WO2021132427A1 - 抗ｃｄｃｐ１抗体 - Google Patents

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WO2021132427A1
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修一 橋本
中村　康司
瞳 佐野
亜希子 吉岡
亜希 武居
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株式会社カイオム・バイオサイエンス
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an anti-CDCP1 antibody. More specifically, it relates to an anti-human CDCP1 antibody having low binding to healthy human bone marrow hematopoietic stem cells and a fragment thereof, and their use.
  • Human CDCP1 (cub domain containing protein 1) (hereinafter also referred to as hCDCP1) is a type I cell membrane transmembrane protein consisting of a total length of 836 amino acids and having three CUB domains (complement C1r / C1s, Uegf, Bmp1 domain) (non-patented). Reference 1).
  • the CUB domain exists in many proteins such as BMP1 and C1r, proteins with protease activity such as TMPRSS7, and proteins involved in cell-cell interactions such as LRP3, NRP1 and TLL2. being insufficient.
  • Non-Patent Document 2 There are many N-glycosylation sites on the N-terminal side of the extracellular domain, and a relationship has been found between the degree of glycosylation and the metastatic state of cancer cells (see Non-Patent Document 2). Although hCDCP1 is expressed in various cells, its soluble ligand is unknown, while it has been suggested that it interacts with various membrane proteins such as EGFR (see Non-Patent Document 3). The hCDCP1 protein exhibits a band size of 135 kDa in electrophoresis, but a 70 kDa fragment is produced when the 368/369 or 369/370 amino acid sites between the CUB1 and CUB2 domains are cleaved by serine proteases. .. (See Non-Patent Document 1).
  • hCDCP1 the 734th, 743rd, and 762th tyrosine residues in the intracellular region are phosphorylated by the action of Src family kinase. Phosphorylated hCDCP1 induces downstream signals by phosphorylation of PKC ⁇ , promotes scaffold-independent proliferation, extracellular matrix degradation, cell migration and epithelial-mesenchymal transition, and causes cancer cell metastasis. ..
  • hCDCP1 is known to interact with various molecules such as EGFR and HER2 to promote the growth and metastasis of cancer cells.
  • hCDCP1 is expressed in various cancer cells and normal tissues.
  • expression of hCDCP1 mRNA and protein in cancer cells such as prostate cancer, lung cancer, colon cancer, ovarian cancer, cell lines established from them, and normal tissues such as colon, skin, small intestine, and prostate. It has been reported (see Patent Document 1 and Patent Document 2).
  • Patent Document 2 discloses an anti-hCDCP1 polyclonal antibody and a screening method, a diagnostic method, and a therapeutic method for ovarian cancer using this antibody.
  • Patent Document 1 discloses an anti-hCDCP1 monoclonal antibody (clone name: 25A11).
  • An ADC (antibody-drug-conjugate) antibody in which saporin is bound to 25A11 shows cytotoxic activity against a PC3 cancer cell line in vitro, and remarkable tumor growth is achieved by intravenous administration of this ADC antibody. It has been shown that inhibitory activity is exerted.
  • Patent Document 4 discloses a plurality of anti-hCDCP1 antibodies, and the anti-hCDCP1 antibody ADC-ized by PBD (pyrrolobenzodiazepine) exhibits cytotoxic activity against a prostate cancer cell line in vitro. It is disclosed that the anti-hCDCP1 antibody ADCd with MMAE (monomethyl auristatin E) exhibits antitumor activity in a mouse xenograft model transplanted with a breast cancer cell line, a colon cancer cell line or a prostate cancer cell line.
  • PBD pyrrolobenzodiazepine
  • Patent Document 3 discloses four anti-hCDCP1 monoclonal antibodies (CUB1 antibody, CUB2 antibody, CUB3 antibody and CUB4 antibody; each derived from hybridoma clones CUB1 to 4). Since these anti-hCDCP1 monoclonal antibodies bind to the hCDCP1 protein expressed in normal CD34-positive (CD34 + ) cells and normal CD133-positive (CD133 + ) cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, nerve stem cells, etc. using the antibody are used. It is disclosed that it can be used for isolation and identification of.
  • hCDCP1 mRNA and hCDCP1 protein has been confirmed in normal tissues / cells and cancer tissues / cells, and the CUB1 antibody disclosed in Patent Document 3 is K562 cells expressing hCDCP1 (human chronic). In addition to myelogenous leukemia cells), it has been shown to strongly bind to normal CD34 + / CD38 -myelogenous cells. Furthermore, the present inventors have an anti-hCDCP1 antibody derived from 25A11 disclosed in Patent Document 2, a CUB4 antibody disclosed in Patent Document 3, and an anti-hCDCP1 antibody (clone name: CUB1) commercially available from BioLegend.
  • the CD34-positive cell population of bone marrow cells contains hematopoietic stem cells capable of regenerating whole human hematopoietic stem cells, and CD34 is considered to be one of the cell surface markers of human hematopoietic stem cells. There is.
  • an object of the present invention is to provide an anti-hCDCP1 antibody that is unlikely to cause the above-mentioned serious side effects.
  • the present inventors examined the antigen-binding properties of various anti-hCDCP1 antibodies and found that they bind to various cancer cells expressing hCDCP1 while being relative to CD34-positive cells such as hematopoietic stem cells expressing hCDCP1.
  • CD34-positive cells such as hematopoietic stem cells expressing hCDCP1.
  • the present invention is an antibody that binds to CDCP1 and is characterized by low binding to CD34-positive cells and an antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides an anti-hCDCP1 antibody with low binding to CD34-positive cells (eg, CD34-positive bone marrow cells). Since the anti-hCDCP1 antibody according to the present invention exhibits antitumor activity by converting to ADC, it is effective as an anticancer agent with few side effects.
  • CD34-positive cells eg, CD34-positive bone marrow cells
  • a histogram of gel permeation chromatography of hCDCP1 extracellular domain purified protein is shown.
  • the results of SDS-PAGE of hCDCP1 extracellular domain purified protein cleaved with plasmin are shown.
  • the results of flow cytometric observation of the hCDCP1 protein expression level on the cell surface of Ba / F3 cells that forcibly express hCDCP1 are shown.
  • the results of cleavage of cell surface CDCP1 by trypsin treatment of Ba / F3 cells forcibly expressing hCDCP1 are shown.
  • A indicates the time course of the average fluorescence intensity of PE in the cell population as measured by flow cytometry.
  • B is the result of Western blotting for the truncated hCDCP1 molecule.
  • the results of screening for anti-hCDCP1 antibody-producing hybridomas by cell ELISA using PC3 cells and hCDCP1-deficient PC3 cells are shown.
  • the results of cell ELISA using the culture supernatants of hybridomas prepared from each immune animal in Experiment 1, Experiment 2 and Experiment 3 (see Example section) are shown in A, B and C and D.
  • the CDR mutation introduction site of the sequence in which the mouse-human chimeric antibody (mh12A041 series, mh14A025 series) was prepared is shown.
  • the CDR mutation introduction site of the sequence in which the mouse-human chimeric antibody (mh14A043 series, mh14A063 series) was prepared is shown.
  • the results of flow cytometry observation of the reactivity of mouse-human chimeric antibody to hCDCP1 forced expression cells are shown.
  • the observation results by flow cytometry of the reactivity of the mouse-human chimeric antibody to trypsin-treated hCDCP1 forced expression Ba / F3 cells are shown.
  • the results of flow cytometry of the reactivity of the mouse-human chimeric antibody to cynomolgus monkey CDCP1 are shown.
  • the results of flow cytometric observation of the reactivity of mouse-human chimeric antibody to cancer cell lines (SK-MES-1, H358, MDA-MB-231, HCC1143, Capan-2, DLD-1 and OVCAR3) are shown.
  • mice-human chimeric antibody to cancer cell lines (SK-OV-3, TFK-1, PC3 and DU145) and primary cultured cells derived from normal tissues (HMEpC and NHEK) are shown.
  • the results of flow cytometry observation comparing the reactivity of hybridoma-produced mouse antibodies with healthy human bone marrow CD34-positive cells at a comparative antibody concentration of 10 ⁇ g / mL are shown.
  • the results of flow cytometry observation comparing the reactivity of mouse-human chimeric antibody with healthy human bone marrow CD34-positive cells at a comparative antibody concentration of 10 ⁇ g / mL are shown.
  • a to C show the observation results by flow cytometry of the reactivity of the biotinylated mouse-human chimeric antibody to healthy human bone marrow CD34-positive cells.
  • D is a diagram comparing the reactivity of the anti-RS virus antibody biotinylated antibody used in A to C and the purified IgG biotinylated protein derived from normal human serum to bone marrow CD34-positive cells at a comparative antibody concentration of 10 ng / mL. Shown. The results of flow cytometry of the reactivity of humanized anti-hCDCP1 antibody to hCDCP1 forced expression Ba / F3 cells are shown.
  • a and B show the antitumor activity of the PBD-bound anti-hCDCP1 mouse-human chimeric antibody drug conjugate in the PC3 cell line Xenograft model (scid mouse model).
  • C and D show antitumor activity in the PC3 cell line Xenograft model (nude mouse model) of the PBD-bound anti-hCDCP1 mouse-human chimeric antibody drug conjugate.
  • A shows the antitumor activity of the PBD-bound humanized anti-hCDCP1 antibody drug conjugate in the PC3 cell line Xenograft model (nude mouse model).
  • B shows the antitumor activity of the PBD-bound humanized anti-hCDCP1 antibody drug conjugate in the colorectal cancer cell line HCT116 cell line Xenograft model. The antitumor activity of the MMAE-bound humanized anti-hCDCP1 antibody-drug conjugate in the HCT116 cell line Xenograft model is shown.
  • the first embodiment of the present invention is an antibody that binds to human CDCP1 and is characterized by low binding to CD34-positive (CD34 + ) cells (hereinafter, "anti-hCDCP1 antibody of the present invention”). ”) Or an antigen-binding fragment thereof.
  • CD34-positive cell is a cell that expresses the CD34 antigen on its cell surface.
  • CD34 is a single-chain transmembrane phosphorylated glycoprotein with a molecular weight of about 110 kDa, and has two domains with different structures outside the cell.
  • CD34 is a surface antigen marker for various somatic stem cells, and is expressed in bone marrow-derived hematopoietic stem cells / vascular endothelial progenitor cells, skeletal muscle satellite cells, hair follicle stem cells, adipose tissue mesenchymal stem cells, and the like.
  • examples of CD34-positive cells include hematopoietic stem cells capable of differentiating into blood cell lineage cells. In hematopoietic stem cells, it is most highly expressed in the most undifferentiated cells, and its expression decreases as it differentiates into each cell lineage.
  • the "binding ability" of the hCDCP1 antibody of the present invention to CD34-positive cells is the ability (binding ability) of the anti-hCDCP1 antibody to bind to any site of the CD34-positive cells.
  • the evaluation of the binding ability of the anti-hCDCP1 antibody to human CD34-positive cells is relatively evaluated as compared with the binding ability of non-specific human IgG to CD34-positive cells.
  • non-specific human IgG is a human-derived IgG that does not have specific reactivity with human CDCP1 protein, and specifically, does not have specific reactivity with human CDCP1.
  • a method such as affinity chromatography.
  • the anti-hCDCP1 antibody and the non-specific human IgG have the same antibody concentration (hereinafter referred to as “comparative antibody concentration”) (that is, the anti-hCDCP1 antibody concentration and the non-specific human IgG).
  • the binding ability of the anti-hCDCP1 antibody to human CD34-positive cells is low. evaluate. For example, if the anti-hCDCP1 antibody does not show statistically significantly higher binding ability to human CD34-positive cells as compared to non-specific human IgG, it may be evaluated as having low binding ability. In addition, when the anti-hCDCP1 antibody shows higher binding ability than non-specific human IgG, it is evaluated that the anti-hCDCP1 antibody has high binding ability to human CD34-positive cells. For example, if the anti-hCDCP1 antibody shows a statistically significantly higher binding ability to human CD34-positive cells as compared with non-specific human IgG, it may be evaluated as having high binding ability.
  • the scope of the present invention is an antibody having a binding property lower than or similar to that of a certain index antibody to CD34-positive cells.
  • an antibody having a binding property to CD34-positive cells lower than that of the known antibody CUB4 (clone name: h12A041VH1A / VL) and having a binding property similar to or lower than that of the antibody (clone name: h12A041VH1A / VL) can be mentioned.
  • the "comparative antibody concentration” is not particularly limited, but means a specific concentration point, for example, any concentration of 10 ng / mL or more, any concentration of 100 ng / mL or more, 1 ⁇ g. Any concentration of / mL or higher, more preferably any concentration of 10 ⁇ g / mL or higher.
  • the concentration point of 10 ng / ml is the concentration at which CUB4 reacts sufficiently in the test system, that is, the concentration at which CUB4 sufficiently binds to CD34-positive cells. Therefore, it is possible to sufficiently compare and evaluate the binding property at this concentration point.
  • the evaluation of the binding property between the anti-hCDCP1 antibody or non-specific human IgG and CD34-positive cells is not particularly limited, but is carried out by, for example, flow cytometry analysis, ELISA method, RIA method, surface plasmon resonance method, or the like. be able to.
  • the anti-hCDCP1 antibody of the present invention can be prepared, for example, as follows. It is expressed on cancer cells from among antibodies prepared using as an antigen the whole or a part of the extracellular domain of human CDCP1 or the cell in which the whole or a part of the extracellular domain is expressed on the surface. To prepare a desired antibody by screening an antibody that reacts with human CDCP1 and further selecting an antibody having low reactivity to a CD34-positive cell fraction of healthy human bone marrow cells from the screened antibody group. Can be done.
  • the "antibody” in the present specification is not particularly limited in its preparation method and its structure, and is, for example, an “antibody” that binds to a desired antigen with desired properties such as a monoclonal antibody, a polyclonal antibody or a nano antibody. All are included.
  • the anti-hCDCP1 antibody of the present invention is a polyclonal antibody, for example, a mixture of an antigen and an adjuvant against an immune animal (for example, but not limited to, rabbit, goat, sheep, chicken, guinea pig, mouse, rat or pig). Can be prepared by injecting. Usually, the antigen and / or adjuvant is injected subcutaneously or intraperitoneally in the immune animal multiple times.
  • the adjuvants include, but are not limited to, complete Freund and monophosphoryl lipid A synthesis-trehalose dicholinemicolate (MPL-TMD).
  • MPL-TMD monophosphoryl lipid A synthesis-trehalose dicholinemicolate
  • the anti-hCDCP1 antibody can be purified from the serum derived from an immunized animal by a conventional method (for example, a method using Sepharose carrying Protein A).
  • the anti-hCDCP1 antibody of the present invention is a monoclonal antibody
  • it can be produced, for example, as follows.
  • “monoclonal” suggests the characteristic of an antibody obtained from a substantially uniform antibody population (an antibody population having the same heavy chain and light chain amino acid sequences constituting the antibody).
  • the antibody is produced by a specific method (for example, a hybridoma method).
  • Examples of the method for producing a monoclonal antibody include a hybridoma method (Kohler and Milstein, Nature 256 495 1975) and a recombinant method (US Pat. No. 4,816,567).
  • the anti-hCDCP1 antibody of the present invention may be a phage antibody library (eg, Clackson et al., Nature 352 624-628 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222 581-597 1991) or a cell library (eg, Patent 4214234). No .; Seo et al., Nature Biotech., 23 731-735 2005, etc.). More specifically, when prepared using the hybridoma method, the preparation method includes, for example, the following four steps: (i) immunizing an antigen on an immunized animal, (ii) a monoclonal antibody.
  • the immune animal for example, a mouse, a rat, a guinea pig, a hamster, a rabbit and the like can be selected.
  • lymphocytes obtained from the host animal fuse with the immortalized cell line using a fusion agent such as polyethylene glycol or an electrofusion method to establish hybridoma cells.
  • a fusion agent such as polyethylene glycol or an electrofusion method to establish hybridoma cells.
  • a fusion cell for example, a rat or mouse myeloma cell line is used.
  • the cells are grown in a suitable medium containing one or more substrates that inhibit the growth or survival of unfused lymphocytes and immortalized cell lines.
  • the usual technique uses parent cells lacking the enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT or HPRT).
  • hypoxanthine, aminopterin and thymidine are added to a medium (HAT medium) that inhibits the growth of HGPRT-deficient cells and allows the growth of hybridomas.
  • HAT medium hypoxanthine, aminopterin and thymidine
  • HAT medium a medium that inhibits the growth of HGPRT-deficient cells and allows the growth of hybridomas.
  • HAT medium hypoxanthine, aminopterin and thymidine
  • HAT medium a medium that inhibits the growth of HGPRT-deficient cells and allows the growth of hybridomas.
  • HAT medium hypoxanthine, aminopterin and thymidine
  • a nanoantibody is a polypeptide consisting of a variable domain of the heavy chain of heavy chain antibody (VHH).
  • VHH heavy chain antibody
  • Antibodies such as humans are usually composed of heavy and light chains, but camelids such as llamas, alpaca and camels produce single-chain antibodies (heavy chain antibodies) consisting only of heavy chains.
  • a heavy chain antibody can recognize a target antigen and bind to the antigen in the same manner as an antibody consisting of a normal heavy chain and a light chain.
  • the variable region of a heavy chain antibody is the smallest unit that has an affinity for binding to an antigen, and this variable region fragment is called a "nanoantibody”.
  • Nanoantibodies have high heat resistance, digestion resistance, and room temperature stability, and can be easily prepared in large quantities by genetic engineering techniques.
  • Nanoantibodies can be produced, for example, as follows. An antigen is immunized to a camel family animal, the presence or absence of the target antibody is detected from the collected serum, and cDNA is prepared from RNA derived from peripheral blood lymphocytes of the immune animal in which the desired antibody titer is detected. A DNA fragment encoding VHH is amplified from the obtained cDNA and inserted into a phagemid to prepare a VHH phagemid library. The desired Nanoantibody can be prepared from the prepared VHH phagemid library through several screenings.
  • the anti-hCDCP1 antibody of the present invention may be a recombinant antibody.
  • Recombinant antibodies include, but are not limited to, human antibodies and chimeric antibodies with human antibodies.
  • the chimeric antibody is, for example, an antibody in which a variable region derived from a different animal species and a constant region are linked (for example, an antibody in which a variable region of a mouse-derived antibody is bound to a constant region derived from a human) (for example, Proc). . Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855, (1984), etc.), can be easily constructed by genetic recombination technology.
  • a humanized antibody is an antibody that has a human-derived sequence in the framework region (FR) and has a complementarity determining region (CDR) derived from another animal species (for example, mouse).
  • CDR complementarity determining region
  • Humanized antibodies first described in other animal species, here mice, were transplanted from the variable region of a mouse-derived antibody into the human antibody variable region to reconstitute the heavy and light chain variable regions. Later, these humanized reconstituted human antibody variable regions can be prepared by linking them to the human antibody constant region. Methods for producing such humanized antibodies are well known in the art (eg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)).
  • the antigen-binding fragment of the antibody of the present invention is a region of a part of the antibody of the present invention and is an antibody fragment that binds to human CDCP1, and examples of the fragment include Fab, Fab', and F (ab'. ) 2 , Fv (variable fragment of antibody), single chain antibody (heavy chain, light chain, heavy chain variable region, light chain variable region and nano antibody, etc.), scFv (single chain Fv), diabody (scFv dimer) ), DsFv (disulfide-stabilized Fv), and peptides containing at least a part of the CDR of the antibody of the present invention.
  • Fab is an antibody fragment having antigen-binding activity in which about half of the N-terminal side of a heavy chain and the entire light chain are bound by a disulfide bond among fragments obtained by treating an antibody molecule with the proteolytic enzyme papain.
  • Fabs are prepared by treating antibody molecules with papain to obtain fragments, for example, constructing an appropriate expression vector into which DNA encoding Fab is inserted, and using this as an appropriate host cell (for example, CHO cell). It can be carried out by expressing Fab in the cells after introduction into mammalian cells, yeast cells, insect cells, etc.).
  • F (ab') 2 is an antibody fragment having antigen-binding activity, which is slightly larger than the fragment obtained by treating an antibody molecule with the proteolytic enzyme pepsin, in which Fab is bound via a disulfide bond in the hinge region.
  • Is. F (ab') 2 can be prepared by treating an antibody molecule with pepsin to obtain a fragment, or by thioether-bonding or disulfide-bonding Fab, and also by genetic engineering techniques like Fab. Can be made.
  • Fab' is an antibody fragment having antigen-binding activity in which the disulfide bond in the hinge region of F (ab') 2 is cleaved.
  • scFv is a VH-linker-VL or VL-linker-VH polypeptide in which one heavy chain variable region (VH) and one light chain variable region (VL) are linked using an appropriate peptide linker. It is an antibody fragment having antigen-binding activity.
  • ScFv can be prepared by genetic engineering techniques by obtaining cDNA encoding the heavy and light chain variable regions of an antibody.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFv is dimerized and has divalent antigen-binding activity.
  • the divalent antigen-binding activity may be the same antigen-binding activity, or one of them may be a different antigen-binding activity.
  • diabody obtains the cDNA encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of the antibody, and constructs the cDNA encoding scFv in which the heavy chain variable region and the light chain variable region are bound by a peptide linker, and genetically engineered it. It can be produced by a method.
  • DsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of the heavy chain variable region and the light chain variable region is replaced with a cysteine residue, which is bound via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be replaced with the cysteine residue can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody.
  • the cDNA encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region of the antibody can be obtained, and the DNA encoding dsFv can be constructed and produced by a genetic engineering method.
  • Peptides containing CDRs are configured to contain at least one region of heavy or light chain CDRs (CDR1-3). Peptides containing multiple CDRs can be linked either directly or via a suitable peptide linker.
  • the peptide containing the CDR constructs the DNA encoding the CDR of the heavy or light chain of the antibody and inserts it into an expression vector.
  • the type of vector is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of host cell to be introduced thereafter. They can be produced by introducing them into suitable host cells (for example, mammalian cells such as CHO cells, yeast cells, insect cells, etc.) for expressing them as antibodies.
  • the peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • a human antibody (fully human antibody) generally has the same structure as a human antibody in that the hypervariable region, which is the antigen binding site of the V region, the other part of the V region, and the constant region have the same structure. ..
  • a human antibody can be easily produced by a person skilled in the art by a known technique.
  • the human antibody is, for example, a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing the H chain and L chain genes of the human antibody (for example, Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)).
  • a multispecific antibody can be constructed using the antigen-binding fragment of the antibody of the present invention.
  • Multispecificity means having binding specificity for two or more antigens, for example, the form of a protein containing a monoclonal antibody or antigen binding fragment having binding specificity for two or more antigens. Can be mentioned. This is performed by one of ordinary skill in the art by known techniques.
  • As a method for constructing multispecificity a technique for constructing an asymmetric IgG in which two different types of antibody heavy chain molecules are subjected to protein engineering operations so as to form a heterodimer, and antigen-binding fragments obtained from the antibody are used.
  • a plurality of methods have been developed that are classified into techniques for linking or linking with another antibody molecule. For an example of a specific construction method, for example, the following documents can be referred to. Kontermann, R. E., & Brinkmann, U. (2015). Bispecific antibodies. Drug Discovery Today, 20 (7), 838-847.
  • anti-hCDCP1 antibody of the present invention for example, an antibody characterized in that the amino acid sequences of CDRs (complementarity determining regions) 1 to 3 satisfy any of the following (A) to (S) and the like.
  • Antigen binding fragments can be mentioned.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25
  • Heavy chain CDR2 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26
  • Heavy chain CDR3 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27
  • Light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29
  • It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33, Heavy chain CDR2, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34, Heavy chain CDR3, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35, Light chain CDR1, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41, Heavy chain CDR2, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, Heavy chain CDR3, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43, Light chain CDR1, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45, It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49, Heavy chain CDR2, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50, Heavy chain CDR3, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51, Light chain CDR1, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53, It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 57
  • Heavy chain CDR2 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58
  • Heavy chain CDR3 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59
  • Light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 61
  • It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 63.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 65, Heavy chain CDR2, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 66, Heavy chain CDR3, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67, Light chain CDR1, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69, Light chain CDR2, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70, It has a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, Heavy chain CDR2, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 74, Heavy chain CDR3, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75, Light chain CDR1, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77, It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 78 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81
  • Heavy chain CDR2 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 82
  • Heavy chain CDR3 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 83
  • Light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 85
  • It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 87.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 89
  • Heavy chain CDR2 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 90
  • Heavy chain CDR3 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 91
  • Light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 93
  • It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 94 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 95.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 97, Heavy chain CDR2, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 98, Heavy chain CDR3, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 99, Light chain CDR1, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 101, Light chain CDR2, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 102, It has a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 103.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 105
  • Heavy chain CDR2 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 106
  • Heavy chain CDR3 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 107
  • Light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109
  • It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 110 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 111.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49
  • Heavy chain CDR2 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50
  • Heavy chain CDR3 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51
  • Light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53
  • It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55.
  • the antibody satisfying (L) has a light chain variable region in which the amino acids 28 and 29 of the light chain and the amino acid 102 of the heavy chain in the Kabat definition are replaced with other amino acids.
  • other amino acids for example, for the 28th light chain, serine, threonine, alanine, glycine, leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, arginine, tryptophan, histidine, methionine, glutamine, glutamic acid, lysine, etc. Tyrosine can be mentioned, but serine is preferred.
  • alanine, aspartic acid, glutamic acid, methionine, arginine, leucine, isoleucine, valine, and lysine can be mentioned, but alanine is preferable.
  • alanine, glutamic acid, serine, threonine, glycine, leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, tryptophan, methionine, lysine, histidine, and glutamine can be mentioned, but serine is preferable.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 65
  • Heavy chain CDR2 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 66
  • Heavy chain CDR3 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67
  • Light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69
  • It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71.
  • the antibody satisfying (N) has a heavy chain variable region in which the 54th and 55th amino acids of the heavy chain in the Kabat definition are replaced with other amino acids.
  • other amino acids for example, for the 54th heavy chain, serine, threonine, alanine, glycine, leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, arginine, tryptophan, histidine, methionine, glutamine, glutamic acid, lysine, etc.
  • Tyrosine can be mentioned, but serine, phenylalanine, arginine, threonine and tryptophan are preferred.
  • alanine, aspartic acid, glutamic acid, methionine, arginine, leucine, isoleucine, valine, and lysine can be mentioned, but alanine, aspartic acid, glutamic acid, leucine, and methionine are preferable.
  • Heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73
  • Heavy chain CDR2 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 74
  • Heavy chain CDR3 which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75
  • Light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77
  • It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 78 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79.
  • the antibody satisfying (P) has a heavy chain and a light chain variable region in which the 54th and 55th amino acids of the heavy chain and the 33rd amino acid of the light chain in the Kabat definition are replaced with other amino acids.
  • other amino acids for example, for the 54th heavy chain, serine, threonine, alanine, glycine, leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, arginine, tryptophan, histidine, methionine, glutamine, glutamic acid, lysine, etc. Tyrosine can be mentioned, but serine is preferred.
  • alanine, aspartic acid, glutamic acid, methionine, arginine, leucine, isoleucine, valine, and lysine can be mentioned, but alanine is preferable.
  • the 33rd amino acid of the light chain include serine, threonine, alanine, glycine, leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, arginine, tryptophan, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, tyrosine, lysine and histidine.
  • Leucine is preferred.
  • the antibody satisfying (R) has a heavy chain and a light chain variable region in which the heavy chains 52a and 53 and the light chain 33 in the Kabat definition are replaced with other amino acids.
  • other amino acids for example, for the 52nd heavy chain, serine, threonine, alanine, glycine, leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, arginine, tryptophan, histidine, methionine, glutamine, glutamic acid, lysine, etc. Tyrosine can be mentioned, but serine is preferred.
  • alanine, aspartic acid, glutamic acid, methionine, arginine, leucine, isoleucine, valine, and lysine can be mentioned, but alanine is preferable.
  • the 33rd amino acid of the light chain include serine, threonine, alanine, glycine, leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, arginine, tryptophan, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, tyrosine, lysine and histidine.
  • leucine is leucine.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR1 of the heavy chain variable region satisfy any of the following (T) to (U), and CDR1 to CDR1 to the light chain variable region are satisfied.
  • Examples thereof include an antibody or an antigen-binding fragment thereof, wherein the amino acid sequence of 3 satisfies any of the following (t) to (v).
  • Light chain CDR1 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 186, Light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54, and light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55.
  • V Light chain CDR1, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 188, It has a light chain CDR2 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55.
  • SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO:
  • the antibody comprises an amino acid sequence having an amino acid sequence identity of about 94% or more, about 95% or more, about 96% or more, about 97% or more, about 98% or more, and most preferably about 99% or more.
  • Examples thereof include antibodies characterized by binding to human CDCP1 and having low binding to human CD34-positive cells, and antigen-binding fragments thereof.
  • a second embodiment of the present invention is an antibody that binds to human CDCP1 and has low binding to human CD34-positive cells, and is an antibody according to the first embodiment (that is, the antibody of the present invention).
  • An antibody that competitively inhibits the binding of an anti-hCDCP1 antibody) to human CDCP1 hereinafter, also referred to as “competitive antibody of the present invention” or an antigen-binding fragment thereof.
  • the competitive antibody of the present invention can be prepared and obtained by competing experiments and the like well known to those skilled in the art.
  • the binding between the first anti-hCDCP1 antibody (antibody according to the embodiment) and human CDCP1 is competitively inhibited by the second anti-hCDCP1 antibody, the first anti-hCDCP1 antibody and the second anti-hCDCP1 antibody It is judged that the hCDCP1 antibody is bound to the antigen site substantially the same or in the immediate vicinity.
  • the second anti-hCDCP1 antibody has low binding to CD34-positive cells, the second anti-hCDCP1 antibody is a competing antibody of the present invention.
  • a method using a Fab fragment or the like is usually performed in the technical field. See, for example, WO95 / 11317, WO94 / 07922, WO2003 / 064473, WO2008 / 118356 and WO2004 / 046733.
  • a third embodiment of the present invention is an antibody according to the first embodiment or an antibody according to the second embodiment or an antigen-binding fragment thereof to which a substance having antitumor activity is bound.
  • a substance having antitumor activity such as a drug can be bound to an antibody to perform targeted treatment for cancer (such a complex is hereinafter referred to as "complex such as antibody drug of the present invention").
  • the substance having antitumor activity includes cytotoxic drugs such as anticancer agents, radioisotopes, substances that indirectly induce antitumor activity by manipulating the immune system, and the like. It is not limited to this.
  • Drugs exhibiting antitumor activity can be used in the third embodiment, and such conjugates are referred to as antibody drug conjugates.
  • Tubulin inhibitors and microtubule polymerization inhibitors such as Auristatins (MMAE, MMAF, etc.), Maytansines (DM1, DM4, etc.), Dubulysin, cryptophycins, rhizoxins, etc., are used as drugs showing antitumor activity.
  • Antibiotics such as Calicheamicin, Doxorubicin, anthracycline, DNA synthesis inhibitors such as Duocarmycin, PBD (Benzodiazepine), IGNs (indolinobenzodiazepine), Topoisomerase I inhibitors of Canptothecin analogs (SN-38, DXd, etc.)
  • RNA polymerase II inhibitors such as Amanitin and RNA splyosome inhibitors such as spliceostatin and thailanstatin are known, but are not limited thereto.
  • a drug exhibiting antitumor activity a compound that is excited by light energy and exhibits toxicity can also be used.
  • Such antibody-drug conjugates are administered into the body to bind to tumor cells, and then kill the tumor cells by applying light energy such as near-infrared rays from outside the body.
  • Photoimmunotherapy It can be used for a treatment called.
  • the anti-hCDCP1 antibody of the present invention may also be used as an antibody used for photoimmunotherapy.
  • IR700 and the like are known as compounds used, but the compound is not limited to this.
  • Radioimmunotherapy in which a radioisotope is bound to an antibody and the radiation emitted by the isotope is used to kill cancer cells, is known.
  • the anti-hCDCP1 antibody of the present invention is also a radioimmunotherapy. It can be used as an antibody used in.
  • Radioisotopes used in the third embodiment of the present invention include, for example, ⁇ -ray nuclides such as 131 I and 90 Y, and ⁇ -ray nuclides such as 213 Bi, 211 At, 225 Ac, 223 Ra and 212 Pb. However, it is not limited to these.
  • the third embodiment of the present invention it is possible to use a substance that directly or indirectly exerts antitumor activity by manipulating the physiological action of a tissue other than the tumor, such as the tumor itself or the immune system.
  • a tissue other than the tumor such as the tumor itself or the immune system.
  • the elements of the immune system to be manipulated include lymphoid cells such as T cells, B cells, and NK cells, myeloid cells such as monospheres, macrophages, dendritic cells, and granulocytes, or these. It is possible to think of cells other than the immune system cells that secrete and present substances that affect the immune system cells.
  • Substances that manipulate these cells include cancer vaccine peptides, cytokines (interleukins, interferons, colony-stimulating factors (CSF), etc.), hormones, growth factors (TGF family, FGF family, IGF family, etc.) Thrombopoietin, erythropoietin, etc.), but are not limited to these.
  • Chemical modification methods for binding an antitumor substance to an antibody have been known so far, and for example, the following methods are known.
  • Chemical modification methods such as covalent bond to the lysine residue side chain and covalent bond to the cysteine residue side chain, an unnatural amino acid is introduced into the antibody peptide chain, and the side chain is chemically modified site-specifically.
  • These include a method of modifying, a method of modifying a specific amino acid sequence in an antibody, a method of modifying a modified sugar chain using a specific enzymatic reaction, a method of modifying using an enzyme that links peptides, and the like.
  • the drug-antibody binding ratio is a numerical value indicating how many drug molecules are bound to one antibody molecule in an antibody-drug conjugate.
  • the DAR varies depending on the method of chemically binding the drug to the antibody, and is generally 1 to 8, but it is also possible to prepare an antibody drug conjugate having a DAR of 9 or more depending on the mode of chemical binding. ..
  • a fourth embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which comprises the antibody drug complex of the present invention or an antigen-binding fragment thereof according to the third embodiment (hereinafter, "the present invention". Also referred to as “pharmaceutical composition”).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in the form of a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutical additives in addition to the complex such as the antibody drug of the present invention which is an active ingredient or an antigen-binding fragment thereof. ..
  • other known drugs may be added to the pharmaceutical composition according to the embodiment.
  • motifs containing asparagine residues and aspartate residues are known (for example, Sydow et al., (2014). Structure-based prediction of asparagine and aspartate degradation sites in antibody. variable regions. PLoS ONE, 9 (6), etc.), showing that it is possible to modify those amino acid motifs while preserving the activity of the antibody further enhances the usefulness of the antibody.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in an oral or parenteral dosage form and is not particularly limited, for example, tablets, capsules, granules, powders, syrups, suspensions, suppositories, etc. Examples include ointments, creams, gels, patches, inhalants or injections. These formulations are prepared according to a conventional method. The liquid preparation may be dissolved or suspended in water or another suitable solvent at the time of use. In addition, tablets and granules may be coated by a well-known method. Injectables are prepared by dissolving the antibody of the invention or a functional fragment thereof in water, but may be dissolved in physiological saline or glucose solution as needed, and may be used as a buffer or storage. Agents may be added.
  • the type of pharmaceutical additive used for producing the pharmaceutical composition of the present invention, the ratio of the pharmaceutical additive to the active ingredient, or the method for producing the pharmaceutical composition shall be appropriately selected by those skilled in the art according to the form. Is possible.
  • an inorganic or organic substance, or a solid or liquid substance can be used, and generally, for example, 0.1% by weight to 99.9% by weight or 1% by weight to the weight of the active ingredient. It can be blended in an amount of 95.0% by weight, or between 1% by weight and 90.0% by weight.
  • additives for preparation lactose, glucose, mannit, dextrin, cyclodextrin, starch, crust, magnesium aluminometasilicate, synthetic aluminum silicate, sodium carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl starch, calcium carboxymethyl cellulose , Ion exchange resin, methyl cellulose, gelatin, arabic rubber, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, light anhydrous silicic acid, magnesium stearate, talc, tragant, bentonite, beagum, titanium oxide, sorbitan fatty acid ester, Examples thereof include sodium lauryl sulfate, glycerin, fatty acid glycerin ester, purified lanolin, glycero gelatin, polysorbate, macrogol, vegetable oil, wax, liquid paraffin, white vaseline, fluorocarbon, nonionic surfactant, propy
  • the active ingredient and excipient ingredient such as lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate or silicic anhydride
  • the active ingredient and excipient ingredient are mixed to form a powder or, if necessary, a powder.
  • a binder such as sucrose, hydroxypropyl cellulose or polyvinylpyrrolidone, a disintegrant such as carboxymethyl cellulose or carboxymethyl cellulose calcium is added, and wet or dry granulation is performed to obtain granules.
  • these powders and granules may be used as they are, or they may be tableted by adding a lubricant such as magnesium stearate or talc.
  • granules or tablets are coated with an enteric solvent base such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate or methacrylic acid-methylmethacrylic acid polymer to form an enteric solvent preparation, or are coated with ethyl cellulose, carnauba wax or a curing oil to form a long-acting preparation. You can also do it.
  • enteric solvent base such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate or methacrylic acid-methylmethacrylic acid polymer to form an enteric solvent preparation
  • ethyl cellulose, carnauba wax or a curing oil to form a long-acting preparation. You can also do it.
  • enteric solvent base such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate or methacrylic acid-methylmethacrylic acid polymer to form an enteric solvent preparation
  • ethyl cellulose, carnauba wax or a curing oil to form a long-acting preparation. You can also do it.
  • hard capsules are filled with powders or
  • the active ingredient may be a pH adjuster such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, sodium monohydrogen phosphate or sodium dihydrogen phosphate, sodium chloride or glucose, etc., as required.
  • a pH adjuster such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, sodium monohydrogen phosphate or sodium dihydrogen phosphate, sodium chloride or glucose, etc.
  • reticine, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, or the like can be added to the active ingredient and emulsified in water to obtain an emulsion for injection.
  • the active ingredient is moistened and dissolved with a suppository substrate such as cocoa butter, fatty acid tri, di and monoglyceride or polyethylene glycol and poured into a mold to cool or the active ingredient.
  • a suppository substrate such as cocoa butter, fatty acid tri, di and monoglyceride or polyethylene glycol
  • the dose and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention are not particularly limited, and may be determined according to conditions such as prevention of exacerbation / progression of the disease to be treated and / or the purpose of treatment, the type of disease, and the weight and age of the patient. It can be appropriately selected at the discretion of the doctor or pharmacist.
  • the daily dose for adults in oral administration is about 0.01 to 1,000 mg (weight of active ingredient), and can be administered once or divided into several times a day, or every few days. .. When used as an injection, it is desirable to administer a daily dose of 0.001 to 100 mg (weight of active ingredient) continuously or intermittently to adults.
  • cytotoxic cells such as T cells expressing the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof on the cell surface
  • Chimeric antigen receptor expression T cell (CAR-T) therapy is a cancer patient after expressing a fusion gene (chimeric antigen receptor gene) of a part of the antigen binding site of the antibody and the T cell receptor in T cells. It is a treatment method that uses T cells that have been transferred into the body and specifically attack cancer cells to bring about antitumor activity.
  • a tumor expressing a human CDCP1 molecule is specifically attacked.
  • CAR-T therapy can be constructed.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can attack and kill any cancer cell expressing hCDCP1 on the cell surface. Therefore, the cancer to be treated by the pharmaceutical composition of the present invention may be any, and is not particularly limited. If we dare to exemplify typical cancers, for example, hepatocellular carcinoma, bile duct cell carcinoma, renal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, transitional cell carcinoma, adenocarcinoma, malignant Gastrinoma, melanoma, fibrosarcoma, mucinosarcoma, liposarcoma, smooth myeloma, horizontal print myoma, malignant malformation, hemangiosarcoma, caposiloma, osteosarcoma, chondrosarcoma, lymphangioma, malignant meningitis, non-hodgkin lymphoma , Hodgkin lymphoma, malignant tumors such as leukemia and brain tumors, epithelial cell-derived
  • a fifth embodiment of the present invention relates to a method for preventing and / or treating cancer (hereinafter, also referred to as “the method for preventing or treating the present invention”), which comprises administering the pharmaceutical composition of the present invention to a patient.
  • treatment means to prevent or alleviate the progression and exacerbation of the pathological condition in a patient who has already suffered from cancer, and thereby to prevent or alleviate the progression and exacerbation of the cancer. It is a treatment to be performed.
  • prevention means to prevent the onset of a person who may develop a cancer requiring treatment in advance, and thereby, a treatment aimed at preventing the onset of the cancer in advance. That is.
  • the target of treatment and prevention is not limited to humans, but mammals other than humans, such as mice, rats, dogs, cats, domestic animals such as cows, horses and sheep, and primates such as monkeys, chimpanzees and gorillas, etc. It may be, particularly preferably a human.
  • a method for diagnosing cancer using the antibody of the present invention can be mentioned.
  • the antibody of the present invention can specifically bind to a human CDCP1 molecule, and by labeling the antibody of the present invention with a fluorescent substance, a radioisotope, an enzyme, etc., a tumor and a cancer cell expressing the human CDCP1 molecule, It is possible to detect a human CDCP1 molecule or a fragment thereof present in blood. Examples of the detection method include immunostaining method, flow cytometry method, Western blotting method, ELISA method, RIA method, CLIA method, PET method and the like.
  • Cancer cells in the body can be directly detected, or the expression level of human CDCP1 in a patient sample can be observed, thereby evaluating the presence or absence of a primary tumor, the presence or absence of a metastatic tumor, and the like. Furthermore, by pre-diagnosing the expression level of human CDCP1 in cancer cases by the method using the antibody of the present invention, it is possible to predict the therapeutic effect of administration of the pharmaceutical composition using the antibody of the present invention.
  • the cancer to be diagnosed may be any cancer and is not particularly limited.
  • hepatocellular carcinoma for example, hepatocellular carcinoma, bile duct cell carcinoma, renal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, transitional cell carcinoma, adenocarcinoma, malignant Gastrinoma, melanoma, fibrosarcoma, mucinosarcoma, liposarcoma, smooth myeloma, horizontal print myoma, malignant malformation, hemangiosarcoma, caposiloma, osteosarcoma, chondrosarcoma, lymphangioma, malignant meningitis, non-Hodikin lymphoma , Hodgkin lymphoma, malignant tumors such as leukemia and brain tumors, epithelial cell-derived neoplasms (epithelial carcinomas), basal cell carcinomas, adenocarcinomas, lip cancers, oral cancers, esophageal cancers, small bowel cancers and gastrointestinal cancer
  • This amino acid sequence was converted into a base sequence based on the codon table of mammals, and a DNA sequence (SEQ ID NO: 3) in which a Kozak translation start sequence was inserted at the 5'end and a translation stop codon was inserted at the 3'side was synthesized by gene synthesis. (GENEWIZ).
  • the synthesized DNA was inserted between the restriction enzyme KpnI recognition sequence and PmeI recognition sequence of pEF1 / V5-His A (Thermo Scientific).
  • the expression vector prepared as described above was used below.
  • the expression vector plasmid was transiently transfected into FreeStyle293 cells (ThermoScientific) using the polyethyleneimine method and then cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C.
  • the culture supernatant was collected, filtered through a 0.22 ⁇ m filter, and then bound to a HisTrap excel column (GE Healthcare). It was then eluted with a concentration gradient of 20 mM to 500 mM imidazole in 20 mM phosphate buffer / 300 mM NaCl / pH 7.5 buffer. The eluted fractions were separated by 1 mL, and fractions with a band of about 100 kDa were collected by SDS-PAGE method. A 9-fold amount of 20 mM Tris-HCl pH 8.0 was added to this eluted fraction and bound to a HiTrap Q (GE Healthcare) column.
  • FIG. 2 is a diagram.
  • the eluted protein contained two molecular species having different molecular weights. These two molecular species were considered to be two peptide fragments resulting from the cleavage of hCDCP1-ECD, and it was considered that these two fragments were purified in some way while maintaining the bound state even after cleavage.
  • the synthesized DNA was inserted between the KpnI / PmeI recognition sequences of pEF1 / V5-His A (Thermo Scientific) and used as the expression vector GS01.
  • the plasmid GS01 was linearized with the restriction enzyme PmeI, and 2 ⁇ g was introduced into 2 ⁇ 10 6 mouse B cell-derived cell lines Ba / F3 cells by Nucleofector 2b (Lonza). After gene transfer, cells were seeded on 96-well plates and G418 (Nacalai Tesque) with a final concentration of 1 ⁇ g / mL was added.
  • Ba / F3-hCDCP1 The hCDCP1-expressing Ba / F3 cell line (hereinafter referred to as Ba / F3-hCDCP1) prepared in the previous section and the Ba / F3 original strain as a negative target were used.
  • Cells serum were washed 2 times with contained no cold RPMI1640 medium (Sigma-Aldrich) were suspended in RPMI1640 medium at a concentration of 1.25 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • FIG. 4A is a graph showing the change in the average fluorescence intensity of the cell population from the fluorescence intensity of PE measured by flow cytometry.
  • the staining intensity of the anti-Myc tag antibody decreased over time only when trypsin / EDTA was added, indicating that the N-terminus of the hCDCP1 molecule on Ba / F3-hCDCP1 was digested by trypsin. It was. On the other hand, the staining intensity with the anti-hCDCP1 antibody did not change, and it was shown that the trypsin treatment did not reduce the number of hCDCP1 molecules recognized by the anti-hCDCP1 antibody used in this experiment.
  • Protein was quantified and 20 ⁇ g was run on SDS-PAGE.
  • the human prostate cancer-derived cell line PC3 which is known to express truncated hCDCP1
  • PC3 human prostate cancer-derived cell line PC3
  • the cells were lysed and SDS-PAGE was performed.
  • the protein is transferred from the cultured gel to a PVDF membrane, and the anti-hCDCP1 intracellular domain antibody (Abcam) is used as the primary antibody for detection, the alkaline phosphatase-labeled anti-goat IgG antibody (Promega) is used as the secondary antibody, and NBT is used as the detection reagent.
  • Abcam anti-hCDCP1 intracellular domain antibody
  • the alkaline phosphatase-labeled anti-goat IgG antibody Promega
  • NBT is used as the detection reagent.
  • hCDCP1 expressing Ba / F3-CDCP1 is cleaved by treatment with trypsin and plasmin, leaving a cleaved hCDCP1 molecule on the cell.
  • This technique was then used to screen for antibodies that react with the truncated hCDCP1 molecule.
  • Hybridomas were prepared using the proteins and cells prepared up to the previous section, and hybridomas producing antibodies showing hCDCP1-specific reactions were screened.
  • PC3 cells in which the hCDCP1 molecule was knocked out were generated for use as a negative control for screening clones that react with hCDCP1 expressed in cancer cells.
  • the human prostate cancer cell line PC3 used was purchased from ATCC.
  • CDCP1 CRISPR / Cas9 KO plasmid (h) (SantaCruz) was introduced into 1 ⁇ 10 6 PC3 cells by Nucleofector 2b (Lonza). This plasmid contains the GFP gene sequence.
  • GFP fluorescence-positive cells were single-cell sorted into 96-well culture plates using FACSAriaII (Becton Dickinson). For clones in which cell proliferation was observed after 7 to 10 days, expression was confirmed by flow cytometry using an anti-hCDCP1 antibody (R & D systems), and cell clones not expressing hCDCP1 were amplified. Was used as hCDCP1-KO PC3 cells in the following experiments.
  • Monoclonal antibodies against hCDCP1 were prepared using lymph node cells isolated from mice immunized with hCDCP1 purified protein or forced expression cells.
  • 50 ⁇ g of hCDCP1-ECD protein was mixed with TiterMaxGold (TiterMax) per mouse and intravenously administered to the sole of the foot.
  • TiterMax Gold TiterMax Gold
  • booster immunization was performed by mixing 10 ⁇ g of antigen per mouse with TiterMax Gold and administering it intravenously to the sole of the foot.
  • Ba / F3-hCDCP1 cells were used as the immune substance.
  • RPMI1640 (ATCC modified; Thermofisher Scientific) was prepared by collecting popliteal lymph nodes from post-immune mice to prepare cell suspensions. The cells were mixed with SP2 / 0-Ag14 myeloma cells and fused with polyethylene glycol (Roche). The fused cells were suspended in ClonaCell TM- HY Medium D (STEMCELL) containing Hybridoma enhancing medium (Sigma-Aldrich) and seeded on a plastic petri dish.
  • ClonaCell TM- HY Medium D STMCELL
  • Hybridoma enhancing medium Sigma-Aldrich
  • the culture medium After removing the culture medium, 25 ⁇ L of the hybridoma culture supernatant or the antibody solution diluted with the medium was added per well, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 1 hour. After removing the culture supernatant and washing with PBS, the secondary antibody was diluted with a medium, added, and reacted at 4 ° C. for 1 hour. After further washing with PBS three times to completely remove the washing liquid, the substrate liquid (ELISA POD substrate TMB Kit, Nacalai Tesque) was reacted, and after 10 minutes, the mixture was stopped with 1N sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm was measured.
  • the substrate liquid ELISA POD substrate TMB Kit, Nacalai Tesque
  • FIGS. 5A, 5B, 5C, and 5D The results of cell ELISA using the culture supernatants of hybridomas prepared from immune animals in Experiment 1, Experiment 2, and Experiment 3 are shown in FIGS. 5A, 5B, 5C, and 5D.
  • the numerical values in the figure are the values obtained by subtracting the values obtained by reacting the hybridoma culture medium containing no antibody from the measured values of each clone. From this result, it was shown that a hybridoma producing an antibody that reacts with PC3 cells, which are cancer cells expressing hCDCP1, was obtained from immune mice using hCDCP1 purified protein or forced expression cells.
  • FIGS. 5A, 5B, and 5C show that the antibodies produced by the hybridomas shown in these figures do not react with hCDCP1-KO PC3 cells, and it is true that these antibodies express PC3. It was shown that it specifically responded to hCDCP1.
  • the CDR regions of the resulting antibody sequences were determined according to the method of Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, 1991).
  • the antibody sequences of the analyzed clones and their CDR region sequences are summarized in Table 1 below.
  • mouse / human chimeric antibody Based on the antibody sequence obtained in the previous section, a chimeric antibody in the mouse heavy chain / light chain variable region and the human IgG1 heavy chain / ⁇ light chain constant region (hereinafter referred to as mouse / human chimeric antibody) was prepared.
  • Mouse-human chimeric antibodies were prepared for 6 of the antibodies sequenced in the previous section, 12A041, 14A025, 14A043, 14A055, 14A063, and 14A091.
  • 12A041, 14A025, 14A043, and 14A063 the same amino acid sequence as the one analyzed in the previous section was prepared, and at the same time, amino acid modification of the CDR region was attempted.
  • the nucleotide sequence was designed based on the amino acid sequence of the antibody molecule, and the expression vector was synthesized by gene synthesis.
  • the 14A055 heavy chain variable region (SEQ ID NO: 80), 14A055 light chain variable region (SEQ ID NO: 84), 14A091 heavy chain variable region (SEQ ID NO: 96), and 14A091 light chain variable region (SEQ ID NO: 100) are described in the preceding section.
  • An expression vector was prepared by amplifying and subcloning the variable region DNA from the sequence subcloned into the pcDNA3.4 vector by the PCR method.
  • the vectors used were the pFUSE-CHIg-hG1 vector (Invivogen) for the heavy chain variable region sequences of antibody groups other than the mh12A041 antibody group and mh14A025 antibody group, and the heavy chain variable region sequences of the mh12A041 antibody group and mh14A025 antibody group.
  • the pFUSE-CHIOME-HC vector and the light chain variable region sequences of all antibody groups were cloned into the pFUSE2-CLIg-hk vector (Invivogen).
  • the amino acid sequences of the antibody constant regions of these three vectors are shown in SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, and SEQ ID NO: 159, respectively.
  • the prepared expression vector was expressed in Expi293 cells (Thermo Fisher Scientific). At this time, for each antibody group of mh12A041, mh14A025, mh14A043, and mh14A063, heavy chain and light chain vectors were expressed in combination in the following patterns.
  • the antibody protein concentration secreted in the culture supernatant was measured by the Alpha LISA method, diluted to each concentration based on the measured value, bound to Ba / F3-hCDCP1 cells, and further as a secondary antibody, PE-labeled anti-human IgG antibody. (Becton Dickinson) was reacted, and the reactivity of each antibody was evaluated by measuring the fluorescence of PE by flow cytometry. The result is shown in FIG. As shown in the figure, all the antibodies evaluated retained reactivity to hCDCP1.
  • mh12A041HCori / LCori mh14A025HCori / LCori, mh14A043HCori / LCori, mh14A055, mh14A063HCori / LCori, mh14A091 Ba / F3-hCDCP1 cells were treated in RPMI1640 medium containing 0.05% trypsin at 37 ° C. for 30 minutes and then washed twice with RPMI1640 / 10% FBS. It was confirmed by Western blotting similar to that described in the previous section that the full-length type of hCDCP1 disappeared and became only the cut type in the Ba / F3-CDCP1 cells subjected to this treatment.
  • a diluted series of anti-hCDCP1 mouse-human chimeric antibody from 5 ⁇ g / mL to 5 ng / mL was prepared for these cells and reacted at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the anti-RS virus antibody described in the later section was used as a non-specific human IgG to prepare a similar dilution series and reacted at 4 ° C. for 30 minutes.
  • a PE-labeled anti-human IgG Fc antibody (Southern Biotech) was allowed to act as a secondary antibody, and after washing, the fluorescence intensity was observed with FACSCantoII (BECTON DICKINSON). The result is shown in FIG.
  • the synthesized DNA was connected to the KpnI / PmeI site of pEF1 / V5-His A (Thermo Fisher Scientific) and used as the expression vector GS02.
  • the plasmids GS01 (prepared in the previous section) and GS02 were linearized with the restriction enzyme PmeI, and 2 ⁇ g was introduced into 2 ⁇ 10 6 CHO-K1 cells by Nucleofector (Lonza).
  • the cells were cultured in the presence of 400 ⁇ g / mL hyglomycin for 3 days, and then the cells were exfoliated and dispersed, stained with anti-hCDCP1 antibody (R & D systems), and positive cells were stained with FACS AriaII (Becton Dickinson). Single cell sorting was performed using the cells.
  • the cell clones grown after isolation were further stained with an anti-hCDCP1 antibody (R & D systems) to isolate clones expressing hCDCP1 and cynomolgus monkey CDCP1. These clones were expanded and used as hCDCP1-expressing CHO-K1 cells and cynomolgus monkey CDCP1-expressing CHO-K1 cells.
  • Petri dish cells were exfoliated and suspended by 0.25% trypsin / EDTA (Nacalai Tesque) treatment, washed with FCM buffer, and then each antibody was diluted with FCM buffer to the concentration shown in the figure. Was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Then, it was washed twice with FCM buffer and stained with PE-labeled mouse anti-human IgG antibody (Becton Dickinson) as a secondary antibody. Flow cytometric analysis was performed using FACSCantoII (Becton Dickinson). The results are shown in FIGS. 10A and 10B. All candidate clones responded to cancer cells. It also showed reactivity with NHEK and HMEpC.
  • the non-specific mouse IgG monoclonal antibody clone 2E12
  • that of MBL was used.
  • PE-labeled anti-mouse IgG antibody Becton Dickinson was reacted at 4 ° C. for 30 minutes.
  • APC-labeled anti-human CD34 antibody (BioLegend) was reacted at 4 ° C. for 30 minutes. After washing twice with FCM buffer, the cells were suspended in FCM buffer containing 7-AAD (Becton Dickinson) and flow cytometrically observed with FACSCantoII (Becton Dickinson). The reactivity of the evaluated antibody is shown in FIG. Only CD34-APC-positive living cells were gated from the flow cytometry data, and a histogram of the fluorescence value of the PE was created. As shown in FIG.
  • the CUB1 antibody binds more strongly to the CD34-positive cell fraction of bone marrow mononuclear cells compared to non-specific mouse IgG, while the reaction of the following antibody clones listed in FIG.
  • the sex was sufficiently low, comparable to non-specific mouse IgG at a comparative antibody concentration of 10 ⁇ g / mL, and the reactivity to CD34-positive cell fractions was undetectable.
  • An anti-hCDCP1 antibody clone CUB1 (BioLegend) was used as a positive antibody.
  • hIgG non-CDCP1-specific human IgG
  • the anti-RS virus antibody described in a later section was used.
  • PE-labeled anti-human IgG antibody (SantaCruz) or CUB1 antibody was reacted with PE-labeled anti-mouse IgG antibody (Becton Dickinson) at 4 ° C. for 30 minutes.
  • APC-labeled anti-human CD34 antibody (BioLegend) was reacted at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the cells were suspended in FCM buffer containing 7-AAD (Becton Dickinson) and observed with FACSCantoII (Becton Dickinson).
  • FCM buffer containing 7-AAD Becton Dickinson
  • FACSCantoII Becton Dickinson
  • FIG. 12 Only CD34-positive living cells were gated from the flow cytometry data, and a histogram of the fluorescence value of the PE was created.
  • the CUB1 antibody binds more strongly to the CD34-positive cell fraction of myeloid mononuclear cells compared to the cell group without the primary antibody, while the following antibody clones listed in FIG.
  • the purified antibody of the above mouse-human chimeric antibody was biotinylated using the EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation Kit (Thermo Scientific).
  • the 25A11 antibody, CUB4 antibody, and anti-RS virus antibody for comparison were prepared based on the sequences listed below.
  • 25A11 antibody Heavy chain variable region sequence set forth in SEQ ID NO: 20 of International Publication No. WO 2008/133851, and light chain variable region sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the heavy chain variable region prepared in the present application is shown in SEQ ID NO: 163, and the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 164.
  • CUB4 antibody Heavy chain variable region sequence set forth in SEQ ID NO: 3 of US Pat. No. US 8394928, and light chain variable region sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
  • the heavy chain variable region of the antibody prepared in the present application is shown in SEQ ID NO: 165, and the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 166.
  • Anti-RS virus antibody Sequence registered in PBD database registration number 2hwz. The heavy chain variable region is from the 1st to the 120th of 2hwz_H, and the light chain variable region is from the 1st to the 106th of 2hwz_L.
  • the heavy chain variable region of the antibody prepared in the present application is shown in SEQ ID NO: 167, and the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 168.
  • the nucleotide sequences encoding these are gene-synthesized, and the heavy chain variable region is cloned into the pFUSE-CHIg-hG1 vector and the light chain variable region is cloned into the pFUSE2-CLIg-hk vector.
  • the antibody sample purified through the process was used.
  • the anti-RS virus antibody was used below as a non-specific human IgG (hIgG).
  • the same bone marrow mononuclear cells derived from healthy subjects as in the previous section were used. After thawing, the frozen cell stock was washed with FCM buffer or IMDM medium containing 2% FBS, and then FcR blocking reagent (Miltenny) was added and treated at room temperature for 15 minutes. The primary antibody sample was added as it was, and the reaction was carried out at 4 ° C. for 30 minutes. After washing twice with FCM buffer, PE-labeled goat anti-human IgG antibody (Southern Biotechnology), APC-labeled anti-human CD34 antibody (BioLegend), and PE-Cy7-labeled anti-human CD45 antibody (BioLegend) were mixed. The reaction was carried out at 4 ° C.
  • the biotinylated antibodies of CUB1, CUB4, and 25A11 show sufficient reactivity with bone marrow CD34-positive cells even at low concentrations, whereas mh12A041HCori / LCori, mh14A025HCori / LCori, and mh14A043HCori / LCori.
  • the reactivity of the biotinylated antibodies of the four antibodies, mh14A063HCori / LCori, to CD34-positive cells was remarkably low, and the biotinylated antibodies of CUB1, CUB4, and 25A11 showed strong reactivity, especially at the comparative antibody concentration of 10 ng / mL.
  • FIG. 13D shows the bone marrow of the anti-RS virus antibody biotinylated antibody used as the non-specific human IgG in FIGS. 13A to 13C and the purified IgG biotinylated protein derived from normal human serum at a comparative antibody concentration of 10 ng / mL.
  • FIG. 13D shows the average value and standard error of the PE average fluorescence intensity. This showed that the reactivity of the anti-hCDCP1 antibody group described in the present invention was comparable to that of human serum-derived IgG protein.
  • a three-dimensional molecular model of a mouse antibody was prepared by a conventional method.
  • the residues considered to be important for the structure formation of CDR and the residues considered to be essential for the reaction with the antigen were estimated in the amino acid sequence of the framework region. ..
  • sequences highly homologous to the heavy chain variable region and light chain variable region of each anti-hCDCP1 antibody were searched from the cDNA sequence database of human antibody heavy chain variable region and light chain variable region.
  • a sequence was designed in which the sequence of the framework part of the searched human antibody sequence and the CDR sequence of each anti-hCDCP1 antibody were linked, and the remainder considered to be essential for CDR structure formation or reaction with an antigen.
  • the group sequences were transplanted to design humanized antibody sequences.
  • the designed arrangement is shown in Table 4 below.
  • the CDR sequence of the humanized antibody sequence is the same as that of the original mouse antibody, and is the same sequence as the above-mentioned SEQ ID NO:.
  • the serine residue of Kabat No. 32 is mutated to a phenylalanine residue
  • the histidine residue of Kabat No. 27d is mutated to a tyrosine residue, or 27a. Since it was considered that the affinity for the antigen was improved by simultaneously mutating the serine residue and the serine residue No. 28 to the aspartic acid residue and the aspartic acid residue, respectively, these mutations are included in Table 5 below. I created an array.
  • a DNA sequence encoding the designed variable region amino acid sequence was synthesized by gene synthesis.
  • the heavy chain variable region sequence DNA was cloned into pFUSE-CHIg-hg1, which is a vector containing a human IgG1 constant region, after connecting a human antibody secretory signal peptide or a human IL-2 secretory signal peptide.
  • the light chain variable region sequence DNA was cloned into a pFUSE2-CLIg-hk vector, which is a vector containing a human Ig ⁇ constant region, after connecting a human antibody secretory signal peptide or a human IL-2 secretory signal peptide.
  • h12A041 VH1 / VL, VH2 / VL, VH1 / VLA, VH2 / VLA, VH1 / VLB, VH2 / VLB, VH1A / VL, VH2A / VL, VH1A / VLA, VH2A / VLA, VH1A / VLB, VH2A / VLB h14A043: VH1 / VL1, VH1 / VL2, VH1 / VL3, VH2 / VL1, VH2 / VL2, VH2 / VL3 h14A063: VH2 / VL1, VH2 / VL2, VH3 / VL1, VH3 / VL2, VH2 / VL3 h14A063: VH2 / VL1, VH2 / VL2, VH3 / VL1, VH3 / VL2, VH2 / V
  • the biotinylated valence of each antibody was measured using the Biotin Quantification Kit (Thermo Scientific) and is as shown in Table 6 below. Using these antibodies, the reactivity to healthy human bone marrow-derived mononuclear cells was observed by flow cytometry in the same manner as described in the previous section. In FIG. 15, the following biotinylated antibody was bound to healthy human bone marrow-derived mononuclear cells at a concentration of 10 ng / mL and then observed by flow cytometry to observe the PE fluorescence intensity of the CD34 / CD45 positive viable cell population. The histogram of the result is shown.
  • FIG. 16 shows a log-log graph showing the concentration dependence of the average fluorescence intensity of PE in live CD34-positive cells.
  • the CUB4 antibody showed remarkable binding to CD34-positive cells in the bone marrow, whereas all the antibodies shown in Table 6 were sufficiently low in reactivity with the antibody to be compared positively.
  • the reactivity was comparable to that of the non-specific human IgG antibody observed as a negative subject. From this, it was considered that the antibody described in the present invention has low reactivity to hematopoietic stem cells, and therefore the modified antibody having antitumor activity derived from these also has low cytotoxicity to bone marrow cells.
  • PBD conjugate antibody The mouse-human chimeric antibody prepared in Item 7, the humanized antibody prepared in Item 14, and the anti-RS virus antibody described above as a non-specific human IgG are directly applied to the purified antibody. , An antibody drug conjugate to which PBD (Pyrrolobenzodiazepine), which is an anticancer drug, was bound, and its cytotoxicity was evaluated.
  • PBD Polyrrolobenzodiazepine
  • Mouse-human chimeric antibody PBD conjugated antibody mh12A041-PBD (DAR 2.1); mh14A025-PBD (DAR 1.7); mh14A043-PBD (DAR 1.8); mh14A063-PBD (DAR 2.0) Humanized antibody PBD conjugated antibody: h12A041-PBD (DAR 3.8); h14A043-PBD (DAR 3.6); h14A063-PBD (DAR 3.4) Anti-RS virus antibody PBD conjugated antibody: hIgG-PBD (DAR 2.2)
  • Cytotoxic activity of mouse-human chimeric antibody PBD-conjugated antibody against cancer cells The cytotoxic activity of the PBD-conjugated antibody of mouse-human chimeric antibody prepared in the previous section against cultured cells was evaluated by the following method. The same cancer cell lines and primary cultured cells derived from normal tissues as described in the previous section were used. The cells were cultured in a plastic dish using a suitable medium. The cells were detached by trypsin treatment, and 1000 cells or 2000 cells per well were seeded on a 96-well flat bottom plate.
  • FIG. 17A is a calculation of the 50% inhibition concentration (IC50) from the experimental results
  • FIG. 17B is a graph of this. As can be seen from these figures, the cytotoxic activity of each antibody PBD conjugate against NHEK and HMEpC was weaker than that against cancer cell lines.
  • Cytotoxic activity of humanized antibody PBD-conjugated antibody against cancer cells The cytotoxic activity of humanized antibody PBD-conjugated antibody prepared in Item 16 was evaluated for cultured cells by the same method as in Item 17.
  • the cell lines used were PC3, DU145, HCT116, MDA-MB-231, H358, SK-OV-3 and normal human epidermal keratinocytes (NHEK), the same as those described in Item 10. ..
  • the cells were detached by trypsin treatment, and 1000 cells or 2000 cells per well were seeded on a 96-well flat bottom plate.
  • mice scid mice (C.B17 / Icr-scidJcl; Japan Marie) or nude mice (BALB / cAJcl-nu / nu; Japan Marie) females 6 to 7 weeks old were used.
  • PC3 cells purchased from ATCC were used.
  • PC3 cells were cultured in a medium containing 7% FBS and 10 ⁇ g / mL Gentamicin (Thermo Scientific) added to Ham's F-12K (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After exfoliating the cells with 0.25% trypsin / 0.02% EDTA (ThermoScientific) and washing with PBS, 5 ⁇ 10 6 cells per animal were combined with Matrigel growth factor reduced phenol red-free (Corning) 1: 1. And transplanted subcutaneously to the right flank of the mouse. When the tumors grew and the average tumor volume exceeded 100 mm 3, they were randomized and grouped (8 animals in a group) based on the tumor volume of each individual.
  • test drug was administered once to the tail vein at 10 ⁇ L / g per mouse body weight.
  • Tumor size and body weight measurements started 3-4 days after cell transplantation and were performed twice a week thereafter.
  • the minor axis and major axis of the tumor were measured using calipers, and the tumor size was calculated as (minor axis mm) 2 x (major axis mm) x 3.14 / 6.
  • 19A and 19B show the experimental results using the scid mouse model.
  • Both mh12A041-PBD and mh14A025-PBD significantly suppressed tumors in both the 1 mg / kg and 0.3 mg / kg groups compared to the group receiving the same concentration of nonspecific hIgG-PBD.
  • 19C and 19D show the experimental results using a nude mouse model.
  • Both mh14A043-PBD and mh14A063-PBD significantly suppressed tumors in both the 1 mg / kg and 0.3 mg / kg groups compared to the group receiving the same concentration of nonspecific hIgG-PBD.
  • mice nude mice (BALB / cAJcl-nu / nu; Japan Marie) females 6 to 7 weeks old were used.
  • PC3 cells and HCT116 cells purchased from ATCC were used.
  • PC3 cells were cultured in a medium containing 7% FBS and 10 ⁇ g / mL Gentamicin (Thermo Scientific) added to Ham's F-12K (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • HCT116 cells were cultured in a medium containing McCoy's 5A (Thermo Scientific) supplemented with 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin (Nacalai Tesque). After exfoliating the cells with 0.25% trypsin / 0.02% EDTA (ThermoScientific) and washing with PBS, 5 ⁇ 10 6 cells per animal were combined with Matrigel growth factor reduced phenol red-free (Corning) 1: 1. And transplanted subcutaneously to the right flank of the mouse. When the tumors grew and the average tumor volume exceeded 100 mm 3, they were randomized and grouped (8 animals in a group) based on the tumor volume of each individual.
  • FIG. 20A shows the experimental results using a Xenograft model using PC3 cells. All of h12A041-PBD, h14A043-PBD, and h14A063-PBD significantly suppressed tumors with a single dose of 1 mg / kg compared to the group receiving the same concentration of nonspecific hIgG-PBD.
  • FIG. 20B shows the experimental results using a Xenograft model using HCT116 cells.
  • a single dose of 0.3 mg / kg of h12A041-PBD, h14A043-PBD, and h14A063-PBD significantly suppressed tumors compared to the group receiving the same concentration of nonspecific hIgG-PBD.
  • MMAE-conjugated antibody For the humanized antibody prepared in Item 14 below, an antibody-drug conjugate in which the purified antibody was directly bound to MMAE (monomethyl auristatin E), which is an anticancer drug, was prepared. Its cytotoxicity was evaluated.
  • TCEP Tris (2-carboxyethyl) phosphine Hydrochloride
  • maleimidocaproyl-valine-citruline-p-aminobenzyloxycarbonyl-monomethyl auristatin E (MC-vc-PAB-MMAE) was bound by an addition bond reaction between maleimide and cysteine.
  • unreacted MC-vc-PAB-MMAE was removed with a Sephadex G50 column, and buffer substitution was performed at PBS pH 7.2.
  • the number of bound MMAE molecules per antibody molecule was measured by the ratio of absorption at 248 nm to absorption at 280 nm, and was measured to be approximately 3.9 for h14A043VH1 / VL1 and approximately 4.0 for h14A063VH4 / VL2.
  • the names of the prepared MMAE conjugated antibodies are as follows. h14A043-MMAE; h14A063-MMAE
  • mice nude mice (BALB / cAJcl-nu / nu; Japan Marie) females 6 to 7 weeks old were used.
  • HCT116 cells purchased from ATCC were used. HCT116 cells were cultured by the same method as in Item 20.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • FIG. 21 shows the experimental results. Both h14A043-PBD and h14A063-PBD significantly suppressed tumors by 4 doses of 5 mg / kg as compared with the PBS-administered group.
  • the antibody and its antigen-binding fragment provided by the present invention are considered to play an important role in the provision of prevention or treatment of cancer, the development of a preventive or therapeutic agent for cancer, etc. Therefore, the present invention is in the medical field. , Expected to be used in the pharmaceutical field, etc.

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Abstract

本発明は、副作用の少ない抗がん剤等の有効成分として使用し得る抗hCDCP1抗体およびADC化した当該抗hCDCP1抗体の提供を目的とする。具体的には、本発明は、ヒトCDCP1（CUB domain-containing protein 1）に結合する抗体であって、ヒトCD34陽性細胞との結合性が低いことを特徴とする、前記抗体またはその抗原結合断片である。当該抗体の代表的なとして、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する抗体を挙げることができる。

Description

抗ＣＤＣＰ１抗体
　本発明は、抗CDCP1抗体に関する。より具体的には、健常人骨髄造血幹細胞との結合性が低い抗ヒトCDCP1抗体およびその断片、ならびにそれらの使用に関する。
　ヒトCDCP1（cub domain containing protein 1）（以下hCDCP1とも称する）は、全長836アミノ酸からなり、３つのCUBドメイン（complement C1r/C1s,Uegf,Bmp1ドメイン）を有するI型細胞膜貫通タンパク質である（非特許文献１参照）。CUBドメインは、BMP1やC1rの他、TMPRSS7などのプロテアーゼ活性を持つタンパク質、LRP3、NRP1およびTLL2などの細胞間相互作用に関わるタンパク質など多くのタンパク質に存在するが、分子機能の統一的な理解は不足している。細胞外ドメインのＮ末側には多数のN-グリコシル化部位があり、グリコシル化の程度とがん細胞の転移性状態との間に関連性がみとめられている（非特許文献２参照）。hCDCP1は種々の細胞で発現しているがその可溶性リガンドは不明であり、一方でEGFRなど様々な膜タンパク質と相互作用することが示唆されている（非特許文献３参照）。hCDCP1タンパク質は、電気泳動において135kDaのバンドサイズを示すが、CUB1ドメインとCUB2ドメインの間の368/369番目ないしは369/370番目のアミノ酸の部位がセリンプロテアーゼによって切断されると、70kDaの断片が生じる。（非特許文献１参照）。
　hCDCP1は、細胞内領域にある734番目、743番目、762番目のチロシン残基がSrcファミリーキナーゼの働きなどによりリン酸化される。リン酸化されたhCDCP1はPKCδのリン酸化などにより下流のシグナルを惹起し、足場非依存的増殖、細胞外マトリックスの分解、細胞遊走および上皮間葉転換などを促進し、がん細胞の転移を引き起こす。また、hCDCP1はEGFR、HER2などさまざまな分子と相互作用してがん細胞の増殖、転移を促進することが知られている。
　hCDCP1は、様々ながん細胞および正常組織において発現していることが報告されている。例えば、前立腺がん、肺癌、大腸癌、卵巣がんなどのがん細胞、それらより樹立された細胞株、さらには結腸、皮膚、小腸、および前立腺などの正常組織においてhCDCP1 mRNAおよびタンパク質の発現が報告されている（特許文献１、特許文献２参照）。
　現在までにいくつかのhCDCP1に対する抗体（以下、抗ヒトCDCP1ないし抗hCDCP1抗体と称することもある）が知られている。
　特許文献２には、抗hCDCP1ポリクローナル抗体ならびにこの抗体を用いた卵巣がんのスクリーニング方法、診断方法および治療方法が開示されている。特許文献１には抗hCDCP1モノクローナル抗体（クローン名：25A11）が開示されている。25A11にサポリンを結合させたADC（antibody-drug-conjugate）化抗体が、in vitroにおいてPC3癌細胞株に対して細胞傷害活性を示し、このADC化抗体を静脈内投与することにより顕著な腫瘍成長阻害活性が発揮されることが示されている。
　また、特許文献４には、複数の抗hCDCP1抗体が開示されており、PBD（pyrrolobenzodiazepine）でADC化した抗hCDCP1抗体が、in vitroにおいて前立腺がん細胞株に対して細胞傷害活性を示すこと、MMAE（monomethyl auristatin E）でADC化した抗hCDCP1抗体が、乳がん細胞株、大腸癌細胞株または前立腺がん細胞株を移植したマウスゼノグラフトモデルにおいて抗腫瘍活性を示すことが開示されている。
　さらに、特許文献３には、４つの抗hCDCP1モノクローナル抗体（CUB1抗体、CUB2抗体、CUB3抗体およびCUB4抗体；各々、ハイブリドーマクローンCUB1～4由来）が開示されている。これらの抗hCDCP1モノクローナル抗体は、正常CD34陽性（CD34+）細胞および正常CD133陽性（CD133+）細胞に発現するhCDCP1タンパク質に結合するため、当該抗体を用いた造血幹細胞、間葉幹細胞および神経幹細胞などの分離および同定に使用できることが開示されている。
国際公報ＷＯ２００８／１３３８５１号 欧州特許公開公報１６７７８７５号 米国特許公開公報７，５４１，０３０号 国際公報ＷＯ２０１８／１１２３３４号
Mostageerら, Oncogene 20:4402-4408 2001. Yangら, Oncotarget 6:43743-58 2015. Heら、Oncoscience 3:5-8 2016.
　上述のように、hCDCP1 mRNAおよびhCDCP1タンパク質は正常組織／細胞およびがん組織／細胞において発現が確認されており、特許文献３に開示されているCUB1抗体は、hCDCP1を発現するK562細胞（ヒト慢性骨髄性白血病細胞）の他、正常なCD34+/CD38-骨髄細胞にも強く結合することが示されている。
　さらに、本発明者らは、特許文献２に開示されている25A11由来の抗hCDCP1抗体、特許文献３に開示されているCUB4抗体およびBioLegend社から市販されている抗hCDCP1抗体（クローン名：CUB1）は、hCDCP1を発現する各種癌細胞の他、正常なCD34陽性骨髄細胞にも強く結合することを確認した（図１１、図１２、図１３Ａ、図１５および図１６参照）。
　骨髄細胞のうちCD34陽性の細胞集団には、ヒトの血液系細胞全体を再生する能力のある造血幹細胞が含まれており、CD34はヒト造血幹細胞の細胞表面マーカーの一つであると考えられている。
　これら既知の抗体の造血幹細胞に対して強く結合するという性質は、抗腫瘍薬としてこれらの抗hCDCP1抗体を用いる場合に深刻な問題を引き起こす。すなわち、抗hCDCP1抗体が結合した正常な骨髄細胞が免疫機能（例えばADCC活性）により攻撃され、細胞が属する組織の機能阻害および機能抑制が生じ、重篤な副作用を生じる可能性が高い。さらには、抗hCDCP1抗体をADC化した場合、ADC化抗体が正常組織及び細胞にも害を及ぼすことにより、一層顕著かつ深刻な悪影響を与えてしまう。
　したがって、本発明の目的は、上記重篤な副作用を惹起する可能性が低い、抗hCDCP1抗体の提供である。
　本発明者らは、様々な抗hCDCP1抗体の抗原結合特性を検討したところ、hCDCP1を発現する種々のがん細胞に結合する一方、hCDCP1を発現する造血幹細胞などのCD34陽性細胞に対しては相対的に弱く結合する性質を有する新規の抗hCDCP1抗体を調製することに成功した。
　従って、本発明は、CDCP1に結合する抗体であって、CD34陽性細胞との結合性が低いことを特徴とする抗体およびその抗原結合断片である。
　本発明により、CD34陽性細胞（例えば、CD34陽性骨髄細胞）に対する結合性が低い抗hCDCP1抗体が提供される。本発明にかかる抗hCDCP1抗体は、ADC化することによって抗腫瘍活性を示すことから、副作用の少ない抗がん剤として効果を発揮する。
hCDCP1細胞外ドメイン精製タンパクのゲル浸透クロマトグラフィーのヒストグラムを示す。 hCDCP1細胞外ドメイン精製タンパクをプラスミンによって切断処理したタンパクのSDS-PAGEの結果を示す。 hCDCP1を強制発現するBa/F3細胞の細胞表面のhCDCP1タンパク発現量のフローサイトメトリーによる観察結果を示す。 hCDCP1を強制発現するBa/F3細胞のトリプシン処理による細胞表面CDCP1の切断結果を示す。Ａはフローサイトメトリーにより測定された、細胞集団のPEの平均蛍光強度の経時的変化を示す。Ｂは切断型hCDCP1分子に対するウェスタンブロッティングの結果である。 PC3細胞とhCDCP1欠損PC3細胞を用いた細胞ELISAによる、抗hCDCP1抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング結果を示す。実験1、実験2および実験3（実施例の項を参照のこと）における各免疫動物から作製されたハイブリドーマの培養上清を用いた細胞ELISAの結果を、Ａ、ＢおよびＣとＤに示す。 マウス・ヒトキメラ抗体（mh12A041シリーズ、mh14A025シリーズ）を作製した配列のCDR変異導入箇所を示す。 マウス・ヒトキメラ抗体（mh14A043シリーズ、mh14A063シリーズ）を作製した配列のCDR変異導入箇所を示す。 マウス・ヒトキメラ抗体のhCDCP1強制発現細胞への反応性のフローサイトメトリーによる観察結果を示す。 マウス・ヒトキメラ抗体のトリプシン処理したhCDCP1強制発現Ba/F3細胞に対する反応性のフローサイトメトリーによる観察結果を示す。 マウス・ヒトキメラ抗体のカニクイザルCDCP1に対する反応性のフローサイトメトリーによる観察結果を示す。 マウス・ヒトキメラ抗体のがん細胞株（SK-MES-1、H358、MDA-MB-231、HCC1143、Capan-2、DLD-1およびOVCAR3）への反応性のフローサイトメトリーによる観察結果を示す。 マウス・ヒトキメラ抗体のがん細胞株（SK-OV-3、TFK-1、PC3およびDU145）および正常組織由来初代培養細胞（HMEpCおよびNHEK）への反応性のフローサイトメトリーによる観察結果を示す。 ハイブリドーマの産生するマウス抗体の、10μg/mLの比較抗体濃度において健常人骨髄CD34陽性細胞に対する反応性を比較した、フローサイトメトリーによる観察結果を示す。 マウス・ヒトキメラ抗体の、10μg/mLの比較抗体濃度において健常人骨髄CD34陽性細胞に対する反応性を比較した、フローサイトメトリーによる観察結果を示す。 Ａ～Ｃは、ビオチン化したマウス・ヒトキメラ抗体の健常人骨髄CD34陽性細胞に対する反応性のフローサイトメトリーによる観察結果を示す。Ｄは、Ａ～Ｃで用いた抗RSウイルス抗体ビオチン化抗体と、正常ヒト血清由来精製IgGビオチン化タンパクの、10ng/mLの比較抗体濃度における、骨髄CD34陽性細胞に対する反応性を比較した図を示す。 ヒト化された抗hCDCP1抗体のhCDCP1強制発現Ba/F3細胞に対する反応性のフローサイトメトリーによる観察結果を示す。 ビオチン化したヒト化抗hCDCP1抗体、ビオチン化した比較対象抗体の、10ng/mLの比較抗体濃度における、健常人骨髄CD34陽性細胞に対する反応性のフローサイトメトリーによる観察結果を示す。 ビオチン化したヒト化抗体の健常人骨髄CD34陽性細胞に対する反応性の濃度依存性を、フローサイトメトリーによって観察した結果を示す。 PBDを結合させた抗hCDCP1マウス・ヒトキメラ抗体薬物複合体のがん細胞株および正常組織由来初代培養細胞に対するin vitroにおける細胞傷害活性を示す。 PBDを結合させたヒト化抗hCDCP1抗体薬物複合体の、癌細胞株および正常ヒト表皮角化細胞初代培養細胞に対するin vitroにおける細胞傷害活性を示す。 ＡおよびＢは、PBDを結合させた抗hCDCP1マウス・ヒトキメラ抗体薬物複合体のPC3細胞株ゼノグラフトモデル（scidマウスモデル）における抗腫瘍活性を示す。ＣおよびＤは、PBDを結合させた抗hCDCP1マウス・ヒトキメラ抗体薬物複合体のPC3細胞株ゼノグラフトモデル（ヌードマウスモデル）における抗腫瘍活性を示す。 Ａは、PBDを結合させたヒト化抗hCDCP1抗体薬物複合体のPC3細胞株ゼノグラフトモデル（ヌードマウスモデル）における抗腫瘍活性を示す。Ｂは、PBDを結合させたヒト化抗hCDCP1抗体薬物複合体の大腸癌細胞株HCT116細胞株ゼノグラフトモデルにおける抗腫瘍活性を示す。 MMAEを結合させたヒト化抗hCDCP1抗体薬物複合体のHCT116細胞株ゼノグラフトモデルにおける抗腫瘍活性を示す。
　本発明の第１の実施形態は、ヒトCDCP1に結合する抗体であって、CD34陽性（CD34+）細胞との結合性が低いことを特徴とする、前記抗体（以下「本発明の抗hCDCP1抗体」とも記載する）またはその抗原結合断片である。
　CD34陽性細胞とは、その細胞表面にCD34抗原を発現している細胞のことである。CD34は、分子量約110kDaの単鎖膜貫通型リン酸化糖タンパクで、細胞外部に構造の異なる2のドメインを有している。CD34は様々な体性幹細胞の表面抗原マーカーであり、骨髄由来の造血幹細胞／血管内皮前駆細胞、骨格筋衛星細胞、毛包幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞などに発現している。
　ここで、CD34陽性細胞の例を挙げるとすれば、例えば、血球系細胞に分化可能な造血幹細胞などが挙げられる。造血幹細胞においては最も未分化な細胞で最も高く発現しており、各細胞系統に分化するに従って発現が低下していく。
　ここで、本発明のhCDCP1抗体のCD34陽性細胞に対する「結合性」とは、当該抗hCDCP1抗体がCD34陽性細胞のいずれかの部位と結合する能力（結合能）のことである。第１の実施形態において、抗hCDCP1抗体とヒトCD34陽性細胞との結合性の評価は、非特異的ヒトIgGのCD34陽性細胞に対する結合能と比較して、相対的に評価する。ここで「非特異的ヒトIgG」とは、ヒトCDCP1タンパク質に対する特異的反応性を有さないヒト由来のIgGのことであり、具体的にはヒトCDCP1に対して特異的反応性を有しないことが知られているモノクローナル抗体、あるいはより好ましくは、CDCP1に対して特異的反応性を有しない複数のモノクローナル抗体の混合物、あるいはより好ましくは、ヒト生体血清よりアフィニティクロマトグラフィーなどの手法により精製抽出したIgG混合物を指す。具体的な評価方法としては、抗hCDCP1抗体と非特異的ヒトIgGが同一の抗体濃度（以下「比較抗体濃度」とする）の条件下（すなわち、抗hCDCP1抗体の濃度と非特異的ヒトIgGの濃度が同一である条件下）において、ヒトCD34陽性細胞に対して抗hCDCP1抗体が非特異的ヒトIgGと同程度の結合能を示したときには抗hCDCP1抗体のヒトCD34陽性細胞に対する結合性は低いと評価する。例えば、ヒトCD34陽性細胞に対して抗hCDCP1抗体が非特異的ヒトIgGと比較して、統計的に有意に高い結合能を示さない場合は、結合性は低いと評価してもよい。また、抗hCDCP1抗体が非特異的ヒトIgGと比較して高い結合能を示したときには抗hCDCP1抗体のヒトCD34陽性細胞に対する結合性は高いと評価するものとする。例えば、ヒトCD34陽性細胞に対して抗hCDCP1抗体が非特異的ヒトIgGと比較して、統計的に有意に高い結合能を示した場合は、結合性は高いと評価してもよい。
　また、他の視点としては、ある指標となる抗体のCD34陽性細胞への結合性よりも低いかまたは同程度の結合性を有する抗体が本願発明の範囲である。例えば、既知抗体であるCUB４よりもCD34陽性細胞に対する結合性が低い抗体（クローン名：h12A041VH1A/VL）と同程度又はそれより低い結合性を有する抗体が挙げられる。
ここで、「比較抗体濃度」は、特に限定はしないが、ある特定の濃度点を意味し、例えば、10 ng/mL以上のいずれかの濃度、100 ng/mL以上のいずれかの濃度、1μg/mL以上のいずれかの濃度、より好ましくは10 μg/mL以上のいずれかの濃度である。
　また、ここで、10 ng/mlの濃度点は、当該試験系においてCUB４が十分に反応する濃度、即ち、CUB4がCD34陽性細胞と十分に結合する濃度である。そのため、この濃度点において十分に結合性の比較評価が可能である。
　また、抗hCDCP1抗体または非特異的ヒトIgGとCD34陽性細胞との結合性の評価は、特に限定はしないが、例えば、フローサイトメトリー分析、ELISA法、RIA法、表面プラズモン共鳴法などで実施することができる。
　本発明の抗hCDCP1抗体は、例えば、次にようにして調製することができる。ヒトCDCP1の細胞外ドメインの全体もしくはその一部、または細胞外ドメインの全体もしくはその一部が表面上に発現している細胞などを抗原として作製した抗体の中から、がん細胞上に発現するヒトCDCP1に反応する抗体をスクリーニングし、さらに、スクリーニングされた抗体群の中から、健常人骨髄細胞のCD34陽性細胞分画に対する反応性が低い抗体を選択することで、所望の抗体を調製することができる。
　本明細書における「抗体」は、その調製方法およびその構造は特に限定されるものではなく、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはナノ抗体など、所望の抗原と所望の特性で結合する「抗体」の全てが含まれる。
　本発明の抗hCDCP1抗体がポリクローナル抗体の場合、例えば、免疫動物（限定はしないが、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、モルモット、マウス、ラットまたはブタなど）に対して、抗原およびアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、抗原および／またはアジュバントを免疫動物の皮下または腹腔内へ複数回インジェクトする。アジュバントとして、限定はしないが、例えば、完全フロイントおよびモノホスホリル脂質A合成－トレハロースジコリノミコレート（MPL-TMD）が含まれる。抗原の免疫後、免疫動物由来の血清から、定法により（例えば、ProteinAを保持したセファロースなどを用いる方法など）抗hCDCP1抗体を精製することができる。
　また、本発明の抗hCDCP1抗体がモノクローナル抗体の場合、例えば、以下のようにして作製することができる。なお、本明細書において「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体の集団（抗体を構成する重鎖、軽鎖のアミノ酸配列が同一である抗体集団）から得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法（例えば、ハイブリドーマ法など）により作製されることを意味するものではない。
　モノクローナル抗体の作製方法としては、例えば、ハイブリドーマ法（KohlerおよびMilstein, Nature 256 495 1975）、または、組換え法（米国特許第4,816,567号）などを挙げることができる。あるいは、本発明の抗hCDCP1抗体は、ファージ抗体ライブラリ（例えば、Clacksonら, Nature 352 624-628 1991；Marksら, J.Mol.Biol. 222 581-597 1991など）や細胞ライブラリ（例えば、特許4214234号；Seoら, Nature Biotech., 23 731-735 2005など）から単離してもよい。より具体的に説明すると、ハイブリドーマ法を用いて調製する場合、その調製方法には、例えば、以下に示す４つの工程が含まれる：（i）抗原を免疫動物に免疫する、（ii）モノクローナル抗体分泌性（または潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（iii）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（iv）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。免疫動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギなどが選択可能である。免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤や電気融合法を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、例えば、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球および不死化細胞株の成長または生存を阻害する1または複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンがHGPRT欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（HAT培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、選択したハイブリドーマが生育する培地から、常法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
　このようにして調製したハイブリドーマをインビトロ培養し、あるいは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの腹水中でインビボ培養し、目的の抗体を培養上清、あるいは、腹水から調製することができる。
　ナノ抗体とは、抗体重鎖の可変領域（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibody；VHH）からなるポリペプチドのことである。通常ヒトなどの抗体は重鎖と軽鎖から構成されているが、ラマ、アルパカおよびラクダなどのラクダ科の動物では、重鎖のみからなる1本鎖抗体（重鎖抗体）を産生する。重鎖抗体は、通常の重鎖および軽鎖からなる抗体と同様に、標的抗原を認識し、抗原に結合することができる。重鎖抗体の可変領域は、抗原への結合親和性を有する最小単位であり、この可変領域断片は「ナノ抗体」と呼ばれている。ナノ抗体は、高耐熱性、消化耐性、常温安定性があり、遺伝子工学的手法により容易に大量に調製することが可能である。
　ナノ抗体は、例えば、以下のようにして作製することができる。ラクダ科の動物に抗原を免疫し、採取した血清から目的の抗体の有無を検出し、所望の抗体価が検出された免疫動物の末梢血リンパ球由来のRNAからcDNAを作製する。得られたcDNAからVHHをコードするDNA断片を増幅して、これを、ファージミドに挿入して、VHHファージミドライブラリを調製する。作製したVHHファージミドライブラリから数回のスクリーニングを経て、所望のナノ抗体を作製することができる。
  本発明の抗hCDCP1抗体は、遺伝子組換え抗体であってもよい。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、ヒト抗体およびヒト抗体とのキメラ抗体が挙げられる。キメラ抗体とは、例えば、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体（例えば、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に結合させた抗体）などのことで（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, （1984） など）、遺伝子組換え技術によって容易に構築することができる。
　 ヒト化抗体は、フレームワーク領域（FR）にヒト由来の配列を持ち、相補性決定領域（CDR）が他の動物種（例えば、マウスなど）由来の配列からなる抗体である。ヒト化抗体は、まず、他の動物種、ここではマウスで説明するが、マウス由来の抗体の可変領域からそのCDRをヒト抗体可変領域に移植し、重鎖および軽鎖可変領域を再構成した後、これらヒト化された再構成ヒト抗体可変領域をヒト抗体定常領域に連結することで作製することができる。このようなヒト化抗体の作製法は、当分野において周知である（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 （1989）など）。
　本発明の抗体の抗原結合断片とは、本発明の抗体の一部分の領域であって、ヒトCDCP1に結合する抗体断片のことであり、断片としては、例えば、Fab、Fab’、F(ab’）2、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびナノ抗体等）、scFv（single chain Fv）、diabody（scFv二量体）、dsFv（disulfide-stabilized Fv）、ならびに、本発明の抗体のCDRを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
　Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fabの作製は、抗体分子をパパインで処理して断片を取得する他、例えば、FabをコードするDNAを挿入した適当な発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞（例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入後、細胞内でFabを発現させることで実施することができる。
　F（ab’）2は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、抗原結合活性を有する抗体断片である。F（ab’）2は、抗体分子をペプシンで処理して断片を取得する他、Fabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて作製することも可能で、さらに、Fabと同様に遺伝子工学的手法によっても作製することができる。
　Fab’は、上記F（ab’）2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fab’も、Fab等と同様に遺伝子工学的な手法により作製することができる。
　scFvは、１本の重鎖可変領域（VH）と１本の軽鎖可変領域（VL）とを適当なペプチドリンカーを用いて連結した、VH-リンカー-VLないしはVL-リンカー-VHポリペプチドであって、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、遺伝子工学的手法により作製することができる。
　diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、2価の抗原結合活性を有する抗体断片である。2価の抗原結合活性は、同一抗原結合活性であっても、または、一方が異なる抗原結合活性であってもよい。diabodyは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をペプチドリンカーで結合したscFvをコードするcDNAを構築して、遺伝子工学的手法により作製することができる。
　dsFvは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して遺伝子工学的手法により作製することができる。
　CDRを含むペプチドは、重鎖または軽鎖のCDR（CDR1～3）の少なくとも１領域以上を含むように構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体の重鎖または軽鎖のCDRをコードするDNAを構築し、発現ベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）およびtBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
  ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般にV領域の抗原結合部位である超可変領域（Hypervariable region）、V領域のその他の部分および定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体は、公知の技術により当業者であれば容易に作製することができる。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のH鎖およびL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（例えば、Tomizukaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, （2000）97, 722-727など）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（例えば、Siriwardenaら, Opthalmology, （2002）109 （3）, 427-431 等を参照）により取得することができる。
　本発明の抗体の抗原結合断片を用いて、多重特異性抗体を構成することができる。多重特異性とは２つ以上の抗原に対して結合特異性を有することを意味し、例えば、２つ以上の抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体あるいは抗原結合断片を含むタンパク質の形態が挙げられる。これは既知の技術によって当業者によって実施される。多重特異性を構築する方法としては、異なる２種類の抗体重鎖分子がヘテロ二量体を形成するようにタンパク工学的操作を施した非対称IgGの構築技術、抗体から得た抗原結合断片どうしを連結するあるいは別の抗体分子と連結する技術、などに分類される手法が複数開発されている。具体的な構築法の例はたとえば以下の文献を参考にすることができる。Kontermann, R. E., & Brinkmann, U. (2015). Bispecific antibodies. Drug Discovery Today, 20(7), 838-847. 
　本発明の抗hCDCP1抗体およびその抗原結合断片として、例えば、CDR（complementarity determining region）1～3のアミノ酸配列が下記の（Ａ）～（Ｓ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体およびその抗原結合断片を挙げることができる。
（Ａ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｂ）配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｃ）配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｄ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｅ）配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｆ）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｇ）配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｈ）配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｉ）配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号９０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｊ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号９９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号１０２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
配列番号１０３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｋ）配列番号１０５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号１０６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号１０７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号１０９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号１１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号１１１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｌ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｍ）前記（Ｌ）を満たす抗体において、Kabat定義における軽鎖２８番目および２９番目のアミノ酸、および重鎖１０２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された軽鎖可変領域を有する。ここで他のアミノ酸として、限定はしないが、例えば、軽鎖２８番目についてはセリン、トレオニン、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、チロシンを挙げることができるが、好ましくはセリンである。軽鎖２９番目についてはアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジンを挙げることができるが、好ましくはアラニンである。重鎖１０２番目についてはアラニン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、リジン、ヒスチジン、グルタミンを挙げることができるが、好ましくはセリンである。
（Ｎ）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｏ）前記（Ｎ）を満たす抗体において、Kabat定義における重鎖５４番目および５５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された重鎖可変領域を有する。ここで他のアミノ酸として、限定はしないが、例えば、重鎖５４番目についてはセリン、トレオニン、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、チロシンを挙げることができるが、好ましくは、セリン、フェニルアラニン、アルギニン、トレオニン、トリプトファンである。重鎖５５番目についてはアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジンを挙げることができるが、好ましくはアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、メチオニンである。
（Ｐ）配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｑ）前記（Ｐ）を満たす抗体において、Kabat定義における重鎖５４番目および５５番目のアミノ酸、軽鎖３３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された重鎖および軽鎖可変領域を有する。ここで他のアミノ酸として、限定はしないが、例えば、重鎖５４番目についてはセリン、トレオニン、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、チロシンを挙げることができるが、好ましくはセリンである。重鎖５５番目についてはアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジンを挙げることができるが、好ましくはアラニンである。軽鎖３３番目のアミノ酸としては、セリン、トレオニン、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、アルギニン、トリプトファン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、チロシン、リジン、ヒスチジンを挙げることができるが、好ましくはロイシンである。
　（Ｒ）配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号９０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
（Ｓ）前記（Ｒ）を満たす抗体において、Kabat定義における重鎖５２ａ番目および５３番目、軽鎖３３番目が他のアミノ酸に置換された重鎖および軽鎖可変領域を有する。ここで他のアミノ酸として、限定はしないが、例えば、重鎖５２ａ番目についてはセリン、トレオニン、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、メチオニン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、チロシンを挙げることができるが、好ましくは、セリンである。重鎖５３番目についてはアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジンを挙げることができるが、好ましくは、アラニンである。軽鎖３３番目のアミノ酸としては、セリン、トレオニン、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、アルギニン、トリプトファン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、チロシン、リジン、ヒスチジンを挙げることができるが、好ましくは、ロイシンである。
　さらに、本発明の抗hCDCP1抗体およびその抗原結合断片として、例えば、重鎖可変領域のCDR1～3のアミノ酸配列が下記（Ｔ）～（Ｕ）のいずれかを満たし、軽鎖可変領域のCDR1～3のアミノ酸配列が下記（ｔ）～（ｖ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片を挙げることができる。
（Ｔ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号１１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有する、
（Ｕ）配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
配列番号１１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有する、
（ｔ）配列番号１１７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
（ｕ）配列番号１８６であらわされるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号54で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および配列番号55で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3。
（ｖ）配列番号１８８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
　さらにまた、本発明の抗hCDCP1抗体およびその抗原結合断片として、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号１０４、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８２または配列番号１８４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のいずれか、および配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号１００、配列番号１０８、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１４８、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１７１、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８５または配列番号１８７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のいずれかを有する抗体、ならびに、これらの抗体を構成する重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の各アミノ酸配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、約81％以上、約82％以上、約83％以上、約84％以上、約85％以上、約86％以上、約87％以上、約88％以上、約89％以上、より好ましくは約90％以上、約91％以上、約92％以上、約93％以上、約94％以上、約95％以上、約96％以上、約97％以上、約98％以上、最も好ましくは約99％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる抗体であって、ヒトCDCP1に結合し、ヒトCD34陽性細胞との結合性が低いことを特徴とする抗体、ならびにそれらの抗原結合断片を挙げることができる。
　本発明の第２の実施形態は、ヒトCDCP1に結合し、ヒトCD34陽性細胞との結合性が低いことを特徴とする抗体であって、第１の実施形態にかかる抗体（すなわち、本発明の抗hCDCP1抗体）とヒトCDCP1との結合を競合阻害する抗体（以下「本発明の競合抗体」とも記載する）またはその抗原結合断片である。本発明の競合抗体は、当業者において周知である競合実験などにより、調製および取得することができる。具体的には、第１の抗hCDCP1抗体（実施形態にかかる抗体）とヒトCDCP1との結合が、第２の抗hCDCP1抗体によって競合阻害を受けるとき、第１の抗hCDCP1抗体と第２の抗hCDCP1抗体は実質的に同一、または極近傍の抗原部位に結合していると判断される。そして、当該第２の抗hCDCP1抗体がCD34陽性細胞との結合性が低いときには、当該第２の抗hCDCP1抗体は本発明の競合抗体である。このような競合実験の方法として、例えば、Fab断片等を用いる方法が当該技術分野おいて、通常行われている。例えば、WO95/11317、 WO94/07922、WO2003/064473、WO2008/118356およびWO2004/046733などを参照のこと。
　本発明の第３の実施形態は、抗腫瘍活性を有する物質が結合している第１の実施形態にかかる抗体または第２の実施形態にかかる抗体またはその抗原結合断片である。
　抗体に対し薬物などの抗腫瘍活性を有する物質を結合させ、がんの標的治療を行うことができる（このような複合体を以下「本発明の抗体薬物等複合体」と記載する）。この場合の抗腫瘍活性を有する物質とは、抗がん剤などの細胞傷害性の薬物、放射性同位元素、免疫系を操作して間接的に抗腫瘍活性を誘導する物質などが含まれるが、これに限るものではない。
　第３の実施形態において抗腫瘍活性を示す薬物を用いることができ、このような複合体を抗体薬物複合体と呼ぶ。使用される抗腫瘍活性を示す薬物として、例えば、Auristatin類（MMAE, MMAFなど）、Maytansine類（DM1、DM4など）、Tubulysin類、cryptophycin類、rhizoxinなどのチューブリン阻害剤および微小管重合阻害剤、Calicheamicin類、Doxorubicin、anthracycline類などの抗生物質類、Duocarmycin類、PBD （Benzodiazepine）類、IGNs （indolinobenzodiazepine）などのDNA合成阻害剤、Canptothecinアナログ（SN-38,　DXdなど）のトポイソメラーゼI阻害剤、Amanitin類などのRNAポリメレースII阻害剤、spliceostatin類、thailanstatin類などのRNAスプライソソーム阻害剤などが知られているが、これらに限るものではない。
　また抗腫瘍活性を示す薬物としては、光エネルギーによって励起され毒性を発現するような化合物を用いることもできる。このような抗体薬物複合体は、体内に投与して腫瘍細胞に結合させたのちに、体外から近赤外線などの光エネルギーを与えることによって腫瘍細胞を殺傷する、光免疫療法（photoimmunotherapy：PIT）と呼ばれる治療法に使用することができる。本発明の抗hCDCP1抗体も、光免疫療法に用いる抗体として使用してもよい。用いられる化合物としては、IR700などが知られているが、これに限るものではない。
　また、抗体に放射性同位元素を結合させ、その同位元素の発する放射線を用いてがん細胞を殺傷する放射線免疫療法（radioimmunotherapy：RIT）が知られており、本発明の抗hCDCP1抗体も放射線免疫療法に用いる抗体として使用することができる。本発明の第３の実施形態で用いられる放射性同位元素にはたとえば、131I、90Yなどのβ線核種、213Bi、211At、225Ac、223Ra、212Pbなどのα線核種が知られているが、これらに限るものではない。
　また、本発明の第３の実施形態において、腫瘍そのもの、あるいは免疫系など、腫瘍以外の組織の生理作用を操作することにより直接的・間接的に抗腫瘍活性を発揮する物質を使用することができる。免疫系を例にとると、操作する免疫系の要素としてはT細胞、B細胞、NK細胞などのリンパ球系細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球などのミエロイド系細胞、あるいはこれらの免疫系細胞に影響を与える物質を分泌・提示する免疫系細胞以外の細胞などを考えることができる。これらの細胞を操作する物質としては、がんワクチンペプチド、サイトカイン（インターロイキン類、インターフェロン類、コロニー刺激因子(CSF)類など）、ホルモン類、成長因子類（TGFファミリー、FGFファミリー、IGFファミリー、トロンボポエチン、エリスロポエチンなど）などを挙げることができるが、これらに限るものではない。
　抗体に抗腫瘍性物質を結合させる化学修飾の方法は、これまでに数多く知られており、例えば、以下のような方法が知られている。リジン残基側鎖への共有結合、システイン残基側鎖への共有結合などの化学的修飾方法、抗体ペプチド鎖中に非天然アミノ酸を導入し、その側鎖に対して部位特異的に化学的修飾を施す方法、抗体中の特定のアミノ酸配列や、修飾糖鎖に対して特異的な酵素反応を用いて修飾を施す方法、およびペプチド連結を行う酵素を用いた修飾方法などである。また、薬物等をタンパク質に結合させるために薬物等に化学的な改変を施し、タンパク質結合のためのリンカーとして用いることが一般的である。このような化学的リンカーには多くの種類が知られており、その性質によって、抗体薬物等複合体の体内における薬理作用が大きく変わる。たとえば、ヒドラゾンリンカー、バリン―シトルリンリンカー、SS結合リンカー、ピロリン酸リンカーなどは、体内の酵素などによって切断され、薬物が抗体から分離され、高い抗腫瘍効果を示す抗体薬物複合体を調製することが可能である。一方、このような化学的リンカーとして、体内での切断が起こりえないような化学構造を用いることも一般的に行われている。以上の方法に関する概要は例えば以下の文献に記載されている。TsuchikamaおよびAn, （2018）. Antibody-drug conjugates: recent advances in conjugation and linker chemistries. Protein and Cell, 9（1）, 33-46。
　薬物－抗体結合比率（Drug Antibody Ratio：DAR）は、抗体薬物複合体において一つの抗体分子に対していくつの薬物分子が結合しているかを示した数値である。DARは薬物を抗体に化学結合させる方法によって変化し、一般的には１から８であるが、化学結合の様式によっては９以上のDARを持った抗体薬物複合体を作製することも可能である。
　本発明の第４の実施形態は、第３の実施形態にかかる本発明の抗体薬物等複合体またはその抗原結合断片を含む、がんの予防または治療のための医薬組成物（以下「本発明の医薬組成物」とも記載する）である。
　本発明の医薬組成物は、有効成分である本発明の抗体薬物等複合体またはその抗原結合断片の他、1または2以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与してもよい。また、当該実施形態にかかる医薬組成物中には、公知の他の薬剤を併せて配合してもよい。
　本発明の抗体薬物等複合体またはその抗原結合断片を用いて、ヒトに投与可能な治療用抗体を製造する場合、その製造過程において抗体の精製後に化学的な修飾がしばしば起こることが知られている。このような化学的修飾への対応は、精製抗体の品質確保および安全性の確保において重要であることとして、当該技術分野において認識されている。具体的には、抗体のCDR領域を含む配列の中に、N型糖鎖修飾、タンパク切断、脱アミド化、ラセミ化、酸化などの修飾を受やすいアミノ酸配列モチーフがあった場合に精製抗体の品質低下を招くことが予想される。修飾をうけやすいアミノ酸配列モチーフとしては、例えば、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基を含むモチーフが知られており（例えば、Sydowら, （2014）. Structure-based prediction of asparagine and aspartate degradation sites in antibody variable regions. PLoS ONE, 9（6）など）、抗体の活性を保ったままそれらのアミノ酸モチーフを改変することが可能であることを示すことは、抗体の有用性をより高める。
　本発明の医薬組成物は、経口または非経口用の剤型であってもよく、特に限定はしないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤または注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の抗体またはその機能的断片を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
　本発明の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、あるいは、医薬組成物の製造方法は、その形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して、例えば、0.1重量％～99.9重量％、1重量％～95.0重量％、または1重量％～90.0重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコールまたは水等が挙げられる。
　経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウムまたは無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤および顆粒剤をそのまま、あるいは、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸－メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいは、エチルセルロース、カルナウバロウまたは硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいは、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油またはオリーブ油などに溶解した後ゼラチンで被覆し軟カプセルとすることができる。
　注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて、塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウムまたはリン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらに、マンニトール、デキストリン、シクロデキストリンまたはゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート80またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化させ、注射剤用乳剤とすることもできる。
　直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリドまたはポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し、型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコールまたは大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜等で被覆してもよい。
　本発明の医薬組成物の投与量および投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師または薬剤師の判断により適宜選択することが可能である。
　一般的には、経口投与における成人1日あたりの投与量は0.01～1,000 mg（有効成分重量）程度であり、1日1回または数回に分けて、または数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して1日量0.001～100ｍｇ（有効成分重量）を連続投与または間欠投与することが望ましい。
　本発明の医薬組成物の別の形態として、本発明の抗体あるいはその抗原結合断片を細胞表面上に発現するT細胞などの細胞傷害性細胞を挙げることができる。キメラ抗原受容体発現T細胞(CAR-T)療法は、抗体の抗原結合部位とT細胞受容体の一部の融合遺伝子（キメラ抗原受容体遺伝子）をT細胞に発現させたのちにがん患者の体内に移入し、移入したT細胞ががん細胞を特異的に攻撃して抗腫瘍活性をもたらすことを用いた治療法である。本発明の抗体あるいはその抗原結合断片をコードする遺伝子を、上記キメラ抗原受容体遺伝子の構成要素として用いて、発現T細胞を構築することによって、ヒトCDCP1分子を発現する腫瘍を特異的に攻撃するCAR-T療法を構築することができる。
　本発明の医薬組成物は、細胞表面にhCDCP1を発現しているがん細胞であれば攻撃し、殺傷することが可能である。従って、本発明の医薬組成物が治療対象とするがんは、いかなるものであってもよく、特に限定されない。あえて、典型的ながんを例示するならば、例えば、肝細胞がん、胆管細胞がん、腎細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、移行細胞がん、腺がん、悪性ガストリノーマ、メラノーマ、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性奇形腫、血管肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、リンパ管肉腫、悪性髄膜腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病および脳腫瘍等の悪性腫瘍、上皮細胞由来新生物（上皮癌腫）、基底細胞癌腫、腺癌腫、口唇がん、口腔がん、食道がん、小腸がんよび胃がんのような消化管がん、結腸がん、直腸がん、膀胱がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚がん、肺がん、乳がん、皮膚がん、前立腺がんなどの悪性新生物の他、全身の上皮系細胞、間葉系細胞または血液細胞を冒す他の既知のがんなどを挙げることができる。
　本発明の第５の実施形態は、本発明の医薬組成物を患者に投与することを含む、がんの予防および／または治療方法（以下「本発明の予防または治療方法」とも記載する）である。
　　ここで「治療」とは、すでにがんに罹患した患者において、その病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、これによってがんの進行および悪化を阻止または緩和することを目的とする処置のことである。
　また、「予防」とは、治療を要するがんを発症するおそれがある者について、その発症を予め阻止することを意味し、これによってがんの発症を予め阻止することを目的とする処置のことである。さらに、がん治療後の再発を阻止するための処置も「予防」に含まれる。
　また、治療および予防の対象はヒトに限定されず、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコのほか、ウシ、ウマ、ヒツジなど家畜、サル、チンパンジーやゴリラなどの霊長類等であってもよく、特に好ましくは、ヒトである。
　また本発明の別の実施形態においては、本発明の抗体を用いたがんの診断方法があげられる。本発明の抗体はヒトCDCP1分子に特異的に結合することができ、本発明の抗体を蛍光物質、放射性同位元素、酵素などで標識することによって、ヒトCDCP1分子を発現する腫瘍およびがん細胞、血液中に存在するヒトCDCP1分子あるいはその断片などを検出することができる。検出の方法としては、例えば免疫染色法、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロッティング法、ELISA法、RIA法、CLIA法、PET法などがあげられる。体内のがん細胞を直接検出する、あるいは患者検体中のヒトCDCP1の発現量を観察することができ、それにより原発性腫瘍の有無、転移性腫瘍の有無などを評価することができる。さらには、がん症例におけるヒトCDCP1の発現量を本発明の抗体を用いた方法により事前に診断することによって、本発明の抗体を使用した医薬組成物の投与による治療効果を予測することが可能である。
　診断の対象とするがんはいかなるものであってもよく、特に限定されない。あえて、典型的ながんを例示するならば、例えば、肝細胞がん、胆管細胞がん、腎細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、移行細胞がん、腺がん、悪性ガストリノーマ、メラノーマ、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性奇形腫、血管肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、リンパ管肉腫、悪性髄膜腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病および脳腫瘍等の悪性腫瘍、上皮細胞由来新生物（上皮癌腫）、基底細胞癌腫、腺癌腫、口唇がん、口腔がん、食道がん、小腸がんよび胃がんのような消化管がん、結腸がん、直腸がん、膀胱がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚がん、肺がん、乳がん、皮膚がん、前立腺がんなどの悪性新生物の他、全身の上皮、間葉または血液細胞を冒す他の既知のがんなどを挙げることができる。
　本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみ
ならず複数のものを含むものとする。
　以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
１．組み換えhCDCP1細胞外ドメインタンパクの発現と精製
　hCDCP1タンパク質のアミノ酸配列はUniProt登録番号Q9H5V8のアイソフォーム1として登録されている（配列番号１）。この配列の30番目から666番目のアミノ酸に対し、N末側にCampath分泌シグナルを連結し、C末側に6×HisタグおよびFLAGタグを挿入した配列を設計した（配列番号２）。このアミノ酸配列を、哺乳類のコドン表を基に塩基配列に変換し、5’末端にKozak翻訳開始配列、3’側に翻訳終止コドンを挿入したDNA配列（配列番号３）を遺伝子合成により合成した（GENEWIZ社）。合成したDNAはpEF1/V5-His A（サーモサイエンティフィック社）の制限酵素KpnI認識配列とPmeI認識配列の間に挿入した。以上により作製された発現ベクターを以下に用いた。
　発現ベクタープラスミドを、ポリエチレンイミン法を用いてFreeStyle293細胞（サーモサイエンティフィック社）に一過性トランスフェクションした後、37℃、5% CO2インキュベータで5日間培養した。培養上清を回収し0.22μmフィルターで濾過したのち、HisTrap excel カラム（GEヘルスケア社）に結合させた。次に、20mMリン酸バッファー/300mM NaCl/pH 7.5バッファー中で20mMから500mMイミダゾールの濃度勾配によって溶出した。溶出画分は1mLごとに分取し、SDS-PAGE法で約100kDaのバンドを認めたフラクションを回収した。
　この溶出画分に9倍量の20mM Tris-HCl pH8.0を添加し、HiTrap Q（GEヘルスケア社）カラムに結合させた。溶出は20mM Tris-HCl pH8.0バッファー中で0Mから1MのNaCl濃度勾配によって行った。溶出画分は2.5mLごとに分取し、SDS-PAGE法でバンドが確認できたフラクションを回収した。
　さらに、このイオン交換カラムの溶出画分を約1.7mLまで濃縮し、D-PBS（ナカライテスク）を移動相として、Superdex 200pg 16/60 （GEヘルスケア）を用いて分画した。このゲル浸透クロマトグラフィーを用いた精製実験における溶出曲線を図１に示す。溶出画分は1.0mLごとに分取し、SDS-PAGE法でバンドが確認できたフラクションを回収した。回収されたタンパク質を、精製組み換えhCDCP1細胞外ドメインタンパク（以下hCDCP1-ECDタンパクと呼ぶ）として使用した。
２．全長ECDタンパクのプラスミン処理および精製
　hCDCP1-ECDタンパクに対し、25分の1量のヒト血漿由来プラスミンタンパク（シグマアルドリッチ社）を添加し、4℃で18時間反応させた。SDS-PAGE法により、このプラスミン処理によってhCDCP1-ECDタンパクがほぼ完全に切断されたことを確認した。このタンパクサンプルをcOmplete His-Tag purification resin （シグマアルドリッチ社）および抗FLAG M2抗体 アフィニティーゲル（シグマアルドリッチ社）により精製を行い、そのサンプルを還元条件および非還元条件でSDS-PAGEにより観察した結果が図２である。溶出されたタンパクには、分子量の異なる二つの分子種が含まれていると考えられた。これら二つの分子種はhCDCP1-ECDが切断された結果生じる二つのペプチド断片であると考えられ、これらの二つの断片が切断後も何らかの様式により結合状態を保ったまま精製されたと考えられた。
３．全長hCDCP1安定発現Ba/F3細胞の構築
　UniProt番号Q9H5V8アイソフォーム1の30番目から836番目のアミノ酸に対し、N末側にCampath分泌シグナルおよびc-Mycタグを連結した配列を設計した（配列番号４）。このアミノ酸配列を、哺乳類のコドン表を基に塩基配列に変換し、この配列を含み5’末端にKozak配列および3’末端の翻訳終止コドンを挿入したDNAを遺伝子合成により合成した（GENEWIZ社；配列番号５）。合成したDNAはpEF1/V5-His A（サーモサイエンティフィック社）のKpnI/PmeI認識配列の間に挿入し、発現ベクターGS01とした。
　プラスミドGS01を制限酵素PmeIによって線状化し、2×106個のマウスB細胞由来細胞株Ba/F3細胞に対して2μgをNucleofector 2b（Lonza社）により導入した。遺伝子導入後、細胞を96 wellプレートに播種して最終濃度1μg/mLのG418（ナカライテスク社）を添加した。6日後、G418耐性的な増殖のみられた24個のコロニーをウェルから回収し、抗hCDCP1抗体（R&D systems社；カタログ番号MAB26662）を用いたフローサイトメトリーによってhCDCP1の発現を確認し、確認できたコロニー由来の細胞の限界希釈を行った。増殖した細胞を回収し、抗hCDCP1抗体（R&D systems社）を用いたフローサイトメトリーによりhCDCP1の発現を確認し、最終的に単クローン由来の細胞株を選択した。この細胞を同じ抗hCDCP1抗体、抗Mycタグ抗体（和光純薬社）およびPE標識抗マウスIgG二次抗体で染色した結果を図３に示す。いずれのクローンも、抗hCDCP1抗体、抗Mycタグ抗体に陽性であり、遺伝子導入したN末端にMycタグが付加されたhCDCP1遺伝子の産物が細胞表面上に発現されていることを確認した。この細胞をBa/F3-hCDCP1細胞株として、以下の実験に用いた。
４．Ba/F3-hCDCP1のトリプシン処理によるΔN型分子の生成
　前項で作製したhCDCP1発現Ba/F3細胞株（以下Ba/F3-hCDCP1）、および陰性対象としてBa/F3元株を用いた。細胞を、血清を含まない冷RPMI1640培地（シグマアルドリッチ社）で2回洗浄し、1.25×107細胞/mLの濃度でRPMI1640培地に懸濁した。細胞懸濁液800μLに対し200μLの0.25% トリプシン/EDTA （ナカライテスク社）、あるいは陰性対照として1mM EDTAを含むHank’s Balanced Salt Solution（以下HBSS）を添加し、37℃で0分、5分、15分、30分処理を行った。反応後9mLの10%の非働化済牛胎児血清（以下FBS）含むRPMI1640培地を添加し反応を停止させた。この細胞を、1% BSAを含むPBS（以下フローサイトメトリーバッファー、FCMバッファーと呼ぶ）で洗浄した後、これらの細胞を抗Mycタグ抗体（和光純薬社）および抗hCDCP1抗体（R&D systems社）を用いて染色した。細胞を洗浄後、PE標識抗マウスIgG抗体（Becton Dickinson社）を用いて染色した。細胞を洗浄後FACSCantoII （Becton Dickinson社）により観察した。
　フローサイトメトリーにより測定されたPEの蛍光強度から、細胞集団の平均蛍光強度の変化をグラフに表したものが図４Ａである。抗Mycタグ抗体の染色強度がトリプシン/EDTAを添加したときのみ経時的に減少しており、このことからBa/F3-hCDCP1上のhCDCP1分子のN末端がトリプシンにより消化されていることが示された。その一方で抗hCDCP1抗体による染色強度は変化せず、トリプシン処理によっても本実験で用いた抗hCDCP1抗体に認識されるhCDCP1分子の数は減少していないことが示された。
　次に、トリプシン処理によって産生した切断型hCDCP1分子の分子量をウェスタンブロッティングにより観察した。Ba/F3-hCDCP1細胞4×106個に対し、RPMI1640培地で5倍希釈した0.25%トリプシン/EDTA、あるいは50nM、500nMプラスミン（シグマアルドリッチ社）を含むPBSにより37℃で5分、10分、ないしは30分処理した。これらの細胞を回収しHBSSで洗浄したのち、1% TritonXとプロテアーゼインヒビターカクテル（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を含むTris緩衝生理食塩水で溶解し、Micro BCAキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によりタンパク定量を行って、20μgをSDS-PAGEにより泳動した。また同時に、切断型hCDCP1を発現していることが知られているヒト前立腺癌由来細胞株PC3（ATCC）も、接着培養した状態で細胞溶解、ないしはBa/F3と同様に希釈トリプシン/EDTA溶液で処理したのちに細胞溶解し、合わせてSDS-PAGEを行った。泳動したゲルからタンパク質をPVDF膜に転写して、検出用一次抗体として抗hCDCP1細胞内ドメイン抗体（Abcam社）、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ヤギIgG抗体 （プロメガ社）、検出用試薬としてNBT/BCIP stock solution （ロシュ社）を用いてウェスタンブロッティングを行った。
　ウェスタンブロッティングの結果を図４Ｂに示す。トリプシン処理なしのBa/F3-hCDCP1細胞では130kDa付近にほぼ単一のバンドが認められるのに対し、トリプシン処理した細胞では70kDa付近に単一バンドが認められ、このバンドサイズはPC3細胞の溶解サンプルから検出されたバンドと同一の位置であると考えられるため、Ba/F3のトリプシン処理により生成した分子種はPC3の発現する切断型hCDCP1と同一であることが示唆された。500nMプラスミン処理によっても同じ移動度に切断タンパクのバンドが検出された。
　これにより、Ba/F3-CDCP1が発現しているhCDCP1はトリプシン、プラスミンの処理により切断されて、細胞上に切断型hCDCP1分子が残ることが示唆された。この手法を用いて、こののち切断型hCDCP1分子に反応する抗体のスクリーニングを行った。
５．hCDCP1ノックアウト細胞株を用いたハイブリドーマのスクリーニング
　前項までで作製したタンパク質および細胞を用いてハイブリドーマを作製し、hCDCP1特異的な反応を示す抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。
癌細胞の発現するhCDCP1に対して反応するクローンのスクリーニングを行うためのネガティブコントロールとして使用するため、hCDCP1分子をノックアウトしたPC3細胞を作製した。ヒト前立腺癌細胞株PC3はATCCから購入したものを使用した。PC3細胞1×106個に対し、CDCP1 CRISPR/Cas9 KO Plasmid（h）（SantaCruz社）をNucleofector 2b（Lonza）により遺伝子導入を行った。このプラスミドにはGFP遺伝子配列が含まれている。1日後、GFPの蛍光が陽性となった細胞を、FACSAriaII（Becton Dickinson社）を用いて、96ウェル培養プレートに単細胞ソーティングした。7～10日後に細胞の増殖がみられたクローンに対し、抗hCDCP1抗体（R&D systems社）を用いたフローサイトメトリーによる発現確認を行い、hCDCP1を発現していない細胞クローンを増幅して、これをhCDCP1-KO PC3細胞として以下の実験に用いた。
　hCDCP1に対するモノクローナル抗体の作製は、hCDCP1精製タンパクあるいは強制発現細胞を免疫したマウスから単離したリンパ節細胞を用いて行った。
　実験1においては、hCDCP1-ECDタンパクをマウス1匹あたり50μg、TiterMaxGold（TiterMax社）と混合して足底静脈投与を行った。7日後と10日後に、マウス1匹あたり10μgの抗原をTiterMaxGoldと混合して足底静脈投与を行うことで追加免疫を行った。
　実験2においては、免疫物質として、Ba/F3-hCDCP1細胞を用いた。この細胞を前述の方法によってトリプシン処理を行ったのち、マウス1匹あたり1×107個の細胞をTiterMaxGold（TiterMax社）と混合して足底静脈投与を行った。7日後と10日後に、マウス1匹あたり1×105個のトリプシン処理したBa/F3-hCDCP1細胞をPBSに懸濁したものを腹腔内に投与することによって、追加免疫を行った。
　実験3においては、hCDCP1-ECDタンパクを前項の方法に従ってプラスミンで切断処理したのちに、His-tag、FLAG-tagアフィニティ樹脂を用いて精製を行ったものを、マウス1匹あたり50μg、TiterMaxGoldと混合して足底静脈投与を行った。7日後と10日後に、マウス1匹あたり10μgの抗原をTiterMaxGoldと混合して足底静脈投与を行うことで追加免疫を行った。
　実験1、実験2、実験3それぞれについて、免疫終了後のマウスから膝窩リンパ節を採取して細胞懸濁液を調製したのち、血清を含まないRPMI1640（ATCC modified；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）中でSP2/0-Ag14ミエローマ細胞と混合し、ポリエチレングリコール（ロシュ社）によって細胞融合を行った。融合後の細胞はHybridoma enhancing medium（シグマアルドリッチ社）を含むClonaCellTM-HY Medium D （STEMCELL社）に懸濁してプラスチックシャーレに播種した。8~10日後に形成されたコロニーを培地（RPMI1640/10% FBS/HAT supplement（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）／Hybridoma enhancing medium（シグマアルドリッチ社））を分注した96ウェルプラスチックプレート中に単離し、拡大培養を行って、培養上清を結合性評価に用いた。
　PC3細胞およびhCDCP1-KO PC3細胞を用いた細胞ELISA法により、ハイブリドーマの産生する抗体のhCDCP1結合性スクリーニングを行った。384ウェルプレートに、PC3細胞およびhCDCP1-KO PC3細胞を5000細胞/wellで播種し、37℃で一晩培養した。培養培地を除去した後、ハイブリドーマの培養上清あるいは培地で希釈した抗体液を1ウェルあたり25μL添加し、4℃で1時間反応させた。培養上清を除去してPBSによる洗浄を行った後、二次抗体を培地で希釈して添加し4℃で1時間反応させた。さらにPBSで3回洗浄し、洗浄液を完全に除去したあと、基質液（ELISA POD substrate TMB Kit、ナカライテスク社）を反応させ、10分後1N硫酸で停止し、450nmの吸光度を測定した。
　実験1、実験2、実験3のそれぞれ免疫動物から作製されたハイブリドーマの培養上清を用いたcell ELISAの結果を図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄに示す。図の数値は、各クローンの測定値から、抗体を含まないハイブリドーマ培養培地を反応させた値を引いた数値を示した。この結果から、hCDCP1精製タンパク質あるいは強制発現細胞を用いた免疫マウスから、hCDCP1を発現する癌細胞であるPC3細胞に反応する抗体を産生するハイブリドーマが得られたことが示された。また図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃの結果からは、これらの図で示されたハイブリドーマの産生する抗体がhCDCP1-KO PC3細胞には反応しないことが示され、確かにこれらの抗体がPC3の発現するhCDCP1に特異的に反応していることが示された。
６．抗体配列解析
　前項で述べた、PC3細胞の発現するhCDCP1に特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマについて、その免疫グロブリン遺伝子可変領域の配列の解析を以下の通り実施した。
　ハイブリドーマ細胞を拡大培養し、SuperPrep II Cell Lysis & RT Kit（東洋紡社）を使用してRNA抽出および逆転写酵素によるcDNA合成を行った。合成したcDNAより、PCR法により抗体遺伝子を増幅した。重鎖、軽鎖ともに可変領域上流、および定常領域下流を認識するプライマーを使用し増幅した。使用したプライマー配列は以下の通りである。
重鎖5’増幅用：5’MsVHE（配列番号６）
重鎖3’増幅用：3’Cg1_outer（配列番号７）、3’Cg2c_outer（配列番号８）、3’Cg2b_outer（配列番号９）、3’Cg3_outer（配列番号１０）、3’mIgG2a_CH（配列番号１１）
 
κ軽鎖5’増幅用：5’L-Vk_3（配列番号１２）、5’L-Vk_4（配列番号１３）、5’L-Vk_5（配列番号１４）、5’L-Vk_6（配列番号１５）、5’L-Vk_689（配列番号１６）、5’L-Vk_14（配列番号１７）、5’L-Vk_19（配列番号１８）、5’L-Vk_20（配列番号１９）
κ軽鎖3’増幅用：3’mCk（配列番号２０）
 
λ軽鎖5’増幅用：5’mVλ1/2（配列番号２１）、5’mVλx（配列番号２２）
λ軽鎖3’増幅用：3’mCλ_outer（配列番号２３）
 
　得られたDNA断片をTOPO TA cloning kit（サーモサイエンティフィック社）によってpcDNA3.4ベクターにクローニングを行い、DNA配列解析を行った。
結果として得られた抗体配列について、Kabatらの方法 (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) に従ってCDR領域を決定した。解析されたクローンの抗体配列およびそのCDR領域配列は、以下の表１にまとめる通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
７．マウス・ヒトキメラ抗体の作製
　前項において得られた抗体配列を基に、マウス重鎖・軽鎖可変領域とヒトIgG1重鎖・κ軽鎖定常領域のキメラ抗体（以下マウス・ヒトキメラ抗体）を作製した。マウス・ヒトキメラ抗体は、前項で配列解析した抗体のうち、12A041、14A025、14A043、14A055、14A063、14A091の6つについて作製した。
　12A041、14A025、14A043、14A063の各々の抗体配列については、前項で解析したアミノ酸配列と同じものを作製すると同時に、CDR領域のアミノ酸改変を試みた。配列改変の導入箇所と改変した後のアミノ酸、および改変後抗体配列の名称との対応関係は図６Ａおよび図６Ｂに示すとおりであり、CDR領域中に存在するSS結合を形成しないと思われるシステイン、タンパク質の溶媒中での切断反応・酸化反応を受ける可能性の高い配列について実施した。
　また、mh12A041HCoriについては、Kabat番号32番のセリン残基をフェニルアラニン残基に変異させることにより、またmh12A041LCoriに対しては、Kabat番号27d番のヒスチジン残基をチロシン残基に変異させること、あるいは27a番のセリン残基と28番のアスパラギン残基をそれぞれアスパラギン残基とアスパラギン酸残基に同時に変異させることにより、抗原に対する親和性が向上すると考えられたため、これらの変異を含む配列（mh12A041HCoriA、mh12A041LCoriA、mh12A041LCoriB）を設計した。
CDRの配列改変を施した抗体配列、およびそのもととなっている配列を以下の表２に示す
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２中の配列については、抗体分子のアミノ酸配列をもとに塩基配列を設計し遺伝子合成により発現ベクターを合成した。
　また、14A055重鎖可変領域（配列番号８０）、14A055軽鎖可変領域（配列番号８４）、14A091重鎖可変領域（配列番号９６）、14A091軽鎖可変領域（配列番号１００）については、前項においてpcDNA3.4ベクターにサブクローニングされた配列からPCR法により可変領域DNAを増幅しサブクローニングすることにより発現ベクターを作製した。
　使用したベクターは、mh12A041抗体群とmh14A025抗体群以外の抗体群の重鎖可変領域配列についてはpFUSE-CHIg-hG1ベクター（Invivogen社）、mh12A041抗体群とmh14A025抗体群の重鎖可変領域配列についてはpFUSE-CHIOME-HCベクター、すべての抗体群の軽鎖可変領域配列についてはpFUSE2-CLIg-hkベクター（Invivogen社）にクローニングを行った。これらの３つベクターの持つ抗体定常領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９に示す。
　作製された発現ベクターをExpi293細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に発現させた。この際、mh12A041、mh14A025、mh14A043、mh14A063の各抗体群については、重鎖・軽鎖のベクターを以下のパターンで組み合わせて発現させた。
mh12A041：
HCori/LCori、HCori/LCv1、HCori/LCv2、HCv1/LCori、HCv1/LCv1、HCv1/LCv2、HCori/LCoriA、HCori/LCoriB、HCoriA/LCori、HCoriA/LCoriA、HCoriA/LCoriB
mh14A025：
HCori/LCori、HCv1/LCori、HCv2/LCori、HCv5/LCori、HCv7/LCori、HCv8/LCori、HCv15/LCori、HCv17/LCori、HCv19/LCori、HCv21/LCori、HCv24/LCori
mh14A043：
HCori/LCori、HCori/LCv1、HCv1/LCori、HCv1/LCv1、HCv2/LCori、HCv2/LCv1
mh14A063：
HCori/LCori、HCori/LCv1、HCv1/LCori、HCv1/LCv1、HCv2/LCori、HCv2/LCv1
　培養上清中に分泌された抗体タンパク濃度をAlphaLISA法により測定し、測定値を基に各濃度に希釈してBa/F3-hCDCP1細胞に結合させ、さらに二次抗体としてPE標識抗ヒトIgG抗体（Becton Dickinson社）を反応させ、フローサイトメトリーによりPEの蛍光を測定することで、各抗体の反応性を評価した。その結果を図７に示す。図に示されたとおり、評価したすべての抗体はhCDCP1に対する反応性を保持していた。
８．抗体のトリプシン処理hCDCP1強制発現細胞への反応性
　得られた抗hCDCP1マウス・ヒトキメラ抗体が、hCDCP1分子のセリンプロテアーゼ切断箇所のN末側に結合するのか、あるいは膜貫通領域側に結合するのかを調べるため、前項で述べた手法によりトリプシン処理で切断したhCDCP1強制発現Ba/F3細胞に対する反応性を検証した。評価した抗hCDCP1マウス・ヒトキメラ抗体クローンは以下のとおりである。
mh12A041HCori/LCori、mh14A025HCori/LCori、mh14A043HCori/LCori、mh14A055、mh14A063HCori/LCori、mh14A091
　Ba/F3-hCDCP1細胞を、0.05％トリプシンを含むRPMI1640培地中で、37℃で30分処理し、その後RPMI1640/10% FBSで２回洗浄した。この処理を行ったBa/F3-CDCP1細胞において、hCDCP1の全長型が消滅し切断型のみになっていることは、前項で述べたのと同様のウェスタンブロッティングにより確認した。この細胞に対し、抗hCDCP1マウス・ヒトキメラ抗体を5μg/mLから5ng/mLまで希釈系列を作製して、4℃で30分反応させた。陰性対象としては、後の項に述べる抗RSウイルス抗体を非特異的ヒトIgGとして同様の希釈系列を作製して４℃で３０分反応させた。次に二次抗体としてPE標識抗ヒトIgG Fc抗体（Southern Biotech社）を作用させ、洗浄後、蛍光強度をFACSCantoII（BECTON DICKINSON社）により観察した。
　その結果を図８に示す。この結果から評価した6つの抗体はすべて、トリプシン処理によって切断されたhCDCP1分子をもつ細胞に、トリプシン処理をしない場合と同程度に反応すること、すなわち、これらの抗体がhCDCP1分子のセリンプロテアーゼ切断部位よりも細胞膜貫通領域側に結合することが示された。
９．抗体のカニクイザルCDCP1分子に対する反応性
　カニクイザル（Macaca fascicularis）のCDCP1タンパク（isoform X1；NCBI Reference Sequence：XP_005546930.1；配列番号１６０）の30番目から836番目のアミノ酸に対し、N末側にCampath分泌シグナルおよびc-Mycタグを連結した配列を設計した（配列番号１６１）。このアミノ酸配列を、哺乳類のコドン表を基に塩基配列に変換し、この配列を含み5’末端にKozak翻訳開始配列および3’末端に翻訳終止コドンを挿入したDNAを遺伝子合成により合成した（GENEWIZ社；配列番号１６２）。合成したDNAはpEF1/V5-His A（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）のKpnI/PmeIサイトに接続し、発現ベクターGS02とした。
　プラスミドGS01（前項で作製）およびGS02を制限酵素PmeIによって線状化し、2×106 個のCHO-K1細胞に対して2μgをNucleofector（Lonza社）により導入した。遺伝子導入作業後400μg/mLハイグロマイシン存在下で3日間培養し、その後の細胞を剥離・分散後、抗hCDCP1抗体（R&D systems社）で染色し、陽性の細胞をFACS AriaII（Becton Dickinson社）を用いて単細胞ソーティングを行った。分離後増殖した細胞クローンを、さらに抗hCDCP1抗体（R&D systems社）によって染色することによって、hCDCP1、カニクイザルCDCP1を発現するクローンを単離した。これらのクローンを拡大し、以下、hCDCP1発現CHO-K1細胞、カニクイザルCDCP1発現CHO-K1細胞として用いた。
　hCDCP1発現CHO-K1細胞、カニクイザルCDCP1発現CHO-K1細胞を0.25% トリプシン/EDTA （ナカライテスク社）により剥離・分散させたのち、mh12A041HCori/LCori、mh14A025HCori/LCori、mh14A043HCori/LCori、mh14A055、mh14A063HCori/LCori、mh14A091の各マウス・ヒトキメラ抗体をさまざまな濃度で反応させ、フローサイトメトリーによる結合性を観察した（図９）。その結果、これらの６つの抗体はいずれもカニクイザルのCDCP1に対して反応し、特にmh14A055以外の5抗体については、ヒトとカニクイザルのCDCP1に対して同程度に反応した。
１０．抗体のヒトがん細胞への反応性
　抗hCDCP1抗体群の各ヒトがん細胞株への反応性を調べるため、フローサイトメトリーによる抗体の結合反応性の評価を行った。用いたヒトがん細胞株およびその入手先は以下のとおりである。
前立腺癌：PC3（ATCC）、DU145（理研バイオリソースセンター）
肺癌：H358（ATCC）、SK-MES-1（ATCC）
乳癌：MDA-MB-231（ATCC）、HCC1143（ATCC）
胆管癌：TFK-1（理研バイオリソースセンター）
卵巣がん：SK-OV3（ATCC）、OVCAR3（ATCC）
膵がん：Capan-2（ATCC）
大腸・直腸がん：DLD-1（JCRB）
正常細胞：ヒト乳腺上皮細胞（以下HMEpC）（Cell Applications社）、正常ヒト表皮角化細胞（以下NHEK）（PromoCell社）
　各ヒトがん細胞株・正常組織由来細胞は、10cmシャーレにて、個々の細胞に適した培養培地で培養した。シャーレの細胞は0.25% トリプシン/EDTA （ナカライテスク社）処理により剥離処理および懸濁したのち、FCMバッファーを用いて洗浄し、そののちに各抗体をFCMバッファーで図中の各濃度に希釈したものを加えて4℃で30分反応させた。その後FCMバッファーで2回洗浄し、二次抗体としてPE標識マウス抗ヒトIgG抗体（Becton Dickinson社）を用いて染色した。フローサイトメトリー解析はFACSCantoII （Becton Dickinson社）を用いて行った。
その結果を図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。候補クローンはすべてがん細胞に対して反応を示した。またNHEKおよびHMEpCに対しても反応性を示した。
１１．マウスハイブリドーマ由来抗体の骨髄細胞への反応性
　健常人骨髄由来単核球細胞は、AllCells社、STEMCELL Technologies社、Lonza社のいずれかから購入した。
　凍結細胞ストックは融解後、2% FBSを含むIMDM培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によって洗浄し、その後、FcR blocking reagent （ミルテニー社）で室温15分処理した。そのまま最終濃度10μg/mLの一次抗体サンプルを加えて4℃で30分反応させた。一次抗体サンプルとして、前項のスクリーニングによって得られたハイブリドーマクローンの培養上清からprotein G sepharose fast flow （GEヘルスケア社）を用いて精製した抗体サンプルを用いた。陽性対象の抗体として、抗hCDCP1抗体クローンCUB1（BioLegend社）を用いた。非特異的マウスIgG（モノクローナル抗体クローン2E12）はMBL社のものを用いた。FCMバッファーで2回洗浄後、PE標識抗マウスIgG抗体（Becton Dickinson社）を4℃で30分反応させた。さらにFCMバッファーで2回洗浄後、APC標識抗ヒトCD34抗体（BioLegend社）を4℃で30分反応させた。FCMバッファーで2回洗浄後、7-AAD（Becton Dickinson社）を含むFCMバッファー中に懸濁し、FACSCantoII （Becton Dickinson社）によりフローサイトメトリー観察した。
　評価した抗体の反応性を図１１に示す。フローサイトメトリーのデータからCD34-APC陽性生細胞のみをゲーティングし、そのPEの蛍光値のヒストグラムを作成した。図１１が示す通り、CUB1抗体は非特異的マウスIgGと比較して強く骨髄単核球細胞のCD34陽性細胞分画に対して結合する一方で、図１１に挙げられた以下の抗体クローンの反応性は十分に低く、10μg/mLの比較抗体濃度においても非特異的マウスIgGと同程度であり、CD34陽性細胞分画に対する反応性が検出できないほど弱かった。
クローン：01A2C5、12A033、12A038、12A041、14A025、14C013
１２．マウス・ヒトキメラ抗体の骨髄細胞への反応性
　健常人骨髄由来単核球細胞は前項と同じものを用いた。凍結細胞ストックは融解後、FCMバッファーによって洗浄し、その後、FcR blocking reagent（ミルテニー社）を加え室温で15分処理した。そのまま最終濃度10μg/mLの一次抗体サンプルを加えて4℃で30分反応させた。一次抗体サンプルとして、項７で作製したマウス・ヒトキメラ抗体をrProtein A Sepharose Fast Flow（GEヘルスケア社）を用いて精製した抗体を用いた。陽性対象の抗体として、抗hCDCP1抗体クローンCUB1（BioLegend社）を用いた。非CDCP1特異的ヒトIgG (hIgG)はあとの項で述べる抗RSウイルス抗体を用いた。FCMバッファーで2回洗浄後、PE標識抗ヒトIgG抗体（SantaCruz社）あるいはCUB1抗体についてはPE標識抗マウスIgG抗体（Becton Dickinson社）を4℃で30分反応させた。さらにFCMバッファーで2回洗浄後、APC標識抗ヒトCD34抗体（BioLegend社）を4℃で30分反応させた。FCMバッファーで2回洗浄後、7-AAD（Becton Dickinson社）を含むFCMバッファー中に懸濁し、FACSCantoII（Becton Dickinson社）により観察した。
　評価した抗体の反応性を図１２に示す。フローサイトメトリーのデータからCD34陽性生細胞のみをゲーティングし、そのPEの蛍光値のヒストグラムを作成した。図１２が示す通り、CUB1抗体は一次抗体非添加の細胞群と比較して強く骨髄単核球細胞のCD34陽性細胞分画に対して結合する一方で、図１１に挙げられた以下の抗体クローンの反応性は十分に低く、比較抗体濃度を10μg/mLとした場合においても抗体非添加の細胞と同等の染色強度であり、CD34陽性細胞分画に対する反応性が検出できなかった。
クローン：mh12A041HCori/LCori、mh14A025HCori/LCori、mh14A043HCori/LCori、mh14A055、mh14A063HCori/LCori、mh14A091
１３．ビオチン化マウス・ヒトキメラ抗体の骨髄細胞への反応性
　以下の抗体については、より感度の高い方法により健常人骨髄由来単核球細胞に対する反応性を詳細に検討するため、マウス・ヒトキメラ抗体を直接ビオチン化し、それを用いて骨髄単核球細胞に対するフローサイトメトリーを実施した。
mh12A041HCori/LCori、mh14A025HCori/LCori、mh14A043HCori/LCori、mh14A063HCori/LCori
　上記のマウス・ヒトキメラ抗体の精製抗体に対して、EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylation Kit（サーモサイエンティフィック社）を用いてビオチン化を行った。比較対象としての25A11抗体、CUB4抗体、および抗RSウイルス抗体は、それぞれ以下に掲載された配列をもとに作製した。
25A11抗体：国際公開番号WO 2008/133851の配列番号２０に掲載された重鎖可変領域配列、および配列番号４に掲載された軽鎖可変領域配列。本願において作製した重鎖可変領域を配列番号１６３ 、軽鎖可変領域を配列番号１６４ に示す。
CUB4抗体：米国特許 US 8394928の配列番号３に掲載された重鎖可変領域配列、および配列番号１５に掲載された軽鎖可変領域配列。本願において作製した抗体の重鎖可変領域を配列番号１６５、軽鎖可変領域を配列番号１６６に示す 。
抗RSウイルス抗体：PBDデータベース登録番号2hwzに登録された配列。重鎖可変領域は2hwz_Hの1番目から120番目まで、軽鎖可変領域は2hwz_Lの1番目から106番目まで。本願において作製した抗体の重鎖可変領域を配列番号１６７、軽鎖可変領域を配列番号１６８に示す。
　これらをコードする塩基配列を遺伝子合成し、重鎖可変領域はpFUSE-CHIg-hG1ベクター、軽鎖可変領域はpFUSE2-CLIg-hkベクターにクローニングしたのち、Expi293細胞による発現、protein Aセファロースによる精製を経て精製した抗体サンプルを用いた。抗RSウイルス抗体は、以下、非特異的ヒトIgG (hIgG)として用いた。
　同じく比較対象として、正常ヒト血清由来精製IgGタンパク質（シグマアルドリッチ社）および抗hCDCP1抗体クローンCUB1（BioLegend社）に対しても同様の手法によるビオチン化を行い、実験に供した。
　各抗体のビオチン化価数はBiotin Quantification Kit（サーモサイエンティフィック社）を用いて測定し、以下の表３に示す通りであることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　健常人由来骨髄単核球細胞は前項と同じものを用いた。凍結細胞ストックは融解後、FCMバッファーあるいは2% FBSを含むIMDM培地によって洗浄し、その後、FcR blocking reagent （ミルテニー社）を加え室温で15分処理した。そのまま一次抗体サンプルを加えて4℃で30分反応させた。FCMバッファーで2回洗浄後、PE標識ヤギ抗ヒトIgG抗体（Southern Biotechnology社）、APC標識抗ヒトCD34抗体（BioLegend社）、PE-Cy7標識抗ヒトCD45抗体（BioLegend社）を混合したものと、4℃で30分反応させた。FCMバッファーで2回洗浄後、7-AAD（Becton Dickinson社）を含むFCMバッファー中に懸濁し、FACSCantoII（Becton Dickinson社）により観察した。
　この実験による骨髄細胞への反応性を図１３に示す。この図では、観察した結果に対しCD34／CD45両陽性の生細胞のみを抜き出して、そのPE蛍光強度の平均を算出し、添加した抗体濃度との関連を示した。この図から分かるとおり、CUB1、CUB4、25A11のビオチン化抗体が低濃度域においても骨髄CD34陽性細胞に対して十分な反応性を示すのに対して、mh12A041HCori/LCori、mh14A025HCori/LCori、mh14A043HCori/LCori、mh14A063HCori/LCoriの４つの抗体のビオチン化抗体のCD34陽性細胞に対する反応性は顕著に低く、特に10ng/mLの比較抗体濃度において、CUB1、CUB4、25A11のビオチン化抗体が強い反応性を示すのに対し、mh12A041HCori/LCori、mh14A025HCori/LCori、mh14A043HCori/LCori、mh14A063HCori/LCoriの４つの抗体のビオチン化抗体はほぼビオチン化非特異的ヒトIgGと同レベルの弱い反応性であることが示された。
また図１３Ｄには、図１３Ａ～Ｃまでで非特異的ヒトIgGとして用いた抗RSウイルス抗体ビオチン化抗体と、正常ヒト血清由来精製IgGビオチン化タンパクについて、10ng/mLの比較抗体濃度において、骨髄CD34陽性細胞に対する反応性を比較した図を示す。測定は独立した３サンプルについて行い、図１３DにはPE平均蛍光強度の平均値と標準誤差を示した。これにより本発明で述べる抗hCDCP1抗体群の反応性は、ヒト血清由来IgGタンパクと同程度の反応性であることが示された。
１４．抗体のヒト化および強制発現細胞に対する反応性
　次に、以下のマウス抗hCDCP1抗体配列のヒト化を行った。mh12A041HCv1、mh12A041LCv1、mh14A043HCv2、mh14A043LCv1、mh14A063HCv1、mh14A063LCori。
各抗体可変領域の配列から、CDR移植法によるヒト化を行った。ヒト化配列の設計は、以下の論文に記載された方法をもとに実施した。Tsurushitaら, 2005. Design of humanized antibodies: From anti-Tac to Zenapax. Methods 36:69-83.
　最初に、マウス抗体の3次元分子モデルを定法により作成した。次にこの分子モデルをもとに、フレームワーク領域のアミノ酸配列の中で、CDRの構造形成に重要と考えられる残基、また抗原との反応に必須であると考えられた残基を推定した。並行して、ヒト抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域のcDNA配列データベースの中から、各抗hCDCP1抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域に相同性の高い配列を検索した。その後に、検索したヒト抗体配列のフレームワーク部分の配列と各抗hCDCP1抗体のCDR配列を連結した配列をデザインし、そこにさらにCDR構造形成あるいは抗原との反応に必須であると考えられた残基の配列を移植して、ヒト化抗体配列をデザインした。デザインされた配列は以下の表４のとおりである。ヒト化抗体配列の持つCDR配列はもととなったマウス抗体のものと同一であり、前掲の配列番号と同じ配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　mh12A041HCv1については、Kabat番号32番のセリン残基をフェニルアラニン残基に変異させることにより、またmh12A041LCv1に対しては、Kabat番号27d番のヒスチジン残基をチロシン残基に変異させること、あるいは27a番のセリン残基と28番のセリン残基をそれぞれアスパラギン残基とアスパラギン酸残基に同時に変異させることにより、抗原に対する親和性が向上すると考えられたため、これらの変異を含む、以下の表５に示す配列を作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　デザインされた可変領域アミノ酸配列をコードするDNA配列を遺伝子合成によって合成した。重鎖可変領域配列DNAは、ヒト抗体分泌シグナルペプチドあるいはヒトIL-2の分泌シグナルペプチドを接続したうえで、ヒトIgG1定常領域を含むベクターであるpFUSE-CHIg-hg1にクローニングした。軽鎖可変領域配列DNAはヒト抗体分泌シグナルペプチドあるいはヒトIL-2の分泌シグナルペプチドを接続したうえで、ヒトIgκ定常領域を含むベクターであるpFUSE2-CLIg-hkベクターにクローニングした。
　クローニングしたプラスミドを、Expi293細胞にExpifectamineによって遺伝子導入し、培養液中に抗体を発現させた。重鎖・軽鎖のベクターを以下のパターンで組み合わせて発現させた。
h12A041：VH1/VL、VH2/VL、VH1/VLA、VH2/VLA、VH1/VLB、VH2/VLB、VH1A/VL、VH2A/VL、VH1A/VLA、VH2A/VLA、VH1A/VLB、VH2A/VLB
h14A043：VH1/VL1、VH1/VL2、VH1/VL3、VH2/VL1、VH2/VL2、VH2/VL3
h14A063：VH2/VL1、VH2/VL2、VH3/VL1、VH3/VL2、VH4/VL1、VH4/VL2
　培養液を回収・フィルター清浄化し、AlphaLISA法により培養液中の抗体タンパク濃度を測定した。
　作製されたヒト化抗hCDCP1抗体タンパク、および比較対象として元となったクローンのマウス・ヒトキメラ抗体を用い、それらのhCDCP1への反応性をフローサイトメトリーにより検討した。ターゲット細胞としてBa/F3-hCDCP1細胞を用いた。二次抗体としてはPE標識マウス抗ヒトIgG抗体（Becton Dickinson社）を用いた。図１４に示したこの実験の結果から明らかなとおり、デザインされたヒト化抗体はいずれも、元となったマウス・ヒトキメラ抗体と同程度ないしはそれ以上の反応性を示した。このことから、作製されたヒト化抗hCDCP1抗体群はhCDCP1に対する反応性を十分に保持していることが示された。
１５．ヒト化抗体の骨髄細胞に対する反応性
　以下の重鎖・軽鎖の組み合わせをもつ抗体の精製タンパクについて、前項で述べた方法と同様の方法によって、直接ビオチン化を行った。
h12A041：VH1/VL、VH1/VLA、VH1/VLB、VH1A/VL
h14A043：VH1/VL1、VH1/VL2、VH1/VL3、VH2/VL1、VH2/VL2、VH2/VL3
h14A063：VH4/VL1、VH4/VL2
　また比較対象の抗体として、項１３で作製した25A11抗体、CUB4抗体、CUB1抗体、非特異的ヒトIgG抗体として抗RSウイルス抗体、および正常ヒト血清由来精製IgGタンパク質を直接ビオチン化したものを用いた。各抗体のビオチン化価数はBiotin Quantification Kit（サーモサイエンティフィック社）を用いて測定し、以下の表６に示す通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　これらの抗体を用いて、前項で述べたのと同様の手法により、フローサイトメトリーにより健常人骨髄由来単核球細胞に対する反応性を観察した。図１５に以下のビオチン化抗体を10ng/mLの濃度において健常人骨髄由来単核球細胞に結合させたのちにフローサイトメトリーにより観察し、CD34／CD45両陽性生細胞集団のPE蛍光強度を観察した結果のヒストグラムを示す。
25A11-biotin、CUB4-biotin、CUB1-biotin、h12A041VH1/VLA-biotin、h14A043VH1/VL1-biotin、h14A063VH4/VL2-biotin、ヒト血清IgG-biotin
　この結果より、本発明において述べる抗体は、比較対象の抗体に比較して、骨髄中のCD34陽性細胞に対する反応性が非常に低く、ヒト血清中のIgGと同じくほぼ反応性が無いことが示された。
さらに表６に示した抗体群について、作用させる抗体濃度を変化させて同様の実験を行った。フローサイトメトリーの測定結果から、CD34陽性生細胞におけるPEの平均蛍光強度の濃度依存性を両対数グラフに示したものが図１６である。この結果、CUB4抗体は骨髄中のCD34陽性細胞に対し顕著な結合性を示すのに対し、表６に示した抗体は、いずれも、陽性比較対象の抗体に対して十分に反応性が低く、少なくとも10ng/mLの比較抗体濃度において、陰性対象として観察した非特異的ヒトIgG抗体と同程度の反応性となった。このことから、本発明において述べる抗体は造血幹細胞に対する反応性が低く、したがってこれらから派生した抗腫瘍活性をもつ修飾抗体も、骨髄細胞に対する細胞傷害性が低いと考えられた。
１６．PBDコンジュゲート抗体の作成
　以下の、項７において作製されたマウス・ヒトキメラ抗体、項１４において作製されたヒト化抗体と、非特異的ヒトIgGとして前述の抗ＲＳウイルス抗体について、その精製抗体に直接、抗がん剤であるPBD（Pyrrolobenzodiazepine）を結合させた抗体薬物複合体を作製し、その細胞傷害性を評価した。
mh12A041HCori/LCori、mh14A025HCori/LCori、mh14A043HCori/LCori、mh14A063HCori/LCori
h12A041VH1/VLA、h14A043VH1/VL1、h14A063VH4/VL2
　2mgの精製抗体にたいしTCEP（Tris（2-carboxyethyl）phosphine Hydrochloride）によってジスルフィド結合を切断したのち、マレイミド-PEG4-Val-Ala-PBDを、マレイミド－システイン間の付加結合反応により結合させた。その後、Sephadex G50カラムにより未反応のマレイミド-PEG4-Val-Ala-PBDを除去して、PBS pH7.2にバッファー置換を行った。作製されたPBDコンジュゲート抗体の名称は以下のとおりである。333nmの吸光と280nmの吸光の比によって測定された、1抗体分子あたりの結合PBD分子数（DAR）とともに示す。
マウス・ヒトキメラ抗体PBDコンジュゲート抗体：mh12A041-PBD (DAR 2.1)；mh14A025-PBD (DAR 1.7)；mh14A043-PBD (DAR 1.8)；mh14A063-PBD (DAR 2.0)
ヒト化抗体PBDコンジュゲート抗体：h12A041-PBD (DAR 3.8)；h14A043-PBD (DAR 3.6)；h14A063-PBD (DAR 3.4)
抗RSウイルス抗体PBDコンジュゲート抗体：hIgG-PBD (DAR 2.2)
１７．マウス・ヒトキメラ抗体PBDコンジュゲート抗体のがん細胞に対する細胞傷害活性
　前項で作製したマウス・ヒトキメラ抗体のPBDコンジュゲート抗体の、培養細胞に対する細胞傷害活性を、以下の方法により評価した。がん細胞株および正常組織由来初代培養細胞は前項で述べたものと同じものを用いた。
　細胞は適切な培地を用いてプラスチックディッシュで培養した。細胞をトリプシン処理により剥離し、96ウェル平底プレートに1ウェルあたり1000細胞あるいは2000細胞を播種した。37℃で翌日まで培養後、培地によって各濃度にまで希釈したPBDコンジュゲート抗体を添加し、37℃インキュベータで3日間（DU145）、5日間（PC3）、7日間（そのほかの細胞）それぞれインキュベートした。その後、細胞の生存率をCell Titer Glo（Promega）によって測定した。各PBDコンジュゲート抗体の濃度に対し二つのウェルを同じ条件で処理し、測定値はその2ウェルの平均値を採用した。
　テストした4つの抗hCDCP1マウス・ヒトキメラ抗体PBDコンジュゲート抗体は肺癌、乳癌、卵巣がん、前立腺がん、大腸癌、膵がん、胆管癌の各細胞株に対して強い細胞傷害性を示した。ヒト乳腺上皮細胞（HMEpC）と正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）に対しても、高濃度においては細胞傷害性を示したが、その細胞傷害性の程度はがん細胞株に対する細胞傷害性に比較して弱いものであった。実験結果より、50%阻害濃度（IC50）を算出したものが図１７Ａであり、これをグラフ化したものが図１７Ｂである。これらの図から分かる通り、各抗体PBDコンジュゲートのNHEKおよびHMEpCに対する細胞傷害活性は、がん細胞株に対する傷害活性と比較して弱いものであった。
１８．ヒト化抗体PBDコンジュゲート抗体のがん細胞に対する細胞傷害活性
　項１６で作製したヒト化抗体PBDコンジュゲート抗体に対し、項１７と同様の手法により、培養細胞に対する細胞傷害活性を評価した。使用した細胞株は、PC3、DU145、HCT116、MDA-MB-231、H358、SK-OV-3および正常ヒト表皮角化細胞(NHEK)であり、項１０で述べたものと同じものを用いた。
　細胞をトリプシン処理により剥離し、96ウェル平底プレートに1ウェルあたり1000細胞あるいは2000細胞を播種した。37℃で翌日まで培養後、培地によって各濃度にまで希釈したPBDコンジュゲート抗体を添加し、37℃インキュベータで3日間（DU145）、5日間（PC3）、7日間（それ以外の細胞）それぞれインキュベートした。その後、細胞の生存率をCell Titer Glo（Promega）によって測定した。各PBDコンジュゲート抗体の濃度に対し二つのウェルを同じ条件で処理し、測定値はその2ウェルの平均値を採用した。その結果を図１８に示す。
　テストした3つのヒト化抗hCDCP1抗体PBDコンジュゲートはPC3、DU145、HCT116、MDA-MB-231、H358に対して強い細胞傷害性を示した。SK-OV-3細胞に対する細胞傷害性はこれらよりは弱かった。正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）に対しても、高濃度においては細胞傷害性を示したが、その細胞傷害性の程度はがん細胞株に対する細胞傷害性に比較して弱いものであった。実験結果より、50%阻害濃度（IC50）を算出すると以下の表のとおりとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　表７から分かる通り、各抗体PBDコンジュゲートのNHEKに対する細胞傷害活性は、がん細胞株に対する傷害活性と比較して弱いものであった。
１９．マウス・ヒトキメラ抗体PBDコンジュゲート抗体のゼノグラフトモデルに対する抗腫瘍活性
　次に、抗CDCP1マウス・ヒトキメラ抗体PBDコンジュゲート抗体のin vivoでの抗腫瘍活性を以下の方法により評価した。マウスは、scidマウス（C.B17/Icr-scidJcl; 日本クレア）ないしはヌードマウス（BALB/cAJcl-nu/nu; 日本クレア）雌6～7週齢のものを用いた。PC3細胞はATCCより購入したものを用いた。PC3細胞は、Ham’s F-12K（和光純薬工業）に7%のFBSおよび10μg/mLのGentamicin（サーモサイエンティフィック社）を添加した培地で培養した。細胞を0.25%トリプシン/0.02% EDTA（サーモサイエンティフィック社）で剥離しPBSで洗浄したのち、1匹あたり5×106細胞を、Matrigel growth factor reducedフェノールレッドフリー（コーニング社）と1:1で混合し、マウス右脇腹皮下に移植した。
　腫瘍が増殖して平均腫瘍体積が100mm3を超えた時点で、各個体の腫瘍体積にもとづきランダマイズしてグループ化（一群8匹）した。群分け同日ないしは翌日に被験薬を、マウス体重あたり10μL/gにて1回尾静脈投与した。
　腫瘍サイズならびに体重の測定は、細胞移植後3～4日から開始し、以降週に2回の頻度で実施した。ノギスを用いて腫瘍の短径と長径をそれぞれ計測し、腫瘍サイズは（短径 mm）2×（長径 mm）×3.14/6 で算定した。
　図１９Ａ、Ｂに、scidマウスモデルを用いた実験結果を示す。mh12A041-PBDおよびmh14A025-PBDは1mg/kg、0.3mg/kg群ともに、同じ濃度の非特異的hIgG-PBDを投与した群に比較して、有意に腫瘍を抑制した。
　図１９Ｃ、Ｄに、ヌードマウスモデルを用いた実験結果を示す。mh14A043-PBDおよびmh14A063-PBDは1mg/kg、0.3mg/kg群ともに、同じ濃度の非特異的hIgG-PBDを投与した群に比較して、有意に腫瘍を抑制した。
２０．ヒト化抗体PBDコンジュゲート抗体のゼノグラフトモデルに対する抗腫瘍活性
　次に、抗CDCP1ヒト化抗体PBDコンジュゲート抗体のin vivoでの抗腫瘍活性を以下の方法により評価した。マウスは、ヌードマウス（BALB/cAJcl-nu/nu; 日本クレア）雌6～7週齢のものを用いた。PC3細胞およびHCT116細胞はATCCより購入したものを用いた。PC3細胞は、Ham’s F-12K（和光純薬工業）に7%のFBSおよび10μg/mLのGentamicin（サーモサイエンティフィック社）を添加した培地で培養した。HCT116細胞は、McCoy’s 5A（サーモサイエンティフィック社）に10%のFBSおよび1%ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク社）を添加した培地で培養した。
　細胞を0.25%トリプシン/0.02% EDTA（サーモサイエンティフィック社）で剥離しPBSで洗浄したのち、1匹あたり5×106細胞を、Matrigel growth factor reducedフェノールレッドフリー（コーニング社）と1:1で混合し、マウス右脇腹皮下に移植した。
　腫瘍が増殖して平均腫瘍体積が100mm3を超えた時点で、各個体の腫瘍体積にもとづきランダマイズしてグループ化（一群8匹）した。群分け同日に被験薬を、マウス体重あたり10μL/gにて1回尾静脈投与した。
　腫瘍サイズならびに体重の測定は、項１９と同様の手法により行った。
　図２０Ａに、PC3細胞を用いたゼノグラフトモデルを用いた実験結果を示す。h12A041-PBD、h14A043-PBD、h14A063-PBDともに、1mg/kgの単回投与によって、同じ濃度の非特異的hIgG-PBDを投与した群に比較して、有意に腫瘍を抑制した。
　図２０Ｂに、HCT116細胞を用いたゼノグラフトモデルを用いた実験結果を示す。h12A041-PBD, h14A043-PBD, h14A063-PBDともに、0.3mg/kgの単回投与によって、同じ濃度の非特異的hIgG-PBDを投与した群に比較して、有意に腫瘍を抑制した。
２１．MMAEコンジュゲート抗体の作成
　以下の、項１４において作製されたヒト化抗体について、その精製抗体に直接、抗がん剤であるMMAE（monomethyl auristatin E）を結合させた抗体薬物複合体を作製し、その細胞傷害性を評価した。
h14A043VH1/VL1、h14A063VH4/VL2
　約30 mgの精製抗体にたいしTCEP（Tris（2-carboxyethyl）phosphine Hydrochloride）によってジスルフィド結合を切断したのち、maleimidocaproyl-valine-citruline-p-aminobenzyloxycarbonyl-monomethyl auristatin E (MC-vc-PAB-MMAE).を、マレイミド－システイン間の付加結合反応により結合させた。その後、Sephadex G50カラムにより未反応のMC-vc-PAB-MMAEを除去して、PBS pH7.2にバッファー置換を行った。1抗体分子あたりの結合MMAE分子数は248nmの吸光と280nmの吸光の比によって測定し、h14A043VH1/VL1についてはおよそ3.9、h14A063VH4/VL2についてはおよそ4.0と測定された。作製されたMMAEコンジュゲート抗体の名称は以下のとおりである。
h14A043-MMAE；h14A063-MMAE
２２．ヒト化抗体MMAEコンジュゲート抗体のゼノグラフトモデルに対する抗腫瘍活性
　次に、ヒト化抗体MMAEコンジュゲート抗体のin vivoでの抗腫瘍活性を以下の方法により評価した。マウスは、ヌードマウス（BALB/cAJcl-nu/nu; 日本クレア）雌6～7週齢のものを用いた。HCT116細胞はATCCより購入したものを用いた。HCT116細胞は、項２０と同様の手法により培養した。
　細胞を0.25%トリプシン/0.02% EDTA（サーモサイエンティフィック社）で剥離しPBSで洗浄したのち、1匹あたり5×106細胞を、Matrigel growth factor reducedフェノールレッドフリー（コーニング社）と1:1で混合し、マウス右脇腹皮下に移植した。
　腫瘍が増殖して平均腫瘍体積が100mm3を超えた時点で、各個体の腫瘍体積にもとづきランダマイズしてグループ化（一群8匹）した。被験薬および陰性対象として溶媒であるリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を、群分け当日を初回投与日として週２回、計４回投与した。投与は、マウス体重あたり10μL/gにて尾静脈投与により行った。腫瘍サイズならびに体重の測定は、項１９と同様の手法により行った。
　図２１に実験結果を示す。h14A043-PBD、h14A063-PBDともに、5mg/kgの４回投与によって、PBS投与群に比較して、有意に腫瘍を抑制した。
　本発明によって提供される抗体およびその抗原結合断片は、がんの予防または治療の提供、がんの予防または治療剤の開発等において重要な役割を果たすと考えられる、従って、本発明は医療分野、製薬分野等における利用が期待される。

Claims (16)

  1. 　ヒトCDCP1（CUB domain-containing protein 1）に結合する抗体であって、ヒトCD34陽性細胞との結合性が低いことを特徴とする、前記抗体またはその抗原結合断片。
  2. 　前記ヒトCD34陽性細胞との結合性の評価における比較抗体濃度が10 ng/ml以上のいずれかの濃度であることを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 　CDR（complementarity determining region）1～3のアミノ酸配列が下記（Ａ）～（Ｋ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
    （Ａ）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｂ）配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｃ）配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｄ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｅ）配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｆ）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
    配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｇ）配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｈ）配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号８５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号８６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号８７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｉ）配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号９０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｊ）配列番号９７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号９９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号１０２で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、
    配列番号１０３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｋ）配列番号１０５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号１０６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号１０７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号１０９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号１１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号１１１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
  4. 　CDR（complementarity determining region）1～3のアミノ酸配列が下記（Ｌ）または（Ｍ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
    （Ｌ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｍ）前記（Ｌ）を満たす抗体において、Kabat定義における重鎖１０２番目のアミノ酸、軽鎖２８番目および２９番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された重鎖および軽鎖可変領域を有する。
  5. 　CDR（complementarity determining region）1～3のアミノ酸配列が下記（Ｎ）または（Ｏ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
    （Ｎ）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号６６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｏ）前記（Ｎ）を満たす抗体において、Kabat定義における重鎖５４番目および５５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された重鎖可変領域を有する。
  6. 　CDR（complementarity determining region）1～3のアミノ酸配列が下記（Ｐ）または（Ｑ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
    （Ｐ）配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号７４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号７７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｑ）前記（Ｐ）を満たす抗体において、Kabat定義における重鎖５４番目および５５番目のアミノ酸、軽鎖３３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された重鎖および軽鎖可変領域を有する。
  7. 　CDR（complementarity determining region）1～3のアミノ酸配列が下記（Ｒ）または（Ｓ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
    （Ｒ）配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号９０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （Ｓ）前記（Ｒ）を満たす抗体において、Kabat定義における重鎖５２ａ番目および５３番目、軽鎖３３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された重鎖および軽鎖可変領域を有する。
  8. 　重鎖可変領域のCDR1～3のアミノ酸配列が下記（Ｔ）～（Ｕ）のいずれかを満たし、軽鎖可変領域のCDR1～3のアミノ酸配列が下記（ｔ）～（ｖ）のいずれかを満たすことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
    （Ｔ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
    配列番号１１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有する、
    （Ｕ）配列番号１８３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、および
    配列番号１１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を有する、
    （ｔ）配列番号１１７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （ｕ）配列番号１８６であらわされるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する、
    （ｖ）配列番号１８８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号５４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有する。
  9. 配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号１４７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号１４９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有することを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
  10. 配列番号８９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号１５１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号９３で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番９５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を有することを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
  11. 　CDCP1に結合し、ヒトCD34陽性細胞との結合性が低いことを特徴とする抗体であって、請求項３ないし１０のいずれかに記載の抗体とCDCP1との結合を競合阻害する抗体またはその抗原結合断片。
  12. 　ヒト化抗体であることを特徴とする請求項１ないし１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  13. 　抗腫瘍活性を有する物質が結合していることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  14. 　前記抗腫瘍活性を有する物質が抗がん剤であることを特徴とする請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  15. 　Fab、Fab’、F（ab’）2、Fv、一本鎖抗体、scFv、scFv二量体またはdsFvであることを特徴とする請求項１ないし１４のいずれかに記載の抗原結合断片。
  16. 　請求項１ないし１５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。

     
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