WO2021130453A1 - Formulation d'un dendrimère anti-inflammatoire pour le traitement de psoriasis - Google Patents

Formulation d'un dendrimère anti-inflammatoire pour le traitement de psoriasis Download PDF

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WO2021130453A1
WO2021130453A1 PCT/FR2020/052608 FR2020052608W WO2021130453A1 WO 2021130453 A1 WO2021130453 A1 WO 2021130453A1 FR 2020052608 W FR2020052608 W FR 2020052608W WO 2021130453 A1 WO2021130453 A1 WO 2021130453A1
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WO
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dendrimer
skin
vesicle
nmr
compound
Prior art date
Application number
PCT/FR2020/052608
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Inventor
Muriel Blanzat
Ranime JEBBAWI
Rémy POUPOT
Cédric-Olivier TURRIN
Michel Simon
Emily CLEMENT
Hélène LABIE
Abdelouahd OUKHRIB
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -
Universite Paul Sabatier Toulouse Iii
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)
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Priority to US17/787,787 priority patent/US20230085651A1/en
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Definitions

  • the present invention relates to vesicles of catanionic surfactants derived from sugar comprising anti-inflammatory dendrimers and their use as a medicament, more particularly in the treatment of psoriasis.
  • Psoriasis is a chronic inflammatory disease of the skin which is the consequence of an accelerated renewal of the epidermis maintained by the inflammation and which manifests itself by the appearance of red plaques covered with white films which stand out from the skin. the skin (dander). This disease which affects more than 125 million people worldwide and has a strong impact on the quality of life of those affected. No treatment can cure psoriasis today and the causes of this disease are multiple and still poorly understood.
  • Treatments making it possible to alleviate the symptoms have however been developed such as the topical application of corticosteroids or vitamin D. These treatments make it possible to relieve the mild symptoms of psoriasis but are not very effective for the treatment of the most severe forms. more severe. The more severe forms are treated by oral administration of immunosuppressants such as cyclosporine, but these cause significant side effects. Monoclonal antibodies and soluble receptors targeting pro-inflammatory mediators such as TNF, IL-12, IL-23 and IL-17 have been proposed. These biological drugs have a high cost and see their effectiveness decrease over time. They are also contraindicated in the case of certain co-morbidities associated with psoriasis. [0004] There therefore remains a need to develop new treatments for the treatment of psoriasis for topical application, thus limiting the side effects.
  • Dendrimers are macromolecules made up of monomers combined together to form a multi-branched three-dimensional architecture with a defined structure.
  • the dendrimers have a perfectly defined size and structure thanks to their iterative synthesis. Their multivalence makes them very attractive nano-objects for many applications, particularly in biology and medicine.
  • phosphorus-containing dendrimers with an Azabisphosphonate surface are capable of activating monocytes and inducing an anti-inflammatory response (WO2010 / 013086, Portevin D. et al. J Transi Med. 2009; 7 : 82). More specifically, the anti-inflammatory properties have been validated in animal models of rheumatoid arthritis in which monocytes are known to play a primary role in inflammation and osteoclastogenesis (Hayder M. et al. 2011; Sci Trans Med. 3 (81)). The anti-inflammatory effect of the ABP dendrimer has also been validated in models of uveitis (Fruchon et al. 2013.
  • the inventors have formulated the aza-bisphosphonate dendrimers with catanionic surfactants derived from sugar.
  • Catanionic surfactants sugar derivatives associate spontaneously in the form of vesicles and can encapsulate hydrophobic active ingredients in their membrane bilayer.
  • hydrophilic ABP dendrimers exhibit a low level of encapsulation with surfactants derived from sugar and a transition temperature of the "solid-fluid" phase of the membrane bilayer of 37 ° C
  • the inventors have discovered in such a way It is surprising that the complex formed as a result of the combination of the phosphonic acid form of the ABP dendrimer (ABP-OH) with a surfactant derived from sugar results in a decrease in the transition temperature of the complex to 33 ° C.
  • this complex becomes fluid and is therefore able to diffuse more easily into the deep layers of the skin, also improving its anti-inflammatory action.
  • the rate of encapsulation of these phosphonic acid forms is higher than that of hydrophilic ABP dendrimers and the complexes are stable at a pH close to that of the skin.
  • the invention relates to a vesicle comprising:
  • R 1 is chosen from H and a linear or branched, saturated or unsaturated, 1 to 20 membered hydrocarbon chain,
  • R 2 is a linear or branched, saturated or unsaturated, 1 to 20 membered hydrocarbon chain
  • R 3 and R 4 are independently of each other a linear hydrocarbon chain or branched, saturated or unsaturated, 1 to 19 membered; and - a dendrimer of formula (II):
  • R is chosen from H and C1-C12-alkyl
  • A is chosen from where X is chosen from S and O, and n is an integer between 3 and 8.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one vesicle according to the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the invention relates to a vesicle according to the invention or to a pharmaceutical composition according to the invention for its use in the treatment of psoriasis.
  • the invention relates to a process for preparing a vesicle according to the invention.
  • FIG. 1 represents a diagram illustrating the production of the bioactive formulation.
  • Fig. 2 represents a diagram illustrating the production of the bioactive formulation.
  • FIG. 2 shows the phase transition temperature for the TriCat 12 / ABP formulation.
  • FIG. 3 shows the fluorescence quantification of the quantity of ABP-NIR dendrimer (ABP dendrimer in its fluorescent form), whether or not formulated with TriCat 12, which has penetrated into the skin of the pig's ear (Franz cells) after 24 hours at 40 ° C.
  • FIG. 4 shows in a) the size distribution measured by DLS of the vesicles formed by the TriCat 12 / G1-A formulation (1 / 0.5), b) the scanning electron microscopy image of the vesicles formed by the TriCat formulation 12 / G 1 - A (1 / 0.5).
  • FIG. 5 shows the phase transition temperature of the TriCat 12 / G1-A formulation.
  • FIG. 6 shows the measurement of the mean hydrodynamic diameter and the DLS intensity of the TriCat 12 / G1-A formulation over two months at 4 ° C.
  • Fig. 7 shows the measurement of the mean hydrodynamic diameter and the DLS intensity of the TriCat 12 / G1-A formulation over two months at 4 ° C.
  • FIG. 7 shows the measurement of the mean hydrodynamic diameter and the DLS intensity of the TriCat 12 / G1-A formulation over two months at + 4 ° C and - 20 ° C.
  • Fig. 8 shows the measurement of the mean hydrodynamic diameter and the DLS intensity of the TriCat 12 / G1-A formulation over two months at + 4 ° C and - 20 ° C.
  • FIG. 8 shows the fluorescence quantification of the quantity of G1A-NIR dendrimer (G1A dendrimer in its fluorescent form), whether or not formulated with TriCat 12, which has penetrated into the skin of the pig's ear (Franz cells) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 9 shows the fluorescence quantification of the quantity of G1A-NIR dendrimer (G1A dendrimer in its fluorescent form), whether or not formulated with TriCat 12, which has penetrated into the skin of the pig's ear (Franz cells) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 9 shows the fluorescence quantification of the quantity of G1A-NIR dendrimer (G1A dendrimer in its fluorescent form), whether or not formulated with TriCat 12, which has penetrated into the skin of the pig's ear (Franz cells) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 9 shows the fluorescence quantification of the quantity of G1A
  • FIG. 9 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white) of the unformulated G1-A-NIR dendrimer (left image) and formulated with T riCat 12 (right image) which has penetrated the skin of pig's ear (Franz cells) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 10 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white) of the unformulated G1-A-NIR dendrimer (left image) and formulated with T riCat 12 (right image) which has penetrated the skin of pig's ear (Franz cells) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 10 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white) of the unformulated G1-A-NIR dendrimer (left image) and formulated with T riCat 12 (right image) which has penetrated the skin of pig's ear (Franz cells) after 24 hours at 35
  • FIG. 10 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white) of the unformulated G1-A-NIR dendrimer (left image) and formulated with TriCat 12 (right image) which has penetrated human skin (cells de Franz) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 11 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white) of the unformulated G1-A-NIR dendrimer (left image) and formulated with TriCat 12 (right image) which has penetrated human skin (cells de Franz) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 11 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white) of the unformulated G1-A-NIR dendrimer (left image) and formulated with TriCat 12 (right image) which has penetrated human skin (cells de Franz) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 11 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white)
  • FIG. 11 shows the analysis by flow cytometry of the morphology (size and granulosity) of the monocytes (on the graphs, each point is a cell).
  • the top graph shows the unactivated control monocytes.
  • the lower left graph shows the monocytes cultured in the presence of TriCat 12 vesicles alone (no activation).
  • the lower right graph shows the monocytes cultured with the TriCat 12 vesicles loaded with the G1-A dendrimer. The activated monocytes are in the ellipse.
  • FIG. 12 [0025] [Fig.12] shows the therapeutic efficacy of the G1-A dendrimer and the TriCat12 vesicles loaded with the G1-A dendrimer in the mouse model of psoriasis induced by Imiquimod (IMQ). Clinical scores (top graph) are given as a function of time expressed in days. Histological scores are given on the bottom graph. The "control" mice are the animals which have not been treated.
  • FIG. 13 shows the antiproliferative effect of compound G1-A, as a function of the treatment time, on the N-TERT keratinocyte line (top graphs) and on primary human keratinocytes (bottom graphs).
  • FIG. 14 shows in a) the size distribution measured by DLS of the vesicles formed by the TriCat 12 / G1-B formulation (1 / 0.5), b) scanning electron microscopy image of the vesicles formed by the TriCat 12 formulation / G1 -B (1 / 0.5).
  • FIG. 15 shows the phase transition temperature of the TriCat 12 / G1-B formulation.
  • Fig. 16 shows the measurement of the mean hydrodynamic diameter and the DLS intensity of the TriCat 12 / G1-B formulation over two months at 4 ° C.
  • TriCat 12 / G1-B in xanthan gel (A) after 3 months storage at pH 4 at 25 ° C in water protected from light.
  • FIG. 18 shows the evolution of light transmission, after 1 day in water at room temperature, through a sample of TriCat 12 / G1-B incorporated (bottom) or not (top) in a gel of xanthan (physical stabilization).
  • Fig. 19 shows the evolution of light transmission, after 1 day in water at room temperature, through a sample of TriCat 12 / G1-B incorporated (bottom) or not (top) in a gel of xanthan (physical stabilization).
  • FIG. 19 shows the fluorescence quantification of the amount of G1- B-NIR dendrimer (G1-B dendrimer in its fluorescent form), whether or not formulated with TriCat 12, which has penetrated into the skin of the pig's ear (Franz cells ) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 20 shows the fluorescence quantification of the amount of G1- B-NIR dendrimer (G1-B dendrimer in its fluorescent form), whether or not formulated with TriCat 12, which has penetrated into the skin of the pig's ear (Franz cells ) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 20 shows the fluorescence quantification of the amount of G1- B-NIR dendrimer (G1-B dendrimer in its fluorescent form), whether or not formulated with TriCat 12, which has penetrated into the skin of the pig's ear (Franz cells ) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 20 shows the fluorescence
  • FIG. 20 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white) of the G1-B-NIR dendrimer (G1-B dendrimer in its fluorescent form) unformulated (A) and formulated with TriCat 12 (B) which has penetrated in pig ear skin (Franz cells) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 21 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white) of the G1-B-NIR dendrimer (G1-B dendrimer in its fluorescent form) unformulated (A) and formulated with TriCat 12 (B) which has penetrated in pig ear skin (Franz cells) after 24 hours at 35 ° C.
  • Fig. 21 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white) of the G1-B-NIR dendrimer (G1-B dendrimer in its fluorescent form) unformulated (A) and formulated with TriCat 12 (B) which has penetrate
  • FIG. 21 shows the observation by confocal microscopy of the fluorescence (in white) of the G1-B-NIR dendrimer (G1-B dendrimer in its fluorescent form) unformulated (A) and formulated with TriCat 12 + xanthan 1% (B ) which has penetrated the skin of the pig's ear (Franz cells) after 24 hours at 35 ° C.
  • FIG. 22 shows the analysis by flow cytometry of the morphology (size and granulosity) of the monocytes (on the graphs, each point is a cell).
  • the top graph shows the unactivated control monocytes.
  • the lower graph shows the monocytes cultured in the presence of TriCat 12 vesicles loaded with the G1-B dendrimer. The activated monocytes are in the ellipse.
  • FIG. 23 shows the therapeutic efficacy of the G1-B dendrimer and the TriCat12 vesicles loaded with the G1-B dendrimer in the mouse model of imiquimod-induced psoriasis.
  • Clinical scores (top graph) are given as a function of time expressed in days. Histological scores are given on the bottom graph. The "control" mice are the animals which have not been treated.
  • Fig. 24 shows the therapeutic efficacy of the G1-B dendrimer and the TriCat12 vesicles loaded with the G1-B dendrimer in the mouse model of imiquimod-induced psoriasis.
  • Clinical scores (top graph) are given as a function of time expressed in days. Histological scores are given on the bottom graph.
  • the "control" mice are the animals which have not been treated.
  • Fig. 24 shows the therapeutic efficacy of the G1-B dendrimer and the TriCat12 vesicles loaded with the G1-B dendrimer
  • FIG. 24 shows the antiproliferative effect of compound G1-B, as a function of the treatment time, on the N-TERT keratinocyte line (top graphs) and on primary human keratinocytes (bottom graphs).
  • FIG. 25 shows the size distribution measured by DLS of the vesicles formed by the TriCat 12 / G1-C formulation (1 / 0.5)
  • FIG. 26 shows the phase transition temperature of the TriCat 12 / G1-C formulation Fig. 27
  • FIG. 27 shows the measurement of the mean hydrodynamic diameter measured in DLS of the TriCat 12 / G1-C formulation over one month at 4 ° C.
  • FIG. 28 shows the fluorescence quantification of the quantity of G1C-NIR dendrimer (G1C dendrimer in its fluorescent form) formulated with TriCat 12, which penetrated into the skin of pig's ear (Franz cells) after 24 hours at 35 ° vs.
  • FIG. 29 shows the analysis by flow cytometry of the morphology (size and granulosity) of the monocytes (on the graphs, each point is a cell).
  • the top graph shows the unactivated control monocytes.
  • the lower graphs show the monocytes cultured with the G1-C dendrimer at 3 concentrations 0.2 ⁇ M, 2 pM and 20 pM.
  • the activated monocytes are in the ellipse.
  • Fig. 30 shows the analysis by flow cytometry of the morphology (size and granulosity) of the monocytes (on the graphs, each point is a cell).
  • the top graph shows the unactivated control monocytes.
  • the lower graphs show the monocytes cultured with the G1-C dendrimer at 3 concentrations 0.2 ⁇ M, 2 pM and 20 pM.
  • the activated monocytes are in the ellipse.
  • FIG. 30 shows the size distribution measured by DLS of the vesicles formed by the TriCat 8 / G1-B formulation (1 / 0.5)
  • FIG. 31 shows the size distribution measured by DLS of the vesicles formed by the TriCat 16 / G1-B formulation (1 / 0.5)
  • FIG. 32 shows the measurement of the mean hydrodynamic diameter measured in DLS of the TriCat 16 / G1-B formulation over 10 days at 4 ° C.
  • the inventors have shown that the formulation of azabisphosphonate dendrimers in the phosphonic acid form with catanionic surfactants derived from sugar promotes the penetration of the dendrimer into the skin, thus improving its anti-inflammatory effect for the treatment of psoriasis.
  • the present invention thus relates to a vesicle comprising:
  • R 1 is chosen from H and a linear or branched, saturated or unsaturated, 1 to 20 membered hydrocarbon chain, in particular R 1 is chosen from H and C1-C20- alkyl, more particularly, R 1 is chosen from H and C4 -C18-alkyl, more particularly R 1 is H, and
  • R 2 is a linear or branched, saturated or unsaturated, 1 to 20 membered hydrocarbon chain, in particular R 2 is C1-C20-alkyl, more particularly R 2 is C4-C18-alkyl, more particularly R 2 is C8- C16-alkyl, always more particularly R 2 is dodecyl,
  • R 3 and R 4 are independently of each other a linear or branched, saturated or unsaturated, 1 to 19 membered hydrocarbon chain, in particular R 3 and R 4 are independently of one another C1-C19 -alkyl, more particularly R 3 and R 4 are C3-C17-alkyl, more particularly R 3 and R 4 are C7-C15-alkyl, always more particularly R 3 and R 4 are undecyl; and - a dendrimer of formula (II):
  • R is chosen from H and C1 -C12-alkyl, in particular R is C1 -C12-alkyl, more particularly R is C1-C8-alkyl, more particularly R is C1-C4-alkyl, always more particularly R is chosen from methyl, n-hexyl and n-octyl;
  • A is selected from and, where X is selected from S and O; in in particular A is, where X is selected from S and O; more particularly X is S, and n is an integer between 3 and 8, in particular n is equal to 6.
  • alkyl is meant within the meaning of the present invention a hydrocarbon radical of formula C n H 2n + 1 in which n is an integer greater than or equal to 1.
  • the alkyl radicals can be linear or branched, preferably linear.
  • Particular alkyl radicals of the invention are from 1 to 20 carbon atoms, more particularly from 1 to 12 carbon atoms.
  • sugar is meant within the meaning of the present invention monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, polyols and their derivatives.
  • Sugar derivatives include in particular sugar-type radicals in which a hydroxyl function has been deleted.
  • a particularly preferred sugar of the invention is 1-deoxylactilol.
  • the vesicle according to the invention is characterized in that it comprises a single catanionic surfactant of formula (I).
  • the vesicle according to the invention is characterized in that it comprises a mixture of catanionic surfactants of formula (I), in particular a mixture of two different catanionic surfactants of formula (I).
  • the molar ratio between the two different catanionic surfactants of formula (I) can be between 99/1 and 1/99.
  • the vesicle according to the invention is characterized in that, in the catanionic surfactant of formula (I), is 1-deoxylactilol.
  • the catanionic surfactant present in the formulation is that of formula (Ia):
  • the vesicle according to the invention is characterized in that, in the dendrimer of formula (II), is
  • the dendrimer present in the vesicle is that of formula (IIa):
  • the dendrimer of formula (IIa) present in the vesicle is that in which Z is -CH 2 -. According to another variant of this embodiment, the dendrimer of formula (IIa) present in the vesicle is that in which A is where X is chosen from S and O.
  • the dendrimer of formula (IIa) present in the vesicle is that in which A is
  • the catanionic surfactant / dendrimer molar ratio in the vesicle according to the invention is between 50/1 and 1/1, in particular between 30/1 and 1/1, more particularly between 20/1 and 1 / 1, even more particularly between 10/1 and 1/1, always more particularly between 5/1 and 1/1.
  • the catanionic surfactant / dendrimer molar ratio in the vesicle according to the invention is approximately 2/1.
  • the vesicle according to the invention makes it possible to encapsulate the dendrimer in the catanionic surfactant.
  • the degree of encapsulation of the dendrimer of formula (I) in the catanionic surfactant of formula (II) is greater than 50%.
  • the degree of encapsulation of the dendrimer of formula (I) in the catanionic surfactant of formula (II) is between 50% and 95%, more particularly between 60% and 85%, more particularly still between 70% and 80%. %.
  • the term “encapsulation rate” is understood to mean the ratio between the number of moles of dendrimer stabilized in the catanionic surfactant over the number of moles of dendrimer initially used for the preparation of the vesicle.
  • the degree of encapsulation can be determined by all the methods known to those skilled in the art, in particular by assay by UV-visible spectrophotometry or by fluorescence spectroscopy.
  • the average diameter of the vesicles according to the invention is between 50 and 500 nm, in particular between 100 and 350 nm.
  • the average diameter can be determined by all the methods known to those skilled in the art, in particular by dynamic light scattering (DLS), in particular by means of a He-Ne laser emitting a monochromatic light of a wavelength of 633 nm.
  • the phase transition temperature of the vesicles according to the invention is between 30 and 35 ° C, in particular is 33 ° C.
  • the present application also relates to a process for preparing the vesicles as described above.
  • the catanionic surfactant of formula (I) present in the vesicle according to the invention is formed by the combination of an N-alkylaminosugar of formula (G):
  • R 1 is chosen from H and a linear or branched, saturated or unsaturated, 1 to 20 membered hydrocarbon chain, in particular R 1 is chosen from H and C1-C20-alkyl,
  • R 2 is a linear or branched, saturated or unsaturated, 1 to 20 membered hydrocarbon chain, in particular R 2 is C1-C20-alkyl; and a phosphinic acid of formula (I ”):
  • R 3 and R 4 are independently of each other a linear or branched, saturated or unsaturated, 1 to 19 membered hydrocarbon chain, in particular R 3 and R 4 are independently of one another C1-C19 -alkyl.
  • the process for preparing a vesicle according to the invention successively comprises the following steps:
  • the mixing step is carried out in an aqueous solution, in particular in water.
  • the N-alkylaminosugar, the phosphinic acid and the dendrimer are mixed with a molar ratio of between 100/50/1 and 1/1/1.
  • the mixing step is carried out with an N-alkylaminosugar / phosphinic acid / dendrimer molar ratio of 2/2/1.
  • the mixing can be carried out by means of all the techniques known to those skilled in the art, in particular by magnetic stirring, by vortex stirring and / or by sonication by ultrasound, more particularly by vortex stirring and then by magnetic stirring or by ultrasound sonication.
  • the mixing step can be carried out at room temperature or by heating at a temperature between room temperature and 100 ° C, in particular between 25 ° C and 75 ° C, for a period of between 5 minutes and 72 hours, especially between 10 minutes and 48 hours.
  • the vesicle obtained can then be separated from the non-encapsulated dendrimer.
  • the separation step can be carried out by means of all the techniques known to those skilled in the art, in particular by filtration.
  • composition A subject of the present patent application is also a pharmaceutical composition comprising the vesicle as described above and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a pharmaceutically acceptable excipient does not produce a side effect, allergic or other adverse reaction when administered to an animal, preferably a human.
  • the preparations must meet the criteria of sterility, pyrogenicity, general safety and purity standards as required by regulatory agencies, such as for example the FDA or IMA.
  • composition as described above will be intended for topical or transcutaneous application.
  • the pharmaceutical composition as described above can thus comprise one or more pharmaceutically acceptable excipients for a formulation suitable for topical administration.
  • compositions for topical application in the form of a milk, a cream, a balm, an oil, a lotion, a gel, a foaming gel, an ointment, or a spray, preferably in the form of a gel.
  • the pharmaceutical excipients can be gelling agents chosen from: carbomers, polysaccharides, such as xanthan gum, guar gum, chitosans, carrageenans, cellulose and its derivatives such as hydroxypropylmethylcellulose in particular or hydroxyethylcellulose available under the name Natrosol or also the family of aluminum and magnesium silicates, the family of acrylic polymers, the family of modified starches and the gelling agents of the family of polyacrylamides.
  • the pharmaceutical excipient comprises hydroxyethylcellulose, chitosan or xanthan, preferably xanthan. Therapeutic use
  • the inventors have shown that the dendrimers according to the invention have, in addition to an anti-inflammatory effect, an anti-proliferative effect on the keratinocytes.
  • the formulation of dendrimers in vesicles according to the invention allows the active principle to cross the stratum corneum and to reach the region of proliferation of keratinocytes in the deep epidermis.
  • the present patent application relates to the vesicle or the pharmaceutical composition of the invention as described above for its use for the treatment or prevention of dermatosis linked to hyperproliferation of keratinocytes and / or to a context inflammatory, preferably psoriasis, dermatitis such as atopic dermatitis, contact dermatitis, seborrheic dermatitis or ichthyosis, such as erythematous ichthyosis (rare diseases) such as Peeling Skin Syndrom (PSS) type 1 or 6 or congenital ichthyosiform erythroderma, squamous cell carcinoma, basal or squamous cell carcinoma or acne.
  • a context inflammatory preferably psoriasis, dermatitis such as atopic dermatitis, contact dermatitis, seborrheic dermatitis or ichthyosis, such as erythematous ichthyosis (rare diseases)
  • the present patent application relates to the vesicle or the pharmaceutical composition of the invention as described above for its use for the treatment or prevention of dermatosis linked to hyperproliferation of keratinocytes and to a inflammatory context, preferably dermatitis such as atopic dermatitis, contact dermatitis, seborrheic dermatitis or ichthyosis, such as erythematous ichthyosis (rare diseases) such as Peeling Skin Syndrom (PSS) type 1 or 6 or Congenital ichthyosiform erythroderma. Dermatitis corresponds to irritation of the skin. Dermatitis is a common condition and comes in many forms.
  • dermatitis such as atopic dermatitis, contact dermatitis, seborrheic dermatitis or ichthyosis, such as erythematous ichthyosis (rare diseases) such as Peeling Skin Syndrom (PSS) type 1 or 6 or Congenital ich
  • the vesicle or the pharmaceutical composition of the invention as described above is particularly useful for treating atopic dermatitis, contact dermatitis and seborrheic dermatitis.
  • Atopic dermatitis also called atopic eczema, is a chronic inflammatory disease of the skin. It develops preferentially in infants and children, but can persist or even appear sometimes in adolescents and adults. It is characterized by skin dryness associated with eczema-like lesions (redness and itching, blisters, oozing and scabs) which develop in flare-ups.
  • Atopic dermatitis is a chronic inflammatory disease of the skin.
  • Contact dermatitis designates a skin reaction resulting from exposure to allergenic (allergic contact dermatitis) or irritant (irritant dermatitis) substances.
  • the skin reaction usually develops a few minutes to a few hours after exposure to the substance and can last for two to four weeks.
  • Seborrheic dermatitis typically affects the scalp and causes scaly patches, red skin, and stubborn dandruff. It can also affect fatty areas of the body, such as the face, upper chest and back. Seborrheic dermatitis can be a long-lasting condition, with periods of improvement and then seasonal flare-ups. In infants, this condition is called "cradle cap”.
  • the vesicle or the pharmaceutical composition of the invention as described above is particularly useful also for treating ichthyosis, preferably erythematous ichthyosis such as "Peeling Skin Syndrom (PSS))" type 1 or 6 or congenital ichthyosiform erythroderma.
  • ichthyosis preferably erythematous ichthyosis such as "Peeling Skin Syndrom (PSS))" type 1 or 6 or congenital ichthyosiform erythroderma.
  • Ichthyosis is a congenital disease of the skin which is characterized by extremely dry, rough skin, by the presence of an excessive amount of fine scales with a free edge, sometimes arranged like fish scales which are continuously detached.
  • Erythematous ichthyosis is an ichthyosis presenting a dermatological lesion characterized by congestive redness of the skin, diffuse or localized, disappearing with vitopression.
  • Type 1 or 6 skin syndrome peels are inflammatory forms of ichthyosis characterized by diffuse and superficial desquamation of the entire skin surface with underlying erythroderma, pruritus and atopy.
  • Congenital ichthyosiform erythroderma is characterized by the presence from birth of fine grayish-white scales of different sizes, associated with erythroderma. Some newborns are wrapped in a soft collodion wrap (tight, shiny, and translucent) and develop scaly erythroderma after peeling.
  • a subject of the present patent application is also the vesicle or the pharmaceutical composition as described above for its use for the treatment or prevention of dermatosis linked to hyperproliferation of keratinocytes, such as basal or spinoid carcinomas. - cellular.
  • Basal cell carcinoma is a type of skin cancer that begins in the basal cells. Basal cell carcinoma often appears as a slightly transparent lump on the skin, although it can take other forms. Basal cell carcinoma most often appears on areas of the skin that are exposed to the sun, such as the head and neck.
  • Squamous cell carcinoma is a common form of skin cancer which develops in the squamous cells which make up the middle and outer layers of the skin. Squamous cell carcinoma most commonly occurs on skin exposed to the sun, such as the scalp, the backs of the hands, ears, or lips.
  • a subject of the present application is also the vesicle or the pharmaceutical composition of the invention as described above for its use for the treatment or prevention of dermatosis linked to an inflammatory context such as acne.
  • Acne is a common and chronic dermatological disease of the pilosebaceous system (which comprises the hair follicle, the hair shaft and the sebaceous gland secreting sebum, at the root of the hair). It usually occurs in adolescence and is linked to hypersecretion of sebum (hyperseborrhea) and keratinization abnormalities leading to obstruction of the excretory duct of the pilosebaceous follicle, and the formation of comedones.
  • the present patent application also relates to the vesicle or the pharmaceutical composition as described above for its use for the treatment of psoriasis in a subject who needs it.
  • Psoriasis is a dermatosis linked to hyperproliferation of keratinocytes, cells constituting 90% of the epidermis, and to a chronic inflammatory context.
  • keratinocytes play a role, alongside immune cells of the skin and infiltrating immune cells.
  • the hyperproliferation of the keratinocytes is accompanied by a defect of differentiation when they reach the most superficial layer of the epidermis, the stratum corneum, hence the desquamation plaques characteristic of the disease.
  • the different layers of the epidermis are renewed in 3 to 4 days, compared to 3 weeks for normal skin.
  • the vesicle or the pharmaceutical composition according to the application is particularly useful for the treatment of psoriasis.
  • psoriasis is meant a chronic inflammatory disease of the skin inducing abnormal renewal of the skin causing thick red patches covered with scales.
  • psoriasis is meant all forms of psoriasis, including plaque psoriasis, guttate psoriasis, psoriasis in infants, pustular psoriasis, erythrodermic psoriasis, reverse psoriasis, psoriasis of the face, scalp, skin. mucous membrane nail.
  • Plaque psoriasis or vulgar psoriasis, is the most common form affecting more than 80% of patients and is characterized by raised red patches with white scales on the surface.
  • Guttate psoriasis which affects nearly 10% of patients, is characterized by lesions multiple teardrop-shaped with few scales.
  • Pustular psoriasis is the most serious form of psoriasis in which the plaques are covered with white, non-infectious pustules.
  • Erythrodermic psoriasis is a generalized inflammation with scales in which 90 to 100% of the skin is affected.
  • Reverse psoriasis is characterized by the presence of non-scaly plaques inside the joints and folds.
  • subject refers to an animal, more particularly a mammal.
  • the subject is a human.
  • a subject may be a patient, namely a person receiving medical care, undergoing or having undergone medical treatment, or being monitored for the development of a disease.
  • treat refers both to a therapeutic treatment and to prophylactic or preventive measures, in which the objective is to prevent or slow down (decrease) the targeted pathological condition, in particular proliferation of keratinocytes and inflammation of the skin.
  • the objective is to reduce the surface area of the affected skin, to reduce the degree of redness of the lesions, their thickness and the intensity of the scaling.
  • the vesicle or the composition as described above for its use as a medicament in particular for the treatment or prevention of dermatosis linked to hyperproliferation of keratinocytes and / or to an inflammatory context, preferably for Psoriasis treatment are characterized in that they are formulated for topical application.
  • the present invention relates to a method of treatment or prevention of a dermatosis linked to hyperproliferation of keratinocytes and / or to an inflammatory context in a subject who needs it, comprising the administration.
  • a therapeutically effective dose of a vesicle or a pharmaceutical composition according to the invention to a subject, a therapeutically effective dose of a vesicle or a pharmaceutical composition according to the invention.
  • the subject is an animal, preferably a mammal, more preferably a human suffering from a dermatosis linked to hyperproliferation of keratinocytes and / or to an inflammatory context.
  • the present invention also relates to the use of a vesicle or a pharmaceutical composition as described above for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of dermatosis linked to hyperproliferation of keratinocytes and / or to an inflammatory context.
  • the present patent application also relates to a method of treating psoriasis in a subject in need thereof comprising the administration of a therapeutically effective dose of the vesicle or of the composition as described above in said subject.
  • the present application relates to a method of treating psoriasis in a subject in need thereof comprising the topical administration of a therapeutically effective dose of the vesicle or the pharmaceutical composition as described above in said subject.
  • the present invention also relates to the use of a vesicle or a pharmaceutical composition as described above for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of psoriasis.
  • terapéuticaally effective dose refers to the dose of therapeutic agent necessary and sufficient to slow down or stop the progression, worsening or deterioration of one or more symptoms of a dermatosis linked to hyperproliferation.
  • keratinocytes and / or an inflammatory context as described above preferably psoriasis disease, for example reducing the area of the affected skin, reducing the degree of redness of the lesions, their thickness and the intensity of the scaling.
  • the vesicle or a pharmaceutical composition as described above can be used as a medicament in particular for the treatment or prevention of dermatosis linked to hyperproliferation of keratinocytes and / or to an inflammatory context such as as described above, preferably psoriasis in a subject in combination with at least one other therapeutic agent.
  • additional therapeutic agents include, but are not limited to anti-inflammatory agents, anti-infective agents or immunosuppressive agents.
  • the gallbladder and the additional therapeutic agent can be administered by at the same time or at different times, simultaneously or separately.
  • the treatment methods and pharmaceutical compositions of the present invention can use the vesicle of the invention in the form of monotherapy, but these methods and compositions can also be used in the form of combination therapy in which the vesicles of the invention are co-administered in combination with one or more other therapeutic agents
  • the reactor After three purges at 20 bars of hydrogen, the reactor is filled with hydrogen at 22 bars then separated from the hydrogen bottle and placed in a sand bath thermostated at 60 ° C, so as to have a temperature of about 50 ° C in the reactor.
  • the reaction medium is thus left under magnetic stirring for 3 days.
  • the reaction medium is returned to atmospheric pressure.
  • filtration of the reaction medium is carried out on Celite using a filter of porosity 5.
  • the reaction medium heated to 50 ° C. is deposited, then washed with 200 ml_ of ultrapure water / methanol solution (1: 1) at 50 ° C.
  • the filtrate is then dried in a rotary evaporator. When only water remains, it is removed by lyophilization.
  • the latter is washed successively with 15mL of ultrapure water, 15mL of tetrahydrofuran (THF), 4x15mL of acetone, 15mL of ultrapure water, 15mL of tetrahydrofuran, 4x15mL of acetone and 15mL of tetrahydrofuran.
  • the washes are all carried out using a frit of porosity 4.
  • the ABP dendrimer was synthesized according to the protocol described in Poupot et al. FASEB J. 2006, 20 (13) 2339-51.
  • the G1-A dendrimer was synthesized according to the protocol described in Poupot et al. FASEB J. 2006, 20 (13) 2339-51.
  • reaction medium is lyophilized, the crude residue is dissolved in 50 mL of dichloromethane (DCM) then washed with water (3 x 25 mL). The organic phase is dried and concentrated under reduced pressure. The residue is purified on a silica column (eluent: hexane / AcOEt, 60/40) to give product b with a yield of 85% in the form of a transparent oil.
  • DCM dichloromethane
  • the G1-B dendrimer is synthesized according to the reaction scheme presented in scheme 3:
  • the compound 1-G "' 0 -HCl (300 mg) is dissolved in 25 ml of distilled water to which is added 25 ml of a solution of NaOH (2M). The aqueous phase is then extracted 3 times with 200 mL of CH 2 Cl 2. The organic phase is then dried with Na 2 SO 4, filtered and concentrated under vacuum to give the dendrimer 1-G "' 0 in the form of a transparent oil with a yield of 80%.
  • the compound G1-B is not sufficiently soluble in water to be analyzed by NMR, it is converted into sodium mono salt according to the following procedure:
  • the compound is then converted into a sodium salt for analysis.
  • To a suspension of the phosphonic acid compound in water with stirring are added 24 equivalents of an aqueous solution of 0.1 M NaOH.
  • the resulting solution is filtered through a 0.4 ⁇ M microfilter and then lyophilized to give the expected compound in the form of a white powder with a yield of 90%.
  • the formulation of the dendrimer is obtained by mixing in water the catanionic surfactant TriCat-n and the dendrimeric acid precursor G1-X [Fig. 1],
  • TriCat8 The formula of TriCat8 is as follows: [0277] [Chem 43]
  • ABP dendrimer To 5.82 mg of ABP dendrimer, 1.02 mg of N-dodecylamino-1-deoxylactitol (L-Hyd 12) and 0.87 mg of bis-a- (hydroxydodecyl) phosphinic acid are added at temperature ambient 2 ml of ultrapure water. The mixture is vortexed for 5 min then sonicated using an ultrasonic probe for 15 min at power 3 with 30% of active cycles while controlling the temperature at 45 ° C.
  • L-Hyd 12 N-dodecylamino-1-deoxylactitol
  • bis-a- (hydroxydodecyl) phosphinic acid To 5.82 mg of ABP dendrimer, 1.02 mg of N-dodecylamino-1-deoxylactitol (L-Hyd 12) and 0.87 mg of bis-a- (hydroxydodecyl) phosphinic acid are added at temperature ambient 2 ml
  • a 5.21 mg of G1-B dendrimer, 1.16 mg of N-hexadecylamino-1-deoxylactitol (L-Hyd 16) and 0.86 mg of bis-a- (hydroxydodecyl) phosphinic acid are added at room temperature 2 mL of ultrapure water. The mixture is vortexed for 5 min then left under magnetic stirring (500 rpm) at 40 ° C. for 15 minutes then for 24 h at room temperature.
  • the size and size distribution of the vesicles is measured by DLS (dynamic light scattering). Each analysis is carried out on the samples, filtered at 1.2 ⁇ m with a Minisart cellulose acetate filter, placed in plastic tanks (semi-micro polystyrene tanks, Brand). The measurements are carried out on a Malvern Instruments Nano S or Nano ZS device, both equipped with a He-Ne laser that emits a light monochromatic wavelength 633 nm. The scattered intensity is measured at 25.0 ° C ⁇ 0.1 ° C at an angle of 173 °. The result is an average of 4 measurements and was processed by the Contin algorithm.
  • DLS dynamic light scattering
  • the samples are prepared saturated at 1 .10 -2 M in TriCat12. Equimolar amounts of L-Hyd12 and phosphonic acid are dispersed at a concentration of 1 .10 -2 M and of dendrimer at a concentration of 5.10 -4 M in 2 ml of water. The mixture is stirred at 300 rpm for 2 days. Two methods are carried out: the first consists in lyophilizing the medium and then dispersing it in 100 ⁇ L of water followed by the conventional vesicle formation protocol. The second method consists in immediately sonicating 100 ⁇ L of the medium without going through the freeze-drying step. An identical result is obtained by both methods.
  • Another method consists in immediately sonicating the mixture following the conventional protocol without going through the stirring step, similar results are obtained but with this method there is more background noise.
  • the measurements are then carried out on a DSC 1 STARe System device with MultiSTAR® HSS8 sensor.
  • the sample crucible and the reference crucible are placed in the same furnace.
  • the reference is filled with 75 ⁇ L of the solvent while 75 ⁇ L of the solution to be analyzed is placed in the sample crucible.
  • the method developed consists in bringing the sample from 25 to 5 ° C at 5 ° C / min then to make 4 cycles of 5 to 60 ° C at 2 ° C / min.
  • the total amount of G1-X-NIR was determined by measuring the fluorescence intensity (IF) of a sample for which the vesicular structures were broken by adding methanol to the solution. (1mL of methanol for 20 ⁇ L of vesicular solution).
  • IF fluorescence intensity
  • the vesicles were observed by scanning electron microscopy after freeze-fracture (cryoMEB).
  • the apparatus used for the analysis is an ESEM Quanta FEG250 from the company FEI (TRI-Genotoul platform), operating at 5 kV and approximately 1.10 '4 Pa.
  • the solutions are deposited on the sample holder and then solidified in pasty nitrogen (-210 ° C). They are then fractured in a chamber at -140 ° C.
  • the sample then undergoes a sublimation step at -90 ° C. for 5 minutes.
  • the sample then undergoes a 60 s platinum metallization by plasma. It is transferred for observation in the cryogenic chamber of the SEM, maintained at all times at -140 ° C by a flow of nitrogen gas.
  • TriCat12 / dendrimer solutions are stored at 4 ° C. in DLS tanks. When the size is measured, the solution is placed at room temperature for 5 min then the size is measured at 25 ° C. in DLS.
  • a 2% wt xanthan solution in water is prepared: 20 mg of xanthan are added in rain with stirring at 500 rpm in 1 mL of mQ water filtered at 0.2 ⁇ m. The mixture is stirred for 1 hour minimum. Then, an equivolume mixture of Tricat12 / G1-X vesicles and 2% wt xanthan gel is produced. The mixture is left stirring at 500rpm for a minimum of 4 hours.
  • the resulting powder is moistened with a few drops of D20 before analysis by solid NMR (MAS NMR). 12. Evaluation of skin penetration in vitro on Franz cell
  • the Franz type continuous flow cell diffusion method (PermGear®, Standard Franz Cells) is used to study in vitro the cutaneous penetration of the formulation over time without disturbing the system. These experiments were performed on the skin of pig ears which represents a predictive model of human skin penetration, having histological and physiological properties similar to human skin. Samples of pig ear skin were obtained from the slaughterhouse (Arcadie Sud-rium, Montauban), so that the skin tissue was intact. After dissection of the skin from the underlying tissue, the skin is cleaned with water, degreased, depilated and then cut into square pieces of about 2 cm. These skin patches are frozen at -80 ° C for subsequent use.
  • the skins were thawed at room temperature and placed on the Franz cells in the donor compartment so that the face bathed in the receiving liquid corresponds to the internal face of the skin while the face which is in contact with air is that of the stratum corneum.
  • a fluorescent dendrimer analog is used with near infrared emission (G1-X-NIR), for skin penetration and retention studies in vitro.
  • a dose 300 ⁇ l) of PBS (white), G1-X-NIR alone or formulated in TriCat12 / G1-X-NIR vesicles was deposited on the face of the stratum corneum, using a micropipette, to cover the area. diffusion surface of 1.77 cm 2 for 24 h. The outer surface of the cell was covered with parafilm to prevent evaporation and changes in volume.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the skin is rinsed with PBS in order to remove the rest of the deposit and dried with absorbent paper.
  • the treatment area is then cut into small pieces in a pill container with 3 mL of PBS and homogenized using a disperser (Ultra-Turrax Ika®- Werke, T 25 Basic) for 5 min at 21,500 rpm.
  • Confocal microscopy is chosen to assess the depth of penetration of G1-X-NIR into the different layers of the skin (stratum corneum, viable epidermis and the dermis).
  • the first step is the diffusion of G1 - X-NIR on Franz cell, according to the protocol described above.
  • the skin is gently rinsed with PBS and dried.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PANBiotech GmbFI Pancoll's solution
  • monocytes are isolated by negative selection with antibodies directed against all blood cells (T cells, B cells, NK cells, dendritic cells, erythrocytes and granulocytes) except monocytes using the Dynabeads® Untouched kit TM Fluman Monocytes (Invitrogen). The purity of the monocytes was verified, by flow cytometry, greater than 90% for each donor with anti-CD14-APC-Cy7 antibody (Miltenyi Biotec).
  • the freshly purified monocytes were resuspended in a 48-well plate at 1 million per ml in RPMI 1640 + GLUTAMAX, penicillin and streptomycin at 100 U / ml and 10% fetal calf serum (FCS). All the molecules were added at the start of the cultures at a concentration of 20 ⁇ M of G1-X except the TriCat12 alone at a concentration of 40 ⁇ M.
  • FCS fetal calf serum
  • mice 8-week-old Balb / c female mice, weighing approximately 20 g, were used during these experiments.
  • the experimental procedures have been evaluated and approved by the Ethics Committee in Animal Experimentation.
  • the gestures and experimental procedures are performed under gas anesthesia, performed in an anesthesia station by inhalation of 4% isoflurane in the induction box and then 3% with a mask. After a week of acclimatization, the backs of the mice are shaved on D-1, over an area of about 4 cm 2 using a trimmer, and the residual hairs are removed using a cream depilatory.
  • mice On D7, 5 hours after the last treatment, the mice are euthanized.
  • the severity of the inflammation of the skin of the back of the mice was assessed using a clinical score based on the Psoriasis Area Severity Index (PASI) score.
  • PASI Psoriasis Area Severity Index
  • Back thickness was measured using a caliper.
  • a total clinical score combining these three clinical criteria was then calculated (scale from 0 to 12).
  • HE staining is carried out on 5 ⁇ m sections of dewaxed skin. The images are obtained using a slide scanner (Panoramic slide scanner 250, 40x objective). The severity of the inflammation, histologically, was assessed based on the following histopathologic features of psoriasis: acanthosis, spongiosis, hyperkeratosis, parakeratosis and immune infiltrate. For each of these five criteria, a score ranging from 0 (normal) to 4 (severe) was assigned, then the scores were cumulated to give the total histological score (scale from 0 to 20).
  • the expression of the proliferation marker Ki67 was studied by immunohistochemistry after treatment or not (control) with 20 ⁇ M of G1-A or of G1-B for 24, 48 or 72 hours.
  • Two types of keratinocytes were studied: the human line N-TERT and primary human keratinocytes. Following treatment with the dendrimers, the cells are washed, fixed in para-formaldehyde (PFA) and permeabilized with triton.
  • PFA para-formaldehyde
  • the fixed cells are incubated with a rabbit primary antibody directed against Ki67, then washed and incubated with an anti-rabbit secondary antibody coupled to the Alexa Fluor 488 fluorochrome.
  • the nuclei of the cells are labeled with 4 ', 6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI).
  • DAPI 6-diamidino- 2-phenylindole
  • the keratinocytes were then observed with a wide-field fluorescence microscope. For each observation zone, two images are acquired: one with the ultraviolet laser to observe the marking of the nuclei with DAPI; one with the green laser to observe the marking of Ki67. These images are processed with ImageJ software. On the image corresponding to the DAPI marking, the nuclei are counted in order to obtain the total number of cells per image. On the image corresponding to labeling of Ki67, the nuclei positive for Ki67 are counted in order to obtain the number of cells which are proliferating, and to calculate the percentage of prolife
  • the process for preparing the TriCat12 / ABP formulation makes it possible to obtain vesicles whose average diameter is around 250-300 nm with a bilayer transition temperature of 37 ° C [Fig. 2],
  • the process for preparing the TriCat12 / ABP formulation is capable of encapsulating on average between 25% of the dendrimer initially used in the formulation.
  • the separation of the non-encapsulated dendrimer is difficult to access with the techniques known to those skilled in the art.
  • the Zeta potential is -55 ⁇ 4 mV and the pH of the solution ⁇ 6.5.
  • the process for preparing the formulation involving a precursor, the dendrimer in its phosphonic acid form makes it possible to increase its capacity for insertion into the hydrophobic part of the vesicles and thus to obtain an average degree of encapsulation of 75 % and simply separate the non-encapsulated active by filtration.
  • the formulation of the G1-A dendrimer by TriCat-12 gives rise to the formation of vesicles, the average diameter of which is around 100-350 nm [Fig. 4].
  • the TriCat 12 / G1-A formulation has a phase transition temperature of 33 ° C. Below 33 ° C, the membrane bilayer of the vesicle is rigid and stable. Above 33 ° C (the skin temperature oscillating between 30 and 35 ° C), this membrane becomes fluid and its bio-addressing properties are increased (diffusion in the tissues, fusion with the cells, release of the active ingredients) [Fig. 5].
  • the Zeta potential is -53 ⁇ 2.5 mV and the pH of the solution ⁇ 2.8.
  • the formulation of the G1-A-NIR dendrimer by TriCat-12 gives rise to the formation of vesicles, the mean diameter of which is around 100-350 nm.
  • the pH of the solution is ⁇ 2.8.
  • the TriCat 12 / G1-A-NIR formulation is stable for at least 1 month when stored at 4 ° C in solution.
  • the TriCat 12 / G1-A formulation is stable for more than two months when stored at 4 ° C in solution [Fig. 6].
  • the Franz type continuous flow cell diffusion method is used to study in vitro the cutaneous penetration of the formulation over time. These experiments were carried out on pig ear skins, which have histological and physiological properties similar to those of human skin. These experiments show that after 24 hours, the amount of dendrimer which has penetrated the skin is significantly greater when it is formulated [Fig. 8]).
  • a change in morphology (increase in granulosity and size) reflects activation of primary human monocytes.
  • the results show that the TriCat12 vesicles alone do not modify the morphology of human monocytes, while the TriCat12 vesicles loaded with the G1-A dendrimer cause an increase in granulosity and size.
  • nearly half of the cells are in the ellipse of activated monocytes [Fig. 11],
  • mice control: untreated IMQ mice, IMQ mice treated with 13 mg / kg of free G1-A dendrimer, and mice treated with 13 mg / kg of G1 dendrimer -A formulated in TriCat12 vesicles
  • mice show a decrease in the clinical score in the 2 treated groups.
  • the mean clinical score is 9.5 on D7.
  • the clinical score was reduced to 6.5 and 5.7 for the free G1-A dendrimer and TriCat12 / G1-A formulated dendrimer groups, respectively [Fig. 12, top graph],
  • the mean histological score is also reduced from 16.5 for the untreated control mice to 14.5 and 10.4 for the free G1-A dendrimer and TriCat12 / G1-A dendrimer groups, respectively [Fig. 12, bottom graph].
  • FIG. 13 shows the antiproliferative effect of compound G1-A, as a function of the treatment time, on the N-TERT keratinocyte line (top graphs) and on primary human keratinocytes (bottom graphs). A decrease in total cell number and percentage of proliferative cells is observed [Fig. 13].
  • the Zeta Potential is -41 ⁇ 2.6 mV and the pH of the solution ⁇ 2.7
  • the membrane bilayer of the formulations is rigid and very stable. Above 33 ° C (the temperature of the skin oscillating between 30 and 35 ° C), this membrane becomes fluid and its bio-addressing properties are increased (diffusion in the tissues, fusion with the cells, release of the active ingredients ) [Fig. 15].
  • the formulations are stable (in terms of diameter and quantity (represented by the diffused intensity DCR)) for more than two months when they are stored at 4 ° C. in solution [Fig. 16].
  • TriCat 12 / G1-B vesicles in a xanthan gel For the formulation of the TriCat 12 / G1-B vesicles in a xanthan gel, no significant modification of the transmission through the sample is observed over the entire height of the sample after 24 h, whereas for the TriCat vesicles 12 / G1-B stored in water transmission increases at the top of the volume showing clarification of the solution due to slight sedimentation of the vesicles.
  • the pharmaceutical formulation of the vesicles in the xanthan gel thus allows better storage at room temperature.
  • the Franz type continuous flow cell diffusion method is used to study the in vitro skin penetration of the formulation over time. These experiments were carried out on pig ear skins, which have histological and physiological properties similar to those of human skin. These experiments show that after 24 h, the amount of G1-B-NIR dendrimer which has penetrated the skin is significantly greater when it is formulated in the TriCat 12 / G1-B-NIR vesicles [Fig. 19]).
  • a change in morphology (increase in granulosity and size) reflects activation of primary human monocytes.
  • the results show that TriCat12 vesicles alone do not modify the morphology of human monocytes [Fig. 11], whereas the TriCat12 vesicles loaded with the G1-B dendrimer cause an increase in granulosity and size.
  • nearly 2/3 of the cells are in the ellipse of activated monocytes [Fig. 22],
  • the mean histological score is also reduced from 14.8 for the untreated control mice to 12.4 and 10.8 for the free G1-B dendrimer and TriCat12 / G1-B dendrimer groups, respectively [Fig. 23, bottom graph].
  • FIG. 24 shows the antiproliferative effect of compound G1-B, as a function of the treatment time, on the N-TERT keratinocyte line (top graphs) and on primary human keratinocytes (bottom graphs). A decrease in the total number of cells and the percentage of proliferative cells is observed.
  • the membrane bilayer of the formulations is rigid and very stable. Above 34 ° C (the temperature of the skin oscillating between 30 and 35 ° C), this membrane becomes fluid and its bio-addressing properties are increased (diffusion in the tissues, fusion with the cells, release of the active ingredients ) [Fig. 26].
  • the formulations are stable (in terms of diameter) for more than a month when they are stored at 4 ° C. in solution [Fig. 27],
  • a change in morphology (increase in granulosity and size) reflects activation of primary human monocytes.
  • the results show that the G1-C dendrimer at 20 ⁇ M causes an increase in granulosity and in size. Furthermore, we note that nearly half of the cells are in the ellipse of activated monocytes [Fig. 29]
  • TriCat-16 / G1 B formulations are stable (in terms of diameter) for more than 10 days when they are stored at 4 ° C in solution [Fig. 32],

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Abstract

La présente invention a pour objet des vésicules de tensioactifs catanioniques dérivés de sucre comprenant des dendrimères anti-inflammatoires et leur utilisation en tant que médicament, plus particulièrement dans le traitement du psoriasis.

Description

Description
Titre : Formulation d'un dendrimère anti-inflammatoire pour le traitement du psoriasis
Domaine technique
[0001] La présente invention a pour objet des vésicules de tensioactifs catanioniques dérivés de sucre comprenant des dendrimères antiinflammatoires et leur utilisation en tant que médicament, plus particulièrement dans le traitement du psoriasis.
Technique antérieure
[0002] Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui est la conséquence d'un renouvellement accéléré de l'épiderme entretenu par l'inflammation et qui se manifeste par l'apparition de plaques rouges recouvertes de pellicules blanches qui se détachent de la peau (squames). Cette maladie qui affecte plus de 125 millions de personnes dans le monde et a un fort impact sur la qualité de vie des personnes atteintes. Aucun traitement ne permet aujourd'hui de soigner le psoriasis et les causes de cette maladie sont multiples et encore mal connues.
[0003] Des traitements permettant d'atténuer les symptômes ont toutefois été développés tels que l'application topique de corticostéroïde ou de vitamine D. Ces traitements permettent de soulager les symptômes légers du psoriasis mais ne sont que peu efficaces pour le traitement des formes les plus sévères. Les formes les plus sévères sont traitées par administration orale d'immunosuppresseurs tels que la cyclosporine, mais ces derniers entraînent d'important effets secondaires. Des anticorps monoclonaux et récepteurs solubles ciblant les médiateurs pro-inflammatoires tels que le TNF, l'IL-12, IL-23 et l'IL-17 ont été proposés. Ces médicaments biologiques ont un coût élevé et voient leur efficacité diminuer au cours du temps. Ils sont également contre- indiqués dans le cas de certaines co-morbidités associées au psoriasis. [0004] Il reste donc un besoin de développer de nouveaux traitements pour le traitement du psoriasis pour une application par voie topique limitant ainsi les effets secondaires.
[0005] Les dendrimères sont des macromolécules constituées de monomères combinés ensemble pour former une architecture tridimensionnelle multibranchée à structure définie. Les dendrimères ont une taille et une structure parfaitement définies grâce à leur synthèse itérative. Leur multivalence en fait des nano-objets très attractifs pour de nombreuses applications, notamment en biologie et en médecine.
[0006] En particulier, les dendrimères phosphorés à surface Azabisphosphonate (dendrimère ABP) sont capables d'activer des monocytes et d'induire une réponse anti-inflammatoire (WO2010/013086, Portevin D. et al. J Transi Med. 2009 ; 7 :82). Plus particulièrement, les propriétés anti-inflammatoires ont été validées dans des modèles animaux de polyarthrite rhumatoïde dans laquelle les monocytes sont connus pour jouer un rôle primordial dans l'inflammation et l'ostéoclastogénèse (Hayder M. et al. 2011 ; Sci Trans Med. 3(81)). L'effet antiinflammatoire du dendrimère ABP a également été validé dans des modèles de l'uvéite (Fruchon et al. 2013. Molecules;18(8):9305-16) et de scléroses en plaque (Hayder M. Biomacromolecules 2015 ; 16, 3425-3433). En revanche, l'effet potentiel de ces dendrimères dans le traitement du psoriasis a seulement été suggéré dans la demande internationale WO2010/013086.
Résumé
[0007] Le traitement d'une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes et/ou à un contexte inflammatoire, telle que le psoriasis, par voie cutanée nécessite le franchissement du stratum corneum qui assure à lui seul la fonction de barrière de la peau ce qui rend son franchissement par des principes actifs très complexe. Ainsi, pour traiter le psoriasis par voie cutanée, il est nécessaire d'améliorer la pénétration des substances actives dans la peau.
[0008] Pour permettre une meilleure pénétration cutanée des dendrimères, les inventeurs ont formulé les dendrimères aza-bisphosphonates avec des tensioactifs catanioniques dérivés de sucre. Les tensioactifs catanioniques dérivés de sucre s'associent spontanément sous forme de vésicules et peuvent encapsuler des principes actifs hydrophobes dans leur bicouche membranaire.
[0009] Alors que les dendrimères ABP hydrophiles présentent un taux d'encapsulation avec les tensioactifs dérivés de sucre faible et une température de transition de la phase « solide-fluide » de la bicouche membranaire de 37°C, les inventeurs ont découvert de manière surprenante que le complexe formé suite à la combinaison de la forme acide phosphonique du dendrimère ABP (ABP-OH) avec un tensioactif dérivé de sucre entraîne une diminution de la température de transition du complexe à 33°C. Ainsi au contact de la peau, ce complexe devient fluide et est donc capable de diffuser plus facilement dans les couches profondes de la peau améliorant aussi son action anti-inflammatoire. De plus, le taux d'encapsulation de ces formes acide phosphonique est plus élevé que celui des dendrimères ABP hydrophiles et les complexes sont stables à un pH proche de celui de la peau.
[0010] Dans un premier aspect, l'invention concerne une vésicule comprenant :
- un tensioactif catanionique de formule (I) ou un mélange de tensioactifs catanioniques de formule générale (I) :
[Chem . 1]
Figure imgf000004_0001
dans laquelle
Figure imgf000004_0002
est un sucre,
R1 est choisi parmi H et une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 20 chaînons,
R2 est une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 20 chaînons,
R3 et R4 sont indépendamment l'un de l'autre une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 19 chaînons ; et - un dendrimère de formule (II) :
[Chem. 2]
Figure imgf000005_0001
(II) dans laquelle
Figure imgf000005_0002
est choisi parmi les pentoses, les hexoses et les groupes de formules suivantes :
Figure imgf000005_0003
et,
Z est choisi parmi -CH2- et -CH=N-,
R est choisi parmi H et C1-C12-alkyle,
A est choisi parmi
Figure imgf000005_0004
où X est choisi parmi S et O, et n est nombre entier compris entre 3 et 8.
[0011] Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins une vésicule selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable. [0012] Selon un autre aspect, l'invention concerne une vésicule selon l'invention ou une composition pharmaceutique selon l'invention pour son utilisation dans le traitement du psoriasis.
[0013] Enfin, l'invention concerne un procédé de préparation d'une vésicule selon l'invention.
Brève description des dessins
Fig. 1
[0014] [Fig. 1] représente un schéma illustrant l'obtention de la formulation bioactive. Fig. 2
[0015] [Fig. 2] montre la température de transition de phase pour la formulation TriCat 12/ABP.
Fig. 3
[0016] [Fig. 3] montre la quantification par fluorescence de la quantité de dendrimère ABP-NIR (dendrimère ABP sous sa forme fluorescente) formulé ou non avec le TriCat 12, qui a pénétré dans la peau d'oreille de cochon (cellules de Franz) après 24h à 40°C.
Fig. 4
[0017] [Fig. 4] montre en a) la distribution de la taille mesurée par DLS des vésicules formées par la formulation TriCat 12/G1-A (1/0,5), b) le cliché de microscopie électronique à balayage des vésicules formées par la formulation TriCat 12/G 1 - A (1/0,5).
Fig. 5
[0018] [Fig. 5] montre la température de transition de phase de la formulation TriCat 12/G1-A.
Fig. 6
[0019] [Fig. 6] montre la mesure du diamètre hydrodynamique moyen et de l'intensité en DLS de la formulation TriCat 12/G1-A sur deux mois à 4°C. Fig.7
[0020] [Fig. 7] montre la mesure du diamètre hydrodynamique moyen et de l'intensité en DLS de la formulation TriCat 12/G1-A sur deux mois à +4°C et - 20°C. Fig. 8
[0021] [Fig. 8] montre la quantification par fluorescence de la quantité de dendrimère G1A-NIR (dendrimère G1A sous sa forme fluorescente) formulé ou non avec le TriCat 12, qui a pénétré dans la peau d'oreille de cochon (cellules de Franz) après 24h à 35°C. Fig. 9
[0022] [Fig. 9] montre l'observation par microscopie confocale de la fluorescence (en blanc) du dendrimère G1-A-NIR non formulé (image de gauche) et formulé avec le T riCat 12 (image de droite) qui a pénétré dans la peau d'oreille de cochon (cellules de Franz) après 24h à 35°C. Fig. 10
[0023] [Fig. 10] montre l'observation par microscopie confocale de la fluorescence (en blanc) du dendrimère G1-A-NIR non formulé (image de gauche) et formulé avec le TriCat 12 (image de droite) qui a pénétré dans la peau humaine (cellules de Franz) après 24h à 35°C. Fig. 11
[0024] [Fig. 11] montre l'analyse par cytométrie de flux de la morphologie (taille et granulosité) des monocytes (sur les graphes, chaque point est une cellule). Le graphe du haut montre les monocytes contrôles non activés. Le graphe du bas à gauche montre les monocytes cultivés en présence des vésicules TriCat 12 seules (pas d'activation). Le graphe du bas de droite montre les monocytes cultivés avec les vésicules TriCat 12 chargées avec le dendrimère G1-A. Les monocytes activés sont dans l'ellipse.
Fig. 12 [0025] [Fig.12] montre l'efficacité thérapeutique du dendrimère G1-A et des vésicules TriCat12 chargées avec le dendrimère G1-A dans le modèle murin de psoriasis induit par l'Imiquimod (IMQ). Les scores cliniques (graphe du haut) sont donnés en fonction du temps exprimé en jours. Les scores histologiques sont donnés sur le graphe du bas. Les souris « contrôle » sont les animaux qui n'ont pas été traités.
Fig. 13
[0026] [Fig. 13] montre l'effet antiprolifératif du composé G1-A, en fonction du temps de traitement, sur la lignée de kératinocytes N-TERT (graphes du haut) et sur des kératinocytes humains primaires (graphes du bas).
Fig. 14
[0027] [Fig. 14] montre en a) la distribution de la taille mesurée par DLS des vésicules formées par la formulation TriCat 12/G1-B (1/0,5), b) cliché de microscopie électronique à balayage des vésicules formées par la formulation TriCat 12/G1 -B (1/0,5).
Fig. 15
[0028] [Fig. 15] montre la température de transition de phase de la formulation TriCat 12/G1-B.
Fig. 16 [0029] [Fig. 16] montre la mesure du diamètre hydrodynamique moyen et de l'intensité en DLS de la formulation TriCat 12/G1-B sur deux mois à 4°C.
Fig. 17
[0030] [Fig. 17] montre le spectre NMR 31 P-{1H} en présence de D20 et après ajustement du pH à pH = 7 du composé G1-B (B) et le spectre MAS NMR 31P- {1H} en présence de D2O et après ajustement du pH à pH = 7 des vésicules
TriCat 12/G1-B dans un gel de xanthane (A) après 3 mois de stockage à pH=4 à 25°C dans l'eau à l'abri de la lumière.
Fig. 18 [0031] [Fig. 18] montre l'évolution de la transmission de la lumière, après 1 jour dans l'eau à température ambiante, à travers un échantillon de TriCat 12/G1-B incorporé (en bas) ou non (en haut) dans un gel de xanthane (stabilisation physique). Fig. 19
[Fig. 19] montre la quantification par fluorescence de la quantité de dendrimère G1- B-NIR (dendrimère G1-B sous sa forme fluorescente) formulé ou non avec le TriCat 12, qui a pénétré dans la peau d'oreille de cochon (cellules de Franz) après 24h à 35°C. Fig. 20
[0032] [Fig. 20] montre l'observation par microscopie confocale de la fluorescence (en blanc) du dendrimère G1-B-NIR (dendrimère G1-B sous sa forme fluorescente) non formulé (A) et formulé avec le TriCat 12 (B) qui a pénétré dans la peau d'oreille de cochon (cellules de Franz) après 24h à 35°C. Fig. 21
[0033] [Fig. 21] montre l'observation par microscopie confocale de la fluorescence (en blanc) du dendrimère G1-B-NIR (dendrimère G1-B sous sa forme fluorescente) non formulé (A) et formulé avec le TriCat 12 + xanthane 1% (B) qui a pénétré dans la peau d'oreille de cochon (cellules de Franz) après 24h à 35°C.
Fig. 22
[0034] [Fig. 22] montre l'analyse par cytométrie de flux de la morphologie (taille et granulosité) des monocytes (sur les graphes, chaque point est une cellule). Le graphe du haut montre les monocytes contrôles non activés. Le graphe du bas montre les monocytes cultivés en présence des vésicules TriCat 12 chargées avec le dendrimère G1-B. Les monocytes activés sont dans l'ellipse.
Fig. 23
[0035] [Fig. 23] montre l'efficacité thérapeutique du dendrimère G1-B et des vésicules TriCat12 chargées avec le dendrimère G1-B dans le modèle murin de psoriasis induit par l'imiquimod. Les scores cliniques (graphe du haut) sont donnés en fonction du temps exprimé en jours. Les scores histologiques sont donnés sur le graphe du bas. Les souris « contrôle » sont les animaux qui n'ont pas été traités. Fig. 24
[0036] [Fig. 24] montre l'effet antiprolifératif du composé G1-B, en fonction du temps de traitement, sur la lignée de kératinocytes N-TERT (graphes du haut) et sur des kératinocytes humains primaires (graphes du bas).
Fig. 25 [0037] [Fig. 25] montre la distribution de la taille mesurée par DLS des vésicules formées par la formulation TriCat 12/G1-C (1/0,5)
Fig. 26
[0038] [Fig. 26] montre la température de transition de phase de la formulation TriCat 12/G1-C Fig. 27
[0039] [Fig. 27] montre la mesure du diamètre hydrodynamique moyen mesuré en DLS de la formulation TriCat 12/G1-C sur un mois à 4°C.
Fig. 28
[0040] [Fig. 28] montre la quantification par fluorescence de la quantité de dendrimère G1C-NIR (dendrimère G1C sous sa forme fluorescente) formulé avec le TriCat 12, qui a pénétré dans la peau d'oreille de cochon (cellules de Franz) après 24h à 35°C.
Fig. 29
[0041] [Fig. 29] montre l'analyse par cytométrie de flux de la morphologie (taille et granulosité) des monocytes (sur les graphes, chaque point est une cellule). Le graphe du haut montre les monocytes contrôles non activés. Les graphes du bas montrent les monocytes cultivés avec le dendrimère G1-C à 3 concentrations 0,2 μM, 2 pM et 20 pM. Les monocytes activés sont dans l'ellipse. Fig. 30
[0042] [Fig. 30] montre la distribution de la taille mesurée par DLS des vésicules formées par la formulation TriCat 8/G1-B (1/0,5)
Fig. 31 [0043] [Fig. 31] montre la distribution de la taille mesurée par DLS des vésicules formées par la formulation TriCat 16/G1-B (1/0,5)
Fig. 32
[Fig. 32] montre la mesure du diamètre hydrodynamique moyen mesuré en DLS de la formulation TriCat 16/G1-B sur 10 jours à 4°C.
Description des modes de réalisation
[0044] Les inventeurs ont montré que la formulation de dendrimères azabisphosphonates sous la forme acide phosphonique avec des tensioactifs catanioniques dérivés de sucre favorise la pénétration du dendrimère dans la peau améliorant ainsi son effet anti-inflammatoire pour le traitement du psoriasis.
[0045] La présente invention concerne ainsi une vésicule comprenant :
- un tensioactif catanionique de formule générale (I) ou un mélange de tensioactifs catanioniques de formule générale (I) :
[Chem. 1]
Figure imgf000011_0001
dans laquelle est un sucre, en particulier
Figure imgf000011_0002
est choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides, les polysaccharides et les polyols, plus particulièrement est un disaccharide ou un polyol, encore plus particulièrement
Figure imgf000012_0001
est le 1-déoxylactilol,
R1 est choisi parmi H et une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 20 chaînons, en particulier R1 est choisi parmi H et C1-C20- alkyle, plus particulièrement, R1 est choisi parmi H et C4-C18-alkyle, plus particulièrement encore R1 est H, et
R2 est une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 20 chaînons, en particulier R2 est C1-C20-alkyle, plus particulièrement R2 est C4-C18-alkyle, plus particulièrement encore R2 est C8-C16-alkyle, toujours plus particulièrement R2 est dodécyle,
R3 et R4 sont indépendamment l'un de l'autre une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 19 chaînons, en particulier R3 et R4 sont indépendamment l'un de l'autre C1-C19-alkyle, plus particulièrement R3 et R4 sont C3-C17-alkyle, plus particulièrement encore R3 et R4 sont C7-C15-alkyle, toujours plus particulièrement R3 et R4 sont undécyle ; et - un dendrimère de formule (II) :
[Chem.2]
Figure imgf000012_0002
dans laquelle
Figure imgf000012_0003
est choisi parmi les pentoses, les hexoses et les groupes de formules suivantes : , et en particulier
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
est choisi parmi les groupes de formules suivantes : et plus
Figure imgf000013_0003
Figure imgf000013_0004
particulièrement est choisi parmi les groupes de formules suivantes : et encore plus particulièrement est
Figure imgf000013_0005
Z est choisi parmi -CH2- et -CH=N-,
R est choisi parmi H et C1 -C12-alkyle, en particulier R est C1 -C12-alkyle, plus particulièrement R est C1-C8-alkyle, plus particulièrement encore R est C1-C4- alkyle, toujours plus particulièrement R est choisi parmi méthyle, n-hexyle et n- octyle ;
A est choisi parmi et , où X est choisi parmi S et O ; en
Figure imgf000013_0006
Figure imgf000013_0007
particulier A est , où X est choisi parmi S et O ; plus particulièrement X est
Figure imgf000014_0001
S, et n est un nombre entier compris entre 3 et 8, en particulier n est égal à 6.
[0046] Par « alkyl(e) », on entend au sens de la présente invention un radical hydrocarbure de formule CnH2n+1 dans lequel n est un nombre entier supérieur ou égal à 1. Les radicaux alkyles peuvent être linéaires ou ramifiées, de préférence linéaires. Des radicaux alkyles particuliers de l'invention sont de 1 à 20 atomes de carbones, plus particulièrement de 1 à 12 atomes de carbones.
[0047] Par « sucre », on entend au sens de la présente invention les monosaccharides, les disaccharides, les polysaccharides, les polyols et leurs dérivés. Les dérivés de sucres incluent notamment les radicaux de type sucre dans lesquels une fonction hydroxyle a été supprimée. Un sucre particulièrement préféré de l'invention est le 1-déoxylactilol.
[0048] Dans un mode de réalisation, la vésicule selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend un seul tensioactif catanionique de formule (I).
[0049] Dans un autre mode de réalisation, la vésicule selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de tensioactifs catanioniques de formule (I), en particulier un mélange de deux tensioactifs catanioniques différents de formule (I). [0050] Selon ce mode de réalisation, le ratio molaire entre les deux tensioactifs catanioniques différents de formule (I) peut être compris entre 99/1 et 1/99.
[0051] Dans un mode de réalisation particulier, la vésicule selon l'invention est caractérisée en ce que, dans le tensioactif catanionique de formule (I),
Figure imgf000014_0002
est le 1-déoxylactilol. [0052] Ainsi, selon ce mode de réalisation, le tensioactif catanionique présente dans la formulation est celui de la formule (la) :
[Chem. 3]
Figure imgf000015_0001
(la) dans laquelle R1, R2, R3 et R4 sont tels que définis dans la formule (I).
[0053] Dans un mode de réalisation, la vésicule selon l'invention est caractérisée en ce que, dans le dendrimère de formule (II),
Figure imgf000015_0003
est
Figure imgf000015_0002
[0054] Ainsi, selon ce mode de réalisation, le dendrimère présent dans la vésicule est celui de la formule (lla) :
[Chem. 4]
Figure imgf000015_0004
(lia) dans laquelle Z, R, X et n sont tels que définis dans la formule (II).
[0055] Selon une variante de ce mode de réalisation, le dendrimère de formule (lia) présent dans la vésicule est celui dans lequel Z est -CH=N-,
[0056] Selon une autre variante de ce mode de réalisation, le dendrimère de formule (lia) présent dans la vésicule est celui dans lequel Z est -CH2-. [0057] Selon une autre variante de ce mode de réalisation, le dendrimère de formule (lia) présent dans la vésicule est celui dans lequel A est
Figure imgf000016_0001
où X est choisi parmi S et O.
[0058] Selon une autre variante de ce mode de réalisation, le dendrimère de formule (lia) présent dans la vésicule est celui dans lequel A est
Figure imgf000016_0002
[0059] Avantageusement, le ratio molaire tensioactif catanionique/dendrimère dans la vésicule selon l'invention est compris entre 50/1 et 1/1, en particulier entre 30/1 et 1/1, plus particulièrement entre 20/1 et 1/1, encore plus particulièrement entre 10/1 et 1/1, toujours plus particulièrement entre 5/1 et 1/1. De manière tout à fait particulière, le ratio molaire tensioactif catanionique/dendrimère dans la vésicule selon l'invention est d'environ 2/1.
[0060] La vésicule selon l'invention permet d'encapsuler le dendrimère dans le tensioactif catanionique.
[0061] Avantageusement, le taux d'encapsulation du dendrimère de formule (I) dans le tensioactif catanionique de formule (II) est supérieur à 50%. En particulier, le taux d'encapsulation du dendrimère de formule (I) dans le tensioactif catanionique de formule (II) est compris entre 50% et 95%, plus particulièrement entre 60% et 85%, plus particulièrement encore entre 70% et 80%. [0062] Par « taux d'encapsulation » on entend au sens de la présente invention le ratio entre le nombre de mole de dendrimère stabilisé dans le tensioactif catanionique sur le nombre de mole de dendrimère initialement utilisé pour la préparation de la vésicule. Le taux d'encapsulation peut être déterminé par toutes les méthodes connues de l'homme du métier, en particulier par dosage par spectrophotométrie UV-visible ou par spectroscopie de fluorescence.
[0063] Avantageusement, le diamètre moyen des vésicules selon l'invention est compris entre 50 et 500 nm, en particulier entre 100 et 350 nm. [0064] Le diamètre moyen peut être déterminé par toutes les méthodes connues de l'homme du métier, en particulier par diffusion dynamique de la lumière (DLS), notamment au moyen d'un laser He-Ne émettant une lumière monochromatique d'une longueur d'onde de 633 nm. [0065] Avantageusement, la température de transition de phase des vésicules selon l'invention est comprise entre 30 et 35°C, en particulier est de 33°C.
[0066] Procédé de préparation
[0067] La présente demande concerne aussi un procédé de préparation des vésicules telles que décrites précédemment. [0068] Le tensioactif catanionique de formule (I) présent dans la vésicule selon l'invention est formé par l'association d'un N-alkylaminosucre de formule (G) :
[Chem. 5]
Figure imgf000017_0001
dans laquelle
Figure imgf000017_0002
est un sucre
R1 est choisi parmi H et une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 20 chaînons, en particulier R1 est choisi parmi H et C1-C20- alkyle,
R2 est une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 20 chaînons, en particulier R2 est C1-C20-alkyle ; et d'un acide phosphinique de formule (I”) :
[Chem. 6]
Figure imgf000017_0003
dans laquelle R3 et R4 sont indépendamment l'un de l'autre une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 19 chaînons, en particulier R3 et R4 sont indépendamment l'un de l'autre C1-C19-alkyle.
[0069] Ainsi, le procédé de préparation d'une vésicule selon l'invention comprend successivement les étapes suivantes :
(a) mélange d'un ou plusieurs N-alkylaminosucres de formule (G), en particulier un N-alkylaminosucre de formule (G), d'un acide phosphinique de formule (I”) et du dendrimère de formule (II) tel que défini précédemment ; et
(b) optionnellement, séparation de la vésicule obtenue du dendrimère non- encapsulé.
[0070] Avantageusement, l'étape de mélange est réalisée dans une solution aqueuse, en particulier dans l'eau.
[0071] Avantageusement, le N-alkylaminosucre, l'acide phosphinique et le dendrimère sont mélangés avec un ratio molaire compris entre 100/50/1 et 1/1/1. En particulier, l'étape de mélange est réalisée avec un ratio molaire N- alkylaminosucre/acide phosphinique/dendrimère de 2/2/1.
[0072] Le mélange peut être effectué au moyen de toutes les techniques connues de l'homme du métier, en particulier par agitation magnétique, par agitation vortex et/ou par sonication par ultrasons, plus particulièrement par agitation vortex puis par agitation magnétique ou par sonication par ultrasons.
[0073] L'étape de mélange peut être effectuée à température ambiante ou en chauffant à une température comprise entre la température ambiante et 100°C, en particulier entre 25°C et 75°C, pendant une durée comprise entre 5 minutes et 72 heures, en particulier entre 10 minutes et 48 heures.
[0074] Une fois l'étape de mélange réalisée, la vésicule obtenue peut être ensuite séparée du dendrimère non-encapsulé.
[0075] L'étape de séparation peut être réalisée au moyen de toutes les techniques connues de l'homme du métier, en particulier par filtration.
[0076] Composition pharmaceutique [0077] La présente demande de brevet a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant la vésicule telle que décrite précédemment et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[0078] Le terme « pharmaceutiquement acceptable » se réfère uniquement aux ingrédients d'une composition pharmaceutique compatibles entre eux et non délétères pour le patient. Dans un mode de réalisation, un excipient pharmaceutiquement acceptable ne produit pas d'effet secondaire, allergique ou autre réaction indésirable lorsqu'il est administré à un animal, de préférence un humain. Pour une administration humaine, les préparations doivent satisfaire les critères de stérilité, de pyrogénicité, de sécurité générale et de pureté standards tels que requis par les offices de réglementation, comme par exemple la FDA ou IΈMA.
[0079] En particulier, la composition pharmaceutique telle que décrite précédemment sera destinée à une application topique ou transcutanée.
[0080] La composition pharmaceutique telle que décrite précédemment peut ainsi comprendre un ou des excipients pharmaceutiquement acceptables pour une formulation adaptée à une administration topique.
[0081] Les excipients pharmaceutiquement acceptables peuvent notamment être tout excipient parmi ceux connus de l'homme de l'art en vue d'obtenir une composition pour l'application topique sous forme d'un lait, d'une crème, d'un baume, d'une huile, d'une lotion, d'un gel, d'un gel moussant, d'une pommade, ou d'un spray, de préférence sous forme de gel.
[0082] En particulier, les excipients pharmaceutiques peuvent être des agents gélifiants choisis parmi : les carbomers, les polysaccharides, tels que la gomme de xanthane, la gomme guar, les chitosanes, les carraghénanes, la cellulose et ses dérivés tels que l'hydroxypropylméthylcellulose en particulier ou l'hydroxyéthylcellulose disponible sous le nom de Natrosol ou encore la famille des silicates d'aluminium et de magnésium, la famille des polymères acryliques, la famille des amidons modifiés et les gélifiants de la famille des polyacrylamides. De préférence, l'excipient pharmaceutique comprend un hydroxyéthylcellulose, du chitosane ou du xanthane, de préférence du xanthane. Utilisation thérapeutique
[0083] Dans la présente demande, les inventeurs ont montré que les dendrimères selon l'invention ont en plus d'un effet anti-inflammatoire, un effet anti-prolifératif sur les kératinocytes. La formulation des dendrimères dans des vésicules selon l'invention permet au principe actif de traverser le stratum corneum et d'atteindre la région de prolifération des kératinocytes dans l'épiderme profond.
[0084] La présente demande de brevet a pour objet la vésicule ou la composition pharmaceutique de l'invention telle que décrite précédemment pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes et/ou à un contexte inflammatoire, de préférence le psoriasis, la dermatite telle que la dermatite atopique, la dermatite de contact, la dermatite séborrhéique ou les ichtyoses, telles que les ichtyoses érythémateuses (maladies rares) comme le Peeling Skin Syndrom (PSS) de type 1 ou 6 ou l'érythrodermie ichtyosiforme congénitale, les carcinomes épidermoïdes, carcinomes baso- ou spino-cellulaires ou l'acné.
[0085] En particulier, la présente demande de brevet a pour objet la vésicule ou la composition pharmaceutique de l'invention telle que décrite précédemment pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes et à un contexte inflammatoire, de préférence la dermatite telle que la dermatite atopique, la dermatite de contact, la dermatite séborrhéique ou les ichtyoses, telles que les ichtyoses érythémateuses (maladies rares) comme le Peeling Skin Syndrom (PSS) de type 1 ou 6 ou l'érythrodermie ichtyosiforme congénitale. [0086] La dermatite correspond à une irritation de la peau. La dermatite est une affection courante et se présente sous de nombreuses formes. Elle se manifeste généralement par des démangeaisons, une peau sèche ou une éruption cutanée sur une peau gonflée et rougie. Elle peut également provoquer des cloques, des suintements, des croûtes ou des desquamations. [0087] De préférence, la vésicule ou la composition pharmaceutique de l'invention telle que décrite précédemment est particulièrement utile pour traiter la dermatite atopique, la dermatite de contact et la dermatite séborrhéique.
[0088] La dermatite atopique, aussi appelée eczéma atopique, est une maladie chronique inflammatoire de la peau. Elle se développe préférentiellement chez le nourrisson et l'enfant, mais peut persister voire apparaître parfois chez l'adolescent et l'adulte. Elle est caractérisée par une sécheresse cutanée associée à des lésions de type eczéma (rougeurs et démangeaisons, vésicules, suintement et croûtes) qui évoluent par poussées. La dermatite atopique est une maladie chronique inflammatoire de la peau.
[0089] La dermatite de contact désigne une réaction cutanée résultant de l'exposition à des substances allergènes (dermatite de contact allergique) ou irritantes (dermatite d'irritation). La réaction cutanée se développe en général quelques minutes à quelques heures après l'exposition à la substance et peut durer de deux à quatre semaines.
[0090] La dermatite séborrhéique touche généralement le cuir chevelu et provoque des plaques squameuses, une peau rouge et des pellicules tenaces. Elle peut également atteindre les zones grasses du corps, comme le visage, le haut de la poitrine et le dos. La dermatite séborrhéique peut être une affection de longue durée, avec des périodes d'amélioration puis des poussées saisonnières. Chez les nourrissons, cette affection est appelée "croûte de lait".
[0091] La vésicule ou la composition pharmaceutique de l'invention telle que décrite précédemment est particulièrement utile également pour traiter l'ichtyose, de préférence les ichtyoses érythémateuses telles que le « Peeling Skin Syndrom (PSS)) » de type 1 ou 6 ou l'érythrodermie ichtyosiforme congénitale.
[0092] L'ichtyose est une maladie congénitale de la peau qui se caractérise par une peau extrêmement sèche, rugueuse, par la présence d'une quantité excessive de squames fines à bord libre parfois disposées comme des écailles de poissons qui se détachent continuellement. L'ichtyose érythémateuse est une ichtyose présentant une lésion dermatologique caractérisée par une rougeur congestive de la peau, diffuse ou localisée, s'effaçant à la vitopression. [0093] Le peeling skin syndrome de type 1 ou 6 sont des formes inflammatoires d'ichtyose caractérisées par une desquamation diffuse et superficielle de toute la surface cutanée avec une érythrodermie sous-jacente, un prurit et une atopie.
[0094] L'érythrodermie ichtyosiforme congénitale est caractérisée par la présence dès la naissance de fines squames blanche-grisâtres de différentes tailles, associées à une érythrodermie. Certains nouveau-nés sont enveloppés dans une pellicule de collodion doux (tendue, brillante et translucide) et développant une érythrodermie squameuse après sa desquamation.
[0095] La présente demande de brevet a également pour objet la vésicule ou la composition pharmaceutique telle que décrite précédemment pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes, tels que les carcinomes baso- ou spino- cellulaires.
[0096] Le carcinome basocellulaire est un type de cancer de la peau qui débute dans les cellules basales. Le carcinome basocellulaire apparaît souvent sous la forme d'une bosse légèrement transparente sur la peau, bien qu'il puisse prendre d'autres formes. Le carcinome basocellulaire apparaît le plus souvent sur les zones de la peau qui sont exposées au soleil, comme la tête et le cou.
[0097] Le carcinome spinocellulaire est une forme courante de cancer de la peau qui se développe dans les cellules épidermoïdes qui constituent les couches médianes et externes de la peau. Le carcinome spinocellulaire se produit le plus souvent sur la peau exposée au soleil, comme le cuir chevelu, le dos des mains, les oreilles ou les lèvres.
[0098] La présente demande a également pour objet la vésicule ou la composition pharmaceutique de l'invention telle que décrite précédemment pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d'une dermatose liée à un contexte inflammatoire telle que l'acnée.
[0099] L'acné est une maladie dermatologique courante et chronique du système pilosébacé (qui comprend le follicule pileux, la tige pilaire et la glande sébacée sécrétant le sébum, à la racine du poil). Elle survient généralement à l'adolescence et est liée à l'hypersécrétion de sébum (hyperséborrhée) et à des anomalies de kératinisation aboutissant à l'obstruction du canal excréteur du follicule pilosébacé, et à la formation de comédons.
[0100] De préférence, la présente demande de brevet a également pour objet la vésicule ou la composition pharmaceutique telle que décrite précédemment pour son utilisation pour le traitement du psoriasis chez un sujet qui en a besoin.
[0101] Le psoriasis est une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes, cellules constituant 90% de l'épiderme et à un contexte inflammatoire chronique. Dans cette pathologie, les kératinocytes jouent un rôle, aux côtés des cellules immunitaires de la peau et des cellules immunitaires infiltrantes. L'hyperprolifération des kératinocytes s'accompagne d'un défaut de différenciation lorsqu'ils atteignent la couche la plus superficielle de l'épiderme, le stratum corneum, d'où les plaques de desquamation caractéristiques de la maladie. Dans le psoriasis, le renouvellement des différentes couches de l'épiderme se fait en 3 à 4 jours, contre 3 semaines pour une peau normale. Afin de contrôler l'hyperprolifération et le contexte inflammatoire, il faut donc atteindre ces acteurs cellulaires de la maladie en permettant au principe actif de traverser le stratum corneum qui constitue la barrière étanche de la peau. La formulation des dendrimères dans des vésicules selon l'invention permet au principe actif de traverser le stratum corneum et d'atteindre le site d'hyperprolifération des kératinocytes dans l'épiderme profond. Ainsi, la vésicule ou la composition pharmaceutique selon la demande est particulièrement utile pour le traitement de psoriasis.
[0102] Par « psoriasis », on entend une maladie inflammatoire chronique de la peau induisant le renouvellement anormal de la peau provoquant des plaques rouges épaisses recouvertes de squames. Par psoriasis, on entend toutes les formes de psoriasis, notamment le psoriasis en plaques, le psoriasis en gouttes, le psoriasis chez le nourrisson, le psoriasis pustuleux, le psoriasis érythrodermique, psoriasis inversé, psoriasis du visage, du cuir chevelu, de l'ongle des muqueuses. Le psoriasis en plaque, ou psoriasis vulgaire est la forme la plus commune qui concerne plus de 80% des patients et est caractérisé par des plaques rouges surélevées avec des squames blanches en surface. Le psoriasis en gouttes qui atteint près de 10% des patients se caractérise par des lésions multiples en forme d'une larme avec peu de squames. Le psoriasis pustuleux est la forme de psoriasis la plus grave dans laquelle les plaques sont recouvertes de pustules blanches non infectieuses. Le psoriasis érythrodermique est une inflammation généralisée avec squames dans lequel 90 à 100% de la peau est atteinte. Le psoriasis inversé est caractérisé par la présence de plaques non squameuses à l'intérieur des articulations et des plis.
[0103] Le terme « sujet » fait référence à un animal, plus particulièrement un mammifère. De préférence, le sujet est un être humain. Au sens de la présente invention, un sujet peut être un patient, à savoir une personne recevant des soins médicaux, subissant ou ayant subi un traitement médical, ou surveillée dans le cadre du développement d'une maladie.
[0104] Le terme « traiter » ou « traitement » se réfère à la fois à un traitement thérapeutique et à des mesures prophylactiques ou préventives, dans lesquels l'objectif est de prévenir ou de ralentir (diminuer) la condition pathologique ciblée, en particulier la prolifération des kératinocytes et l'inflammation de la peau. De préférence, dans le cas du traitement du psoriasis l'objectif est de réduire la surface de la peau atteinte, diminuer le degré de rougeur des lésions, leur épaisseur et l'intensité de la désquamation.
[0105] En particulier, la vésicule ou la composition telle que décrite précédemment pour son utilisation comme médicament, en particulier pour le traitement ou la prévention d'une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes et/ou à un contexte inflammatoire, de préférence pour le traitement du psoriasis sont caractérisées en ce qu'elles sont formulées pour une application topique.
[0106] La présente invention, selon un autre de ses aspects, concerne une méthode de traitement ou de prévention d'une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes et/ou à un contexte inflammatoire chez un sujet qui en a besoin comprenant l'administration, à un sujet, d'une dose thérapeutiquement efficace d'une vésicule ou une composition pharmaceutique selon l'invention. De préférence, le sujet est un animal, de préférence un mammifère, plus préférentiellement un humain atteint d'une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes et/ou à un contexte inflammatoire. [0107] La présente invention concerne également l'utilisation d'une vésicule ou une composition pharmaceutique telle que décrite précédemment pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes et/ou à un contexte inflammatoire.
[0108] La présente demande de brevet a également pour objet une méthode de traitement du psoriasis chez un sujet qui en a besoin comprenant l'administration d'une dose thérapeutiquement efficace de la vésicule ou de la composition telle que décrite précédemment chez ledit sujet. En particulier, la présente demande a pour objet une méthode de traitement du psoriasis chez un sujet qui en a besoin comprenant l'administration topique d'une dose thérapeutiquement efficace de la vésicule ou la composition pharmaceutique telle que décrite précédemment chez ledit sujet.
[0109] La présente invention concerne également l'utilisation d'une vésicule ou une composition pharmaceutique telle que décrite précédemment pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention du psoriasis.
[0110] Le terme « dose thérapeutiquement efficace » se réfère à la dose d'agent thérapeutique nécessaire et suffisante pour ralentir ou stopper la progression, l'aggravation ou la détérioration de l'un ou plusieurs symptômes d'une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes et/ou à un contexte inflammatoire telle que décrite précédemment, de préférence de la maladie de psoriasis, par exemple réduire la surface de la peau atteinte, diminuer le degré de rougeur des lésions, leur épaisseur et l'intensité de la désquamation.
[0111] Selon un mode de réalisation, la vésicule ou une composition pharmaceutique telle que décrite précédemment peut être utilisée comme médicament en particulier pour le traitement ou la prévention d'une dermatose liée à une hyperprolifération des kératinocytes et/ou à un contexte inflammatoire telle que décrite précédemment, de préférence le psoriasis chez un sujet en combinaison avec au moins un autre agent thérapeutique. De tels agents thérapeutiques supplémentaires comprennent, sans s'y limiter des agents antiinflammatoires, agents anti-infectieux ou des agents immunosuppresseurs. La vésicule et l'agent thérapeutique supplémentaire peuvent être administrés en même temps ou à des moments différents, simultanément ou de manière séparée.
[0112] Ainsi, les méthodes de traitement et les compositions pharmaceutiques de la présente invention peuvent utiliser la vésicule de l'invention sous forme de monothérapie, mais ces méthodes et compositions peuvent également être utilisées sous forme de polythérapie dans laquelle les vésicules de l'invention sont co-administrés en combinaison avec un ou plusieurs autres agents thérapeutiques
[0113] La présente invention sera mieux comprise à la lumière des exemples et figures non-limitatifs qui suivent.
Exemples
I. Matériel et méthodes
1. Synthèse des composés utilisés G01141 N-dodécylamino-1-déoxylactitol a été synthétisé selon le protocole décrit dans la thèse de Pauline Castagnos (thèse Castagnos, Pauline (2011). Vésicules catanioniques : design et mécanismes de délivrance de principes actifs). 8,75 mmol (soit 3,15g) d'a-lactose sont dissoutes dans 20 ml_ d'eau ultrapure. 14,88 mmol (soit 2,76g) de dodécylamine sont dissoutes dans 25 ml_ de méthanol. 5% massique (par rapport à la masse totale de réactifs) de palladium supporté sur charbon (soit 0,338g) sont placés en suspension dans 10ml_ de méthanol. L'amine, le palladium et enfin le lactose sont placés dans un réacteur fermement vissé.
[0115] Après trois purges sous 20 bars d'hydrogène, le réacteur est rempli d'hydrogène sous 22 bars puis désolidarisé de la bouteille d'hydrogène et placé dans un bain de sable thermostaté à 60°C, de façon à avoir une température d'environ 50°C dans le réacteur. Le milieu réactionnel est ainsi laissé sous agitation magnétique pendant 3 jours. Après refroidissement du réacteur, le milieu réactionnel est remis à pression atmosphérique. [0116] Afin d'éliminer l'excès de palladium, on effectue une filtration sur célite du milieu réactionnel en utilisant un filtre de porosité 5. Après avoir tassé la célite à l'eau ultrapure, le milieu réactionnel chauffé à 50°C y est déposé, puis lavé par 200ml_ de solution d'eau ultrapure/méthanol (1 : 1) à 50°C. Le filtrat est ensuite séché à l'évaporateur rotatif. Lorsqu'il ne reste que de l'eau, celle-ci est éliminée par lyophilisation. Une poudre blanche hygroscopique est récupérée (m=1,62g, R=36%).
[0117] RMN 1H (D20, 300MHZ) : δ (ppm) : 0,81 (m, 3H, CH3) ; 1,48 (m, 20H, CH2 aliphatiques) ; 3,48 à 3,84 (m, 20H, OH, CH et CH2 du sucre) ; 4,42 (d, 1H, H anomérique)
[0118] MS : m/z: 512,4
[0119] FT-IR (KBr) : vmax (cm-1) : 3435 (N-H st (amine secondaire), alcools), 2924 (élongation C-H), 2853 (élongation CH, CH2, CH3), 1638 (élongation N-H), 1466 (déformation angulaire CH2), 1380 (C-H), 1079 (C-N st (amine secondaire)), 720 (N-H δ, présence d'une chaîne aliphatique supérieure à 4C)
[0120] Analyse élémentaire : C : 53,90%, H : 9.68%, N : 2.79%, Pd < 0,02% (Cthéo : 56,34% ; Hthéo : 9,65% ; Nthéo : 2,74%)
[0121] Pureté sur le carbone : 95,7%
G0122Ί L'acide bis-a-(hvdroxydodécyl)phosphinique a été synthétisé selon le protocole décrit dans l'article (Brun, A.; Etemad-Moghadam, G. New double- chain and aromatic (alpha-hydroxyalkyl)phosphorus amphiphiles. Synthesis 2002, 10, 1385-1390.)
[0123] 2,5mmol d'hypophosphite de sodium monohydraté (soit 2,38g) sont agitées en présence de 30mL de 1,4-dioxane. 56mmol de dodécylaldéhyde (soit 10,3g) sont ajoutées, de même que 4mL d'acide chlorhydrique à 37%. Le mélange réactionnel est chauffé à reflux (101°C) pendant 24h. Après son refroidissement, le ballon est passé à l'évaporateur rotatif jusqu'à l'obtention d'une pâte solide brune. Cette dernière est lavée successivement avec 15mL d'eau ultrapure, 15mL de tétrahydrofurane (THF), 4x15mL d'acétone, 15mL d'eau ultrapure, 15mL de tétrahydrofurane, 4x15mL d'acétone et 15mL de tétrahydrofurane. Les lavages sont tous effectués en utilisant un fritté de porosité 4. On obtient une poudre compacte blanche (m=2,00g, R=20,5%).
[0124] RMN 1H (CDCI3 / CD3OD, locké CD3OD, 55°C, 300MHz) : δ (ppm) : 0,85 (t, 6H, CH3); 1 ,25 (m, 36H, CH2 aliphatiques); 1 ,61 (m, 4H, CH2 en a); 1 ,77 (m, 4H, CH2 a); 3,60 (m, 2H de CHOH)
[0125] RMN 13C (CDCIs / CD3OD, locké CD3OD, 55°C, 300MHz) : δ (ppm) : 13,6 (s, CH3) ; 22,4 à 31 ,7 (CH2), entre 60 et 70 (CH)
[0126] RMN 31P (CDCIs / CD3OD, locké CD3OD, 55°C, 300MHz) : δ (ppm) : 45,43 et 46,52 : pics dus à la pseudo-asymétrie du phosphore. Pas de pic vers 30ppm : il ne reste pas de monosubstitué
[0127] MS : 433,3 (M-H)-
[0128] FT-IR (KBr) : vmax (cm-1) : 3313 (C-OH) ; 2918 (C-H) ; 2848 (C-H) ; 2369 (P-OH) ; 1465 (δCH2) ; 1222 (P=0); 1141 (P=0); 1115 (PO-OH); 1067 (P-OH); 960 (P-OH); 941 (P-OH) [0129] Analyse élémentaire : C : 65,67%, H : 9.18% (Cthéo : 66,32% ; Hthéo :
11 ,83%)
[0130] Pureté sur le carbone : 99,0%
Dendrimère ABP
[0131] [Chem 7]
Figure imgf000028_0001
[0132] Le dendrimère ABP a été synthétisé selon le protocole décrit dans Poupot ét al. FASEB J. 2006, 20(13)2339-51.
Dendrimère G1-A [0133] [Chem 8]
Figure imgf000029_0001
[0134] Le dendrimère G1-A a été synthétisé selon le protocole décrit dans Poupot ét al. FASEB J. 2006, 20(13)2339-51.
Dendrimère G1-A-NIR
[0135] Schéma de synthèse [schéma 1]
Figure imgf000030_0001
Synthèse du composé b
[0136] Acide 4-hydroxy-benzenepropanoique (90 mg, 0.54 mmol), 1 -Éthyl-3-(3- diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (90.18 mg, 0.47 mmol), et 1.1 équivalents de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) (48.64 mg, 0.39 mmol) sont ajoutés à une solution d'ADIBO-amine a (100 mg, 0.36 mmol) dans 5 ml_ de L/,/V-diméthylformamide DMF. Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Le milieu réactionnel est lyophilisé, le résidu brut est solubilisé dans 50 mL du dichlorométhane (DCM) puis lavé avec de l'eau (3 x 25 mL). La phase organique est séchée et concentrée sous pression réduite. Le résidu est purifié sur une colonne de silice (éluant : hexane/AcOEt, 60/40) pour donner le produit b avec un rendement de 85% sous forme d'une huile transparente.
[0137] [Chem 9]
Figure imgf000031_0001
[0138] 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ :2.01-1.92 (m, 1 H, CH2-CON), 2.30- 2.23 (m, 2H, C'0 4-CH2-), 2.50-2.50 (m, 2H, CH2-CON), 2.80-2.69 (m, 3H, -CH2-
CO-NH-), 3.25-3.19 (m, 1H, -CH2-NH-CO), 3.39-3.32 (m, 1H, -CH2-NH-CO), 3.72 (d, 2 JHH= 13.9 Hz, 1H, r-CH2-N-CO-), 5.16 (d, 2JHH= 13.9 Hz, 1H, r-CH2-N- CO-), 6.14-6.08 (t, 3JHH = 6.0 Hz, 1 H, CO-NH), 6.71 (d, 2JHH = 8.2 Hz, 4H, C'o3H), 6.95 (d, 3JHH = 8.2 Hz, 4H, C'o2H), 7.17 (br s, 1H, HAr), 7.23-7.27 (m, , 1H, HAr), 7.35 - 7.27 (m, 2H, HAr), 7.49 - 7.35 (m, 4H, HAr), 7.70 (d, 3JHH = 7.6 Hz, 2H,
HAr), 8.04 (s, 1 H, OH) ppm.
[0139] 13C NMR (126 MHz, Chloroform-d) δ : 30.80(-CH2-C0-NH-). 34.75(s, CH2- CON), 35.22(s, -CH2-NH-CO), 38.55 (s, C'0 4-CH2-), 55.63 (-CH2-N-CO), 107.74(s, CºC'), 114.79(s, CºC'), 115.38(s, C'o2), 122.48 (s, Cf), 122.91 (s, Cf'), 125.66 (s, Ce'), 127.27 (s, CHAr), 127.93 (s, CHAr), 128.37 (s, CHAr), 128.53
(s, CHAr), 128.69 (s, CHAr), 129.05 (s, C'o3), 129.29 (s, CHAr), 131.96 (s, C'o4), 132.09 (s, CHAr), 147.91 (s, CAr), 150.88 (s, CAr), 154.81 (s, C'o1), 172.44 (s, CONH) ppm.
Synthèse du composé d [0140] A une solution de composé b (130 mg, 0.30 mmol) dans le THF (30 ml_) avec du CS2CO3 (199 mg, 0.61 mmol) est ajoutée le composé c (465 mg, 0.6 mmol). Après une nuit d'agitation à température ambiante, le mélange est centrifugé, filtré puis concentré sous pression réduite. Le résidu brut est purifié sur une colonne de silice (éluant : DCM/AcOEt, 60/40) pour donner le composé d avec un rendement de 88% sous forme d'une huile transparente. Le composé c peut être préparé selon Rolland, O. et al. (2008) Chemistry - A European Journal, 14: 4836-4850.
[0141] [Chem 10]
Figure imgf000032_0001
[0142] 31P NMR (121 MHz, Chloroform-d) δ : 7.40 (s, P=N).
[0143] 1H NMR (600 MHz, Acetone-d6) δ : 1.96 - 1.88 (m, 1 H, CH2CON). 2.34-2.31 (m, 2H, CH2-CO4), 2.44-2.48 (m, 0.5H, CH2CON), 2.47 - 2.53 (m, 0.5H, CH2CON), 2.82 - 2.79 (m, 2H, CH2CONH), 3.17-3.12 (m, 1H, CH2NH-), 3.26- 3.20 (m, 1 H, CH2NH-), 3.65 (d, 1JHH = 14.0 Hz, 1H, CH2NCO), 5.12 (d, 1JHH =
14.0 Hz, 1 H, CH2NCO), 6.79 (t, 3JHH = 6A HZ, 1H, CONH), 7.01 - 6.97 (m, 2H, C'o2H), 7.13 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, C'o3H), 7.21 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 4H, C0 2H), 7.26 - 7.23 (m, 1 H, CHAr), 7.29 - 7.27 (m, 6H, C0 2H), 7.33 - 7.30 (m, 1 H, HAr), 7.36 - 7.40 (m, 1 H, CHAr), 7.49 - 7.45 (m, 2H, CHAr,), 7.54 - 7.51 (m, 1 H, HAr), 7.67 (d, 3JHH = 7.4 Hz, 1 H, CHAr), 7.85-7.84 (m, 2H, C0 3H), 7.86-7.85 (m, 5H, C0 3H), 7.87- 7.86 (m, 3H, C0 3H), 9.99 (s, 3H, CHO), 10.00 (s, 1H, CHO), 10.01 (s, 1H, CHO).
[0144] 13C NMR (151 MHz, Acetone-d6) δ : 30.43 (s, CH2CONH), 34.52 (s, CH2CON), 35.29 (s, CH2NH-), 37.08 (s, CH2-C04), 54.95 (s, -CH2NCO), 107.98 (s, CºC), 114.35 (s, CºC), 120.59 (s, C'o2H), 121.27 (s, C0 2H), 121.35 (s, C0 2H), 122.15 (s, CAr), 123.05 (s, CAr), 125.17 (s, CHAr), 126.87 (s, CHAr), 127.60 (s, CHAr), 127.92 (s, CHAr), 128.10 (s, CHAr), 128.79 (s, CHAr), 129.46 (s, C'o3H),
131.30 (s, C0 3H), 131.34 (s, C0 3H), 132.51 (s, CHAr), 133.98 (s, CAr), 134.05 (s CHAr), 134.11 (s, CHAr), 139.32 (br s, CAr, C'o4), 148.11 (br s, CAr, C'o1), 148.62(s CAr), 151 .80(s, CAr), 154.46 (br s, Cq, C0 1), 154.65 (br s, Cq, C0 1), 170.64 (s, CON), 170.85 (s, CONH), 190.65 (s, CHO), 190.80 (s, CHO).
Composé e
[0145] A une solution de composé d (300 mg, 0.25 mmpl) dans 10 ml_ de CHCl3 sont ajoutés 7 équivalents de dichlorothiophospho(N-methyl)hydrazide à 0.2 M (8.75 ml_, 1.75 mmol) dans le chloroforme. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. A la fin de la réaction (contrôle par RMN 1 H), le solvant est concentré sous pression réduite. Le résidu obtenu est solubilisé dans 2 mL de THF puis précipité par ajout dans un grand volume de pentane (100 mL). Le solide formé est filtré et séché pour obtenir le composé e avec un rendement de 83% sous forme d'une poudre blanche.
[0146] [Chem 11]
Figure imgf000033_0001
[0147] 31P NMR (243 MHz, Chloroform-d) δ : 8.30 (s, N=P), 62.42 (s, P=S), 62.47 (s, P=S), 62.57(s, P=S). [0148] 1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ : 1 .96-1 .91 (m, 1 H, -CH2CON-), 2.25
(t, 3JHH = 7.8 Hz, 2H, -CH2-C 04), 2.44-2.39 (m, 1 H, CH2CON-), 2.84- 2.76 (m, 2H, -CH2-CONH-), 3.22 - 3.14 (m, 1 H, -CH2-NHCO), 3.37-3.33 (m, 1 H, -CH2-NHCO), 3.50 (d, 3JHP = 13.9, 15H, CHs-NPS), 3.69 (d, 1JHH = 14.0 Hz, 1H, -CH2-NCO), 5.13 (d, 1JHH = 14.0 Hz, 1H, -CH2-NCO), 6.01 (t, 3JHH = 6.2 Hz, 1H, -CONH-), 6.92 (d, 3JHH = 8.1 Hz, 2H, C'o2H), 7.02 - 6.98 (m, 4H, C0 2H, 2H, C'o3H), 7.06 (d, 3JHH = 8.2 Hz, 6H, C0 2H), 7.21 (d, 3JHH = 7.6 Hz, 1 H, HAr), 7.29 (d, 3JHH = 6.1 Hz, 3H, HAT), 7.44 - 7.35 (m, 3H, HAr), 7.61 - 7.58 (m, 3JHH = 8.7 Hz, 10H, C0 3H), 7.64 (s, 4H, -CH=N-), 7.66 (s, 1H, -CHAr), 7.68 (s, 2H, -CH=N-).
[0149] 13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ : 30.76(s, CH2CONH), 31.96 (d, 2JCP = 12.6 Hz, CHs-NPS), 34.72 (s, -CH2CON-), 35.21 (s, -CH2-NH), 37.95 (s, CH2- C' o4), 55.53(s, -CH2NCO), 107.78 (s, CºC), 114.75 (s, Cº C), 120.88 (s, C'o2H), 121.30 (s, C'o3H), 121 ,39(s, C0 2H), 122.48 (s, CAr), 122.90 (s, CAr), 125.59 (s, CHAr), 127.27 (s, CHAr), 127.86 (s, CHAr), 128.33 (s, CHAr), 128.50 (s, CHAr), 128.60 (s, C0 3), 128.66 (s, CHAr), 129.04 (s, CHAr), 129.35 (s, CHAr), 131.14 (s, CHAr), 131.24 (s, CHAr), 131.26 (s, CAr), 132.02 (s, CHAr), 138.03, 140.59, 140.62 (d, 3JCP = 9.3 Hz, C=N), 140.74 (d, 3JCP = 9.4 Hz, C=N), 140.71 (s, CAr), 140.77 (s, CAr), 147.98 (s, CAr), 148.54 (m, C'o1), 150.94 (s, CAr), 151.74 (d, 2JCP = 9.8 Hz, C0 1), 151.89 (br d, C0 1), 171.24(s, CONH), 172.22 (s, CON).
Synthèse du composé f
[0150] A une suspension de composé aminobismethylenephosphonate dérivé de la tyramine préparé selon Rolland et al. (2008), A European Journal, 14: 4836- 4850, (680 mg, 1.78 mmol) dans le THF (15 ml_) et de CS2CO3 (1.15g, 3.56 mmol) est ajouté le composé e (350 mg, 0.18 mmol). Après une nuit d'agitation à température ambiante, les insolubles sont éliminés par centrifugation et le solvant est éliminé par pression réduite. Le dendrimère f est obtenu sous forme d'une huile transparente avec un rendement de 97%. Le composé peut être purifié sur colonne chromatographique.
[0151] [Chem 12]
Figure imgf000035_0001
[0152] 31P NMR (243 MHz, Chloroform-d) δ : 8.33 (s, NP), 26.81 (s, POMe), 63.15 (s, PS), 6312 (s, PS),
[0153] 1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ : 1.86 - 1.90 (m, 1H, CH2CON), 2.18 (t, 3JHH = 7.8 Hz, 2H, CH2-C'o4), 2.37 - 2.41 (m, 1H, CH2CON), 2.74 (t, 3JHH = 7.6 Hz, 20H, C1 4-CH2), 3.03 (t, 3JHH = 7.6 Hz, 20H, CH2-N), 3.17 (d, 2JHP = 9.5 Hz, 40H, CH2-PO ), 3.25 (d, 3JHH = 10.3 Hz, 4H, CH3-N-), 3.25 (d, 3JHP = 10.0 Hz, 6H, CH3-N), 3.30 (d, 3JHP = 10.0 Hz, 5H, CH3-N), 3.71 (d, 3JHP = 10.4 Hz, 120H, POMe), 5.08 (d, 2JHH = 14 Hz, 1H, CH2-Ca'), 6.24 (t, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, CONH), 6.91 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, C'o2H), 6.96 (d, 3JHH = 8.6 Hz, 1H, C'o3H), 7.00 (d, 3JHH = 8.2 Hz, 5H, C0 2H), 7.04 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 3H, C0 2H), 7.10-7.08 (m, 20H, Ci2H), 7.15 (d, 3JHH = 7.9 Hz, 20H, C1 3H), 7.24 (m, 2H, CHAr), 7.35- 7.31 (m, 2H, CHAr), 7.60 (d, 3JHH = 8.9 Hz, 10H, C0 3H), 7.63 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 15H, C0 3H, CH=N).
[0154] 13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) d:31.91 (s, CH2), 32.92 (d, 2JCp = 5.9 Hz, CH3-NPS), 33.01 (br s, C1 4-CH2, CH3-NPS), 34.71 (s, CH2CON), 35.25 (s, CH2-NH), 37.74 (s, CH2-C'O4), 49.44 (d, 1JCp = 157.5 Hz, CH2-PO), 49.49 (d, 1JCp = 157.6 Hz, -CH2-PO), 51.15-53.51 (m, POMe), 55.42 (s, CH2NCO), 58.12 (t, 3JCP = 7.6 Hz, CH2-N), 107.84 (s, CºC), 114.71 (s, CºC), 120.81 (s, C'o2), 121.24-121.18 (m, Ci2, C0 2), 122.36 (s, CHAr), 122.93 (s, CHAr), 125.50 (s, CHAr), 127.17 (s, CHAr), 127.80 (s, CHAr), 128.25-128.22 (m, C0 3), 128.37 (s, CHAr), 128.64 (s, CHAr), 129.02 (s, CHAdibo), 129.35 (s, C'o3), 129.91 (s, C1 3),132.14- 132.07 (m, C0 4), 136.54 (s, C1 4), 136.58 (s, C1 4), 138.01 (s, CAr), 138.72 (d, 3JCP=13.8 Hz, C=N), 148.00 (s, CAr), 148.64 (s, CAr), 148.93 (s, C11), 148.98 (s, C11), 151.00 (s, CAr), 151.25 (br s, C0 1), 171.52 (s, CONH), 171.90 (s, CON). Synthèse du composé NIR
[0155] Ce composé est préparé selon le schéma suivant en adaptant la procédure décrite dans S. A. Klymchenko,; V. G. Pivovarenko; O. Turan; D. P. Alexander New Journal of Chemistry, 27(9), 1336-1343; 2003. [0156] Schéma de synthèse [Schéma 2]
Figure imgf000036_0001
Synthèse du chlorure de 1-(3-azidopropyl)-4-methylquinolinium
[0157] A une solution de iodure de 1-(3-azidopropyl)-4-methylquinolinium (1 g, 2.8 mmol) dans un mélange H2O/MeCN (50/50) est ajoutée une résine basique (DOWEX MARATHON MSA) (3 g). Le mélange réactionnel est agité pendant 3 jours à température ambiante. Le mélange est ensuite filtré, concentré à sec sous pression réduite. Le résidu est solubilisé dans DCM (100 mL), ensuite lavé 2 fois avec H2O (30 mL). La phase organique est récupérée, séchée avec Na2SÜ4, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu brut est rapidement purifié sur une colonne de silice (éluant : DCM/MeOH, 90/10) pour donner un solide noir avec un rendement de 70%.
[0158] [Chem 13]
Figure imgf000037_0001
[0159] 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ : 2.71-2.33 (m, 2H, CH2), 3.05 (s, 3H, Me), 3.82 (t, 3JHH= 6.5 Hz, 2H, CH2-N3), 5.65-5.39 (m, 2H, CH2-N), 8.08 - 7.98 (m, 2H, CHAr), 8.20-8.3 (m, 1 H, CHAr), 8.40 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 1 H, CHAr), 8.56 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 1 H, CHAr), 10.25 (d, 3JHH = 6.0 Hz, 1 H, CHAr).
[0160] 13C NMR (75 MHz, Chloroform-d) δ : 20.70 (s, Me), 29.45 (s, CH2), 48.35 (s, CH2), 54.99 (s, CH2-N), 119.10 (s, CHAr), 123.32(s, CHAr), 126.94 (s, CHAr), 129.51 (s, CAr), 130.13 (s, CHAr), 135.86 (s, CHAr), 137.14 (s, CAr), 148.79 (s, CAr), 158.56 (s, CHAr). Synthèse du composé NIR chlorure de (E)-1-(3-azidopropyl)-4-(2-(6-
(diethylamino)benzofuran-2-yl)vinyl)quinolinium
[0161] A une solution de dorure de 1-(3-azidopropyl)-4-methylquinolinium (500 mg, 1.9 mmol) dans EtOH (30 ml_) est ajoutée du 6-Diethylaminobenzo[b]furan-2- carbaldehyde (1.2g, 7.5 mmol) et une quantité catalytique de piperidine (3 à 4 gouttes), la solution est agitée au reflux pendant 5 heures. Le mélange est évaporé à sec sous pression réduite. Le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant: DCM/MeOH 90/10) pour donner le NIR sous forme d'une poudre avec un rendement de 65%.
[0162] [Chem 14]
Figure imgf000037_0002
[0163] 35CI NMR (59 MHz, Methylene Chloride-d2) δ : 233.98 (s, CL).
[0164] 1H NMR (300 MHz, Methylene Chloride-d2) δ : 1.25 (t, 3JHH = 7.1 Hz, 6H,
CH3-CH2-N), 2.46 - 2.23 (m, 2H, CH2-CH2-N=), 3.46 (q, 3JHH = 7.1 Hz, 4H, CH3- CH2-N), 3.70 (t, 3JHH = 6.3 Hz, 2H, CH2-N3), 5.17 - 4.99 (m, 2H, CH2-N=), 6.62 - 6.56 (m, 1 H, CHAr ), 6.69 (d, 3JHH = 8.9 Hz, 1H, CHAr), 7.15 (s, 1H, CHfurane), 7.37 (d, 3JHH= 8.9 Hz, 1H, CHAr), 7.56 (d, 3JHH= 14.9 Hz, 1H, CHC=C), 7.83 (d, 3JHH= 8.4 Hz, 1 H, CHAr ), 7.90 (d, 3JHH= 15.2 Hz, 1 H, CHc=c), 8.09 - 8.00 (m, 1 H, CHAr), 8.19 (d, 3JHH= 8.9 Hz, 1H, CHAr), 8.23 (d, 3JHH= 6.7 Hz, 1H, CHAr), 8.46 (d, 3JHH= 8.6 Hz, 1 H, CHAr), 9.48 (d, 3JHH= 6.6 Hz, 1H, CHAr).
[0165] 13C NMR (75 MHz, Methylene Chloride-d2) δ :12.46 (s, CH3-CH2-N), 29.02 (s, CH2-CH2-N3), 45.08 (s, CH3-CH2-N), 48.40 (s, CH2-N3), 54.09 (s, CH2-N=), 91.85 (s, CHAr), 110.75 (s, CHAr ), 114.00 (s, CHAr ), 115.00 (s, CHAr ), 117.06 (s, CHAr ), 118.09 (s, CAr ), 118.23 (s, CHAr ), 123.05 (s, CHAr ), 125.73 (s, CHAr ), 126.39 (s, CAr ), 128.71 (s, CHAr ), 130.00 (s, CHAr ), 134.92 (s, CHAr ), 137.89 (s, CAr ), 146.12 (s, CHAr ), 149.31 (s, CAr ), 151.11 (s, CAr ), 152.20 (s, CAr ), 159.46 (s, CAr).
Synthèse du composé g [0166] A une solution de dendrimère f (300, 0.055 mmol) dans l'acétonitrile anhydre
(3 ml_) est ajoutée l'azoture fluorescent dans le proche infrarouge NIR (25.5 mg, 0.11 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant trois jours à température ambiante. Le solvant est ensuite éliminé sous pression réduite pour donner le dendrimère g avec un rendement quantitatif sous forme d'une huile bleue [0167] [Chem 15]
Figure imgf000038_0001
[0168] 31P NMR (121 MHz, CD2CI2) δ : 8.40 (s, N3P3), 29.64 (s, -PO3Me2), 63.26 (s, -P=S-). [0169] 1H NMR (500 MHz, CD2CI2) δ : 1.19 (t, 3JHH = 701 HZ, 6H, CH3-CH2-N), 2.63 - 2.19 (m, 4H, CH2), 2.74 (br s, 22H, C1 4-CH2, CH2), 3.04 (br s, 20H, C1 4-CH2- CH-), 3.17 (d, 2JHP = 9.4 Hz, 41 H, -CH2-P, CH2), 3.39-3.26 (m, 17H, CH3-N, CH2), 3.60-3.45 (m, 4H, Me-CH2-N), 3.64-3.57 (m, 120H, POCH3), 7.10-6.73 (m, 16H, C03H, CO2H, CO3H, CHAr,), 7.13 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 24H, C1 2H, HAr), 7.21 (d, 3JHH = 7.3 Hz, 22H, C1 3H, HAr), 7.37-7.25 (m, 4H, HAr), 7.58-7.38 (m, 4H, HAr), 8.10- 7.57 (m, 19H, CH=N, C0 3H, HAr).
[0170] 13C NMR (126 MHz, CD2CI2) δ : 29.66 (s, CH3), 32.76 (s, CH2), 32.88 (s, CH3), 45.08 (s, CH2), 49.34 (d, 1JCP = 157.4 Hz, N-CH2-P), 49.40 (d, 1JCP = 157.4 Hz, N-CH2-P), 52.49 (br s, POCH3), 58.07 (s, CH2), 58.12 (s, CH2), 58.17 (s, CH2), 120.89 (s, CHAr), 121.13 (s, C1 2), 128.21 (s, C0 3), 129.38 (s, CHAr), 129.93 (s, C13), 132.29 (br s, CO4), 136.98 (s, C14), 138.98 (s, CH=N-), 148.94 (br s, C11), 148.98 (br s, C11), 151.25 (br s, CO1).
Synthèse du composé G1-A-NIR
[0171] A une solution de dendrimère g (300, 0.05 mmol) dans le CH3CN anhydre (30 ml_) à 0°C est ajouté goutte à goutte BrTMS (0.33 ml_, 2.55 mmol). Après une nuit d'agitation, le mélange est évaporé à sec sous pression réduite. Le résidu brut est repris dans le 10 mL de MeOH. Après une heure d'agitation à température ambiante, le solide est récupéré par filtration puis lavé 2 fois avec du MeOH (20 mL) et avec Et20 (20 mL). Le solide obtenu est séché sous pression réduite pour donner le dendrimère G1 -A-NIR sous forme d'une poudre verte avec un rendement quantitatif. Le composé est ensuite converti en sel de sodium pour être analysé. A une suspension de composé acide phosphonique dans l'eau sous agitation sont ajoutés 20 équivalents d'une solution aqueuse de NaOH 0.1 M. La solution résultante est filtrée sur microfiltre à 0.4 μM puis lyophilisée pour donner le composé attendu sous forme d'une poudre bleue avec un rendement de 85%.
[0172] [Chem 16]
Figure imgf000040_0001
[0173] 31P NMR (121 MHz, Deuterium Oxide) δ : 6.78 (s, POHONa), 6.83 (s, POHONa), 9.26 (s, P=N), 64.09 (s, PS), 64.35 (s, PS).
Dendrimère G1-B [0174] [Chem 17]
Figure imgf000040_0002
[0175] Le dendrimère G1-B est synthétisé selon le schéma réactionnel présenté dans le schéma 3 :
[Schéma 3]
Figure imgf000041_0001
- Synthèse du composé 1-G'o [0176] [Chem 18]
Figure imgf000041_0002
[0177] A une solution de N3P3CI6 (2000 mg, 5,75 mmol) dans le THF (200 mL) à température ambiante sont ajouté successivement K2CO3 (14,3 g, 103,5 mmol) et le 4-hydroxybenzaldéhyde (4634 mg, 37,95 mmol). Après 72h sous agitation à température ambiante, le mélange est filtré puis concentré à sec. Le résidu brut est lavé 4 à 5 fois avec du MeOH pour donner le composé 1 -G'o sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 81%. [0178] RMN 1H (300 MHz, Chloroforme-d) : δ (ppm) 9,83 (s, 6H, CHO), 7,74 (d, 3JHH = 8.6 Hz, 12H, C0 3H), 7,12 (d, 3JHH = 8,5 Hz, 12H, C0 2H).
[0179] RMN 31P (121 MHz, Chloroforme-d) : δ (ppm) 7,15 (s, P0).
[0180] RMN 13C (75 MHz, Chloroforme-d) : δ (ppm) 190,47 (s, ÇHO), 154,44 (dd, 2JCP = 5,1 Hz, 4 J CP = 2,5 Hz, C0 1), 133,74 (s, C0 4), 131 ,38 (s, C0 3), 121 ,21 (d, 4 J CP = 2,5 Hz, C0 2).
- Synthèse du composé 1-G"0 [0181] [Chem 19]
Figure imgf000042_0001
[0182] A une solution de composé 1-G'0 (500 mg, 0,580 mmol) dans le THF (50 ml_) à température ambiante est ajoutée une solution de méthylamine à 8M dans EtOH (1,3 ml, 10,45 mmol). Après une nuit d'agitation à température ambiante, le mélange est concentré à sec pour donner le dendrimère 1-G"0 sous forme d'une poudre blanche. [0183] RMN 1H (300 MHz, Acetonitrile-ds) : δ (ppm) 8,24 (d, 4JHH = 1,7 Hz, 6H,
CH=N), 7,55 (d, 3JHH = 8,6 Hz, 12H, C0 3H), 6,99 (d, 3JHH = 8,5 Hz, 12H, C0 2H), 3,50 (s, 18H, N-CHs)
[0184] RMN 31 P (121 MHz, Acetonitrile-ds) : δ (ppm) 8,66 (s, P0).
[0185] RMN 13C (75 MHz, Acetonitrile-ds) : δ (ppm) 160,80 (s, C=N), 151,57 (dd, 2JCP = 5,1 Hz, 4 J CP = 2,5 Hz, C0 1), 133,94 (s, C0 4) 129,13 (C0 3), 120,66 (dd, 3JCP = 3,2 Hz, 5JCP = 1,8 Hz, C0 2), 47,29 (s, CHs).
- Synthèse du composé 1-G"'0-HCI
[0186] [Chem 20]
Figure imgf000042_0002
[0187] A une solution de dendrimère 1-G"0 (500 mg, 0,53 mmol) dans un mélange THF/MeOH (25/5) ml_ est ajoutée NaBH4 (201 mg, 5,32 mmol). Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange est concentré à sec. Le résidu brut est dilué dans 200 mL de DCM puis lavé une fois avec 50 mL d'eau distillée. La phase organique est récupérée, séchée avec Na2S04, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le produit est ensuite dissous dans du MeOH (30 mL) auquel est ajouté 9,5 mL d'HCI (1 M dans MeOH). Après 2h sous agitation à température ambiante, la solution est filtrée puis concentrée sous pression réduite. Le résidu est ensuite lavé 3 fois avec 25 mL de CH2CI2 pour donner le produit 1-G"'0-HCI (forme protonée HCl) sous forme d'une poudre blanche.
[0188] RMN 1H (400 MHz, Methanol-d4) : δ (ppm) 7,54 (d, 3JHH = 8,5 Hz, 12H, C0 3H), 7,05 (d, 3JHH = 8,3 Hz, 12H, C0 2H), 4,27 (s, 12H, CH2NH), 2,75 (s, 18H, N-CHs).
[0189] RMN 31 P (162 MHz, Methanol-d4) : δ (ppm) 8,29 (s, Po). [0190] RMN 13C (101 MHz, Methanol-d4) : δ (ppm) 151,07 (dd, 2JCP = 5,1 Hz, 4JCP
= 2,5 Hz, C0 1), 131,46 (s, C0 3), 128,71 (s, C0 4), 121,12 (dd, 3J = 3,2, 5 J = 1,7 Hz, (s, C0 2), 51,30 (s, CH2NH), 31,88 (s, N-CH3).
- Synthèse du composé 1-G"'0
[0191] [Chem 21]
Figure imgf000043_0001
[0192] Le composé 1-G"'0-HCI (300 mg) est solubilisé dans 25 mL d'eau distillée auquel est ajouté 25 mL d'une solution de NaOH (2M). La phase aqueuse est ensuite extraite 3 fois avec 200 mL de CH2CI2. La phase organique est ensuite séchée avec Na2S04, filtrée et concentrée sous vide pour donner le dendrimère 1-G"'0 sous forme d'huile transparente avec un rendement de 80%.
[0193] RMN 1H (400 MHz, Chloroforme-d) : δ (ppm) 7,12 (d, 3JHH = 8,5 Hz, 12H, C0 3H), 6.91 (d, 3JHH = 8,3 Hz, 12H, C0 2H), 3.69 (s, 12H, CH2NH), 2.43 (s, 18H, N-CHs). [0194] RMN 31P (162 MHz, Chloroforme-d) : δ (ppm) 8,71 (s, Po).
[0195] RMN 13C (101 MHz, Chloroforme-d) : δ (ppm) 149,55 (dd, 2JCP = 5,1 Hz, 4JCP = 2,5 Hz, C0 1), 136,70 (s, C0 3), 128,99 (s, C0 4), 120,82 (dd, 3J = 3,4, 5J = 1,7 Hz, C0 2), 55,43 (s, CH2NH), 36,06 (s, N-CH3). - Synthèse du composé 1-Gi
[0196] [Chem 22]
Figure imgf000044_0001
[0197] A une solution de PSCI3 (3,109 mL, 30,60 mmol) dans le CH2CI2 (100 ml_) à température ambiante est ajoutée goutte à goutte une solution de dendrimère 1- G"'0 (800 mg, 0,85 mmol) en présence de Et3N (0,740 mL, 5,31 mmol) dans le
CH2CI2 (25 mL) sur une durée de 30 min. Après 3h d'agitation à température ambiante, le mélange est concentré à sec sous pression réduite. Le résidu brut est ensuite solubilisé dans 200 mL de CH2CI2 puis filtré sur un gel de silice pour donner le dendrimère 1-G1 sous forme d'huile transparente avec un rendement de 82%.
[0198] RMN 1H (300 MHz, Chloroforme-d) : δ (ppm) 7,22 (d, 3JHH = 8,5 Hz, 12H, C0 3H), 6,99 (d, 3JHH = 8,3 Hz, 12H, C0 2H), 4,60 (d, 3JHP = 15,1 Hz, 12H, CH2NH), 2,82 (d, 3JHP = 16,2 Hz, 18H, N-CH3).
[0199] RMN 31P (121 MHz, Chloroforme-d) : δ (ppm) 64,12 (s, Pi), 8,35 (s, Po). [0200] RMN 13C (75 MHz, Chloroforme-d) : δ (ppm) 150,26 (dd, 2JCP = 5,1 Hz, 4JCP
= 2,5 Hz, C0 1), 132,73 (d, 3JCP = 6,5 Hz, C0 4), 129,17 (s, C0 3), 121 ,29 - 121.15 (m, C0 2), 54,18 (d, 2JCP = 5,5 Hz, CH2NH), 35,11 (d, 2JCP = 2,5 Hz, N-CH3).
- Composé 3-G'1(OMe)
[0201] [Chem 23]
Figure imgf000044_0002
[0202] A une solution de composé 1-G1 préparé précédemment (1 mmol) dans le THF (30 ml_) avec du CS2CO3 (24 mmol) est ajouté le phénol aza-bis-diméthyl- phosphonate (voir WO 2005/052031 A1) (12 mmol). Après une nuit d'agitation à température ambiante, le mélange est centrifugé, filtré puis concentré sous pression réduite. Le résidu brut est dilué dans un minimum de THF puis lavé un large volume d'éther diéthylique. Après séchage sous pression réduite le dendrimère 3-G'1(OMe) est obtenu sous forme d'une huile transparente avec un rendement quantitatif.
[0203] 31 P-{1 H} (243 MHz, CDCI3) NMR d = 8.40 (s, N=P), 26.85 (s, PO), 68.32 (s, PS);
[0204] 1H NMR (600 MHz, CDCI3) d = 2.75 (d, 3JHH = 10.1 Hz, 24H, C1 4-CH2), 2.77 (d, 3JHP = 7.6 Hz, 18H, CH3), 3.06 (d, 3JHH = 7.7 Hz, 24H, C1 4-CH2-CH2). 3.19 (d, 2JHP = 9.4 Hz, 48H, CH2-P), 3.73 (d, 3JHP = 10.6 Hz, 144H, POMe), 6.94 (d, 3JHH = 8.2 Hz, 12H, C0 2H), 7.07 (d, 3JHH = 8.1 Hz, 24H, Ci2H), 7.18 (br d, 3JHH = 8.2 Hz, 36H, C0 3 and C1 3H);
[0205] 13C-{1H} NMR (151 MHz, CDCI3) d = 33.05 (s, CH2), 33.64 s, (CH3N), 49.46 (dd, 1JCp = 157.3, 3JCp =7.2 Hz, CH2-P), 53.56-51.75 (m, POCH3), 53.47 (d, 2JCp = 10.3 Hz, C1 4-CH2). 58.22 (t, 3Jcp = 7.7 Hz, C1 4-CH2-CH2). 120.91 (br d, 3JCp = 4.4 Hz, C0 2 and C1 2), 129.30 (s, C0 3), 129.87 (s, C1 3), 134.10 (br d, 2JCp = 4.5 Hz, C0 4), 136.22 (s, C1 4), 149.35 (d, 2JCp = 7.5 Hz, C1 1), 150.01 (br s, C0 1) ppm.
- Composé G1-B
[0206] [Chem 24]
Figure imgf000045_0001
[0207] A une solution de dendrimère 3-Gi(OMe) (1g, 0.17 mmol) dans le CH3CN anhydre (30 mL) à 0°C est ajouté goutte à goutte BrTMS (1.34, 10.2 mmol). Après une nuit d'agitation, le mélange est concentré à sec sous pression réduite. Le résidu est agité une heure dans MeOH (10 mL), ensuite lavé 2 fois avec MeOH (20 mL puis une fois avec Et20 (20 mL). Le solide obtenu est séché sous pression réduite pour donner le dendrimère G1-B sous forme d'une poudre blanche avec un rendement quantitatif.
[0208] Le composé G1-B n'est pas suffisamment soluble dans l'eau pour être analysé par RMN, il est converti en mono sel de sodium selon la procédure suivante :
[0209] A une suspension de G1-B dans l'eau sous agitation sont ajoutés 24 équivalents d'une solution aqueuse de NaOH 0.1 M. La solution résultante est filtrée sur microfiltre à 0.4 μM puis lyophilisée pour donner la forme saline de G1 - B (24 atomes de sodium) sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 90%.
[0210] 31 P-{1 H} (162 MHz, D2O/CD3CN) NMR d = 6.93 (s, PO), 9.59 (s, N=P), 68.77(s, PS);
[0211] 1H NMR (600 MHz, D2O/CD3CN) d =2.76 (d, 3JHP = 10.7 Hz, 18H, CH3), 3.13 (t, 3JHH = 8.8 Hz, 24H, CI4-CH2), 3.47 (d, 2JHP = 11.9 Hz, 48H, CH2-P), 3.72 (t, 3JHH = 8.6 Hz, 24H, C1 4-CH2-CH2). 4.47 (d, 2JHP = 13.5 Hz, 12H, C0 4-CH2), 6.91 (d, 2JHH = 8.1 Hz, 12H, C0 2H), 7.15 (d, 2JHH = 8.1 Hz, 24H, C1 2H), 7.29 (d, 2JHH = 8.3 Hz, 12H, C0 3H),7.38 (d, 2JHH = 8.2 Hz, 24H, C1 3H);
[0212] 13C-{1H} NMR (151 MHz, D2O/CD3CN) d =29.07 (s, C1 4-CH2). 33.58 (s, CH3), 52.91 (d, 1JCP = 127.6 Hz, CH2-P), 52.94 (s, C0 4-CH2). 57.81 (s, C1 4-CH2-CH2). 121.14 (br s, C0 2), 121.42 (d,3JCP = 4.4 Hz C1 2), 129.61 (s, C0 3), 130.59 (s, C13),
133.95 (s, C1 4), 134.89 (s, C0 4), 149.18 (s, C0 1), 149.60 (d, 3JCP = 7.6 Hz, C11) PPm.
Dendrimère G1-B-NIR
[0213] Schéma de synthèse : [Schéma 4]
Figure imgf000047_0001
Composé m
[0214] [Chem 25]
Figure imgf000048_0001
[0215] A une solution de 4-((tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)benzaldehyde (Fu H. et al. Molécules, 2014,16 :17715-17726) (1g, 4.83 mmol) dans le THF (30 ml_) est ajoutée une solution de méthylamine (8M dans EtOH) (1,8 ml_, 14,49 mmol). Après une nuit d'agitation à température ambiante, le mélange est concentré à sec pour donner le produit m sous forme d'une huile incolore avec un rendement de 95%.
[0216] 1H NMR (300 MHz, Methanol-d4) δ (ppm) : 1.39 - 1.74 (m, 3H, -CH2-), 1.75 - 1.92 (m, 2H, -CH2-), 1.90 - 2.06 (m, 1 H, -CH2-0), 3.55 - 3.62 (m, 1 H, -CH2- O), 3.79 - 3.87 (m, 1H, -CH2-), 5.46 (t, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, O-CH-O ), 7.08 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, C02H), 7.63 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, C03H), 8.21 (q, 4JHH = 1.6 Hz, 1 H, -CH=N-).
[0217] 13C NMR (75 MHz, Methanol-d4) δ (ppm) : 18.46 (s, -CH2-), 24.89 (s, -CH2-), 29.95 (s, -CH2-), 46.32 (s, CH3-), 61.73 (s, -CH2-0), 96.10 (s, -CH-O), 116.17 (s, C0 2), 129.22 (s, C0 4), 129.30 (s, C0 3), 159.41 (s, C0 4), 163.46 (s, C=N).
Composé n
[0218] [Chem 26]
Figure imgf000048_0002
[0219] A une solution de composé m (1g, 4.5 mmol), Pd/C à10% (225 mg) et MeOH (40 ml_) sont introduits dans un tube de type Fisher Porter. Le tube est placé lentement sous vide de façon à chasser l'air. La pression en H2 est ensuite ajustée à 5 bars. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 heures à température ambiante. Après une dépressurisation lente, le mélange réactionnel est récupéré, filtré et concentré sous pression réduite. Le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant: AcOEt) pour obtenir le composé n sous forme d'une huile transparente avec un rendement de 80%.
[0220] 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 1.33 - 1.72 (m, 3H, -CH2-), 1.77 - 1.82 (m, 2H, -CH2-), 1.87 - 2.07 (m, 1H, -CH2-0), 2.36 (s, 3H, CH3), 3.50 - 3.57 (m, 1H, -CH2-0), 3.61 (s, 2H, -CH2-N), 3.76 - 3.99 (m, 1 H, -CH2-), 5.34 (t, 3JHH = 3.3 Hz, 1 H, O-CH-O), 6.96 (d, 3JHH = 8.6 Hz, 2H, C0 2H), 7.09 - 7.26 (m,2H, C0 2H).
[0221] 13C NMR (75 MHz, Chloroform-d) δ (ppnn) : 18.78 (s, -CH2-), 25.16 (s, -CH2-), 30.33 (s, -CH2-), 35.63 (s, -CH3), 55.31 (s, -CH2-N), 61.96 (s, -CH2-0), 96.38 (s,
O-CH-O), 116.36 (s, C0 2), 129.25 (s, C0 3), 132.78 (s, C0 3), 156.12 (s, C0 4).
Composé o
[0222] [Chem 27]
Figure imgf000049_0001
[0223] A une solution de PSCl3 (2.2 ml_, 22.6 mmol) dans le DCM (100 ml_) est ajoutée goutte à goutte une solution de composé n (1g, 4.52 mmol) en présence de Et3N (0,62 ml_, 4.52 mmol) dans le DCM (40 ml_) sur une durée de 30 min. Après une 4 heure d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est concentré à sec sous pression réduite. Le résidu brut est ensuite solubilisé dans 200 mL de DCM puis filtré sur un gel de silice pour donner le dendron o sous forme d'huile transparente avec un rendement de 85%.
[0224] 31P NMR (162 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 63.18 (s, PS).
Composé p
[0225] [Chem 28]
Figure imgf000049_0002
[0226] A une solution de composé o (1 mmol) dans le THF (30 mL) avec du Cs2C03 (4 mmol) est ajoutée le phénol aminobismethylene phosphonate dérivé de la tyramine (Rolland et al. (2008), A European Journal, 14: 4836-4850) (2 mmol). Après une nuit sous agitation à température ambiante, le mélange est centrifugé, filtré puis concentré sous pression réduite. Le résidu brut est ensuite purifié par colonne chromatographique sur gel de silice avec mélange d'éluant (MeOH/EtOAc) pour donner, après élimination des solvants sous pressions réduite, le composé p sous forme d'une huile transparente avec 85% de rendement.
[0227] 31P NMR (162 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 26.95 (s, POMe), 68.48 (s, P=N).
[0228] 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 1.58-1.72 (m, 3H, -CH2), 1.81- 1.94 (m, 2H, CH2), 1.96-2.05 (m, 1 H, CH2), 2.78-2.83 (m, 7H, C1 4-CH2, CH3N),
3.09 (t, 3JHH = 7.6 Hz, 4H, CH2N), 3.22 (d, 3JHH = 8.9 Hz, 8H, ), 3.55-3.67 (m, 1 H, CH2-0), 3.75 (d, 3JHP = 10.3 Hz, 24H, POMe), 3.89-3.95 (m, 1H, CH2-0), 4.44 (d, 3JHP = 12.0 Hz, 2H), 5.41 (t, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, 0-CH2-0), 6.99 (d, 3JHH = 8.6 Hz, 2H, C0 2H), 7.12 (d, 3JHH = 8.4, 4H, Ci2H), 7.16-7.25 (m, 6H, C0 3H, Ci3H). Composé q
[0229] [Chem 29]
Figure imgf000050_0001
[0230] A une solution de composé p (1 mmol) dans MeOH (30 ml_) est ajouté du pyridinium p-toluenesulfonate (1.5 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à température ambiante. Le solvant est éliminé sous pression réduite et le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant : MeOH/AcOEt) pour donner après élimination des solvants sous pression réduite le composé q sous forme d'une huile transparente avec un rendement de 80%.
[0231] 31P NMR (162 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 26.76 (s, POMe), 68.38 (s, PS). Composé r
[0232] A une suspension de dendron q (1g, 1.04 mmol) dans le THF (30 mL) avec du CS2CO3 (794 mg, 2.08 mmol) est ajouté l'hexachlorocyclotriphosphazene (70 mg, 0.20 mmol). Après une nuit d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est centrifugé, filtré sur célite puis concentré sous pression réduite. Le composé r est obtenu sous forme d'une huile transparente avec un rendement de 90%.
[0233] [Chem 30]
Figure imgf000051_0001
[0234] 31 P NMR (121 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 6.50 (d, 2JPP = 83.3 Hz, P=N), 21.50 (dd, 2JPP = 85.2, 2JPP = 81.6 Hz, P=N), 26.41 (s, POMe), 68.12 (s, PS).
Composé s [0235] A une suspension du composé b (130 mg, 0.30 mmol) dans le THF (30 mL) avec du CS2CO3 (199 mg, 0.61 mmol) est ajouté le composé r 989 mg, 0.2 mmol). Après une nuit d'agitation à 45°C, le mélange est centrifugé, filtré puis concentré sous pression réduite. Le résidu est purifié sur une colonne de silice avec DCM/MeOH (60/40) pour donner le dendrimère t avec un rendement de 90%. Le produit peut être purifié par chromatographie flash sur colonne de silice.
[0236] [Chem 31]
Figure imgf000051_0002
[0237] 31 P NMR (162 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 8.45 (s, P=N), 26.89 (s, POMe), 68.33 (s, PS). Composé t
[0238] A une solution de dendrimère s (500, 0.093 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (3 ml_) est ajoutée le composé azoture NIR (43.4 mg, 0.18 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant trois jours à température ambiante. Le solvant est ensuite éliminé sous pression réduite pour donner le dendrimère t avec un rendement quantitatif sous forme d'une huile bleue. [0239] [Chem 32]
Figure imgf000052_0001
[0240] 31 P NMR (162 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 8.40 (s, P=N), 26.86 (s, POMe), 68.38 (s, PS). G1B-NIR
[0241] A une solution de dendrimère t (500, 0.086 mmol) dans le CH3CN anhydre (50 ml_) maintenue à 0°C est ajouté goutte à goutte du BrTMS (0.56 ml_, 4.38 mmol). Après une nuit d'agitation, le mélange est concentré à sec sous pression réduite. Le résidu brut est repris dans le 10 mL de MeOH. Après une heure d'agitation à température ambiante, le solide est récupéré par filtration puis lavé 2 fois avec du MeOH (20 mL) et avec Et20 (20 mL). Le solide obtenu est ensuite séché sous pression réduite pour donner le dendrimère G1B-NIR sous forme d'une poudre verte avec un rendement quantitatif.
[0242] [Chem 33]
Figure imgf000052_0002
[0243] Le composé est ensuite converti en sel de sodium pour être analysé. A une suspension de composé acide phosphonique dans l'eau sous agitation sont ajoutés 20 équivalents d'une solution aqueuse de NaOH 0.1 M. La solution résultante est filtrée sur microfiltre à 0.4 μM puis lyophilisée pour donner le composé attendu sous forme d'une poudre bleue avec un rendement de 85%.
[0244] [Chem 34]
Figure imgf000053_0001
[0245] 31P NMR (162 MHz, Deuterium Oxide) δ (ppm) : 6.66 (s, POsHNa), 6.69 (s POsHNa), 6.74 (s, POsHNa), 9.42 (s, P=N), 68.49 (s, PS), 68.69 (s, PS).
Dendrimère G1-C
[Chem 35]
Figure imgf000053_0002
Composé u
[Chem 36]
Figure imgf000054_0001
[0246] A une solution de chlorure cyanurique (1 g, 5.4 mmol) dans le dichlorométhane (60 ml_) à 0°C sont ajoutées le phénol amino- bismethylènephosphonate dérivé de la tyramine (voir WO 2005/052031 A1) (2.1 g, 5.4 mmol) et la N, N diisopropyléthylamine (296 mg, 5.7 mmol). Après une heure d'agitation à 0°C, un nouvel ajout de phénol amino- bismethylènephosphonate dérivé de la tyramine (2.1 g, 5.4 mmol) et de N, N diisopropyléthylamine (696 mg, 5.4 mmol) sont réalisés à 0°C. Le mélange réactionnel est alors laissé sous agitation à température ambiante pendant une nuit. Après filtration et élimination des solvants sous pression réduite, le résidu est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant : DCM/MeOH ; 98/02) pour donner le composé u sous forme d'une huile jaune avec un rendement de 80%. [0247] 31 P-{1 H} NMR (121 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 26.55 (s, POMe).
[0248] 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 2.72 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 3.02 (t, j = 7.4 Hz, 4H), 3.10 (d, J = 9.4 Hz, 8H), 3.62 (d, J = 10.5 Hz, 24H), 6.96 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 7.20 (d, J = 8.6 Hz, 4H).
[0249] 13C-{1H} NMR (75 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 32.94 (CH2), 49.39 (dd, J = 157.9 Hz, J = 7.5 Hz, CH2), 51.65-53.36 (m, CH3), 57.81 (t, J = 7.7 Hz, CH2),
120.83 (CH), 130.07 (CH), 137.69 (C), 149.54(C), 172.39(C), 173.36(C).
Composé v
[chem 37]
Figure imgf000055_0001
[0250] A une solution du composé u (2 g, 2.28 mmol) dans THF (40 ml_) sont ajoutés le p-hydroxy-N-methylbenzylamine (324 mg, 4.56 mmol) et la N, N- diisopropylethylamine (794 mg, 6.84 mmol) à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite agité à 60°C pendant une nuit. Après filtration et élimination des solvants sous pression réduite, le résidu brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant : DCM/MeOH ; 95/05) pour donner le composé v sous forme d'une huile transparente avec un rendement de 70%.
[0251] 31 P-{1 H} NMR (121 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 26.73 (s, POMe), 26.94 (s, POMe).
[0252] 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 2.84 - 2.79 (m, 4H), 3.02-3.15 (m, 4H, CH2 , 3H CH3), 3.21 (d, 2JHP = 9.1 Hz, 8H, CH2), 3.79-3.72 (m, 24H, CH3), 4.33 (s, 2H, CH2), 6.70 (br d, 4H, CH2), 7.02 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, CH2), 7.09 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, CH2), 7.19-7.28 (m, 4H, CH2). [0253] 13C-{1H} NMR (75 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 32.82 (s, CH2), 33.17 (s,
CH2), 35.34 (s, CH3), 47.15-51.27 (m, CH2), 52.74-52.64 (m, CH3), 57.14-58.97 (m, CH2), 115.45 (s, CH), 121.59 (s, CH), 121.96 (s, CH), 127.41 (s, Cq), 129.47 (s, CH), 129.64 (s, CH), 136.12 (s, Cq), 136.37 (s, Cq), 150.49 (s, Cq), 150.99 (s, Cq), 156.65 (s, Cq), 167.11 (s, Cq), 172.21 (s, Cq), 172.29 (s, Cq).
Composé w
[Chem 38]
Figure imgf000056_0001
[0254] A une suspension du composé v (1.02 mmol) dans le THF (30 mL) avec du CS2CO3 (2.04 mmol) est ajouté l'hexachlorocyclotrisphosphazene (0.14 mmol) à température ambiante. Après une nuit d'agitation à 40 °C, le mélange est centrifugé, filtré puis concentré sous pression réduite. Le composé w est obtenu sous forme d'une huile transparente avec un rendement quantitatif.
[0255] 31 P-{1 H} NMR (121 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 8.11 (s, N=P), 27.06 (br s, POMe).
[0256] 1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 2.77 (m, 24H), 2.87-2.96 (m, 18H), 3.05 (t, J = 8.3 Hz, 24H), 3.12-3.30 (m, 48H), 3.60-3.88 (m, 144H), 4.64
(s, 12H), 6.89 (d, J = 8.6 Hz, 10H), 7.01 (m, 16H), 7.03-7.10 (m, 24H), 7.14- 7.24 (m, 24H).
Composé G1-C A une solution du composé w (1 g, 0.16 mmol) dans le CH3CN anhydre (50 ml_) à 0°C est ajouté goutte à goutte bromotrimethylsilane (1.4 g, 9.6 mmol). Après une nuit d'agitation, le mélange réactionnel est concentré à sec sous pression réduite. Le résidu est agité une heure dans le MeOH (10 mL), ensuite lavé 3 fois avec MeOH (20 mL) puis une fois avec Et20 (20 mL). Le solide obtenu est séché sous pression réduite pour donner le composé G1-C sous forme acide phosphonique (neutre) sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 80%.
[0257] Le composé est ensuite converti en sel de sodium pour être analysé. A une suspension du composé acide phosphonique dans l'eau sous agitation sont ajoutés 24 équivalents d'une solution aqueuse de NaOH 0.1 M. La solution résultante est filtrée sur microfiltre à 0.4 μM puis lyophilisée pour donner le composé attendu sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 90%.
[0258] 31P-{1H} NMR (162 MHz, Deuterium Oxide) δ (ppm) : 9.64 (s, N-P), 6.70 (br s, POsHNa). [0259] 1H NMR (400 MHz, Deuterium Oxide) δ (ppm) : 2.96 (br s, 18H, CH3), 3.20
(br s, 24H, CH2), 3.37-3.41 (m, 48H), 3.79 (br s, 24H, CH2), 6.72-6.98 (m, 10H, CH), 7.00-7.29 (m, 38H, CH), 7.36-7.65 (m, 24H, CH).
[0260] 13C-{1H} NMR (101 MHz, Deuterium Oxide) δ (ppm) : 28.95 (s, CH3), 53.42 (br s, CH2), 54.66 (br s, CH2), 57.35 ((br s, CH2), 121.02 (s, CH), 121.76 (s, CH), 129.16(s, CH2), 130.46 (, CH), 134.52 (s, C), 150.54(s,C), 171 ,65(br s,C=N).
Composé G1-C-NIR
[0261] [chem 39]
Figure imgf000057_0001
Composé x
[0262] [chem 40]
Figure imgf000058_0002
[0263] A une solution du composé v (0.9 g, 1.0 mmol) dans le THF (30 ml_) avec du CS2CCO3(794 mg, 2.08 mmol) est ajouté l'hexachlorocyclotrisphosphazene (70 mg, 0.20 mmol). Après une nuit d'agitation à température ambiante, le mélange est centrifugé, filtré puis concentré sous pression réduite. Le composé x est obtenu sous forme d'une huile transparente avec un rendement de 90%.
[0264] 31 P-{1 H} NMR (121 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 6.35 (d, 2JPP = 82.2 Hz, P=N), 20.76-20.98 (m, P=N)), 26.41 (s, POMe).
Composé v [0265] [Chem 41]
Figure imgf000058_0001
[0266] A une solution du composé b (75 mg, 0.17 mmol) dans le THF (30 mL) avec du CS2CO3 (199 mg, 0.34 mmol) est ajoutée le composé x (900 mg, 0.17 mmol). Après une nuit d'agitation à 45°C, le mélange est centrifugé, filtré puis concentré sous pression réduite pour donner le composé y avec un rendement quantitatif.
[0267] 31 P-{1 H} NMR (162 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 8.45 (s, P=N), 26.89 (br s, POMe). Composé z
[0268] [Chem 42]
Figure imgf000059_0001
[0269] A une solution du composé y (500 mg, 0.092 mmol) dans l'acétonitrile anhydre (5 ml_) est ajoutée le composé NIR (tel que décrit dans S. A. Klymchenko; V. G.
Pivovarenko; O. Turan; D. P. Alexander New Journal of Chemistry, 27(9), 1336- 1343; 2003) (43.4 mg, 0.18 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant trois jours à température ambiante. Le solvant est concentré sous pression réduite pour donner le dendrimère z avec un rendement quantitatif sous forme d'une huile bleue. [0270] 31 P-{1 H} NMR (162 MHz, Chloroform-d) δ (ppm) : 8.51 (s, P=N), 26.72 (br s, POMe).
Composé G1-C-NIR
[0271] A une solution de dendrimère z (500, 0.086 mmol) dans le CH3CN anhydre (50 mL) à 0°C est ajouté goutte à goutte du bromotrimethylsilane (0.56 mL, 4.38 mmol). Après une nuit d'agitation, le mélange est concentré à sec sous pression réduite. Le résidu est agité une heure dans MeOH (10 mL), ensuite lavé 2 fois avec MeOH (20 mL) puis une fois avec Et20 (20 mL). Le solide obtenu est séché sous pression réduite pour donner le dendrimère G1-C-NIR_sous forme d'une poudre verte avec un rendement quantitatif. Le composé est ensuite converti en sel de sodium pour être analysé. A une suspension de composé acide phosphonique dans l'eau sous agitation sont ajoutés 20 équivalents d'une solution aqueuse de NaOH 0.1 M. La solution résultante est filtrée sur microfiltre à 0.4 μM puis lyophilisée pour donner le composé attendu sous forme d'une poudre bleue avec un rendement de 80%. [0272] 31P-{1H} NMR (162 MHz, Deuterium Oxide) δ (ppm) : 7.79 (br s, PO3HNa), 9.42 (s, P=N).
2. Préparation des vésicules [0273] La formulation du dendrimère est obtenue par mélange dans l'eau du tensioactif catanionique TriCat-n et du précurseur dendrimérique acide G1-X [Fig. 1],
[0274] La formule du TriCat12 est la suivante :
[0275] [Chem 42]
Figure imgf000060_0001
[0276] La formule du TriCat8 est la suivante : [0277] [Chem 43]
Figure imgf000060_0002
[0278] La formule du TriCat16 est la suivante : [0279] [Chem 44]
Figure imgf000061_0001
Contre-exemple : Préparation d'une vésicule comprenant le dendrimère ABP
[0280] A 5,82 mg de dendrimère ABP, 1 ,02 mg de N-dodécylamino-1-déoxylactitol (L-Hyd 12) et 0,87 mg d'acide bis-a-(hydroxydodécyl)phosphinique sont ajoutés à température ambiante 2 ml_ d'eau ultrapure. Le mélange est vortexé pendant 5 min puis soniqué à l'aide d'une sonde à ultrasons pendant 15 min à la puissance 3 avec 30% de cycles actifs en contrôlant la température à 45°C.
Préparation d'une vésicule comprenant le dendrimère G1-A (TriCat12/G1-A)
[0281] A 5,29 mg de dendrimère G1-A, 1,02 mg de N-dodécylamino-1-déoxylactitol (L-Hyd 12) et 0,87 mg d'acide bis-a-(hydroxydodécyl)phosphinique sont ajoutés à température ambiante 2 mL d'eau ultrapure. Le mélange est vortexé pendant 5 min puis soniqué à l'aide d'une sonde à ultrasons pendant 15 min à la puissance 3 avec 30% de cycles actifs en contrôlant la température à 45°C.
Préparation d'une vésicule comprenant le dendrimère G1-X-NIR (TriCat12/G1- X-NIR)
[0282] A 5,31 mg de dendrimère G1 -X-NIR, 1,02 mg de N-dodécylamino-1- déoxylactitol (L-Hyd 12) et 0,87 mg d'acide bis-a-(hydroxydodécyl)phosphinique sont ajoutés à température ambiante 2 mL d'eau ultrapure. Le mélange est vortexé pendant 5 min puis soniqué à l'aide d'une sonde à ultrasons pendant 15 min à la puissance 3 avec 30% de cycles actifs en contrôlant la température à 45°C.
Préparation d'une vésicule comprenant le dendrimère G1-B (TriCat12/G1-B)
[0283] A 5,21 mg de dendrimère G1-B, 1,02 mg de N-dodécylamino-1-déoxylactitol (L-Hyd 12) et 0,87 mg de d'acide bis-a-(hydroxydodécyl)phosphinique sont ajoutés à température ambiante 2 mL d'eau ultrapure. Le mélange est vortexé pendant 5 min puis laissé sous agitation magnétique (500 tr/min) pendant 24 h à température ambiante.
Préparation d'une vésicule comprenant le dendrimère G1-C (TriCat12/G1-C)
[0284] A 5,3 mg de dendrimère G1-C, 1,02 mg de N-dodécylamino-1-déoxylactitol (L-Hyd 12) et 0,86 mg de d'acide bis-a-(hydroxydodécyl)phosphinique sont ajoutés à température ambiante 2 ml_ d'eau ultrapure. Le mélange est vortexé pendant 5 min puis soniqué à l'aide d'une sonde à ultrasons pendant 15 min à la puissance 3 avec 30% de cycles actifs en contrôlant la température à 45°C.
Préparation d'une vésicule comprenant le dendrimère G1-B et TriCat8
(TriCat8/G1-B)
[0285] A 5,21 mg de dendrimère G1-B, 0,94 mg de N-octylamino-1-déoxylactitol (L-Hyd 8) et 0,86 mg de d'acide bis-a-(hydroxydodécyl)phosphinique sont ajoutés à température ambiante 2 mL d'eau ultrapure. Le mélange est vortexé pendant 5 min puis laissé sous agitation magnétique (500 tr/min) à 40°C pendant 15 minutes puis pendant 24 h à température ambiante.
Préparation d'une vésicule comprenant le dendrimère G1-B et TriCat 16
(TriCat16/G1-B)
[0286] A 5,21 mg de dendrimère G1-B, 1,16 mg de N-hexadecylamino-1- déoxylactitol (L-Hyd 16) et 0,86 mg de d'acide bis-a- (hydroxydodécyl)phosphinique sont ajoutés à température ambiante 2 mL d'eau ultrapure. Le mélange est vortexé pendant 5 min puis laissé sous agitation magnétique (500 tr/min) à 40°C pendant 15 minutes puis pendant 24 h à température ambiante.
3. Mesure par DLS
[0287] La mesure de la taille et de la distribution de la taille des vésicules est mesurée par DLS (diffusion dynamique de lumière). Chaque analyse est effectuée sur les échantillons, filtrés à 1 ,2μm avec un filtre Minisart Acétate de cellulose, placés dans des cuves de plastique (cuves Polystyrène semi-micro, Brand). Les mesures sont effectuées sur un appareil Malvern Instruments Nano S ou Nano ZS, tous deux équipés d'un laser He-Ne qui émet une lumière monochromatique de longueur d'onde 633 nm. L'intensité diffusée est mesurée à 25,0°C ± 0,1 °C à un angle de 173°. Le résultat est une moyenne de 4 mesures et a été traité par l'algorithme Contin.
4. Mesure de la température de transition
[0288] Les échantillons sont préparés saturés à 1 .10-2 M en TriCat12. Des quantités équimolaires de L-Hyd12 et d'acide phosphonique sont dispersées à une concentration de 1 .10-2 M et de dendrimère à la concentration de 5.10'4 M dans 2 mL eau. Le mélange est mis sous agitation à 300 rpm pendant 2 jours. Deux méthodes sont réalisées: la première consiste à lyophiliser le milieu puis le mettre en dispersion dans 100 μL d'eau suivie du protocole de formation classique des vésicules. La deuxième méthode consiste à soniquer tout de suite 100 μL du milieu sans passer par l'étape de lyophilisation. Un résultat identique est obtenu par les deux méthodes.
[0289] Une autre méthode consiste à soniquer immédiatement le mélange suivant le protocole classique sans passer par l'étape d'agitation, des résultats similaires sont obtenus mais avec cette méthode il y a plus de bruit de fond.
[0290] Les mesures sont ensuite réalisées sur un appareil DSC 1 STARe System avec capteur MultiSTAR® HSS8. Dans ce dispositif, le creuset échantillon et le creuset référence sont placés dans un même four. Afin de maximiser l'intensité du signal du produit, la référence est remplie avec 75 μL du solvant tandis que 75 μL de la solution à analyser sont placés dans le creuset échantillon. La méthode mise au point consiste à amener l'échantillon de 25 à 5°C à 5°C/min puis de faire 4 cycles de 5 à 60°C à 2°C/min.
5. Mesure du taux d'encapsulation
[0291] Afin d'évaluer l'efficacité d'encapsulation du dendrimère dans les vésicules de TriCat12/dendrimère, un dosage spectrofluorimétrique a été mis au point en utilisant l'analogue fluorescent du dendrimère, G1-X-NIR.
[0292] La quantité totale de G1-X-NIR (encapsulées ou non) a été déterminée par mesure de l'intensité de fluorescence (IF) d'un échantillon pour lequel les structures vésiculaires ont été cassées par addition de méthanol dans la solution (1mL de méthanol pour 20 μL de solution vésiculaire). [0293] En parallèle, le G1-X-NIR non encapsulée a été séparé des vésicules par une filtration à 1,2 μm (filtre Minisart Acétate de cellulose, Sartorius). Une solution contrôle de G1-X-NIR a permis de vérifier l'élimination de 70% (SD= 3%) de G1-X -NIR par cette technique (à tenir en compte dans le calcul). Après dilution du filtrat dans du méthanol (1 ml_ méthanol pour 20 μL de filtrat), la mesure de l'intensité de fluorescence (IF) a permis de quantifier le G1-X-NIR majoritairement encapsulée.
[Math. 1]
% d' élimination = [1 - ({lF dendrimère ancapsulé)/(IF dendrimère totales})] x 100 x 1,43
[Math. 2]
EE (%) - 100 - % d'élimination
6. Observation par cryoMEB
[0294] L'observation des vésicules a été réalisée par microscopie électronique à balayage après cryofracture (cryoMEB). L'appareil utilisé pour l'analyse est un ESEM Quanta FEG250 de l'entreprise FEI (Platerforme TRI-Genotoul), opérant à 5 kV et environ 1 ,10'4 Pa. Les solutions sont déposées sur le porte échantillon puis solidifiées dans du diazote pâteux (-210°C). Elles sont ensuite fracturées dans une chambre à -140°C. Puis l'échantillon subit une étape de sublimation à -90°C pendant 5 minutes. L'échantillon subit alors une métallisation de 60 s au platine par plasma. Il est transféré pour l'observation dans la chambre cryogénique du MEB, maintenue en tout temps à -140°C par un flux de diazote gazeux.
7. Mesure de la stabilité de la formulation à 4°C
[0295] Les solutions de TriCat12/dendrimère sont stockées à 4°C dans des cuves de DLS. Au moment de la mesure de la taille, la solution est mise à température ambiante pendant 5 min puis la taille est mesurée à 25°C en DLS.
8. Mesure de la stabilité de la formulation après congélation [0296] Afin d'évaluer la stabilité de la formulation à la congélation, des aliquotes de la formulation de TriCat12/dendrimère sont congelées à -20°C. Après un temps t (jours), la solution est décongelée dans un bain à ultrasons à 25°C pendant 10 min, filtrée à 1,2μm puis la taille est mesurée en DLS à 25°C.
9. Préparation d'une formule pharmaceutique de xanthane comprenant les vésicules TriCat12/G1-X
[0297] Une solution de Xanthane à 2%wt dans l'eau est préparée : 20 mg de Xanthane sont ajoutés en pluie sous agitation à 500rpm dans 1 mL d'eau mQ filtrée à 0,2μm. Le mélange est agité pendant 1h minimum. Puis, un mélange équivolume de vésicules Tricat12/G1-X et de gel Xanthane 2%wt est réalisé. On laisse sous agitation à 500rpm pendant 4h minimum.
10. Mesure de la stabilité physique
[0298] L'étude de la stabilité physique des vésicules TriCat12/G1-B et de la formulation pharmaceutique de TriCat12/G1-B dans le xanthane est mesuré à l'aide d'un Turbiscan Lab Expert (Formulaction). Le Turbiscan détecte les variations de l'intensité de la lumière transmise à différentes hauteur (z) de l'échantillon en fonction du temps, permettant ainsi un suivi direct des hétérogénéités physiques locales. Les mesures sont effectuées selon le protocole de 145 scans/1 heure, puis 145 scans/24h à 25°C.
11. Mesure de la stabilité par RMN
[0299] Les composés G1-X ont été solubilisés dans l'eau puis le pH a été ajusté à pH=4 et les solutions ont été stockées à 25°C à l'abri de la lumière. Juste avant l'analyse par RMN la solution est lyophilisée et la poudre résultante (20 à 50 mg) est diluée dans 0.5 à 0.7 mL de D20 en présence de 6 goutte de CD3CN. Les préformulations TriCat 12/G1-B immobilisées dans un gel de xanthane sont préparées selon l'invention, si nécessaire le pH a été ajusté à pH = 4 et les solutions ont été stockées à 25°C à l'abri de la lumière. Les spectres RMN ont été enregistrés à 25°C après ajustement du pH à pH = 7, puis lyophilisation. La poudre résultante est humidifiée avec quelques gouttes de D20 avant analyse par RMN solide (MAS NMR). 12. Evaluation de la pénétration cutanée in vitro sur cellule de Franz
Quantification du dendrimère fluorescent (G1X-NIR) dans la peau
[0300] La méthode de diffusion en cellules à flux continu de type Franz (PermGear®, Standard Franz Cells) est utilisée pour étudier in vitro la pénétration cutanée de la formulation au cours du temps sans la perturbation du système. Ces expériences ont été faites sur la peau d'oreilles de cochons qui représente un modèle prédictif de la pénétration cutanée humaine, ayant des propriétés histologiques et physiologiques similaires à la peau humaine. Des échantillons de peau d'oreilles porcines ont été obtenus de l'abattoir (Arcadie Sud-Ouest, Montauban), de façon que le tissu cutané soit intact. Après dissection de la peau du tissu-sous-jacent, la peau est nettoyée avec de l'eau, dégraissée, épilée puis coupée en morceaux de carré d'environ 2 cm. Ces patchs de peau sont congelés à -80°C pour une utilisation subséquente.
[0301] Lors de l'expérience, les peaux ont été décongelées à température ambiante et placées sur les cellules de Franz dans le compartiment donneur de façon que la face qui baigne dans le liquide récepteur corresponde à la face interne de la peau alors que la face qui est en contact avec l'air est celle du stratum cornéum.
[0302] Un analogue fluorescent de dendrimère est utilisé avec une émission dans le proche infrarouge (G1-X-NIR), pour les études de pénétration et rétention cutanée in vitro. Une dose (300 pi) de PBS (blanc), de G1-X-NIR seul ou formulé dans les vésicules de TriCat12/G1-X-NIR a été déposée sur la face du stratum cornéum, en utilisant une micropipette, pour couvrir la surface de diffusion de 1 ,77 cm2 pendant 24 h. La surface externe de la cellule a été couverte avec du parafilm pour éviter l'évaporation et les variations du volume. Le compartiment récepteur en contact avec la surface interne de la peau a été remplie par 12 mL d'une solution tampon phosphate (PBS; pFI=7.45), thermostaté à 37°C et maintenue sous agitation constante (300 rpm) pour assurer un renouvellement constant du volume, ce qui se rapproche des conditions physiologiques.
[0303] Après 24 h, la peau est rincée avec du PBS afin d'éliminer le reste du dépôt et séchée avec du papier absorbant. La zone de traitement est ensuite découpée en petits morceaux dans un pilulier avec 3 mL de PBS et homogénéisée à l'aide d'un disperseur (Ultra-Turrax Ika®- Werke, T 25 Basic) durant 5 min à 21500 rpm. La dispersion est ensuite filtrée à 0,45 μm (filtre Minisart Acétate de cellulose, Sartorius) puis le dendrimère dans le filtrat est dosé par spectrofluorométrie (l excitation = 632 nm et l émission = 650 à 850 nm).
Observation de la pénétration cutanée par microscopie confocale
[0304] La microscopie confocale est choisie pour évaluer la profondeur de pénétration du G1-X-NIR dans les différentes couches de la peau (Stratum cornéum, épiderme viable et le derme). La première étape est la diffusion du G1 - X-NIR sur cellule de Franz, selon le protocole décrit précédemment.
[0305] Après 24h d'application, la peau est rincée délicatement au PBS et séchée. La zone traitée est coupée en trois morceaux égaux pour être représentatif de toute la peau. Ces trois morceaux sont congelés, inclus dans de l'O.C.T (Tissue- Tek®)dans un moule plastique (Tissue-Tek® Cryomold®), dans de l'isopentane refroidi à -80°C. Des coupes de 10 pm d'épaisseur obtenues à l'aide de cryostat (CM 1950, Leica), sont ensuite observées à l'aide d'un microscope confocal SP8 Leica à objectif inversé (63X), à immersion huile. Les paramètres utilisés lors de l'observation sur le logiciel LAS X sont : l excitation = 635 nm et l émission = 650 à 800 nm. La peau traitée avec du PBS est utilisé comme un blanc pour évaluer l'auto-fluorescence de la peau. Les images obtenues sont ensuite traitées sur le logiciel Fiji avec le plugin Bio-formats.
13. Purification des monocytes et analyse par FACS
[0306] Le sang humain des donneurs sains est récupéré de l'établissement français du sang (EFS, Toulouse, France). Les cellules mononucléées sanguines périphériques (PBMCs : peripheral blood mononuclear cells) sont ensuite séparées du sang à l'aide d'un gradient de densité avec une solution de Pancoll (PANBiotech GmbFI) par centrifugation à 1200 rpm pendant 20 min à 20°C. A partir des PBMCs, les monocytes sont isolées par une sélection négative avec des anticorps dirigés contre toutes les cellules du sang (cellules T, cellules B, cellules NK, cellules dendritiques, érythrocytes et granulocytes) excepté les monocytes en utilisant le kit Dynabeads® Untouched™ Fluman Monocytes (Invitrogen). La pureté des monocytes a été vérifiée, en cytométrie en flux, supérieure à 90% pour chaque donneur avec un anticorps anti-CD14-APC-Cy7 (Miltenyi Biotec).
[0307] Les monocytes fraîchement purifiés ont été resuspendus dans une plaque 48 puits à 1 million par ml dans du RPMI 1640 + GLUTAMAX, pénicilline et streptomycine à 100 U/mL et 10% de sérum de veau fœtal (SVF). Toutes les molécules ont été ajoutées au début des cultures à la concentration de 20 μM de G1-X sauf le TriCat12 seul à la concentration de 40 μM. Après 5 jours de culture à 37°C, la morphologie des monocytes a été analysée par cytométrie en flux avec un cytomètre MACSQUANT Q10 (Miltenyi Biotec). Toutes les données de cytométrie ont été analysées par le logiciel Flowlogic™ (Miltenyi Biotec).
14. Evaluation de l'activité anti-psoriasique in vivo sur souris IMQ
[0308] Des souris femelles Balb/c âgées de 8 semaines, de poids approximatif 20 g, ont été utilisées lors de ces expérimentations. Les procédures expérimentales ont été évaluées et approuvées par le comité d'éthique en Expérimentation Animale. Les gestes et les procédures expérimentales sont réalisés sous anesthésie gazeuse, pratiquée dans un poste à anesthésie par inhalation de 4% d'isoflurane dans la boite à induction puis de 3% au masque. Après une semaine d'acclimatation, le dos des souris est rasé à J-1 , sur une surface d'environ 4 cm2 à l'aide d'une tondeuse, et les poils résiduels sont éliminés à l'aide d'une crème dépilatoire. À J0, 80 mg d'Aldara™ crème à 5% d'Imiquimod (IMQ) ont été appliqués et massés sur le dos des souris chaque jour, pendant 7 jours consécutifs, en fin d'après-midi. Le lendemain matin, le dos des animaux traités par l'IMQ a été lavé par un coton imbibé d'eau. Les traitements suivants sont alors appliqués dans un volume de 100 μL : eau (contrôle), dendrimères G1-A ou G1-B dissous dans l'eau (quantité correspondant à une dose finale de 13 mg/kg), et dendrimères G1-A ou G1-B formulé dans les vésicules TriCat12 (quantité correspondant à une dose finale de dendrimère de 13 mg/kg). À J7, 5 heures après le dernier traitement, les souris sont euthanasiées. La sévérité de l'inflammation de la peau du dos des souris a été évaluée à l'aide d'un score clinique basé sur le score PASI (Psoriasis Area Severity Index). La sévérité de l'inflammation cutanée a été déterminée par une évaluation quotidienne de l'érythème, des squames et de l'épaisseur du dos suivant un score allant de 0 à 4 (0 = normal ; 1 = léger ; 2 = modéré ; 3 = marqué ; 4 = très marqué). L'épaisseur du dos a été mesurée à l'aide d'un pied à coulisse. Un score clinique total combinant ces trois critères cliniques a été ensuite calculé (échelle de 0 à 12).
[0309] A l'euthanasie, les peaux de dos sont prélevées, fixées immédiatement en 4% de paraformaldéhyde et incluses dans des blocs de paraffine. Pour l'évaluation histologique, la coloration Hémalun-Eosine (HE) est réalisée sur des coupes de peaux déparaffinées de 5 μm. Les images sont obtenues à l'aide d'un scanner de lames (Panoramic slide scanner 250, objectif 40x). La sévérité de l'inflammation, au niveau histologique, a été évaluée en se basant sur les caractéristiques histopathologiques du psoriasis suivantes : acanthose, spongiose, hyperkératose, parakératose et infiltrat immunitaire. Pour chacun de ces cinq critères, un score allant de 0 (normal) à 4 (sévère) a été attribué, puis les scores ont été cumulés pour donner le score histologique total (échelle de 0 à 20).
15. Prolifération des kératinocytes
[0310] Pour étudier l'effet des dendrimères sur la prolifération des kératinocytes in vitro, l'expression du marqueur de prolifération Ki67 (marqueur nucléaire) a été étudié par immunohistochimie après un traitement ou non (contrôle) avec 20μM de G1-A ou de G1-B pendant 24, 48 ou 72h. Deux types de kératinocytes ont été étudiés : la lignée humaines N-TERT et des kératinocytes humains primaires. Suite au traitement avec les dendrimères, les cellules sont lavées, fixées dans du para-formaldéhyde (PFA) et perméabilisées avec du triton. Ensuite, les cellules fixées sont incubées avec un anticorps primaire de lapin dirigé contre Ki67, puis lavées et incubées avec un anticorps secondaire anti-lapin couplé au fluorochrome Alexa Fluor 488. Les noyaux des cellules sont marqués avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Les kératinocytes ont ensuite été observés avec un microscope à fluorescence à champ large. Pour chaque zone d'observation, deux images sont acquises : une avec le laser ultraviolet pour observer le marquage des noyaux au DAPI ; une avec le laser vert pour observer le marquage de Ki67. Ces images sont traitées avec le logiciel ImageJ. Sur l'image correspondant au marquage DAPI, les noyaux sont comptés afin d'obtenir le nombre total de cellules par image. Sur l'image correspondant au marquage de Ki67, les noyaux positifs au Ki67 sont comptés afin d'obtenir le nombre de cellules qui prolifératives, et de calculer le pourcentage de cellules prolifératives. II. Résultats
1. Formulation TriCat12/ABP
1.1 Caractérisation des vésicules
[0311] Le procédé de préparation de la formulation TriCat12/ABP permet d'obtenir des vésicules dont le diamètre moyen se situe vers 250-300 nm avec une température de transition de la bicouche de 37°C [Fig. 2], Le procédé de préparation de la formulation TriCat12/ABP est capable d'encapsuler en moyenne entre 25% du dendrimère initialement engagé dans la formulation. La séparation du dendrimère non encapsulé est difficilement accessible avec les techniques connues de l'homme du métier. Le potentiel Zêta est de -55 ± 4 mV et le pH de la solution ~ 6,5.
1.2 Pénétration de la formulation dans la peau
[0312] La quantification par fluorescence de la quantité de dendrimère ABP-NIR (dendrimère ABP sous sa forme fluorescente) formulé ou non avec le TriCat 12, qui a pénétré dans la peau d'oreille de cochon (cellules de Franz) montre qu'après 24h à 40°C, le dendrimère ABP formulé ou pas ne pénètre que peu dans la peau [Fig. 3].
2. Formulation TriCat12/G1-A
2.1 Caractérisation des vésicules
[0313] Le procédé de préparation de la formulation mettant en jeu un précurseur le dendrimère sous sa forme acide phosphonique permet d'augmenter sa capacité d'insertion dans la partie hydrophobe des vésicules et ainsi d'obtenir un taux d'encapsulation moyen de 75% et de séparer simplement l'actif non encapsulé par filtration. La formulation du dendrimère G1-A par le TriCat-12 donne lieu à la formation de vésicules, dont le diamètre moyen se situe vers 100-350 nm [Fig. 4]. [0314] La formulation TriCat 12/G1-A possède une température de transition de phase de 33°C. En dessous de 33°C, la bicouche membranaire de la vésicule est rigide et stable. Au-dessus de 33°C (la température de peau oscillant entre 30 et 35°C), cette membrane devient fluide et ses propriétés de bio-adressage sont augmentées (diffusion dans les tissus, fusion avec les cellules, relargage des principes actifs) [Fig. 5].
[0315] Le potentiel Zêta est de -53 ± 2.5 mV et le pH de la solution ~ 2,8.
[0316] De même, la formulation du dendrimère G1-A-NIR par le TriCat-12 donne lieu à la formation de vésicules, dont le diamètre moyen se situe vers 100-350 nm. Le pH de la solution est ~ 2,8. La formulation TriCat 12/G1-A-NIR est stable pendant au moins 1 mois lorsqu'elle est stockée à 4°C en solution.
2.2 Stabilité de la formulation TriCat12/G1-A
[0317] La formulation TriCat 12/G1-A est stable pendant plus de deux mois lorsqu'elles sont stockées à 4°C en solution [Fig. 6].
[0318] Des expériences ont été réalisées pour vérifier si les vésicules pouvaient être endommagées par une étape de congélation. Ces expériences démontrent qu'on peut congeler les formulations et les décongeler sans modifications de leurs propriétés physico-chimiques [Fig. 7].
2.3 Pénétration de la formulation dans la peau
[0319] La méthode de diffusion en cellules à flux continu de type Franz est utilisée pour étudier in vitro la pénétration cutanée de la formulation au cours du temps. Ces expériences ont été faites sur les peaux d'oreilles de cochons, dont les propriétés histologiques et physiologiques sont similaires à celles de la peau humaine. Ces expériences montrent qu'après 24h, la quantité de dendrimère qui a pénétré dans la peau est significativement supérieure lorsque celui-ci est formulé [Fig. 8]).
[0320] La microscopie confocale a été choisie pour évaluer la profondeur de pénétration du dendrimère dans les différentes couches de la peau ( stratum corneum, épiderme viable et le derme). Les expériences en microscopie confocale montrent que le dendrimère ne pénètre dans l'épiderme et le derme que lorsqu'il est formulé dans les vésicules, sinon il reste dans les couches superficielles de la peau (stratum corneum) [Fig. 9].
[0321] Expériences faites sur peaux humaines, issues de biopsies cutanées humaines. Ces expériences montrent qu'après 24h, la quantité de dendrimère qui a pénétré dans la peau est significativement supérieure lorsque celui-ci est formulé [Fig. 10].
2.4 Activation des monocytes
[0322] Un changement de morphologie (augmentation de la granulosité et de la taille) traduit une activation des monocytes humains primaires. Les résultats montrent que les vésicules TriCat12 seules ne modifient pas la morphologie des monocytes humains, alors que les vésicules TriCat12 chargées avec le dendrimère G1-A entraînent une augmentation de la granulosité et de la taille. Par ailleurs, on note que près de la moitié des cellules sont dans l'ellipse des monocytes activés [Fig. 11],
2.5 Activité in vivo sur souris psoriasique
[0323] Les résultats du suivi du score clinique des 3 groupes de souris (contrôle : souris IMQ non-traitées, souris IMQ traitées avec 13 mg/kg du dendrimère G1- A libre, et souris traitées avec 13 mg/kg du dendrimère G1-A formulé dans les vésicules TriCat12) montrent une diminution du score clinique dans les 2 groupes traités. Pour les souris contrôle non-traité le score clinique moyen est de 9,5 à J7. Le score clinique est diminué à 6,5 et 5,7 pour les groupes dendrimère G1-A libre et dendrimère formulé TriCat12/G1-A, respectivement [Fig. 12, graphe du haut],
[0324] Le score histologique moyen est également diminué de 16,5 pour les souris contrôle non-traité à 14,5 et 10,4 pour les groupes dendrimère G1-A libre et dendrimère formulé TriCat12/G1-A, respectivement [Fig. 12, graphe du bas].
2.6 Prolifération des kératinocytes
[0325] La Figure 13 montre l'effet antiprolifératif du composé G1-A, en fonction du temps de traitement, sur la lignée de kératinocytes N-TERT (graphes du haut) et sur des kératinocytes humains primaires (graphes du bas). Une diminution du nombre totale de cellule et du pourcentage de cellules prolifératives est observée [Fig. 13].
3. Formulation TriCat 12/G1-B
3.1 Caractérisation des vésicules
[0326] La formulation du dendrimère G1-B par leTriCat-12 donne lieu à la formation de vésicules, dont le diamètre moyen se situe vers 200-300 nm [Fig. 14]. Létaux d'encapsulation moyen est 70 % en dendrimère G1-B.
[0327] Le Potentiel Zêta est de -41 ± 2.6 mV et le pH de la solution ~ 2.7
[0328] En dessous de 33°C la bicouche membranaire des formulations est rigide et très stable. Au-dessus de 33°C (la température de la peau oscillant entre 30 et 35°C), cette membrane devient fluide et ses propriétés de bio-adressage sont augmentées (diffusion dans les tissus, fusion avec les cellules, relargage des principes actifs) [Fig. 15].
3.2 Stabilité de la formulation
[0329] Les formulations sont stables (en terme de diamètre et de quantité (représentée par l'intensité diffusée DCR)) pendant plus de deux mois lorsqu'elles sont stockées à 4°C en solution [Fig. 16].
3.3 Composition pharmaceutique de TriCat 12/G1-B avec du Xanthane
[0330] La stabilité chimique des composés G1-B dans les préformulations immobilisées dans un gel de xanthane a été évaluée par RMN en comparaison avec celles des composés G1-B seul à pH = 4. Les résultats montrent que la stabilité du composé G1-B dans la préformulation TriCat 12/G1-X immobilisée dans un gel de xanthane selon l'invention est très supérieure à celle du G1-B dans les mêmes conditions. La spectroscopie RMN 31 P montre une dégradation du composé G1-B après 3 mois de stockage à pH = 4 à 25°C (spectre B de la [Fig. 17], signal attestant de l'hydrolyse acide à environ 48 ppm symbolisé par une flèche). Dans les mêmes conditions le composé G1-B dans la préformulation TriCat 12/G1-X immobilisée dans un gel de xanthane reste parfaitement stable et aucun sous-produit n'est observé (spectre A de la [Fig. 17]). [0331] La formulation des vésicules de TriCat 12/G1-B dans un gel de Xanthane à 1 % est stable en terme de stabilité physique de l'échantillon même stockée à température ambiante [Fig. 18]. Pour la formulation des vésicules de TriCat 12/G1-B dans un gel de Xanthane aucune modification significative de la transmission à travers l'échantillon n'est observée sur toute la hauteur de l'échantillon après 24h, alors que pour les vésicules de TriCat 12/G1-B conservées dans l'eau la transmission augmente en haut du volume montrant une clarification de la solution due à une légère sédimentation des vésicules. La formulation pharmaceutique des vésicules dans le gel de xanthane permet ainsi une meilleure conservation à température ambiante.
3.4 Pénétration de la formulation dans la peau
[0332] La méthode de diffusion en cellules à flux continu de type Franz est utilisée pour étudier la pénétration cutanée in vitro de la formulation au cours du temps. Ces expériences ont été faites sur les peaux d'oreilles de cochons, dont les propriétés histologiques et physiologiques sont similaires à celles de la peau humaine. Ces expériences montrent qu'après 24h, la quantité de dendrimère G1-B-NIR qui a pénétré dans la peau est significativement supérieure lorsque celui-ci est formulé dans les vésicules TriCat 12/G1-B-NIR [Fig. 19]).
[0333] Des expériences sur peau de cochon ont été également réalisées pour vérifier par microscopie confocale si le dendrimère pouvait pénétrer dans les couches profondes de la peau. Ces clichés montrent que le dendrimère pénètre mieux dans l'épiderme lorsqu'il est formulé dans les vésicules, sinon il reste préférentiellement dans les couches superficielles de la peau (stratum corneum) [Fig. 20],
[0334] Des expériences faites sur peau de cochon ont été réalisées pour vérifier par microscopie confocale si le dendrimère formulé dans les vésicules et dans le gel de xanthane à 1 % pouvait pénétrer dans les couches profondes de la peau. Ces clichés montrent que le dendrimère pénètre profondément dans l'épiderme et le derme lorsqu'il est formulé dans les vésicules inclues dans le gel de xanthane, sinon il reste préférentiellement dans les couches superficielles de la peau (stratum corneum) [Fig. 21]. 3.5 Activation des monocytes
[0335] Un changement de morphologie (augmentation de la granulosité et de la taille) traduit une activation des monocytes humains primaires. Les résultats montrent que les vésicules TriCat12 seules ne modifient pas la morphologie des monocytes humains [Fig. 11], alors que les vésicules TriCat12 chargées avec le dendrimère G1-B entraînent une augmentation de la granulosité et de la taille. Par ailleurs, on note que près de 2/3 des cellules sont dans l'ellipse des monocytes activés [Fig. 22],
3.6 Activité in vivo sur souris psoriasique [0336] Les résultats du suivi du score clinique des 3 groupes de souris (contrôle : souris IMQ non-traitées, souris IMQ traitées avec 13 mg/kg du dendrimère G1- B libre, et souris traitées avec 13 mg/kg du dendrimère G1-B formulé dans les vésicules TriCat12) montrent une diminution du score clinique dans les 2 groupes traités. Pour les souris contrôle non-traité le score clinique moyen est de 9,6 à J7. Le score clinique est diminué à 7,8 et 6,4 pour les groupes dendrimère G1-B libre et dendrimère formulé TriCat12/G1 -B respectivement [Fig. 23, graphe du haut],
[0337] Le score histologique moyen est également diminué de 14,8 pour les souris contrôle non-traité à 12,4 et 10,8 pour les groupes dendrimère G1-B libre et dendrimère formulé TriCat12/G1-B, respectivement [Fig. 23, graphe du bas].
3.7. Prolifération des kératinocytes
[0338] La Figure 24 montre l'effet antiprolifératif du composé G1-B, en fonction du temps de traitement, sur la lignée de kératinocytes N-TERT (graphes du haut) et sur des kératinocytes humains primaires (graphes du bas). Une diminution du nombre totale de cellules et du pourcentage de cellules prolifératives est observée.
4. Formulation TriCat 12/G1-C
4.1 Caractérisation des vésicules [0339] La formulation du dendrimère G1-C par leTriCat-12 donne lieu à la formation de vésicules, dont le diamètre moyen se situe vers 300 nm [Fig. 25]. Le taux d'encapsulation moyen est 80 % en dendrimère G1-C.
[0340] En dessous de 34°C la bicouche membranaire des formulations est rigide et très stable. Au-dessus de 34°C (la température de la peau oscillant entre 30 et 35°C), cette membrane devient fluide et ses propriétés de bio-adressage sont augmentées (diffusion dans les tissus, fusion avec les cellules, relargage des principes actifs) [Fig. 26].
4.2 Stabilité de la formulation
[0341] Les formulations sont stables (en terme de diamètre) pendant plus d'un mois lorsqu'elles sont stockées à 4°C en solution [Fig. 27],
4.3 Pénétration de la formulation dans la peau
[0342] Des expériences faites sur peau de cochon ont été réalisées pour vérifier par microscopie confocale si le dendrimère formulé dans les vésicules pouvait pénétrer dans les couches profondes de la peau. Ces clichés montrent que le dendrimère pénètre profondément dans l'épiderme et le derme lorsqu'il est formulé dans les vésicules TriCat12/G1-C [Fig. 28].
4.4 Activation des monocytes
[0343] Un changement de morphologie (augmentation de la granulosité et de la taille) traduit une activation des monocytes humains primaires. Les résultats montrent que le dendrimère G1-C à 20μM entraîne une augmentation de la granulosité et de la taille. Par ailleurs, on note que près de la moitié des cellules sont dans l'ellipse des monocytes activés [Fig. 29]
5. Formulation TriCat 8/G1-B
5.1 Caractérisation des vésicules
[0344] La formulation du dendrimère G1-B par le TriCat-8 donne lieu à la formation de vésicules, dont le diamètre moyen se situe vers 300 nm [Fig. 30].
6. Formulation TriCat 16/G1-B
6.1 Caractérisation des vésicules [0345] La formulation du dendrimère G1-B par leTriCat-16 donne lieu à la formation de vésicules, dont le diamètre moyen se situe vers 300-400 nm [Fig. 31].
6.2 Stabilité de la formulation
[0346] Les formulations TriCat-16/G1 B sont stables (en terme de diamètre) pendant plus de 10 jours lorsqu'elles sont stockées à 4°C en solution [Fig. 32],

Claims

Revendications [Revendication 1] Vésicule comprenant : - un tensioactif catanionique de formule (I) ou un mélange de tensioactifs catanioniques de formule générale (I) :
[Chem . 1]
Figure imgf000078_0001
dans laquelle est un sucre,
R1 est choisi parmi H et une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 20 chaînons,
R2 est une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 20 chaînons,
R3 et R4 sont indépendamment l'un de l'autre une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 19 chaînons ; et - un dendrimère de formule (II) :
[Chem. 2]
Figure imgf000078_0002
(II) dans laquelle est choisi parmi les pentoses, les hexoses et les groupes de formules
Figure imgf000078_0003
suivantes :
Z est chois
Figure imgf000079_0001
i parmi -CH2- et -CH=N-,
R est choisi parmi H et C1-C12-alkyle,
A est choisi parmi
Figure imgf000079_0002
où X est choisi parmi S et O, et n est nombre entier compris entre 3 et 8.
[Revendication 2] Vésicule selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans le tensioactif catanionique dérivé de sucre de formule (I),
Figure imgf000079_0003
est le 1- déoxylactilol.
[Revendication 3] Vésicule selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que, dans le dendrimère de formule (II),
Figure imgf000079_0004
est
Figure imgf000079_0005
[Revendication 4] Vésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le ratio molaire tensioactif catanionique/dendrimère est compris entre 50/1 et 1/1.
[Revendication 5] Vésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le taux d'encapsulation du dendrimère de formule (I) dans le tensioactif catanionique de formule (II) est supérieur à 50%.
[Revendication 6] Vésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le diamètre moyen est compris entre 50 et 500 nm.
[Revendication 7] Composition pharmaceutique comprenant au moins une vésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
[Revendication 8] Vésicule selon les revendications 1 à 6 ou composition pharmaceutique selon la revendication 7 pour son utilisation en tant que médicament.
[Revendication 9] Vésicule selon les revendications 1 à 6 ou composition pharmaceutique selon la revendication 7 pour son utilisation dans le traitement du psoriasis.
[Revendication 10] Vésicule pour son utilisation dans le traitement du psoriasis selon la revendication 9 par administration par voie topique.
[Revendication 11] Procédé de préparation d'une vésicule selon les revendications 1 à 6 comprenant successivement les étapes suivantes :
(a) mélange d'un ou plusieurs N-alkylaminosucres de formule (G) :
[Chem. 5]
Figure imgf000080_0001
(I') dans laquelle
Figure imgf000080_0002
est un sucre,
R1 est choisi parmi H et une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 20 chaînons,
R2 est une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 20 chaînons; et d'un acide phosphinique de formule (I”) :
[Chem. 6]
Figure imgf000081_0001
dans laquelle
R3 et R4 sont indépendamment l'un de l'autre une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée, de 1 à 19 chaînons et du dendrimère de formule (II) tel que défini dans les revendications 1 à 6 ; et
(b) optionnellement, séparation de la vésicule obtenue du dendrimère non- encapsulé.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005052031A1 (fr) 2003-11-24 2005-06-09 Rhodia Uk Ltd Nouveaux dendrimeres a terminaisons bisphosphoniques et derives, leur procede de preparation et leur utilisation
WO2010013086A1 (fr) 2008-08-01 2010-02-04 Centre National De La Recherche Scientifique Dendrimères phosphorylés en tant que médicaments anti-inflammatoires

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005052031A1 (fr) 2003-11-24 2005-06-09 Rhodia Uk Ltd Nouveaux dendrimeres a terminaisons bisphosphoniques et derives, leur procede de preparation et leur utilisation
WO2010013086A1 (fr) 2008-08-01 2010-02-04 Centre National De La Recherche Scientifique Dendrimères phosphorylés en tant que médicaments anti-inflammatoires
EP2341915A1 (fr) * 2008-08-01 2011-07-13 Centre National de la Recherche Scientifique Dendrimères phosphorylés en tant que médicaments anti-inflammatoires

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNE-MARIE CAMINADE ET AL: "The key role of the scaffold on the efficiency of dendrimer nanodrugs", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 6, no. 1, 14 July 2015 (2015-07-14), XP055643363, DOI: 10.1038/ncomms8722 *
BLANZAT MURIEL ET AL: "Dendritic catanionic assemblies: in vitro anti-HIV activity of phosphorus-containing dendrimers bearing galbeta1cer analogues", CHEMBIOCHEM,, vol. 6, no. 12, 1 December 2005 (2005-12-01), pages 2207 - 2213, XP002549180, ISSN: 1439-4227, [retrieved on 20051130], DOI: 10.1002/CBIC.200500203 *
BRUN, A.ETEMAD-MOGHADAM, G.: "New double-chain and aromatic (alpha-hydroxyalkyl)phosphorus amphiphiles", SYNTHESIS, vol. 10, 2002, pages 1385 - 1390
F. IELASI ET AL: "Influence of PPH dendrimers' surface functions on the activation of human monocytes: a study of their interactions with pure lipid model systems", PHYSICAL CHEMISTRY CHEMICAL PHYSICS, vol. 18, no. 31, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 21871 - 21880, XP055677714, ISSN: 1463-9076, DOI: 10.1039/C6CP03536A *
FRUCHON ET AL., MOLECULES, vol. 18, no. 8, 2013, pages 9305 - 16
FRUCHON SÉVERINE ET AL: "Biodistribution and Biosafety of a Poly(Phosphorhydrazone) Dendrimer, an Anti-Inflammatory Drug-Candidate", BIOMOLECULES, vol. 9, no. 9, 11 September 2019 (2019-09-11), CH, pages 475, XP055791921, ISSN: 2218-273X, DOI: 10.3390/biom9090475 *
FU H. ET AL., MOLECULES, vol. 16, 2014, pages 17715 - 17726
HAYDER M. ET AL., SCI TRANS MED, vol. 3, no. 81, 2011
HAYDER M., BIOMACROMOLECULES, vol. 16, 2015, pages 3425 - 3433
MYRIAM HAYDER ET AL: "Three-Dimensional Directionality Is a Pivotal Structural Feature for the Bioactivity of Azabisphosphonate-Capped Poly(PhosphorHydrazone) Nanodrug Dendrimers", BIOMACROMOLECULES, vol. 19, no. 3, 14 February 2018 (2018-02-14), pages 712 - 720, XP055719698, ISSN: 1525-7797, DOI: 10.1021/acs.biomac.7b01398 *
PORTEVIN D. ET AL., J TRANSI MED, vol. 7, 2009, pages 82
POUPOT ET AL., FASEB J., vol. 20, no. 13, 2006, pages 2339 - 51
ROLLAND ET AL., A EUROPEAN JOURNAL, vol. 14, 2008, pages 4836 - 4850
ROLLAND OLIVIER ET AL: "Tailored control and optimisation of the number of phosphonic acid termini on phosphorus-containing dendrimers for the ex-vivo activation of human monocytes", CHEMISTRY - A EUROPEAN JOURNAL, WILEY - V C H VERLAG GMBH & CO. KGAA, DE, vol. 14, no. 16, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 4836 - 4850, XP009116043, ISSN: 0947-6539, DOI: 10.1002/CHEM.200701063 *
ROLLAND, O. ET AL., CHEMISTRY - A EUROPEAN JOURNAL, vol. 14, 2008, pages 4836 - 4850
S. A. KLYMCHENKOV. G. PIVOVARENKOO. TURAND. P. ALEXANDER, NEW JOURNAL OF CHEMISTRY, vol. 27, no. 9, 2003, pages 1336 - 1343
SABRINA CONSOLA ET AL: "Design of Original Bioactive Formulations Based on Sugar-Surfactant/Non-steroidal Anti-inflammatory Catanionic Self-Assemblies: A New Way of Dermal Drug Delivery", CHEMISTRY - A EUROPEAN JOURNAL, vol. 13, no. 11, 23 March 2007 (2007-03-23), DE, pages 3039 - 3047, XP055637570, ISSN: 0947-6539, DOI: 10.1002/chem.200601449 *

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