WO2021149925A1 - Trpv1 활성 매개 질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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WO2021149925A1
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trpv1
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김승훈
전하원
하유승
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    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention relates to a novel therapeutic pharmaceutical composition, and more particularly, to a pharmaceutical composition for treating a disease mediated by TRPV1 activity to a method for treating a disease mediated by TRPV1 activity.
  • TRPV1 transient receptor potential vanilloid type 1
  • TRPV1 transient receptor potential vanilloid type 1
  • TRPV1 is a non-selective cation channel activated by various stimuli such as noxious heat (more than 42 degrees Celsius), capsaicin, resiniferatoxin (RTX), and protons, and is mainly a nociceptive nerve fiber (nociceptive) channel. fiber) is a key molecule involved in the development of peripheral and central sensitization that is expressed at the terminal and causes chronic pain.
  • GDF11 is a protein belonging to the TGF- ⁇ family, and its expression is increased in young animals and is known to promote neurogenesis and angiogenesis. Although many studies have been conducted on the chronic pain-regulating effect of TGF- ⁇ belonging to the same family, the part regarding the chronic pain-relieving effect of GDF11 remains unknown.
  • Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2017-0093283 relates to a composition containing GDF11 and its use, and provides the fibroblast proliferation effect of a human-derived adult stem cell culture medium containing GDF11.
  • studies or descriptions related to the chronic pain relief effect of GDF11 have not been disclosed.
  • the present inventors have made intensive efforts to provide a substance capable of resolving side effects such as severe high fever accompanying TRPV1 inhibition while treating chronic pain through TRPV1 inhibition.
  • GDF11 has an effect of relieving pain caused by various causes. Confirmed and completed the present invention.
  • GDF11 growth differentiation factor 11
  • a composition comprising a growth differentiation factor 11 (GDF11) peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a polynucleotide encoding the peptide, or an expression vector comprising the polynucleotide
  • GDF11 growth differentiation factor 11
  • a method for treating a disease mediated by TRPV1 activity comprising administering to a patient with a disease mediated by TRPV1 activity.
  • growth differentiation factor 11 is also referred to as bone morphogenetic protein 11 (BMP11), and refers to a protein expressed by the GDF11 gene present in human chromosome 12.
  • TRPV1 Transient receptor potential channel, Vanilloid subfamily member 1
  • TRPV1 Transient receptor potential channel, Vanilloid subfamily member 1
  • TRPV1 is activated by heat, protons and endogenous substances that interact synergistically to induce nociceptive signals.
  • the term "vector” refers to a tool used for gene delivery. It can be viewed as a concept corresponding to the drug carrier. Therefore, as well as a DNA vector composed of the same nucleic acid molecule as the transgene to be introduced like a general plasmid vector, phospholipid membrane structures such as nanoparticles, liposomes, extracellular vesicles, and exosomes made of silica or gold, chitosan, polyethylene Cationic polymers such as imine and polylysine, and reagents used for DNA transfection, such as calcium phosphate, are also included in a broad vector.
  • GDF11 growth differentiation factor 11
  • the expression vector may be a viral vector or a non-viral vector, and the viral vector is an adeno-associated viral vector, an adenoviral vector, an alphaviral vector, a herpes simplex virus vector, a vaccinia vector, and a Sendai vector. It may be a viral vector, a flavivirus vector, a radovirus vector, a retroviral vector, or a lentiviral vector, and the serotype of the adeno-associated virus (AAV) vector is AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6. , AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 or AAV16.
  • AAV adeno-associated virus
  • the non-viral vector may be a DNA vector, nanoparticles, cationic polymer, exosome, extracellular vesicle or liposome, and the DNA vector is a plasmid vector, a cosmid vector, a phagemid vector or It may be an artificial human chromosome.
  • the TRPV1 activity-mediated disease is pain, hypertension, stroke, myocardial ischaemia, urinary incontinence, urinary bladder hypersensitivity, irritable bowel syndrome.
  • irritable bowel syndrome fecal urgency, stomach-duodenal ulcer, gastro-esophageal reflux disease (GERD), Crohn's disease, hemorrhoids, Asthma, chronic obstructive pulmonary disease, pruritus, psoriasis, hearing loss, tinnitus, cough, hypertrichosis and alopecia
  • irritable bowel syndrome fecal urgency, stomach-duodenal ulcer, gastro-esophageal reflux disease (GERD), Crohn's disease, hemorrhoids, Asthma, chronic obstructive pulmonary disease, pruritus, psoriasis, hearing loss, tinnitus, cough, hypertrichosis and alopecia
  • GSD gastro-esophageal reflux disease
  • the pain may be nociceptive pain, psychogenic pain, inflammatory pain, or pathological pain
  • the pathological pain is neuropathic pain ( neuropathic pain, cancer pain, chemotherapy pain, postoperative pain, trigeminal neuralgia pain, idiopathic pain, diabetic neuropathic pain, or migraine.
  • a method of alleviating or treating pain comprising administering the pharmaceutical composition.
  • Pain according to the present invention is nociceptive pain, psychogenic pain, inflammatory pain associated with tissue damage and infiltration of immune cells, pathological pain (fibromyalgia, irritable bowel syndrome, dysfunctional pain such as tension headache);
  • the pain may include anatomically distinct back pain: neck pain, middle back pain, lower back pain or tailbone pain
  • pain may include neuropathic pain, migraine pain.
  • Pain may include pain such as Neuropathic pain is a chronic neuropathic disease caused when the nervous system is damaged by various causes such as trauma, inflammation, ischemic injury, or metabolites. can It is a type of non-malignant chronic pain that is usually caused by abnormalities in the nerves, spinal cord, and brain and is estimated to be suffered by more than 1% of the population.
  • Neuropathic pain is associated with abnormal sensations called dysesthesia, allodynia in which a person feels pain despite innocuous stimuli that do not cause pain, and hyperalgesia, in which a person experiences more intense and prolonged pain in response to noxious stimuli such as heat.
  • neuropathic pain may be of a continuous and/or intermittent (paroxysmal) component. The latter is likened to an electric shock. Common characteristics include burning, cold, tingling sensations in the legs (pins and needles), numbness, and itching. Depending on whether the peripheral or central nervous system is affected, it can be divided into peripheral neuropathic pain and central neuropathic pain. In contrast, nociceptive pain is often expressed as ache.
  • Migraine is also a chronic disorder associated with a number of autonomic symptoms and causing headaches of moderate to severe severity. The exact mechanism of these migraines has not been elucidated so far.
  • the basic theory is related to increased excitability of the cerebral cortex and abnormal regulation of pain neurons in the trigeminal nucleus of the brain stem.
  • pain is neuropathic pain, cancer pain, postoperative pain, trigeminal neuralgia pain, idiopathic pain, diabetic neuropathic pain ( It may be at least one selected from the group consisting of diabetic neuropathic pain), migraine, and the like.
  • the effective amount of the compound in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the type of the patient's affected part, the application site, the number of treatments, the treatment time, the dosage form, the patient's condition, the type of adjuvant, and the like.
  • the amount used is not particularly limited, but may be 0.01 ⁇ g/kg/day to 10 mg/kg/day.
  • the daily dose may be administered once a day, or dividedly administered 2-3 times a day at an appropriate interval, or may be administered intermittently at intervals of several days.
  • the compound may be contained in an amount of 0.01-100% by weight based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • solid or liquid additives may be used in the preparation of the pharmaceutical composition.
  • the additive for formulation may be either organic or inorganic. Examples of the excipient include lactose, sucrose, sucrose, glucose, cornstarch, starch, talc, sorbit, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate and silicon dioxide.
  • binder examples include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, calcium citrate, dextrin and pectin.
  • lubricant examples include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, and hydrogenated vegetable oil.
  • a coloring agent if it is permitted to be added to a pharmaceutical normally, all can be used. These tablets and granules may be suitably coated with sugar coatings, gelatin coatings, or other needs. In addition, if necessary, preservatives, antioxidants, etc. may be added.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, and the form of the formulation is not particularly limited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, preferably parenterally, intravenous injection, subcutaneous injection, intraventricular injection (intracerebroventricular injection), intracerebrospinal fluid injection (intracerebrospinal fluid injection), intrathecal It can be administered by injection (intrathecal injection), cervical intervertebral injection (transforaminal injection), intramuscular injection, intraperitoneal injection, and the like.
  • the present invention provides a method for alleviating and/or treating pain, comprising administering a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition to a patient in need of pain relief and/or treatment.
  • the method may further comprise identifying the patient as a patient in need of pain relief and/or treatment prior to the administering step.
  • therapeutically effective amount may refer to the amount of active gradient that can achieve the desired effect, alleviation of pain and/or therapeutic effect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful for the prevention and treatment of diseases related to the activity of TRPV1, acute pain, chronic pain, neuropathic pain, post-operative pain, rheumatoid arthritis pain, arthritis pain, postherpetic neuralgia, neuralgia, pain such as headache, toothache, pelvic pain, migraine, bone cancer pain, chemotherapy pain, breast pain and visceral pain; neurological diseases such as neuropathy, HIV-associated neuropathy, nerve damage, neurodegeneration and stroke; diabetic peripheral neuropathy; fecal urgency; irritable bowel syndrome; inflammatory bowel disease; gastrointestinal diseases such as gastroesophageal reflux disease (GERD), gastroduodenal ulcer and Crohn's disease; respiratory diseases such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cough; incontinence; urinary bladder hypersensitivity; neurotic/allergic/inflammatory skin diseases such as psoriasis, pruritus, prurigo and dermatitis; Hyperacusis; Hearing loss; tinnitus;
  • GDF11 of the present invention is a protein encoded by the twelfth gene of a growth differentiation factor.
  • GDF11 acts as a cytokine and has the same molecular structure as that of humans and mice.
  • the bone morphogenetic protein group is characterized as a polybasic proteolytic processing site and is cleaved to produce a protein containing seven conserved cysteine residues.
  • Systemic GDF11 treatment improves neurogenesis by enhancing the vasculature of hippocampus and cortex in elderly mice, and systematic supplementation of GDF11 improves ⁇ -cell survival and morphology in both nongenic and genetic mouse models of type 2 diabetes and glucose improved metabolism.
  • GDF11 induces phenotypes such as calorie restriction without affecting appetite or GDF15 levels in the blood, restores the insulin/IGF-1 signaling pathway, and acts directly on adipocytes to secrete adiponectin from white adipose tissue. Stimulates and restores neurogenesis in the aged brain. It is also a regulator of skin biology, has an important effect on the production of procollagen I and hyaluronic acid, activates the Smad2/3 phosphorylation pathway in skin endothelial cells, and improves skin vasculature. Increased GDF11 levels in aged mice also improved muscle structure and functional characteristics and increased strength and endurance exercise capacity.
  • GDF11 was found to reduce oxidative stress, decreased levels of AGE, protein oxidation and lipid peroxidation, and slowed the accumulation of age-related histological markers, and significantly inhibited the decrease in CAT, GPX and SOD activity.
  • GDF11 family are regulators of cell growth and differentiation in both embryonic and adult tissues. Studies in mice and in the genus Xenopus report that this protein is involved in mesoderm formation and neurogenesis during embryonic development. did.
  • GDF11 shown in SEQ ID NO: 2 and GDF11 derived from other mammals having at least 96% homology thereto can also be used.
  • GDF11 derived from the other mammals is a mouse (Mus musculus, SEQ ID NO: 3), a chimpanzee (Pan troglodytes, SEQ ID NO: 4), a gorilla (Gorilla beringei graueri, SEQ ID NO: 5), a golden snub-nosed monkey (Rhinopithecus roxellana, SEQ ID NO: 6), Northern white-cheeked gibbon (Nomascus leucogenys, SEQ ID NO: 7), Bengal monkey (Macaca mulatta, SEQ ID NO: 8), bonobo (Pan paniscus, SEQ ID NO: 9) or pig (Sus scrofa domesticus, SEQ ID NO: 10).
  • the human-derived GDF11 protein is a protein with very high homology to other primate-derived GDF11, and all or part of full-length peptides or mature peptides derived from other animals may be used.
  • the double mature peptide corresponds to amino acid positions 299 to 407 (SEQ ID NO: 1), and amino acid positions 1 to 298 are cleaved portions of the signal peptide and precursor protein.
  • homology with other mammals is almost 100% Since it appears close, it is possible to utilize genes or proteins derived from other animals.
  • the polynucleotide encoding the mature peptide may be set forth in SEQ ID NO: 11.
  • the present invention can be implemented by gene therapy using genes instead of proteins or peptides.
  • a recombinant vector in which a gene construct in which a polynucleotide encoding GDF11 is operably linked to a regulatory sequence is inserted into various expression vectors is used to facilitate gene amplification and manipulation.
  • These expression vectors are divided into viral vectors and non-viral vectors.
  • the viral vectors include adeno-associated viral vectors, adenovirus vectors, alphavirus vectors, herpes simplex virus vectors, vaccinia vectors, Sendaivirus vectors, flavivirus vectors, radovovirus vectors, retroviral vectors, and lentiviral vectors, etc.
  • Viral vectors used in gene therapy are well documented in the literature. This document is incorporated herein by reference.
  • a transgene is inserted into the genome of the host, and since it is randomly inserted, there are concerns about unexpected side effects such as cancer. Accordingly, an adeno-associated virus that inserts only at a certain position on the genome of a host cell is attracting attention.
  • the adeno-associated virus is a single-stranded DNA virus and is a helper-dependent human parvovirus.
  • the genome size is about 4.7 kbp, and the N-terminal part of the genome encodes the rep gene involved in viral replication and expression of viral genes, and the C-terminal part encodes the cap gene encoding the viral capsid protein. It consists of a repeat region (ITR) having about 145 bases inserted at both ends.
  • ITR repeat region
  • Four proteins are translated from the rep region, which are divided into rep78, rep68, rep52, and rep40 according to their molecular weight, and perform important functions in AAV DNA replication.
  • Three proteins, VP1, VP2, and VP3 are translated from the cap region, which are structural proteins required for AAV virus assembly.
  • the AAV vector of the present invention can be used to deliver a foreign gene sequence into a cell according to various viral infection methods known in the art, and the method is not particularly limited.
  • the expression vector for gene therapy is a non-viral expression vector including a gene construct in which a polynucleotide encoding GDF11 is operably linked to a regulatory sequence, particularly a plasmid vector, etc. is inserted into a DNA vector This can be used.
  • operably linked to means that the target nucleic acid sequence is linked to the regulatory sequence in such a way that expression can be achieved in vivo into which the transgene is to be introduced. it means.
  • regulatory sequence is meant to include promoters, enhancers and other regulatory elements (eg, polyadenylation signals). Regulatory sequences include instructing that a target nucleic acid can always be expressed in many host cells, instructing that a target nucleic acid can be expressed only in cells of a specific tissue (eg, tissue-specific control sequence), and This includes directing expression to be induced by a signal (eg, an inducible regulatory sequence). It will be understood by those skilled in the art that the design of an expression vector used in gene therapy may vary depending on factors such as the selection of a host into which the transgene will be introduced and the level of desired protein expression.
  • the expression vector of the present invention can be introduced into a host to express the GDF11 protein.
  • the expression vector according to an embodiment of the present invention must have a control sequence of a eukaryotic cell capable of expressing a foreign gene in a eukaryotic cell, particularly a mammal.
  • Regulatory sequences that enable the expression of foreign genes in such eukaryotic cells are well known to those skilled in the art. As mentioned above, they usually contain regulatory sequences responsible for transcription initiation and optionally poly-A signals responsible for transcription termination and stabilization of the transcript. Additional regulatory sequences may include, in addition to transcriptional regulators, translation enhancing factors and/or natively-combined or heterologous promoter regions.
  • regulatory sequences that enable expression in cells in mammals include the CMV-HSV thymidine kinase promoter, SV40, RSV-promoter (Rous sarcoma virus), human kidney element 1 ⁇ -promoter, glucocorticoid-inducible MMTV-promoter (Moloni mouse tumor virus), a metallothionein-inducible or tetracycline-inducible promoter, or an amplifying agent such as a CMV amplifier or an SV40-amplifier.
  • neurofilament-promoter For expression in neurons, it is contemplated that neurofilament-promoter, PGDF-promoter, NSE-promoter, PrP-promoter or thy-1-promoter may be used. Such promoters are known in the art and described in the literature.
  • the control sequences may include a transcription termination signal such as an SV40-poly-A site or a TK-poly-A site downstream of the polynucleotide according to an embodiment of the present invention.
  • suitable expression vectors are known in the art, for example, Okayama-Berg cDNA expression vectors pcDV1 (Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL), pGX-27, pX, yeast two-hybrid vectors such as pEG202 and dpJG4-5 exist.
  • the vector may further comprise a polynucleotide encoding a secretion signal.
  • the secretion signals are well known to those skilled in the art.
  • a leader sequence capable of directing GDF11 to a cell compartment may be combined with the coding sequence of the polynucleotide according to an embodiment of the present invention, preferably a translated protein or It is a leader sequence capable of directly secreting its protein into the cytoplasmic surrounding or extracellular medium.
  • the expression vector of the present invention can be prepared by, for example, standard recombinant DNA technology, and the standard recombinant DNA technology includes, for example, ligation of blunt and adherent ends, restriction enzyme treatment to provide appropriate ends, In order to prevent improper binding, phosphate group removal by alkaline forstase treatment and enzymatic linkage by T4 DNA ligase are included.
  • the vector of the present invention can be prepared by recombination of a DNA encoding a signal peptide obtained by chemical synthesis or genetic recombination technology and a DNA encoding a dual specificity fusion protein of the present invention into a vector containing an appropriate regulatory sequence.
  • the vector containing the control sequence can be purchased or prepared commercially.
  • the expression vector may further include a polynucleotide encoding a secretion signal sequence, wherein the secretion signal sequence induces secretion of the recombinant protein expressed in the cell out of the cell, and a tissue plasminogen activator (tPA) signal sequence; It may be an HSV gDs (herpes simplex virus glycoprotein Ds) signal sequence or a growth hormone signal sequence.
  • tPA tissue plasminogen activator
  • the non-viral expression vector for gene therapy may be a DNA vector capable of expressing the GDF11 in a host cell, and the DNA vector is a plasmid vector, a cosmid vector, a phagemid vector, or artificial Any form, such as a human chromosome, may be represented.
  • a gene transfer method used for gene therapy using a DNA expression vector as described above electroporation, gene gun, ultrasonic microbubble therapy, magnetofection, gold or silica nanoparticles, cation
  • electroporation, gene gun, ultrasonic microbubble therapy, magnetofection, gold or silica nanoparticles, cation A method of transfection using vectors such as sexual polymers, liposomes, nanoparticles, and exosomes may be used. These gene transfer methods are well known in the art. Recently, a method of directly injecting a DNA vaccine composition into a human muscle by applying an irreversible electroporation method using a small electroporation device has been used.
  • TRPV1 The activity of TRPV1, one of the permeable, non-selective cation channel families, induces Ca2+ influx and is inhibited by specific antagonists such as capsazepine. In addition, it is directly activated by capsaicin, heat, low pH, bradykinin, PGE2, or ATP, and this activation condition means that TRPV1 is a primary biological sensor for thermo-chemical stimulation and tissue damage. . TRPV1 is reported to be present in various tissues such as brain, kidney, bronchial epithelial cells and epidermal keratinocytes, and capsaicin stimulation increases the intracytoplasmic Ca2+ concentration of keratinocytes, which is inhibited by capsazepine.
  • the present inventors conducted a study on a composition for the treatment of pain that can effectively inhibit TRPV1, and confirmed that GDF11 can be a novel antagonist for the treatment of pain, so that the composition for the treatment of pain using inhibition of TRPV1 activity of the present invention developed.
  • GDF11 inhibited the function of TRPV1 channels in a concentration-dependent manner in mouse primary small sensory neurons (DRGs) using intracellular calcium (Ca2+) imaging and total-cell patch clamping.
  • the GDF11 of the present invention can be utilized as a novel pain treatment antagonizing the TRPV1 channel in chronic pain, and various mediated diseases related to TRPV1 activity. It suggests that it can be used as a therapeutic agent that can be treated.
  • a composition comprising a growth differentiation factor 11 (GDF11) peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a polynucleotide encoding the peptide, or an expression vector comprising the polynucleotide
  • GDF11 growth differentiation factor 11
  • a method for treating a disease mediated by TRPV1 activity comprising administering to a patient with a disease mediated by TRPV1 activity.
  • composition for treating pain using the inhibition of TRPV1 activity of the present invention made as described above exhibited an effect of excellently inhibiting neuropathic pain caused by spinal nerve damage, so TRPV1 channels such as arthritis and diabetic peripheral neuropathy It can be used as a novel pain treatment for various pain conditions and diseases related to Also, since it effectively inhibits TRPV1 activity, it can be used as a therapeutic agent for treating various TRPV1 activity-mediated diseases.
  • the scope of the present invention is not limited by these effects.
  • FIG. 1 is a schematic diagram schematically illustrating a method for evaluating thermal hyperalgesia inhibition (a) and TRPV1 ion channel activity inhibition evaluation method (b) according to GDF11 treatment of the present invention by preparing a mouse chronic pain model.
  • 2A is a graph analyzing the delay time of avoidance response due to radiant heat stimulation when GDF11 of the present invention is injected into a spinal nerve injury mouse model.
  • Figure 2b is a graph analyzing the delay time of the avoidance response due to radiant heat stimulation when GDF11 (0.1 mg/kg) of the present invention is injected into a mouse model of anticancer drug peripheral neuropathy.
  • Figure 2c is a graph analyzing the delay time of avoidance response due to radiant heat stimulation when GDF11 (0.2 mg/kg) of the present invention is injected into a mouse model of anticancer drug peripheral neuropathy.
  • Figure 3a is a graph showing the calcium influx curve by the treatment of GDF11 and capsaicin of the present invention in mouse sensory neurons.
  • Figure 3b is a graph comparing the ratio of calcium inflow by concentration compared to the control group treated with GDF11 and capsaicin of the present invention in mouse sensory neurons.
  • Figure 4a is a graph showing the calcium influx curve by treatment with GDF11 and capsaicin of the present invention in HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) cells transformed using pcDNA-TRPV1 vector.
  • Figure 4b is a graph analyzing the ratio of calcium inflow by concentration compared to the control group treated with GDF11 and capsaicin of the present invention in HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) cells transformed using pcDNA-TRPV1 vector.
  • 5a is a graph showing an inward current curve by treatment with GDF11 and capsaicin of the present invention in mouse sensory neurons.
  • Figure 5b is a graph analyzing the ratio of the inward current magnitude for each concentration compared to the control group treated with GDF11 and capsaicin of the present invention in mouse sensory neurons.
  • 6a is a graph showing the TRPV1 inward current curve by treatment with GDF11 and capsaicin of the present invention in HEK293 cells transformed using pcDNA-TRPV1 vector.
  • Figure 6b is a graph analyzing the ratio of the inward current magnitude by concentration compared to the control group treated with GDF11 and capsaicin of the present invention in HEK293 cells transformed using the pcDNA-TRPV1 vector.
  • FIG 7 shows changes in body temperature after administration of GDF11 of the present invention to an anticancer drug-induced peripheral neuropathy mouse model. Even when GDF11 was administered, it was confirmed that there was no rapid change in the body temperature of the mouse.
  • FIG. 8 shows that the adeno-associated virus vector AAV-GDF11 expressing GDF11 of the present invention stably expresses GDF11 in mouse sensory neurons (L4 DRG or L5 DRG).
  • FIG. 9 is a graph analyzing the delay time of avoidance response due to radiant heat stimulation when the adeno-associated virus vector AAV-GDF11 expressing GDF11 of the present invention is administered to a mouse model of neuropathic pain.
  • SNT spinal nerve transection
  • the present inventors have prepared an animal model of chemotherapy-induced peripheral neuropathy (CIPN).
  • CIPN chemotherapy-induced peripheral neuropathy
  • 6-week-old C57BL/6 male mice were subjected to a one-week acclimatization period in an animal laboratory breeding environment.
  • the rate of change of the response value of each individual was calculated based on the average value of all subjects, and subjects within the range of ⁇ 50% of the overall average value were selected.
  • a neuropathic pain model was created using only selected individuals, and thermal hyperalgesia was measured 5 days after nerve injury under the same conditions as above.
  • thermal nociceptive responses the experimental animals were placed in an acrylic chamber for 2 hours each time, stabilized, and then radiant heat stimulation was applied, and thermal nociceptive responses were measured between 4 and 6 pm. Thereafter, the neuropathic pain animal model was arbitrarily divided into two groups, and human recombinant GDF11 or saline was administered intrathecally, and the analgesic effect of the thermal pain reaction was evaluated ( FIG. 2A ).
  • a blind researcher measured the heat nociceptive response, and after the planned heat nociception reaction evaluation test was completed, the results were analyzed using information from the drug administration group and statistical processing was performed.
  • the drug was administered directly into the spinal cavity using a syringe under isoflurane respiratory anesthesia.
  • a 30-gauge needle was connected to a Hamilton syringe, filled with GDF11 or saline, and then injected into the space between the 5th and 6th vertebrae to administer GDF11 at a concentration of 10 ng/5 ⁇ l.
  • the present inventors primary cultured sensory neurons from dorsal root ganglion (DRG) in mice. Specifically, 6-9 week old C57BL/6 mice were anesthetized with isoflurane for 5 minutes, sterilized with 70% ethanol, and the back area was incised. Thereafter, spinal cord DRGs were dissected from all sites and placed in a solution of 10X HBSS and 10 mM HEPES (wood et al, J Neurosi. 8, pp3208-3220, 1988).
  • DRG dorsal root ganglion
  • the dorsal root ganglion was cultured in a mixed solution of 0.2 mg/ml collagenase A and 3 mg/ml dispase II, washed once with DMEM medium containing 10% FBS, and Pasteur Grinding was performed using a pipette. Then, an average of 100 to 300 cells were seeded on a coverslip coated with poly-D-lyrine, and after 1 hour of incubation, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1X 2 ml of Neurobasal medium containing B27 supplement was added and cultured.
  • the primary cultured sensory neurons were exposed to DMEM medium containing 2 ⁇ M Fura-2AM for 40 minutes, and then the degree of calcium ion influx was measured through the F340/F380 ratio, and 200 nM capsaicin ( Calcium influx inhibition rate by GDF11 pre-treatment was measured for F340/F380 increased by capsaicin).
  • the intracellular calcium ion concentration was measured using a microscope equipped with an imaging camera and a fluorescence measuring device connected thereto.
  • the ratio of fluorescence wavelengths (F340/F380) that appears during fluorescence measurement reflects the intracellular calcium ion concentration.
  • the perfusate containing the drug was perfused at a rate of 2-3 ml/min.
  • the composition of the perfusate was 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 10 mM glucose and 10 mM HEPES, and NaOH was added to adjust the pH to 7.4 ( FIG. 1b ).
  • the inhibition rate of capsaicin-induced inward current by GDF11 was measured through the patch clamp experiment.
  • the composition of the solution in the patch pipette is 126 mM K-gluconate, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 0.1 mM Na 2 GTP, 2 mM Na 2 ATP, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA, pH 7.4 by addition of KOH. adjusted.
  • the composition of the extracellular perfusate was 140 mM NaCl, 2 mM EGTA, 1 MgCl 2 , 10 mM glucose, 5 mM KCl, and 10 mM HEPES, and the pH was adjusted to 7.4 by adding NaOH.
  • the drug-containing extracellular perfusate was perfused by gravity at a rate of 2-3 ml/min, and capsaicin and GDF11 were perfused in nociceptive neurons through the extracellular perfusate to measure the inhibition rate of capsaicin-induced inward current by GDF11.
  • the present inventors measured calcium inflow and inward current through the above-described intracellular Ca2+ influx measurement experiment and single cell patch clamp experiment.
  • the pcDNA TRPV1 expression vector was transformed using the following method using lipofectamine TM 2000 (Invitrogen, USA). First, the medium of HEK293 cells cultured in a 35 mm cell culture dish was removed, then only DMEM medium was added and wet cultured at 5% CO2 and 37°C. pcDNA-TRPV1 (1 ⁇ g) and lipofectamine (10 ⁇ l) were dissolved in each DMEM medium.
  • the two mediums were mixed and then waited for another 20 minutes.
  • the medium containing the pcDNA prepared above was dispensed and wet-cultured at 5% CO 2 , 37° C. for 4 hours.
  • DMEM medium containing 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin incubation for 12 hours, calcium imaging or patch clamp experiments were performed within 24 hours.
  • the present inventors attempted to prepare a viral vector containing the GDF11 gene.
  • the AAV5 serotype and the CMV promoter to induce the constitutive expression of GDF11 in infected cells and infected with neurons.
  • IRES Internal ribosome entry site
  • eGFP enhanced green fluorescence protein
  • the present inventors performed tissue immunostaining to confirm the expression of GDF11 in sensory neurons after intrathecal injection of a viral vector containing the gene.
  • the experimental animals were anesthetized by intraperitoneal injection of pentobarbital sodium (60 mg/kg). After filling a 30 ml syringe with 30 ml of 0.9% NaCl solution, the right atrium side of the heart was incised, and blood was removed by inserting the syringe into the left ventricle. Then, 30 ml of a 10% formalin solution was administered to the left ventricle to perform a fixation operation, and then L4 and L5 DRG tissues were sampled. The removed DRG tissue was immersed in 10% formalin solution for 16 hours for additional fixation, and then the tissue was transferred to 30% sucrose solution and dehydrated for two days.
  • DRG tissue was frozen at -20 °C and then sectioned to a thickness of 12 ⁇ m.
  • Tubulin antibody (Santa Cruz, USA) was diluted 1/100 in 0.1 M PBS solution and treated on DRG tissue sections for 24 hours, and after washing with 0.1 M PBS, fluorescence images were captured using a confocal microscope.
  • Statistical analysis was performed using prism (Graphpad, version 501) software. Specifically, after confirming the normal distribution through a normality test, a parametric test or a non-parametric test was used. For the parametric and non-parametric tests, t-test was performed when there were two or more groups, and when there were three or more groups, one-way ANOVA test or two-way ANOVA test was used. Error bars were visualized by standard error of measurement (SEM), and if the experimental result was significant * or # [1 for P ⁇ 0.05, 2 for P ⁇ 0.005, 3 for P ⁇ 0.001 dog].
  • the present inventors produced a mouse experimental model for spinal nerve injury (SNT) chronic pain, and after intrathecal administration of GDF11 (10 ng), the thermal pain response was evaluated using the Hargreaves equipment. As a result, compared to the control group, it was shown that the hindfoot avoidance response delay time was increased by suppressing the thermal hyperalgesia phenomenon according to administration of the GDF11 of the present invention to a chronic pain mouse model ( FIG. 2A ).
  • the present inventors produced an anticancer drug-induced peripheral neuropathy (CIPN) mouse experimental model, and after intraperitoneal administration of GDF11 0.1 mg/kg or 0.2 mg/kg, the thermal nociception response was evaluated using the Hargreaves equipment.
  • CIPN anticancer drug-induced peripheral neuropathy
  • the GDF11 of the present invention was shown to decrease the capsaicin-induced TRPV1-mediated inward current in a concentration-dependent manner in mouse sensory neurons (Figs. 5a, 5b and 6a, 6b). The measurement of the current was indicated by normalizing it based on the magnitude of the first reaction by capsaicin.
  • Examples 1 to 3 suggest that treatment with GDF11 effectively inhibits TRPV1 ion channel activity at a low concentration, and thus can be utilized as an effective antagonist of TRPV1.
  • TRPV1 antagonists are known to accompany side effects of abnormal fever or hypothermia under the administration conditions showing analgesic efficacy, so the present applicant wanted to determine whether the side effects occurred due to the administration of GDF11.
  • BCTC (30 mg/kg) or GDF11 (0.1 mg/kg or 0.2 mg) at a concentration that inhibits TRPV1 activity by capsaicin to a similar degree in anticancer drug pain model mice exposed to skin by shaving the hair on the back /kg) after intraperitoneal administration, the temperature of the exposed skin was measured by time using a thermal imaging camera.
  • the present inventors tried to determine whether GDF11 expression is induced in the body when the prepared viral vector is administered.
  • mice were sacrificed, L4 and L5 DRG tissues were sampled, and lyophilized sections were prepared. Tissues were immunostained with Tubulin antibody, and the GFP fluorescence signal was considered as the expression level of GDF11, and imaging was performed with a confocal microscope.
  • the present inventors tried to determine whether the prepared viral vector AAV5-GDF11 exhibits an analgesic effect in an animal model of neuropathic pain.
  • a neuropathic pain model was prepared by measuring the basic pain response value before making the pain model and then cutting the peripheral spinal nerve. Pain model 3 days after surgery, the heat nociceptive response was evaluated, and the object whose avoidance response threshold value fell to 6 seconds or less was considered as a pain model. 5 ⁇ l of GDF11 virus vector at a concentration of 1.22 ⁇ 10 11 GC/ml was intrathecally injected into this pain model, and heat nociceptive response was evaluated using a Hargreaves device once a week.
  • GDF11 a composition for the treatment of pain using inhibition of TRPV1 activity of the present invention, was shown to rapidly and effectively inhibit the TRPV1 channel, so it is a novel treatment for various pain conditions and diseases related to the TRPV1 channel, such as arthritis and diabetic peripheral neuropathy. It can be used as a treatment.
  • composition for the treatment of pain using inhibition of TRPV1 activity of the present invention exhibits an excellent effect of inhibiting neuropathic pain caused by spinal nerve damage, and thus various pain conditions related to TRPV1 channels such as arthritis and diabetic peripheral neuropathy And it can be utilized as a novel pain treatment for diseases.
  • various pain conditions related to TRPV1 channels such as arthritis and diabetic peripheral neuropathy
  • it can be used as a therapeutic agent to treat various TRPV1 activity-mediated diseases, so it has high industrial applicability.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of a growth differentiation factor 11 (GDF11) mature peptide.
  • SEQ ID NO: 2 shows the full length of the amino acid sequence of the human GDF11 peptide.
  • SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of mouse GDF11.
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of chimpanzee GDF11.
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of gorilla GDF11.
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of GDF11 of golden harlequin monkey.
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of the northern white-cheeked gibbon GDF11.
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of bengal monkey GDF11.
  • SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of bonobo GDF11.
  • SEQ ID NO: 10 shows the amino acid sequence of porcine GDF11.
  • SEQ ID NO: 11 shows a polynucleotide sequence encoding the GDF 11 peptide (SEQ ID NO: 1).

Abstract

본 발명은 신규 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 TRPV1 활성 매개 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 TRPV1 활성 억제를 이용한 통증 치료용 조성물은 척수신경 손상에 의해 발생된 신경병증성 통증을 우수하게 억제하는 효과를 나타내었으므로 관절염, 당뇨병성 말초신경병증과 같은 TRPV1 채널과 관련된 다양한 통증 상태 및 질환에 대한 신규 통증 치료제로 활용될 수 있다. 또한 TRPV1 활성을 효과적으로 억제하므로 다양한 TRPV1 활성 매개 질환을 치료하는 치료제로도 활용 가능하다.

Description

TRPV1 활성 매개 질환 치료용 약학적 조성물
본 발명은 신규 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 TRPV1 활성 매개 질환 치료용 약학적 조성물 내지 TRPV1 활성 매개 질환 치료방법에 관한 것이다.
통증(pain)은 ‘실제 또는 잠재적 조직 손상과 관련된 불쾌한 감각 및 감정적 경험’으로 일반적으로 통증은 손상된 조직이 회복되면서 완화되지만, 통증이 만성화되면 손상 부위가 분명히 완전히 치유되었음에도 아무런 자극 없이 통증이 지속적으로 발생하고, 일반적으로 통증을 유발하지 않는 무해한 자극에 의해 통증이 발생하기도 한다.
한편, TRPV1(transient receptor potential vanilloid type 1)은 유해 자극이 통증을 유발하는 세포 기전의 중요한 통각 수용체 중 하나로 TRP(transient receptor potential) 패밀리의 구성원이다. 또한 TRPV1은 유해 열(noxious heat, 섭씨 42도 이상), 캡사이신, 레시니페라톡신(RTX), 양성자(protons) 등의 다양한 자극에 의해 활성화 되는 비선택적 양이온 채널로, 주로 침해 수용 신경섬유(nociceptive fiber) 말단에서 발현되어 만성 통증의 원인이 되는 말초 및 중추 감작의 발달에 관여하는 핵심 분자이다. TRPV1은 만성 통증의 치료를 위한 주요한 표적으로 제시되고 있지만, TRPV1의 약리학적 억제는 원인을 알 수 없는 심각한 고열을 유발하여 TRPV1 억제제는 치료제로서의 개발이 어려운 것으로 알려져 있다.
GDF11은 TGF-β 패밀리에 속하는 단백질로 어린 동물에서 발현이 증가하여 신경생성, 혈관 신생 촉진작용을 하는 것으로 알려져 있다. 같은 패밀리에 속하는 TGF-β의 만성 통증 조절 효과에 관해서는 많은 연구가 수행되었지만, GDF11의 만성 통증을 완화 효과에 관한 부분은 여전히 미지의 상태로 남아있다.
대한민국 공개특허 제10-2017-0093283호 는 GDF11을 포함하는 조성물 및 그의 용도에 대한 것으로서, GDF11이 포함된 인간 유래 성체 줄기세포 배양액의 섬유아세포 증식 효과를 제공하고 있다. 그러나 GDF11의 만성 통증 완화 효과와 관련된 연구 내지 기재는 개시된 바 없다.
본 발명자들은 TRPV1 억제를 통해 만성 통증을 치료하면서도 TRPV1 억제 시 동반되는 심각한 고열 등의 부작용을 해결할 수 있는 물질을 제공하고자 예의 노력한 결과, GDF11가 다양한 원인에 의해 발생하는 통증을 완화하는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 만성 통증을 비롯한 통증 동반 질환 및 TRPV1 매개 질환을 부작용 없이 치료할 수 있는 TRPV1 활성 매개 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 GDF11(growth differentiation factor 11) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, TRPV1 활성 매개 질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 GDF11(growth differentiation factor 11) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 포함하는 조성물을 TRPV1 활성 매개 질환 환자에 투여하는 단계를 포함하는, TRPV1 활성 매개 질환 치료방법이 제공된다.
용어의 정의:
본 명세서에서 사용되는 용어 "GDF11(growth differentiation factor 11)"은 BMP11(bone morphogenetic protein 11)이라고도 하며, 사람의 12번 염색체에 존재하는 GDF11 유전자에 의해 발현되는 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "TRPV1(Transient receptor potential channel, Vanilloid subfamily member 1)"은 열과 시각 미각 후각 촉각의 영역을 포함하는 비전압 양이온 개폐 채널(non voltage gated cation channel)로 이루어진 TRP 채널의 큰 과에 속한다. TRPV1은 상승작용을 통해 상호 작용하는 열, 양성자 및 내인성 물질에 의해 활성화되어 통각 신호를 유발한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "벡터"는 유전자의 전달을 위해 사용되는 도구를 지칭한다. 약물의 담체에 대응되는 개념으로 볼 수 있다. 따라서, 일반적인 플라스미드 벡터와 같이 도입하고자 하는 형질도입 유전자와 동일한 핵산 분자로 구성된 DNA 벡터 뿐만 아니라, 실리카나 금으로 이루어진 나노입자, 리포좀, 세포외소포, 및 엑소좀과 같은 인지질막 구조체, 키토산, 폴리에틸렌 이민 및 폴리라이신과 같은 양이온성 폴리머, 인산칼슘과 같이 DNA 형질감염에 사용되는 시약 역시 광의의 벡터에 포함이 된다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 GDF11(growth differentiation factor 11) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, TRPV1 활성 매개 질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비 바이러스성 벡터일 수 있고 상기 바이러스성 벡터는 아데노부속 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있으며 상기 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 혈청형(serotype)은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 또는 AAV16 일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 비 바이러스성 벡터는 DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜일 수 있고 상기 DNA 벡터는, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터 또는 인공 인간 염색체일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 TRPV1 활성 매개 질환은 통증, 고혈압(hypertension), 뇌졸중(stroke), 심근허혈증(myocardial ischaemia), 요실금(urinary incontinence), 비뇨 방광 과민증(urinary bladder hypersensitiveness), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 절박배변(fecal urgency), 위-십이지장 궤양(stomach-duodenal ulcer), 위식도 역류 질환(gastro-esophageal reflux disease: GERD), 크론병(Crohn's disease), 치핵(haemorrhoid), 천식(asthma), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 소양증(pruritus), 건선(psoriasis), 난청(hearing loss), 이명(tinnitus), 기침(cough), 다모증(hypertrichosis) 및 탈모증(alopecia)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 통증은 통각 통증(nociceptive pain), 심인성 통증(psychogenic pain), 염증성 통증(inflammatory pain), 또는 병적 통증(pathological pain)일 수 있으며 상기 병적 통증은 신경병증성 통증(neuropathic pain), 암성 통증(cancer pain), 항암제성 통증, 수술 후 통증(postoperative pain), 삼차 신경통(trigeminal neuralgia pain), 특발성 통증(idiopathic pain), 당뇨성 신경병증성 통증(diabetic neuropathic pain), 또는 편두통(migraine)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 통증의 완화 또는 치료방법이 제공된다.
본 발명에 따른 통증은 통각 통증, 심인성 통증, 조직 손상 및 면역 세포의 침윤과 관련된 염증 통증, 신경 시스템의 손상 또는 그것의 비정상적 기능에 의해 유발되는 질병 상태인 병적 통증(섬유 근육통, 과민성 대장 증후군, 긴장성 두통과 같은 기능 장애 통증)등을 포함한다. 또한, 통증은 해부학상 구분되는 등 통증을 포함할 수 있다: 목 통증, 등 가운데 통증(middle back pain), 등 아래쪽 통증 또는 꼬리뼈 통증(tailbone pain) 또한, 통증은 신경병증성 통증, 편두통(migraine) 등과 같은 통증을 포함할 수 있다. 신경병증성 통증은 외상(trauma)이나 염증, 허혈성 손상, 또는 대사산물 등 다양한 원인에 의해 신경계가 손상될 때 유발되는 만성적 신경질환으로 체성 감각(somatosensory) 시스템에 영향을 주는 손상 또는 질병에서부터 유발될 수 있다. 일반적으로 신경, 척수(spinal cord), 뇌의 이상에 의해 유발되고 인구의 1% 이상이 겪고 있는 것으로 추정되는 비악성(non-malignant) 만성 통증의 유형이다.
신경병증성 통증은 지각이상(dysesthesia)이라고 불리는 비정상적 감각, 통증을 유발하는 않는 무해한 자극에도 통증을 느끼는 이질통(allodynia), 열과 같은 유해한 자극에 대해 더 강하고 오랫동안 통증을 느끼는 통각과민증(hyperalgesia)과 관련이 있을 수도 있다. 또한, 신경병증성 통증은 연속적 및/또는 간헐적(발작) 요소일 수 있다. 후자는 전기 충격에 비유된다. 일반적인 특성은 화끈거림, 추위, 다리가 저리는 감각(pins and needles), 무감각(numbness) 및 가려움(itch)을 포함한다. 말초 또는 중추 신경 시스템에 영향을 받는지에 따라 말초 신경병성 통증 및 중추 신경병성 통증으로 구분될 수 있다. 대조적으로 통각 통증은 흔히 아픔(ache)으로 표현된다. 또한, 편두통은 다수의 자율신경계 증상과 관련되어 있으며 일반적인 정도부터 심각한 정도까지의 두통을 유발하는 만성적인 장애(chronic disorder)이다. 이들 편두통의 정확한 메커니즘은 현재까지 밝혀진 바 없다. 기본적인 이론은 대뇌피질(cerebral cortex)의 증가된 흥분도 및 뇌 줄기(brainstem)의 삼차 신경 핵(trigeminal nucleus)에서 통증 신경세포의 비정상적인 조절과 관련되어 있다. 예컨대, 통증은 신경병증성 통증(neuropathic pain), 암성 통증(cancer pain), 수술 후 통증(postoperative pain), 삼차 신경통(trigeminal neuralgia pain), 특발성 통증(idiopathic pain), 당뇨성 신경병증성 통증(diabetic neuropathic pain), 편두통 등으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물의 유효량은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리횟수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일 일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.01-100 중량%로 함유될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥 내 주입, 피하 주입, 뇌실 내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액 내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 척수강 내 주입(intrathecal injection), 경추간공 주입(transforaminal injection), 근육 내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명은 상기 약학 조성물의 치료적 유효량을 통증의 완화 및/또는 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 통증의 완화 및/또는 치료방법을 제공한다. 상기 방법은 투여하는 단계 전에 상기 환자를 통증의 완화 및/또는 치료가 필요한 환자로 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "치료적 유효량"은 원하는 효과, 통증의 완화 및/또는 치료 효과를 얻을 수 있는 활성 농도(active gradient) 양에 따를 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 TRPV1의 활성과 관련된 질병의 예방 및 치료에 유용하며, 급성 통증, 만성 통증, 신경병증성 통증, 수술 후 통증, 류마티스성 관절염 통증, 관절염 통증, 후포진성 신경통, 신경통, 두통, 치통, 골반통증, 편두통, 골암 통증, 항암제성 통증, 유방통 및 내장 통증(visceral pain)과 같은 통증; 신경장해, HIV-관련 신경장해, 신경 손상, 신경퇴화 및 뇌졸중과 같은 신경 관련 질병; 당뇨병성 말초신경병증; 절박배변(fecal urgency); 과민성 대장 증후군; 염증성 대장 질환; 위식도 역류질환(GERD), 위 십이지장 궤양 및 크론씨 병(Crohn's disease)과 같은 위장 질환; 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 기침과 같은 호흡기 질환; 요실금; 비뇨 방광 과민증; 건선, 소양증, 양진(prurigo) 및 피부염과 같은 신경증/알러지/염증 피부 질환; 청각과민(Hyperacusis); 난청(Hearing loss); 이명; 전정 과민증(vestibular hypersensitiveness); 심근허혈(Myocardial ischemia)과 같은 심장병; 출혈 쇼크(haemorrhagic shock); 다모증, 탈모(effluvium), 탈모증(alopecia)과 같은 모(hair) 성장 관련 질환; 비염; 췌장염; 방광염; 외음통(vulvodynia); 긴장 또는 공포와 같은 정신질환; 비만; 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병 이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 GDF11은 성장 분화 인자(growth differentiation factor) 12번째 유전자에 의해 코딩되는 단백질로 GDF11은 사이토카인의 역할을 하며 인간 및 생쥐의 분자구조가 동일하다. 골 형태 형성 단백질 그룹(bone morphogenetic protein group)은 다염기 단백질 분해 공정 사이트(polybasic proteolytic processing site)로 특징지어지며, 7개의 보존된 시스테인 잔기를 함유하는 단백질을 생성하기 위해 절단된다. 전신 GDF11 치료는 고령 생쥐의 해마와 피질의 혈관 구조를 향상시켜 신경 발생을 향상시키고 GDF11의 체계적인 보충은 제2형 당뇨병의 비유전자 및 유전자 마우스 모델 모두에서 β-세포의 생존 및 형태를 개선하고 포도당 대사를 개선시켰다.
GDF11은 혈액 내 식욕 또는 GDF15 수준에 영향을 미치지 않으면서 칼로리 제한과 같은 표현형을 유발하고, 인슐린/IGF-1 신호 전달 경로를 복원하며, 지방 세포에 직접 작용하여 백색 지방조직으로부터 아디포넥틴(adiponectin) 분비를 자극하고, 노화된 뇌의 신경 발생을 회복시킨다. 또한 피부 생물학(skin biology)의 조절제이며 프로콜라겐 I과 히알루론산의 생성에 중요한 영향을 미치고 피부 내피 세포(endothelial cells)에서 Smad2/3 인산화 경로를 활성화시키고 피부 맥관 구조(vasculature)를 향상시킨다. 노화된 마우스에서 증가된 GDF11 수준은 또한 근육 구조 및 기능적 특징을 향상시키고 강도 및 지구력 운동 능력을 증가시켰다.
아울러, GDF11은 산화 스트레스를 감소시키고 AGE, 단백질 산화 및 지질 과산화의 수준을 감소시키고 연령 관련 조직학적 마커의 축적을 늦추는 것으로 밝혀졌으며 CAT, GPX 및 SOD 활동 감소를 크게 억제했다. GDF11 패밀리의 구성원은 배아 및 성인 조직 모두에서 세포 성장 및 분화의 조절 인자로 생쥐와 아프리카 손톱개구리속(Xenopus)에서의 연구는 상기 단백질이 배아 발생 동안 중배엽(mesoderm) 형성과 신경 발생에 관여한다고 보고하였다.
상기 서열번호 2로 기재되는 인간 GDF11 및 이와 적어도 96% 이상의 상동성을 갖는 다른 포유류 유래의 GDF11도 사용할 수 있다. 상기 다른 포유류 유래의 GDF11은 마우스(Mus musculus, 서열번호 3), 침팬지(Pan troglodytes, 서열번호 4), 고릴라(Gorilla beringei graueri, 서열번호 5), 황금들창코원숭이(Rhinopithecus roxellana, 서열번호 6), 북부흰뺨긴팔원숭이(Nomascus leucogenys, 서열번호 7), 벵골원숭이(Macaca mulatta, 서열번호 8), 보노보(Pan paniscus, 서열번호 9) 또는 돼지(Sus scrofa domesticus, 서열번호 10)일 수 있다.
상기 인간 유래 GDF11 단백질은 다른 영장류 유래 GDF11과 상동성이 매우 높은 단백질로 다른 동물 유래 전장 펩타이드 또는 성숙 펩타이드의 전부 혹은 일부를 사용해도 상관없다. 이중 성숙 펩타이드는 299 내지 407번째 아미노산 위치에 해당되며(서열번호 1) 1 내지 298번째 아미노산 위치는 신호 펩타이드 및 전구체 단백질 중 절단되는 부분으로 상기 성숙 펩타이드의 경우 다른 포유동물과 상동성이 거의 100% 가까이 나타나므로 다른 동물 유래의 유전자를 활용하거나 단백질을 활용할 수 있다. 또한, 상기 성숙 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11로 기재될 수 있다.
본 발명은 단백질 내지 펩타이드 대신 유전자를 활용한 유전자 요법에 의해 구현될 수 있다. 이러한 유전자 요법을 위해, 유전자의 증폭 및 조작을 용이하게 하기 위해서 GDF11을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 조절서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트가 다양한 발현벡터에 삽입된 재조합 벡터가 사용된다. 이러한 발현 벡터에는 바이러스성 벡터 및 비 바이러스성 벡터로 구분이 된다. 상기 바이러스성 벡터에는 아데노부속 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터 등이 사용되고 있다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터에 대하여는 문헌에 잘 정리가 되어 있다. 상기 문헌은 본 발명에 참조로 삽입이 된다. 그러나, 이들 바이러스성 벡터 중 레트로바이러스나 렌티바이러스의 경우 숙주의 게놈에 형질도입 유전자(transgene)가 삽입이 되는데, 무작위적으로 삽입이 되기 때문에, 암의 발생과 같은 예기치 못한 부작용이 염려되고 있다. 이에, 숙주세포의 게놈 상에 일정한 위치에서만 삽입이 일어나는 아데노부속바이러스가 주목을 받고 있다.
상기 아데노부속바이러스(AAV; adeno-associated virus)는 단일사슬 DNA 바이러스로서 헬퍼 벡터 의존적 사람 파보바이러스(Helper-dependent human parvovirus)이다. 게놈크기는 약 4.7 kbp이며, 게놈의 N-말단 부분은 바이러스 복제와 바이러스 유전자의 발현에 관여하는 rep 유전자를 코딩하고, C-말단 부분은 바이러스의 캡시드(capsid) 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 코딩하고 있으며, 양 말단부위에 약 145 염기가 삽입된 반복영역(ITR)으로 구성되어 있다. rep 영역으로부터는 4개의 단백질이 번역되는데, 이들은 그 분자량에 따라 rep78, rep68, rep52, rep40으로 구분되며, AAV DNA 복제에 중요한 기능을 수행한다. cap 영역으로 부터는 3개의 단백질 즉, VP1, VP2, VP3이 번역되며 이들은 AAV 입자형성(virus assembly)에 필요한 구조단백질들이다.
본 발명의 AAV 벡터는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 외래 유전자 서열을 세포 내로 운반하는데 이용될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 요법용 발현벡터는 GDF11을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 비 바이러스성 발현벡터 특히 플라스미드 벡터 등 DNA 벡터에 삽입이 되어 사용이 될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열이 형질도입 유전자를 도입하고자 하는 생체 내에서 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직의 세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직 특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 유전자 요법에 사용되는 발현 벡터의 설계는 형질도입 유전자가 도입될 숙주의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 해당 업계 종사자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주에 도입되어 GDF11 단백질을 발현할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터는 진핵세포 특히 포유동물에서 외래 유전자를 발현시킬 수 있는 진핵세포의 조절서열을 가지고 있어야 한다. 이러한 진핵세포에서 외래 유전자의 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 해당 업계 종사자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및 선택적으로 전사물의 전사 종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진 인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 내의 세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경세포 내 발현을 위해, 신경 미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌에 기술되어 있다. 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 발명에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(Invitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX-27, pX, 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5 등이 존재한다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비 신호들은 해당 업계 종사자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, GDF11을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 암호화 서열에 조합될 수 있고, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포 외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더서열이다.
또한, 본 발명의 발현벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 이중 특이성 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있다.
상기 발현벡터는 분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분비 신호서열은 세포내에서 발현되는 재조합 단백질의 세포 밖으로의 분비를 유도하며, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 유전자 요법용 비 바이러스성 발현벡터는 숙주세포에서 상기 GDF11을 발현할 수 있는 DNA 벡터일 수 있으며, 상기 DNA 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.
아울러, 상기와 같은 DNA 발현벡터를 이용한 유전자 요법에 사용되는 유전자 전달법으로는 전기천공법, 유전자총(gene gun), 초음파 마이크로 버블 요법, 자성형질감염(magnetofection), 금이나 실리카 나노입자, 양이온성 폴리머, 리포좀, 나노입자, 및 엑소좀 등의 벡터를 이용하여 형질감염시키는 방법이 사용될 수 있다. 이들 유전자 전달법은 업계에 잘 알려져 있다. 최근에는 DNA 백신 조성물을 소형 전기천공장치를 이용하여 비가역적 전기천공법을 적용하여 인체의 근육에 직접 주입하는 방법이 사용되고 있다.
투과성의 비-선택적 양이온 채널 패밀리 중 하나인 TRPV1의 활성은 Ca2+ 유입을 유도하고 캡사제핀(capsazepine)과 같은 특정 길항제에 의해 억제된다. 또한, 캡사이신(capsaicin), 열, 낮은 pH, 브래디키닌(bradykinin), PGE2, 또는 ATP 등에 의해 직접적으로 활성화되며 이러한 활성조건은 TRPV1이 열-화학적 자극 및 조직 손상에 대한 일차적인 생물학적 센서임을 의미한다. TRPV1은 뇌, 신장, 기관지 상피세포 및 표피 각질세포와 같은 다양한 조직에 존재하는 것으로 보고되고 있고 캡사이신 자극은 각질세포의 세포질 내 Ca2+ 농도를 증가시키고 이는 캡사제핀에 의해 억제된다. 상기 TRPV1의 길항제가 만성 통증의 치료제로 보고되었으나 TRPV1의 약리학적 억제가 고열을 유발하므로 고열 작용이 없는 진통제의 개발이 요구되었다. 이에 본 발명자들은 TRPV1를 효과적으로 억제할 수 있는 통증 치료용 조성물에 대한 연구를 수행하였고 GDF11이 통증 치료에 대한 신규 길항분자가 될 수 있음을 확인하여 본 발명의 TRPV1 활성 억제를 이용한 통증 치료용 조성물을 개발하였다. 본 발명자들은 재조합 GDF11이 세포 내 칼슘(Ca2+) 이미징 및 총-세포 패치 클램핑을 사용하여 마우스 1차 소형 감각신경세포(DRG)에서 농도 의존적 방식과 관련된 TRPV1 채널의 기능을 억제함을 관찰하였다. 또한, TRPV1-형질감염된 HEK293 세포주에서 DRG 뉴런과 유사한 결과를 확인하였으며 따라서 상기 결과는 본 발명의 GDF11이 만성 통증에서 TRPV1 채널을 길항하는 새로운 통증 치료제로 활용될 수 있고 TRPV1 활성과 관련된 다양한 매개 질환들을 치료할 수 있는 치료제로 활용될 수 있음을 시사한다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 GDF11(growth differentiation factor 11) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 포함하는 조성물을 TRPV1 활성 매개 질환 환자에 투여하는 단계를 포함하는, TRPV1 활성 매개 질환 치료방법이 제공된다.
상기 발현벡터 또는 TRPV1 활성 매개 질환은 상기 약학적 조성물에서 사용되는 개념과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 TRPV1 활성 억제를 이용한 통증 치료용 조성물은 척수신경 손상에 의해 발생된 신경병증성 통증을 우수하게 억제하는 효과를 나타내었으므로 관절염, 당뇨병성 말초신경병증과 같은 TRPV1 채널과 관련된 다양한 통증 상태 및 질환에 대한 신규 통증 치료제로 활용될 수 있다. 또한 TRPV1 활성을 효과적으로 억제하므로 다양한 TRPV1 활성 매개 질환을 치료하는 치료제로도 활용가능하다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 마우스 만성통증모델을 제조하여 본 발명의 GDF11 처리에 따른 열 통각 과민화 억제 평가(a) 및 TRPV1 이온채널 활성 억제 평가 방법(b)을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 2a는 본 발명의 GDF11를 척수신경 손상 마우스 모델에 주입함에 따른 복사열 자극에 의한 회피반응 지연시간을 분석한 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 GDF11(0.1 ㎎/㎏)를 항암제성 말초신경병증 마우스 모델에 주입함에 따른 복사열 자극에 의한 회피반응 지연시간을 분석한 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 GDF11(0.2 ㎎/㎏)를 항암제성 말초신경병증 마우스 모델에 주입함에 따른 복사열 자극에 의한 회피반응 지연시간을 분석한 그래프이다.
도 3a는 마우스 감각신경세포에서 본 발명의 GDF11 및 캡사이신 처리에 의한 칼슘 유입량 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 3b는 마우스 감각신경세포에서 본 발명의 GDF11 및 캡사이신 처리에 의한 대조군 대비 농도별 칼슘 유입량의 비율을 비교한 그래프이다.
도 4a는 pcDNA-TRPV1 벡터를 이용하여 형질전환시킨 HEK293(Human Embryonic Kidney 293) 세포에서 본 발명의 GDF11 및 캡사이신 처리에 의한 칼슘 유입량 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 4b는 pcDNA-TRPV1 벡터를 이용하여 형질전환시킨 HEK293(Human Embryonic Kidney 293) 세포에서 본 발명의 GDF11 및 캡사이신 처리에 의한 대조군 대비 농도별 칼슘 유입량의 비율을 분석한 그래프이다.
도 5a는 마우스 감각신경세포에서 본 발명의 GDF11 및 캡사이신 처리에 의한 내향 전류 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 5b는 마우스 감각신경세포에서 본 발명의 GDF11 및 캡사이신 처리에 의한 대조군 대비 농도별 내향 전류 크기 비율을 분석한 그래프이다.
도 6a는 pcDNA-TRPV1 벡터를 이용하여 형질전환한 HEK293 세포에서 본 발명의 GDF11 및 캡사이신 처리에 의한 TRPV1 내향 전류 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 6b는 pcDNA-TRPV1 벡터를 이용하여 형질전환한 HEK293 세포에서 본 발명의 GDF11 및 캡사이신 처리에 의한 대조군 대비 농도별 내향 전류 크기 비율을 분석한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 GDF11을 항암제성 말초신경병증 마우스 모델에 투여한 후의 체온변화를 나타낸다. GDF11을 투여하더라도 마우스의 체온에 급격한 변화는 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
도 8은 본 발명의 GDF11을 발현하는 아데노부속바이러스 벡터 AAV-GDF11가 마우스 감각신경세포(L4 DRG 또는 L5 DRG)에서 안정적으로 GDF11을 발현하고 있음을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 GDF11을 발현하는 아데노부속바이러스 벡터 AAV-GDF11를 신경병증성 통증 마우스 모델에 투여함에 따른 복사열 자극에 의한 회피 반응 지연시간을 분석한 그래프이다.
일반적 방법
신경성 동통의 척수신경 손상 마우스 모델의 제조
본 발명자들은 척수신경 손상(spinal nerve transection, SNT) 동물모델을 제작하였다. 구체적으로, 6주령의 C57BL/6 수컷 마우스를 동물 실험실 사육환경에서 1주간 순화 기간을 거친 후, 1회에 거쳐 적외선 열 자극 장비를 이용하여 오른쪽 뒷 발바닥에 복사열 자극을 가하고 회피 반응까지의 시간을 측정하여 기준치를 설정하였다. 그 후, 실험군을 무작위로 분리하였고(n = 5-6 마우스/그룹), 척수신경 손상 수술을 진행하였다. 먼저, 펜토바르비탈 소듐(60 ㎎/㎏)을 복강 내 주사하여 마취시킨 상태에서 마우스 등의 피부를 절개하여 5번 요추신경(L5 spinal nerve)을 절단하였고 상기 절개된 근육 및 피부는 외과용 스테이플(surgical staples)로 봉합하였다.
말초신경병증 동물 모델의 제작
본 발명자들은 항암제성 신경병증(Chemotherapy-induced peripheral neuropathy; CIPN) 동물모델을 제조하였다.
구체적으로, 6주령의 C57BL/6 수컷 마우스를 동물 실험실 사육환경에서 1주간 순화 기간을 거쳤다. Cremophor EL과 absolute ethanol을 1:1 비율로 섞은 용액 1.66 ㎖에 파클리탁셀(paclitaxel; Sigma aldrich, USA) 10 ㎎을 녹여 6 ㎎/㎖로 stock을 만들고, 마이크로튜브에 100 ㎕씩 나누어 담아 -20℃에 보관했다. 투여 바로 전 파클리탁셀 stock을 녹인 후, saline에 1/30로 희석하여 1일 1회 5일간 2 ㎎/㎏ 용량(누적 투여용량 10 ㎎/㎏)을 복강으로 투여하여 항암제성 통증을 유발하였다. 마지막 투여를 수행하고 나서 7일 후에 열 통각 반응을 평가하여 복사열 자극에 대한 회피 반응 시간이 6초 미만인 개체를 항암제성 통증이 발병된 것으로 간주하였다.
열 통각 과민화 측정
열 통각 측정 장비의(Plantar test analgesia meters) 유리판 위에 밑이 뚫려 있는 아크릴 챔버를 올리고, 챔버 안에 마우스를 3일 동안 2시간씩 넣어두어 안정화 과정을 거친다. 척수신경 손상 마우스 모델을 만들기 전 복사열 자극에 대한 기본 통증 반응 값을 측정한다. 8-10초의 기본 통증 회피 반응 시간을 얻기 위해 적외선 강도를 25 또는 30으로 설정하였다. 마우스의 오른쪽 뒷발바닥에 복사열 자극을 개체 당 최소 1분 이상의 간격으로 3번씩 가하고 회피 반응 시간을 측정하여 그 평균값을 열 통각 반응 값으로 제시하였다. 열 통각 반응 평가 시 복사열 자극에 의해 발바닥 조직의 열 손상을 방지하기 위해 열 자극의 지속시간을 20초로 제한하였다. 기본 통증 반응 값을 측정한 후, 전체 개체의 평균값을 기준으로 각 개체의 반응 값 변화율을 계산하여 전체 평균값 ± 50% 범위 안에 속한 개체들을 선별하였다. 선별된 개체들만을 이용하여 신경병증성 통증 모델을 제작하고 신경 손상 후 5일째에 위와 같은 조건으로 열 통각 과민반응을 측정하였다. 열 통각 반응 측정 시 매번 2시간씩 실험동물을 아크릴 챔버에 넣고 안정화된 후 복사열 자극을 가했으며, 오후 4시부터 6에 사이에 열 통각 반응을 측정했다. 이후, 신경병증성 통증 동물모델을 임의로 두 그룹으로 나누고 human recombinant GDF11 또는 saline을 척 수강 내로 투여한 후, 열 통각 반응의 진통 효과를 평가하였다(도 2a). 실험그룹에 대해 암맹상태인 연구자가 열 통각 반응을 측정했으며, 계획된 열 통각 반응평가시험이 종료된 후, 약물 투여군의 정보를 이용하여 결과를 분석하고 통계처리를 수행하였다.
척수강 내 약물 투여
이소플루레인(Isoflurane) 호흡 마취 하에 주사기를 이용하여 약물을 직접 척수 강 내로 투여하였다. Hamilton 주사기에 30 게이지의 바늘을 연결하고 GDF11 또는 saline을 채운 다음 5번과 6번 척추 뼈 사이 공간으로 주사하여 10 ng/5 ㎕ 농도로 GDF11을 투여하였다.
마우스 감각신경세포의 배양
본 발명자들은 마우스에서 후근신경절(dorsal root ganglion, DRG)로부터 감각신경세포를 1차 배양하였다. 구체적으로, 생후 6-9주 C57BL/6 마우스를 5분 동안 아이소플루레인으로 마취시키고, 70% 에탄올로 소독한 뒤, 등 부위를 절개하였다. 그 후 모든 부위의 척수 DRG를 해부하였고, 10X HBSS와 10 mM HEPES가 혼합된 용액에 넣었다(wood et al, J Neurosi. 8, pp3208-3220, 1988). 그 후 상기 후근 신경절을 0.2 ㎎/㎖ 콜라제네이스(collagenase A) 및 3 ㎎/㎖ 디스페이즈(dispase Ⅱ)를 혼합한 용액에서 배양하였고 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 1회 세정하였으며, 파스퇴르 파이펫을 이용하여 분쇄하였다. 이어서 폴리-디-라이신(poly-D-lyrine)이 코팅되어있는 커버슬립에 평균 100~300개의 세포를 분주하였고 1시간 배양 후, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin streptomycin), 1X B27 서플리먼트를 포함하는 뉴로바잘(Neurobasal) 배지를 2 ㎖ 추가하여 배양했다.
세포 내 Ca2+ 유입 실험
칼슘 유입 측정 실험을 위해 상기 1차 배양한 감각신경세포에 2 μM Fura-2AM를 포함한 DMEM 배지에 40분간 노출시킨 후 F340/F380 비율을 통해 칼슘 이온의 세포 내 유입 정도를 측정하였고 200 nM 캡사이신(capsaicin)에 의해 증가된 F340/F380에 대해서 GDF11 전처리(pre-treatment)에 의한 칼슘 유입 억제율을 측정하였다. 구체적으로, 세포 내 칼슘 이온 농도 측정은 이미징 카메라가 장착된 현미경과 이에 연결된 형광측정장치를 이용하였다. 형광측정 시 나타나는 형광 파장의 비율(F340/F380)이 세포 내 칼슘 이온 농도를 반영한다. 약물이 포함된 관류액은 2~3 ㎖/min의 속도로 관류시켰다. 상기 관류액의 조성은 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glucose 및 10 mM HEPES이며 NaOH를 첨가하여 pH 7.4로 조정하였다(도 1b).
단일 세포 패치클램프 실험
패치클램프 실험을 통해 GDF11에 의한 캡사이신 유도 내향 전류 억제율을 측정하였다. 패치 파이펫 내 용액의 조성은 126 mM K-gluconate, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM Na2GTP, 2 mM Na2ATP, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA이며 KOH를 첨가하여 pH 7.4로 조정하였다. 세포 외 관류액의 조성은 140 mM NaCl, 2 mM EGTA, 1 MgCl2, 10 mM glucose, 5 mM KCl, 10 mM HEPES이며 NaOH를 첨가하여 pH 7.4로 조정하였다. 약물이 포함된 세포 외 관류액을 중력에 의해 2~3 ㎖/min 속도로 관류시켰고 세포외 관류액을 통해 통각 신경세포에서 캡사이신, GDF11을 관류하여 GDF11에 의한 캡사이신 유도 내향 전류 억제율을 측정하였다.
pcDNA TRPV1 발현벡터의 HEK293 세포 내 형질전환
본 발명자들은 TRPV1의 유전자와 GFP(green fluorescence protein) 유전자를 동시에 HEK293 세포에 형질 전환한 후, 상기 기술한 세포 내 Ca2+ 유입 측정 실험과 단일 세포 패치클램프 실험을 통해 칼슘 유입 및 내향 전류를 측정하였다. 구체적으로 lipofectamineTM 2000 (Invitrogen, USA)을 이용하여 pcDNA TRPV1 발현벡터를 하기의 방법을 이용하여 형질전환시켰다. 먼저 35 mm 세포 배양 접시에서 배양한 HEK293 세포의 배지를 제거한 뒤 DMEM 배지만을 넣고 5% CO2, 37℃에서 습식 배양하였으며 pcDNA-TRPV1 (1 ㎍), lipofectamine (10 ㎕)을 각각의 DMEM 배지에 녹여 5분간 기다린 후 두 배지를 혼합하여 다시 20분간 대기하였다. 그 후 HEK293 세포가 부착된 dish의 DMEM 배지를 제거한 뒤, 앞서 제조한 pcDNA가 포함된 배지를 분주하여 4시간 동안 5% CO2, 37℃에서 습식 배양하였다. 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지로 갈아주어 12시간 배양 후 24시간 이내에 칼슘이미징 혹은 패치클램프 실험을 수행하였다.
바이러스 벡터의 제조
본 발명자들은 GDF11 유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 제조하고자 하였다.
구체적으로, 신경세포로의 감염 및 감염된 세포에서 GDF11의 상시 발현을 유도하기 위해 AAV5 serotype과 CMV 프로모터를 선택했다. 또한, GDF11 뉴클레오타이드 서열 뒤에 IRES(Internal ribosome entry site) 와 eGFP(enhanced green fluorescence protein) 뉴클레오타이드 서열을 추가하여 감염된 세포 내에서 GDF11과 GFP 단백질이 서로 독립적으로 발현될 수 있도록 했으며, GFP 형광단백질 신호를 통해 실험동물의 조직 내에서 감염된 세포의 분포와 GDF11 발현을 평가할 수 있다. AAV5 벡터에 GDF11 유전자를 실어서 바이러스 벡터를 생산한 후 뉴클레오타이드 시퀀싱을 통해 정상적인 GDF11 유전자의 삽입을 검증했으며 그리고 테스트한 GDF11 발현 바이러스의 titer는 1.22 × 1013 GC/㎖ 이었다.
조직면역염색
본 발명자들은 유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 척수 강 주사 후 감각신경세포에서 GDF11 발현을 확인하기 위해 조직면역염색을 수행하였다.
구체적으로, 실험동물에 펜토바르비탈 소듐(60 ㎎/㎏)을 복강으로 주사하여 마취하였다. 30 ㎖ 주사기에 0.9% NaCl 용액 30 ㎖을 채운 다음 심장의 우심방 쪽을 절개하고 주사기를 좌심실에 찔러서 혈액을 제거하였다. 이어서 10% 포르말린 용액 30 ㎖을 좌심실로 투여하여 고정 작업을 수행한 후 L4와 L5 DRG 조직을 샘플링 하였다. 떼어낸 DRG 조직을 10% 포르말린 용액에 16시간 동안 담가 추가 고정 작업을 진행하였고, 이후 30% sucrose 용액으로 조직을 옮겨서 이틀 동안 탈수과정을 진행하였다. 이후, DRG 조직을 -20℃에서 얼린 다음 12 ㎛ 두께로 절편조직을 만들었다. Tubulin 항체(Santa Cruz, USA)를 0.1 M PBS 용액에 1/100으로 희석하여 DRG 조직 절편에 24시간 동안 처리하였고, 0.1 M PBS로 세척작업 후 공초점 현미경을 이용하여 형광이미지를 캡처하였다.
실험통계
통계분석은 prism(Graphpad, version 501) 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 정규성 테스트(normality test)를 통해 정규분포 여부를 확인한 후, 모수 검정법 혹은 비모수 검정법을 이용하였다. 상기 모수 및 비모수 검정법은 2그룹 이상일 경우 t-test를 수행하였으며, 3그룹 이상일 때 one way ANOVA test 혹은 two way ANOVA test로 분석하였다. 오차 막대(error bar)는 SEM(standard error of measurement)으로 가시화하였고 만일 실험결과가 유의한 경우 * 혹은 # [P<0.05의 경우 1개, P<0.005의 경우 2개, P<0.001의 경우 3개]으로 표기하였다.
[실시예 1]
열 통각 과민화 평가
<1-1> 척수신경 손상 만성통증 마우스 모델
본 발명자들은 척수신경 손상(SNT) 만성통증 마우스 실험모델을 제작하였고 GDF11(10 ng)을 척수 강 내 투여 후 하그리브스 장비를 이용하여 열 통각 반응을 평가하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 본 발명의 GDF11을 만성 통증 마우스 모델에 투여에 따라 열 통각 과민화 현상을 억제하여 뒷발바닥 회피 반응 지연시간이 증가하는 것으로 나타났다(도 2a).
<1-2> 말초신경병증 마우스 모델
본 발명자들은 항암제성 말초신경병증(CIPN) 마우스 실험모델을 제작하였고, GDF11 0.1 ㎎/㎏ 또는 0.2 ㎎/㎏를 복강 내 투여후 하그리브스 장비를 이용하여 열 통각 반응을 평가하였다.
그 결과, [도 2b] 및 [도 2c] 에 나타나는 바와 같이 GDF11 투여에 따라 열 통각 과민화 현상을 억제하여 회피 반응 지연시간이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 대표적인 통증 치료제 중 하나인 가바펜틴(Gabapentin; Sigma aldrich, USA) 대비 GDF11 이 650배 적은 양으로 더 오랫동안 열 통각 과민화 현상을 억제하는 것으로 나타났다(도 2b).
[실시예 2]
마우스 감각신경세포 및 HEK293 세포 내 칼슘 유입량 분석
일차 배양한 마우스 감각신경세포 및 pcDNA-TRPV1 벡터를 이용하여 형질전환한 HEK293 세포에서 본 발명의 GDF11(10 nM) 및 캡사이신(200 nM) 처리에 의한 칼슘 유입량 및 GDF11 농도별(0.1 nM, 1 nM 또는 10 nM) 처리에 따른 칼슘 유입량을 비교분석 하였다.
그 결과, GDF11을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 본 발명의 GDF11의 처리는 TRPV1-매개 Ca2+ 유입 (Ca2+ transient) 현상을 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 3a, 3b 및 4a, 4b) 칼슘 유입의 정도는 캡사이신에 의한 첫 번째 칼슘반응 크기를 기준으로 표준화하여 나타내었다.
[실시예 3]
마우스 감각신경세포 및 HEK293 세포 내 내향전류 크기 분석
일차 배양한 마우스 감각신경세포 및 pcDNA-TRPV1 벡터를 이용하여 형질전환시킨 HEK293 세포에서 본 발명의 GDF11(10 nM) 및 캡사이신(200 nM) 처리에 의한 내향 전류 크기 및 GDF11 농도별(0.1 nM, 1 nM 또는 10 nM) 처리에 따른 내향 전류 크기를 비교분석하였다. 그 결과, GDF11을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 본 발명의 GDF11은 마우스 감각 신경세포에서 캡사이신으로 유도된 TRPV1-매개 내향 전류를 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 5a, 5b 및 6a, 6b) 내향 전류의 측정은 캡사이신에 의한 첫 번째 반응의 크기를 기준으로 표준화하여 나타내었다.
상기 실시예 1 내지 실시예 3의 결과는 GDF11의 처리는 TRPV1 이온 채널 활성을 저농도에서 효과적으로 억제하므로 TRPV1의 효과적인 길항제로 활용할 수 있음을 시사한다.
[실시예 4]
GDF11 의 부작용 확인
기존의 TRPV1 길항제들은 진통 효능을 나타내는 투여 조건에서 이상발열 또는 저체온증의 부작용을 동반하는 것으로 알려져 있어, 본 출원인은 GDF11의 투여로 인해 상기 부작용 발생 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 등 쪽 일부분의 털을 면도하여 피부가 노출된 항암제성 통증모델 마우스에 캡사이신에 의한 TRPV1 활성을 유사한 정도로 억제하는 농도의 BCTC(30 ㎎/㎏) 또는 GDF11(0.1 ㎎/㎏ 또는 0.2 ㎎/㎏)을 복강투여한 후 열화상 카메라를 이용하여 노출된 피부의 온도를 시간대별로 측정하였다.
그 결과, [도 7]에서 나타나는 바와 같이 GDF11를 투여하더라도 마우스의 체온에는 유의한 변화가 발생하지 않는 것으로 나타나, GDF11 투여는 이상발열 또는 저체온증의 부작용을 유발하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 대표적인 TRPV1 길항제인 BCTC를 30 ㎎/㎏ 용량으로 복강 투여한 경우 이상발열 부작용이 나타났다.
[실시예 5]
바이러스 벡터의 GDF11 발현 확인
본 발명자들은 제조한 바이러스 벡터를 투여하는 경우 체내 GDF11 발현이 유도되는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 말초 척수신경 손상에 의한 신경병증성 통증모델에 1.22×1011 GC/㎖ 농도의 GDF11 바이러스 벡터 5 ㎕를 척수 강 내 주사하였다. 5주 후 마우스를 희생시켜 L4와 L5 DRG 조직을 샘플링하고 동결건조 섹션을 제작하였다. Tubulin 항체로 조직을 면역염색했고, GFP 형광신호를 GDF11 발현량으로 간주하여 공초점 현미경으로 이미징 작업을 수행하였다.
그 결과, [도 8]에서 나타나는 바와 같이 마우스의 L4 또는 L5 DRG 뉴런에서 GDF11이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6]
바이러스 벡터의 통증 완화 효과 확인
본 발명자들은 제조한 바이러스 벡터 AAV5-GDF11이 신경병증성 통증 동물모델에서 진통 효과를 나타내는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 통증모델 제작 전 기본 통증 반응 값을 측정한 후 말초 척수신경을 절단하여 신경병증성 통증모델을 제작하였다. 통증모델 수술 3일 후 열 통각 반응을 평가하여 회피 반응 역치 값이 6초 이하로 떨어진 개체를 통증모델로 간주하였다. 이 통증모델에 1.22×1011 GC/㎖ 농도의 GDF11 바이러스 벡터 5 ㎕를 척수 강 내 주사하고, 매주 1회 하그리브스 장비를 이용하여 열 통각 반응을 평가하였다.
그 결과, [도 9]에서 나타나는 바와 같이, AAV5-GDF11을 투여함에 따라 열 통각 과민화 현상을 억제하여 회피 반응 지연시간이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
종합적으로 본 발명의 TRPV1 활성 억제를 이용한 통증 치료용 조성물인 GDF11은 TRPV1 채널을 신속하게 효과적으로 억제하는 것으로 나타났으므로 관절염, 당뇨병성 말초신경병증과 같은 TRPV1 채널과 관련된 다양한 통증 상태 및 질환에 대한 신규 치료제로 활용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 TRPV1 활성 억제를 이용한 통증 치료용 조성물은 척수신경 손상에 의해 발생된 신경병증성 통증을 우수하게 억제하는 효과를 나타내었으므로 관절염, 당뇨병성 말초신경병증과 같은 TRPV1 채널과 관련된 다양한 통증 상태 및 질환에 대한 신규 통증 치료제로 활용될 수 있다. 또한 TRPV1 활성을 효과적으로 억제하므로 다양한 TRPV1 활성 매개 질환을 치료하는 치료제로도 활용 가능하므로 산업상 이용가능성이 높다.
서열번호 1은 GDF11(growth differentiation factor 11) 성숙 펩타이드(mature peptide)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 2는 인간 GDF11 펩타이드의 아미노산 서열 전장을 나타낸다.
서열번호 3은 마우스 GDF11 의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 4는 침팬지 GDF11 의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 5는 고릴라 GDF11 의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 6은 황금들창코원숭이 GDF11 의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 7은 북부흰뺨긴팔원숭이 GDF11 의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 8은 뱅골원숭이 GDF11 의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 9는 보노보 GDF11 의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 10은 돼지 GDF11 의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 11은 상기 GDF 11 펩타이드(서열번호 1)을 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 GDF11(growth differentiation factor 11) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, TRPV1 활성 매개 질환 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비 바이러스성 벡터인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 바이러스성 벡터는 아데노부속바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터인, 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 혈청형(serotype)은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 또는 AAV16인, 약학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 비 바이러스성 벡터는 DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜인, 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 DNA 벡터는, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터 또는 인공 인간 염색체인, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 TRPV1 활성 매개 질환은 통증, 고혈압(hypertension), 뇌졸중(stroke), 심근허혈증(myocardial ischaemia), 요실금(urinary incontinence), 비뇨 방광 과민증(urinary bladder hypersensitiveness), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 절박배변(fecal urgency), 위-십이지장 궤양(stomach-duodenal ulcer), 위식도 역류 질환(gastro-esophageal reflux disease: GERD), 크론병(Crohn's disease), 치핵(haemorrhoid), 천식(asthma), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 소양증(pruritus), 건선(psoriasis), 난청(Hearing loss), 이명(tinnitus), 기침(cough), 다모증(hypertrichosis) 및 탈모증(alopecia)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 통증은 통각 통증(nociceptive pain), 심인성 통증(psychogenic pain), 염증성 통증(inflammatory pain) 또는 병적 통증(pathological pain)인, 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 병적 통증은 신경병증성 통증(neuropathic pain), 암성 통증(cancer pain), 항암제성 통증, 수술 후 통증(postoperative pain), 삼차 신경통(trigeminal neuralgia pain), 특발성 통증(idiopathic pain), 당뇨성 신경병증성 통증(diabetic neuropathic pain), 편두통(migraine), 관절통(arthralgia) 및 신경통(neuralgia)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  10. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 GDF11(growth differentiation factor 11) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 포함하는 조성물을 TRPV1 활성 매개 질환 환자에 투여하는 단계를 포함하는, TRPV1 활성 매개 질환 치료방법.
PCT/KR2020/018895 2020-01-20 2020-12-22 Trpv1 활성 매개 질환 치료용 약학적 조성물 WO2021149925A1 (ko)

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