents, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may be used.
- the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited thereto, but intrapericardial administration is preferable, for example, oral, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intraarterial, intramedullary, intrathecal , intracardiac, transdermal, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual, rectal, intrasternal, intralesional, intracranial, and the like.
- the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the activity of the specific compound used, age, weight, general health, sex, formula, administration time, administration route, excretion rate, drug formulation, and the severity of the specific disease to be prevented or treated. It may vary depending on factors, and may be appropriately selected by those skilled in the art although it varies depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug form, administration route and period, and 0.0001 to 500 mg/kg or 0.001 to 0.001 to 1 day It can be administered at 500 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
- Example 1 Preparation of myocardial infarction animal model and transplantation of cardiac stem cells
- MI myocardial infarction
- mice BALB/c male mice aged 10 to 12 weeks were anesthetized using 3% isoflurane. Then, the heart was confirmed through thoracotomy, and the proximal left anterior descending coronary artery was ligated using a 7-0 Prolene suture (Ethicon) to produce an animal model of myocardial infarction.
- Ethicon Prolene suture
- cardiac stem cells were injected into the myocardium (intramuscular, IM) or pericardial cavity (IP) of an animal model using a 27-gauge Hamilton syringe. More specifically, cardiac stem cells of 5X10 5 cells added to 15 ⁇ L of saline solution were injected into myocardium or pericardium, and the same amount of saline solution was injected as a control.
- IM intramuscular
- IP pericardial cavity
- ketoprofen was given as an analgesic to relieve postoperative pain and recover.
- ST segment increased and cardiac cyanosis appeared on the electrocardiogram (ECG) from 1 week after the transplant operation for ischemia.
- the black bar is the result of injection into the myocardium
- the gray bar is the result of intrapericardial injection.
- the intrapericardial injection significantly improved cardiac function. It was confirmed that the recovery was confirmed, and through this, it was confirmed that the effect of treating myocardial infarction could be improved by injecting cardiac stem cells into the pericardium.
- CSCs cardiac stem cells
- a culture medium (10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF), 2 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF), 10 ng/ml insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and 1% (v/v) antibiotics-antimycoplasmic reagent (AA) DMEM:F-12 (1:1 volume ratio)
- FBS fetal bovine serum
- EGF epidermal growth factor
- bFGF basic fibroblast growth factor
- IGF-1 insulin-like growth factor-1
- AA antibiotics-antimycoplasmic reagent
- microspheres were stained using LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit (Molecular ProbesTM), and the degree of cell viability was checked according to the number of cells contained in the microspheres. The results are shown in Figures 2A and 2B.
- FIGS. 2C and 2D it was confirmed that cardiac stem cell microspheres of uniform size with an average diameter of about 300 ⁇ m were prepared.
- FIGS. 2A and 2B when 5000 cells were included in the microsphere, and when the diameter became 500 ⁇ m or more, it was confirmed that apoptosis of the cells inside the microsphere was induced.
- each microsphere contains 200 cells or more and less than 5000 cells, or when the diameter of the microsphere is 10 to 500 ⁇ m, it is the most effective cardiac stem cell microsphere in which apoptosis is not induced. there was.
- a composition for intrapericardial injection using hydrogel 5X10 5 cells/mL cardiac stem cells or 5X10 5 cells/mL cardiac stem cells in 7.5 ⁇ L of thrombin solution (0.5 IU/mL). Cardiac stem cell microspheres were suspended, and 7.5 ⁇ L of fibrinogen concentrate (0.2 mg/mL) was added to the suspension and reacted to prepare a composition for intrapericardial injection of cardiac stem cell microspheres in gel form.
- Example 4 Transplantation of cardiac stem cells, cardiac stem cell microspheres, cardiac stem cells contained in hydrogel, or cardiac stem cell microspheres contained in hydrogel
- an animal model of myocardial infarction was prepared primarily in the same manner as in Example 1. And in the same manner as in the manufacture using a 5X10 5 cells / mL of cardiac stem cells, 5X10 5 cells / mL cardiac stem cells in the production MI animal model of cardiac stem cells, microspheres (CSC spheroid), or Example 3 15 ⁇ L each of cardiac stem cells (CSC+gel) contained in the prepared hydrogel or cardiac stem cell microspheres (CSC spheroid-Gel) contained in the hydrogel were placed in the pericardial cavity of 27 gauge Hamilton Samples were injected using a syringe.
- the “Sham” group is a normal mouse without any treatment
- the “Control” group is an animal model of myocardial infarction
- the “Saline” group is a control group injected with the same amount of saline solution
- the “CSC” group is The experimental group in which cardiac stem cells were injected
- the “CSC spheroid” group was the experimental group injected with the same amount of cardiac stem cell microspheres
- the “CSC+gel” group was the experimental group injected with the same amount of cardiac stem cells contained in the hydrogel
- the “CSC spheroid-Gel” group represents the experimental group in which the same amount of cardiac stem cell microspheres contained in the hydrogel was injected.
- ketoprofen was provided as an analgesic to relieve postoperative pain and recover.
- the survival rate of the myocardial infarction animal model transplanted in the same manner as in Example 4 was confirmed by the Kaplan-Meier curve. After that, all experiments were repeated at least three times, and the results were expressed as mean ⁇ standard deviation. Statistical significance was confirmed between two groups by Student's t-test, and between three or more groups using Bonferroni's comparison test after two-way ANOVA. If p ⁇ 0.05, it was judged to be statistically significant. The results are shown in FIG. 3 .
- the Control group showed a survival rate of about 48%
- the Saline group showed a survival rate of about 40% lower than that of the Control group, and about 59% in the case of transplanting cardiac stem cell microspheres.
- the survival rate did not decrease from the first week of transplantation, and it was confirmed that the survival rate was maintained at about 67% ( p ⁇ 0.01).
- the survival rate (1 week difference) which was reduced as myocardial infarction was induced, showed the effect of treating myocardial infarction when transplanting cardiac stem cell microspheres or cardiac stem cell microspheres contained in hydrogel. was confirmed to be maintained.
- FIG. 4 is a fluorescence micrograph confirming the fluorescence of DiR-labeled cardiac stem cell microspheres. It was confirmed that the fluorescence signal was observed only in the heart and not in other tissues such as the lung and liver. Through the above results, it was confirmed that cardiac stem cell microspheres were normally transplanted into the heart.
- FIG. 5A is a graph measuring the number of cells according to DiR fluorescence intensity
- FIG. 5B is a quantification of the retention rate of DiR-labeled cardiac stem cells present in the heart using the fluorescence intensity measured in the heart of an animal model. As a result, it was confirmed that the transplanted DiR-labeled cardiac stem cells gradually decreased and were not observed at all 4 weeks after transplantation.
- Figure 6 is the result of staining the cell nucleus using DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) in a heart tissue section and observing it using a fluorescence microscope, an animal model directly transplanted with cardiac stem cell microspheres ( When comparing the CSC spheroid) and the animal model (CSC spheroid-Gel) in which the cardiac stem cell microspheres contained in the hydrogel were transplanted, the cardiac stem cell microspheres or the cardiac stem cell microspheres contained in the hydrogel were transplanted. In one case, DiR-labeled cardiac stem cells were observed in all, and it was confirmed that the transplanted cardiac stem cells were alive for more than 3 weeks.
- DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole
- the cardiovascular differentiation efficiency of the transplanted cells was checked.
- the heart tissue section prepared in the same manner as in Example 5.2 was ⁇ -SA ( ⁇ -sarcomeric actinin) antibody (Abcam) or ⁇ -SMA ( ⁇ -smooth muscle actin) antibody (Abcam), Then, it was stained with DAPI and observed using a fluorescence microscope. The results are shown in FIG. 7 .
- ⁇ -SA and ⁇ -SMA were observed in the same portion as the DiR labeled cardiac stem cells.
- ⁇ -SA indicates differentiation into cardiomyocytes
- ⁇ -SMA indicates differentiation into vascular smooth muscle cells.
- the heart tissue section prepared in the same manner as in Example 5.2 was prepared with cTnI (cardiac troponin I) antibody (Abcam), ⁇ -SMA antibody (Abcam), and DAPI. was stained and observed using a fluorescence microscope. The results are shown in FIGS. 8 and 9 .
- FIG. 8 it was confirmed that the area stained by cTnI was significantly increased when cardiac stem cell microspheres were transplanted by intrapericardial injection. In particular, it was confirmed that the area stained by cTnI was significantly increased to 21.7% when cardiac stem cell microspheres contained in the hydrogel were transplanted into the pericardium. Through the above results, it was confirmed that the regeneration of myocardial cells was remarkably promoted when cardiac stem cell microspheres were transplanted into the pericardium. It was confirmed that it could be improved.
- H&E hematoxylin-eosin
- FIG. 10 in the Sham group, there is a stripe adjacent to the myofibril and shows the form of a branched normal heart tissue, but in the Control group, myocardial infarction is induced and the heart tissue is damaged. It was confirmed that it was not in the form of normal heart tissue. In addition, infiltration of inflammatory cells (infiltration), nuclei aggregation (aggregation), and necrosis was observed in cardiomyocytes. However, when cardiac stem cell microspheres or cardiac stem cell microspheres contained in hydrogel were injected into the pericardium, it was confirmed that cardiac tissue similar to the Sham group appeared.
- MT Masson's trichrome
- FIG. 11 in the case of an animal model in which myocardial infarction was induced, fibrosis was induced around the heart tissue and mostly blue, and the wall thickness of the left ventricle was reduced to about 0.5 mm, but cardiac stem cell microspheres themselves were transplanted. In one case, the degree of fibrosis was reduced, and the wall thickness of the left ventricle was increased again. In addition, when the cardiac stem cell microspheres were transplanted using the composition for intrapericardial injection of cardiac stem cell microspheres, the degree of fibrosis induction was reduced by more than half, and the thickness of the left ventricle wall was also increased more than twice to about 1.2 mm. .
- cardiac stem cell microspheres are transplanted into an animal model of myocardial infarction using the composition for intrapericardial injection of cardiac stem cell microspheres of the present invention
- cardiac stem cell microspheres are normally engrafted into the heart and stably It not only differentiates into cardiomyocytes or vascular smooth muscle cells, but also promotes the formation of myocardial cells and blood vessels in the surrounding damaged heart tissue, thereby effectively regenerating the damaged heart, thereby significantly increasing the therapeutic effect of ischemic heart disease. I was able to confirm that it could be done.
- cardiac function was confirmed using echocardiography. More specifically, the mouse was anesthetized, placed on a heating pad at 37 °C, and echocardiography was performed using the VEVO2100 micro-ultrasound system (Visual Sonics) equipped with an echocardiography probe (MS-400). The left ventricle (LV) was imaged with both parasternal long-axis and M-mode tracings, and cine loops of two-dimensional echocardiography were recorded. Ejection fraction (EF), fractional shortening (FS), left ventricle end diastolic diameter (LVEDD), and left ventricle end systolic diameter (LVESD) values were measured, respectively. Measurement time was measured before myocardial infarction, after myocardial infarction, and 1 week, 2 weeks, 3 weeks, and 4 weeks after cardiac stem cell transplantation. The results are shown in FIG. 12 .
- EF Ejection fraction
- FS fractional shortening
- LVEDD left ventricle end diastolic diameter
- cardiac function was confirmed using echocardiography in the same manner as in Example 5.5.
- the “Gel” group is a control group injected with the same amount of fibrin gel alone. The results are shown in FIG. 13 .
- the cardiac function which was lowered due to myocardial infarction, is significantly improved through intrapericardial injection, and through this, the cardiac stem cell of the present invention
- the composition for intrapericardial injection containing as an active ingredient it was confirmed that various ischemic heart diseases can be effectively treated.
- the use of cardiac stem cell microspheres or hydrogel not only promotes the survival rate of animal models, the degree of engraftment of cardiac stem cell microspheres, the differentiation of transplanted cardiac stem cell microspheres into cardiomyocytes and vascular cells, but also promotes myocardial infarction.
- the composition for intrapericardial injection of stem cells of the present invention implants stem cells through a method of injecting stem cells into the pericardium for use as a therapeutic agent, thereby increasing the engraftment rate and differentiation efficiency of stem cells, as well as recovery of damaged heart tissue and Since it can significantly increase the recovery of heart function, it is expected to significantly increase the treatment efficiency by applying it to the treatment of various ischemic heart diseases.
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Abstract
본 발명은 줄기세포를 포함하는 심막 내 주입용 조성물 및 이의 용도 등에 관한 것으로, 보다 자세하게는, 줄기세포를 심막 내로 효과적으로 이식하여, 줄기세포의 치료 효과를 향상시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 줄기세포를 포함하는 심막 내 주입용 조성물 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 배아, 태아, 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전의 미분화 세포들을 총칭한다. 다양한 종류의 줄기세포 중에서도 심장 줄기세포(cardiac stem cell)란 심장 내에 상주하는 세포로서, 심장을 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포를 지칭한다.
한편, 허혈성 심장질환(Ischemic heart disease)이란 심장에 혈액을 공급해주는 혈관(관상동맥)이 좁아져 심장 근육의 일부에 혈액 공급이 부족하여 발생되는 질환으로서, 최근 고령화 사회로의 급진적 변화로 인하여 발병률이 현저히 증가되고 있는 질환 중의 하나이다. 허혈성 심장질환으로는 협심증(angina pectoris), 심근경색(myocardial infarction) 등이 있으며, 이를 치료하기 위하여 약물치료, 혈관성형술, 심장 이식 등을 포함한 다양한 치료 방법이 시도되고 있으나, 아직 심장 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 방법은 부족한 실정이다.
최근에는 이러한 한계점을 극복하고자 줄기세포를 이용하여 심장 및 심근의 재생을 가능하게 하는 세포 치료(cell therapy)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 줄기세포를 체내에 이식한 후에 심장 조직으로의 분화효율을 현저히 낮을 뿐만 아니라, 이식된 줄기세포의 체내에서의 생존률이 낮아 실질적인 치료 방법으로 사용되기에는 한계점을 가지고 있다(대한민국등록특허 10-1915367).
따라서, 줄기세포를 이용하여 심근으로의 분화 효율을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 혈관의 신생을 촉진시킬 수 있는 효과적인 방법이 개발된다면, 줄기세포를 이용한 허혈성 심장질환의 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 줄기세포의 치료 효과를 향상시키기 위한, 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 심막 내 주입용 조성물 및 이의 용도 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 심막 내 주입용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 줄기세포 미세구일 수 있으며, 상기 줄기세포 미세구는 바람직하게는 10 내지 500 μm의 직경을 가질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 μm 이하인 것이 바람직하다. 또한, 상기 줄기세포 미세구는 바람직하게는 개당 100 내지 5000개의 세포를 포함하고 있을 수 있으며, 더욱 바람직하게는 300 내지 3000개의 세포를 포함할 수도 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 심막 내 주입용 조성물은 하이드로젤(hydrogel)을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 하이드로젤은 바람직하게는 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 콘드로이틴(chondroitin), 하알루로닉산(hyaluronic acid), 알지닌(alginic acid), 메트리젤(MatrigelTM), 키토산(chitosan), 펩티드(peptide), 피브린(fibrin), PGA(polyglycolic acid), PLA(polylactic acid), PEG(polyethylene glycol), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 등일 수 있으며, 상기 고분자 물질을 하나 이상 혼합하여 제조할 수도 있다. 그러나 일반적으로 심막 내로 주사하기 위한 용이한 형태의 하이드로젤이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 피브린 젤은 트롬빈(thrombin) 및 피브리노겐(fibrinogen)을 혼합하여 제조할 수 있으며, 상기 트롬빈은 바람직하게는 0.05 내지 5 IU/mL의 농도로 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 2 IU/mL일 수 있으며, 상기 피브리노겐은 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/mL의 농도로 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 5 mg/mL의 농도로 사용될 수 있으나, 일반적으로 피브린젤을 만드는데 사용되는 농도라면 제한되지 않는다. 그리고 상기 피브리노겐은 인간 유래 피브리노겐 농축물을 사용할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 바람직하게는 심근 유래 줄기세포(심장 줄기세포 또는 심장 전구세포), 골수 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 역분화줄기세포, 혈관내피전구세포, 조혈모세포, 신경줄기세포 등일 수 있으나, 허혈성 질환 치료용도로 사용될 수 있는 줄기세포라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 심막 내 주입용 조성물을 유효성분으로 포함하는 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 심막 내 주입용 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 심막 내 주입용 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 허혈성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 심막 내 주입용 조성물의 허혈성 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 허혈성 심장질환은 바람직하게는 심근경색, 협심증 등일 수 있으나, 심근 세포로의 분화 촉진, 심장 혈관 형성 촉진 등으로 인하여 치료할 수 있는 심장 질환이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 심막 내 주입용 조성물을 이용하여 줄기세포를 이식한 경우에는 동물모델의 생존률, 줄기세포의 생착 정도, 이식된 줄기세포의 심근 세포 및 혈관 세포로의 분화 등이 촉진될 뿐만 아니라, 심근경색으로 인하여 손상되었던 심장 조직이 이식된 줄기세포로 인하여 효과적으로 재생되고, 혈관 형성이 촉진되어 심장 기능을 효과적으로 회복시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 심막 내 주입용 조성물을 이용하여 줄기세포를 다양한 허혈성 심장 질환의 치료제로 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 심근경색 동물모델에 심장줄기세포를 심근 내 또는 심낭 내 이식한 후, 심장 기능의 회복 정도를 심초음파로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. **는 p < 0.01을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장줄기세포 미세구를 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 백색 바는 100 μm를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 심근경색 동물모델에 심장줄기세포 미세구를 이식한 후, 생존률을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 심근경색 동물모델에 심장줄기세포 미세구를 이식한 후, 심장줄기세포 미세구가 심장 내에 정상적으로 생착했는지 여부를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5A는 본 발명의 일 실시예에 따른 DiR 형광 강도에 따른 세포 수를 측정한 결과를 나타내며, 도 5B는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장 내 심장줄기세포의 수를 형광 강도에 따라 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예 따른 심장줄기세포 미세구의 이식 방법에 따른 생착률을 비교한 결과를 나타낸 도면으로, 백색 바는 20 μm를 나타내며, *는
p < 0.05를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 이식된 심장줄기세포의 분화 여부를 면역염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 백색 바는 20 μm를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 심장줄기세포 미세구 이식 방법에 따른 심근 세포의 재생 효과를 면역염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 백색 바는 50 μm를 나타내며, *는 Control 그룹과의
p value가 0.05 미만인 것을 나타내며, **는 Control 그룹과의
p value가 0.01 미만인 것을 나타내며, # 는 CSC spheroid 그룹과의
p value가 0.01 미만인 것을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장줄기세포 미세구 이식 방법에 따른 심장 혈관의 재생 효과를 면역염색법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 백색 바는 50 μm를 나타내며, **는 Control 그룹과의
p value를 나타내며
p < 0.01인 것을 나타내며, # 는 CSC spheroid 그룹과의
p value를 나타내며
p < 0.01인 것을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 심장줄기세포 미세구 이식 방법에 따른 손상된 심장 조직의 회복 정도를 H&E 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 흑색 바는 50 μm를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 심장줄기세포 미세구 이식 방법에 따른 손상된 심장 조직의 회복 정도를 MT 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 흑색 바는 50 μm를 나타내며, *는 Control 그룹과의
p value가 0.05 미만인 것을 나타내며, **는 Control 그룹과의
p value가 0.01 미만인 것을 나타내며, # 는 CSC spheroid 그룹과의
p value가 0.01 미만인 것을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 심장줄기세포 또는 심장줄기세포 미세구 이식에 따른 심장 기능의 회복 정도를 심초음파로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. **는 p < 0.01을 나타내며, ***는 p < 0.001을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 심장줄기세포/피브린 젤 또는 심장줄기세포 미세구/피브린 젤 이식에 따른 심장 기능의 회복 정도를 심초음파로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. *와 #는 0.05를 나타내며, **와 ##는 0.01을 나타내며, ***는 0.001을 나타낸다.
본 발명의 줄기세포 심막 내 주입용 조성물을 이용하여 줄기세포를 이식할 경우, 동물모델의 생존률, 줄기세포의 생착 정도, 이식된 줄기세포의 심근 세포 및 혈관 세포로의 분화가 촉진될 뿐만 아니라, 심근경색으로 인하여 손상되었던 심장 조직이 이식된 줄기세포로 인하여 효과적으로 재생되고, 혈관 형성이 촉진되어 심장 기능이 현저히 향상되는 것을 확인하였다. 따라서, 다양한 허혈성 심장질환의 세포 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
본 명세서에 있어서, "줄기세포(stem cell)"란 여러 종류의 신체 조직 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포성(stemness)을 가진 미분화 세포를 총칭하는 광의의 개념을 말한다. 이러한 줄기세포는 크게 배아를 이용하여 제조할 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 생식세포(gamete), 암 줄기세포(cancer stem cell) 등으로 나뉠 수 있다. 이중 심장 줄기세포(cardiac stem cell)은 심장 내에 존재하는 줄기세포로서 심장을 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포를 지칭한다.
본 명세서에 있어서, “미세구(spheroid)”란 심장 줄기세포를 입체 배양(3D 배양)하여 제조된 구체 형태의 세포괴를 총칭한다.
본 명세서에 있어서, “허혈성 심장질환(Ischemic heart disease)”이란 심장에 혈액을 공급해주는 혈관(관상동맥)이 좁아져서 심장근육의 일부에 혈액 공급이 부족하여 발생하는 질환이다. 혈액 공급이 부족하여 심장에 필요한 산소와 영양소가 제대로 공급되지 않게 되어 심장에 이상이 생기는 것이 특징이며, 허혈성 심장질환의 종류로는 심근경색 및 협심증, 구체적으로 안정성 협심증(Stable angina), 불안정성 협심증(Unstable angina), 이형 협심증(Variant angina), 급성 심근경색증(Acute myocardial infarction) 등이 있다.
본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 허혈성 심장질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "치료(treatment)"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 허혈성 심장질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, “개체(individual)”란 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”이란 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 당의정, 겔, 환제, 산제, 과립제, 좌제, 외용제, 용액, 현탁액, 서방형 제제, 슬러리 등으로 제형화하여 사용할 수도 있다. 한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 심막 내 투여가 바람직하며, 예를 들어, 구강, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피내, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하, 직장, 흉골내, 병소내, 두개골내 등이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 500 mg/kg 또는 0.001 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 심근경색 동물모델의 제작 및 심장줄기세포의 이식
모든 동물의 취급 및 절차는 이화여자대학교의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻은 연구 프로토콜에 따라 수행하였다(IACUC 번호: 18-073). 심근경색(myocardial infarction, MI) 동물 모델을 제작하기 위하여, 10 내지 12 주령의 BALB/c 수컷 마우스를 3% 이소플라본(isoflurane)을 이용하여 마취시켰다. 그리고 개흉술을 통해 심장을 확인하고, 근위 좌측 전방 하행 관상 동맥(proximal left anterior descending coronary artery)을 7-0 Prolene 봉합사(Ethicon)를 이용하여 결찰(ligation)시켜, 심근경색 동물모델을 제작하였다.
그리고 심장줄기세포를 이식하기 위하여, 동물모델의 심근(intramuscular, IM) 또는 위심강(pericardial cavity, IP)에 27 게이지 해밀톤 시린지를 이용하여 심장줄기세포를 주사하였다. 보다 자세하게는, 15 μL의 염류용액에 첨가된 5X10
5 cells의 심장줄기세포를 심근 또는 심막 내 주입하고, 대조군으로는 염류용액을 동량 주사하였다.
이식이 완료된 후, 가슴 및 피부를 닫고, 진통제로 2 내지 5 mg/kg s.c의 케토프로펜(ketoprofen)을 제공하여 수술 후 통증을 경감시키며 회복시켰다. 그리고 허혈(ischemia) 여부는 이식 수술 후, 1 주일부터 심전도(ECG) 상에서 ST segment가 증가되고, 심장 청색증(cyanosis)이 나타나는 것으로 확인하였다.
심장줄기세포 이식 방법에 따른 치료 효과를 확인하기 위하여, 심장 기능을 심초음파를 이용하여 확인하였다. 보다 자세하게는, 이식 후 2 주일 후에 마우스를 마취시키고, 37 ℃의 heating pad 위에 눕히고, echocardiography probe(MS-400)이 장착된VEVO2100micro-ultrasound system(Visual Sonics)를 이용하여 심초음파를 실시하였다. 좌심실(LV)은 parasternal long-axis 및 M-mode tracings을 모두 이미지화하였으며, 2차원 심초음파의 cine loops를 기록하였다. 박출율(ejection fraction, EF), 부분 단축(fractional shortening, FS) 값을 각각 측정하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 흑색 바는 심근에 주사한 결과이며, 회색 바는 심막 내 주사한 결과로서, 심장줄기세포를 심근에 주사한 경우과 비교하여, 심막 내 주사한 경우에 유의성있게 심장 기능이 회복된 것을 확인하으며, 이를 통하여, 심장줄기세포를 심막 내 주입함으로써 심근경색 치료 효과를 향상시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 심장줄기세포 미세구의 제작
심장줄기세포(cardiac stem cells, CSCs)의 미세구(spheroid)를 제조하기 위하여, 일차적으로 인간 유래 심장줄기세포를 배양액(10%(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 10 ng/ml epidermal growth factor(EGF), 2 ng/ml basic fibroblast growth factor(bFGF), 10 ng/ml insulin-like growth factor-1(IGF-1) 및 1%(v/v) antibiotics-antimycoplasmic reagent(AA)가 DMEM:F-12(1:1 volume ratio))이 담긴 T-75 플라스크에 접종하고, 5% CO
2, 37℃배양기에서 밀집도(confluence)가 80%에 도달할 때까지 배양한 후, 계대 배양하였다. 11번 계대배양한 심장줄기세포를 각각 2.5X10
5, 5X10
5, 7.5X10
5, 1X10
6 cells/mL의 농도가 되도록 1%(v/v) 송아지 혈청(calf serum, CS), 0.1%(v/v) DMSO, 및 50 μg/mL의 아스코르브산(ascorbic acid)이 첨가된 DMEM with low glucose가 담겨있는 Ultra-Low Attachment Surface 6 well culture plate(Corning)에 접종하고 3일 동안 배양하여, 심장줄기세포 미세구를 제작하였다. 각각의 세포 수에 따라 생성된 미세구의 크기는 광학 현미경으로 생성된 미세구의 직경을 측정하여 나타내었다. 그 결과는 도 2C 및 2D에 나타내었다. 그리고 형성된 미세구를 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Assay Kit(Molecular Probes™)를 이용하여 염색한 후, 미세구 내에 포함되어 있는 세포의 수에 따른 세포의 생존 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 2A 및 2B에 나타내었다.
도 2C 및 2D에 나타난 바와 같이, 평균 직경이 300 μm 정도 되는 균일한 크기의 심장줄기세포 미세구가 제작된 것을 확인하였다. 또한, 도 2A 및 2B에 나타난 바와 같이, 미세구에 5000개의 세포가 포함되었을 때, 그리고 직경이 500 μm 이상이 되었을 때, 미세구 내부의 세포가 사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 미세구 각각에 200 cells 이상, 그리고 5000 cells 미만으로 포함되었을 때, 또는 미세구의 직경이 10 내지 500 μm일 때, 세포 사멸이 유도되지 않는 가장 효과적인 심장줄기세포 미세구임을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 하이드로젤을 이용한 미세구 심막 내 주입용 조성물의 제작
하이드로젤을 이용한 심막 내 주입용 조성물을 제조하기 위하여, 7.5 μL의 트롬빈용액(0.5 IU/mL)에 5X10
5 cells/mL의 심장줄기세포 또는 5X10
5 cells/mL의 심장줄기세포를 이용하여 제조된 심장줄기세포 미세구를 현탁하고, 상기 현탁액에 7.5 μL의 피브리노겐 농축물(0.2 mg/mL)을 첨가하고, 반응시켜 젤 형태의 심장줄기세포 미세구 심막 내 주입용 조성물을 제작하였다.
실시예 4: 심장줄기세포, 심장줄기세포 미세구, 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포, 또는 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 미세구의 이식
심장줄기세포 미세구를 이식하기 위하여, 일차적으로 실시예 1과 동일한 방법으로 심근경색 동물모델을 제작하였다. 그리고 제작된 심근경색 동물 모델에 5X10
5 cells/mL의 심장줄기세포, 5X10
5 cells/mL의 심장줄기세포를 이용하여 제조된 심장줄기세포 미세구(CSC spheroid), 또는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조된 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포(CSC+gel), 또는 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 미세구(CSC spheroid-Gel)를 각각 15 μL씩 위심강(pericardial cavity)에 27 게이지 해밀톤 시린지를 이용하여 시료를 주사하였다. 이하, 모든 실험들에서 “Sham” 그룹은 어떠한 처치도 하지 않은 정상 마우스이고, “Control” 그룹은 심근경색 동물모델이고, “Saline” 그룹은 염류용액을 동량 주사한 대조군이고, “CSC” 그룹은 심장줄기세포를 주사한 실험군이고, “CSC spheroid” 그룹은 심장줄기세포 미세구를 동량 주사한 실험군이고, “CSC+gel” 그룹은 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포를 동량 주사한 실험군이고, “CSC spheroid-Gel” 그룹은 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 미세구를 동량 주사한 실험군을 나타낸다.
그리고 이식이 완료된 후, 가슴 및 피부를 닫고, 진통제로 2 내지 5 mg/kg s.c의 케토프로펜(ketoprofen)을 제공하여 수술 후 통증을 경감시키며 회복시켰다.
실시예 5: 심장줄기세포 미세구 심막 내 주입용 조성물의 치료 효과 확인
5.1. 동물모델의 생존률 확인
실시예 4와 동일한 방법으로 이식된 심근경색 동물모델의 생존률을 Kaplan-Meier 커브로 확인하였다. 이후 모든 실험은 최소 세 번 이상 반복하였으며, 결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 두 개의 그룹 간에는 Student's t-test로 확인하였고, 세 개 이상의 그룹 간에는two-way ANOVA 후 Bonferroni's comparison test 를 이용하여 확인하였다.
p < 0.05이면, 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 4 주일 차에 Control 그룹은 48% 정도의 생존률을 나타내며, Saline 그룹은 Control 그룹보다 낮은 40% 정도의 생존률을 나타내며, 심장줄기세포 미세구를 이식한 경우에는 59% 정도의 생존률을 나타내는 반면, 심장줄기세포 미세구의 심막 내 주입용 조성물을 이식한 경우에는 처음 이식한 1 주차에서부터 생존률이 감소되지 않고, 67% 정도의 생존률을 유지하는 것을 확인하였다(
p<0.01). 상기 결과를 통하여, 심근경색이 유도됨에 따라 감소되었던 생존률(1 주일 차)이 심장줄기세포 미세구 또는 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 미세구를 이식한 경우에 심근경색 치료 효과를 나타내어 생존률이 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
5.2. 이식된 심장줄기세포 미세구의 생착 여부 확인
이식된 심장줄기세포 미세구에 의한 허혈성 심장 질환 치료 효과를 확인하기 위하여, 이식된 세포의 생착 여부를 DiR을 이용하여 확인하였다. 보다 자세하게는, IVIS-100 imaging system(Caliper Life Science)를 이용하여 살아있는 동물모델의 형광을 관찰하였다. 형광 강도는 photons/cm
2 per second로 산출하였다. 그리고 심장 조직 염색을 위해서는, 심장줄기세포 미세구를 이식한 동물모델을 4 주 후에 안락사시킨 후에 심장 조직을 추출하였다. 그리고 추출된 심장 조직은 4% 파라포름알데히드 용액을 이용하여 고정시키고, 파라핀을 이용하여 embedding시킨 후 0.4 μm 두께로 잘라 심장 조직 절편을 제조하여 사용하였다. 그 결과는 도 4 내지 6에 나타내었다.
도 4는 DiR-labeled 심장줄기세포 미세구의 형광을 확인한 형광 현미경 사진으로, 형광 신호가 심장에서만 관찰되며, 폐, 간 등 다른 조직에서는 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 심장줄기세포 미세구가 정상적으로 심장에 이식된 것을 확인하였다.
도 5A는 DiR 형광 강도에 따른 세포 수를 측정한 그래프이고, 도 5B는 동물 모델의 심장에서 측정된 형광 강도를 이용하여 심장 내에 존재하는 DiR-labeled 심장줄기세포의 보유율(retention rate)을 정량화한 것으로, 이식된 DiR-labeled 심장줄기세포가 점차 감소하여 이식 후 4주차에는 전혀 관찰되지 않는 것을 확인하였다.
도 6은 심장 조직 절편을 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 세포핵을 염색하고, 형광 현미경을 이용하여 관찰한 결과로, 심장줄기세포 미세구를 직접 이식한 동물모델(CSC spheroid)과 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 미세구를 이식한 동물모델(CSC spheroid-Gel)을 비교하였을 때, 심장줄기세포 미세구 또는 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 미세구를 이식한 경우, 모두 DiR labeled 심장줄기세포가 관찰되었으며, 이를 통하여, 3주 이상 이식된 심장줄기세포가 생존해있는 것을 확인할 수 있었다.
5.3. 이식된 심장줄기세포 미세구의 분화 여부 확인
이식된 심장줄기세포 미세구에 의한 허혈성 심장 질환 치료 효과를 확인하기 위하여, 이식된 세포의 심혈관 분화 효율을 확인하였다. 심혈관 분화 효율을 확인하기 위하여, 상기 실시예 5.2와 동일한 방법으로 준비된 심장 조직 절편을 α-SA(α-sarcomeric actinin) 항체(Abcam) 또는 α-SMA(α-smooth muscle actin) 항체(Abcam), 그리고 DAPI를 이용하여 염색하고 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, DiR labeled 심장줄기세포와 동일한 부분에서 α-SA와 α-SMA가 관찰되는 것을 확인하였다. α-SA는 심근 세포(cardiomyocyte)로 분화되었음을 나타내며, α-SMA는 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell)로 분화되었음을 의미한다. 상기 결과를 통하여, 이식된 심장줄기세포가 심장 내에 안정적으로 생착되어 심장근육세포 및 혈관평활근세포로 분화되었음을 확인할 수 있었다.
5.4. 심장줄기세포 미세구 이식에 따른 심장 재생 효과 확인
심장줄기세포 미세구 이식에 따른 심장 재생 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 5.2와 동일한 방법으로 준비된 심장 조직 절편을 cTnI(cardiac troponin I) 항체(Abcam), α-SMA 항체(Abcam), 그리고 DAPI를 이용하여 염색하고 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과는 도 8 및 9에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 심장줄기세포 미세구를 심막 내 주입 방식으로 이식한 경우에 cTnI에 의하여 염색된 면적이 유의성 있게 증가되는 것을 확인하였다. 특별히, 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 미세구를 심막 내 이식한 경우에 cTnI에 의하여 염색된 면적이 21.7%로 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 심장줄기세포 미세구를 심막 내 이식한 경우에 심근 세포(myocardial cell)의 재생성이 현저히 촉진되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여, 허혈성 심장 질환에서 심근 세포의 생성을 촉진시켜 치료 효과를 향상시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 심장줄기세포 미세구 자체를 이식한 경우에도 α-SMA 양성 세포가 Control 그룹과 비교하여 증가되나, 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 미세구를 심막 내 주입한 경우에 α-SMA 양성 세포가 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 본 발명의 심장줄기세포 미세구를 심막 내 주입함으로써 심장 혈관의 생성을 촉진시킬 수 있으며, 이를 통하여, 허혈성 심장 질환에서 심장 혈관의 재생성을 촉진시켜 치료 효과를 향상시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, hematoxylin-eosin(H&E) stain(Abcam)을 이용하여 심장 조직 절편을 염색하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, Sham 그룹의 경우에는 근원섬유(myofibril)와 인접하여 줄무늬가 있으며 분지된 형태의 정상적인 심장 조직의 형태를 나타내나, Control 그룹에서는 심근 경색이 유도되어, 심장 조직이 손상되어 정상적인 심장 조직의 형태가 아닌 것을 확인하였다. 또한, 염증성 세포들(inflammatory cells)이 침투(infiltration)되고, 핵이 응집(aggregation)되고, 심근 세포에서 necrosis가 관찰되었다. 그러나 심장줄기세포 미세구 또는 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 미세구를 심막 내 주입한 경우에는 Sham 그룹과 유사한 형태의 심장 조직이 나타남을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 심장줄기세포 미세구를 심막 내 주입함으로써, 정상 마우스와 유사한 정도로 심장이 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 더욱이 면역 억제제(immunosuppressive drug)의 사용 없이도 면역 거부반응(immune rejection)이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
또한, Masson's trichrome(MT) stain(Polysciences)를 이용하여 심장 조직 절편을 염색하여, 섬유증(fibrosis) 정도와 좌심실(left ventricular, LV)의 벽 두께(wall thickness)를 정량하였다. 현미경 이미지에서 청색은 콜라겐 파이버(collagen fiber)를 나타내며, 적색은 근세포(myocyte)를 나타낸다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 심근 경색이 유도된 동물모델의 경우에는 심장 조직의 주변으로 섬유증이 유발되어 대부분 청색을 띠며, 좌심실의 벽 두께가 0.5 mm 정도로 감소되었으나, 심장줄기세포 미세구 자체를 이식한 경우에는 섬유증의 유발 정도가 감소되었으며, 좌심실의 벽 두께는 다시 증가된 것을 확인하였다. 그리고 심장줄기세포 미세구의 심막 내 주입용 조성물을 이용하여 심장줄기세포 미세구를 이식한 경우에는 섬유증이 유발 정도가 반 이상으로 감소하였으며, 좌심실 벽 두께도 1.2 mm 정도로 2배 이상 증가된 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 심장줄기세포 미세구의 심막 내 주입용 조성물을 이용하여 심근경색 동물모델에 심장줄기세포 미세구를 이식한 경우에는 심장줄기세포 미세구가 정상적으로 심장에 생착되어, 안정적으로 심장근육세포 또는 혈관평활근세포로 분화될 뿐만 아니라, 주변에 손상된 심장 조직 내에서도 심근 세포의 생성과 혈관 생성을 촉진시켜 손상된 심장을 효과적으로 재생시킬 수 있으며, 이를 통하여, 허혈성 심장질환의 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
5.5. 심장줄기세포 또는 심장줄기세포 미세구 이식에 따른 심장 기능 확인
심장줄기세포 또는 심장줄기세포 미세구 이식에 따른 치료 효과를 확인하기 위하여, 심장 기능을 심초음파를 이용하여 확인하였다. 보다 자세하게는, 마우스를 마취시키고, 37 ℃의 heating pad 위에 눕히고, echocardiography probe(MS-400)이 장착된VEVO2100micro-ultrasound system(Visual Sonics)를 이용하여 심초음파를 실시하였다. 좌심실(LV)은 parasternal long-axis 및 M-mode tracings을 모두 이미지화하였으며, 2차원 심초음파의 cine loops를 기록하였다. 박출율(ejection fraction, EF), 부분 단축(fractional shortening, FS), 좌심실 이완기 말단 직경(left ventricle end diastolic diameter, LVEDD), 및 좌심실 수축기 말단 직경(left ventricle end systolic diameter, LVESD) 값을 각각 측정하였으며, 측정 시기는 심근경색 유도 전, 심근경색 유도 후, 그리고 심장줄기세포 이식 후 1 주일 후, 2주일 후, 3주일 후 및 4 주일 후 각각에 측정하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 4 주 차 결과를 보면, 심근 경색이 유도된 Control 그룹, Saline 그룹과 Gel 그룹의 경우에는 심실벽의 편평화에 의하여 비정상적인 격벽 운동(septal motion)이 관찰되나, 심장줄기세포 또는 심장줄기세포 미세구를 심막 내 주입한 경우에는 격벽 운동이 회복되며, 심근 경색이 유도되어 감소되었던 박출율과 부분 단축 정도가 다시 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 심장줄기세포 또는 심장줄기세포를 심막 내 주입 방식으로 이식함으로써, 심장 기능의 회복이 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
5.6. 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 또는 심장줄기세포 미세구 이식에 따른 심장 기능 확인
하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 또는 심장줄기세포 미세구 이식에 따른 치료 효과를 확인하기 위하여, 실시예 5.5와 동일한 방법으로 심장 기능을 심초음파를 이용하여 확인하였다. “Gel” 그룹은 피브린 젤만을 동량 주사한 대조군이다. 그 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 4 주 차 결과를 보면, Gel 그룹의 경우에는 심실벽의 편평화에 의하여 비정상적인 격벽 운동(septal motion)이 관찰되나, 하이드로젤에 포함되어 있는 심장줄기세포 또는 심장줄기세포 미세구를 심막 내 주입 방식으로 이식한 경우에는 격벽 운동이 심근 경색이 유도되기 전과 유사할 정도로 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 심근 경색이 유도되어 감소되었던 박출율과 부분 단축 정도가 다시 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 일반적으로 줄기세포를 이식하기 위하여 사용되는 심근 내 주사 방식과 비교하여, 심막 내 주입을 통하여 심근 경색에 의하여 저하되었던 심장 기능이 현저히 향상되며, 이를 통하여, 본 발명의 심장줄기세포를 유효성분으로 포함하는 심막 내 주입용 조성물을 이용함으로써, 다양한 허혈성 심장 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 더욱이 심장줄기세포 미세구, 또는 하이드로젤을 이용함으로써 동물모델의 생존률, 심장줄기세포 미세구의 생착 정도, 이식된 심장줄기세포 미세구의 심근 세포 및 혈관 세포로의 분화가 촉진될 뿐만 아니라, 심근경색으로 인하여 손상되었던 심장 조직이 이식된 심장줄기세포 미세구로 인하여 효과적으로 재생되고, 혈관 형성이 촉진되어 심장 기능이 현저히 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 심막 내 주입용 조성물을 이용하여 다양한 허혈성 심장 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 줄기세포 심막 내 주입용 조성물은 줄기세포를 치료제로 사용하기 위하여 심막 내로 주입하는 방식을 통하여 줄기세포를 이식함으로써, 줄기세포의 생착률 및 분화 효율을 높일 뿐만 아니라, 손상된 심장 조직의 회복 및 심장 기능의 회복을 현저히 증가시킬 수 있기 때문에 다양한 허혈성 심장 질환의 치료에 적용함으로써 치료 효율을 현저히 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.
Claims (11)
- 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 심막 내 주입용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 줄기세포는 줄기세포 미세구인 것을 특징으로 하는, 심막 내 주입용 조성물.
- 제 2 항에 있어서,상기 줄기세포 미세구는 10 μm 내지 500 μm의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는, 심막 내 주입용 조성물.
- 제 2 항에 있어서,상기 줄기세포 미세구는 미세구당 100 내지 5000개의 세포를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는, 심막 내 주입용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 심막 내 주입용 조성물은 하이드로젤(hydrogel)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 심막 내 주입용 조성물.
- 제 5 항에 있어서,상기 하이드로젤은 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 콘드로이틴(chondroitin), 하알루로닉산(hyaluronic acid), 알지닌(alginic acid), 메트리젤(MatrigelTM), 키토산(chitosan), 펩티드(peptide), 피브린(fibrin), PGA(polyglycolic acid), PLA(polylactic acid), PEG(polyethylene glycol) 및 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 심막 내 주입용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 줄기세포는 심근 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 역분화줄기세포, 혈관내피전구세포, 조혈모세포, 신경줄기세포, 및 심장 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이상인 것을 특징으로 하는, 심막 내 주입용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 심막 내 주입용 조성물을 유효성분으로 포함하는, 허혈성 심장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 8 항에 있어서,상기 허혈성 심장질환은 심근경색 또는 협심증인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 심막 내 주입용 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 심막 내 주입용 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 허혈성 질환의 예방 또는 치료 용도.
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