WO2021150066A1 - 낙지 유래 펩타이드를 함유하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물 - Google Patents

낙지 유래 펩타이드를 함유하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2021150066A1
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octominin
inflammatory
lps
amino acid
seq
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황일선
류보미
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국립해양생물자원관
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating inflammatory diseases containing an octopus-derived peptide, and more particularly, to a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising octominin, an octopus-derived peptide that exhibits anti-inflammatory effects in macrophages, as an active ingredient. it's about
  • Marine ecosystems are a rich and potential therapeutic source for structurally unique and novel bioactive compounds.
  • peptides are important physiologically active natural products found in many marine organisms, and recently, due to new chemical properties and various biological properties, considerable attention has been focused on identifying physiologically active marine peptides.
  • a marine organism-derived peptide having physiologically active properties such as ROS scavenging, lipid peroxidation, antimicrobial, anticancer, antiviral, antihypertensive, antidiabetic, anti-inflammatory and anticoagulant properties was found (Cheung, RC et al.
  • Inflammation is a complex biological process that is evolutionarily conserved in response to disruption of tissue homeostasis due to the presence of biological, physical or chemical stimuli.
  • the innate adaptive immune system coordinates the inflammatory response to control tissue damage or pathogen attack.
  • an uncontrolled or prolonged inflammatory response contributes to the pathogenesis of inflammatory diseases, including cancer and tissue damage.
  • TLRs toll-like receptors
  • TLR2 and TLR4 expressed in macrophages in response to LPS activate NF- ⁇ B of activated B cells, and were found to be associated with the development of inflammatory diseases. Activation of the NF- ⁇ B transcription factor then leads to transcription of genes involved in inflammatory mediators such as nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX2), cytokines (IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF- ⁇ ) and chemokines. (CCL3, CCL4, CCL5 and CXCL10).
  • iNOS nitric oxide synthase
  • COX2 cyclooxygenase
  • COX2 cyclooxygenase
  • IL-1 ⁇ IL-1 ⁇
  • IL-6 and TNF- ⁇ chemokines
  • Pro-inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 produced during the inflammatory response have been shown to contribute to the pathogenesis of diseases such as disc degeneration, epilepsy, osteoarthritis, cancer initiation and progression, and depression. It has been reported, and upregulates chemokine secretion from macrophages. Chemokines are small (7-13 kDa) heparin binding proteins and have been shown to play important roles during acute and chronic inflammatory responses.
  • chemokines such as CCL3 (macrophage inflammatory protein 1 ⁇ , or MIP-1 ⁇ ), CCL4 (MIP-1 ⁇ ), CCL5 (RANTES), and CXCL10 produced during the inflammatory response mainly act as attractants for leukocytes (monocytes and neutrophils). It acts as a mediator of chronic and acute inflammation.
  • chemokines causes diseases such as osteoarthritis, liver disease and cancer.
  • overexpression of iNOS and COX2 in tissues leads to the production of NO and PGE2, where these mediators are involved in a number of inflammatory It has been shown to play a pivotal role in the development of the disease.
  • octopus (Octopus minor) has a smaller body and shorter lifespan than other octopus species, has thin legs, and is widely distributed along the coasts of East Asian countries such as Korea, Japan, and China. As an economically important seafood, research on it is in progress.
  • most of the studies performed on octopus were limited to genomic studies, co-culture techniques, and nutritional analysis, and studies on their bioactive properties such as anti-inflammatory, anti-cancer and antioxidant properties were limited.
  • the present inventors made diligent efforts to find natural substances exhibiting anti-inflammatory effects from octopus.
  • TLR-mediated NF- ⁇ B transcription was inhibited, resulting in an anti-inflammatory effect. It confirmed that it shows, and completed the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases containing an antibacterial peptide as an active ingredient, characterized in that it has five or more consecutive amino acid sequences in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an inflammatory disease comprising administering the antibacterial peptide.
  • the present invention provides the use of the antibacterial peptide for the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention also provides the use of said antibacterial peptide for the manufacture of a therapeutic agent for inflammatory diseases.
  • helical wheel of octominin is the amino acid sequence and number of residues counted from the amino (N) terminus of the peptide indicates. Circles indicate hydrophilic residues, diamonds (diamonds) indicate hydrophobic residues, and pentagons indicate positively charged residues. Most of the hydrophobic residues are green, the amount of green decreases in proportion to the hydrophobicity, and 0 hydrophobicity is shown in yellow. Potentially filled residues are shown in light blue. (b) shows the 3D structure of octominin with positively charged amino acid residues.
  • Figure 2 shows the results of examining the cytoprotective and NO inhibitory effects of octominin on LPS-activated RAW 264.7 macrophages, a is cytotoxicity of octominin in macrophages, b is NO production; C shows the cytoprotective effect of octominin in LPS-activated macrophages, and d shows the NO inhibitory effect of octominin.
  • Figure 4 shows the results of confirming by qPCR whether octominin inhibits the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines in LPS-activated RAW 264.7 macrophages (IL-1 ⁇ (a), IL-6 (b), TNF- ⁇ ) (c), CCL3 (d), CCL4 (e), CCL5 (f) and CXCL10 (g)).
  • the experiment was repeated three times to evaluate the data, and the mean value was expressed as ⁇ SD.
  • mRNA significance for vehicle-treated controls was calculated using the Mann-Whitney U test (# ⁇ 0.05 and ## ⁇ 0.01) or LPS-treated groups (* ⁇ 0.05 and ** ⁇ 0.01).
  • a is the relative mRNA expression level using the qPCR result of iNOS
  • b is the relative mRNA expression level using the PCR result of COX2 mRNA expression level is shown.
  • c shows the protein expression level as a result of using western blot of iNOS and COX2
  • d shows the result of analyzing the related expression of the c band using ImageJ software.
  • a is the relative mRNA expression level using the qPCR result of TLR2
  • b is It shows the relative mRNA expression level using the PCR result of TLR4.
  • c shows the Western blot results of the cytoplasmic protein extract
  • d shows the Western blot results of the nuclear protein extract. Antibodies to ⁇ -actin and nucleolin, respectively, were used to control the same protein loading in the cytoplasmic and nuclear extracts.
  • a is a 2D diagram of octominin
  • b is a structure in which octominin is docked to the crystal structure of the TLR4 / MD-2 complex
  • c shows the amino acid binding site of the TLR4/MD-2 complex and octominin.
  • octominin a novel peptide derived from octopus, can alleviate inflammation induced by LPS by down-regulating NO, PGE2, pro-inflammatory cytokines and chemokines of macrophages.
  • octominin can reduce the inflammatory response in macrophages activated by LPS (lipopolysaccharide) by blocking the downstream activation of TLR / NF-kB signaling.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases containing an antibacterial peptide as an active ingredient, characterized in that it has five or more consecutive amino acid sequences in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the antibacterial peptide is a peptide having 5 or more, preferably 7 or more, more preferably 10 or more, most preferably 18 or more consecutive amino acid sequences in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. and preferably comprises an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are conservatively substituted in a peptide having a contiguous amino acid sequence of at least 7, more preferably at least 10, and most preferably at least 18 consecutive amino acids.
  • Conservative amino acid substitutions may include substitutions with amino acid residues that have little or no effect on the size, polarity, inversion hydrophobicity or hydrophilicity of the amino acid residue.
  • the antibacterial peptide according to the present invention contains 5 or more, preferably 7 or more, more preferably 10 or more, most preferably 18 or more consecutive sequences in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It may be characterized as having an amino acid sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more homology to the amino acid sequence.
  • the antibacterial peptide according to the present invention preferably comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and may be characterized as comprising 18 to 23 consecutive amino acid residues, more preferably SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 It can be characterized as represented by the amino acid sequence of:
  • the antibacterial peptide according to the present invention preferably includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and further comprises 1 to 5 consecutive amino acid sequences among the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 at the C-terminus of SEQ ID NO: 2 can be characterized.
  • Octominin an antibacterial peptide according to the present invention having the sequence of SEQ ID NO: 1, showed characteristics such as positive charge (+5), total hydrophobic residue ratio (43%) and Boman index 1.86 kcal / mol as a result of analysis of the amino acid sequence. .
  • the secondary structure of octominin was predicted to have an alpha helix and a beta sheet.
  • the molecular weight of the synthesized octominin was 2625.2 Da, and the purity was 92.5%.
  • Macrophages play a critical role during the inflammatory response, and activated macrophages secrete NO and PGE2 and proinflammatory mediators.
  • macrophages In response to LPS, macrophages produce NO and PGE2 through overexpression of iNOS and COX2, respectively.
  • the production of excess NO and PGE2 plays an important role in the pathogenesis of various inflammatory diseases. Therefore, alternative compounds that inhibit/downregulate the expression of inflammatory mediators such as iNOS and COX2 can help in the treatment of inflammatory diseases, and thus can be developed as therapeutic agents for inflammatory diseases.
  • TLR4 is an important receptor of TLR that identifies LPS and plays a role in initiating LPS-mediated inflammatory responses.
  • MD-2 and TLR4 form a heterodimer (TLR4/MD-2) that identifies a common pattern in LPS.
  • LPS binding leads to the formation of an m-type receptor multimer consisting of two copies of the symmetrically arranged TLR4/MD-2/LPS complex.
  • LPS interacts with the hydrophobic pocket of MD-2 and directly connects the two components of the TLR4/MD-2/LPS multimer.
  • the lipid chain (five chains) of LPS is contained in a pocket located in MD-2, and the other chain is exposed to the surface of MD-2 to form a hydrophobic interaction with the conserved phenylalanine of TLR4. Therefore, it is essential for LPS to bind to the TLR4/MD-2 heterodimer to trigger an inflammatory response.
  • octominin may act as an anti-inflammatory agent in LPS-activated macrophages (see Example 7 and FIG. 7).
  • octominin interacts with an amino acid site located in the heratodiamer of the TLR4/MD-2 complex and is put into the pocket of the TLR4/MD-2 complex. This steric hindrance weakens or reduces the binding of LPS to TLR4/MD-2.
  • octominin down-regulates mRNA/protein expression of iNOS and COX2 without reducing cell viability, thereby effectively inhibiting NO and PGE2 secretion from activated macrophages.
  • octominin significantly inhibited LPS-induced mRNA expression and protein expression of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 in a dose-dependent manner.
  • Synthetic peptides and antimicrobial peptides have been found to exhibit similar anti-inflammatory properties in LPS-activated macrophages.
  • synthetic peptides and AMP have been shown to inhibit LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages through inhibition of iNOS, COX2 and pro-inflammatory cytokine secretion. Therefore, it was attempted to determine whether octominin inhibits pro-inflammatory mediators and exhibits anti-inflammatory effects on LPS-activated macrophages.
  • octominin can inhibit LPS-induced chemokine production from LPS-activated RAW 264.7 macrophages including CCL3, CCL4, CCL5 and CXCL10.
  • Chemokines are a group of small proteins secreted by macrophages in response to proinflammatory cytokines and play important roles during the inflammatory response. In general, chemokines regulate different activities of leukocytes during inflammatory reactions such as leukocyte activation, chemotaxis and recruitment of activated macrophages, cell proliferation and migration of neutrophils and T cells to sites of inflammation. Thus, therapeutic compounds targeting chemokine secretion may contribute to the inhibition of this inflammatory process.
  • chemokine secretion from activated macrophages treated with octominin is reduced similarly to pro-inflammatory cytokine production from activated macrophages.
  • phosphorylation of p50 and p65 and their nuclear translocation were significantly inhibited by pretreatment with octominin.
  • activation of NF- ⁇ B is induced by LPS after binding to TLR.
  • the TLR-mediated signaling pathway regulates the release of proinflammatory cytokines and chemokines and is identified as one of the new therapeutic targets for inflammatory diseases.
  • gene expression levels of TLR2 and TLR4 were evaluated using RT-qPCR. Similar to previous studies conducted to evaluate the anti-inflammatory mechanisms of other peptides, the present invention confirmed that octominin can inhibit LPS-activated TLRs mRNA expression from LPS-activated macrophages.
  • the present invention suggests that the anti-inflammatory activity of octominin is partially mediated by inhibiting NF- ⁇ B binding to the nucleus through TLR inhibition, and octominin can modulate the LPS-activated inflammatory response in RAW 264.7 macrophages.
  • a possible mechanism of action is shown in Figure 8.
  • inflammatory diseases include atopy, psoriasis, arthritis, dermatitis, allergy, osteoarthritis, rhinitis, otitis media, sore throat, tonsillitis, periodontitis, gingivitis, inflammatory eye disease, cystitis, nephritis, rheumatoid arthritis, spondylitis, inflammatory bowel disease , hepatitis, sepsis, alcoholic liver disease, non-alcoholic fatty liver, various cancers, epilepsy, intervertebral disc degeneration, and the like, but are not limited thereto.
  • Oral or parenteral administration of the pharmaceutical composition of the present invention is preferable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is in any orally acceptable form including, but not limited to, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, and suspensions. It can also be administered orally.
  • ком ⁇ онент For oral tablets, commonly used carriers include lactose and corn starch. Lubricants such as magnesium stearate are also typically added. Useful diluents for oral administration in capsule form include lactose and dried corn starch. When aqueous suspensions are administered orally, the active ingredient is combined with emulsifying and suspending agents. If desired, sweetening and/or flavoring and/or coloring agents may be added.
  • the pharmaceutical composition for oral administration may be prepared by mixing the active ingredient with a solid excipient, and may be prepared in the form of granules for preparation in the form of tablets or dragees.
  • Suitable excipients include, but are not limited to, sugar forms such as lactose, sucrose, mannitol and sorbitol or starch from corn, wheat flour, rice, potatoes or other plants, cellulose such as methyl cellulose, hydroxypropylmethyl-cellulose or sodium carboxymethylcellulose; Carbohydrates such as gums including gum arabic and tagacanth or protein fillers such as gelatin and collagen may be used. If necessary, disintegrants or solubilizers in the form of cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar and their respective salts such as alginic acid or sodium alginic acid may be added.
  • sugar forms such as lactose, sucrose, mannitol and sorbitol or starch from corn, wheat flour, rice, potatoes or other plants, cellulose such as methyl cellulose, hydroxypropylmethyl-cellulose or sodium carboxymethylcellulose
  • Carbohydrates such as gums including gum arabic and tagacanth or protein fillers such as
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrabursar, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of a sterile injectable preparation as a sterile injectable aqueous or oleaginous suspension.
  • suspensions may be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (eg, Tween 80) and suspending agents.
  • the sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension (eg, a solution in 1,3-butanediol) in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent.
  • Vehicles and solvents that can be used permissibly include mannitol, water, Ringel's solution and isotonic sodium chloride solution.
  • sterile, non-volatile oils are conventionally employed as the solvent or suspending medium.
  • any non-volatile, less irritating oil may be used, including synthetic mono or diglycerides.
  • Fatty acids such as oleic acid and its glyceride derivatives are useful in injectable formulations as are pharmaceutically acceptable natural oils (eg olive oil or castor oil), especially their polyoxyethylated ones.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared as an aqueous solution.
  • a physically suitable buffer solution such as Hank's solution, Ringer's solution or physically buffered saline may be used.
  • Aqueous injection suspensions may contain a substrate capable of increasing the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol or dextran.
  • suspensions of the active ingredient may be prepared as suitable oily injection suspensions.
  • Suitable lipophilic solvents or carriers include fatty acids such as sesame oil or synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate, triglycerides or liposomes.
  • Polycationic non-lipid amino polymers can also be used as carriers.
  • the suspension may use suitable stabilizers or agents to increase the solubility of the compound and to prepare solutions of high concentration.
  • compositions of the present invention may also be administered in the form of a suppository for rectal administration.
  • These compositions can be prepared by mixing a compound of the present invention with a suitable non-irritating excipient that is solid at room temperature but liquid at rectal temperature.
  • suitable non-irritating excipient include, but are not limited to, cocoa butter, beeswax, and polyethylene glycol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is applied topically to the skin, the pharmaceutical composition should be formulated as a suitable ointment containing the active ingredient suspended or dissolved in a carrier.
  • Carriers for topical administration of the compounds of the present invention include, but are not limited to, mineral oil, liquid paraffin, white petrolatum, propylene glycol, polyoxyethylene, polyoxypropylene compounds, emulsifying waxes and water.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as a suitable lotion or cream containing the active compound suspended or dissolved in a carrier.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, mineral oil, sorbitan monostearate, polysorbate 60, cetyl ester wax, cetearyl alcohol, 2-octyldodecanol, benzyl alcohol and water.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be topically applied to the lower intestinal tract by rectal suppository and with a suitable enema. Topically applied transdermal patches are also included in the present invention.
  • compositions of the present invention can be administered by nasal aerosol or inhalation.
  • Such compositions are prepared according to techniques well known in the art of pharmaceuticals and can be dissolved in saline with benzyl alcohol or other suitable preservatives, absorption enhancers to enhance bioavailability, fluorocarbons and/or other solubilizing or dispersing agents known in the art. It can be prepared as a solution.
  • the specific effective amount for a particular patient will depend on several factors including the activity of the particular compound used, age, weight, general health, sex, diet, time of administration, route of administration, excretion rate, drug formulation, and severity of the particular disease to be prevented or treated. It will be understood that this may vary accordingly.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating an inflammatory disease comprising administering the antibacterial peptide.
  • the present invention relates to the use of the antibacterial peptide for the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention relates to the use of said antibacterial peptide for the preparation of a therapeutic agent for inflammatory diseases.
  • Healthy octopuses with an average weight of ⁇ 120 g were collected from the Sinan tidal flat on the southeastern coast of Korea. Before the experiment, the octopus was used after acclimatization for one week in a 300L flow system tank under the conditions of 34 ⁇ 1 psu of salt and 8.0 ⁇ 0.4 at 20 ⁇ 1 °C.
  • RNA was obtained from 13 tissues of octopus (eye, brain, eggplant heart, liver, buccal mass, heart, kidney, ovary, siphon, poison gland, skin and sucker) from the RNeasy Mini Kit. (Qiagen, Hilden) was used for extraction. The purity of the extracted RNA was confirmed using an Agilent Bioanalyzer, isoform sequencing was performed using RNA pools collected from 13 institutions, and library construction and sequencing were performed by PacBio RS II (DNA Link, Inc.). ., Korea) was used.
  • the defense protein gene was screened by screening the transcript sequence obtained from the octopus transcript database. Based on the N-terminal amino acid sequence of the defense protein, a novel peptide consisting of 23 amino acids ( 1 GWLIRGAIHAGKAIHGLIHRRRH 23 ) having peptide properties was designed and named as Octominin.
  • Octominin was synthesized using solid-phase peptide synthesis technology (AnyGen Co., Korea), and purified by reverse-phase HPLC using a C18 analytical column (SHIMADZU C18, Shimadzu HPLC Lab Solution, Japan). The molecular weight of octominin was confirmed using mass spectral analysis (AXIMA assurance, MALDI-TOF, Shimadzu).
  • octominin is positively charged (+5) residues (Lys-K, Arg-R and His-H), total hydrophobicity (43%) residues (Ile-1, Leu-L, Ala-Trp) -W) and has a Borman index (protein binding potential) of 1.86 kcal/mol. Negatively charged amino acids such as aspartate and glutamate were not present in the octominin sequence. There are a total of 8 hydrophobic residues in the peptide and alpha helices on the same surface. The secondary and three-dimensional structures of octominin are shown in FIG. 1 . As a result of analysis of the secondary structure of octominin, alpha helices and beta sheets were confirmed as expected. The molecular weight of synthetic octominin was 2626.1 Da and the purity was 92.5%.
  • RAW 264.7 cells American Type Culture Collection; ATCC
  • 5% CO 2 100% humidity
  • DMEM Gibco/BRL, Canada
  • RAW 264.7 cells were cultured in 24-cell culture plates (45,000 cells/well) and LPS (1 ⁇ g/mL) alone or in combination with octominin (62.5, 125, 250 and 500 ⁇ g/ml) in a total volume of 500 ⁇ L
  • MTT Culture medium containing (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (0.1 mg/ml) was added to each well. After 1 hour, the culture medium was removed and formazan crystals were dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide) and measured at 550 nm using a microplate reader, and the concentration of NO in the culture medium was measured using a Griess reagent. (Abekura et al. Int Immunopharmacol 68:156, 2019). The cell viability of the octominin-untreated control group was designated as 100%, indicating no cytotoxicity.
  • FIG. 2 As a result, as shown in FIG. 2, when RAW 264.7 macrophages were incubated for 24 hours at an octominin concentration between 62.5 and 500 ⁇ g/ml, a significant decrease in cell viability (FIG. 3a) or NO production (FIG. 3b) is not shown.
  • the protective effect of octominin on macrophages was confirmed, and octominin between 0, 62.5 and 500 ⁇ g/ml was confirmed to be non-toxic to macrophages, and octominin was found at 62.5-500 ⁇ g/ml in LPS-activated macrophages. It exhibited an enhanced cell-protective effect and inhibited NO production in a dose-dependent manner ( FIGS.
  • Macrophages were exposed to various concentrations of octominin for 1 h prior to activation with LPS. After culturing the cells for 24 hours, the cell-free culture supernatant was collected. The level of PGE2 in the culture supernatant was measured using an ELISA kit (R & D System Inc. USA), and the levels of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ and IL-6 were measured using an ELISA kit (BD Biosciences; San Jose, CA, USA). and analyzed.
  • LPS stimulation significantly increased the levels of PGE2, IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF- ⁇ in the culture supernatant of RAW 264.7 cells after 24 hours.
  • the group treated with octominin (62.5 to 250 ⁇ g/ml) prior to LPS stimulation had reduced PGE2 and pro-inflammatory cytokines (IL-6; FIG. 4b, IL-1 ⁇ ; FIG. 4c, and TNF- ⁇ ; FIG. 4d). It was significantly inhibited compared to the LPS-activated group.
  • Example 4 Confirmation of the effect of inhibiting gene expression of chemokines and proinflammatory cytokines of octominin in activated macrophages
  • qPCR of IL-1 ⁇ , IL-6, TNF- ⁇ , CCL3, CCL4, CCL5 and CXCL10 in LPS-activated macrophages Analysis was performed.
  • RAW 264.7 cells (150,000 cells/well) were plated in 6-well plates and pretreated with different concentrations (62.5, 125 and 250 ⁇ g/ml) of octominin, followed by stimulation with 1 ⁇ g/mL LPS for 6 hours.
  • RAW 264.7 cells were collected and total RNA was isolated using Trizol reagent according to the manufacturer's instructions. The amount of total RNA was measured at 260 and 280 nm.
  • Total RNA (5 ⁇ g) was reverse transcribed and cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit (TaKaRa, Tokyo, Japan). Then, the target gene was amplified by RT-PCR with oligo dT primer (Bioneer, Korea).
  • the relative gene expression level of GAPDH used as an internal control was analyzed by the 2- ⁇ CT method. Data are presented as mean ⁇ standard error (SE) of relative mRNA expression levels from three consecutive studies. The Mann-Whitney U test was used to determine the importance of gene expression level, and the primers used in the present invention are shown in Table 1.
  • FIG. 4 compared with the vehicle-treated control group, LPS significantly increased gene transcription of IL-1 ⁇ ( FIG. 4A ), IL-6 ( FIG. 4B ) and TNF- ⁇ ( FIG. 4C ). confirmed that.
  • octominin significantly and dose-dependently inhibited the elevated cytokine levels identified in LPS-activated macrophages.
  • the production of chemokines including CCL3 (MIP-1 ⁇ ), CCL4 (MIP-1 ⁇ ), CCL-5 (RANTES) and CXCL10 was significantly increased, and octominin It was confirmed that the increased expression of chemokines by treatment was decreased in a dose-dependent manner.
  • qPCR was performed in the same manner as in Example 4 using the primers described in Table 1, 2 - Relative mRNA expression levels were calculated using the ⁇ Ct method.
  • cytoplasmic and nuclear proteins were extracted with a nuclear and cytoplasmic protein extraction kit (Thermo Scientific; Rockford, USA). The same amount of protein was electrophoresed on 10% SDS-PAGE, and the separated protein was transferred to a PVDF membrane. Then, the PVDF membrane was incubated with the primary antibody and then the secondary antibody conjugated to HRP was incubated. Protein bands on PVDF membranes were detected using an enhanced chemiluminescent substrate, and membranes were captured using a FUSION SOLO Vilber Lourmat system. The signal intensities of protein bands were confirmed by densitometry using ImageJ (version 1.4).
  • mRNA expression levels of iNOS and COX2 were significantly inhibited by octominin in a dose-dependent manner from activated RAW 264.7 cells. Similar to the mRNA expression results, the protein levels of iNOS and COX2 were upregulated in LPS-activated RAW 264.7 cells ( FIGS. 6c and d ), but this effect was significant by octomininization (62.5-250 ⁇ g/ml) and dose dependently suppressed.
  • Cytoplasmic and nuclear proteins were extracted with a nuclear and cytoplasmic protein extraction kit (Thermo Scientific; Rockford, USA). The same amount of protein was electrophoresed on 10% SDS-PAGE, and the separated protein was transferred to a PVDF membrane. Then, the PVDF membrane was incubated with the primary antibody and then the secondary antibody conjugated to HRP was incubated. Protein bands on PVDF membranes were detected using an enhanced chemiluminescent substrate, and membranes were captured using a FUSION SOLO Vilber Lourmat system. The signal intensities of protein bands were confirmed by densitometry using ImageJ (version 1.4).
  • the gene expression levels of TLR2 ( FIG. 6A ) and TLR4 ( FIG. 6B ) were significantly upregulated by LPS treatment as expected.
  • the elevated TLRs gene expression level in LPS-activated macrophages was down-regulated.
  • phosphorylation of NF- ⁇ B subunits p50 and p65 in the cytoplasm was significantly increased after LPS treatment, whereas octominin significantly down-regulated the levels of phosphorylated p50 and p65 in the cytoplasm. , it is possible that octominin inhibits NF- ⁇ B in the cytoplasm.
  • FIG. 6d As a result of Western blotting, as shown in FIG. 6d , the nuclear metastasis levels of NF- ⁇ B, p50 and p65 in LPS-activated macrophages were increased, and the expression levels of p50 and p65 in LPS-activated macrophages were increased by octominin treatment. It was down-regulated in a dose-dependent manner. However, 62.5 ⁇ g/ml of octominin did not show significant p50 inhibition in the nucleoprotein extract ( FIG. 6f ).
  • TLR4/myeloid differentiation factor 2 (MD-2) (PDB: 3FXI) was obtained from Protein Data Bank (PDB, (http://www.rcsb.org/pdb).
  • the two-dimensional structure of octominin is MDL It was written with ISIS Draw 2.5 standalone software, converted into a three-dimensional structure using Accelrys Discovery Studio 3.0 (Accelrys, Inc), and the coupling was predicted based on CDOCKER.
  • octominin was virtually docked to a 3D model of the TLR4/MD-2 complex using Accelrys Discovery Studio 3.0 (Accelrys, Inc) (Fig. 7b). As shown in Fig. 7b, molecular docking showed that octominin moved to the pocket of the TLR4/MD-2 complex, and several amino acid sites such as SER120, SER 917, LEU293, LYS941, THR919 (see Fig. 7c) of TLR4 and interacting, occupying space and weakening the binding of LPS to TLR4/MD-2.
  • Accelrys Discovery Studio 3.0 Accelrys, Inc
  • novel antibacterial peptide or fragment thereof efficiently inhibits pro-inflammatory cytokines and chemokines that perform inflammatory responses in macrophages activated by LPS, and can be effectively used to prevent or treat inflammatory diseases.
  • the present invention was carried out with the support of the following national support projects.

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Abstract

본 발명은 낙지 유래 펩타이드를 함유하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규 항균 펩타이드 또는 이의 단편은 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 염증반응을 수행하는 전염증성 사이토카인과 케모카인을 효율적으로 억제하여, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

낙지 유래 펩타이드를 함유하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물
본 발명은 낙지 유래 펩타이드를 함유하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 대식세포에서 항염 효과를 나타내는 낙지 유래 펩타이드인 옥토미닌을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
해양생태계는 구조적으로 독특하고 새로운 생리활성화합물에 대한 풍부하고 잠재적인 치료제 공급원이다. 해양천연물 중 펩타이드는 많은 해양 유기체에서 발견되는 중요한 생리활성천연물이며, 최근 새로운 화학적 성질과 다양한 생물학적 특성으로 인해 생리활성 해양펩타이드를 확인하는데 상당한 관심이 집중되고 있다. 구체적으로, ROS 소거, 지질과산화 방지, 항미생물, 항암, 항바이러스, 항고혈압, 항당뇨병, 항염증 및 항응고와 같은 생리활성 특성을 갖는 해양생물 유래 펩타이드가 밝혀졌다(Cheung, R.C. et al., Mar Drugs, 13, 4006, 2015, Suleria, H.A.R. et al., Trends in Food Science & Technology, 50:44, 2016). 또한, 다양한 문어 종에서 분리된 펩타이드는 염증성, 자가면역, 호르몬 관련 및 심혈관 질환을 포함한 병리학적 상태에 대한 생리활성으로 인해 광범위하게 연구되고 있다.
염증은 생물학적, 물리적 또는 화학적 자극의 존재로 인한 조직 항상성의 중단에 반응하여 진화적으로 보존된 복잡한 생물학적 과정이다. 스트레스 조건에서 선천적 적응 면역 시스템은 조직 손상 또는 병원체 공격을 제어하기 위해 염증 반응이 일어나도록 조정한다. 그러나 제어되지 않거나 계속된 염증반응은 암 및 조직 손상을 포함한 염증성 질환의 발병원인이 된다. 지난 10년 동안, 염증 반응 동안 톨-유사 수용체(TLR)의 중요성이 보고되고 있으며, 구체적으로, 만성 염증성 질환의 발병을 유발하는 TLR의 과발현이 여러 연구에서 밝혀졌다. 문헌에 따르면, 포유류 세포에서 13개의 알려진 TLR이 발견되었다. 이들 13개의 수용체 중에서, LPS에 반응하여 대식세포에서 발현된 TLR2 및 TLR4는 활성화된 B세포의 NF-κB를 활성화시켜 염증성 질환의 발생과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 이어서 NF-κB 전사 인자의 활성화는 산화질소신타제(iNOS), 시클로옥시게나제(COX2), 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α) 및 케모카인과 같은 염증 매개체와 관련된 유전자 전사를 유발한다(CCL3, CCL4, CCL5 및 CXCL10). 염증반응동안 생성된 TNF-α, IL-1α, IL-1β 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인은 추간판 퇴행, 간질, 골관절염, 암의 시작 및 진행, 우울증과 같은 질병의 발병에 기여하는 것으로 보고되고 있으며, 대식세포로부터 케모카인 분비를 상향 조절한다. 케모카인은 작은(7-13 kDa) 헤파린 결합 단백질이며, 급성 및 만성 염증 반응 동안 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 염증반응 동안 생성된 CCL3(대식세포 염증성 단백질 1α, 또는 MIP-1α), CCL4(MIP-1β), CCL5(RANTES) 및 CXCL10과 같은 케모카인은 주로 백혈구(단핵구 및 호중구)에 대한 유인제로서 작용하고, 만성 및 급성 염증의 매개자로서 간주된다. 최근 여러 연구에서 케모카인의 과발현이 골관절염, 간 질환 및 암과 같은 질병을 유발한다고 보고되고 있으며, 또한, 조직에서 iNOS 및 COX2의 과발현은 NO 및 PGE2의 생성으로 이어지며, 여기서 이들 매개체는 다수의 염증성 질환의 발달에 중추적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.
한편, 낙지(Octopus minor)는 다른 문어 종에 비해 몸이 작고 수명이 짧으며, 가는 다리를 가지며, 한국, 일본, 중국과 같은 동아시아 국가의 해안을 따라 널리 분포되어 있으며, 고영양 및 저칼로리 음식으로, 경제적으로도 중요한 해산물로 이에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나 낙지에 대해 수행된 대부분의 연구는 게놈 연구, 공동 배양 기술 및 영양 분석에 국한되었으며 항염증제, 항암 및 항산화 제와 같은 생리활성 특성에 대한 연구는 제한적이었다.
이에, 본 발명자들은 낙지로부터 항염효과를 나타내는 천연물질을 찾고자 예의 노력한 결과, LPS에 의해 활성화된 대식세포에 낙지 유래 신규 펩타이드를 처리한 결과, TLR 매개된 NF-κB 전사를 억제하여, 항염증 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 낙지 유래 천연 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 5개 이상의 연속된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:
1GWLIRGAIHAGKAIHGLIHRRRH23 (서열번호 1).
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 염증성 질환 치료제의 제조를 위한 상기 항균 펩타이드의 사용을 제공한다.
도 1은 옥토미닌의 아미노산 서열로부터 예측된 나선형 2 차 및 3D 구조를 나타낸 것으로, (a) 옥토미닌의 헬리컬 휠(helical wheel)은 펩타이드의 아미노(N) 말단으로부터 카운트된 아미노산 배열 및 잔기 수를 나타낸다. 원형은 친수성 잔기, 마름모(다이아몬드)형은 소수성 잔기 및 오각형은 양으로 하전된 것을 나타내었다. 대부분의 소수성 잔기는 녹색이며, 녹색의 양은 소수성에 비례하여 감소하며, 소수성 0은 노란색으로 나타내었다. 잠재적으로 충전된 잔기는 연한 파란색으로 나타내었다. (b)는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 갖는 옥토미닌의 3D 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 LPS-활성화 RAW 264.7 대식세포에 대한 옥토미닌의 세포보호 및 NO 억제효과를 학인한 결과를 나타낸 것으로, a는 대식세포에서 옥토미닌의 세포 독성, b는 NO 생산; C는 LPS-활성화 대식세포에서 옥토미닌의 세포보호 효과 및 d는 옥토미닌의 NO 저해효과를 나타낸 것이다.
도 3은 대식세포로부터 LPS에 의해 유도된 PGE2 및 전염증성 사이토카인의 분비를 옥토미닌이 억제하는 지를 확인한 결과를 나타낸 것이다 (PGE2 (a), IL-6 (b), IL-1β (c) 및 TNF-α (d)). 실험은 3 회 반복하였고, 평균값은 ± SD로 표시하였다. 비히클-처리된 대조군 (# <0.05 및 ## <0.01) 또는 LPS-처리된 그룹 (* <0.05 및 ** <0.01)에 대하여 통계적으로 유의하다고 결정하였다.
도 4는 LPS 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 생성을 옥토미닌이 억제하는지를 qPCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다(IL-1β (a), IL-6 (b), TNF-α (c), CCL3 (d), CCL4 (e), CCL5 (f) 및 CXCL10 (g)). 데이터를 평가하기 위해 실험을 3회 반복하였고, 평균값은 ± SD로 표시하였다. 비히클-처리 된 대조군에 대한 mRNA 유의성은 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 계산하였다 (# <0.05 및 ## <0.01) 또는 LPS-처리된 그룹 (* <0.05 및 ** <0.01).
도 5는 LPS-활성화 대식세포에서 옥토미닌의 iNOS 및 COX2 분비를 억제를 확인한 결과를 나타낸 것으로, a는 iNOS의 qPCR 결과를 이용한 상대 mRNA 발현수준을 나타낸 것이고, b는 COX2의 PCR 결과를 이용한 상대 mRNA 발현수준을 나타낸 것이다. c는 iNOS 및 COX2의 웨스턴 블롯을 사용결과 단백질 발현수준을 나타낸 것이고, d는 c의 밴드의 관련 발현을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 옥토미닌이 TLR4/NF-κB 신호전달 차단을 통해 대식세포에서 LPS 유발 염증을 억제하는지에 대한 결과를 나타낸 것으로, a는 TLR2의 qPCR 결과를 이용한 상대 mRNA 발현수준을 나타낸 것이고, b는 TLR4의 PCR 결과를 이용한 상대 mRNA 발현수준을 나타낸 것이다. c는 세포질 단백질의 추출물의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이고, d는 핵 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다. 세포질 및 핵 추출물에서 각각 β-액틴 및 뉴클레오린에 대한 항체를 사용하여 동일한 단백질 로딩을 제어하였다.
도 7은 TLR4 / MD-2 복합체에 옥토미닌 분자 도킹을 나타낸 그림으로, a는 옥토미닌의 2D 다이어그램이고, b는 TLR4/MD-2 복합체의 결정구조에 옥토미닌이 도킹한 구조를 나타낸 것이고, c는 TLR4/MD-2 복합체와 옥토미닌의 아미노산 결합 사이트를 나타낸 것이다.
도 8은 RAW 264.7 대식세포에서 LPS-활성화된 염증반응을 억제하는 옥토미닌 작용에 대한 가능성 있는 메커니즘을 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
해양생물로부터 분리된 활성펩타이드는 항바이러스, 항암, 항당뇨병 및 항비만을 포함하는 다양한 질병을 치료하는 유망한 치료제로 사용될 수 있다. 그러나, 낙지 등의 두족류로부터 분리된 펩타이드의 항염증 효과 및 기본 분자 메카니즘은 잘 알려지지 않았다. 본 발명에서는 낙지유래 신규 펩타이드인 옥토미닌(Octominin)이 NO, PGE2, 전염증성 사이토카인 및 대식세포의 케모카인을 하향 조절하여 LPS에 의해 유도된 염증을 완화시킬 수 있는 것을 확인하였다. 또한, 옥토미닌이 TLR / NF-kB 신호전달의 다운스트림 활성화를 차단하여 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 활성화된 대식세포에서 염증반응을 줄일 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 5개 이상의 연속된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다:
1GWLIRGAIHAGKAIHGLIHRRRH23 (서열번호 1).
본 발명에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 5개 이상, 바람직하게는 7개 이상, 더욱 바람직하게는 10개 이상, 가장 바람직하게는 18개 이상의 연속된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함할 수 있고, 바람직하게는 7개 이상, 더욱 바람직하게는 10개 이상, 가장 바람직하게는 18개 이상의 연속된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드에서 1 이상의 아미노산 잔기가 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기의 크기, 극성, 전화 소수성 또는 친수성에 대한 효과가 거의 없거나 전혀 없는 아미노산 잔기로의 치환을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 5개 이상, 바람직하게는 7개 이상, 더욱 바람직하게는 10개 이상, 가장 바람직하게는 18개 이상의 연속된 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 18개 내지 23개의 연속된 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
1GWLIRGAIHAGKAIHGLIHRRRH23 (서열번호 1)
1GWLIRGAIHAGKAIHGLI18(서열번호 2)
1GWLIRGAIHAGKAIHGLIH19 (서열번호 3)
1GWLIRGAIHAGKAIHGLIHR20 (서열번호 4)
1GWLIRGAIHAGKAIHGLIHRR21 (서열번호 5)
1GWLIRGAIHAGKAIHGLIHRRR22 (서열번호 6)
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 2의 C-말단에 하기 서열번호 7의 아미노산 서열 중 연속되는 1 내지 5개의 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
“HRRRH”(서열번호 7)
서열번호 1의 서열을 가지는 본 발명에 따른 항균 펩타이드인 옥토미닌은 아미노산 서열의 분석 결과, 양전하 (+5), 전체 소수성 잔기 비율 (43%) 및 Boman 지수 1.86 kcal / mol과 같은 특징을 나타내었다. 옥토미닌의 2차 구조는 알파 나선과 베타 시트를 가지는 것으로 예측되었다. 합성된 옥토미닌의 분자량은 2625.2 Da이고, 순도는 92.5%였다.
대식세포는 염증반응 동안 결정적인 역할을 하며, 활성화된 대식세포는 NO 및 PGE2와 전염증성 매개체를 분비한다. LPS에 반응하여, 대식세포는 각각 iNOS 및 COX2의 과발현을 통해 NO 및 PGE2를 생성한다. 과량의 NO 및 PGE2의 생성은 다양한 염증성 질환의 발병에 중요한 역할을 한다. 따라서, iNOS 및 COX2와 같은 염증 매개체의 발현을 억제/하향조절하는 대체 화합물은 염증성 질환의 치료에 도움을 줄 수 있어, 염증성 질환 치료제로 개발될 수 있다.
TLR4는 LPS를 확인하는 TLR의 중요한 수용체이며, LPS-매개 염증 반응을 개시하는 역할을 한다. MD-2 및 TLR4는 LPS에서 공통 패턴을 식별하는 이종이량체(TLR4 / MD-2)를 형성한다. LPS 결합은 대칭적으로 배열된 TLR4/MD-2/LPS 복합체의 2개의 카피로 구성된 m 형 수용체 다량체의 형성을 유도한다. 일반적으로 LPS는 MD-2의 소수성 포켓과 상호작용하고 TLR4/MD-2/LPS 멀티머의 2 가지 구성 요소를 직접 연결한다. LPS의 지질사슬(5 사슬)은 MD-2에 위치한 포켓에 담기고, 다른 사슬은 MD-2의 표면에 노출되어 TLR4의 보존된 페닐알라닌과 소수성 상호작용을 형성한다. 따라서 염증 반응을 유발하기 위해 LPS가 TLR4/MD-2 이종이량체와 결합하는 것이 필수적이다.
본 발명의 일 양태에서는 옥토미닌의 TLR4/MD-2 복합체에 대한 실리코 결합 능력을 확인하였으며, 옥토미닌은 LPS-활성화 대식세포에서 항염증제로서 작용할 수 있다(실시예 7 및 도 7 참조). 실리코 도킹 결과에 따르면, 옥토미닌은 TLR4/MD-2 복합체의 헤라토디아머(heratodiamer)에 위치한 아미노산 부위와 상호작용하여 TLR4 / MD-2 복합체의 포켓에 담기게 된다. 이 입체장애는 LPS와 TLR4/MD-2의 결합을 약화시키거나 감소시킨다.
본 발명에서는 옥토미닌의 항염증 특성을 확인하기 위해 일련의 시험 관내 실험을 수행하였다.
본 발명의 다른 양태에서, 옥토미닌은 세포 생존력을 감소시키지 않으면서 iNOS 및 COX2의 mRNA/단백질 발현을 하향조절하여, 활성화된 대식세포로부터 NO 및 PGE2 분비를 효과적으로 억제하였다.
본 발명의 또다른 양태에서, 옥토미닌은 LPS로 유도된 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현 및 단백질 발현을 용량 의존적으로 유의하게 억제하였다.
합성 펩타이드 및 항균성펩타이드(AMP)는 LPS-활성화된 대식세포에서 유사한 항염증 특성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 합성 펩타이드 및 AMP는 iNOS, COX2 및 전염증성 사이토카인 분비의 억제를 통해 RAW 264.7 대식세포에서 LPS-유도 염증을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 옥토미닌이 전염증성 매개체를 억제하여 LPS 활성화 대식세포에 항염증 효과나타내는지 확인하고자 하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 옥토미닌이 CCL3, CCL4, CCL5 및 CXCL10을 포함한 LPS-활성화 RAW 264.7 대식세포로부터 LPS-유도 케모카인 생산을 억제할 수 있는 것을 확인하였다. 케모카인은 전염증성 사이토카인에 반응하여 대식세포에 의해 분비되는 소 단백질 그룹이며 염증반응 동안 중요한 역할을 한다. 일반적으로, 케모카인은 백혈구활성화, 화학주성 및 활성화된 대식세포의 모집, 세포증식 및 호중구와 T 세포를 염증 부위로 이동시키는 것과 같은 염증 반응동안 백혈구의 상이한 활성을 조절한다. 따라서, 케모카인 분비를 표적으로 하는 치료화합물은 이러한 염증 과정의 억제에 기여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 옥토미닌이 처리된 활성화된 대식세포로부터의 케모카인 분비는 활성화된 대식세포로부터의 전염증성 사이토카인 생성과 유사하게 감소되었다. 이러한 결과는 옥토미닌이 감염된 부위로의 백혈구 및 호중구 모집을 감소시킴으로써 염증증상의 발달뿐만 아니라 LPS-활성화된 염증 반응을 억제할 수 있음을 의미한다.
여러 연구에서 대식세포가 LPS에 노출되면 즉각적인 세포 반응이 유발되는 것으로 확인되었다. LPS에 노출되면, TLR과 같은 패턴 수용체에 의해 MyD88이 활성화된다. 이어서 활성화된 MyD88은 카파 B 억제제(IκB)의 인산화를 유도하는 kappB 키나제 억제제(IKK) 복합체를 활성화시킨다. IκB의 인산화는 세포질 NF-κB 이량체(p50 및 p65)를 유리시키고 이들이 핵으로 전위(translocate)되도록 한다. 후속적으로, NF-κB의 전위는 대식세포에서 염증반응과 관련된 유전자의 전사를 촉진한다. 이전 연구에서 다른 유기체로부터 분리된 펩타이드가 핵에 대한 NF-κB 결합을 완화시켜 염증성 사이토카인 및 케모카인 분비를 억제한다는 보고가 있다(Glaeser, J.D.et al., Tissue Eng Part A 24:1641, 2018),
본 발명의 또 다른 양태에서는 p50 및 p65의 인산화 및 이들의 핵 전위는 옥토미닌으로의 전처리에 의해 상당히 억제되었다. 상기 언급한 바와 같이, NF-κB의 활성화는 TLR에 결합한 후 LPS에 의해 유발된다. TLR 매개된 신호전달경로는 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 방출을 조절하며 염증성 질환에 대한 새로운 치료 표적 중 하나로 확인된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서는 RT-qPCR을 사용하여 TLR2 및 TLR4의 유전자 발현 수준을 평가하였다. 다른 펩타이드의 항염증성 메커니즘을 평가하기 위해 수행된 이전의 연구와 유사하게, 본 발명에서는 옥토미닌이 LPS-활성화 대식세포로부터 LPS-활성화된 TLRs mRNA 발현을 억제할 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서는 옥토미닌의 항염증 활성이 TLR 억제를 통해 핵에 NF-κB 결합을 억제함으로써 부분적으로 매개되는 것을 시사하며, RAW 264.7 대식세포에서 옥토미닌이 LPS-활성화된 염증 반응을 조절할 수 있는 가능한 작용 메커니즘을 도 8에 나타내었다.
본 발명에 있어서, 염증성 질환으로는 아토피, 건선, 관절염, 피부염, 알레르기, 골관절염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 치주염, 치은염, 염증성 안질환, 방광염, 신장염, 류머티즘성 관절염, 척추염, 염증성 장질환, 간염, 패혈증, 알콜성 간질환, 비-알콜성 지방간, 각종 암, 간질, 추간판 퇴행 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 바람직하다.
경구 투여의 경우, 구강내 투여를 포함하며, 본 발명의 의약 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제를 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 형태로도 경구 투여될 수 있다.
경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수 전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
구강내 투여를 위한 의약 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다.
적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸세룰로스와 같은 셀룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
본 발명의 의약 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.
바람직한 양태로서, 비경구적 투여의 경우 본 발명의 의약 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 (injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액 (oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다.
복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 화합물을 실온에서 고형이지만 직장 온도에서는 액상인 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
본 발명의 의약 조성물은 피부에 국소적으로 적용하는 경우, 의약 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 함유한 적합한 연고로 제형되어야 한다. 본 발명의 화합물을 국소 투여하기 위한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 유동 파라핀, 백색 와셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 포함된다. 다른 방도로서, 의약 조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유한 적합한 로션 또는 크림으로 제형될 수 있다. 적합한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물이 포함된다. 본 발명의 의약 조성물은 또한 직장 좌제에 의해 또한 적합한 관장제로 하부 장관으로 국소 적용할 수 있다. 국소 적용된 경피 패치가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 의약 조성물은 비내 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 약제의 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조하며 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용율을 증강시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 본 분야에 알려진 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조할 수 있다.
특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 염증성 질환 치료제의 제조를 위한 상기 항균 펩타이드의 사용에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 옥토미닌의 합성 및 물리화학적 특성
건강한 낙지를 한국 남서부 해안의 신안 갯벌에서 평균 체중이 ~ 120g인 것을 채집하였다. 실험 전 낙지를 20 ± 1℃에서 염분 34 ± 1 psu 및 pH 8.0 ± 0.4의 조건으로 300L 유량 시스템 탱크에서 일주일 동안 순응시킨 후 사용하였다.
낙지의 전사체 서열분석
총 RNA는 낙지의 13개 조직(눈, 뇌, 가지 심장, 간, 구구(buccal mass), 심장, 신장, 난소, 수관(siphon), 독선(poison gland), 피부 및 빨판) 부분에서 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden)를 사용하여 추출하였다. 추출된 RNA의 순도는 Agilent Bioanalyzer를 사용하여 확인하였으며, 13개 기관으로부터 수집한 RNA 풀을 사용하여 이소형 서열분석(isoform sequencing)을 수행하였으며, 라이브러리 구축 및 시퀀싱은 PacBio RS II (DNA Link, Inc., 한국)를 사용하였다.
낙지 유래 방어펩타이드인 옥토미닌의 설계 및 합성
낙지의 전사체 데이터베이스로부터 얻은 전사체 서열을 스크리닝하여 방어 단백질 유전자를 스크리닝하였다. 상기 방어 단백질의 N- 말단 아미노산 서열에 기초하여, 펩타이드의 특성을 갖는 23 개의 아미노산(1GWLIRGAIHAGKAIHGLIHRRRH23)으로 구성된 신규 펩타이드를 설계하고 옥토미닌(Octominin)으로 명명하였다. 옥토미닌은 고상 펩타이드 합성기술 (AnyGen Co., Korea)을 사용하여 합성하였고, C18 분석 컬럼 (SHIMADZU C18, Shimadzu HPLC Lab Solution, Japan)을 사용하여 역상 HPLC로 정제하였다. 옥토미닌의 분자량은 질량 스펙트럼 분석(AXIMA 보증, MALDI-TOF, Shimadzu)을 사용하여 확인하였다.
펩타이드 예측 결과에 근거하여, 옥토미닌은 양전하(+5) 잔기(Lys-K, Arg-R 및 His-H), 총 소수성비(43%) 잔기(Ile-1, Leu-L, Ala-Trp-W)를 가지고, 1.86kcal/mol의 보만지수(단백질 결합 전위)를 가진다. 아스파테이트 및 글루타메이트와 같은 음전하 아미노산은 옥토미닌 서열에 존재하지 않았다. 동일한 표면의 펩타이드 및 알파나선에는 총 8개의 소수성 잔기가 있다. 옥토미닌의 2차 및 3차원 구조를 도 1에 나타내었다. 옥토미닌의 2차 구조 분석 결과, 알파 나선 및 베타 시트가 예상대로 확인되었다. 합성 옥토미닌의 분자량은 2626.1 Da이고 순도는 92.5 %이었다.
실시예 2: LPS 활성화 대식세포에서 옥토미닌의 세포독성 효과 및 NO 분비 확인
대식세포로 RAW 264.7세포 (American Type Culture Collection; ATCC)를 사용하여, 10% 열 불활성화 FBS 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM(Gibco/BRL, Canada)에서 5% CO2, 100% 습도, 37℃ 조건에서 배양하였다.
RAW 264.7 세포를 24-세포배양 플레이트(45,000세포/웰)에서 배양하고 LPS(1μg/mL) 단독으로 또는 옥토미닌(62.5, 125, 250 및 500μg/ml)과 함께 총 부피 500μL 24시간 후, MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) (0.1mg/ml)를 함유하는 배양 배지를 각 웰에 첨가하였다. 1시간 후, 배양배지를 제거하고 포르마잔 결정을 DMSO(디메틸설폭사이드)에 용해시키고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 550nm에서 측정하였으며, 배양 배지에서 NO의 농도는 그리스 시약(Griess reagent)를 이용하여 측정하였다(Abekura et al. Int Immunopharmacol 68:156, 2019). 옥토미닌 미처리 대조군의 세포 생존율을 100%로 지정하였으며, 이는 세포 독성이 없음을 나타낸다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 62.5 ~ 500 ㎍/ml 사이의 옥토미닌 농도로 RAW 264.7 대식세포에 24시간 인큐베이션 한 경우, 대조군과 비교하여 현저한 세포 생존력 감소(도 3a) 또는 NO 생성(도 3b)을 나타내지 않았다. 아울러 대식세포에 대한 옥토미닌의 보호 효과를 확인하였으며, 0, 62.5 ~ 500μg/ml 사이의 옥토미닌은 대식세포에 무독성인 것으로 확인되었으며, 옥토미닌은 LPS-활성화 대식세포에서 62.5-500μg/ml에서 용량-의존적 방식으로 향상된 세포-보호 효과를 나타내고 NO 생성을 억제하였다(도 3 c 및 d). 생물학적 분석, 세포 보호 및 NO 억제 데이터에 필요한 양을 고려하여 62.5μg/ml, 125μg/ml 및 250μg/ml 농도의 옥토미닌을 후속 연구에 사용하기로 결정하였다.
실시예 3: 옥토미닌의 LPS 유도 PGE2 및 전염증성 사이토카인 분비 억제능 확인
RAW 264.7 대식세포로부터 LPS에 의해 유도되는 PGE2 및 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 분비를 옥토미닌이 억제하는지를 ELISA 분석을 통해 확인하였다.
LPS로 활성화하기 전에 대식세포를 1시간 동안 여러 농도의 옥토미닌에 노출시켰다. 세포를 24시간 동안 배양한 후, 무세포 배양상청액을 수집하였다. 배양상청액에서 PGE2 수준은 ELISA 키트(R & D System Inc. 미국)를 사용하였고, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 수준은 ELISA 키트(BD Biosciences; San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, LPS 자극은 24 시간 후 RAW 264.7세포의 배양 상청액에서 PGE2, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 수준을 유의하게 증가시켰다. 그러나, LPS 자극 전에 옥토미닌(62.5 ~ 250㎍ / ml)으로 처리된 군은 PGE2 및 전염증성 사이토카인(IL-6; 도 4b, IL-1β; 도 4c, 및 TNF-α; 도 4d)이 LPS-활성화 군과 비교하여 현저히 억제되었다.
실시예 4: 활성화된 대식세포에서 옥토미닌의 케모카인 및 전염증성 사이토카인의 유전자 발현 억제효과 확인
전염증성 사이토카인 및 케모카인 신호 전달 유전자의 전사에 대한 옥토미닌의 효과를 확인하기 위하여, LPS-활성화된 대식세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL3, CCL4, CCL5 및 CXCL10의 qPCR 분석을 수행하였다.
RAW 264.7세포(150,000 세포/웰)를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고 상이한 농도(62.5, 125 및 250㎍/ml)의 옥토미닌으로 전처리한 후 6시간 동안 1㎍/mL LPS로 자극하였다. RAW 264.7 세포를 수집하고 제조업체의 지침에 따라 Trizol 시약을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 총 RNA의 양은 260 및 280nm에서 측정하였다. 전체 RNA(5μg)를 역전사하여 cDNA 합성키트를 사용하여 cDNA를 합성하였다(TaKaRa, Tokyo, Japan). 이어서 표적유전자를 올리고 dT 프라이머(바이오니아, 한국)로 RT-PCR에 의해 증폭시켰다. 내부대조군으로 사용되는 GAPDH의 상대적 유전자 발현 수준을 2-ΔΔCT 방법으로 분석하였다. 데이터는 3개의 연속 연구로부터의 상대 mRNA 발현 수준의 평균±표준 오차(SE)로 나타내었다. Mann-Whitney U 테스트는 유전자 발현 수준의 중요성을 결정하기 위해 사용하였으며, 본 발명에서 사용된 프라이머는 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2021000925-appb-T000001
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 비히클 처리된 대조군과 비교하여, LPS가 IL-1β (도 4a), IL-6 (도 4b) 및 TNF-α(도 4c)의 유전자 전사를 현저히 증가시키는 것을 확인하였다.
그러나, 옥토미닌은 LPS-활성화 대식세포에서 확인된 상승된 사이토카인 수준을 유의미하고 용량 의존적으로 억제하였다. 또한, 도 4d~도 4g에 나타낸 바와 같이, LPS 자극 후 CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β), CCL-5 (RANTES) 및 CXCL10을 포함하는 케모카인의 생성이 현저히 증가하며, 옥토미닌 처리에 의해 상기 증가된 케모카인의 발현이 용량 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 5: LPS에 의한 iNOS 및 COX2 활성화를 옥토미닌이 억제하는지 확인
LPS-활성화 RAW 264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도되어 발현된 iNOS 및 COX2의 활성이 옥토미닌 처리에 의하여 억제되는 지를 확인하였다.
iNOS 및 COX2를 포함하여 NO 및 PGE2 생성을 담당하는 주요 효소의 발현을 qPCR 분석 및 웨스턴 블럿으로 각각 확인하였으며, qPCR은 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였으며, 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 상대 mRNA 발현 수준을 계산하였다.
웨스턴 블럿을 위해, 세포질 및 핵 단백질은 핵 및 세포질 단백질 추출 키트(Thermo Scientific; Rockford, USA)로 추출하였다. 동일한 양의 단백질을 10% SDS-PAGE에서 전기영동하였으며, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 옮겼다. 이어서, PVDF 막을 1차 항체와 함께 인큐베이션 한 후 HRP에 접합 된 2차 항체를 인큐베이션하였다. 강화된 화학 발광 기질을 사용하여 PVDF 막 상의 단백질 밴드를 검출하였으며, FUSION SOLO Vilber Lourmat 시스템을 사용하여 막을 포획하였다. 단백질 밴드의 신호 강도는 ImageJ (버전 1.4)를 사용한 밀도 측정법에 의해 확인하였다.
iNOS, COX2 및 β- 액틴에 대한 일차항체 와 이차 항체는 산타 크루즈 바이오 테크놀로지(미국)에서 구입하여 사용하였다.
그 결과, 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, iNOS 및 COX2의 mRNA 발현 수준은 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 용량 의존적으로 옥토미닌에 의해 유의하게 억제되었다. mRNA 발현 결과와 유사하게, LPS-활성화 RAW 264.7 세포에서 iNOS 및 COX2의 단백질 수준은 상향 조절되었으나 (도 6c 및 d), 이 효과는 옥토미닌처리 (62.5-250 μg / ml)에 의해 유의미하고 용량 의존적으로 억제되었다.
실시예 6: 옥토미닌의 LPS 활성화 대식세포에서 TLRs 발현 억제 및 NF-κB 인산화 억제능 확인
LPS가 톨-유사 수용체 (TLR)를 활성화시키고, 상류 단백질의 활성화를 통해 NF-κB의 활성화가 일어난다는 것은 잘 알려진 사실이다. 따라서, 본 실시예에서는 웨스턴 블롯을 사용하여 NPC-κB의 단백질 발현 수준을 확인하였으며, TLR2 및 TLR4의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인하였다.
세포질 및 핵 단백질은 핵 및 세포질 단백질 추출 키트(Thermo Scientific; Rockford, USA)로 추출하였다. 동일한 양의 단백질을 10% SDS-PAGE에서 전기영동하였으며, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 옮겼다. 이어서, PVDF 막을 1차 항체와 함께 인큐베이션 한 후 HRP에 접합 된 2차 항체를 인큐베이션하였다. 강화된 화학 발광 기질을 사용하여 PVDF 막 상의 단백질 밴드를 검출하였으며, FUSION SOLO Vilber Lourmat 시스템을 사용하여 막을 포획하였다. 단백질 밴드의 신호 강도는 ImageJ (버전 1.4)를 사용한 밀도 측정법에 의해 확인하였다.
phospo-P50, P50, phospo-P65, P65, 뉴클레오린, β- 액틴에 대한 일차항체 및 이차 항체는 산타 크루즈 바이오 테크놀로지(미국)에서 구입하여 사용하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, TLR2 (도 6a) 및 TLR4 (도 6b)의 유전자 발현 수준은 예상대로 LPS 처리에 의해 상당히 상향조절되었다. 그러나, 옥토미닌 처리에 의하여, LPS 활성화 대식세포에서 상승된 TLRs 유전자 발현 수준이 하향 조절되었다. 또한, 도 6c 및 6e에 나타난 바와 같이, 세포질에서 NF-κB 서브유닛 p50 및 p65의 인산화는 LPS 처리 후 유의하게 증가된 반면, 옥토미닌은 세포질에서 인산화된 p50 및 p65의 수준을 현저히 하향 조절하여, 옥토미닌이 세포질에서 NF-κB를 억제할 가능성이 있다. 웨스턴 블럿 결과, 도 6d에 나타난 바와 같이, LPS 활성화된 대식세포에서 NF-κB, p50 및 p65의 핵 전이 수준은 증가하였으며, LPS 활성화된 대식세포에서 p50 및 p65의 발현 수준은 옥토미닌 처리에 의하여 용량 의존적으로 하향 조절되었다. 그러나, 62.5μg/ml의 옥토미닌은 핵단백질 추출물에서 유의한 p50 억제를 나타내지 않았다(도 6f).
실시예 7: in silico에서 옥토미닌의 TLR4/MD-2 복합체 형성 억제효과 확인
LPS-활성화 대식세포에서 관찰된 옥토미닌의 항염증 효과를 추가로 확인하기 위해 (도 7a), 옥토미닌의 TLR4/MD-2 복합체에 대한 결합능을 예측하기 위한 디자인을 수행하였다.
TLR4/골수 분화인자 2(MD-2) (PDB: 3FXI)의 결정 구조는 Protein Data Bank (PDB, (http://www.rcsb.org/pdb)로부터 얻었다. 옥토미닌의 2차원 구조는 MDL ISIS Draw 2.5 독립형 소프트웨어로 작성하였으며, Accelrys Discovery Studio 3.0 (Accelrys, Inc)을 사용하여 3 차원 구조로 변환하였으며, 결합은 CDOCKER를 기반으로 예측하였다.
가능한 바인딩 모드를 탐색하기 위해 옥토미닌은 Accelrys Discovery Studio 3.0(Accelrys, Inc)을 사용하여 TLR4/MD-2 복합체의 3D 모델에 사실상 도킹되었다(도 7b). 도 7b에 도시된 바와 같이, 분자 도킹은 옥토미닌이 TLR4/MD-2 복합체의 포켓으로 맞춰 이동하였으며, TLR4의 SER120, SER 917, LEU293, LYS941, THR919 (도 7c 참조)와 같은 여러 아미노산 부위와 상호 작용하여, 공간을 차지하고 LPS와 TLR4/MD-2의 결합을 약화시킨다.
본 발명에 따른 신규 항균 펩타이드 또는 이의 단편은 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 염증반응을 수행하는 전염증성 사이토카인과 케모카인을 효율적으로 억제하여, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 하기 국가지원과제의 지원으로 수행되었다.
[과제번호] 2019R1A2C1087028
[부처명] 과학기술정보통신부
[연구관리전문기관] 한국연구재단
[연구사업명] 중견연구자지원사업
[연구과제명] 낙지(Octopus minor) 유래 표적선택적 융합 생체방어펩타이드 기반 나노약물전달시스템 개발
[과제수행기관명] 국립해양생물자원관
[연구기간] 2019.09.01 ~ 2023.02.28
전자파일 첨부하였음.

Claims (4)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 5개 이상의 연속된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    1GWLIRGAIHAGKAIHGLIHRRRH23 (서열번호 1).
  2. 제1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 18개 내지 23개의 연속된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
    1GWLIRGAIHAGKAIHGLI18(서열번호 2).
  3. 제2항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 6에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피, 건선, 관절염, 피부염, 알레르기, 골관절염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 치주염, 치은염, 염증성 안질환, 방광염, 신장염, 류머티즘성 관절염, 척추염, 염증성 장질환, 간염, 패혈증, 알콜성 간질환, 비-알콜성 지방간, 각종 암, 간질 및 추간판 퇴행으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물
PCT/KR2021/000925 2020-01-22 2021-01-22 낙지 유래 펩타이드를 함유하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물 WO2021150066A1 (ko)

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