WO2021149761A1 - 表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物、前記３次元培養物の製造方法、および前記３次元培養物を用いた被検物質の評価方法 - Google Patents

表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物、前記３次元培養物の製造方法、および前記３次元培養物を用いた被検物質の評価方法 Download PDF

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芳浩 中島
歴 宮崎
克裕 近江谷
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Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional culture of immortalized skin cells having a stratum corneum formed on the surface layer, a method for producing the three-dimensional culture, and a method for evaluating a test substance using the three-dimensional culture.
  • Cultured skin cells are widely used in the development of cosmetics, pharmaceuticals, and quasi-drugs for screening test substances with toxicity and skin protective activity and for elucidating the mechanism. For example, there is a method of collecting skin cells from a healthy adult and using them for the above screening, but there is an ethical problem in receiving skin cells from a healthy person for screening, and the characteristics of the skin by the skin donor. There is also the problem that
  • An in vitro complete skin model comprising a support layer containing a collagen matrix, a dermis equivalent, a basement membrane, an epidermis equivalent, said dermis equivalent, and the dermis or epidermis equivalent comprising a three-dimensional sweat gland equivalent.
  • the primary fibroblasts are cultured to produce a dermis equivalent, the primary keratinocytes are cultured on the dermis equivalent, and then further cultured at the air-culture solution boundary to form a three-dimensional sweat gland equivalent. ..
  • human fibroblasts are cultured to serve as a support for cultured skin, and a melanocyte suspension is added thereto for adhesion, and human epidermal keratinized cells are further seeded and cultured in air for exposure to the epidermal layer.
  • a melanocyte suspension is added thereto for adhesion
  • human epidermal keratinized cells are further seeded and cultured in air for exposure to the epidermal layer.
  • the primary cultured cells such as human primary fibroblasts and primary keratinocytes used in Patent Document 1 have a finite lifespan. The same applies to normal human skin fibroblasts and normal human epidermal keratinocytes used in Patent Document 2.
  • Introducing a reporter gene into cultured cells makes it possible to visualize intracellular information (Patent Document 3), but even if a specific reporter gene is introduced into a finite-life cell such as a primary cultured cell, it is subcultured for a long period of time. It is difficult.
  • primary cultured cells are often a mixture of various cells rather than a single cell, maintenance of cell characteristics is not guaranteed even if the cells are limited to a predetermined period of culture.
  • human primary cells and other human cells are required to be ethically considered due to their nature, and if it is difficult for researchers to collect them themselves, they need to be purchased from a specific overseas company.
  • the immortalized skin culture cell line can be subcultured and has merits such as small variation between production lots.
  • a reporter assay can be performed by introducing a reporter gene into cultured skin cells using a genetic engineering technique.
  • the epidermal tissue in the living body is a three-dimensional structure composed of a basal layer, a spinous layer, a granular layer, and a stratum corneum from the deep part. Normally, in vitro cell culture can only obtain a two-dimensional monolayer structure in a container, and spontaneous formation of a three-dimensional structure does not occur.
  • Jurkat, U937 cells, THP-1 cells and the like used in Patent Document 3 are all immune cells, not skin cells.
  • the reporter gene has been introduced into these immune cells and other primary cultured cells, there have been no cases where the reporter gene has been introduced into immortalized skin cells and a three-dimensional structure has been formed while retaining the function of the reporter.
  • a reporter gene is introduced into immortalized skin cells and the surface layer is used for use as an alternative method for animal experiments in which tests such as drug efficacy and safety evaluation of various test substances are performed without conducting animal experiments. It is desired to develop a three-dimensional cultured skin model in which a stratum corneum is formed.
  • an immortalized skin cell into which a reporter gene has been introduced is used as the three-dimensional culture, a test substance is administered thereto, and the skin of the test substance is based on the expression of the introduced reporter gene. It is an object of the present invention to provide a method for evaluating a test substance, which comprises evaluating sensitivities and / or physiological activity.
  • the present inventors can produce a three-dimensional culture of immortalized skin cells in which a stratum corneum is formed on the surface layer of the cell culture by three-dimensionally culturing the immortalized skin cells while applying stress.
  • the three-dimensional culture can be suitably used for screening of a test substance, and completed the present invention.
  • the present invention is a cultured laminate of a plate-shaped substrate and immortalized skin cells adhering to the surface of the plate-shaped substrate, and the cultured laminate is characterized in that the surface layer is composed of a stratum corneum. To provide a three-dimensional culture of immortalized skin cells.
  • the immortalized skin cells are HaCaT, NHEK / SVTERT3-5 (human skin keratinocytes), SIK (immortalized epidermal keratinocytes by spontaneous immortalization), immortalized human epidermal keratinocytes-SV40.
  • the immortalized skin cells can evaluate a first reporter gene controlled by a constantly expressed promoter, a second reporter gene controlled by a promoter capable of evaluating skin sensitization, and / or physiological activity. It provides a three-dimensional culture of the immortalized skin cells, which comprises a third reporter gene regulated by a promoter.
  • the plate-shaped base material is a liquid-impregnated base material composed of one or more base materials selected from the group consisting of silica, alumina, zirconia, titania, hydroxyapatite, and synthetic resin. It provides a three-dimensional culture of the immortalized skin cells.
  • the present invention provides a method for producing a three-dimensional culture of immortalized skin cells having a stratum corneum formed on the surface layer, which is characterized by three-dimensionally culturing the immortalized skin cells while applying stress. be.
  • the immortalized skin cells were seeded on the upper surface of the culture solution-impregnated plate-like substrate.
  • the present invention provides the above-mentioned production method, which comprises three-dimensionally culturing the surface layer of the immortalized skin cell layer on which the immortalized skin cells are laminated while applying stress.
  • the immortalized skin cells were seeded on the bottom of the inner container whose bottom was impregnated with the culture solution.
  • the inner container is stored in the outer container,
  • the production method is provided in the outer container, characterized in that the surface layer of the immortalized skin cell layer is three-dimensionally cultured while being stressed.
  • three-dimensional culture can be performed while applying stress to the surface layer of the immortalized skin cell layer.
  • Oligotrophic culture of the surface layer of the immortalized skin cell layer Anoxic culture of the surface layer of the immortalized skin cell layer, A carbon dioxide-deficient culture on the surface of the immortalized skin cell layer, Poor humidity culture of the surface layer of the immortalized skin cell layer, or
  • the present invention provides the above-mentioned production method, which is one or more of charging and culturing a culture solution to the extent that the surface layer of the immortalized skin cell layer does not dry.
  • the immortalized skin cells are HaCaT, NHEK / SVTERT3-5 (human skin keratinocytes), SIK (immortalized epidermal keratinocytes by spontaneous immortalization), immortalized human epidermal keratinocytes-SV40, immortalized. It provides the said production method which is one or more selected from the group consisting of human melanocyte-hTERT and immortalized human melanocyte-hTERT / SV40.
  • the immortalized skin cells are controlled by a first reporter gene controlled by a constantly expressed promoter, a second reporter gene controlled by a promoter capable of evaluating skin sensitization, and / or a promoter capable of evaluating physiological activity.
  • the present invention provides the above-mentioned production method, which comprises a third reporter gene.
  • the present invention administers the test substance to the three-dimensional culture of the immortalized skin cells and is based on the expression level of the second reporter gene and / or the third reporter gene with respect to the expression level of the first reporter gene.
  • the present invention provides a method for evaluating a test substance, which comprises evaluating the skin sensitivities and / or physiological activity of the test substance.
  • a three-dimensional culture of immortalized skin cells can be obtained. Since the surface layer of this culture is composed of the stratum corneum, it can be used as a substitute for experimental animals in the evaluation of bioactive substances that maintain skin sensitization and skin health.
  • FIG. 8 (A) shows color development by red luminescent luciferase (introduced by IL-8 promoter)
  • FIG. 8 (B) shows color development by green luminescent luciferase (introduced by UBC promoter).
  • the first aspect of the present invention is a cultured laminate of a plate-shaped substrate and immortalized skin cells adhering to the surface of the plate-shaped substrate, wherein the surface layer of the cultured laminate is composed of a stratum corneum. It is a three-dimensional culture.
  • FIG. 1 shows an example of a preferred embodiment of a three-dimensional culture 10 in which immortalized skin cells 2 are attached to the plate-shaped substrate 1 and its surface, and the surface layer 3 of the culture laminate of the immortalized skin cells 2 is a stratum corneum. show. Since it resembles the structure of the skin epidermis of a living body, it can be used for screening various substances such as skin sensitizing substances as a skin tissue alternative to animal experiments.
  • the stratum corneum means a surface layer in which keratinocytes are stacked in layers, and the stratum corneum means cells expressing at least keratinocyte 2.
  • the three-dimensional culture of immortalized skin cells of the present invention is not a mere cell culture laminate, but the cytokeratin marker differs from layer to layer as shown in Examples described later, and cytokeratin 10 is located near the surface layer of cells. Keratin 14 was particularly highly expressed in the subcellular layer, and cytokeratin 2 was present throughout the cell. Cytokeratin 2 is a marker expressed in the stratum corneum in normal cells. Since the three-dimensional culture of the present invention has at least a stratum corneum whose surface layer expresses cytokeratin 2, it has become possible to screen substances such as fat-soluble compounds which were not possible with conventional two-dimensional cultures.
  • the culture laminate can be easily moved by handling the plate-shaped base material 1. .. In particular, by checking the plate-shaped base material layer, it is possible to easily determine which is the surface layer of the three-dimensional culture.
  • the plate-like substrate is a liquid-impregnated substrate composed of one or more substrates selected from the group consisting of silica, alumina, zirconia, titania, hydroxyapatite, and synthetic resin.
  • the synthetic resin include polyethylene terephthalate, urethane, polypropylene, polyester, polystyrene, polymodified prolactone, and poly-L lactic acid.
  • liquid impregnation means a property capable of impregnating and retaining a culture solution.
  • the plate-like substrate is preferably a scaffold for cell culture because the culture laminate of immortalized skin cells adheres to the plate-like substrate.
  • the plate-like substrate may further contain extracellular matrix components such as hyaluronic acid, collagen, elastin, laminin, fibronectin, poly-L or D-lysine.
  • the thickness of the plate-shaped base material is 100 to 600 ⁇ m, more preferably 200 to 300 ⁇ m. Within this range, handling is easy.
  • a cell bed made of silica fiber manufactured by Japan Vilene Co., Ltd. can be preferably used.
  • immortalized skin cells that can survive on a plate-like substrate can be widely targeted.
  • HaCaT human skin keratinocytes
  • SIK embryotalized epidermal keratinocytes due to spontaneous immortalization
  • immortalized human epidermal keratinocytes-SV40 immortalized human melanocytes-hTERT, or immortality. It may be any of keratinocytes-hTERT / SV40.
  • HaCaT is preferred.
  • the three-dimensional culture of the present invention contained in a container can survive for a long period of time by a culture solution impregnated with a plate-shaped substrate.
  • Immortalized skin cells are further regulated by a first reporter gene regulated by a constant expression promoter, a second reporter gene regulated by a promoter capable of assessing skin sensitization, and / or a promoter capable of assessing physiological activity. It may have a third reporter gene.
  • the three-dimensional culture of the present invention can be used for screening various substances as a skin tissue alternative to animal experiments, and introduces a first reporter gene, a second reporter gene, a luciferase gene as a third reporter gene, and the like. Therefore, the effect of screening can be visualized. At that time, if the expression level of the first reporter gene controlled by the constant expression promoter is used as the internal standard, the increase or decrease in the expression level of the second reporter gene or the third reporter gene can be relatively evaluated.
  • a promoter originally possessed by immortalized skin cells may be used, or may be prepared and used separately.
  • the constant expression promoter include UBC (ubiquitin C), B2M ( ⁇ -2-microglobulin), GAPDH, TK, SV-40, HPRT, ⁇ -actin, G6PDH, and EF (elongation factor).
  • UBC ubiquitin C
  • B2M ⁇ -2-microglobulin
  • GAPDH kinaselongation factor
  • TK TK
  • SV-40 HPRT
  • ⁇ -actin G6PDH
  • EF elongation factor
  • IL-1beta As promoters that can evaluate skin sensitization, IL-1beta, IL-4, IL-6, IL-8, which are involved in hyperinflammatory, IL-10, which is conversely involved in suppression, and chronic skin inflammatory diseases are particularly prominent.
  • IL-17 and IL-22 IL-12 which promotes cell differentiation of T cells into Th1
  • IFN- ⁇ which is induced by IL-2 and IL-12 and has a regulatory effect on inflammation
  • promoters of genes such as cytokines and HO-1 induced by oxidative stress.
  • the number of promoters that can evaluate skin sensitization is not limited to 1, and two or more promoters may be introduced into cells, and which one is introduced can be appropriately selected depending on the type of immortalized skin cells.
  • IL-6, IL-8, IL-10 and the like are preferable.
  • the expression level of IL-8 or IL-6 mRNA or protein is increased (particularly significantly) when the immortalized skin cells are brought into contact with the test substance as compared with the case where the test substance is not contacted. , It can be judged that this test substance sensitized the skin sensitivities, while when the expression levels of IL-8 and IL-6 decreased, it was judged that the test substance suppressed the skin sensitivities. be able to.
  • IL-10 when the immortalized skin cells were brought into contact with the test substance, the expression level of IL-10 mRNA or protein increased as compared with the case where the test substance was not contacted. In this case, it can be determined that the test substance suppressed the skin sensitization, and when the expression level decreased, it can be determined that the test substance sensitized the skin sensitization.
  • Promoters that can evaluate physiological activity include clock genes bmal1 and per2, filaggrin and keratin type10 that maintain skin health, and tumor necrosis factor TNF-alpha.
  • the number of promoters that can evaluate physiological activity is not limited to one, and two or more promoters may be introduced into cells, and which one to introduce can be appropriately selected depending on the type of immortalized skin cells.
  • HaCaT there are bmal1, per2, filaggrin, keratin10 and the like, and per2 and filaggrin are preferable.
  • the expression level of keratin10 or filaggrin mRNA or protein is increased (particularly significantly) when the immortalized skin cells are brought into contact with the test substance as compared with the case where the test substance is not contacted, this test is performed. It can be determined that the substance has activated physiological activity. On the other hand, when the expression levels of keratin10 and filaggrin decrease, it can be determined that the test substance suppressed the physiological activity.
  • Examples of the combination of promoters capable of simultaneously evaluating such skin sensitization and physiological activity include a combination of IL-8 and TNF-alpha and a combination of IL-6 and TNF-alpha in the case of HaCaT.
  • the combination of IL-8 and TNF-alpha and the combination of IL-6 and TNF-alpha are preferably exemplified.
  • SIK a combination of IL-8 and TNF-alpha and a combination of IL-6 and TNF-alpha are preferably exemplified.
  • Examples of the first reporter gene, the second reporter gene, and the third reporter gene used in the present invention include a luciferase gene, a fluorescent protein gene, a colored protein gene, and the like, and any of them may be used.
  • a luciferase gene can be used as the first reporter gene
  • a fluorescent protein gene can be used as the second reporter gene
  • a colored protein gene can be used as the third reporter gene.
  • the luciferase gene can be used as the first reporter gene, the second reporter gene, and the third reporter gene. In this case, the signal indicating which reporter gene is expressed may be detected separately.
  • luciferase genes include red luciferase derived from railroad insects, green luciferase, orange luciferase derived from Iriomotebotaru, and green luciferase.
  • a red luciferase derived from railroad worms is used as the first reporter gene
  • a green luciferase derived from railroad worms is used as the second reporter gene
  • an orange luciferase derived from iriomote firefly is used as the third reporter gene.
  • a luciferase that emits light having an emission wavelength that does not fluctuate under measurement conditions such as pH and can be separated from each other by a color filter or the like.
  • the phrase "does not fluctuate under measurement conditions" means that the fluctuation of the maximum emission wavelength is 3 nm or less even if the pH, temperature, concentration, or the like changes.
  • red and green luciferase derived from railway insects, orange and green luciferase derived from Iriomotebotaru may be used to remove greens from each other and measure the ratio of light emission to each other by using a filter.
  • the maximum emission wavelength is 20 nm or more, preferably 30 nm or more, more preferably 40 nm or more, and particularly preferably 50 nm or more
  • a filter between the maximum wavelengths is used, and the transmittance of each emission before and after the filter is used. By measuring and converting, the amount of each emission can be quantified at the same time.
  • the luciferase used in the present invention includes green to red (maximum emission wavelength: 535 to 635 nm) luciferase derived from railway insects, orange to green (maximum emission wavelength: 530 to 600 nm) luciferase of Hikarikometsukimushi, and orange of Iriomoto firefly.
  • -Green maximum emission wavelength: 550 to 590 nm
  • the luciferase gene used in the present invention it is preferable that the luciferase generated by the expression of each reporter gene emits light on the same luminescent substrate. This is because the amount of luminescence derived from a plurality of luciferases can be quantified at the same time, and the ratio of the expression amount of each promoter can be accurately measured. For example, when using a luciferase derived from a railroad worm having a plurality of luciferases whose maximum emission wavelengths are separated to some extent, a luciferase derived from Iriomoto firefly, etc. (Luciferin can be used) can be used to simultaneously quantify the amount of luminescence derived from multiple co-expressed luciferases.
  • luciferase As a combination of luciferase, there is a method of monitoring the first reporter gene with railroad worm red luciferase and the second reporter gene with iriomote firefly orange or green luciferase.
  • iriomote firefly green and orange luciferase By monitoring with iriomote firefly green and orange luciferase as the second reporter gene and the third reporter gene, it is possible to measure the activity of three promoters at the same time. Red, orange and green luciferases can be interchanged with each other.
  • the transgene is incorporated into a vector and introduced into immortalized skin cells.
  • Commercially available products can also be used as a vector incorporating a second reporter gene controlled by a promoter capable of evaluating skin sensitization and a third reporter gene controlled by a promoter capable of evaluating physiological activity.
  • the transgene includes each reporter gene, its upstream promoter, an element that streamlines translation, an mRNA stabilizing element, an enhancer, an IRES, SV40pA, and a drug resistance gene (Neor, etc.). You may.
  • UBC is introduced as a constant expression promoter and a green luminescent luciferase gene is introduced as a first reporter gene.
  • a three-dimensional culture of HaCaT into which IL-8 has been introduced as a promoter for evaluating skin sensitization and a red luminescent luciferase gene has been introduced as a second reporter gene can be preferably used.
  • bmal1 is introduced as a constant expression promoter and a green luminescent luciferase gene is introduced as a first reporter gene to maintain health.
  • a three-dimensional culture of immortalized skin cell HaCaT into which filaggrin has been introduced as a promoter for evaluating the above and a red luminescent luciferase gene has been introduced as a second reporter gene can be preferably used.
  • the second aspect of the present invention is a method for producing a three-dimensional culture of immortalized skin cells having a stratum corneum formed on the surface layer, which is characterized in that the immortalized skin cells are three-dimensionally cultured while being stressed.
  • "three-dimensional culture” means that a scaffold is used to form agglomerates of cells
  • "three-dimensional culture” means a culture laminate having a thickness in the height direction. ..
  • HaCaT is an immortalized human epidermal keratinized cell line established under Ca 2+ concentration and temperature conditions different from normal culture conditions
  • NHEK / SVTERT3-5 is a human immortalized by hTERT and SV40.
  • SIK is an immortalized epidermal keratinocyte by spontaneous immortalization
  • immortalized human epidermal keratinocyte-SV40 continuously passages epidermal keratinocyte isolated from human skin and SV40 large. It is a human epidermal keratinocyte cell line immortalized by introducing T antigen by lentivirus technology.
  • Immortalized human melanocyte-hTERT is an immortalized melanocyte obtained by continuously passing melanocytes isolated from human skin and introducing the hTERT gene by lentivirus technology. It can be used to study skin diseases such as pigmentation (melanin formation) and melanoma.
  • immortalized human melanocyte-hTERT / SV40 is a cell line that has been immortalized by continuously passing melanocytes isolated from human skin and introducing the SV40 large T antigen and hTERT gene by lentivirus technology. It can be used to study skin diseases such as pigmentation (melanin formation) and melanoma.
  • the immortalized cells are common in that they are single clone cells in which "differentiation" is suppressed and continuous culture is possible.
  • the inventor of the present application puts stress on the surface layer of the immortalized skin cell layer on which the immortalized skin cells are laminated, and three-dimensionally. Culturing, more specifically, when a sufficient amount of the culture solution was applied to the cells around the plate-shaped substrate and a very small amount of the culture solution was applied to the upper surface of the cultured cell layer, the amount of the culture solution present on the surface layer was applied. It was found that stress was applied to the surface cells due to the difference between the two, and the surface layer became a three-dimensional culture differentiated into the stratum corneum.
  • the anaerobic culture in which the surface layer of the immortalized skin cell layer is cultured while giving a difference in the amount of nutrients, and the amount of oxygen supplied is different.
  • a culture solution-impregnated plate-like base material may be used as a scaffold, immortalized skin cells may be seeded on the upper surface thereof, and three-dimensional culture may be performed while applying stress to the surface layer of the immortalized skin cell layer. .. More specifically, there is a method in which immortalized skin cells are seeded on the bottom of an inner container whose bottom is impregnated with a culture solution, and the inner container is stored in the outer container for culturing.
  • the bottom of the inner container may have a mesh structure through which the culture solution can pass, and a culture solution-impregnated plate-like base material may be placed on the mesh to be used as the inner container.
  • the culture solution-impregnated plate-shaped substrate is impregnated with the culture solution in advance, and immortalized skin cells are seeded on the upper surface thereof.
  • the inner container containing the immortalized skin cells is stored in the outer container, and the culture solution is charged in the outer container for culturing.
  • the culture solution-impregnated plate-like base material serves as a scaffold, and a culture laminate in which immortalized skin cells proliferate in layers is formed in the inner container.
  • the amount of the culture solution in the outer container is adjusted to such that the surface layer of the immortalized skin cell layer in the inner container does not dry.
  • Culture solution impregnated plate-like substrate and immortalized skin cells in the vicinity are supplied with abundant culture solution, but the immortalized skin cells on the surface layer are not supplied with a sufficient amount of nutrient solution and are in an oligotrophic state. Incubate. This oligotrophic stress causes immortalized skin cells, whose differentiation is originally suppressed, to differentiate into the stratum corneum. After culturing immortalized skin cells to form 3 to 10-stage cell layers, stress may be applied to the surface layer to form a stratum corneum on the surface layer.
  • the culture solution can be appropriately selected and used from those suitable for two-dimensional culture of immortalized skin cells.
  • D-MEM KBM basal medium (Lonza), Kerationocyte Basal Medium 2 (TaKaRa), human Epivita growth medium-basic medium (Toyobo) and the like can be preferably used.
  • These insulin, pituitary extract (bovine pituitary extract), human epidermal growth factor (human epidermal growth factor), adrenaline, transferrin, hydrocortisone, cholera toxin, fetal bovine serum (Fetal bovine serum), Ca ions such as CaCl 2 Etc. may be included.
  • the culture solution used for the two-dimensional culture is charged in the outer container, and the culture solution given from the cell surface is 1 of this culture solution. Incubation may be carried out using the one having a low concentration of the above components.
  • the two-dimensional culture solution is used as it is in the outer container, for example, it is diluted 2 to 5 times and given from the surface layer for culturing.
  • a normal amount of oxygen is supplied to the outer container, and the inner container has a low oxygen concentration of 10 to 50% of the amount of oxygen supplied to the outer container.
  • a method of supplying an atmosphere of 5 to 50% of the humidity of the outer container to the cell surface of the inner container can be exemplified. .. In the present invention, a culture method combining these may be used.
  • Culturing varies depending on the stress loading method, but is usually 30 to 40 ° C. for 5 to 40 days, more preferably 18 to 23 days. Further, it is desirable that the plate-shaped base material has a pore diameter of about 5 to 20 ⁇ m. This makes it possible to produce a three-dimensional culture in a state close to the original skin structure. In particular, since the obtained three-dimensional culture is at least the stratum corneum in which the surface layer expresses cytokeratin 2 or a cell layer similar to the stratum corneum, evaluation of water-insoluble substances, which has not been possible in the conventional two-dimensional culture, is also possible. It will be possible.
  • the reason for doing so is unknown.
  • the obtained three-dimensional culture is used to sensitize the lipophilic substance, a large sensitization result is shown as compared with the solvent control, and the lipophilic substance is compatible. It was a culture laminate having sex.
  • Immortalized skin cells are a first reporter gene regulated by a constant expression promoter, a second reporter gene controlled by a promoter capable of assessing skin sensitization, and / or a third regulated by a promoter capable of assessing physiological activity. It may have a reporter gene.
  • the first reporter gene, the second reporter gene, and the third reporter gene controlled by the constant expression promoter used in the production method of the present invention are the same as those described in the above-mentioned three-dimensional culture of immortalized skin cells. Can be used.
  • each of these reporter genes include a luciferase gene, a fluorescent protein gene, and a colored protein gene, but the luciferase gene is preferable in that signals of two or more types, preferably three or more types of reporter genes can be detected separately.
  • the three-dimensional culture of immortalized skin cells into which a reporter gene has been introduced, which is produced in the present invention, is obtained by introducing a reporter gene into all cells and proliferating.
  • the surface layer is the stratum corneum, it can be used in a reporter assay when screening a test substance as an alternative to animal experiments.
  • the third aspect of the present invention is controlled by a first reporter gene controlled by a constantly expressed promoter, a second reporter gene controlled by a promoter capable of evaluating skin sensitization, and / or a promoter capable of evaluating physiological activity.
  • the test substance was administered to a three-dimensional culture of immortalized skin cells into which a third reporter gene had been introduced, and the expression level of the second reporter gene and / or the third reporter gene relative to the expression level of the first reporter gene.
  • a method for evaluating a test substance which comprises evaluating the skin sensitivities and / or physiological activity of the test substance based on the above.
  • the culture laminate of immortalized skin cells is stored in the culture container for usually 3 to 8 hours, more preferably 4 to 6. Pre-culture for hours. Then, after adding or contacting the test substance to the three-dimensional culture for a predetermined time, the expression level of the first reporter gene, the second reporter gene and / or the second reporter gene and / or the second reporter gene are expressed over time while culturing the three-dimensional culture as it is. 3 Measure the expression level of the reporter gene.
  • the expression level of each reporter gene can be measured by measuring the luminescence, fluorescence, etc. of each reporter gene over time for a predetermined time using a cultured cell real-time luminescence monitoring system or the like.
  • An immortalized skin cell is introduced with a first reporter gene regulated by a constantly expressed promoter and a second reporter gene and / or a third reporter gene controlled by a promoter capable of evaluating skin sensitization and / or physiological activity. Then, by calculating the relative ratio using the expression level of the first reporter gene as an internal standard, the skin sensitization and / or physiological activity that affects the expression level of the second reporter gene and / or the third reporter gene can be simplified. And it can be evaluated accurately.
  • Immortalized skin cells into which a second reporter gene regulated by a promoter involved in skin sensitization and a third reporter gene controlled by a promoter related to physiological activity having an effect of maintaining the health of the skin have been introduced. When used, the skin sensitivities and physiological activity of the test substance can be evaluated at the same time.
  • additional stimulation with the second test substance may be applied after the test substance treatment, and then the expression of each reporter gene may be evaluated.
  • a second test substance examples include PMA, ionomycin, LPS, and an active oxygen production inhibitor (N-acetyl-cysteine).
  • Example 1 A cell bed 24-well carrier (Japan Vilene Co., Ltd .: made of silica fiber) was placed in each well of a 24-well plate (Japan Vilene Co., Ltd.) and hydrophilized with PBS. Then, D-MEM suspension HaCaT to each well (containing 10% FBS and antibiotics, cell concentration: 1 ⁇ 10 6 cells / mL ) were placed one by 500 ⁇ L, 37 °C, 5% CO 2, 100% humidity The cells were cultured in an atmosphere for 3 hours.
  • the cells adhere to the cell bed to which the culture of HaCaT cells adheres, on the scaffold of the scaffold well insert type (for 12 wells) manufactured by Alvetex, so as not to bring in D-MEM as much as possible.
  • the face was placed on top. At the time of mounting, air bubbles did not enter between the scaffold and the cell bed.
  • three well inserts on which a cell bed was placed were stored in a scaffold well insert deep Petri dish manufactured by Alvetex, and 37 mL of KGM Gold culture solution (Lonza) was added to the Petri dish.
  • FIG. 4 shows the results of microscopic examination of the culture cultured from the first day of the start of the three-dimensional culture to the 21st day over time by the above method.
  • Neutral red is a soluble pigment, and only living cells can be taken up into cells.
  • the dark-colored immortalized skin cells adhering to the cell bed shown in light color proliferated in layers over time by the three-dimensional culture, and became a three-dimensional culture.
  • Example 2 HaCaT cells were cultured for 25 days in the same manner as in Example 1 to obtain a three-dimensional culture of HaCaT cells.
  • a cell bed is used as a plate-like base material, and a culture laminate of HaCaT adheres to the plate-like base material in a layered manner.
  • the 3D culture was rinsed 3 times with PBS and then immersed in 4% paraformaldehyde / PBS overnight for immobilization.
  • the immobilized cells were deparaformaldehyde-treated with a retrieving buffer, embedded with an OTC compound, and longitudinally cut with a cryostat to a width of 5 ⁇ m. The resulting sections were then immunostained and Hoechst stained.
  • the upper part of FIG. 5 is the result of cytokeratin 2 (K2), nucleus, and bright-field observation
  • the upper part of FIG. 6 is the result of cytokeratin 10 (K10), nucleus, and bright-field observation
  • the upper part of FIG. 7 is the site. Results of keratin 14 (K14), ylvoclin, nuclei, and brightfield observations.
  • the bright-field tissue shown in the upper part of FIG. 5 was composed of a large number of nuclei by Hoechst staining, and that the three-dimensional culture was a stack of cells.
  • the cells were found to express K2 by immunostaining.
  • the expression of K10 by immunostaining was confirmed particularly in the surface layer portion, and as shown in the upper part of FIG. 7, it was confirmed that K14 and ilvoclin were expressed by immunostaining.
  • K2 is expressed in all epithelial cells including stratum corneum in normal skin tissue
  • K10 is expressed in the stratum spinosum
  • K14 is expressed in the basal cells
  • involucrin is expressed in the stratum spinosum to the surface layer.
  • K2 is expressed throughout the structure
  • K14 is widely expressed from the upper layer to the lower layer, but is particularly strongly expressed in the lowest layer.
  • K10 was strongly expressed in the upper surface layer, and it was considered that the cells were differentiated into the stratum corneum. Although involucrin was totally expressed, it was confirmed that it was densely expressed in the lower layer.
  • the three-dimensional culture obtained in Example 1 is a culture of HaCaT, which is an immortalized skin cell, but is similar to the epidermal cell layer because it contains various keratinocytes found in normal cells and contains a large amount of involucrin in the lower layer. It was a cell laminate.
  • Example 1 1 ml of D-MEM used in Example 1 was added dropwise to the cover glass, and 7 ⁇ 10 4 HaCaTs were seeded therein, and the cells were cultured under an atmosphere of a temperature of 37 ° C., 5% CO 2 , and a humidity of 100%.
  • the culture obtained by culturing for 3 days is referred to as a two-dimensional culture.
  • the two-dimensional culture 3 days after the culture was fixed with paraformaldehyde, and immunostaining and Hoechst staining were performed. The results are shown in the lower rows of FIGS. 5, 6 and 7.
  • FIG. 5 is the result of cytokeratin 2 (K2), nucleus, and bright-field observation
  • the lower part of FIG. 6 is the result of cytokeratin 10 (K10), nucleus, and bright-field observation
  • the lower part of FIG. 7 is the site. Results of keratin 14 (K14), ylvoclin, nuclei, and brightfield observations.
  • cytokeratin 2 (K2) expressed on the surface layer could not be confirmed.
  • K10 expressed in the spinous layer was sparsely expressed, but as shown in the lower part of FIG. 7, involucrin also expressed from the spinous layer to the surface layer was hardly expressed.
  • K14 expressed in the basal layer was well expressed. Comparing these expression profiles with the three-dimensional culture of Example 2, the cells constituting the three-dimensional culture express cytokeratin 2 characteristic of the stratum corneum, differentiation progresses, the surface is keratinized, and normal skin. It was shown to have the characteristics of the tissue.
  • Micronuclei containing the mouse artificial chromosome vector were isolated from CHO-K1 cells carrying the mouse artificial chromosome vector according to a conventional method. The micronuclei were introduced into HaCaT cells using polyethylene glycol and fused to the micronuclear cells, and then HaCaT cells into which a mouse artificial chromosome vector had been introduced were selected using hyglomycin.
  • a vector in which the HS4 insulator sequence is arranged upstream / downstream and at the connecting portion of both the IL-8 promoter sequence and the red luminescent luciferase sequence, and the ubiquitin C promoter sequence and the green luminescent luciferase sequence shown in SEQ ID NO: 1 is provided. Made. This was introduced into HaCaT cells carrying the mouse artificial chromosome vector described above by the lipofection method. Reporter vector-introduced cells were selected by selective culture using G418. SEQ ID NO: 1 is the 601 base sequence of No. 4891 to No. 5491 of the ubiquitin C promoter (NCBI sequence ID NG_027722).
  • the IL-8 promoter sequence used is the base sequence site of the 8th to 5202th of NCBI sequence ID NG_029889.1 shown in SEQ ID NO: 2.
  • HaCaT having a red luminescent luciferase gene controlled by the IL-8 promoter and a green luminescent luciferase gene controlled by the ubiquitin C promoter was obtained.
  • Example 1 Using the HaCaT thus obtained, a three-dimensional culture was obtained in the same manner as in Example 1.
  • the three-dimensional culture was a three-dimensional culture in which a cell bed was used as a plate-like base material and a culture laminate of HaCaT was attached thereto as in Example 1, and the surface layer of the three-dimensional culture was a stratum corneum. ..
  • Example 4 The three-dimensional cultures obtained in Example 3 were placed one by one in three 24-well plates for cell culture with a black wall surface and a colorless and transparent bottom surface, and 10% FBS and an antibiotic [penicillin (100 U / mL)) were placed therein. / Streptomycin (0.1 mg / mL)] 1 mL of D-MEM containing 0.2 mM luciferin potassium salt was added. In order to evaluate the luminescence intensity of the three-dimensional structure, a plastic paraffin film was sprinkled around this well plate, and the luminescence was measured by the cultured cell real-time luminescence monitoring system Kronos HT (manufactured by Atto Co., Ltd.).
  • Kronos HT manufactured by Atto Co., Ltd.
  • FIG. 8 shows the results of multicolor emission measurement.
  • FIG. 8 (A) shows color development by red luminescent luciferase (IL-8 promoter)
  • FIG. 8 (B) shows color development by green luminescent luciferase (UBC promoter). Note that FIG. 8 also shows the results of Comparative Example 2.
  • the curve shown in 3D is the result of Example 4 (three-dimensional culture)
  • the curve shown in 2D is the result of Comparative Example 2 (two-dimensional culture).
  • Example 2 HaCaT having a red luminescent luciferase gene controlled by the IL-8 promoter and a green luciferase gene controlled by the ubiquitin C promoter prepared in Example 3 is used for cell culture with a black wall surface and a colorless and transparent bottom surface 24.
  • Example 4 In the same manner as in Example 4, a plastic paraffin film was sprinkled around the well plate, and the luminescence was measured by the cultured cell real-time luminescence monitoring system Kronos HT (manufactured by Atto Co., Ltd.). The measurement was continued for 72 hours in each well with and without an optical filter for 10 seconds each.
  • FIG. 8 shows the results of multicolor emission measurement.
  • Example 4 red luminescent luciferase (IL-8 promoter) and green luminescent luciferase when two-dimensional cultured cells are present on the entire bottom surface of a 24-well plate and when a three-dimensional cultured structure is present.
  • the luminescence intensity of (ubiquitin C promoter) can be compared.
  • the three-dimensional culture (3D) has higher luminescence intensity of red luminescent luciferase (IL-8 promoter) and green luminescent luciferase (ubiquitin C promoter) than the two-dimensional culture (2D). became.
  • the red luminescent luciferase (IL-8 promoter) that emits light due to the influence of sensitizing substances has stronger luminescence intensity in 3D than in 2D, and the cells are stacked in layers, causing functional changes in the cells and increasing luminescence. It was thought to suggest that it was done.
  • Example 5 The three-dimensional culture obtained in Example 3 was used to evaluate the response to hydroquinone (HQ) as a hydrophilic sensitizer.
  • a cell culture insert (Falcon culture insert # 353095) composed of a colorless and transparent 24-well PET membrane with a pore size of 0.4 ⁇ m on the bottom is placed in the well of a 24-well plate for cell culture with a black wall and a colorless and transparent bottom. The cells were inserted and placed in the bottom surface of the culture insert with the cells facing up, and 0.8 mL of KGM-gold containing 0.2 mM luciferin potassium salt was placed in the outer well of the culture insert. The test substance was loaded over the 3D culture inside the insert for sensitization assessment.
  • HQ was dissolved in KGM medium to a concentration of 200 ⁇ M, 800 ⁇ M, and 2 mM, and 30 ⁇ L of the lysate was loaded only from the top of the three-dimensional culture.
  • 30 ⁇ L of KGM medium was added from the top of the three-dimensional culture.
  • a plastic paraffin film was sprinkled around this well plate, and luminescence was measured for 0 to 72 hours with a cultured cell real-time luminescence monitoring system, Kronos HT (manufactured by Atto Co., Ltd.). The measurement was performed every 1 minute for 10 seconds for each color and continued for 0 to 72 hours.
  • IL-8 shows the luminescence of the red luminescent luciferase of the sample and the control to which each concentration of HQ was administered
  • UBC shows the result of the green luminescent luciferase (ubiquitin C promoter).
  • the luminescence of red luminescent luciferase is an index that directly indicates the response of skin sensitization by the test substance, and the ubiquitin C promoter is selected as a housekeeping gene, and is an index that reflects the cell viability.
  • the luminescence ratio of HQ which is a hydrophilic sensitizing substance
  • the method of Example 5 is a method of loading the test substance from the upper surface of the three-dimensional culture. This is, for example, a method similar to a sensitization test for evaluating an allergic reaction in a living body. It has been found that the three-dimensional culture of the present invention can evaluate the sensitization property of a hydrophilic substance by a method similar to the method of loading the test substance on the surface of a living body. ..
  • Example 6 In Example 5, the three-dimensional culture was recovered after measuring the multicolored luminescence for 72 hours. This three-dimensional culture was stained with neutral red in the same manner as in Example 1, and cut vertically to obtain sections. This is shown in FIG. It was confirmed that the three-dimensional culture was maintained even after the multicolor luminescence measurement.
  • Example 7 The three-dimensional culture obtained in Example 3 was used to evaluate the response to dibutyl aniline (DA) and hexyl salicylate (HS) as lipophilic sensitizers. Similar to Example 5, a cell culture insert composed of a well of a 24-well plate for cell culture having a black wall surface and a colorless and transparent bottom surface and a PET membrane having a colorless and transparent bottom surface and a pore size of 0.4 ⁇ m for 24 wells (similar to Example 5). Falcon culture insert # 353095) is inserted, the 3D culture is placed on the bottom surface of the culture insert so that the cells face up, and KGM-gold containing 0.2 mM luciferin potassium salt is placed in the outer well of the culture insert.
  • DA dibutyl aniline
  • HS hexyl salicylate
  • DA was diluted with olive oil to a concentration of 12.5% (v / v) and 25% (v / v), and 30 ⁇ L of the lysate was loaded from the top of the three-dimensional culture.
  • the HS was diluted with olive oil to a concentration of 12.5% (v / v), and 30 ⁇ L of the lysate was loaded from the top of the three-dimensional culture.
  • 30 ⁇ L of olive oil was added from the top of the three-dimensional culture as a solvent control.
  • a plastic paraffin film was sprinkled around this well plate, and luminescence was measured for 0 to 72 hours with a cultured cell real-time luminescence monitoring system, Kronos HT (manufactured by Atto Co., Ltd.). The measurement was performed every 1 minute for 10 seconds for each color and continued for 0 to 72 hours.
  • Kronos HT cultured cell real-time luminescence monitoring system
  • the surface layer of the three-dimensional culture of the present invention is composed of the stratum corneum, the sensitization of lipophilic substances can be evaluated in a short time.
  • the test substance is loaded from the upper surface of the three-dimensional culture, which is similar to the sensitization test for evaluating the allergic reaction of the living body. It has been found that the three-dimensional culture of the present invention can be used for sensitization evaluation by a method similar to the method of loading a test substance on the surface of a living body in terms of lipophilicity.
  • Example 8 Using the 3D culture obtained in Example 3, hydroquinone was loaded from the bottom and top surfaces of the 3D culture and the response to hydroquinone was evaluated.
  • a cell culture insert (Falcon culture insert # 353095) composed of a colorless and transparent 24-well PET membrane with a pore size of 0.4 ⁇ m on the bottom is placed in the well of a 24-well plate for cell culture with a black wall and a colorless and transparent bottom. The cells were inserted and the three-dimensional culture obtained in Example 3 was placed on the bottom surface of the culture insert so that the cells were on the top surface.
  • the emission ratio increased depending on the concentration of HQ. Further, comparing FIG. 10 in which the test substance was administered only from the upper surface of the three-dimensional culture and FIG. 15 in which the test substance was administered to the three-dimensional culture from both the bottom surface and the upper surface of the well, the bottom surface and the upper surface of the well were compared. It was found that sensitization can be detected even at low concentrations when the test substance is administered from both of the above.

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Abstract

板状基材(1)と前記板状基材の表面に付着する不死化皮膚細胞(2)の培養積層物であって、表層(3)が角質層で構成されることを特徴とする、不死化皮膚細胞の３次元培養物(10)を提供する。この３次元培養物は、培養液含浸性板状基材の上面に不死化皮膚細胞を播種し、前記不死化皮膚細胞が積層する不死化皮膚細胞層の表層にストレスを負荷しつつ３次元培養して製造することができる。この３次元培養物を用いて被検物質の感作性を評価することができる。

Description

表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物、前記３次元培養物の製造方法、および前記３次元培養物を用いた被検物質の評価方法
　本発明は、表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物、前記３次元培養物の製造方法、および前記３次元培養物を用いた被検物質の評価方法に関する。
　本出願は、２０２０年１月２２日に出願された、日本国特許出願特願２０２０－８６０７号に基づく。本明細書中に日本国特許出願特願２０２０－８６０７号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　皮膚培養細胞は、化粧品や医薬品、医薬部外品の開発において、毒性や皮膚保護活性を持つ被検物質などのスクリーニングやそのメカニズム解明に広く用いられている。例えば、皮膚細胞を健常成人から採取し、上記スクリーニングに用いる方法が存在するが、スクリーニングのために健常者から皮膚細胞の提供を受けるのは倫理上の問題があり、皮膚提供者により皮膚の特性が変動するという問題もある。
　一方、健常者からの皮膚提供によらない皮膚モデルとして、ヒト初代線維芽細胞を用いたインビトロ完全皮膚モデルがある（特許文献１）。コラーゲンマトリックスを含む支持層、真皮同等物、基底膜、表皮同等物、前記真皮同等物を含み、真皮同等物または表皮同等物が三次元汗腺同等物を含む、インビトロ完全皮膚モデルである。初代線維芽細胞を培養して真皮同等物を製造し、初代ケラチノサイトを真皮同等物の上で培養した後、更に空気－培養液境界で培養し、３次元汗腺同等物を形成するというものである。
　同様に、ヒト繊維芽細胞を培養して培養皮膚の支持体とし、この上にメラノサイト懸濁液を添加して接着させ、更にヒト表皮角化細胞を播種して空気暴露培養して表皮層、角質層を形成する方法もある（特許文献２）。
特表２０１９－５１４３７０号公報 特開２０１０－１９３８２２号公報 国際公開第２０１２／００２５０７号
　しかしながら、特許文献１で使用するヒト初代線維芽細胞や初代ケラチノサイトなどの初代培養細胞は、有限寿命である。特許文献２で使用する正常ヒト皮膚線維芽細胞や正常ヒト表皮ケラチノサイトも同様である。培養細胞にレポーター遺伝子を導入すると細胞内の情報を可視化することができるが（特許文献３）、初代培養細胞等の有限寿命細胞に特定のレポーター遺伝子を導入しても、長期に亘る継代培養は困難である。また、初代培養細胞は多くの場合、単一の細胞ではなく種々の細胞が混在しているため、所定期間の培養に限定しても、細胞特性の維持は保障されない。更に、ヒト初代細胞その他のヒト細胞は、その性格上倫理的な配慮が要求され、研究者自身で採取が困難な場合には海外の特定企業から購入する必要がある。
　一方、不死化された皮膚培養細胞株は継代培養が可能で、製造ロット間のばらつきが小さいなどのメリットを有する。遺伝子工学的な手法を用いて皮膚培養細胞にレポーター遺伝子を導入すれば、レポーターアッセイを行うことができる。しかしながら、生体内の表皮組織は、深部から基底層、有棘層、顆粒層、角質層で構成される３次元構造体となっている。通常ｉｎ　ｖｉｔｒｏの細胞培養では容器内で２次元の単層構造しか得ることができず、自発的な３次元構造体の形成は起こらない。特に、不死化された皮膚細胞株を通常のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養をしても、同じ皮膚細胞が分裂増殖するのみであり、３次元培養を行っても、培養物の表面に角質層等の異なる分化細胞で形成された３次元構造体は得られない。したがって、購入可能な不死化皮膚細胞からなり、正常な皮膚細胞組織のように層状の構造を持つ３次元構造体を形成する技術の開発が希求されている。
　また、特許文献３で使用するＪｕｒｋａｔ、Ｕ９３７細胞、ＴＨＰ－１細胞等は、いずれも免疫細胞であって皮膚細胞ではない。これら免疫細胞や他の初代培養細胞にレポーター遺伝子が導入された例はあるが、不死化皮膚細胞に導入され、かつそのレポーターの機能を保持したまま３次元構造体を作った例はない。動物愛護の観点から動物実験を行わずに各種被検物質の薬効や安全性評価等の試験を行う動物実験代替法に利用するためにも、不死化皮膚細胞にレポーター遺伝子が導入され、かつ表層に角質層が形成された３次元培養皮膚モデルの開発が望まれる。
　上記現状に鑑み、本発明は、角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物およびその製造方法を提供することを目的とする。
　更に本発明は、前記３次元培養物としてレポーター遺伝子が導入された不死化皮膚細胞を使用し、これに被検物質を投与して、導入したレポーター遺伝子の発現に基づいて前記被検物質の皮膚感作性および／または生理活性を評価することを特徴とする、被検物質の評価方法を提供することを目的とする。
　本発明者等は、不死化皮膚細胞にストレスを負荷しつつ３次元培養すると、細胞培養物の表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物を製造しうること、このような３次元培養物は、被検物質のスクリーニングに好適に使用できることを見出し、本願発明を完成させた。
　すなわち本発明は、板状基材と前記板状基材の表面に付着する不死化皮膚細胞の培養積層物であって、前記培養積層物は、表層が角質層で構成されることを特徴とする、不死化皮膚細胞の３次元培養物を提供するものである。
　また本発明は、前記不死化皮膚細胞は、ＨａＣａＴ、ＮＨＥＫ／ＳＶＴＥＲＴ３－５（ヒト皮膚ケラチノサイト）、ＳＩＫ（自発的な不死化による不死化表皮角化細胞）、不死化ヒト表皮角化細胞－ＳＶ４０、不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴ、および不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０からなる群から選択される１以上である、前記不死化皮膚細胞の３次元培養物を提供するものである。
　また本発明は、前記不死化皮膚細胞は、定常発現プロモーターで制御される第１レポーター遺伝子と、皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される第２レポーター遺伝子、および／または生理活性を評価できるプロモーターで制御される第３レポーター遺伝子とを有することを特徴とする、前記不死化皮膚細胞の３次元培養物を提供するものである。
　また本発明は、前記板状基材は、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタニア、ハイドロキシアパタイト、および合成樹脂からなる群から選択される１以上の基材で構成される液含浸性基材である、前記不死化皮膚細胞の３次元培養物を提供するものである。
　更に本発明は、不死化皮膚細胞にストレスを負荷しつつ３次元培養することを特徴とする、表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物の製造方法を提供するものである。
　また、培養液含浸性板状基材の上面に前記不死化皮膚細胞を播種し、
　前記不死化皮膚細胞が積層する不死化皮膚細胞層の表層にストレスを負荷しつつ３次元培養することを特徴とする、前記製造方法を提供するものである。
　また、底部が培養液含浸性の内側容器の前記底部に前記不死化皮膚細胞を播種し、
　前記内側容器を外側容器に収納し、
　前記外側容器に、前記不死化皮膚細胞層の表層にストレスを負荷しつつ３次元培養することを特徴とする、前記製造方法を提供するものである。
　また、前記不死化皮膚細胞層の表層にストレスを負荷しつつ３次元培養することが、
　前記不死化皮膚細胞層の表層の貧栄養培養、
　前記不死化皮膚細胞層の表層の貧酸素培養、
　前記不死化皮膚細胞層の表層の貧二酸化炭素培養、
　前記不死化皮膚細胞層の表層の貧湿度培養、または、
　前記不死化皮膚細胞層の表層が乾かない程度の培養液を仕込んで培養することのいずれか１以上である、前記製造方法を提供するものである。
　また、前記不死化皮膚細胞が、ＨａＣａＴ、ＮＨＥＫ／ＳＶＴＥＲＴ３－５（ヒト皮膚ケラチノサイト）、ＳＩＫ（自発的な不死化による不死化表皮角化細胞）、不死化ヒト表皮角化細胞－ＳＶ４０、不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴおよび不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０からなる群から選択される１以上である、前記製造方法を提供するものである。
　前記不死化皮膚細胞は、定常発現プロモーターで制御される第１レポーター遺伝子と、皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される第２レポーター遺伝子、および／または生理活性を評価できるプロモーターで制御される第３レポーター遺伝子とを有することを特徴とする、前記製造方法を提供するものである。
　更に本発明は、前記不死化皮膚細胞の３次元培養物に被検物質を投与し、前記第１レポーター遺伝子の発現量に対する前記第２レポーター遺伝子および／または第３レポーター遺伝子の発現量に基づいて前記被検物質の皮膚感作性および／または生理活性を評価することを特徴とする、被検物質の評価方法を提供するものである。
　本発明によれば、不死化皮膚細胞の３次元培養物が得られる。この培養物は、表層が角質層で構成されるため、実験動物の代替品として皮膚感作性や皮膚の健康を維持する生理活性物質の評価に使用することができる。
本発明の不死化皮膚細胞の３次元培養物を説明する図であり、板状基材の表面に付着した、表層が角質層で構成される３次元培養物の縦断面図の一例を示す図である。 実施例１の工程を説明する図であり、Ａｌｖｅｔｅｘ社製、スキャホールドウェルインサートディープペトリ皿に、セルベッドを載置したウェルインサートを３つ収納した状態、および操作手順を示す図である。 実施例１を説明する図であり、培養時のペトリ皿、ウェルインサートの底、セルベッド、不死化皮膚細胞、培養液の関係を説明する図である。 実施例２の培養細胞を経時的に観察した結果を示す図である。 実施例２の培養で得たＨａＣａＴの３次元培養物のＫ２の免疫染色および核のヘキスト染色および明視野の結果を示す図である。 実施例２の培養で得たＨａＣａＴの３次元培養物のＫ１０の免疫染色および核のヘキスト染色および明視野の結果を示す図である。 実施例２の培養で得たＨａＣａＴの３次元培養物のＫ１４、インボルクリンの免疫染色、核のヘキスト染色および明視野の結果を示す図である。 比較例２および実施例４の結果を示す図であり、２次元培養物および３次元培養物の培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムによる、赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター導入）と緑色発光ルシフェラーゼ（ＵＢＣプロモーター導入）の多色発光測定の結果を示す図である。図８（Ａ）は赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター導入）による発色を示し、図８（Ｂ）は緑色発光ルシフェラーゼ（ＵＢＣプロモーター導入）による発色を示す。 実施例５のヒドロキノン（ＨＱ）の結果を示す図であり、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムにより赤色発光ルシフェラーゼおよび緑色発光ルシフェラーゼの発光を７２時間測定した結果を示す図である。 実施例５のＨＱの結果を示す図であり、緑色発光ルシフェラーゼに対する赤色発光ルシフェラーゼの発光比を示す図である。 実施例６の結果を示す図であり、実施例５で培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムにより発光を７２時間測定した後の３次元培養物の切片を示す図である。 実施例７のジブチルアニリン（ＤＡ）およびヘキリルサリシレート（ＨＳ）の結果を示す図であり、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムにより赤色発光ルシフェラーゼおよび緑色発光ルシフェラーゼの発光を４８時間測定した結果を示す図である。 実施例７のＤＡおよびＨＳの結果を示す図であり、緑色発光ルシフェラーゼに対する赤色発光ルシフェラーゼの発光比を示す図である。 実施例８で、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムにより赤色発光ルシフェラーゼおよび緑色発光ルシフェラーゼの発光を７２時間測定した結果を示す図である。 実施例８の結果を示す図であり、緑色発光ルシフェラーゼに対する赤色発光ルシフェラーゼの発光比を示す図である。
　本発明の第１は、板状基材と前記板状基材の表面に付着する不死化皮膚細胞の培養積層物であって、前記培養積層物の表層が角質層で構成されることを特徴とする３次元培養物である。図１に、板状基材１とその表面に不死化皮膚細胞２が付着し、不死化皮膚細胞２の培養積層物の表層３が角質層である３次元培養物１０の好ましい態様の一例を示す。生体の皮膚表皮の構造と類似するため、動物実験に代わる皮膚組織として皮膚感作性物質等の様々な物質のスクリーニングに使用することができる。なお、本開示において、角質層とは角質細胞が層状に積層された表層を意味し、角質細胞とは少なくともケラチノサイト２を発現する細胞を意味する。
　本発明の不死化皮膚細胞の３次元培養物は、単なる細胞培養積層物ではなく、後記する実施例に示すようにサイトケラチンマーカーが層ごとに異なり、サイトケラチン１０は細胞の表層近傍に、サイトケラチン１４は細胞下層に特に発現が多く、サイトケラチン２は細胞全域に存在した。サイトケラチン２は正常細胞では角質層に発現するマーカーである。本発明の３次元培養物は少なくとも表層がサイトケラチン２を発現する角質層であるため、脂溶性化合物などの従来の２次元培養物では不可能だった物質のスクリーニングが可能となった。しかも、本発明の３次元培養物１０は、不死化皮膚細胞２が板状基材１に付着しているため、板状基材を取り扱うことで培養積層物の移動を容易に行うことができる。特に、板状基材層を確認することで、何れが３次元培養物の表層であるか、容易に判別することができる。
　本発明の３次元培養物において、板状基材は、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタニア、ハイドロキシアパタイト、および合成樹脂からなる群から選択される１以上の基材で構成される液含浸性基材であることが好ましい。合成樹脂としては、ポリエチレンテレフタレート、ウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリ化プロラクトン、ポリ－Ｌ乳酸などがある。本発明において、「液含浸性」とは、培養液を含浸および保持し得る特性を意味する。例えば、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタニア、ハイドロキシアパタイト、合成樹脂を繊維状に加工したものの不織布状担体、メッシュ状担体や、多孔を形成した多孔板状物などは液含浸性である。板状基材に不死化皮膚細胞の培養積層物が付着するために、板状基材は細胞培養の足場であることが好ましい。このような足場として好適な環境を付与するために、板状基材に細胞を播種して培養できる空隙率を有することが好ましい。板状基材は、更に、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ－Ｌ又はＤ－リジンなどの細胞外マトリックス成分を含んでいてもよい。なお、板状基材の厚さは、１００～６００μｍ、より好ましくは２００～３００μｍである。この範囲であれば、取扱いが容易である。このような板状基材として、日本バイリーン社のシリカファイバー製のセルベッドなどを好適に使用することができる。
　不死化皮膚細胞としては、板状基材上で生存できる不死化皮膚細胞を広く対象とすることができる。たとえば、ＨａＣａＴ、ＮＨＥＫ／ＳＶＴＥＲＴ３－５（ヒト皮膚ケラチノサイト）、ＳＩＫ（自発的な不死化による不死化表皮角化細胞）、不死化ヒト表皮角化細胞－ＳＶ４０、不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴ、または不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０のいずれであってもよい。好ましくはＨａＣａＴである。本発明の３次元培養物を容器に収納したものは板状基材に含浸させた培養液によって長期生存が可能である。
　不死化皮膚細胞は、更に、定常発現プロモーターで制御される第１レポーター遺伝子と、皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される第２レポーター遺伝子、および／または生理活性を評価できるプロモーターで制御される第３レポーター遺伝子とを有するものであってもよい。本発明の３次元培養物は、動物実験に代わる皮膚組織として様々な物質のスクリーニングに使用することができるが、第１レポーター遺伝子、第２レポーター遺伝子、第３レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子などを導入することで、スクリーニングの効果を可視化することができる。その際、定常発現プロモーターによって制御される第１レポーター遺伝子の発現量を内部標準に用いると、第２レポーター遺伝子や第３レポーター遺伝子の発現量の増減を相対的に評価することができる。
　定常発現プロモーターとしては、不死化皮膚細胞が本来有するプロモーターを使用してもよく、別個に調製して使用してもよい。定常発現プロモーターとしては、ＵＢＣ（ユビキチンＣ）、Ｂ２Ｍ（β－２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＧＡＰＤＨ、ＴＫ、ＳＶ－４０、ＨＰＲＴ、β－ａｃｔｉｎ、Ｇ６ＰＤＨ、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）などがある。本発明では、定常発現プロモーターとして、ＵＢＣ、β－ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨを使用することが好ましい。なお、定常発現プロモーターの導入数は１に限定されず、２以上を細胞に導入してもよい。
　皮膚感作性を評価できるプロモーターとしては、炎症亢進に関与するＩＬ－１ｂｅｔａ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、逆に抑制に関与するＩＬ－１０、慢性の皮膚炎症疾患に特に著明に上昇するＩＬ－１７やＩＬ－２２、Ｔ細胞のＴｈ１への細胞の分化を促進するＩＬ－１２、ＩＬ－２やＩＬ－１２によって誘導され炎症への調節作用を有するＩＦＮ－γ、およびサイトカインや酸化ストレスによって誘導されるＨＯ－１などの遺伝子のプロモーターがある。皮膚感作性を評価できるプロモーターの導入数も１に限定されず、２以上を細胞に導入してもよく、いずれを導入するかは、不死化皮膚細胞の種類によって適宜選択することができる。例えば、ＨａＣａＴには、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０などが好ましい。不死化皮膚細胞と被検物質とを接触させたときに、被検物質非接触時と比べて、ＩＬ－８、ＩＬ－６のｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現量が増加（特に有意に増加）した場合、この被検物質は皮膚感作性を増感したと判断できる一方、ＩＬ－８、ＩＬ－６の発現量が低下した場合には、被検物質は皮膚感作性を抑制したと判定することができる。これとは逆にＩＬ－１０については、不死化皮膚細胞と被検物質とを接触させたときに、被検物質非接触時と比べて、ＩＬ－１０のｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現量が増加した場合、この被検物質は皮膚感作性を抑制したと判断でき、発現量が低下した場合には、被検物質は皮膚感作性を増感したと判定することができる。
　生理活性を評価できるプロモーターとしては、時計遺伝子であるｂｍａｌ１やｐｅｒ２、皮膚健常性を維持するｆｉｌａｇｇｒｉｎやｋｅｒａｔｉｎ　ｔｙｐｅ１０、腫瘍壊死因子ＴＮＦ－ａｌｐｈａなどがある。生理活性を評価できるプロモーターの導入数は１に限定されず、２以上を細胞に導入してもよく、いずれを導入するかは、不死化皮膚細胞の種類によって適宜選択することができる。ＨａＣａＴについてはｂｍａｌ１、ｐｅｒ２、ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、ｋｅｒａｔｉｎ１０などがあり、ｐｅｒ２、ｆｉｌａｇｇｒｉｎが好ましい。不死化皮膚細胞と被検物質とを接触させたときに、被検物質非接触時と比べて、ｋｅｒａｔｉｎ１０、ｆｉｌａｇｇｒｉｎのｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現量が増加（特に有意に増加）した場合、この被検物質は生理活性を賦活化したと判断することができる。一方、ｋｅｒａｔｉｎ１０、ｆｉｌａｇｇｒｉｎの発現量が低下した場合には、被検物質は生理活性を抑制したと判定することができる。
　このような皮膚感作性と生理活性を同時に評価できるプロモーターの組み合わせとして、例えば、ＨａＣａＴの場合は、ＩＬ－８とＴＮＦ－ａｌｐｈａの組合せ、ＩＬ－６とＴＮＦ－ａｌｐｈａの組合せが挙げられる。ＮＨＥＫ／ＳＶＴＥＲＴ３－５細胞についてもＩＬ－８とＴＮＦ－ａｌｐｈａの組合せ、ＩＬ－６とＴＮＦ－ａｌｐｈａの組合せが好ましく例示される。またＳＩＫについてもＩＬ－８とＴＮＦ－ａｌｐｈａの組合せ、ＩＬ－６とＴＮＦ－ａｌｐｈａの組合せが好ましく例示される。
　本発明で使用する第１レポーター遺伝子、第２レポーター遺伝子および第３レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、着色タンパク質遺伝子などがあり、何れを使用してもよい。例えば、第１レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用し、第２レポーター遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子を使用し、第３レポーター遺伝子として着色タンパク質遺伝子を使用することができる。一方、例えば第１レポーター遺伝子、第２レポーター遺伝子および第３レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用することもできる。この場合は、何れのレポーター遺伝子によって発現されたものであるかのシグナルを区別して検出すればよい。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子には、鉄道虫由来の赤色ルシフェラーゼ、緑色ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の橙色ルシフェラーゼ、緑色ルシフェラーゼなどが存在する。第１レポーター遺伝子として鉄道虫由来の赤色ルシフェラーゼを使用し、第２レポーター遺伝子として鉄道虫由来の緑色ルシフェラーゼを使用し、第３レポーター遺伝子としてイリオモテボタル由来の橙色ルシフェラーゼを使用し、適宜、フィルター（カラーフィルター、バンドパスフィルターなど）を用いると、各発光波長の発光量を別個に測定することができる。
　ルシフェラーゼ遺伝子を使用する場合は、ｐＨなどの測定条件で変動せず、かつカラーフィルター等で相互に分別可能な発光波長の光を発するルシフェラーゼを使用することが好ましい。なお、「測定条件で変動しない」とは、ｐＨ、温度、濃度などが変化しても、最大発光波長の変動が３ｎｍ以下であることを意味する。例えば、鉄道虫由来の赤色、緑色ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の橙色、緑色ルシフェラーゼなどは、フィルターを使用することにより、緑色同士を除き、相互の光の発光量の比率を測定してもよい。例えば、最大発光波長が２０ｎｍ以上、好ましくは３０ｎｍ以上、より好ましくは４０ｎｍ以上、特に好ましくは５０ｎｍ以上離れていると、各最大波長間のフィルターを使用し、フィルターの前後での各発光の透過率を測定して換算することで、各発光の発光量を同時に定量することができる。本発明で使用するルシフェラーゼとしては、鉄道虫由来の緑～赤（最大発光波長：５３５～６３５ｎｍ）のルシフェラーゼ、ヒカリコメツキムシのオレンジ～緑（最大発光波長：５３０～６００ｎｍ）のルシフェラーゼ、イリオモテボタルのオレンジ～緑（最大発光波長：５５０～５９０ｎｍ）のルシフェラーゼなどがある。
　本発明で使用するルシフェラーゼ遺伝子としては、各レポーター遺伝子の発現によって発生するルシフェラーゼが同じ発光基質で発光することが好ましい。複数のルシフェラーゼに由来する発光量の同時定量が可能であり、各プロモーターの発現量の比を正確に測定することができるからである。例えば、最大発光波長がある程度離れている複数のルシフェラーゼを有する鉄道虫、イリオモテボタルなどに由来するルシフェラーゼを使用する場合は、１つの発光基質（例えば鉄道虫、イリオモテボタル、ヒカリコメツキムシ由来のルシフェラーゼではホタルルシフェリンを使用できる）を使用して、共発現させた複数のルシフェラーゼに由来する発光量の同時定量が可能である。
　ルシフェラーゼの組み合わせとしては、第１レポーター遺伝子を鉄道虫赤色ルシフェラーゼ、第２レポーター遺伝子をイリオモテボタル橙色又は緑色ルシフェラーゼでモニターする方法がある。第２レポーター遺伝子、および第３レポーター遺伝子としてイリオモテボタル緑色および橙色ルシフェラーゼでモニターすることによって、３つのプロモーター活性を同時に測定することが可能である。赤色、橙色、緑色ルシフェラーゼについては、互いに入れ替えることも可能である。
　導入遺伝子は、ベクターに組み込んで不死化皮膚細胞に導入することが好ましい。皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される第２レポーター遺伝子や生理活性を評価できるプロモーターで制御される第３レポーター遺伝子を組み込んだベクターは、市販品を使用することもできる。更に、導入遺伝子には、各レポーター遺伝子、その上流側のプロモーターに加え、翻訳を効率化するエレメント、ｍＲＮＡの安定化エレメント、エンハンサ、ＩＲＥＳ、ＳＶ４０ｐＡ、薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒなど）を含むものであってもよい。
　湿疹やかぶれ等の皮膚炎を誘発する皮膚感作性のスクリーニングに使用する本発明の３次元培養物としては、例えば、定常発現プロモーターとしてＵＢＣを、第１レポーター遺伝子として緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子を導入し、皮膚感作性を評価するプロモーターとしてＩＬ－８を、第２レポーター遺伝子として赤色発光ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨａＣａＴの３次元培養物を好ましく用いることができる。
　また、体内時計や角質の健常性維持などの生理活性のスクリーニングに使用する３次元培養物としては、定常発現プロモーターとしてｂｍａｌ１を、第１レポーター遺伝子として緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子を導入し、健常性維持機能を評価するプロモーターとしてｆｉｌａｇｇｒｉｎを、第２レポーター遺伝子として赤色発光ルシフェラーゼ遺伝子を導入した不死化皮膚細胞ＨａＣａＴの３次元培養物を好ましく用いることができる。
　本発明の第２は、不死化皮膚細胞にストレスを負荷しつつ３次元培養することを特徴とする、表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物の製造方法である。本発明において「３次元培養」とは、足場を使用して細胞の凝集塊を形成することを意味し、「３次元培養物」とは、高さ方向に厚みを有する培養積層物を意味する。
　本発明で使用する不死化皮膚細胞において、「不死化」の獲得は、細胞株によって異なる。例えば、ＨａＣａＴは、通常の培養条件とは異なるＣａ２＋濃度と温度条件にて樹立された不死化ヒト表皮角化細胞株であり、ＮＨＥＫ／ＳＶＴＥＲＴ３－５は、ｈＴＥＲＴおよびＳＶ４０によって不死化されたヒト皮膚ケラチノサイトである。また、ＳＩＫは、自発的な不死化による不死化表皮角化細胞であり、不死化ヒト表皮角化細胞－ＳＶ４０は、ヒト皮膚より単離された表皮角化細胞を連続継代し、ＳＶ４０ラージＴ抗原をレンチウイルス技術で導入して不死化したヒト表皮角化細胞株である。皮膚の発がんをはじめとする皮膚化学に焦点を当てた研究において有用である。また、不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴは、ヒト皮膚より単離されたメラノサイトを連続継代し、ｈＴＥＲＴ遺伝子をレンチウイルス技術で導入することにより不死化した、不死化メラノサイトである。色素沈着（メラニン形成）や黒色腫（メラノーマ）などの皮膚疾患の研究に使用することができる。更に、不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０は、ヒト皮膚より単離されたメラノサイトを連続継代し、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をレンチウイルス技術で導入することにより不死化した細胞株である。色素沈着（メラニン形成）や黒色腫（メラノーマ）などの皮膚疾患の研究に使用することができる。しかしながら、上記不死化細胞は、「分化」が抑制され継続培養が可能となった単一クローン細胞である点で共通する。しかしながら、本願発明者は、板状基材に載置した不死化皮膚細胞を３次元培養する際に、前記不死化皮膚細胞が積層する不死化皮膚細胞層の表層にストレスを負荷しつつ３次元培養すること、より具体的には、板状基材周辺の細胞に十分量の培養液を付与し、かつ培養細胞層の上面に培養液をごく少量付与したところ、表層に存在する培養液量の相違によって表層細胞にストレスが負荷され表層が角質層に分化した３次元培養物となることを見出した。
　上記不死化皮膚細胞層の表層にストレスを負荷しつつ行う３次元培養としては、不死化皮膚細胞層の表層に栄養量の相違を与えつつ培養する貧栄養培養、供給酸素量の相違を与えつつ培養する貧酸素培養、供給二酸化炭素量の相違を与えつつ培養する貧二酸化炭素培養、供給湿度の相違を与えつつ培養する貧湿度培養、および供給栄養量と供給湿度量に相違を与えつつ培養する、表層細胞が乾かない程度の培養液を仕込む培養などがある。
　例えば、足場として培養液含浸性板状基材を使用し、その上面に不死化皮膚細胞を播種し、不死化皮膚細胞層の表層にストレスを負荷しつつ３次元培養するものであってもよい。より具体的には、底部が培養液含浸性の内側容器の底部に不死化皮膚細胞を播種し、この内側容器を外側容器に収納して培養する方法がある。内側容器の底部を培養液が通過できるメッシュ構造とし、メッシュの上に培養液含浸性板状基材を載置して、内側容器として使用してもよい。培養液含浸性板状基材に予め培養液を含浸させ、その上面に不死化皮膚細胞を播種する。不死化皮膚細胞を収納した内側容器を外側容器に収納し、外側容器に培養液を仕込んで培養する。この状態で培養すると、培養液含浸性板状基材が足場となり、内側容器内に不死化皮膚細胞が層状に増殖した培養積層物を形成する。本発明では、培養積層物を形成する際に、外側容器の培養液量を、内側容器の不死化皮膚細胞層の表層が乾かない程度の培養液量に調整する。培養液含浸性板状基材およびその近傍の不死化皮膚細胞には潤沢に培養液が供給されるが、表層にある不死化皮膚細胞には十分量の栄養液が供給されず貧栄養状態で培養する。この貧栄養がストレスとなり、本来分化が抑制された不死化皮膚細胞が角質層に分化する。なお、不死化皮膚細胞を培養して３～１０段の細胞層を形成した後に、表層にストレスを負荷して、表層に角質層を形成してもよい。
　培養液は、不死化皮膚細胞の２次元培養に適するものの中から適宜、選択して使用することができる。培養液として、Ｄ－ＭＥＭ、ＫＢＭ基本培地（Ｌｏｎｚａ社）、Ｋｅｒａｔｉｏｎｏｃｙｔｅ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　２　（ＴａＫａＲａ）、ヒトＥｐｉｖｉｔａ増殖培地－基本培地（東洋紡）などを好ましく使用することができる。これらにインシュリン、脳下垂体抽出物（ｂｏｖｉｎｅ　ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　ｅｘｔｒａｃｔ）、ヒト上皮成長因子（ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、アドレナリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、コレラトキシン、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ）、ＣａＣｌ２などのＣａイオンなどを含むものであってもよい。例えば、ストレスが貧栄養培養の場合には、上記した培養液量の変更の他に、外側容器に２次元培養で使用する培養液を仕込み、細胞表層から与える培養液として、この培養液の１以上の成分の濃度を低くしたものを使用して培養してもよい。外側容器に２次元用培養液をそのまま使用した場合には、例えばこれを２～５倍に希釈したものを表層から与えて培養する。また、供給酸素量の相違を与えつつ培養する貧酸素培養の場合は、外側容器に通常量の酸素を供給し、内側容器を外側容器に供給した酸素量の１０～５０％の低酸素濃度の気相とする。供給二酸化炭素量の相違を与えつつ培養する貧二酸化炭素培養の場合も同様であり、外側容器に供給する二酸化炭素量の１０～５０％濃度の二酸化炭素を内側容器の気相とする。供給湿度の相違を与えつつ培養する貧湿度培養の場合は、内側容器の細胞表面に、外側容器の湿度の５～５０％の雰囲気を内側容器の細胞表面に供給する方法を例示することができる。本発明では、これらを組み合わせた培養方法であってもよい。
　培養は、ストレスの負荷方法によって相違するが、通常、３０～４０℃で、５～４０日、より好ましくは１８～２３日である。また、板状基材は、ポアの直径がおよそ５～２０μｍ程度であることが望ましい。これにより本来の皮膚構造体に近い状態の３次元培養物を製造することができる。特に、得られる３次元培養物は、少なくとも表層がサイトケラチン２を発現する角質層またはこれに近似する細胞層であるため、これまでの２次元培養では不可能だった非水溶性物質の評価も可能となる。
　本発明の製造方法により、不死化皮膚細胞の培養積層物が層ごとに異なるサイトケラチンマーカーを発現する理由や、少なくとも表層にサイトケラチン２を発現し、角質層または角質層に近似する細胞に分化する理由は不明である。しかしながら、後記する実施例に示すように、得られた３次元培養物を使用して、親油性物質を感作させると、溶媒対照に比して大きな感作結果を示し、親油性物質に親和性を有する培養積層物となっていた。これに対し、不死化皮膚細胞をカバーグラス上で培養して得た２次元培養物は、サイトケラチン２の発現は確認できなかった。
　不死化皮膚細胞は、定常発現プロモーターで制御される第１レポーター遺伝子、皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される第２レポーター遺伝子、および／または生理活性を評価できるプロモーターで制御される第３レポーター遺伝子とを有するものであってもよい。本発明の製造方法で使用する定常発現プロモーターで制御される第１レポーター遺伝子、第２レポーター遺伝子、および第３レポーター遺伝子は、前記した不死化皮膚細胞の３次元培養物に記載したと同様のものを使用することができる。これら各レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、着色タンパク質遺伝子があるが、２種以上、好ましくは３種以上のレポーター遺伝子のシグナルを区別して検出することができる点でルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。本発明で製造される、レポーター遺伝子が導入された不死化皮膚細胞の３次元培養物は、全ての細胞にレポーター遺伝子が導入されて増殖したものである。特に、表層が角質層であるため、動物実験の代替品として被検物質のスクリーニングの際にレポーターアッセイに使用することができる。
　本発明の第３は、定常発現プロモーターで制御される第１レポーター遺伝子と、皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される第２レポーター遺伝子、および／または生理活性を評価できるプロモーターで制御される第３レポーター遺伝子とを導入された不死化皮膚細胞の３次元培養物に被検物質を投与し、前記第１レポーター遺伝子の発現量に対する前記第２レポーター遺伝子および／または第３レポーター遺伝子の発現量に基づいて前記被検物質の皮膚感作性および／または生理活性を評価することを特徴とする、被検物質の評価方法である。
　使用する３次元培養物は、板状基材の表面に不死化皮膚細胞の培養積層物が付着しているため、これを培養容器に収納して通常３～８時間、より好ましくは４～６時間、前培養する。その後、所定時間、被検物質を３次元培養物に添加しまたは接触させた後に、そのまま３次元培養物を培養しながら経時的に第１レポーター遺伝子の発現量、第２レポーター遺伝子および／または第３レポーター遺伝子の発現量を測定する。各レポーター遺伝子の発現量は、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムなどにより、所定時間、経時的に各レポーター遺伝子による発光や蛍光などを計測することで実施することができる。
　不死化皮膚細胞に、定常発現プロモーターで制御される第１レポーター遺伝子と、皮膚感作性および／または生理活性を評価できるプロモーターで制御される第２レポーター遺伝子および／または第３レポーター遺伝子とを導入すると、第１レポーター遺伝子の発現量を内部標準として相対比を算出することで、第２レポーター遺伝子および／または第３レポーター遺伝子の発現量に影響を与える皮膚感作性および／または生理活性を簡便かつ正確に評価することができる。皮膚感作性に関与するプロモーターで制御される第２レポーター遺伝子と、皮膚の健康状態を維持させる効果を有する生理活性に関するプロモーターで制御される第３レポーター遺伝子とが導入された不死化皮膚細胞を使用すると、被検物質の皮膚感作性と生理活性とを同時に評価することができる。
　被検物質の評価に際しては、被検物質処理後に第２被検物質による追加刺激を加え、その後に各レポーター遺伝子の発現を評価してもよい。このような第２被検物質としては、ＰＭＡ、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、ＬＰＳ、活性酸素産生阻害剤（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）などがある。この評価法により、デキサメサゾン、シクロスポリンなどの免疫抑制薬剤、ディーゼルエンジン排気微粒子、ホルマリンなどの環境汚染物質、ｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎ、ニッケルなど感作性物質の皮膚感作性をハイスループットに評価することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（実施例１）
　セルベッド２４ウェルキャリア（日本バイリーン社：シリカファイバー製）を、２４ウェルプレート（日本バイリーン社）の各ウェルに１枚ずつ入れ、ＰＢＳで親水化処理を行った。その後、各ウェルにＨａＣａＴのＤ－ＭＥＭ懸濁液（１０％ＦＢＳ及び抗生物質を含有、細胞濃度：１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を５００μＬずつ入れ、３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％雰囲気下で３時間培養した。
　上記ＨａＣａＴ細胞の培養物が付着するセルベッドを、Ｄ－ＭＥＭを出来る限り持ち込まないようにして、Ａｌｖｅｔｅｘ社製、スキャホールドウェルインサートタイプ（１２ウェル用）のスキャホールドの上に、細胞が付着する面を上に載置した。載置の際にはスキャホールドとセルベッドとの間に気泡が入らないようにした。図２に示すように、Ａｌｖｅｔｅｘ社製、スキャホールドウェルインサートディープペトリ皿に、セルベッドを載置したウェルインサートを３つ収納し、ペトリ皿にＫＧＭ　Ｇｏｌｄ培養液（Ｌｏｎｚａ社）を３７ｍＬ加えた。ペトリ皿に収納した各セルベッドの上面に、更にＫＧＭ　Ｇｏｌｄを５０μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％雰囲気下で３次元培養を行った。この際、インサートタイプのスキャホールドの底面は完全に培養液中に沈むが、セルベッドは培養液に沈まず、その上面が培養液で湿る状態を維持できるように、培養液５０～１５０μＬをペトリ皿に添加した。セルベッドの上面に１ｍｍ未満のＨａＣａＴ細胞の培養液の層ができる状態であった。ペトリ皿内の培養液を２～３日おきに１８．５ｍＬずつ交換し、２５日間培養を継続した。なお、培養液交換の度に、セルベッドが培養液に沈まず、ＨａＣａＴ細胞が付着しているセルベッドの上面が培養液で湿る状態であることを確認した。この培養時の縦端面を模式的に図３に示す。ＨａＣａＴ細胞は周囲に培養液が存在するが培養液に浸らないという、ストレス環境下での培養であった。
　培養開始１日目から２１日目までの細胞増殖を観察するため、ニュートラルレッドによる染色を行った。セルベッド上の３次元培養細胞をＰＢＳで一回リンスしたのち、ニュートラルレッド溶液に５分間浸して染色した。染色後３回ＰＢＳでリンスしたのち、４％パラフォルムアルデヒド／ＰＢＳに一晩浸して固定化をした。固定化した細胞をＯＴＣコンパウンドで包埋し、クライオスタットで２０μｍの幅に縦に切断して切片を得て検鏡した。３次元培養開始１日目から経時的に２１日まで培養した培養物を上記方法で検鏡した結果を図４に示す。ニュートラルレッドは可溶性の色素であり、生細胞のみ細胞内に取り込むことが出来る。図４に示すように、淡色で示されるセルベッドに付着する暗色の不死化皮膚細胞は、３次元培養により経時的に層状に増殖し、３次元培養物となった。
　(実施例２）
　実施例１と同様にしてＨａＣａＴ細胞を２５日間培養し、ＨａＣａＴ細胞の３次元培養物を得た。この３次元培養物は、セルベッドを板状基材とし、これにＨａＣａＴの培養積層物が層状に付着するものである。この３次元培養物を３回ＰＢＳでリンスしたのち、４％パラフォルムアルデヒド／ＰＢＳに一晩浸して固定化を行った。固定化した細胞をリトリービングバッファーで脱パラフォルムアルデヒド処理した後、ＯＴＣコンパウンドで包埋し、クライオスタットで５μｍの幅で縦に切断した。次いで得られた切片について、免疫染色およびヘキスト染色を行った。免疫染色は１次抗体に抗サイトケラチン２ウサギ抗体、抗サイトケラチン１０ウサギ抗体、抗サイトケラチン１４ウサギ抗体、二次抗体にＡｌｅｘａ４８８をコンジュゲートした抗ウサギ抗体を用いた。また得られた切片について抗イルボクリン（involcurin）マウス抗体で染色し、二次抗体にＡｌｅｘａ５６８をコンジュゲートした抗マウス抗体を用いてイルボクリンを検出した。また、ヘキスト染色はテルモ社のＮｕｃＢｌｕｅ　ｒｅａｇｅｎｔを用いて行い、核を検出した。染色切片にそれぞれの励起光を当てて検鏡した。結果を図５、図６、図７の各上段に示す。図５～図７において、暗色の細胞の下層にある淡色層は、板状基材に該当するセルベッドである。
　図５の上段は、サイトケラチン２（Ｋ２）、核、および明視野観察の結果、図６の上段はサイトケラチン１０（Ｋ１０）、核、および明視野観察の結果、図７の上段は、サイトケラチン１４（Ｋ１４）、イルボクリン、核、および明視野観察の結果である。
　図５上段に示す明視野の組織は、ヘキスト染色による多数の核で構成され、３次元培養物が細胞の積層物であることが確認された。この細胞は免疫染色によりＫ２を発現することが判明した。また、図６上段に示すように特に表層部分に免疫染色によるＫ１０の発現が確認され、図７上段に示すように免疫染色によりＫ１４、およびイルボクリンを発現することが確認された。Ｋ２は正常皮膚組織では角質を含む全ての上皮細胞に、Ｋ１０は有棘層に、Ｋ１４は基底細胞に、インボルクリンは有棘層から表層にかけて発現するとされる。実施例１で得た３次元培養物は、Ｋ２が構造体全体に発現し、Ｋ１４は上層から下層にかけて広く発現するが、特に最下層で強く発現している。Ｋ１０は表面上層に強く発現し、細胞が角質へ分化していると考えられた。なお、インボルクリンは全体に発現しているが下層で密に発現することが確認された。実施例１で得た３次元培養物は不死化皮膚細胞であるＨａＣａＴの培養物であるが、正常細胞にみられる各種ケラチノサイトを含み、かつ下層にインボルクリンを多く含むなど、表皮細胞層に近似する細胞積層物であった。
　(比較例１）
　カバーガラスに実施例１で使用したＤ－ＭＥＭ１ｍｌを滴下し、これに７×１０４個のＨａＣａＴを播種し、温度３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％雰囲気下で培養を行った。説明の便宜のため、３日間の培養により得られた培養物を２次元培養物と称する。培養３日後の２次元培養物をパラフォルムアルデヒドで固定し、免疫染色およびヘキスト染色を行った。結果を図５、図６、図７の各下段に示す。図５の下段は、サイトケラチン２（Ｋ２）、核、および明視野観察の結果、図６の下段はサイトケラチン１０（Ｋ１０）、核、および明視野観察の結果、図７の下段は、サイトケラチン１４（Ｋ１４）、イルボクリン、核、および明視野観察の結果である。
　図５下段に示すように、表層に発現するサイトケラチン２（Ｋ２）は確認することができなかった。図６下段に示すように、有棘層に発現するＫ１０は疎らに発現するが、図７下段に示すように、同じく有棘層から表層に発現するインボルクリンはほとんど発現していなかった。一方で基底層に発現するＫ１４は良く発現していた。これらの発現プロフィールを実施例２の３次元培養物と比較すると、３次元培養物を構成する細胞は角質層に特徴的なサイトケラチン２を発現し、分化が進んで表面が角化し、正常皮膚組織の特性を備えていることが示されていた。
　（実施例３）
　常法に従い、マウス人工染色体ベクターを保持するＣＨＯ－Ｋ１細胞からマウス人工染色体ベクターを含む微小核を単離した。この微小核をポリエチレングリコールを用いてＨａＣａＴ細胞に導入して微小核細胞融合させ、次いで、マウス人工染色体ベクターが導入されたＨａＣａＴ細胞をハイグロマイシンを用いて選択した。また、定法に従い、ＩＬ－８プロモーター配列と赤色発光ルシフェラーゼ配列、配列番号１に示すユビキチンＣプロモーター配列と緑色発光ルシフェラーゼ配列の両カセットの上流・下流および連結部にＨＳ４インスレーター配列を配置したベクターを作製した。これをリポフェクション法により、前記したマウス人工染色体ベクターを保持するＨａＣａＴ細胞に導入した。レポーターベクター導入細胞はＧ４１８を用いた選択培養により選択した。配列番号１は、ユビキチンＣプロモーター（ＮＣＢＩ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＩＤ　ＮＧ＿０２７７２２）の第４８９１から第５４９１の６０１塩基配列である。また、使用したＩＬ－８プロモーター配列は、配列番号２に示すＮＣＢＩ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＩＤ　ＮＧ＿０２９８８９．１の、第８から第５２０２の塩基配列部位である。これにより、ＩＬ－８プロモーターで制御される赤色発光ルシフェラーゼ遺伝子と、ユビキチンＣプロモーターで制御される緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子とを有するＨａＣａＴを得た。
　このようにして得られたＨａＣａＴを用いて、実施例１と同様の方法で３次元培養物を得た。３次元培養物は、実施例１と同様にセルベッドを板状基材とし、これにＨａＣａＴの培養積層物が付着する３次元培養物であり、３次元培養物の表層は角質層であった。
　(実施例４）
　壁面が黒色で底面が無色透明の細胞培養用２４ウェルプレートの３つに実施例３で得た３次元培養物を１枚ずつ入れ、そこに１０％ＦＢＳ、抗生物質［ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）］０．２ｍＭルシフェリンカリウム塩を含むＤ－ＭＥＭを１ｍＬ入れた。
　３次元構造体の発光強度を評価するため、このウェルプレートの周囲にプラスチックパラフィンフィルムをまき、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステム　クロノスＨＴ（アトー株式会社製）で発光を測定した。測定は特許文献３に示す色分離法を用いて、赤色と緑色を分離するため光学フィルター有・無しで各々１０秒間の測定を各ウェルで７２時間継続した。多色発光測定の結果を示す図８に示す。図８（Ａ）は赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター）による発色を示し、図８（Ｂ）は緑色発光ルシフェラーゼ（ＵＢＣプロモーター）による発色を示す。なお、図８には、比較例２の結果も併せて記載する。図８において３Ｄで示す曲線が実施例４（３次元培養物）の結果であり、２Ｄで示す曲線は比較例２（２次元培養物）の結果である。
　（比較例２）
　実施例３で調製したＩＬ－８プロモーターで制御される赤色発光ルシフェラーゼ遺伝子と、ユビキチンＣプロモーターで制御される緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子とを有するＨａＣａＴを、壁面が黒色で底面が無色透明の細胞培養用２４ウェルプレートの３つにそれぞれ細胞２×１０５個入れ、そこに１０％ＦＢＳ、抗生物質［ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）］０．２ｍＭルシフェリンカリウム塩を含むＤ－ＭＥＭを１ｍＬ入れた。
　実施例４と同様に、このウェルプレートの周囲にプラスチックパラフィンフィルムをまき、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステム　クロノスＨＴ（アトー株式会社製）で発光を測定した。測定は光学フィルター有・無しで各々１０秒間の測定を各ウェルで７２時間継続した。多色発光測定の結果を示す図８に示す。
　（結果）
　実施例４と比較例２とにより、２４ウェルプレートの底全面に２次元培養の細胞が存在する場合と３次元培養構造体が存在する場合の赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター）と緑色発光ルシフェラーゼ（ユビキチンＣプロモーター）の発光強度を比較することができる。図８に示すように、３次元培養物（３Ｄ）は２次元培養物（２Ｄ）よりも、赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター）および緑色発光ルシフェラーゼ（ユビキチンＣプロモーター）の発光強度が高い結果となった。特に感作性物質の影響で発光する赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター）は３Ｄのほうが２Ｄより発光強度が強く、細胞が層状に積層することで細胞の機能的な変化が生じて発光が増加したことを示唆するものと考えられた。
　（実施例５）
　実施例３で得た３次元培養物を使用して、親水性の感作性物質としてヒドロキノン（ＨＱ）に対する応答を評価した。
　壁面が黒色で底面が無色透明の細胞培養用２４ウェルプレートのウェルに、２４ウェル用の無色透明、底面が孔径０．４μｍのＰＥＴメンブレンで構成されたセルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎカルチャーインサート　＃３５３０９５）を挿入し、カルチャーインサートの底面に３次元培養物を細胞が上面になるように入れ、カルチャーインサートの外側のウェルに０．２ｍＭルシフェリンカリウム塩を含むＫＧＭ－ｇｏｌｄを０．８ｍＬ入れた。感作性評価のために、インサートの内側にある３次元培養物の上から被検物質を負荷した。ＨＱは２００μＭ，８００μＭ、２ｍＭとなるようにＫＧＭ培地に溶解し、その溶解液３０μＬを３次元培養物の上部からのみ負荷した。また、溶媒対照としてはＫＧＭ培地を３次元培養物の上部から３０μＬ加えた。このウェルプレートの周囲にプラスチックパラフィンフィルムをまき、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムクロノスＨＴ（アトー株式会社製）で０～７２時間発光を測定した。測定は１分おきにそれぞれの色で１０秒間行い、０～７２時間継続した。
　７２時間までのＨＱの測定結果を図９に示す。図９においてＩＬ－８は、ＨＱの各濃度を投与した検体および対照の赤色発光ルシフェラーゼの発光を、ＵＢＣは緑色発光ルシフェラーゼ（ユビキチンＣプロモーター）の結果を示す。赤色発光ルシフェラーゼの発光は、被検物質による皮膚感作の応答を直接示す指標となり、ユビキチンＣプロモーターはハウスキーピング遺伝子として選択したものであり、細胞の生存率を反映した指標となる。図１０に測定７２時間までの、被検物質の各濃度を投与した検体および対照の緑色発光ルシフェラーゼ（ユビキチンＣプロモーター）に対する赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター）の発光比を示す（それぞれｎ＝３で各点ｍｅａｎ＋／－ＳＤでプロット）。発光比は、毒性による細胞死などによる影響を補正した数値として評価することができる。
　図１０に示すように、親水性の感作性物質であるＨＱは、濃度２００μＭから２ｍＭの範囲で濃度依存的に発光比が増加した。しかも、実施例５の方法は、３次元培養物の上面から被検物質を負荷するという方法である。これは、例えば、生体のアレルギー反応を評価する感作性試験と近似する方法である。本発明の３次元培養物は、親水性の感作性物質について、生体表面に被検物質を負荷する方法と近似する方法で、被検物質の感作性等を評価し得ることが判明した。
　（実施例６）
　実施例５で、多色発光を７２時間測定した後の３次元培養物を回収した。この３次元培養物について、実施例１と同様にニュートラルレッドで染色し、縦に切断して切片を得た。これを図１１に示す。多色発光測定後も、３次元培養物を維持していることを確認できた。
　（実施例７）
　実施例３で得た３次元培養物を使用して、親油性の感作性物質としてジブチルアニリン（ＤＡ）およびヘキリルサリシレート（ＨＳ）に対する応答を評価した。
　実施例５と同様に、壁面が黒色で底面が無色透明の細胞培養用２４ウェルプレートのウェルに、２４ウェル用の無色透明、底面が孔径０．４μｍのＰＥＴメンブレンで構成されたセルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎカルチャーインサート　＃３５３０９５）を挿入し、カルチャーインサートの底面に３次元培養物を細胞が上面になるように入れ、カルチャーインサートの外側のウェルに０．２ｍＭルシフェリンカリウム塩を含むＫＧＭ－ｇｏｌｄを０．８ｍＬ入れた。感作性評価のために、インサートの内側にある３次元培養物の上から被検物質を負荷した。ＤＡは、濃度１２．５％（ｖ／ｖ）、２５％（ｖ／ｖ）となるようにオリーブオイルで希釈して、その溶解液３０μＬを３次元培養物の上部から負荷した。またＨＳは、濃度１２．５％（ｖ／ｖ）となるようにオリーブオイルで希釈して、その溶解液３０μＬを３次元培養物の上部から負荷した。また、溶媒対照としてオリーブオイルを３次元培養物の上部から３０μＬ加えた。このウェルプレートの周囲にプラスチックパラフィンフィルムをまき、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムクロノスＨＴ（アトー株式会社製）で０～７２時間発光を測定した。測定は１分おきにそれぞれの色で１０秒間行い、０～７２時間継続した。
　図１２に４８時間までの溶媒対照、ジブチルアニリン、およびヘキリルサリシレートの各濃度を負荷した検体および対照の赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター）の発光および緑色発光ルシフェラーゼ（ユビキチンＣプロモーター）の結果を示し、図１３に、被検物質の各濃度を投与した検体および対照の緑色発光ルシフェラーゼ（ユビキチンＣプロモーター）に対する赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター）の発光比を示す（それぞれｎ＝３で各点ｍｅａｎ＋／－ＳＤでプロット）。図１３に示すように、何れの被検物質も２４時間までに溶媒対照よりもＩＬ－８／ＵＢＣ比が増加し、感作性物質による影響が定常状態より顕著に表れることが判明した。また、ＤＡの発光強度には、濃度依存性が観察された。本発明の３次元培養物は表層が角質層で構成されるため、短時間で親油性物質の感作性を評価できる。しかも実施例５と同様に、３次元培養物の上面から被検物質を負荷するという方法であり、生体のアレルギー反応を評価する感作性試験と近似する方法である。本発明の３次元培養物は、親油性についても、生体表面に被検物質を負荷する方法と近似する方法で、感作性評価に利用する事が出来ることが判明した。
　（実施例８）
　実施例３で得た３次元培養物を使用して、３次元培養物の下面および上面からヒドロキノンを負荷して、ヒドロキノンに対する応答を評価した。
　壁面が黒色で底面が無色透明の細胞培養用２４ウェルプレートのウェルに、２４ウェル用の無色透明、底面が孔径０．４μｍのＰＥＴメンブレンで構成されたセルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎカルチャーインサート　＃３５３０９５）を挿入し、カルチャーインサートの底面に実施例３で得た３次元培養物を細胞が上面になるように入れた。０．２ｍＭルシフェリンカリウム塩および２５ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）を含むＫＧＭ－ｇｏｌｄを調製し、そこに最終濃度が２０μＭ、１００μＭ、２００μＭとなるようにヒドロキノンを加えた培地をそれぞれ５ｍＬずつ調製した。この培地をカルチャーインサートの外側に０．８ｍＬ入れ、ついで、３０μＬを３次元培養物の上部から負荷した。溶媒対照としてウェルに０．２ｍＭルシフェリンカリウム塩および２５ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）を含むＫＧＭ培地を０．８ｍＬ加え、３次元培養物の上部から０．２ｍＭルシフェリンカリウム塩および２５ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）を含むＫＧＭ培地を３０μＬ負荷した。これにより、３次元培養物の上面および下面からヒドロキノンが添加された。
　このウェルプレートの周囲にプラスチックパラフィンフィルムをまき、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムクロノスＨＴ（アトー株式会社製）で０～７２時間発光を測定した。この３次元培養物について実施例５と同様にそれぞれのルシフェラーゼの発色を測定した。ＨＱの各濃度を負荷した検体および対照の赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター）の発光および緑色発光ルシフェラーゼ（ユビキチンＣプロモーター）の結果を図１４に示す。また、図１５に、被検物質の各濃度を負荷した検体および対照の緑色発光ルシフェラーゼ（ユビキチンＣプロモーター）に対する赤色発光ルシフェラーゼ（ＩＬ－８プロモーター）の発光比を示す（それぞれｎ＝３で各点ｍｅａｎ＋／－ＳＤでプロット）。
　図１５に示すように、ＨＱの濃度依存的に発光比が増加した。また、３次元培養物の上面からのみ被検物質を投与した図１０と、３次元培養物にウェル底面と上面の双方から被検物質を投与した図１５とを比較すると、ウェル底面と上面との双方から被検物質を投与すると低濃度でも感作性を検出できることが判明した。
　本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。

Claims (11)

  1. 　板状基材と前記板状基材の表面に付着する不死化皮膚細胞の培養積層物であって、
    　前記培養積層物は、表層が角質層で構成されることを特徴とする、不死化皮膚細胞の３次元培養物。
  2. 　前記不死化皮膚細胞は、ＨａＣａＴ、ＮＨＥＫ／ＳＶＴＥＲＴ３－５（ヒト皮膚ケラチノサイト）、ＳＩＫ（自発的な不死化による不死化表皮角化細胞）、不死化ヒト表皮角化細胞－ＳＶ４０、不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴ、および不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０からなる群から選択される１以上である、請求項１記載の不死化皮膚細胞の３次元培養物。
  3. 　前記不死化皮膚細胞は、定常発現プロモーターで制御される第１レポーター遺伝子と、皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される第２レポーター遺伝子、および／または生理活性を評価できるプロモーターで制御される第３レポーター遺伝子とを有することを特徴とする、請求項１または２記載の不死化皮膚細胞の３次元培養物。
  4. 　前記板状基材は、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタニア、ハイドロキシアパタイト、および合成樹脂からなる群から選択される１以上の基材で構成される液含浸性基材である、請求項１～３のいずれかに記載の不死化皮膚細胞の３次元培養物。
  5. 　不死化皮膚細胞にストレスを負荷しつつ３次元培養することを特徴とする、表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物の製造方法。
  6. 　培養液含浸性板状基材の上面に前記不死化皮膚細胞を播種し、
    　前記不死化皮膚細胞が積層する不死化皮膚細胞層の表層にストレスを負荷しつつ３次元培養することを特徴とする、請求項５記載の製造方法。
  7. 　底部が培養液含浸性の内側容器の前記底部に前記不死化皮膚細胞を播種し、
    　前記内側容器を外側容器に収納し、
    　前記外側容器に、前記不死化皮膚細胞層の表層にストレスを負荷しつつ３次元培養することを特徴とする、
    　請求項６に記載の製造方法。
  8. 　前記不死化皮膚細胞層の表層にストレスを負荷しつつ３次元培養することが、
    　前記不死化皮膚細胞層の表層の貧栄養培養、
    　前記不死化皮膚細胞層の表層の貧酸素培養、
    　前記不死化皮膚細胞層の表層の貧二酸化炭素培養、
    　前記不死化皮膚細胞層の表層の貧湿度培養、または、
    　前記不死化皮膚細胞層の表層が乾かない程度の培養液を仕込んで培養することのいずれか１以上である、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　前記不死化皮膚細胞が、ＨａＣａＴ、ＮＨＥＫ／ＳＶＴＥＲＴ３－５（ヒト皮膚ケラチノサイト）、ＳＩＫ（自発的な不死化による不死化表皮角化細胞）、不死化ヒト表皮角化細胞－ＳＶ４０、不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴおよび不死化ヒトメラノサイト－ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０からなる群から選択される１以上である、請求項５～８のいずれかに記載の製造方法。
  10. 　前記不死化皮膚細胞は、定常発現プロモーターで制御される第１レポーター遺伝子と、皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される第２レポーター遺伝子、および／または生理活性を評価できるプロモーターで制御される第３レポーター遺伝子とを有することを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　請求項３記載の不死化皮膚細胞の３次元培養物に被検物質を投与し、前記第１レポーター遺伝子の発現量に対する前記第２レポーター遺伝子および／または第３レポーター遺伝子の発現量に基づいて前記被検物質の皮膚感作性および／または生理活性を評価することを特徴とする、被検物質の評価方法。
PCT/JP2021/002020 2020-01-22 2021-01-21 表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物、前記３次元培養物の製造方法、および前記３次元培養物を用いた被検物質の評価方法 WO2021149761A1 (ja)

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PCT/JP2021/002020 WO2021149761A1 (ja) 2020-01-22 2021-01-21 表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の３次元培養物、前記３次元培養物の製造方法、および前記３次元培養物を用いた被検物質の評価方法

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