WO2021121911A1 - Light sheet microscopy assembly and method - Google Patents

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WO2021121911A1
WO2021121911A1 PCT/EP2020/083772 EP2020083772W WO2021121911A1 WO 2021121911 A1 WO2021121911 A1 WO 2021121911A1 EP 2020083772 W EP2020083772 W EP 2020083772W WO 2021121911 A1 WO2021121911 A1 WO 2021121911A1
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light sheet
optics
light
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Thomas Huser
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    • G02B27/09—Beam shaping, e.g. changing the cross-sectional area, not otherwise provided for
    • G02B27/0905—Dividing and/or superposing multiple light beams

Definitions

  • the invention relates to an arrangement and a method for light sheet microscopy.
  • the invention also relates to the use of the arrangement for light sheet microscopy to convert or supplement a microscope into a light sheet microscope.
  • optical microscopy is limited in its spatial resolution by diffraction and, depending on the wavelength, limited to approx. 250 nm.
  • the majority of molecular biological and thus also biomedically relevant processes take place on a scale below this limit.
  • the HI virus (HIV-1) with a diameter of approx. 120 nm is a factor of 2 smaller than the resolution limit.
  • ribosomes the protein factories of the cell, are still much smaller than 100 nm. So far, these structure sizes have only been accessible to us through X-ray structure analysis or electron microscopy.
  • Nobel Prize in Chemistry was awarded to the physicists Stefan Hell, W.E. Moerner, and Eric Betzig in recognition of their discovery of methods that are suitable for circumventing the optical diffraction limit. So far, however, the majority of these methods could only be used at great expense and not in living cells.
  • a currently highly attractive method for high-resolution imaging of living cells and organisms is light sheet microscopy (SPIM - Selective Plane Illumination Microscopy).
  • SPIM light sheet microscopy
  • a light sheet approx. 1-2 ⁇ m thin is generated and radiated into a sample from the side.
  • the area illuminated in this way within the sample is then imaged perpendicular to this light sheet (i.e. at 90 ° to the excitation area).
  • this method has very high contrast and is extremely gentle on the sample. This principle was first used by Zsigmondy in 1912 to study colloidal solutions and was then long forgotten.
  • SIM microscopy the sample to be examined is excited to fluorescence with a lighting pattern that is generated by interference from several laser beams.
  • these laser rays are generated by diffraction on an optical grating and typically the rays that are diffracted into the +1. and -1. Diffraction order arise in a microscope lens at high angles (of up to approx.
  • FIG. 1 the principle of high-resolution microscopy based on structured lighting is shown.
  • Fig. 1 a it is shown that by irradiating mutually coherent laser beams into the rear aperture 3 of a microscope lens 1 with a high numerical aperture, two of the beams 4 that are focused on the edge of the rear aperture are refracted at high angles and brought to interference in the sample, creating a lateral interference pattern.
  • the additional introduction of a centrally focused laser beam 5 creates a three-dimensional interference pattern.
  • Fig. 1 b) the simulation of a 3D interference pattern is shown as it arises in a 3D SIM microscope in the sample plane. Here a wavelength of 500 nm was used and the rays were brought to interference as in the scheme shown in FIG. 1 c).
  • the interference structure is anisotropic, ie the periodicity in the axial direction is significantly greater than in the lateral direction .
  • the invention is therefore based on the object of creating a solution which makes it possible to further increase the isotropic resolution in light sheet microscopy and to implement the solution even more easily than in the prior art.
  • the present invention is based on the object of increasing the resolution of an optical microscope isotropically in all spatial directions and at the same time increasing the recording speed.
  • the invention also has the object of providing an arrangement which enables a microscope to be retrofitted or supplemented with an arrangement for light sheet microscopy.
  • the object is achieved according to the invention in that the arrangement comprises at least six lighting optics for illuminating a sample, the sample being located within a sample chamber in a medium.
  • the sample chamber is aligned parallel to a plane reference surface, while the lighting optics each include a lighting beam path and are set up to generate a light sheet from an excitation beam and to apply the light sheet to the sample at an angle other than zero with respect to a normal to the reference surface to steer.
  • the lighting optics each comprise at least one fiber-optic component, the fiber-optic component being set up in such a way that the excitation beam generated in a laser source is coupled into the lighting beam path of the lighting optics.
  • the at least six Illumination optics are arranged essentially hexagonally around the sample chamber and the arrangement comprises at least one fiber-optic switch, the fiber-optic switch being set up in such a way that, by switching the fiber-optic component, two opposing light sheets are directed onto the sample.
  • the fiber optic switch is further set up in such a way that the opposing light sheets are rotated several times by an angle of essentially 60 ° in a plane of the reference surface, so that the sample is illuminated from at least six different angles.
  • the arrangement comprises at least one detection optics with a detection beam path with an optical axis, the detection optics being arranged below the sample chamber and the optical axis being essentially parallel to the normal of the reference surface, the detection optics being set up in such a way as a fluorescence signal to detect the sample.
  • the basic idea of the present invention is thus to radiate two opposing light sheets of an excitation beam at an angle onto a sample, whereby the excitation beams can be guided compactly into the illumination optics by means of fiber-optic components and are thus only decoupled and brought into interference shortly before the sample.
  • the excitation beams can be radiated quickly onto the sample from different directions.
  • the illumination optics each comprise at least one optical element, the optical element being set up in such a way as to direct the excitation beam in the direction of the sample.
  • the detection optics comprises a fiber optic component and is set up to focus a central excitation beam in the sample, the central excitation beam is set up to interfere with the two light sheets that run in opposite directions to generate a structured light sheet and a three-dimensionally structured one overall Generate light sheet.
  • the detection optics is a microscope objective.
  • the angle between the light sheet of the lighting optics and the normal of the reference surface is between 75 ° and 90 °.
  • the absolute values of the angle between the light sheet and the normal to the reference surface and the angle between an opposing light sheet and the reference surface are the same.
  • the illumination optics each comprise at least one cylinder lens, the cylinder lens being set up in such a way as to generate the light sheet from the excitation beam.
  • the detection optics are set in a stage, the stage being set up in such a way that the distance between the sample and the detection optics can be changed.
  • the stage comprises a piezoelectric element, the piezoelectric element being set up in such a way as to change the distance between the sample and the detection optics.
  • a piezoelectric element for example, the entire sample chamber can be moved with high precision along the z-direction relative to the detection optics, that is, in the axial direction.
  • a method for light sheet microscopy comprising the following steps:
  • the method comprises the additional step:
  • the fiber-optic component for example an optical fiber
  • the fiber-optic component is displaced along the optical axis and thus the phase setting of the optical fiber is changed.
  • the method comprises the following additional steps:
  • the step of changing a distance between the sample and the detection optics takes place by means of a piezoelectric element.
  • the use of the arrangement for light sheet microscopy for converting or supplementing a microscope into a light sheet microscope is also specified.
  • the 3D high-resolution structured lighting can be integrated into a compact microscope head using light sheet microscopy, whereby a fluorescence microscope can be expanded to a light sheet microscope and a high-resolution 3D fluorescence microscope.
  • a modular structure of the components, while retaining existing optomechanical and optoelectronic components, can be provided in order to make the conversion simple and inexpensive.
  • the arrangement for light sheet microscopy is provided separately from a microscope and can subsequently be modularly coupled to the microscope by the user in order to subsequently convert or supplement the microscope into a light sheet microscope and a high-resolution microscope.
  • the arrangement for light sheet microscopy has its own housing that can be coupled to the housing of the microscope, for example a stage made of metal in which the arrangement for light sheet microscopy is housed.
  • FIG. 2 shows simulated three-dimensional interference patterns which arise from the superposition of three laser beams according to an exemplary embodiment of the invention
  • FIG. 3 shows a device for three-dimensional light sheet microscopy according to an embodiment of the invention
  • FIG. 4 shows various top views of a sample chamber with light sheets shown from above according to an exemplary embodiment of the invention
  • 5 shows a top view of a sample chamber with light sheets shown from above according to an exemplary embodiment of the invention
  • 6 shows a simulation of an interference pattern of less than 80 degrees to the normal of a glass surface incident opposite laser beams according to an embodiment of the invention
  • FIG. 7 shows a flow chart of a method for light sheet microscopy according to a
  • FIG. 1 shows the principle of high-resolution microscopy, already described in the introduction to the description, based on the structured illumination according to the prior art.
  • FIG. 2 shows simulated three-dimensional interference patterns which arise from the superposition of three laser beams according to an exemplary embodiment of the invention.
  • Fig. 2 a the best possible increase in resolution is obtained by irradiating laser beams at the angles 90 °, -90 ° and 0 °.
  • this is difficult to achieve in practice, which is mainly due to the fact that biological samples have to be prepared on a transparent substrate, usually a thin glass slide (cover slide), in order to be able to depict them as efficiently and realistically as possible.
  • This geometry therefore makes it difficult to radiate laser beams parallel to the glass surface into the sample and cause them to interfere.
  • the smallest possible interference structure with a periodicity of 187.96 nm (at 500 nm wavelength and a refractive index of water of 1.33). If this structure is also penetrated with a laser beam below 0 °, an interference structure is also created in the axial direction (in the simulation with a periodicity of 188.03 nm). The resulting interference pattern is isotropic in all spatial directions. The next best solution is to keep the angle at which the laser beams are brought to interference as close as possible to the ideal solution.
  • FIG. 3 shows an arrangement for three-dimensional light sheet microscopy according to an exemplary embodiment of the invention.
  • the arrangement shown in FIG. 3 comprises at least six illumination optics 14 for illuminating a sample 13, the sample 13 being located within a sample chamber 11 in a medium 12.
  • the sample chamber 11 is aligned parallel to a flat, optically transparent reference surface 16.
  • the lighting optics 14 each include an illuminating beam path 17.
  • the lighting optics 14 are set up to generate a light sheet 27 from an excitation beam 18 and to direct the light sheet 27 towards the sample 13 at an angle other than zero with respect to a normal 19 of the reference surface 16 to steer.
  • the excitation beams 18 can be generated by means of a laser source 21, for example.
  • excitation beams 18 for opposing light sheets 27 into the illumination beam paths 17 is implemented via fiber-optic components 10 which couple out the excitation beams 18 as Gaussian beams. These are directed onto the sample 13 at a flat angle of, for example, 5 ° to 10 °, via mirror 15 arranged in opposite directions. Shortly before the rays 18 penetrate the sample chamber 11, they are shaped by cylindrical lenses 25 into narrow sheets of light 27.
  • the illumination optics 14 are arranged hexagonally around the sample 13, as shown in the plan view in FIG. 4.
  • the arrangement further comprises at least one fiber optic switch 20 which is not shown in FIG. 3.
  • the fiber-optic switch 20 is set up in such a way that, by switching the fiber-optic component 10, two light sheets 27 running in opposite directions are directed onto the sample 13.
  • the fiber-optic switch 20 is set up in such a way that the opposing light sheets 27 are rotated several times by an angle of essentially 60 ° in a plane of the reference surface 16, so that the sample 13 is illuminated from at least six different angles.
  • the fiber optic switch 20 is a micro-electromechanical fiber switch.
  • micro-electromechanical fiber switches fiber-MEMS switches
  • fiber-MEMS switches make it possible to switch light from a running optical fiber between several outgoing optical fibers in less than 1 millisecond. With a single 1x3 MEMS switch, a quick change between the fiber optic components 10 can therefore be realized.
  • the advantage of this method is that almost no laser light is lost and very fast switching times can be implemented using this technology.
  • the structure described in FIG. 3 uses a single microscope objective with a high numerical aperture as detection optics 9, which are used to detect the fluorescence signal and at the same time can focus a central excitation beam 24 into the sample.
  • the microscope lens 9 is supported, for example, in a stage 26 made of metal. A mating thread allows the stage 26 to be screwed into a regular inverted microscope.
  • a counterpart 29 manufactured for the stage 26 holds the sample chamber 11 as well as the fiber optic components 10 for coupling the excitation beams 18 into the illumination beam path 17 of the illumination optics 14 for the fluorescence excitation of the sample 13 by means of opposing light sheets 27.
  • the stage 26 can therefore also be used for recording of the sample 13 and for fine adjustment of the distance between the sample 13 and the microscope lens 9 who used the.
  • the stage 26 can, for example, also be screwed into a regular inverted microscope from various manufacturers via a standard RMS thread in order to use its imaging optics and the camera connections and thus represents a flexible extension existing microscopes to high-resolution microscopy and light sheet microscopy.
  • the excitation beams 18 of the opposing light sheets 27 can be switched very quickly offset by 60 ° by means of the fiber optic switch 20 and in this way at six different angles, the sample 13 being switched by the opposing light sheets 27 with each adjustment 60 ° is illuminated at two angles.
  • This is advantageous in order to generate a uniform increase in resolution in the lateral direction in the subsequent computer-based image reconstruction.
  • a shift in the lateral phase of the interference pattern can also be provided, which can be implemented, for example, by shifting the fiber-optic component 10 along the optical axis.
  • a 3D interference pattern is generated by adding a central excitation beam 24.
  • the central excitation beam 24 is focused into the sample 11 by means of the microscope objective 9. If the central excitation beam 24 is also added, an interference pattern arises at the level of the sample 11, as is shown by way of example in FIG. 2 b). As a result, the resolution of the optical system is increased almost isotropically in the xy direction and in the z direction.
  • the entire sample chamber 11 can be moved with high precision along the z-direction, that is, in the axial direction, and thus the images necessary for the 3D reconstruction can be recorded.
  • the solution shown here is advantageous, since omitting the central beam 24 still results in a lateral interference pattern of the opposing light sheets 27, which illuminates the sample 13 with minimal excitation power and stimulates fluorescence.
  • the resulting fluorescence images are in turn with the detection optics 9, for example a high-resolution micro Scope lens recorded and calculated as 2D high-resolution images as part of a computer-aided image reconstruction.
  • the resolution that can be achieved with this arrangement is in the range of approx.
  • FIG. 4 shows various top views of a sample chamber 11 with light sheets 27 shown from above according to an exemplary embodiment of the invention.
  • the Pro benhunt 11 is indicated as a hexagon and the light sheets 27 seen from above, which are generated by oppositely arranged cylindrical lenses 25 are shown.
  • 4 a) - c) the opposing light sheets 27 are generated with the help of a fiber optic switch 20 offset by 60 ° in order to achieve a uniform reconstruction of the high-resolution image information, as is common in SIM microscopy, for example.
  • FIG. 5 shows a plan view of a sample chamber 11 with light sheets 27 shown from above according to an exemplary embodiment of the invention.
  • the sample chamber 11 is again indicated as a hexagon and the light sheets 27, seen from above, which are generated by the oppositely arranged cylindrical lenses 25, are shown.
  • a laser source 21 for generating the excitation beams 18 and a fiber optic switch 20 are shown.
  • the fiber-optic switch 20 the excitation beams 18 can be coupled quickly into the lighting beam path 17 of the lighting optics 14 via the fiber-optic components 10.
  • FIG. 6 shows a simulation of an interference pattern of less than 80 degrees to the normal of a glass surface incident opposite laser beams according to an exemplary embodiment of the invention. Reflection on the glass surface also creates an interference pattern in the axial direction (along z).
  • a more realistic simulation of the illumination of the sample with opposing laser beams was carried out, taking into account the glass carrier with the Zemax optical simulation software carried out. Since the laser beams hit the interface between the liquid in the sample chamber and the glass slide at a very flat angle, most of the laser light is reflected at this interface, which in turn leads to interference with the light emitted from the opposite direction.
  • FIG. 7 shows a flow diagram of a method for light sheet microscopy according to an exemplary embodiment of the invention.
  • the method begins with step 700 with the provision of a previously described arrangement for light sheet microscopy.
  • a sample 13 is illuminated with at least two opposing light sheets 27, the light sheets 27 being generated from at least two excitation beams 18, where the excitation beams 18 are coupled into at least two fiber-optic components 10 and are coupled out into the illumination beam paths 17.
  • step 720 a fluorescence signal of the sample 13 is detected by means of the detection optics 9.
  • step 730 the opposing light sheets 27 are rotated around the sample 13 by an angle of essentially 60 °. This is done by dividing the excitation beams 18 into two further fiber-optic components 10 by means of the fiber-optic switch 20 in this way be coupled in that the opposing light sheets 27 generated from the excitation beams are rotated by an angle of essentially 60 ° around the sample 13 and irradiate the sample 13 from an angle offset by essentially 60 °.
  • step 740 the method is carried out again until at least the opposing light blades 27 are rotated twice around the sample 13 by an angle of essentially 60 °. If the light sheets 27 were rotated twice by 60 ° in relation to the sample 13, the sample 13 was thus illuminated from six different angles in order to achieve a uniform reconstruction of high-resolution image information.
  • the sample 13 is illuminated by means of a central excitation beam 24 by means of the detection optics 9 in order to generate a 3D interference pattern.
  • Another method step can be changing a distance between the sample 13 and the detection optics 9.
  • the distance between the sample 13 and the detection optics 9 can take place, for example, by means of a piezoelectric element which, for example, moves the sample chamber 11 with high precision in the axial direction along the normal 19 of the reference surface 16.

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Abstract

The invention relates to a light sheet microscopy assembly. At least six illumination optical units (14) for illuminating a sample (13) are designed to generate a light sheet (27) out of an excitation beam (18) and deflect the light sheet (27) onto the sample (13) at an angle differing from null relative to a normal (19) to the reference surface (16). Each illumination optical unit (14) comprises at least one fiber-optic component (10), wherein the fiber-optic component (10) is designed to couple the excitation beam (18) generated in a laser source (21) into the illumination beam path (17) of the illumination optical unit (14), and the at least six illumination optical units (14) are arranged in a substantially hexagonal manner about the sample chamber (11). The assembly comprises at least one fiber-optic switch (20), said fiber-optic switch (20) being designed to deflect two light sheets (27) running in opposite directions onto the sample (13) by switching the fiber-optic component (10). The fiber-optic switch (20) is additionally designed to rotate the light sheets (27) running in opposite directions by an angle of substantially 60° on a plane of the reference surface (16) multiple times. The invention also relates to a light sheet microscopy method and to the use of the light sheet microscopy assembly for converting a microscope into a light sheet microscope or for supplementing a microscope in order to produce a light sheet microscope.

Description

ANORDNUNG UND VERFAHREN ZUR LICHTBLATTMIKROSKOPIE ARRANGEMENT AND METHOD OF LIGHT LEAF MICROSCOPY
Die Erfindung betrifft eine Anordnung sowie ein Verfahren zur Lichtblattmikroskopie. Auch betrifft die Erfindung die Verwendung der Anordnung zur Lichtblattmikroskopie zur Um wandlung oder Ergänzung eines Mikroskops in ein Lichtblattmikroskop. The invention relates to an arrangement and a method for light sheet microscopy. The invention also relates to the use of the arrangement for light sheet microscopy to convert or supplement a microscope into a light sheet microscope.
Die optische Mikroskopie ist prinzipiell in ihrer räumlichen Auflösung durch Beugung be grenzt und, je nach Wellenlänge, auf ca. 250 nm beschränkt. Die überwiegende Zahl an mole kularbiologischen und damit auch biomedizinisch relevanten Prozessen findet allerdings auf einer Skala unterhalb dieser Grenze statt. So ist zum Beispiel das HI Virus (HIV-1) mit ca. 120 nm Durchmesser um einen Faktor 2 kleiner als die Auflösungsgrenze. Als weiteres Bei spiel sind Ribosomen, die Protein-Fabriken der Zelle, noch wesentlich kleiner als 100 nm. Diese Strukturgrößen waren uns daher bisher nur durch Röntgenstrukturanalyse oder Elektro nenmikroskopie zugänglich. Im Jahr 2014 wurde der Nobelpreis für Chemie an die Physiker Stefan Hell, W.E. Moerner, und Eric Betzig verliehen, um damit ihre Entdeckung von Metho den, die zur Umgehung der optischen Beugungsgrenze geeignet sind, zu würdigen. Bisher konnten diese Methoden jedoch in der Mehrzahl nur mit hohem Kostenaufwand und nicht in lebenden Zellen genutzt werden. In principle, optical microscopy is limited in its spatial resolution by diffraction and, depending on the wavelength, limited to approx. 250 nm. The majority of molecular biological and thus also biomedically relevant processes take place on a scale below this limit. For example, the HI virus (HIV-1) with a diameter of approx. 120 nm is a factor of 2 smaller than the resolution limit. As a further example, ribosomes, the protein factories of the cell, are still much smaller than 100 nm. So far, these structure sizes have only been accessible to us through X-ray structure analysis or electron microscopy. In 2014 the Nobel Prize in Chemistry was awarded to the physicists Stefan Hell, W.E. Moerner, and Eric Betzig in recognition of their discovery of methods that are suitable for circumventing the optical diffraction limit. So far, however, the majority of these methods could only be used at great expense and not in living cells.
Eine derzeit hochattraktive Methode zur hochauflösenden Abbildung lebender Zellen und Organismen ist die Lichtblattmikroskopie (SPIM - Selective Plane Illumination Microscopy). Hier wird z.B. mithilfe einer Zylinderlinse ein ca. 1-2 pm dünnes Lichtblatt erzeugt und seit lich in eine Probe eingestrahlt. Die so beleuchtete Fläche innerhalb der Probe wird dann senk recht zu diesem Lichtblatt (also unter 90° zur Anregungsfläche) abgebildet. Durch Trennung der Anregungs- und der Detektionsebene wird immer nur der Teil der Probe mit Licht durch strahlt, der auch zur Signalerzeugung benötigt wird. Dadurch wird diese Methode sehr kon trastreich und ist äußerst probenschonend. Dieses Prinzip wurde zuerst von Zsigmondy 1912 zur Untersuchung von kolloidalen Lösungen eingesetzt und geriet dann für lange Zeit in Ver gessenheit. Erst in der 1990er Jahren wurde diese Methode wieder entdeckt und hat seitdem rapide an Interesse gewonnen und wurde bereits von mehreren Anbietern kommerziell umge setzt. Ein Problem dieser konventionellen Lichtblattmikroskopie ist allerdings, dass sie in ihrer räumlichen Auflösung immer noch durch das optische Beugungslimit begrenzt ist. Hier sind gerade in jüngerer Zeit interessante Varianten aufgekommen, die dieses Beugungslimit in Kombination mit der Erzeugung von Interferenzmustern umgehen. Die erste Veröffentlichung in dieser Richtung stammt aus dem Jahr 2008 (L. Shao et al., I(5)S: Wide-field light microscopy with 100-nm-scale resolution in three dimensions. Biophys J 94, 4971-4983 (2008)). Hier wird ein dreidimensionales Interferenzmuster auch in axialer Richtung erzeugt, um eine weitestgehend isotrope Auflösung von ca. 100 nm in sämtlichen Raumrichtungen zu erzeugen. Die Auflösungsverbesserung in axialer Richtung wird hier durch zwei entgegenge setzt angeordnete hochauflösende Objektive erreicht, deren Strahlen miteinander zur Interfe renz gebracht werden. Diese Implementierung ist allerdings höchst aufwändig und teuer. Au ßerdem beschränkt sie das zur Verfügung stehende Probenvolumen auf kleinste Probenkam mern, mit einer axialen Dicke von max. ca. 200 mih Aufgrund dieser Einschränkungen wurde diese Methode seither nicht weiter eingesetzt. Vor ca. 20 Jahren wurde schon einmal versucht, die Mikroskopie mit entgegengesetzt angeordneten Mikroskopobjektiven als 4 -Mikroskopie kommerziell umzusetzen (Leica 4 -Mikroskop). Dieses System war allerdings sehr teuer und konnte sich, auch aufgrund des hohen täglichen Justier-Aufwands nicht am Markt durchset zen. Vor kurzem wurde in der Arbeitsgruppe von Emst Stelzer am Buchmann-Institute for Molecular Life Sciences an der Wolfgang-Goethe-Universität Frankfurt gezeigt, dass die Lichtblattmikroskopie, in Verbindung mit gegenläufig erzeugten Lichtblättern, durch die sich ein stehendes Interferenzmuster im Lichtblatt ausbildet, ebenfalls zur signifikanten Erhöhung der räumlichen Auflösung benutzt werden kann (B. J. Chang, V. D. Perez Meza, E. H. K. Stelzer, csiLSFM combines light-sheet fluorescence microscopy and coherent structured Illu mination for a lateral resolution below 100 nm. Proc. Natl. Acad. Sei. U S A 114, 4869-4874 (2017)). Auch diese Realisierung wurde unter hohem technischem Aufwand getätigt, in der 3 hochauflösende Mikroskopobjektive wiederum das Probenvolumen signifikant einschränken. Außerdem konnte die Erhöhung der Auflösung nur in lateraler und nicht in axialer Richtung umgesetzt werden, sodass die dadurch entstehenden Mikroskopie- Aufnahmen nur in lateraler Richtung und damit anisotrop mit ca. 90 nm Auflösung erzeugt werden. Eine hochempfindliche und gleichzeitig sehr schnelle optisch hochauflösende Mikroskopie methode ist die Methode der strukturierten Beleuchtung (englisch: structured Illumination microscopy (SIM)). In der SIM-Mikroskopie wird die zu untersuchende Probe mit einem Be leuchtungsmuster zur Fluoreszenz angeregt, das durch Interferenz von mehreren Laserstrahlen erzeugt wird. Bei bisher kommerziell umgesetzten SIM Mikroskopen werden diese Laser strahlen durch Beugung an einem optischen Gitter erzeugt und typischerweise werden die Strahlen, die durch Beugung in die +1. und -1. Beugungsordnung entstehen in einem Mikro skopobjektiv unter hohen Winkeln (von bis zu ca. 65° zur optischen Achse - in Figur 1 b) ist dies als 115° gezeigt, wenn man den Winkel nach oben hin misst, wie in der Figur angedeu tet) zur Interferenz gebracht, was ein laterales Streifenmuster in der Probe erzeugt. Wird zu sätzlich noch die 0. Beugungsordnung zentral in die Probe eingestrahlt, so entsteht auch ein Interferenzmuster in axialer Richtung. A currently highly attractive method for high-resolution imaging of living cells and organisms is light sheet microscopy (SPIM - Selective Plane Illumination Microscopy). Here, for example, with the help of a cylinder lens, a light sheet approx. 1-2 μm thin is generated and radiated into a sample from the side. The area illuminated in this way within the sample is then imaged perpendicular to this light sheet (i.e. at 90 ° to the excitation area). By separating the excitation and detection levels, only the part of the sample that is required for signal generation is transmitted with light. As a result, this method has very high contrast and is extremely gentle on the sample. This principle was first used by Zsigmondy in 1912 to study colloidal solutions and was then long forgotten. This method was only rediscovered in the 1990s and since then has rapidly gained interest and has already been implemented commercially by several providers. One problem with this conventional light sheet microscopy, however, is that it can be used in their spatial resolution is still limited by the optical diffraction limit. Interesting variants have recently emerged that circumvent this diffraction limit in combination with the generation of interference patterns. The first publication in this direction dates from 2008 (L. Shao et al., I (5) S: Wide-field light microscopy with 100-nm-scale resolution in three dimensions. Biophys J 94, 4971-4983 (2008 )). Here, a three-dimensional interference pattern is also generated in the axial direction in order to generate a largely isotropic resolution of approx. 100 nm in all spatial directions. The resolution improvement in the axial direction is achieved here by two oppositely arranged high-resolution lenses, the beams of which are made to interfere with one another. However, this implementation is extremely complex and expensive. In addition, it limits the available sample volume to the smallest sample chambers, with an axial thickness of max. Approx. 200 mih Because of these limitations, this method has not been used since then. Around 20 years ago, attempts were made to commercially implement microscopy with oppositely arranged microscope objectives as 4 microscopy (Leica 4 microscope). However, this system was very expensive and, due to the high daily adjustment effort, could not establish itself on the market. Recently, in the working group of Emst Stelzer at the Buchmann Institute for Molecular Life Sciences at the Wolfgang Goethe University Frankfurt, it was shown that light sheet microscopy, in conjunction with light sheets generated in opposite directions, through which a standing interference pattern is formed in the light sheet, can also be used significant increase in spatial resolution can be used (BJ Chang, VD Perez Meza, EHK Stelzer, csiLSFM combines light-sheet fluorescence microscopy and coherent structured illumination for a lateral resolution below 100 nm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114, 4869-4874 (2017)). This realization was also carried out with great technical effort, in which 3 high-resolution microscope objectives in turn significantly limit the sample volume. In addition, the increase in resolution could only be implemented in the lateral and not in the axial direction, so that the resulting microscope images are only generated in the lateral direction and thus anisotropically with a resolution of approx. A highly sensitive and at the same time very fast optically high-resolution microscopy method is the structured illumination microscopy (SIM) method. In SIM microscopy, the sample to be examined is excited to fluorescence with a lighting pattern that is generated by interference from several laser beams. In SIM microscopes that have been commercially implemented to date, these laser rays are generated by diffraction on an optical grating and typically the rays that are diffracted into the +1. and -1. Diffraction order arise in a microscope lens at high angles (of up to approx. 65 ° to the optical axis - in Figure 1 b) this is shown as 115 ° if the angle is measured upwards, as indicated in the figure) to Brought interference, which creates a lateral fringe pattern in the sample. If the 0th order of diffraction is also radiated centrally into the sample, an interference pattern also arises in the axial direction.
In Figur 1 ist das Prinzip der hochauflösenden Mikroskopie basierend auf strukturierter Be leuchtung gezeigt. In Fig. 1 a) ist gezeigt, dass durch Einstrahlen von zueinander kohärenten Laserstrahlen in die rückwärtige Apertur 3 eines Mikroskopobjektivs 1 mit hoher numerischer Apertur, werden zwei der Strahlen 4, die am Rande der rückwärtigen Apertur fokussiert wer den, unter hohen Winkeln gebrochen und in der Probe zur Interferenz gebracht, wodurch ein laterales Interferenzmuster entsteht. Durch zusätzliches Einbringen eines zentral fokussierten Laserstrahls 5 entsteht ein dreidimensionales Interferenzmuster. In Fig. 1 b) ist die Simulation eines 3D Interferenzmusters gezeigt, wie es in einem 3D-SIM Mikroskop in der Proben- Ebene entsteht. Hier wurde eine Wellenlänge von 500 nm benutzt und die Strahlen, wie in dem in Fig. 1 c) gezeigten Schema, zur Interferenz gebracht. Außerdem wurde der Bre chungsindex von Wasser (n=l,33) als Medium benutzt. Dabei entsteht eine laterale Interfe renzstruktur mit 207,5 nm Periodizität, sowie eine axiale Interferenzstruktur mit 324,2 nm Periodizität. Wie man bereits an dem in Fig. 1 gezeigten Interferenzmuster erkennt, wird durch die Not wendigkeit, mehrere Laserstrahlen mithilfe eines einzigen hochauflösenden Mikroskopobjek tivs zur Interferenz zu bringen, die Interferenzstruktur anisotrop, d.h. die Periodizität in axia ler Richtung ist deutlich größer als in lateraler Richtung. Dadurch ist auch die Auflösung die ser Mikroskopiemethode auf ca. 100 nm in x-y -Richtung (lateral) und 300 nm in z-Richtung (axial) beschränkt, was dennoch die Auflösung eines herkömmlichen Fluoreszenzmikroskops bereits um einen Faktor 2 in sämtlichen Raumrichtungen erhöht. In Figure 1, the principle of high-resolution microscopy based on structured lighting is shown. In Fig. 1 a) it is shown that by irradiating mutually coherent laser beams into the rear aperture 3 of a microscope lens 1 with a high numerical aperture, two of the beams 4 that are focused on the edge of the rear aperture are refracted at high angles and brought to interference in the sample, creating a lateral interference pattern. The additional introduction of a centrally focused laser beam 5 creates a three-dimensional interference pattern. In Fig. 1 b) the simulation of a 3D interference pattern is shown as it arises in a 3D SIM microscope in the sample plane. Here a wavelength of 500 nm was used and the rays were brought to interference as in the scheme shown in FIG. 1 c). In addition, the refractive index of water (n = 1.33) was used as the medium. This creates a lateral interference structure with 207.5 nm periodicity and an axial interference structure with 324.2 nm periodicity. As can already be seen from the interference pattern shown in Fig. 1, the need to bring multiple laser beams using a single high-resolution microscope lens to interference, the interference structure is anisotropic, ie the periodicity in the axial direction is significantly greater than in the lateral direction . This also limits the resolution of this microscopy method to approx. 100 nm in the xy direction (lateral) and 300 nm in the z direction (axial), which nevertheless increases the resolution of a conventional fluorescence microscope by a factor of 2 in all spatial directions.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Lösung zu schaffen, die es ermöglicht die isotrope Auflösung in der Lichtblattmikroskopie weiter zu erhöhen und die Lösung ge genüber dem Stand der Technik noch einfacher umzusetzen. Insbesondere liegt der vorliegen den Erfindung die Aufgabe zugrunde die Auflösung eines optischen Mikroskops isotrop in alle Raumrichtungen zu erhöhen und gleichzeitig die Aufnahmegeschwindigkeit zu steigern. Auch hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, eine Anordnung bereitzustellen, welches eine Nachrüstung oder Ergänzung eines Mikroskops mit einer Anordnung zur Lichtblattmik roskopie ermöglicht. The invention is therefore based on the object of creating a solution which makes it possible to further increase the isotropic resolution in light sheet microscopy and to implement the solution even more easily than in the prior art. In particular, the present invention is based on the object of increasing the resolution of an optical microscope isotropically in all spatial directions and at the same time increasing the recording speed. The invention also has the object of providing an arrangement which enables a microscope to be retrofitted or supplemented with an arrangement for light sheet microscopy.
Bei einer Anordnung zur Lichtblattmikroskopie der eingangs beschriebenen Art wird die Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass die Anordnung zumindest sechs Beleuch tungsoptiken zur Beleuchtung einer Probe umfasst, wobei sich die Probe innerhalb einer Pro benkammer in einem Medium befindet. Dabei wird die Probenkammer parallel zur einer ebe nen Bezugsfläche ausgerichtet, während die Beleuchtungsoptiken jeweils einen Beleuch tungsstrahlengang umfassen und derart eingerichtet sind, ein Lichtblatt aus einem Anregungs strahl zu erzeugen und das Lichtblatt unter einem von Null verschiedenen Winkel bezüglich einer Normalen der Bezugsfläche auf die Probe zu lenken. Weiterhin umfassen die Beleuch tungsoptiken jeweils zumindest eine faseroptische Komponente, wobei die faseroptische Komponente derart eingerichtet ist, den in einer Laserquelle erzeugten Anregungsstrahl in den Beleuchtungsstrahlengang der Beleuchtungsoptik einzukoppeln. Die zumindest sechs Be- leuchtungsoptiken sind im Wesentlichen hexagonal um die Probenkammer angeordnet und die Anordnung umfasst zumindest einen faseroptischen Schalter, wobei der faseroptische Schalter derart eingerichtet ist, durch Schalten der faseroptischen Komponente zwei gegenläu figen Lichtblätter auf die Probe zu lenken. Der faseroptische Schalter ist weiter derart einge richtet, die gegenläufigen Lichtblätter mehrfach um einem Winkel von im Wesentlichen 60° in einer Ebene der Bezugsfläche zu verdrehen, so dass die Probe aus zumindest sechs ver schiedenen Winkeln beleuchtet wird. Außerdem umfasst die Anordnung zumindest eine De tektionsoptik mit einem Detektionsstrahlengang mit einer optischen Achse, wobei die Detek tionsoptik unterhalb der Probenkammer angeordnet ist und die optische Achse im Wesentli chen parallel zu der Normalen der Bezugsfläche ist, wobei die Detektionsoptik derart einge richtet ist, ein Fluoreszenssignal der Probe zu detektieren. In an arrangement for light sheet microscopy of the type described at the outset, the object is achieved according to the invention in that the arrangement comprises at least six lighting optics for illuminating a sample, the sample being located within a sample chamber in a medium. The sample chamber is aligned parallel to a plane reference surface, while the lighting optics each include a lighting beam path and are set up to generate a light sheet from an excitation beam and to apply the light sheet to the sample at an angle other than zero with respect to a normal to the reference surface to steer. Furthermore, the lighting optics each comprise at least one fiber-optic component, the fiber-optic component being set up in such a way that the excitation beam generated in a laser source is coupled into the lighting beam path of the lighting optics. The at least six Illumination optics are arranged essentially hexagonally around the sample chamber and the arrangement comprises at least one fiber-optic switch, the fiber-optic switch being set up in such a way that, by switching the fiber-optic component, two opposing light sheets are directed onto the sample. The fiber optic switch is further set up in such a way that the opposing light sheets are rotated several times by an angle of essentially 60 ° in a plane of the reference surface, so that the sample is illuminated from at least six different angles. In addition, the arrangement comprises at least one detection optics with a detection beam path with an optical axis, the detection optics being arranged below the sample chamber and the optical axis being essentially parallel to the normal of the reference surface, the detection optics being set up in such a way as a fluorescence signal to detect the sample.
Grundidee der vorliegenden Erfindung ist es somit, zwei gegenläufige Lichtblätter eines An regungsstrahls unter einem Winkel auf eine Probe einzustrahlen wobei die Anregungsstrahlen mittels faseroptischer Komponenten kompakt in die Beleuchtungsoptik geführt werden kön nen und damit erst kurz vor der Probe ausgekoppelt und zur Interferenz gebracht werden. Mit tels einer faseroptischen Schalters können die Anregungsstrahlen schnell aus verschiedenen Richtungen auf die Probe eingestrahlt werden. The basic idea of the present invention is thus to radiate two opposing light sheets of an excitation beam at an angle onto a sample, whereby the excitation beams can be guided compactly into the illumination optics by means of fiber-optic components and are thus only decoupled and brought into interference shortly before the sample. By means of a fiber optic switch, the excitation beams can be radiated quickly onto the sample from different directions.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die Beleuchtungsoptiken jeweils zumin dest ein optisches Element, wobei das optische Element derart eingerichtet ist, den Anre gungsstrahl in Richtung der Probe zu lenken. In one embodiment of the invention, the illumination optics each comprise at least one optical element, the optical element being set up in such a way as to direct the excitation beam in the direction of the sample.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die Detektionsoptik eine faseropti sche Komponente und ist derart eingerichtet, einen zentralen Anregungsstrahl in der Probe zu fokussieren, der zentrale Anregungsstrahl derart eingerichtet ist mit den zwei zur Erzeugung eines strukturierten Lichtblatts gegenläufigen Lichtblättern zu interferieren und insgesamt ein dreidimensional strukturiertes Lichtblatt zu erzeugen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Detektionsoptik ein Mikroskopobjektiv. In a further embodiment of the invention, the detection optics comprises a fiber optic component and is set up to focus a central excitation beam in the sample, the central excitation beam is set up to interfere with the two light sheets that run in opposite directions to generate a structured light sheet and a three-dimensionally structured one overall Generate light sheet. In one embodiment of the invention, the detection optics is a microscope objective.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung beträgt der Winkel zwischen dem Licht blatt der Beleuchtungsoptik und der Normalen der Bezugsfläche zwischen 75° und 90°. Ins besondere kann es vorgesehen sein, dass die Beträge des Winkels zwischen dem Lichtblatt und der Normalen der Bezugsfläche und der Winkel zwischen einem gegenläufigen Lichtblatt und der Bezugsfläche gleich sind. In a further embodiment of the invention, the angle between the light sheet of the lighting optics and the normal of the reference surface is between 75 ° and 90 °. In particular, it can be provided that the absolute values of the angle between the light sheet and the normal to the reference surface and the angle between an opposing light sheet and the reference surface are the same.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die Beleuchtungsoptiken jeweils zumin dest eine Zylinderlinse, wobei die Zylinderlinse derart eingerichtet ist, das Lichtblatt aus dem Anregungsstrahl zu erzeugen. In one embodiment of the invention, the illumination optics each comprise at least one cylinder lens, the cylinder lens being set up in such a way as to generate the light sheet from the excitation beam.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Detektionsoptik in eine Bühne ein gefasst, wobei die Bühne derart eingerichtet, ist den Abstand zwischen der Probe und der De tektionsoptik zu verändern. In a further embodiment of the invention, the detection optics are set in a stage, the stage being set up in such a way that the distance between the sample and the detection optics can be changed.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Bühne ein piezoelektrisches Element, wobei das piezoelektrisches Element derart eingerichtet ist, den Abstand zwischen der Probe und der Detektionsoptik zu verändern. Mittels eines piezoelektrischen Elements lässt sich beispielsweise die gesamte Probenkammer mit hoher Präzision entlang der z-Richtung relativ zur Detektionsoptik, also in axialer Richtung, verfahren. In one embodiment of the invention, the stage comprises a piezoelectric element, the piezoelectric element being set up in such a way as to change the distance between the sample and the detection optics. By means of a piezoelectric element, for example, the entire sample chamber can be moved with high precision along the z-direction relative to the detection optics, that is, in the axial direction.
Erfmdungsgemäß ist außerdem ein Verfahren zur Lichtblattmikroskopie angegeben, umfas send die folgenden Schritte: According to the invention, a method for light sheet microscopy is also specified, comprising the following steps:
- Bereitstellen einer Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche, - Provision of an arrangement according to one of the preceding claims,
- Beleuchten der Probe mit zumindest zwei gegenläufigen Lichtblättern, wobei die Lichtblät ter aus zumindest zwei Anregungsstrahlen erzeugt werden, wobei die Anregungsstrahlen in zumindest zwei faseroptische Komponenten eingekoppelt werden und in die Beleuchtungs strahlengänge ausgekoppelt werden, - Illuminating the sample with at least two counter-rotating light sheets, wherein the light sheets are generated from at least two excitation beams, the excitation beams in at least two fiber optic components are coupled in and coupled out into the illumination beam paths,
- Detektieren eines Fluoreszenzsignals der Probe mittels der Detektionsoptik, - Detecting a fluorescence signal of the sample by means of the detection optics,
- Einkoppeln der Anregungsstrahlen in zwei weitere faseroptische Komponenten mittels des faseroptischen Schalters derart, dass die gegenläufigen Lichtblätter um einen Winkel von im Wesentlichen 60° um die Probe verdreht werden, - Coupling the excitation beams into two further fiber optic components by means of the fiber optic switch in such a way that the opposing light sheets are rotated around the sample by an angle of essentially 60 °,
- erneutes Ausführen des Verfahrens bis zumindest die gegenläufigen Lichtblätter zweimal um einen Winkel von im Wesentlichen 60° um die Probe verdreht wurden. - Repeated execution of the method until at least the opposing light sheets have been rotated twice around the sample by an angle of essentially 60 °.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren den zusätzlichen Schritt:In one embodiment of the invention, the method comprises the additional step:
- Verschieben zumindest einer lateralen Phase der gegenläufigen Lichtblätter. - Shifting at least one lateral phase of the opposing light sheets.
Insbesondere kann es dabei vorgesehen sein, dass die faseroptische Komponente, beispiels weise eine optische Faser, entlang der optischen Achse verschoben wird und damit die Pha seneinstellung der optischen Faser geändert wird. In particular, it can be provided that the fiber-optic component, for example an optical fiber, is displaced along the optical axis and thus the phase setting of the optical fiber is changed.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren die folgenden zu sätzlichen Schritte: In a further embodiment of the invention, the method comprises the following additional steps:
- Beleuchten der Probe mittels eines zentralen Anregungsstrahls mittels der Detektionsoptik und Erzeugen eines 3D Interferenzmusters, - Illuminating the sample by means of a central excitation beam by means of the detection optics and generating a 3D interference pattern,
- Verändern eines Abstands zwischen der Probe und der Detektionsoptik. - Changing a distance between the sample and the detection optics.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt der Schritt des Veränderns eines Abstands zwischen der Probe und der Detektionsoptik mittels eines piezoelektrischen Elements. In one embodiment of the invention, the step of changing a distance between the sample and the detection optics takes place by means of a piezoelectric element.
Erfindungsgemäß ist außerdem die Verwendung der Anordnung zur Lichtblattmikroskopie zur Umwandlung oder Ergänzung eines Mikroskops in ein Lichtblattmikroskop angegeben. Mit der erfmdungsgemäßen Anordnung lässt sich die 3D hochauflösende strukturierte Be leuchtung mittels Lichtblattmikroskopie in einen kompakten Mikroskopiekopf integrieren, wodurch ein Fluoreszenzmikroskop zu einem Lichtblattmikroskop, sowie einem hochauflö senden 3D Fluoreszenzmikroskop erweiterbar ist. Insbesondere kann ein modularer Aufbau der Komponenten, unter Beibehaltung bereits vorhandener optomechani scher und optoelekt ronischer Bauteile, vorgesehen sein, um die Umwandlung einfach und kostengünstig zu ge stalten. Die Anordnung zur Lichtblattmikroskopie wird dabei separat von einem Mikroskop bereitgestellt und kann nachträglich von dem Benutzer modular an das Mikroskop angekop pelt werden, um das Mikroskop nachträglich in ein Lichtblattmikroskop, sowie ein hochauflö sendes Mikroskop umzuwandeln oder zu ergänzen. In einer Ausführungsform der Erfindung weist die Anordnung zur Lichtblattmikroskopie ein eigenes an das Gehäuse des Mikroskops koppelbares Gehäuse auf, beispielsweise einer aus Metall gefertigten Bühne, in welchem die Anordnung zur Lichtblattmikroskopie beherbergt ist. According to the invention, the use of the arrangement for light sheet microscopy for converting or supplementing a microscope into a light sheet microscope is also specified. With the arrangement according to the invention, the 3D high-resolution structured lighting can be integrated into a compact microscope head using light sheet microscopy, whereby a fluorescence microscope can be expanded to a light sheet microscope and a high-resolution 3D fluorescence microscope. In particular, a modular structure of the components, while retaining existing optomechanical and optoelectronic components, can be provided in order to make the conversion simple and inexpensive. The arrangement for light sheet microscopy is provided separately from a microscope and can subsequently be modularly coupled to the microscope by the user in order to subsequently convert or supplement the microscope into a light sheet microscope and a high-resolution microscope. In one embodiment of the invention, the arrangement for light sheet microscopy has its own housing that can be coupled to the housing of the microscope, for example a stage made of metal in which the arrangement for light sheet microscopy is housed.
Es zeigen: Show it:
Fig. 1 das Prinzip der hochauflösenden Mikroskopie basierend auf der strukturierten Beleuchtung gemäß dem Stand der Technik, 1 shows the principle of high-resolution microscopy based on structured lighting according to the prior art,
Fig. 2 simulierte dreidimensionale Interferenzmuster, die durch Überlagerung von drei Laserstrahlen gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung entstehen, FIG. 2 shows simulated three-dimensional interference patterns which arise from the superposition of three laser beams according to an exemplary embodiment of the invention,
Fig. 3 eine Vorrichtung zur dreidimensionalen Lichtblattmikroskopie gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung, 3 shows a device for three-dimensional light sheet microscopy according to an embodiment of the invention,
Fig. 4 verschiedene Draufaufsichten auf eine Probenkammer mit von oben gezeigten Lichtblättern gemäß einem Ausführungsbeispiels der Erfindung, 4 shows various top views of a sample chamber with light sheets shown from above according to an exemplary embodiment of the invention,
Fig. 5 eine Draufaufsicht auf eine Probenkammer mit von oben gezeigten Lichtblät- tem gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung, Fig. 6 eine Simulation eines Interferenzmusters von unter 80° Grad zur Normalen einer Glasoberfläche einfallenden gegenläufigen Laserstrahlen gemäß einem Ausführungsbeispiels der Erfindung, 5 shows a top view of a sample chamber with light sheets shown from above according to an exemplary embodiment of the invention, 6 shows a simulation of an interference pattern of less than 80 degrees to the normal of a glass surface incident opposite laser beams according to an embodiment of the invention,
Fig. 7 ein Ablaufschema eines Verfahrens zur Lichtblattmikroskopie gemäß einem7 shows a flow chart of a method for light sheet microscopy according to a
Ausführungsbeispiels der Erfindung. Embodiment of the invention.
Figur 1 zeigt das bereits in der Einleitung der Beschreibung beschriebene Prinzip der hoch auflösenden Mikroskopie basierend auf der strukturierten Beleuchtung gemäß dem Stand der Technik. FIG. 1 shows the principle of high-resolution microscopy, already described in the introduction to the description, based on the structured illumination according to the prior art.
Die Figur 2 zeigt simulierte dreidimensionale Interferenzmuster, die durch Überlagerung von drei Laserstrahlen gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung entstehen. Wie in Fig. 2 a) ersichtlich, erhält man die bestmögliche Auflösungserhöhung durch Einstrahlen von Laser strahlen unter den Winkeln 90°, -90° und 0°. Dies ist jedoch in der Praxis nur schwer reali sierbar, was im Wesentlichen daran liegt, dass biologische Proben auf einem transparenten Substrat, in der Regel einem dünnen Glasträger (Deckplättchen) präpariert werden müssen, um sie möglichst effizient und realitätsnah abbilden zu können. Diese Geometrie erschwert es daher, Laserstrahlen parallel zur Glasoberfläche in die Probe einzustrahlen und zur Interferenz zu bringen. Werden zwei der Strahlen gegenläufig in die Probe eingestrahlt (unter den Win keln 90° und -90° relativ zur optischen Achse), dann bildet sich in lateraler Richtung bereits die kl einstmögliche Interferenzstruktur mit einer Periodizität von 187,96 nm (bei 500 nm Wellenlänge und einem Brechungsindex von Wasser von 1,33 ) aus. Wird diese Struktur zu sätzlich unter 0° mit einem Laserstrahl durchdrungen, dann entsteht auch in axialer Richtung eine Interferenzstruktur (in der Simulation mit einer Periodizität von 188,03 nm). Das so ent standene Interferenzmuster ist also in allen Raumrichtungen isotrop. Die nächst beste Lösung besteht also darin, die Winkel unter der die Laserstrahlen zur Interfe renz gebracht werden, möglichst nahe an der idealen Lösung zu halten. Dies ist in Figur 2 b) am Beispiel einer Anordnung mit der Einstrahlung von Laserstrahlen unter den Winkeln 80°, -80° und 0° gezeigt. Hierbei wird sowohl die laterale als auch die axiale Periodizität etwas erhöht, das Muster ist aber im Vergleich zu dem in Fig. 1 b) gezeigten immer noch deutlich “feiner” und würde eine nahezu isotrope Auflösungserhöhung ermöglichen. FIG. 2 shows simulated three-dimensional interference patterns which arise from the superposition of three laser beams according to an exemplary embodiment of the invention. As can be seen in Fig. 2 a), the best possible increase in resolution is obtained by irradiating laser beams at the angles 90 °, -90 ° and 0 °. However, this is difficult to achieve in practice, which is mainly due to the fact that biological samples have to be prepared on a transparent substrate, usually a thin glass slide (cover slide), in order to be able to depict them as efficiently and realistically as possible. This geometry therefore makes it difficult to radiate laser beams parallel to the glass surface into the sample and cause them to interfere. If two of the beams are radiated into the sample in opposite directions (at angles of 90 ° and -90 ° relative to the optical axis), the smallest possible interference structure with a periodicity of 187.96 nm (at 500 nm wavelength and a refractive index of water of 1.33). If this structure is also penetrated with a laser beam below 0 °, an interference structure is also created in the axial direction (in the simulation with a periodicity of 188.03 nm). The resulting interference pattern is isotropic in all spatial directions. The next best solution is to keep the angle at which the laser beams are brought to interference as close as possible to the ideal solution. This is shown in Figure 2 b) using the example of an arrangement with the irradiation of laser beams at the angles 80 °, -80 ° and 0 °. Here, both the lateral and the axial periodicity are increased somewhat, but the pattern is still significantly “finer” compared to that shown in FIG. 1 b) and would enable an almost isotropic increase in resolution.
Die Figur 3 zeigt eine Anordnung zur dreidimensionalen Lichtblattmikroskopie gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die in Fig. 3 gezeigte Anordnung umfasst zumindest sechs Beleuchtungsoptiken 14 zur Beleuchtung einer Probe 13, wobei sich die Probe 13 in nerhalb einer Probenkammer 11 in einem Medium 12 befindet. Die Probenkammer 11 ist da bei parallel zur einer ebenen, optisch transparenten Bezugsfläche 16 ausgerichtet. Die Be leuchtungsoptiken 14 umfassen jeweils einen Beleuchtungsstrahlengang 17. Die Beleuch tungsoptiken 14 sind dabei derart eingerichtet, ein Lichtblatt 27 aus einem Anregungsstrahl 18 zu erzeugen und das Lichtblatt 27 unter einem von Null verschiedenen Winkel bezüglich einer Normalen 19 der Bezugsfläche 16 auf die Probe 13 zu lenken. Die Anregungsstrahlen 18 können beispielsweise mittels einer Laserquelle 21 erzeugt werden. Die Einkopplung von Anregungsstrahlen 18 für gegenläufige Lichtblätter 27 in die Beleuchtungsstrahlengänge 17 wird über faseroptische Komponenten 10, die die Anregungsstrahlen 18 als gaußförmige Strahlen auskoppeln, realisiert. Diese werden über jeweils entgegengesetzt angeordnete Spie gel 15 unter einem flachen Winkel von beispielsweise 5° bis 10° auf die Probe 13 gelenkt. Kurz bevor die Strahlen 18 in die Probenkammer 11 eindringen, werden sie durch Zylinder linsen 25 zu schmalen Lichtblättem 27 ausgeformt. Die Beleuchtungsoptiken 14 werden he xagonal um die Probe 13 angeordnet, wie in der Draufsicht in Fig. 4 gezeigt. FIG. 3 shows an arrangement for three-dimensional light sheet microscopy according to an exemplary embodiment of the invention. The arrangement shown in FIG. 3 comprises at least six illumination optics 14 for illuminating a sample 13, the sample 13 being located within a sample chamber 11 in a medium 12. The sample chamber 11 is aligned parallel to a flat, optically transparent reference surface 16. The lighting optics 14 each include an illuminating beam path 17. The lighting optics 14 are set up to generate a light sheet 27 from an excitation beam 18 and to direct the light sheet 27 towards the sample 13 at an angle other than zero with respect to a normal 19 of the reference surface 16 to steer. The excitation beams 18 can be generated by means of a laser source 21, for example. The coupling of excitation beams 18 for opposing light sheets 27 into the illumination beam paths 17 is implemented via fiber-optic components 10 which couple out the excitation beams 18 as Gaussian beams. These are directed onto the sample 13 at a flat angle of, for example, 5 ° to 10 °, via mirror 15 arranged in opposite directions. Shortly before the rays 18 penetrate the sample chamber 11, they are shaped by cylindrical lenses 25 into narrow sheets of light 27. The illumination optics 14 are arranged hexagonally around the sample 13, as shown in the plan view in FIG. 4.
Die Anordnung umfasst weiter zumindest einen faseroptischen Schalter 20 der in Fig. 3 nicht gezeigt ist. Der faseroptische Schalter 20 ist derart eingerichtet, durch Schalten der faseropti schen Komponente 10 zwei gegenläufigen Lichtblätter 27 auf die Probe 13 zu lenken. Des Weiteren ist der faseroptische Schalter 20 derart eingerichtet, die gegenläufigen Lichtblätter 27 mehrfach um einem Winkel von im Wesentlichen 60° in einer Ebene der Bezugsfläche 16 zu verdrehen, so dass die Probe 13 aus zumindest sechs verschiedenen Winkeln beleuchtet wird. The arrangement further comprises at least one fiber optic switch 20 which is not shown in FIG. 3. The fiber-optic switch 20 is set up in such a way that, by switching the fiber-optic component 10, two light sheets 27 running in opposite directions are directed onto the sample 13. Of Furthermore, the fiber-optic switch 20 is set up in such a way that the opposing light sheets 27 are rotated several times by an angle of essentially 60 ° in a plane of the reference surface 16, so that the sample 13 is illuminated from at least six different angles.
Insbesondere kann es vorgesehen sein, dass der faseroptische Schalter 20 ein mikro elektromechanischer Faserschalter ist. Der Vorteil von mikro-elektromechanischen Faser- schaltem (fiber-MEMS switches) ist, dass diese Schalter es ermöglichen, Licht aus einer ein laufenden Lichtfaser in unter 1 Millisekunde zwischen mehreren auslaufenden Lichtfasern zu schalten. Mit einem einzelnen 1x3 MEMS Schalter lässt sich daher ein schneller Wechsel zwischen den faseroptischen Komponenten 10 realisieren. Vorteil dieser Methode ist, dass so gut wie kein Laserlicht verloren geht und sich durch Einsatz dieser Technologie sehr schnelle Schaltzeiten umsetzen lassen. In particular, it can be provided that the fiber optic switch 20 is a micro-electromechanical fiber switch. The advantage of micro-electromechanical fiber switches (fiber-MEMS switches) is that these switches make it possible to switch light from a running optical fiber between several outgoing optical fibers in less than 1 millisecond. With a single 1x3 MEMS switch, a quick change between the fiber optic components 10 can therefore be realized. The advantage of this method is that almost no laser light is lost and very fast switching times can be implemented using this technology.
Der in Fig. 3 beschriebene Aufbau nutzt ein einzelnes Mikroskopobjektiv mit hoher numeri scher Apertur als Detektionsoptik 9, das zur Detektion des Fluoreszenzsignals benutzt wird und gleichzeitig einen zentralen Anregungsstrahl 24 in die Probe fokussiert kann. Das Mikro skopobjektiv 9 wird beispielsweise in einer aus Metall gefertigten Bühne 26 gehaltert. Ein Gegengewinde erlaubt es, die Bühne 26 in ein reguläres invertiertes Mikroskop einzuschrau ben. Ein zur Bühne 26 gefertigtes Gegenstück 29 hält die Probenkammer 11, sowie die faser optischen Komponenten 10 zur Einkopplung der Anregungsstrahlen 18 in den Beleuchtungs strahlengang 17 der Beleuchtungsoptik 14 für die Fluoreszenzanregung der Probe 13 mittels gegenläufiger Lichtblätter 27. Die Bühne 26 kann somit auch zur Aufnahme der Probe 13 und zur Feinjustage des Abstands zwischen Probe 13 und des Mikroskopobjektivs 9 genutzt wer den. Die Bühne 26 kann beispielsweise auch über ein Standard RMS-Gewinde in ein regulä res invertiertes Mikroskop verschiedenster Hersteller geschraubt werden, um dessen Abbil dungsoptik und die Kamera-Anschlüsse zu nutzen und stellt somit eine flexible Erweiterung bestehender Mikroskope um die hochauflösende Mikroskopie und die Lichtblattmikroskopie dar. The structure described in FIG. 3 uses a single microscope objective with a high numerical aperture as detection optics 9, which are used to detect the fluorescence signal and at the same time can focus a central excitation beam 24 into the sample. The microscope lens 9 is supported, for example, in a stage 26 made of metal. A mating thread allows the stage 26 to be screwed into a regular inverted microscope. A counterpart 29 manufactured for the stage 26 holds the sample chamber 11 as well as the fiber optic components 10 for coupling the excitation beams 18 into the illumination beam path 17 of the illumination optics 14 for the fluorescence excitation of the sample 13 by means of opposing light sheets 27. The stage 26 can therefore also be used for recording of the sample 13 and for fine adjustment of the distance between the sample 13 and the microscope lens 9 who used the. The stage 26 can, for example, also be screwed into a regular inverted microscope from various manufacturers via a standard RMS thread in order to use its imaging optics and the camera connections and thus represents a flexible extension existing microscopes to high-resolution microscopy and light sheet microscopy.
Durch diese Anordnung können die Anregungsstrahlen 18 der gegenläufigen Lichtblätter 27, mittels des faseroptischen Schalters 20, sehr schnell um jeweils 60° versetzt geschaltet wer den und auf diese Weise unter sechs verschiedenen Winkeln, wobei die Probe 13 durch die gegenläufigen Lichtblätter 27 bei jeder Verstellung um 60° unter zwei Winkeln ausgeleuchtet wird, ausleuchten. Dies ist vorteilhaft, um in der anschließenden Computer-basierten Bildre konstruktion eine gleichmäßige Auflösungserhöhung in lateraler Richtung zu erzeugen. Dabei kann auch eine Verschiebung der lateralen Phase der Interferenzmuster vorgesehen sein, die sich beispielsweis durch eine Verschiebung der faseroptischen Komponente 10 entlang der optischen Achse realisieren lässt. With this arrangement, the excitation beams 18 of the opposing light sheets 27 can be switched very quickly offset by 60 ° by means of the fiber optic switch 20 and in this way at six different angles, the sample 13 being switched by the opposing light sheets 27 with each adjustment 60 ° is illuminated at two angles. This is advantageous in order to generate a uniform increase in resolution in the lateral direction in the subsequent computer-based image reconstruction. A shift in the lateral phase of the interference pattern can also be provided, which can be implemented, for example, by shifting the fiber-optic component 10 along the optical axis.
Um zusätzlich die Auflösungserhöhung in axialer Richtung zu ermöglichen, wird durch Hin zuschalten eines zentralen Anregungsstrahls 24 ein 3D Interferenzmuster erzeugt. Der zentra le Anregungsstrahl 24 wird mittels des Mikroskopobjektivs 9 in die Probe 11 fokussiert. Wird auch noch der zentrale Anregungsstrahl 24 hinzugenommen, dann entsteht auf Höhe der Pro be 11 ein Interferenzmuster, wie beispielhaft in Fig. 2 b) gezeigt ist. Hierdurch wird die Auf lösung des optischen Systems nahezu isotrop in xy-Richtung und in z-Richtung erhöht. In order to additionally enable the increase in resolution in the axial direction, a 3D interference pattern is generated by adding a central excitation beam 24. The central excitation beam 24 is focused into the sample 11 by means of the microscope objective 9. If the central excitation beam 24 is also added, an interference pattern arises at the level of the sample 11, as is shown by way of example in FIG. 2 b). As a result, the resolution of the optical system is increased almost isotropically in the xy direction and in the z direction.
Mit Hilfe von in der Bühne 26 integrierten piezoelektrischen Elementen lässt sich die gesamte Probenkammer 11 mit hoher Präzision entlang der z-Richtung, also in axialer Richtung, ver fahren und somit die zur 3D-Rekonstruktion notwendigen Bilder aufnehmen. Selbst wenn nur eine erhöhte Auflösung in xy-Richtung gewünscht wird, ist die hier dargestellte Lösung von Vorteil, da sich durch Weglassen des Zentral Strahls 24 immer noch ein laterales Interferenz muster der gegenläufigen Lichtblätter 27 ergibt, die die Probe 13 mit minimaler Anregungs leistung ausleuchtet und zur Fluoreszenz anregt. Die dabei entstehenden Fluoreszenzbilder werden wiederum mit der Detektionsoptik 9 beispielsweise einem hochauflösenden Mikro- skopobjektiv aufgenommen und im Rahmen einer Computer-gestützten Bildrekonstruktion als 2D hochauflösende Bilder berechnet. Die Auflösung, die mit dieser Anordnung erreicht werden kann liegt im Bereich von ca. der Hälfte der Periodizität der Lateral Struktur, also ca. 191 nm / 2 = 95,5 nm. In axialer Richtung sollte sich eine Auflösung von deutlich unter 200 nm realisieren lassen. With the aid of piezoelectric elements integrated in the stage 26, the entire sample chamber 11 can be moved with high precision along the z-direction, that is, in the axial direction, and thus the images necessary for the 3D reconstruction can be recorded. Even if only an increased resolution in the xy direction is desired, the solution shown here is advantageous, since omitting the central beam 24 still results in a lateral interference pattern of the opposing light sheets 27, which illuminates the sample 13 with minimal excitation power and stimulates fluorescence. The resulting fluorescence images are in turn with the detection optics 9, for example a high-resolution micro Scope lens recorded and calculated as 2D high-resolution images as part of a computer-aided image reconstruction. The resolution that can be achieved with this arrangement is in the range of approx. Half the periodicity of the lateral structure, i.e. approx. 191 nm / 2 = 95.5 nm. In the axial direction, a resolution of well below 200 nm should be achieved to let.
Die Figur 4 zeigt verschiedene Draufsichten auf eine Probenkammer 11 mit von oben gezeig ten Lichtblättern 27 gemäß einem Ausführungsbeispiels der Erfindung. In Fig. 4 ist die Pro benkammer 11 als Hexagon angedeutet und die von oben gesehenen Lichtblätter 27, die durch entgegengesetzt angeordnete Zylinderlinsen 25 erzeugt werden, gezeigt. In den Fig. 4 a) - c) werden die gegenläufigen Lichtblätter 27 mit Hilfe eines faseroptischen Schalter 20 unter jeweils 60° versetzt erzeugt, um eine gleichmäßige Rekonstruktion der hochaufgelösten Bild information zu erreichen, wie dies beispielsweise in der SIM Mikroskopie üblich ist. FIG. 4 shows various top views of a sample chamber 11 with light sheets 27 shown from above according to an exemplary embodiment of the invention. In Fig. 4, the Pro benkammer 11 is indicated as a hexagon and the light sheets 27 seen from above, which are generated by oppositely arranged cylindrical lenses 25 are shown. 4 a) - c) the opposing light sheets 27 are generated with the help of a fiber optic switch 20 offset by 60 ° in order to achieve a uniform reconstruction of the high-resolution image information, as is common in SIM microscopy, for example.
Die Figur 5 zeigt eine Draufaufsicht auf eine Probenkammer 11 mit von oben gezeigten Lichtblättem 27 gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. In Fig. 5 ist wiederum die Probenkammer 11 als Hexagon angedeutet und die von oben gesehenen Lichtblätter 27, die durch die entgegengesetzt angeordneten Zylinderlinsen 25 erzeugt werden, gezeigt. Zusätzlich ist eine Laserquelle 21 zur Erzeugung der Anregungsstrahlen 18 und ein faseroptischer Schal ter 20 gezeigt. Mittels des faseroptischen Schalters 20 lassen sich die Anregungsstrahlen 18 über die faseroptische Komponenten 10 schnell in den Beleuchtungsstrahlengang 17 der Be leuchtungsoptik 14 einkoppeln. FIG. 5 shows a plan view of a sample chamber 11 with light sheets 27 shown from above according to an exemplary embodiment of the invention. In FIG. 5, the sample chamber 11 is again indicated as a hexagon and the light sheets 27, seen from above, which are generated by the oppositely arranged cylindrical lenses 25, are shown. In addition, a laser source 21 for generating the excitation beams 18 and a fiber optic switch 20 are shown. By means of the fiber-optic switch 20, the excitation beams 18 can be coupled quickly into the lighting beam path 17 of the lighting optics 14 via the fiber-optic components 10.
Die Figur 6 zeigt eine Simulation eines Interferenzmusters von unter 80° Grad zur Normalen einer Glasoberfläche einfallenden gegenläufigen Laserstrahlen gemäß einem Ausführungsbei spiels der Erfindung. Durch Reflexion an der Glasoberfläche entsteht auch in axialer Richtung (entlang z) ein Interferenzmuster. Hier wurde eine realistischere Simulation der Ausleuchtung der Probe mit gegenläufigen Laserstrahlen unter Berücksichtigung des Glasträgers mit der Optiksimulations-Software Zemax durchgeführt. Da die Laserstrahlen unter einem sehr fla chen Winkel auf die Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit in der Probenkammer und dem Glasträger treffen, wird der Großteil des Laserlichts an dieser Grenzfläche reflektiert, was wiederum zur Interferenz mit dem aus der Gegenrichtung eingestrahlten Licht führt. Wenn man den Zentralstrahl nicht berücksichtigt, dann entsteht auf diese Art dennoch eine axiale Feinstruktur, welche wiederum manche Bereiche der Probe nicht zur Fluoreszenz anregt. Erst wenn die Probe axial verschoben wird (z.B. durch die Piezoelemente), werden auch diese Bereiche der Probe zur Fluoreszenz angeregt. Dies könnte, in Verbindung mit einem bildtei lenden Prisma genutzt werden, um mehrere Anregungsebenen in axialer Richtung gleichzeitig abzubilden, und die Probe dennoch möglichst schonend dem Anregungslicht auszusetzen. FIG. 6 shows a simulation of an interference pattern of less than 80 degrees to the normal of a glass surface incident opposite laser beams according to an exemplary embodiment of the invention. Reflection on the glass surface also creates an interference pattern in the axial direction (along z). Here, a more realistic simulation of the illumination of the sample with opposing laser beams was carried out, taking into account the glass carrier with the Zemax optical simulation software carried out. Since the laser beams hit the interface between the liquid in the sample chamber and the glass slide at a very flat angle, most of the laser light is reflected at this interface, which in turn leads to interference with the light emitted from the opposite direction. If the central beam is not taken into account, an axial fine structure is created in this way, which in turn does not excite some areas of the sample to fluorescence. Only when the sample is axially displaced (eg by the piezo elements) are these areas of the sample also excited to fluoresce. This could be used in conjunction with a forming prism to simultaneously image several excitation planes in the axial direction, and nevertheless expose the sample to the excitation light as gently as possible.
Die Figur 7 zeigt ein Ablaufschema eines Verfahrens zur Lichtblattmikroskopie gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. FIG. 7 shows a flow diagram of a method for light sheet microscopy according to an exemplary embodiment of the invention.
Das Verfahren beginnt mit Schritt 700 mit dem Bereitstellen einer zuvor beschriebenen An ordnung zur Lichtblattmikroskopie. The method begins with step 700 with the provision of a previously described arrangement for light sheet microscopy.
In Schritt 710 wird eine Probe 13 mit zumindest zwei gegenläufigen Lichtblättern 27 beleuch tet, wobei die Lichtblätter 27 aus zumindest zwei Anregungsstrahlen 18 erzeugt werden, wo bei die Anregungsstrahlen 18 in zumindest zwei faseroptische Komponenten 10 eingekoppelt werden und in die Beleuchtungsstrahlengänge 17 ausgekoppelt werden. In step 710, a sample 13 is illuminated with at least two opposing light sheets 27, the light sheets 27 being generated from at least two excitation beams 18, where the excitation beams 18 are coupled into at least two fiber-optic components 10 and are coupled out into the illumination beam paths 17.
In Schritt 720 wird ein Fluoreszenzsignal der Probe 13 mittels der Detektionsoptik 9 detek- tiert. In step 720, a fluorescence signal of the sample 13 is detected by means of the detection optics 9.
In Schritt 730 werden die gegenläufigen Lichtblätter 27 um einen Winkel von im Wesentli chen 60° um die Probe 13 verdreht. Dies geschieht dadurch, dass die Anregungsstrahlen 18 in zwei weitere faseroptische Komponenten 10 mittels des faseroptischen Schalters 20 derart einkoppelt werden, dass die aus den Anregungsstrahlen erzeugten gegenläufigen Lichtblätter 27 um einen Winkel von im Wesentlichen 60° um die Probe 13 verdreht sind und die Probe 13 aus einem um im Wesentlichen 60° versetzten Winkel bestrahlen. In Schritt 740 wird das Verfahren erneut ausgeführt bis zumindest die gegenläufigen Licht blätter 27 zweimal um einen Winkel von im Wesentlichen 60° um die Probe 13 verdreht wur den. Wurden die Lichtblätter 27 zweimal um jeweils 60° zur Probe 13 verdreht, wurde die Probe 13 somit aus sechs verschiedenen Winkel beleuchtet um eine gleichmäßige Rekon struktion von hochaufgelösten Bildinformationen zu erreichen. In step 730, the opposing light sheets 27 are rotated around the sample 13 by an angle of essentially 60 °. This is done by dividing the excitation beams 18 into two further fiber-optic components 10 by means of the fiber-optic switch 20 in this way be coupled in that the opposing light sheets 27 generated from the excitation beams are rotated by an angle of essentially 60 ° around the sample 13 and irradiate the sample 13 from an angle offset by essentially 60 °. In step 740, the method is carried out again until at least the opposing light blades 27 are rotated twice around the sample 13 by an angle of essentially 60 °. If the light sheets 27 were rotated twice by 60 ° in relation to the sample 13, the sample 13 was thus illuminated from six different angles in order to achieve a uniform reconstruction of high-resolution image information.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung kann es zusätzlich vorgesehen sein, dass die Probe 13 mittels eines zentralen Anregungsstrahls 24 mittels der Detektionsoptik 9 zur Erzeu gung eines 3D Interferenzmusters beleuchtet wird. Ein weiterer Verfahrensschritt kann das Verändern eines Abstands zwischen der Probe 13 und der Detektionsoptik 9 sein. Der Ab- stand zwischen der Probe 13 und der Detektionsoptik 9 kann beispielsweise mittels eines pie zoelektrischen Elements erfolgen, das beispielsweise die Probenkammer 11 mit hoher Präzi sion in axialer Richtung entlang der Normalen 19 der Bezugsfläche 16 verschiebt. In one exemplary embodiment of the invention, it can additionally be provided that the sample 13 is illuminated by means of a central excitation beam 24 by means of the detection optics 9 in order to generate a 3D interference pattern. Another method step can be changing a distance between the sample 13 and the detection optics 9. The distance between the sample 13 and the detection optics 9 can take place, for example, by means of a piezoelectric element which, for example, moves the sample chamber 11 with high precision in the axial direction along the normal 19 of the reference surface 16.
Die Arbeiten, die zu dieser Erfindung geführt haben, wurden von der Europäischen Union (H2020-EU.1.3.1.) unter der Fördervereinbarung Nr. 766181 (DeLIVER-ITN) finanziert. The work that led to this invention was funded by the European Union (H2020-EU.1.3.1.) Under grant agreement No. 766181 (DeLIVER-ITN).
Bezugszeichenliste List of reference symbols
1 Mikroskopobjektiv 1 microscope objective
2 Laserstrahlen 2 laser beams
3 rückwärtige Apertur 3 rear aperture
4 Randstrahlen 4 marginal rays
5 zentral fokussierter Laserstrahl5 centrally focused laser beam
9 Detektionsoptik 9 detection optics
10 faseropti sehe Komponente 10 fiber optic components
11 Probenkammer 11 sample chamber
12 Medium 12 medium
13 Probe 13 sample
14 Beleuchtungsoptik 14 lighting optics
15 Umlenkspiegel 15 deflection mirrors
16 Bezugsfläche 16 reference area
17 Beleuchtungsstrahlengang 17 illuminating beam path
18 Anregungsstrahl 18 excitation beam
19 Normale der Bezugsfläche19 Normals of the reference surface
20 faseroptischer Schalter 20 fiber optic switch
21 Laserquelle 21 Laser source
22 Detektionsstrahlengang 22 detection beam path
23 optische Achse 23 optical axis
24 zentraler Anregungsstrahl24 central excitation beam
25 Zylinderlinse 25 cylindrical lens
26 Bühne 26 stage
27 Lichtblatt 27 light sheet
28 Kollimatorlinse 28 collimator lens
29 Gegenstück 29 counterpart

Claims

Patentansprüche Claims
1. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie, umfassend: zumindest sechs Beleuchtungsoptiken (14) zur Beleuchtung einer Probe (13), wobei sich die Probe (13) innerhalb einer Probenkammer (11) in einem Medium (12) befindet, wobei die Probenkammer (11) parallel zur einer ebenen Bezugsfläche (16) ausgerichtet ist, die Beleuchtungsoptiken (14) jeweils einen Beleuchtungsstrahlengang (17) umfassen und derart eingerichtet sind, ein Lichtblatt (27) aus einem Anregungs strahl (18) zu erzeugen und das Lichtblatt (27) unter einem von Null verschiedenen Winkel bezüglich einer Normalen (19) der Bezugsfläche (16) auf die Probe (13) zu lenken, die Beleuchtungsoptiken (14) jeweils zumindest eine faseroptische Komponen te (10) umfassen, wobei die faseroptische Komponente (10) derart eingerichtet ist, den in einer Laserquelle (21) erzeugten Anregungsstrahl (18) in den Beleuchtungsstrah lengang (17) der Beleuchtungsoptik (14) einzukoppeln, die zumindest sechs Beleuchtungsoptiken (14) im Wesentlichen hexagonal um die Probenkammer (11) angeordnet sind, die Anordnung zumindest einen faseroptischen Schalter (20) umfasst, wobei der faseroptischen Schalter (20) derart eingerichtet ist, durch Schalten der faseropti schen Komponente (10) zwei gegenläufigen Lichtblätter (27) auf die Probe (13) zu lenken und der faseroptische Schalter (20) weiter derart eingerichtet ist, die gegenläu figen Lichtblätter (27) mehrfach um einem Winkel von im Wesentlichen 60° in einer Ebene der Bezugsfläche (16) zu verdrehen, so dass die Probe (13) aus zumindest sechs verschiedenen Winkeln beleuchtet wird, die Anordnung zumindest eine Detektionsoptik (1) mit einem Detektionsstrah lengang (22) mit einer optischen Achse (23) umfasst, wobei die Detektionsoptik (1) unterhalb der Probenkammer (11) angeordnet ist und die optische Achse (23) im We sentlichen parallel zu der Normalen (19) der Bezugsfläche (16) ist, wobei die Detekti- onsoptik (9) derart eingerichtet ist, ein Fluoreszenzsignal der Probe (13) zu detektie- ren. 1. An arrangement for light sheet microscopy, comprising: at least six illumination optics (14) for illuminating a sample (13), the sample (13) being located within a sample chamber (11) in a medium (12), the sample chamber (11) being parallel is aligned with a flat reference surface (16), the illumination optics (14) each include an illumination beam path (17) and are set up to generate a light sheet (27) from an excitation beam (18) and the light sheet (27) under one of To direct zero different angles with respect to a normal (19) of the reference surface (16) onto the sample (13), the illumination optics (14) each comprising at least one fiber-optic component (10), the fiber-optic component (10) being set up in such a way the excitation beam (18) generated in a laser source (21) is coupled into the illuminating beam path (17) of the illuminating optics (14), the at least six illuminating optics (14) being essentially hexagonal are arranged around the sample chamber (11), the arrangement comprises at least one fiber-optic switch (20), the fiber-optic switch (20) being set up in such a way that, by switching the fiber-optic component (10), two light sheets (27) running in opposite directions onto the sample ( 13) and the fiber optic switch (20) is further set up in such a way that the opposing light sheets (27) are rotated several times by an angle of essentially 60 ° in a plane of the reference surface (16), so that the sample (13) is illuminated from at least six different angles, the arrangement comprises at least one detection optics (1) with a detection beam path (22) with an optical axis (23), the detection optics (1) being arranged below the sample chamber (11) and the optical axis (23) is essentially parallel to the normal (19) of the reference surface (16), the detection onsoptik (9) is set up to detect a fluorescence signal of the sample (13).
2. Anordnung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsoptiken (14) jeweils zumindest ein optisches Element (15) umfassen, wobei das optische Ele ment (15) derart eingerichtet ist, den Anregungsstrahl (18) in Richtung der Probe (13) zu lenken. 2. Arrangement according to claim 1, characterized in that the illumination optics (14) each comprise at least one optical element (15), wherein the optical Ele ment (15) is set up in such a way that the excitation beam (18) in the direction of the sample (13) to steer.
3. Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsoptik (9) eine faseroptische Komponente (10) umfasst und derart eingerich tet ist, einen zentralen Anregungsstrahl (24) in der Probe (13) zu fokussieren, der zent rale Anregungsstrahl (24) derart eingerichtet ist, mit den zwei zur Erzeugung eines strukturierten Lichtblatts gegenläufigen Lichtblättern (27) zu interferieren und insge samt ein dreidimensional strukturiertes Lichtblatt zu erzeugen. 3. Arrangement according to one of the preceding claims, characterized in that the detection optics (9) comprises a fiber-optic component (10) and is set up in such a way to focus a central excitation beam (24) in the sample (13), the central excitation beam (24) is set up to interfere with the two light sheets (27) running in opposite directions for generating a structured light sheet and, overall, to generate a three-dimensionally structured light sheet.
4. Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsoptik (9) ein Mikroskopobjektiv ist. 4. Arrangement according to one of the preceding claims, characterized in that the detection optics (9) is a microscope objective.
5. Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Winkel zwischen dem Lichtblatt (27) der Beleuchtungsoptik (14) und der Normalen (19) der Bezugsfläche (16) zwischen 75° und 90° beträgt. 5. Arrangement according to one of the preceding claims, characterized in that the angle between the light sheet (27) of the lighting optics (14) and the normal (19) of the reference surface (16) is between 75 ° and 90 °.
6. Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsoptiken (14) jeweils zumindest eine Zylinderlinse (25) umfassen, wobei die Zylinderlinse (25) derart eingerichtet ist, das Lichtblatt (27) aus dem Anregungs strahl (18) zu erzeugen. 6. Arrangement according to one of the preceding claims, characterized in that the illumination optics (14) each comprise at least one cylinder lens (25), wherein the cylinder lens (25) is set up in such a way that the light sheet (27) from the excitation beam (18) to produce.
7. Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsoptik (9) in eine Bühne (26) eingefasst ist, wobei die Bühne (26) derart ein gerichtet ist den Abstand zwischen der Probe (13) und der Detektionsoptik (9) zu ver ändern. 7. Arrangement according to one of the preceding claims, characterized in that the detection optics (9) is enclosed in a stage (26), the stage (26) being directed in such a way as to the distance between the sample (13) and the detection optics (9 ) to change.
8. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bühne ein piezoelekt risches Element umfasst, wobei das piezoelektrische Element derart eingerichtet ist, den Abstand zwischen der Probe (13) und der Detektionsoptik (9) zu verändern. 8. The arrangement according to claim 7, characterized in that the stage comprises a piezoelectric element, wherein the piezoelectric element is set up to change the distance between the sample (13) and the detection optics (9).
9. Verfahren zur Lichtblattmikroskopie umfassend die folgenden Schritte: 9. A method for light sheet microscopy comprising the following steps:
- Bereitstellen einer Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche, - Provision of an arrangement according to one of the preceding claims,
- Beleuchten der Probe (13) mit zumindest zwei gegenläufigen Lichtblättem (27), wo bei die Lichtblätter (27) aus zumindest zwei Anregungsstrahlen (18) erzeugt werden, wobei die Anregungsstrahlen (18) in zumindest zwei faseroptische Komponenten (10) eingekoppelt werden und in die Beleuchtungsstrahlengänge (17) ausgekoppelt werden,- Illuminating the sample (13) with at least two counter-rotating light sheets (27), where the light sheets (27) are generated from at least two excitation beams (18), the excitation beams (18) being coupled into at least two fiber-optic components (10) and are coupled out into the illumination beam paths (17),
- Detektieren eines Fluoreszenssignals der Probe (13) mittels der Detektionsoptik (9),- Detecting a fluorescence signal of the sample (13) by means of the detection optics (9),
- Einkoppeln der Anregungsstrahlen (18) in zwei weitere faseroptische Komponenten (10) mittels des faseroptischen Schalters (20) derart, dass die gegenläufigen Lichtblät ter (27) um einen Winkel von im Wesentlichen 60° um die Probe (13) verdreht wer den, - Coupling the excitation beams (18) into two further fiber-optic components (10) by means of the fiber-optic switch (20) in such a way that the opposing light sheets (27) are rotated by an angle of essentially 60 ° around the sample (13),
- erneutes Ausführen des Verfahrens bis zumindest die gegenläufigen Lichtblätter (27) zweimal um einen Winkel von im Wesentlichen 60° um die Probe (13) verdreht wur den. - Carrying out the method again until at least the counter-rotating light sheets (27) were rotated twice by an angle of essentially 60 ° around the sample (13).
10. Verfahren nach Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren den zusätzli chen Schritt umfasst: 10. The method according to claim 9, characterized in that the method comprises the additional step:
- Verschieben zumindest einer lateralen Phase der gegenläufigen Lichtblätter (27). - Shifting at least one lateral phase of the opposing light sheets (27).
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 10 dadurch gekennzeichnet, dass das Ver fahren die folgenden zusätzlichen Schritte umfasst: 11. The method according to any one of claims 9 to 10, characterized in that the method comprises the following additional steps:
- Beleuchten der Probe (13) mittels eines zentralen Anregungs Strahls (24) mittels der Detektionsoptik (9) und Erzeugen eines 3D Interferenzmusters, - Verändern eines Abstands zwischen der Probe (13) und der Detektionsoptik (9). - illuminating the sample (13) by means of a central excitation beam (24) by means of the detection optics (9) and generating a 3D interference pattern, - changing a distance between the sample (13) and the detection optics (9).
12. Verfahren nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Veränderns eines Abstands zwischen der Probe (13) und der Detektionsoptik (9) mittels eines pie zoelektrischen Elements erfolgt. 12. The method according to claim 11, characterized in that the step of changing a distance between the sample (13) and the detection optics (9) takes place by means of a piezoelectric element.
13. Verwendung der Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Umwandlung oder Ergänzung eines Mikroskops in ein Lichtblattmikroskop. 13. Use of the arrangement for light sheet microscopy according to one of claims 1 to 8 for converting or supplementing a microscope into a light sheet microscope.
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