DE102012103459B4

DE102012103459B4 - OPTICAL IMAGING OR IMAGING SYSTEM WITH STRUCTURED LIGHTING

Info

Publication number: DE102012103459B4
Application number: DE102012103459.1A
Authority: DE
Inventors: Su-Yu Chiang; Bo Jui CHANG; Jih Young YUH; Li Jun CHOU
Original assignee: NAT SYNCHROTRON RADIATION RES CT; National Synchrotron Radiation Research Center
Current assignee: NAT SYNCHROTRON RADIATION RES CT; National Synchrotron Radiation Research Center
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2016-03-31
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: DE102012103459A1

Abstract

Optisches Abbildungs- oder Bildgebungssystem, das eine inkohärente strukturierte Beleuchtung verwendet, umfassend: ein optisches Mikroskop, das umfasst: ein Objektiv mit einer ersten Seite in der Nähe einer Probe, einer zweiten Seite, die von der Probe abgewandt ist, und einer vorderen Brennebene, wobei die vordere Brennebene mit der Probe überlagert ist; eine Verstellstufe, die auf der ersten Seite des Objektivs angeordnet ist und ausgelegt ist, um in eine Richtung hin zu dem Objektiv oder von diesem weg bewegt zu werden und um die Probe auf der Oberfläche der Verstellstufe nahe zu der Probe aufzunehmen; einen 50/50-Strahlteiler, der in dem optischen Strahlengang angeordnet ist, um die auf die zweite Seite des Objektivs einfallenden Lichtstrahlen zu reflektieren und um das von der Probe gestreute Licht auf eine Bildaufnahmeeinrichtung zu übertragen oder hindurchzulassen; eine kohärente Lichtquelle, die ein kohärentes Licht abgibt, das einen optischen Strahlengang ausbildet, der das Objektiv durchläuft; einen räumlichen Lichtmodulator, der in dem optischen Strahlengang angeordnet ist und ausgelegt ist, um aus dem kohärenten Licht auf der vorderen Brennebene des Objektivs ein strukturiertes Muster auszubilden; eine Mehrzahl von optischen Linsen, die in dem optischen Strahlengang angeordnet sind, wobei von den optischen Linsen zumindest eine konjugierte Bildebene des strukturierten Musters auf dem optischen Strahlengang ausgebildet wird; und ein rotierendes oder schwingendes Lichtstreuelement, das ausgelegt ist, um die Kohärenz des kohärenten Lichts zu zerstören, und das auf der wenigstens einen konjugierten Bildebene angeordnet ist.An optical imaging or imaging system using incoherent structured illumination, comprising: an optical microscope, comprising: an objective having a first side near a sample, a second side facing away from the sample, and a front focal plane, wherein the front focal plane is superimposed with the sample; an adjustment stage disposed on the first side of the lens and configured to be moved in a direction toward or away from the lens and to receive the sample on the surface of the adjustment stage proximate to the sample; a 50/50 beam splitter disposed in the optical path for reflecting the rays of light incident on the second side of the objective and for transmitting or transmitting the light scattered by the sample to an imaging means; a coherent light source emitting a coherent light forming an optical path through which the objective passes; a spatial light modulator disposed in the optical path and configured to form a pattern from the coherent light at the front focal plane of the objective; a plurality of optical lenses disposed in the optical path, wherein at least one conjugate image plane of the pattern is formed on the optical path of the optical lenses; and a rotating or oscillating light scattering element configured to destroy the coherence of the coherent light and disposed on the at least one conjugate image plane.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNGBACKGROUND OF THE INVENTION

1. Technisches Gebiet1. Technical area

Die vorliegende Erfindung betrifft ein optisches Abbildungs- bzw. Bildgebungssystem mit inkohärenter strukturierter Beleuchtung (incoherent structured illumination), und betrifft insbesondere ein Abbildungs- bzw. Bildgebungssystem für Streulicht mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsbegrenzung, das eine inkohärente strukturierte Beleuchtung einsetzt.The present invention relates to an incoherently structured illumination optical imaging system and, more particularly, to a scattered light imaging system having a resolution below the diffraction limit that employs incoherent structured illumination.

2. Hintergrund2. Background

Die Fluoreszenzmikroskopie (FM) ist bekannt für ihre hohe Empfindlichkeit, hohe molekulare Ansprechschwelle und gleichzeitige für ein mehrfarbiges Abbildungsvermögen und stellt daher ein sehr wichtiges Instrument für die Untersuchung der Feinstruktur von Zellen und Organismen mittels Fluoreszenzmarkierung (Labeling) dar. Allerdings hat die Fluoreszenzmikroskopie zwei wesentliche Schwächen: das lichtverursachte Ausbleichen von fluoreszierendem Farbstoff und die unzureichende räumliche Auflösung der Fluoreszenz-Bilder aufgrund der Beugungsbegrenzung. Die herkömmliche Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine laterale Auflösung von 220 bis 300 nm und eine axiale Auflösung von 800 bis 1000 nm. Die konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie erhöht die axiale Auflösung auf 400 bis 500 nm und stellt dreidimensionale (3D) Schnittbilder bereit, aber die Zunahme der lateralen Auflösung ist begrenzt. In den letzten Jahren verwendet die structured illumination Mikroskopie (SIM) bzw. Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung ein strukturiertes Lichtmuster, um Proben zu beleuchten, um die Beugungsgrenze zu unterschreiten und eine doppelt so hohe Auflösung für Fluoreszenz-Bilder zu erzielen.Fluorescence microscopy (FM) is known for its high sensitivity, high molecular threshold and simultaneous multi-color imaging capabilities, and therefore represents a very important tool for studying the fine structure of cells and organisms by means of fluorescence labeling. However, fluorescence microscopy has two essentials Weaknesses: the light-induced fading of fluorescent dye and the insufficient spatial resolution of the fluorescence images due to the diffraction limit. Conventional wide-field fluorescence microscopy provides a lateral resolution of 220 to 300 nm and an axial resolution of 800 to 1000 nm. Confocal laser scanning fluorescence microscopy increases axial resolution to 400 to 500 nm and provides three-dimensional (3D) slice images the increase in lateral resolution is limited. In recent years, structured illumination microscopy (SIM) or structured illumination microscopy has used a patterned light pattern to illuminate specimens to undercut the diffraction limit and achieve twice the resolution of fluorescence images.

Als eine Anwendung verwendet die dreidimensionale Fluoreszenzmikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (3D-SIFM) drei gebeugte Laserstrahlen, um ein 3D-Interferenzmuster zur Probenbeleuchtung zu erzeugen und dementsprechend überträgt diese Bilddaten mit hoher räumlicher Frequenz, die von dem Bereich der optischen Übertragungsfunktion (OTF) eines Weitfeld-Mikroskops abgedeckt werden sollen. Die hochfrequenten Bilddaten unter Beleuchtung bei verschiedenen Muster-Orientierungen werden gesammelt und durch den Bildrekonstruktionsalgorithmus weiterverarbeitet, um ein hochauflösendes Fluoreszenzbild nach Gustafsson et al. zu gewinnen. Die 3D-SIFM-Mikroskopie ist nun in der Lage, eine Auflösung sowohl in seitlicher als auch axialer Richtung mit echten optischen Schnittbildern bereitzustellen, die doppelt so hoch ist wie die der herkömmlichen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie.As one application, structured illumination three-dimensional fluorescence microscopy (3D-SIFM) uses three diffracted laser beams to generate a 3D interference pattern for sample illumination, and accordingly, transmits this high spatial frequency image data from the wide field optical transmission function (OTF) region Microscopes are to be covered. The high-frequency image data under illumination at different pattern orientations are collected and further processed by the image reconstruction algorithm to obtain a high-resolution fluorescence image according to Gustafsson et al. to win. 3D SIFM microscopy is now able to provide both lateral and axial resolution with true optical cross-sectional images that are twice that of conventional wide-field fluorescence microscopy.

SIM-basierte Techniken werden in großem Umfang für die Messung von Fluoreszenzlicht eingesetzt, werden jedoch nicht häufig bei der Messung von gestreutem Licht von Proben eingesetzt. Die Abbildung bzw. Bildgebung von gestreutem Licht kann transparente und markierungsfreie (labelfreie) Proben mit starker Streuung in ihrer natürlichen Umgebung abbilden. Die zunehmende Bedeutung von Edelmetall-Nanopartikeln in biologischen und biomedizinischen Anwendungen macht die Streulicht-Bildgebung zu einem attraktiven Untersuchungsverfahren, um das Verhalten und die Wechselwirkungen auf Sub-Zellen-Ebene zu untersuchen. Abgesehen davon, dass eine ausgezeichnete Biokompatibilität und Stabilität vorliegt, streuen Edelmetall-Nanopartikel Licht stark und sind diese sehr resistent gegen Ausbleichung.SIM-based techniques are widely used for the measurement of fluorescent light, but are not widely used in the measurement of scattered light from samples. The imaging of scattered light can image transparent and label-free (label-free) samples with high scatter in their natural environment. The increasing importance of precious metal nanoparticles in biological and biomedical applications makes scattered-light imaging an attractive assay for studying subcell-level behavior and interactions. In addition to excellent biocompatibility and stability, noble metal nanoparticles scatter light strongly and are highly resistant to bleaching.

Die Einführung der 3D-SIM-Mikrokopie zur Abbildung bzw. Bildgebung von gestreutem Licht ist kompliziert. Bei der 3D-SIFM-Mikroskopie wird eine kohärente oder teilweise kohärente Lichtquelle zur Erzeugung eines 3D-Interferenzmusters mit hohem Modulationskontrast verwendet. Da das von einer Probe emittierte Fluoreszenzlicht inkohärent ist, kann man bewährte Beziehungen und Vorgehensweisen für die inkohärente Abbildung bzw. Bildgebung befolgen, um ein hochauflösendes Bild zu gewinnen. Im Gegensatz dazu stellt das von einer Probe gestreute Licht einen kohärenten Prozess dar. Mit einer kohärenten Lichtquelle ist die bekannte mathematische Darstellung für die Rekonstruktion eines Fluoreszenzbildes ungeeignet. Neue korärente Bildgewinnungsverfahren sind notwendig, aber die Komplexität bei der mathematischen Ableitung verhindert einen Fortschritt bei dieser Technologie. Zusätzlich leidet die Abbildung von Streulicht unter dem Problem einer Interferenz von reflektiertem Licht, die von Grenzflächen von unterschiedlichen Materialien hervorgerufen wird, da keine Emissionsfilter vorhanden ist, um das einfallende Licht zu blockieren. Obwohl ein Dunkelfeld-Verfahren eine Maske hinzufügt, um das reflektierte Licht zu blockieren, reduziert diese Vorgehensweise unvermeidbar die Intensität des gestreuten Lichts und verschlechtert die Bildauflösung.The introduction of 3D-SIM microcopy for imaging scattered light is complicated. In 3D SIFM microscopy, a coherent or partially coherent light source is used to produce a 3D interference pattern with high modulation contrast. Because the fluorescent light emitted from a sample is incoherent, one can follow established relationships and procedures for incoherent imaging to obtain a high resolution image. In contrast, the light scattered by a sample is a coherent process. With a coherent light source, the known mathematical representation is unsuitable for reconstructing a fluorescence image. New corporeal image extraction techniques are needed, but the complexity of mathematical derivation prevents progress in this technology. In addition, the imaging of stray light suffers from the problem of interference of reflected light caused by interfaces of different materials because there is no emission filter to block the incident light. Although a dark field method adds a mask to block the reflected light, this approach inevitably reduces the intensity of the scattered light and degrades the image resolution.

Die 1 zeigt ein herkömmliches optisches System 10 zur dreidimensionalen strukturierten Beleuchtung. Ein kohärenter Lichtstrahl wird von einer kohärenten Lichtquelle 11 ausgegeben und wird von einem räumlichen Lichtmodulator (SLM) 12 erhalten, der im optischen Strahlengang angeordnet ist, der von der kohärenten Lichtquelle 11 erzeugt wird. Der räumliche Lichtmodulator 12 beugt dann den einzelnen einfallenden Lichtstrahl in eine Vielzahl von Strahlen höherer Ordnung, beispielsweise in gebeugte Lichtstrahlen der 0.-ten, +1.-ten und –1.-ten Beugungsordnung, wie in der 1 gezeigt. Um die parallelen gebeugten Lichtstrahlen zu konvergieren, ist die konvexe Linse L₁ unter einem Abstand f₁ zu dem räumlichen Lichtmodulator 12 angeordnet, wobei f₁ die Brennweite der konvexen Linse L₁ ist.The 1 shows a conventional optical system 10 for three-dimensional structured lighting. A coherent light beam is emitted from a coherent light source 11 and is emitted by a spatial light modulator (SLM) 12 received, which is arranged in the optical path of the beam from the coherent light source 11 is produced. The spatial light modulator 12 then diffracts the single incident light beam into a plurality of higher order beams, for example, diffracted light beams of the 0th, + 1st, and -1st Diffraction order, as in the 1 shown. In order to converge the parallel diffracted light beams, the convex lens L _{1 is} at a distance f ₁ from the spatial light modulator 12 where f _{1 is} the focal length of the convex lens L ₁ .

Die parallelen Lichtstrahlen, welche die Linse L₁ durchlaufen, konvergieren und divergieren dann, um auf die konvexe Linse L₂ einzufallen. Die Linse L₂ ist unter einem Abstand f₂ zu den konvergierenden Punkten angeordnet und erzeugt parallele Lichtstrahlen, die einander schneiden, wobei der Abstand f₂ die Brennweite der Linse L₂ ist. Das strukturierte Muster wird auf einer konjugierten Bildebene 16 bzw. einer Fourier-Ebene unter einem Abstand f₂ von der Linse L₂ ausgebildet. Eine konvexe Linse L₃ ist unter einem Abstand f₃ von der konjugierten Bildebene 16 positioniert und empfängt die parallelen Lichtstrahlen und erzeugt drei in Richtung der Linse L_obj zusammenlaufende Lichtstrahlen. Die Darstellung des Objektivs L_obj in der 1 ist eher stark schematisch, praktisch ist eine Gruppe von Linsen im Objektiv 17 angeordnet. Der Abstand zwischen dem Objektiv L_obj und der Linse L₃ entspricht der Summe von f₃ und f_obj, wobei f₃ die Brennweite der Linse L₃ ist und f_obj die Brennweite des Objektivs L_obj. Insbesondere ist f₃ der Abstand zwischen der Linse L₃ und der hinteren Brennebene 16 des Objektivs L_obj, während f_obj der Abstand zwischen dem Objektiv L_obj und dessen hinterer Brennebene 16' ist. Für den Fall, dass eine Gruppe von Linsen in dem Objektiv angeordnet ist, ist f_obj die effektive Brennweite der Gruppe von Linsen. Drei parallele Lichtstrahlen, die das Objektiv L_obj durchlaufen, schneiden einander dann in einer anderen Bildebene, in welcher eine Verstellstufe 15, die eine Probe aufnimmt, positioniert ist. Das Schneiden bzw. Kreuzen der drei parallelen kohärenten Lichtstrahlen erzeugt ein strukturiertes 3D-Muster auf der Verstellstufe 15, wo eine Probe mit virtueller Dicke in einzelnen Schnittbildern abgebildet werden kann, um dessen 3D-Bild zu rekonstruieren.The parallel light beams passing through the lens L ₁ then converge and diverge to be incident on the convex lens L ₂ . The lens L ₂ is arranged at a distance f ₂ to the converging points and generates parallel light beams which intersect each other, the distance f _{2 being} the focal length of the lens L ₂ . The structured pattern is on a conjugate image plane 16 or a Fourier plane at a distance f _{2 formed} by the lens L ₂ . A convex lens L ₃ is at a distance f ₃ from the conjugate image plane 16 positions and receives the parallel light beams and produces three light beams _converging in the direction of the lens L _obj . The representation of the objective L _obj in the 1 is rather strong schematic, practical is a group of lenses in the lens 17 arranged. The distance between the objective L _obj and the lens L ₃ corresponds to the sum of f ₃ and f _obj , where f _{3 is} the focal length of the lens L ₃ and f _{obj is} the focal length of the objective L _obj . In particular, f _{3 is} the distance between the lens L ₃ and the rear focal plane 16 of the objective L _obj , while f _{obj is} the distance between the objective L _obj and its rear focal plane 16 ' is. In the case where a group of lenses is arranged in the lens, f _{obj is} the effective focal length of the group of lenses. Three parallel light beams, which pass through the lens L _obj , then intersect each other in another image plane in which an adjustment stage 15 , which takes a sample, is positioned. The cutting or crossing of the three parallel coherent light beams generates a structured 3D pattern on the adjustment stage 15 where a virtual thickness sample can be imaged in individual slices to reconstruct its 3D image.

Die 2 zeigt ein optisches Abbildungssystem 20 für eine dreidimensionale strukturierte Beleuchtung. Die Kombination der kohärenten Lichtquelle 21, des SLM 22, der Verstellstufe 25, des Objektivs 27 und der Gruppe von optischen Linsen (L₁', L₂', L₃', L₄', L₅', L_obj') ist im Wesentlichen identisch zu dem in der 1 gezeigten optischen System, mit nur geringfügigr Änderung der Linsenanordnung aus Gründen der experimentellen Zweckmäßigkeit. Eine einstellbare Maske 23 ist innerhalb oder außerhalb des optischen Strahlengangs positioniert, um die gebeugten Lichtstrahlen selektiv zu filtern. Die Verwendung der Maske 23 führt auch zu einer größeren Vielseitigkeit des optischen Systems mit strukturierter Beleuchtung, weil das System in einer Weitfeld-Betriebsart (bei der nur der Lichtstrahl der 0.-ten Beugungsordnung beibehalten wird) oder in einer Betriebsart mit zweidimensionalem strukturierten Beleuchtungsmuster betrieben werden kann (in welcher nur der Lichtstrahl der +1.-ten und –1.-ten Beugungsordnung beibehalten wird). Die in der 2 gezeigte Maske 23 ist außerhalb des optischen Strahlengangs angeordnet, sodass kein gebeugter Lichtstrahl abgeblockt wird. Eine CCD-Kamera 24 ist an einer geeigneten Position zur Aufnahme von Fluoreszenzlicht, das von der Probe emittiert wird, angeordnet und ein Echtraum-Bild (real space image) kann basierend auf dem Signal, das von der CCD-Kamera 24 aufgenommen wird, rekonstruiert werden.The 2 shows an optical imaging system 20 for a three-dimensional structured lighting. The combination of the coherent light source 21 , the SLM 22 , the adjustment stage 25 , the lens 27 and the group of optical lenses (L ₁ ', L ₂ ', L ₃ ', L ₄ ', L ₅ ', L _obj ') is substantially identical to that in _FIG 1 shown optical system, with only minor changes in the lens arrangement for the sake of experimental convenience. An adjustable mask 23 is positioned inside or outside the optical beam path to selectively filter the diffracted light beams. The use of the mask 23 also results in greater versatility of the structured illumination optical system because the system can operate in a wide field mode (retaining only the 0 th diffraction order light beam) or in a two dimensional structured illumination pattern mode (in which FIG only the light beam of the + 1st and -1st order of diffraction is retained). The in the 2 shown mask 23 is located outside the optical path so that no diffracted light beam is blocked. A CCD camera 24 is disposed at an appropriate position for receiving fluorescent light emitted from the sample, and a real space image may be based on the signal received from the CCD camera 24 is recorded, reconstructed.

Die vorliegende Erfindung kombiniert als Erste die 3D-SIM (3D-Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung) und die Streulicht-Bildgebung, um erfolgreich eine dreidimensionale (3D) inkohärente strukturierte Beleuchtung zu erzeugen, um eine Speckle-Streuung und eine komplizierte kohärente Bildgewinnung zu vermeiden. Ein Reflexions-Lichtstreuungs-Mikroskop mit strukturierter 3D-Beleuchtung (SI-RLSM) gemäß der vorliegenden Erfindung wird offenbart und eine seitliche/axiale Auflösung von 120 nm/430 nm wird anhand eines SI-RLS-Bildes von 100 nm großen Edelmetall-Nanopartikeln demonstriert. Die vorliegende Erfindung kann angewendet werden, um Edelmetall-Nanopartikel oder stark streuende Objekte in biologischen Proben zu detektieren, um 3D-Bilder von Streulicht mit einer hohen Auflösung und hohem Kontrast bereitzustellen.The present invention is the first to combine 3D SIM (structured illumination 3D microscopy) and scattered light imaging to successfully create three-dimensional (3D) incoherent structured illumination to avoid speckle scattering and complicated coherent image acquisition. A Reflected Light Scattering Microscope with Structured 3D Illumination (SI-RLSM) according to the present invention is disclosed and a lateral / axial resolution of 120 nm / 430 nm is demonstrated by an SI-RLS image of 100 nm noble metal nanoparticles , The present invention can be used to detect noble metal nanoparticles or highly scattering objects in biological samples to provide high resolution, high contrast 3D images of stray light.

ZUSAMMENFASSUNGSUMMARY

Ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung offenbart ein optisches System, das eine inkohärente strukturierte Beleuchtung erzeugt, umfassend: eine kohärente Lichtquelle, die ein kohärentes Licht abgibt, das einen optischen Strahlengang ausbildet; einen räumlichen Lichtmodulator, der auf dem bzw. in dem optischen Strahlengang angeordnet ist und das kohärente Licht empfangt, wobei die Muster des räumlichen Lichtmodulators ausgelegt sind, um eine Mehrzahl von gebeugten kohärenten Lichtstrahlen mit einer vorbestimmten Phase und Orientierung zu erzeugen; eine Mehrzahl von optischen Linsen, die auf dem bzw. in dem optischen Strahlengang angeordnet sind und wenigstens eine Bildebene ausbilden, wo sich die Mehrzahl von gebeugten kohärenten Lichtstrahlen schneiden, um ein strukturiertes Muster auszubilden; ein rotierendes oder schwingendes Lichtstreuelement, das auf einer der konjugierten Bildebenen angeordnet ist und das ausgelegt ist, um die Kohärenz der gebeugten kohärenten Lichtstrahlen zu zerstören; ein Objektiv, das die Mehrzahl von gebeugten Lichtstrahlen mit zerstörter Kohärenz empfängt; und eine Verstellstufe in der Nähe des Objektivs, um eine Probe aufzunehmen, wobei die Verstellstufe nahe der vorderen Brennebene des Objektivs angeordnet ist.One aspect of the present invention discloses an optical system that generates incoherent structured illumination comprising: a coherent light source emitting a coherent light forming an optical path; a spatial light modulator disposed on the optical path and receiving the coherent light, the patterns of the spatial light modulator configured to generate a plurality of diffracted coherent light beams having a predetermined phase and orientation; a plurality of optical lenses disposed on the optical path and forming at least one image plane where the plurality of diffracted coherent light beams intersect to form a pattern; a rotating or oscillating light scattering element disposed on one of the conjugate image planes and configured to destroy the coherence of the diffracted coherent light rays; a lens that receives the plurality of diffracted light beams with destroyed coherence; and an adjustment stage in the vicinity of the lens to receive a sample, wherein the adjustment stage is arranged near the front focal plane of the lens.

Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung offenbart ein optisches Abbildungssystem mit inkohärenter strukturierter Beleuchtung, umfassend ein optisches Mikroskop, das ein Objektiv mit einer ersten Seite in der Nähe einer Probe und einer zweiten Seite, die von der Probe abgewandt ist, aufweist; eine Verstellstufe, die auf der ersten Seite des Objektivs angeordnet ist und ausgelegt ist, um in einer Richtung auf das Objektiv zu oder von diesem weg bewegt zu werden und um die Probe auf der Oberfläche der Verstellstufe nahe zu dem Objektiv aufzunehmen; einen 50/50-Strahlteiler, der in dem optischen Strahlengang angeordnet ist, um die einfallenden Lichtstrahlen auf der zweiten Seite des Objektivs zu reflektieren und um von der Probe gestreutes Licht an eine Bildaufnahmeeinrichtung zu übertragen; eine kohärente Lichtquelle, die kohärentes Licht emittiert, das einen optischen Strahlengang ausbildet, der das Objektiv durchläuft; einen räumlichen Lichtmodulator in dem optischen Strahlengang, der ausgelegt ist, um ein strukturiertes Muster des kohärenten Lichts auf der Brennebene des Objektivs zu erzeugen; eine Mehrzahl von optischen Linsen und Spiegeln in dem optischen Strahlengang, wobei mindestens eine konjugierte Bildebene des strukturierten Musters auf dem optischen Strahlengang ausgebildet wird; und ein rotierendes oder schwingendes Lichtstreuelement, das ausgelegt ist, um die Kohärenz des kohärenten Lichts zu zerstören, und das auf der mindestens einen konjugierten Bildebene angeordnet ist. Another aspect of the present invention discloses an incoherent structured illumination optical imaging system comprising an optical microscope having an objective with a first side proximate a sample and a second side remote from the sample; an adjustment stage disposed on the first side of the lens and configured to be moved in a direction toward or away from the lens and to receive the sample on the surface of the adjustment stage close to the lens; a 50/50 beam splitter disposed in the optical path for reflecting the incident light beams on the second side of the objective and for transmitting light scattered from the sample to an image pickup device; a coherent light source that emits coherent light that forms an optical path that passes through the objective; a spatial light modulator in the optical path designed to produce a pattern of coherent light on the focal plane of the objective; a plurality of optical lenses and mirrors in the optical path, wherein at least one conjugate image plane of the pattern is formed on the optical path; and a rotating or oscillating light scattering element configured to destroy the coherence of the coherent light and disposed on the at least one conjugate image plane.

Das Vorstehende hat die Merkmale und technischen Vorteile der vorliegenden Erfindung eher breit umrissen, damit die nachfolgende detaillierte Beschreibung der Erfindung besser verstanden werden kann. Zusätzliche Merkmale und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden beschrieben und bilden den Gegenstand der Patentansprüche der Erfindung. Es sollte von Fachleuten auf diesem Gebiet erkannt werden, dass die hierin offenbarte Konzeption und die hierin offenbarten speziellen Ausführungsformen leicht als Ausgangsgrundlage zum Modifizieren oder Entwerfen anderer Strukturen oder Verfahren zum Ausführen der gleichen Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Es sollte auch von Fachleuten auf dem Gebiet realisiert werden, dass solche äquivalenten Ausführungsformen nicht vom allgemeinen Lösungsgedanken und vom Schutzumfang der Erfindung abweichen, wie diese in den beigefügten Patentansprüchen dargelegt werden.The foregoing has outlined rather broadly the features and technical advantages of the present invention in order that the detailed description of the invention which follows may be better understood. Additional features and advantages of the invention will be described below and form the subject of the claims of the invention. It should be appreciated by those skilled in the art that the concept disclosed herein and the specific embodiments disclosed herein may be readily utilized as a starting point for modifying or designing other structures or methods for carrying out the same purposes of the present invention. It should also be realized by those skilled in the art that such equivalent embodiments do not depart from the general spirit and scope of the invention as set forth in the appended claims.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Die Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden mit der folgenden Beschreibung und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert, worin:The objects and advantages of the present invention will be elucidated with the following description and with reference to the accompanying drawings, in which:

1 ein optisches System zur strukturierten Beleuchtung zeigt; 1 shows an optical system for structured illumination;

2 ein optisches Abbildungssystem zur strukturierten Beleuchtung zeigt; 2 shows an optical imaging system for structured illumination;

3 ein optisches System zeigt, um eine Lichtkohärenz nach einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung effektiv zu zerstören; 3 shows an optical system for effectively destroying light coherence according to an embodiment of the present invention;

4 ein optisches System zeigt, um eine Lichtkohärenz nach einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung effektiv zu zerstören; 4 shows an optical system for effectively destroying light coherence according to an embodiment of the present invention;

5 ein optisches System zeigt, um eine Lichtkohärenz nach einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung effektiv zu zerstören; 5 shows an optical system for effectively destroying light coherence according to an embodiment of the present invention;

6 ein Design (0°, fünf Phasen) von Mustern eines räumlichen Lichtmodulators und dessen entsprechende Beleuchtungsmuster bei einer ausgewählten Höhe z nach einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt; 6 shows a design (0 °, five phases) of spatial light modulator patterns and their corresponding illumination patterns at a selected height z according to one embodiment of the present invention;

7 ein anderes Design (45°, fünf Phasen) von Mustern eines räumlichen Lichtmodulators und dessen entsprechende Beleuchtungsmuster bei einer ausgewählten Höhe z nach einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt; 7 shows another design (45 °, five phases) of spatial light modulator patterns and their corresponding illumination patterns at a selected height z according to one embodiment of the present invention;

8 Projektionen von Weitwinkel-Bildern von 100 nm Gold-Nanopartikeln durch Beleuchtung mit der 0.-ten Beugungsordnung zeigt, wenn ein rotierender Lichtstreukörper a) bei der Position S1, b) bei der Position S2 positioniert ist und wenn c) eine Halogen-Beleuchtung ohne Lichtstreukörper positioniert ist, wobei das obere Bild eine seitliche (xy) Projektion ist während das untere Bild eine axiale (xz) Projektion ist; 8th Projections of wide-angle images of 100 nm gold nanoparticles by illumination with the 0.th diffraction order shows when a rotating light scattering body a) at position S1, b) is positioned at position S2 and c) a halogen illumination without Light scattering body is positioned, wherein the upper image is a lateral (xy) projection while the lower image is an axial (xz) projection;

9 eine theoretische Simulation eines strukturierten 3D-Beleuchtungsmusters mit 0° auf eine xz-Ebene und die entsprechenden drei perspektivischen Ebenen gemäß unterschiedlichen Höhen z darstellt; 9 represents a theoretical simulation of a structured 3D illumination pattern with 0 ° on an xz plane and the corresponding three perspective planes according to different heights z;

10 die axialen Erstreckungen der strukturierten 3D-Muster zeigt, wenn ein rotierender Lichtstreukörper a) bei S1 und b) bei S2 positioniert ist; 10 shows the axial extents of the patterned 3D patterns when a rotating light scattering body a) is positioned at S1 and b) at S2;

11 Projektionen (a) von Weitfeld-Bildern (WF) und (b) von SI-RLS-Bildern von 100 nm Gold-Nanopartikeln zeigt, wobei das obere Bild eine seitliche (xy) Projektion darstellt, während das untere Bild eine axiale (xz) Projektion darstellt, und (c) seitliche und axiale Profile eines einzelnen Gold-Nanopartikels mit einem Gauß-Fit darstellt; und 11 Projections (a) of wide-field images (WF) and (b) of SI-RLS images of 100 nm gold nanoparticles, the top image representing a lateral (xy) projection, while the bottom image represents an axial (xz) And (c) represents lateral and axial profiles of a single gold nanoparticle having a Gaussian fit; and

12(a) ein zweidimensionales Differenz-Kontrastbild einer innen angeordneten (internalized) HeLa-Zelle ist; (b) eine 3D-Weitfeld-Ansicht ist; und (c) ein SI-RLS-Bild von 100 nm Gold-Nanopartikeln innerhalb des Kastens gemäß (a). 12 (a) is a two-dimensional difference contrast image of an internalized HeLa cell; (b) is a 3D wide field view; and (c) an SI-RLS image of 100 nm gold nanoparticles within the box according to (a).

Ausführliche BeschreibungDetailed description

Das gemäß der vorliegenden Erfindung offenbarte Reflexions-Lichtstreumikroskop mit strukturierter Beleuchtung (SI-RLSM) verwendet einen räumlichen Lichtmodulator, um schnell und genau die Orientierung, den Kontrast und die Phase des strukturierten Musters zu verändern, und mit der Anordnung eines rotierenden Lichtstreukörpers genau in der Fourier-Ebene wird die Kohärenz des strukturierten Musters in einer anderen nachgeordneten Fourier-Ebene effektiv zerstört, nämlich dort, wo sich eine Probe befindet. Die vorliegende Offenbarung setzt den mathematischen Algorithmus für eine inkohärente Bildrekonstruktion nach M. G. L. Gustafsson et al. ein, um die SI-RLS-Bilder zu rekonstruieren. Der rotierende Lichtstreukörper, der in der Fourier-Ebene angeordnet ist, mittelt die Phasenverteilung aus und transformiert den Bildrekonstruktionsalgorithmus aus den komplexen Verfahren in die einfachen kohärenten Verfahren. Die geeignete Anwendung einer simulierten 3D optischen Übertragungsfunktion (OTF) der SI-RLSM-Mikroskopie erhöht bei der vorliegenden Erfindung weiter die Auflösung.The structured illumination (SI-RLSM) reflection light scattering microscope disclosed in accordance with the present invention uses a spatial light modulator to rapidly and accurately change the orientation, contrast, and phase of the pattern, and with the arrangement of a rotating light scattering body in precisely Fourier level effectively destroys the coherency of the structured pattern in another Fourier downstream layer, namely where a sample is located. The present disclosure sets the mathematical algorithm for incoherent image reconstruction according to M. G. L. Gustafsson et al. to reconstruct the SI-RLS images. The rotating light scattering body, which is arranged in the Fourier plane, averages the phase distribution and transforms the image reconstruction algorithm from the complex methods into the simple coherent methods. The appropriate application of a simulated 3D optical transfer function (OTF) of SI-RLSM microscopy further enhances the resolution in the present invention.

Die 3 zeigt ein optisches System 30, das die Lichtkohärenz nach einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung effektiv zerstört. Die optischen Elemente, wie beispielsweise eine kohärente Lichtquelle 31, ein räumlicher Lichtmodulator (SLM) 32, ein Verstellstufe 35 zum Aufnehmen von Proben, ein Objektiv 37, eine Gruppe von optischen Linsen (L₁'', L₂'', L₃'', L_obj'') sind in der gleichen Weise wie bei dem herkömmlichen optischen System 10 angeordnet, das in der 1 gezeigt ist. Das in der 3 gezeigte System ist durch die Anordnung eines rotierenden holographischen Diffusors bzw. Lichtstreuelements 33 in der konjugierten Bildebene 36 bzw. der Fourier-Ebene des Systems gekennzeichnet. Da der gewünschte Effekt der vorliegenden Erfindung darin besteht, ein dreidimensionales strukturiertes Beleuchtungsmuster in der stromabwärtigen Bildebene zu erzeugen, wo sich die die Probe tragende Verstellstufe 35 befindet, und gleichzeitig die Kohärenz der strukturierten Beleuchtung auf der Probe zu reduzieren, kann ein rotierendes holographisches Lichtstreuelement 33, das an der dargestellten Position angeordnet ist, gleichzeitig die beiden scheinbar widersprüchlichen Ziele erfüllen. Das optische System 30 gemäß der 3, bei dem die Gruppe von optischen Linsen an bestimmten Positionen angeordnet ist, so dass die gebeugten Lichtstrahlen der +1.-ten und –1.-ten Beugungsordnung von dem räumlichen Lichtmodulator sich nahe am Rand des Objektivs L_obj'' befinden und die gebeugten Lichtstrahlen auf die hintere Brennebene 36' des Objektivs L_obj'' fokussiert bzw. abgebildet werden.The 3 shows an optical system 30 that effectively destroys light coherence according to an embodiment of the present invention. The optical elements, such as a coherent light source 31 , a spatial light modulator (SLM) 32 , an adjustment stage 35 for taking samples, a lens 37 , A group of optical lenses (L ₁ ", L ₂ ", L ₃ ", L _obj ") are the same as in the conventional optical system 10 arranged in the 1 is shown. That in the 3 shown system is by the arrangement of a rotating holographic diffuser or light scattering element 33 in the conjugate image plane 36 or the Fourier level of the system. Since the desired effect of the present invention is to create a three-dimensional patterned illumination pattern in the downstream image plane where the adjustment stage supporting the sample is 35 and at the same time reduce the coherence of the patterned illumination on the sample can be a rotating holographic light scattering element 33 , which is arranged at the position shown, at the same time meet the two seemingly contradictory goals. The optical system 30 according to the 3 in which the group of optical lenses is disposed at certain positions so that the + 1st and -1st diffracted order diffracted light beams from the spatial light modulator are located near the edge of the objective L _obj '' and the diffracted _ones Light rays on the rear focal plane 36 ' of the objective L _obj '' are focused or imaged.

Die 3 zeigt eine andere Ausführungsform nach der vorliegenden Erfindung, die ein optisches System ähnlich zu dem vorstehend Beschriebenen aufweist, jedoch mit einer zusätzlichen Maske 34 versehen ist, um ein Weitfeld-Beleuchtungsmuster oder ein zweidimensionales strukturiertes Beleuchtungsmuster zu erzeugen. Die Maske kann eingestellt werden, um die gebeugten Lichtstrahlen der +1.-ten und –1.-ten Beugungsordnung abzublocken, so dass ein Weitfeld-Bild in der Bildebene vorliegen würde, die Maske kann auch so eingestellt werden, um die gebeugten Lichtstrahlen der 0.-ten Beugungsordnung abzublocken, so dass das strukturierte Muster, das in der Bildebene dort ausgebildet wird, wo sich die Probe befindet, ein 2D-Muster sein kann, das heißt nur auf der Ebene parallel zur Oberfläche der Verstellstufe 35.The 3 shows another embodiment of the present invention, which has an optical system similar to that described above, but with an additional mask 34 is provided to produce a wide-field illumination pattern or a two-dimensional structured illumination pattern. The mask may be adjusted to block the + 1st and -1st diffracted order diffracted beams so that there would be a wide field image in the image plane, the mask may also be adjusted so as to diffract the diffracted light beams Block the second order of diffraction so that the patterned pattern formed in the image plane where the sample is located may be a 2D pattern, that is, only on the plane parallel to the surface of the adjustment stage 35 ,

Die 4 zeigt ein optisches Abbildungs- bzw. Bildgebungssystem 40 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Das System 40 ist speziell auf die SI-RLS-Bildgebung zugeschnitten und ist mit optischen Elementen wie unten beschrieben ausgestattet. Eine kohärente Lichtquelle, beispielsweise ein He-Ne-Laser 41, der bei 543 nm betrieben wird, emittiert kohärentes Licht, das einen optischen Strahlengang ausbildet. Das kohärente Licht wird dadurch aufgeweitet, dass dieses einen 10X-Strahlaufweiter 42 durchlauft, und wird mit einem nur phasenmodulierenden räumlichen Lichtmodulator 44 in Laserstrahlen der 0.-ten, +1.-ten und –1.-ten Beugungsordnung gebeugt. Die Laserstrahlen werden dann mit fünf Linsen (45a, 45b, 45c, 45d, 45e) in einer Gruppe fokussiert, durchläuft einen 50/50-Strahlteiler 411 und wird auf die hintere Brennebene 48 des Objektivs 47 fokussiert bzw. abgebildet, wobei die Linse 45e innerhalb des optischen Mikroskops 414 positioniert sein kann.The 4 shows an optical imaging system 40 according to an embodiment of the present invention. The system 40 is specially tailored for SI-RLS imaging and is equipped with optical elements as described below. A coherent light source, for example a He-Ne laser 41 , which operates at 543 nm, emits coherent light forming an optical path. The coherent light is widened by having a 10X beam expander 42 passes through, and is using a phase-modulating spatial light modulator 44 diffracted in laser beams of the 0th, + 1st, and 1st order of diffraction. The laser beams are then illuminated with five lenses ( 45a . 45b . 45c . 45d . 45e ) focused in a group, passes through a 50/50 beam splitter 411 and gets to the rear focal plane 48 of the lens 47 focused or imaged, the lens 45e within the optical microscope 414 can be positioned.

Bei dem optischen Abbildungssystem 40 nach der 4 ist die Gruppe von optischen Linsen an bestimmten Positionen so angeordnet, dass die gebeugten Lichtstrahlen der +1.-ten und –1.-ten Beugungsordnung von dem räumlichen Lichtmodulator sich nahe dem Rand des Objektivs 47 befinden und die gebeugten Lichtstrahlen werden auf die hintere Brennebene 48 des Objektivs 47 fokussiert. Das von der auf der Verstellstufe 43 positionierten Probe gestreute Licht wird durch das Objektiv 47 gesammelt und durchlauft dann einen 50/50-Strahlteiler 411, eine Zylinder- bzw. Tubuslinse 412 und eine 2X-Übertragungslinse 413 und wird mit einer Elektronenvervielfacher-CCD-Kamera 49 detektiert. In einer Ausführungsform nach der vorliegenden Erfindung umfasst ein aufrecht angeordnetes optisches Mikroskop 414 die Linse 45e, den Strahlteiler 411, die Zylinder- bzw. Tubuslinse 412, die 2X-Übertragungslinse 413, das Objektiv 47, die Verstellstufe 43 und die CCD-Kamera 49. Die Verstellstufe 43 wird durch einen piezoelektrischen Wandler (PZT) gesteuert, um die Probe schrittweise auf das Objektiv 47 zu oder von diesem weg zu verfahren, um die Schnittbilder entlang der z-Richtung zu erhalten.In the optical imaging system 40 after 4 For example, the group of optical lenses is disposed at certain positions so that the + 1st and -1st diffracted order diffracted light beams from the spatial light modulator become near the edge of the lens 47 are located and the diffracted light rays are on the rear focal plane 48 of the lens 47 focused. That of the on the adjustment stage 43 Positioned sample scattered light is transmitted through the lens 47 collected and then passes through a 50/50 beam splitter 411 , a cylinder or tube lens 412 and a 2X relay lens 413 and is using an electron multiplier CCD camera 49 detected. In one embodiment of the present invention, an upright optical microscope comprises 414 the Lens 45e , the beam splitter 411 , the cylinder or tube lens 412 , the 2X transmission lens 413 , the objective 47 , the adjustment stage 43 and the CCD camera 49 , The adjustment stage 43 is controlled by a piezoelectric transducer (PZT) to gradually move the sample onto the lens 47 to move to or from this to get the sectional images along the z-direction.

In der 4 sind drei Positionen auf dem optischen Strahlengang mit S1, S2 und S3 markiert. Das rotierende holographische Lichtstreuelement 46 ist bei der vorliegenden Ausführungsform aus den folgenden Gründen an der Position S2 und nicht an der Position S1 angeordnet. Wenn das Lichtstreuelement 46 an der Position S1 angeordnet ist, ist die Lichtkohärenz unmittelbar nach Verlassen des kohärenten He-Ne-Lasers 41 teilweise zerstört. Da das teilweise kohärente Licht ein gewisses Maß an Kohärenz beibehält, können sich drei gebeugten Lichtstrahlen mit partieller Kohärenz schneiden, um ein strukturiertes Beleuchtungsmuster in der Brennebene dort zu erzeugen, wo sich die Proben befinden. Anderseits nimmt man an, dass jeder Punkt in einem der drei inkohärenten gebeugten Lichtstrahlen gemeinsam mit dem entsprechenden Punkt in den anderen beiden inkohärenten gebeugte Lichtstrahlen kohärent ist, dass also kohärente Punkt-Triplets ausgebildet werden. Ein strukturiertes Beleuchtungsmuster kann auch durch eine inkohärente Überlagerung der kohärenten Punkt-Triplets ausgebildet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das strukturierte Muster, das mit dem an der Position S1 positionierten Lichtstreuelement erzeugt wird, eine Überlagerung des inkohärenten und kohärenten Anteils der drei gebeugten Lichtstrahlen ist.In the 4 For example, three positions on the optical path are marked S1, S2 and S3. The rotating holographic light scattering element 46 is arranged at the position S2 and not at the position S1 in the present embodiment for the following reasons. When the light scattering element 46 is located at the position S1, the light coherence is immediately after leaving the coherent He-Ne laser 41 partially destroyed. Since the partially coherent light retains some degree of coherence, three diffracted light beams may intersect with partial coherence to create a patterned illumination pattern in the focal plane where the samples are located. On the other hand, it is assumed that each point in one of the three incoherent diffracted light beams is coherent with the corresponding point in the other two incoherent diffracted light beams, that is, that coherent point triplets are formed. A structured illumination pattern can also be formed by an incoherent superposition of the coherent point triplets. In summary, the structured pattern created with the light scattering element positioned at position S1 is a superposition of the incoherent and coherent portion of the three diffracted light rays.

Wenn das Lichtstreuelement an der in der 4 gezeigten Position S2 angeordnet ist, wird die Lichtkohärenz effektiv zerstört, was zu einer nahezu vollständig inkohärenten Beleuchtung führen kann. S2 ist in der konjugierten Bildebene, wo sich drei gebeugte Lichtstrahlen schneiden, um ein strukturiertes Beleuchtungsmuster auszubilden. Daher ist nicht nur die Kohärenz des strukturierten Musters stark reduziert, sondern kann auch das inkohärente strukturierte Beleuchtungsmuster auf die Bildebene, in der sich die Proben befinden, abgebildet werden.When the light scattering element at the in the 4 2, the light coherence is effectively destroyed, which can lead to almost completely incoherent illumination. S2 is in the conjugate image plane where three diffracted light beams intersect to form a patterned illumination pattern. Therefore, not only is the coherence of the pattern structured greatly reduced, but also the incoherent structured illumination pattern can be imaged onto the image plane in which the samples are located.

Wenn das Lichtstreuelement an der in der 4 gezeigten Position S3 angeordnet ist, kann ein ähnliches strukturiertes Beleuchtungsmuster beobachtet werden, als wenn der Diffusor an der Position S2 angeordnet ist. In einer anderen Ausführungsform nach der vorliegenden Erfindung ist mehr als ein Lichtstreuelement in dem optischen System vorgesehen. Zum Beispiel könnte in einem optischen System mit zwei Lichtstreuelementen, bei dem ein Lichtstreuelement an der Position S2 angeordnet und das andere Lichtstreuelement an der Position S3 angeordnet ist, ein ähnlich strukturiertes Beleuchtungsmuster dennoch ausgebildet werden, jedoch mit einer viel schwächeren Intensität.When the light scattering element at the in the 4 When the position S3 is shown, a similar structured illumination pattern can be observed as when the diffuser is located at the position S2. In another embodiment of the present invention, more than one light scattering element is provided in the optical system. For example, in an optical system having two light scattering elements in which one light scattering element is located at position S2 and the other light scattering element is located at position S3, a similarly structured lighting pattern could still be formed, but with a much weaker intensity.

Die 5 zeigt ein optisches Abbildungs- bzw. Bildgebungssystem 50 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Im Vergleich mit dem optischen System 40 weist das optische Abbildungssystem 50 weiterhin eine Viertelwellenlängenscheibe 55' auf, die zwischen den Linsen 55a und 55b angeordnet ist. Die Viertelwellenlängenscheibe 55' ist ausgelegt, um zirkular polarisiertes Licht zu erzeugen, um die Beleuchtungsmuster mit unterschiedlichen Orientierungen bzw. Drehsinnen mit nahezu dem gleichen Kontrast zu erzeugen.The 5 shows an optical imaging system 50 according to an embodiment of the present invention. In comparison with the optical system 40 has the optical imaging system 50 still a quarter-wave disk 55 ' on that between the lenses 55a and 55b is arranged. The quarter-wavelength disk 55 ' is adapted to generate circularly polarized light to produce the illumination patterns having different orientations with nearly the same contrast.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein rotierendes holographisches Lichtstreuelement verwendet. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine rotierende Scheibe mit einer aufgerauten Oberfläche oder einer optischen Beschichtung auf der Oberfläche verwendet. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine rotierende Mattscheibe als Lichtstreuelement verwendet. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine schwingende Scheibe mit einer aufgerauten Oberfläche oder einer optischen Beschichtung auf der Oberfläche verwendet. Alle vorgenannten Lichtstreuelemente oder bearbeiteten Scheiben haben die gemeinsame Eigenschaft, dass diese für das einfallende Licht transparent sind und sich schnell um die Achse des optischen Strahlengangs drehen oder schwingen. Da das Lichtstreuelement dem einfallenden Licht eine zufällige Phasenänderung auferlegt, wird die Rotations- oder Schwingbewegung aufrechterhalten, vorzugsweise mit einer konstanten Rate bzw. Geschwindigkeit, um die Phasenverteilung in dem mathematische Ausdruck für die Bildgebung bzw. Abbildung herauszumitteln.In one embodiment of the present invention, a rotating holographic light scattering element is used. In another embodiment of the present invention, a rotating disk having a roughened surface or an optical coating on the surface is used. In another embodiment of the present invention, a rotating focusing screen is used as the light scattering element. In another embodiment of the present invention, a vibrating disc having a roughened surface or an optical coating on the surface is used. All the aforementioned light scattering elements or machined discs have the common feature that they are transparent to the incident light and rotate or oscillate rapidly around the axis of the optical path. Because the light scattering element imposes a random phase change on the incident light, the rotational or oscillatory motion is maintained, preferably at a constant rate, to average out the phase distribution in the mathematical expression for imaging.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Amplitude der gestreuten Signale auf der CCD-Ebene als U_i(x, y, t) = U_g(x, y, t) ⊗ h(x, y) = [√S(x, y)·E(x, y)·e^iϕ(t)] ⊗ h(x, y), beschrieben werden, wobei die Verteilung der gestreuten Signale auf der Probenebene durch U_g(x, y, t) angegeben ist, die kohärente Punktspreizfunktion (Point Spread Function; PSF) durch h(x, y) angegeben ist, die Reflexionsintensität in dem Bild von Edelmetall-Nanopartikeln durch S(x, y) angegeben ist, die Amplitude des Beleuchtungslichts durch E(x, y) angegeben ist, und die Phasenverteilung, die durch das rotierende Lichtstreuelement induziert wird, durch Φ(t) angegeben ist. Da das Lichtstreuelement während der Belichtung zur Abbildung bzw. Bildgebung schnell rotiert, ist der zeitliche Mittelwert von Φ(t) Null. Das detektierte Signal I_i(x, y) ist somit der zeitliche Mittelwert der Intensität der gestreuten Signale, I_i(x, y) = 〈|U_i(x, y, t)|²〉 = [S(x, y)|E(x, y)|²] ⊗ |h(x, y)|². In one embodiment of the present invention, the amplitude of the scattered signals may be at the CCD level as U _i (x, y, t) = U _g (x, y, t) ⊗ h (x, y) = [√ S (x, y) · E (x, y) · e ^{iφ (t)} · h (x, y), where the distribution of the scattered signals on the sample plane is indicated by U _g (x, y, t), the point spread function (PSF) given by h (x, y), the reflection intensity in the image of noble metal nanoparticles by S (x, y), the amplitude of the illumination light is indicated by E (x, y), and the phase distribution induced by the rotating light scattering element is indicated by Φ (t). Since the light scattering element rotates rapidly during imaging for imaging, the time average of Φ (t) is zero. The detected signal I _i (x, y) is thus the time average of the intensity of the scattered signals, I _i (x, y) = <| U _i (x, y, t) | ² > = [S (x, y) | E (x, y) | ² ] ⊗ | h (x, y) | ² .

Diese Gleichung entspricht einem inkohärenten Bild, in Übereinstimmung mit der experimentellen Beobachtung bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel.This equation corresponds to an incoherent image in accordance with the experimental observation in the present embodiment.

Gemäß der 4 weist der in der vorliegenden Ausführungsform verwendete räumliche Lichtmodulator (SLM) ein gemustertes Element 44a auf, beispielsweise eine strukturierte Scheibe oder Platte, ein optisches Gitter oder einen Flüssigkristall-SLM, wobei der Flüssigkristall-SLM (nachfolgend auch als LC-SLM bezeichnet) die Orientierung, Phase und den Kontrast des strukturierten Beleuchtungsmusters rasch verändern kann. Der LC-SLM dient als Zwei-Ebenen-Phasengitter. Wie in der 6 gezeigt, stellen weiße Pixel eine Phasenmodulation des Flüssigkristalls auf einem Eingabe-Grauwert dar während die schwarzen Pixel keine Phasenmodulation darstellen. Die oberen 5 Kasten zeigen Pixel, die mit einem LC-SLM unter 0° Orientierung mit 5 verschiedenen Phasen Φ₁ bis Φ₅ erzeugt wurden, und die unteren Kästen zeigen die entsprechenden Beleuchtungsmuster, die in der xy-Brennebene des Objektivs bei einer ausgewählten Höhe z beobachtet wurden. Die Pixel zeigen eine Periodizität der Länge 7 und die seitliche Periodizität des entsprechenden Beleuchtungsmusters beträgt 274 nm. Bei Verschiebung um einen Pixel (ein Quadrat) für jedes SLM-Muster verschieben sich die entsprechenden Beleuchtungsmuster seitlich in der Phase um 4π/7.According to the 4 For example, the spatial light modulator (SLM) used in the present embodiment has a patterned element 44a for example, a patterned disk or plate, an optical grating, or a liquid crystal SLM, wherein the liquid crystal SLM (hereinafter also referred to as LC-SLM) can rapidly change the orientation, phase, and contrast of the patterned illumination pattern. The LC-SLM serves as a two-level phase grating. Like in the 6 As shown, white pixels represent a phase modulation of the liquid crystal on an input gray level, while the black pixels represent no phase modulation. The upper 5 boxes show pixels generated with an LC-SLM at 0 ° orientation with 5 different phases Φ ₁ to Φ ₅ , and the lower boxes show the corresponding illumination patterns that are in the xy focal plane of the lens at a selected height z were observed. The pixels show a periodicity of length 7 and the lateral periodicity of the corresponding illumination pattern is 274 nm. When shifted by one pixel (one square) for each SLM pattern, the corresponding illumination patterns laterally shift in phase by 4π / 7.

In ähnlicher Weise, wie in der 7 gezeigt, demonstrieren die oberen Kasten Pixel, die mit dem LC-SLM mit 45°-Orientierung mit 5 verschiedenen Phasen Φ₁ bis Φ₅ erzeugt wurden, und zeigen die unteren Kasten die entsprechenden Beleuchtungsmuster der xy-Bildebene des Objektivs. Die Pixel zeigen eine Periode der Länge 5√2 in der Diagonale und die seitliche Periode der entsprechenden 45°-Beleuchtungsmuster beträgt 277 nm. Bei Verschiebung um ein Pixel (ein Quadrat) für jedes SLM Muster verschieben sich die entsprechenden Beleuchtungsmuster seitlich in der Phase um 4π/5.In a similar way as in the 7 3, the upper boxes demonstrate pixels created with the 45 ° LC-SLM with 5 different phases Φ ₁ through Φ ₅ , and the lower boxes show the corresponding illumination patterns of the xy-picture plane of the lens. The pixels show a period of length 5√2 diagonally and the lateral period of the corresponding 45 ° illumination patterns is 277 nm. When shifted by one pixel (one square) for each SLM pattern, the corresponding illumination patterns shift laterally in phase 4π / 5th

Die Perioden der Längen 7 und 5√2 bei räumlicher Lichtmodulation sind ausgelegt, um eine geringe Abweichung bzw. Differenz von etwa 1% aufzuweisen, so dass die entsprechenden Beleuchtungsmuster fast gleichwertig seitliche Perioden haben, was folglich eine nahezu gleiche Verbesserung der Auflösung in der seitlichen Richtung ergibt. Die Auslegung hinsichtlich der Perioden kann unterschiedlich sein, aber ein großer Unterschied würde in einer ungleichen Verbesserung der Auflösung in verschiedenen Orientierungen bzw. Richtungen resultieren. Weiterhin steuert die Anzahl von weißen und schwarzen Pixeln oder der Graustufen der Pixel die Intensitätsverhältnisse des Lichts der 0.-ten und 1.-ten Beugungsordnung. Ersetzt man in jedem SLM-Muster eine schwarze Säule durch eine weiße Säule und legt man in den weißen Pixeln die Phasenverzögerung auf 0,875 π fest, so erhält man das Licht der 0.-ten und 1.-ten Beugungsordnung, das in sämtlichen Orientierungen eine strukturierte Beleuchtung mit nahezu dem gleichen Kontrast erzeugt.The periods of spatial light modulation lengths 7 and 5√2 are designed to have a small difference of about 1%, so that the corresponding illumination patterns have nearly equal lateral periods, thus providing a nearly equal improvement in lateral resolution Direction results. The design in terms of periods may be different, but a large difference would result in uneven improvement in resolution in different orientations. Furthermore, the number of white and black pixels or the gray scale of the pixels controls the intensity ratios of the light of the 0th and 1st diffraction orders. If a black column is replaced by a white column in each SLM pattern and the phase delay in the white pixels is set at 0.875 π, the light of the 0th and 1st order of diffraction is obtained structured lighting produced with almost the same contrast.

Die optischen Linsen sind in dem optischen Strahlengang so angeordnet, um die seitliche Periodizität der strukturierten Beleuchtungsmuster einzustellen. Bevor das Lichtstreuelement an der Position S2 angeordnet ist, wird der Abstand zwischen der Mehrzahl von optischen Linsen in einer Ausführungsform nach der vorliegenden Erfindung durch die folgenden Kriterien bestimmt: 1) die Position des Eintritts des gebeugten Lichtstrahls der +1.-ten und –1.-ten Beugungsordnung muss sich nahe am Rand des Objektivs befinden, so dass sich die seitliche Periodizität des strukturierten Musters der Beugungsgrenze annähern kann; und 2) die drei gebeugten Strahlen sollten auf die hintere Brennebene des Objektivs konvergiert und fokussiert werden, sodass die strukturierten Muster, die auf der konjugierten Bildebene ausgebildet werden, in der Bildebene, in der sich die Probe befindet, beobachtet werden können.The optical lenses are arranged in the optical beam path so as to adjust the lateral periodicity of the patterned illumination patterns. Before the light scattering element is disposed at the position S2, the distance between the plurality of optical lenses in an embodiment according to the present invention is determined by the following criteria: 1) the position of the entry of the + 1-th and -1-diffracted light beam .th order of diffraction must be close to the edge of the lens, so that the lateral periodicity of the structured pattern of the diffraction limit can approach; and 2) the three diffracted beams should be converged and focused on the back focal plane of the objective so that the patterned patterns formed on the conjugate image plane can be observed in the image plane in which the sample is located.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein gebeugter Strahl 0.-ter Beugungsordnung auf die Probe beleuchtet bzw. abgebildet, die 100 nm Gold-Nanopartikel aufweist, die in Wasser auf einem Deckglas eingetaucht sind, um ein Weitfeld-Streulichtbild auszubilden. Die 8 vergleicht die projizierten Weitfeld-Bilder bei Anordnung eines rotierenden holographischen Lichtstreuelements (a) bei der Position S1, (b) bei der Position S2 nach der 5 bei Beleuchtung mit einer kohärenten Laserlichtquelle; und (c) ohne Lichtstreuelement aber bei Beleuchtung mit einer inkohärenten Halogen-Lichtquelle. Die oberen Bilder stellen die seitliche Projektion auf die xy-Ebene dar, während die unteren Bilder die axiale Projektion auf die Ebene xz darstellen. Jede axiale Projektion enthält einen Stapel von einunddreißig Bildern, die durch schrittweises Verfahren der Probe in der z-Richtung mit einer Schrittweite von 100 nm aufgenommen wurden. Das Bild in (a) leidet an einem axial periodischen Hintergrund, der hauptsächlich von den Mehrfachreflexionen an den verschiedenen Grenzflächen herrührt; entsprechend behält die Beleuchtung unter (a) ein gewisses Maß an Kohärenz bei. Im Gegensatz dazu ist der Hintergrund (b) vernachlässigbar, und das Bild ist vergleichbar zu dem in (c) Gezeigten. Die effektive Verschlechterung der Kohärenz durch Anordnen eines rotierenden Streuelements an der Position S2 führt zu einem quasi-inkohärenten Bild.In one embodiment of the present invention, a 0.-order diffracted beam is irradiated onto the sample comprising 100 nm gold nanoparticles immersed in water on a coverslip to form a far-field scattered light image. The 8th compares the projected wide-field images with the arrangement of a rotating holographic light scattering element (a) at the position S1, (b) at the position S2 after the 5 when illuminated with a coherent laser light source; and (c) without a light scattering element but when illuminated with an incoherent halogen light source. The upper images represent the lateral projection on the xy plane, while the lower images represent the axial projection on the xz plane. Each axial projection contains a stack of thirty-one images taken by incrementally scanning the sample in the z-direction with a pitch of 100 nm. The image in (a) suffers from an axially periodic background, mainly due to the multiple reflections at the various interfaces; Accordingly, the illumination under (a) maintains some degree of coherence. In contrast, the background (b) is negligible and the image is comparable to that shown in (c). The effective deterioration of coherence by placing a rotating diffuser at position S2 results in a quasi-incoherent image.

Die 9 zeigt eine theoretische Simulation eines strukturierten 0° 3D-Beleuchtungsmusters auf einer xz-Ebene (linkes Bild) und drei perspektivische Ebenen in Bezug auf verschiedene z-Höhen (rechte Bilder). Das strukturierte 3D-Muster wurde mit drei s-polarisierten kohärenten Lichtquellen ausgebildet, so dass der Kontrast der Modulation maximiert ist. Die Verwendung von zirkular polarisierten Lichtstrahlen verringert den Kontrast der Modulation, hält jedoch die gleiche Periodizität aufrecht. Die 9 belegt, dass die Periodizität nicht nur in der seitlichen Richtung sondern auch in z-Richtung besteht, so dass der durch Schnittbilder ausgebildete Bilderstapel in der vorliegenden Ausführungsform ausgeführt werden kann. Die Piezo-Verstellstufe, welche die Probe aufnimmt, verfährt die Position schrittweise genau entlang der z-Richtung durch die Dicke des strukturierten 3D-Musters hindurch und das reflektierte Signal wird dann von der CCD-Kamera zur Bildrekonstruktion empfangen. The 9 shows a theoretical simulation of a structured 0 ° 3D illumination pattern on an xz-plane (left image) and three perspective planes with respect to different z-heights (right images). The structured 3D pattern was formed with three s-polarized coherent light sources, so that the contrast of the modulation is maximized. The use of circularly polarized light beams reduces the contrast of the modulation but maintains the same periodicity. The 9 proves that the periodicity is not only in the lateral direction but also in the z-direction, so that the image stack formed by sectional images can be performed in the present embodiment. The piezo gain stage that picks up the sample progressively steps the position along the z direction through the thickness of the patterned 3D pattern, and the reflected signal is then received by the CCD camera for image reconstruction.

Die 10 zeigt die axialen Erstreckungen (xz-Ebene) der strukturierten 3D-Muster, wenn ein rotierendes Lichtstreuelement (a) an der Position S1 bzw. (b) an der Position S2 nach der 5 positioniert ist. In der vorliegenden Ausführungsform werden die Bilder in einem Stapel bei einer Schrittweite in z-Richtung von 100 nm aufgenommen, indem ein Silizium-Wafer auf dem Proben-Verstelltisch angeordnet wird und das strukturierte Muster durch Schneiden der Beugungsstrahlen der 0.-ten, +1.-ten und –1.-ten Beugungsordnungen ausgebildet wird. Ohne jegliches Lichtstreuelement im optischen Strahlengang hat das strukturierte 3D-Muster eine unendliche axiale Ausdehnung, wie in der 9 gezeigt, weil sich die drei kohärenten Beugungsstrahlen um die Proben-Brennebene herum schneiden. Im Gegensatz dazu reduziert die Anordnung eines rotierenden Lichtstreuelements die axialen Ausdehnungen in der 10. In der 10(a) weist das strukturierte Muster aufgrund der Überlagerung von Inkohärenz und Kohärenz der drei gebeugten Lichtstrahlen um die Proben-Brennebene herum eine endliche axiale Ausdehnung auf. In der 10(b) weist das strukturierte 3D-Muster, das auf die Probe abgebildet wird, eine axiale Ausdehnung auf, die vergleichbar mit dem beobachtbaren Bereich des Mikroskops in der z-Richtung ist. Eindeutig zerstört dabei die Anordnung des Lichstreuelements an der Position S2 am effektivsten die Kohärenz des kohärenten Laserlichts und ermöglicht somit die Rekonstruktion eines SI-RLS-Bildes unter Verwendung von inkohärenten Bildgebungs- bzw. Abbildungsprozessen.The 10 shows the axial extents (xz-plane) of the patterned 3D pattern when a rotating light scattering element (a) at the position S1 and (b) at the position S2 after the 5 is positioned. In the present embodiment, the images are taken in a stack at a z-direction increment of 100 nm by placing a silicon wafer on the sample displacement stage and patterning the pattern by cutting the diffraction beams of the 0th, +1 .th and -1st-th diffraction orders is formed. Without any light scattering element in the optical path, the patterned 3D pattern has an infinite axial extent, as in FIG 9 because the three coherent diffraction beams intersect around the sample focal plane. In contrast, the arrangement of a rotating light scattering element reduces the axial expansions in the 10 , In the 10 (a) The structured pattern has a finite axial extent due to the superposition of incoherence and coherence of the three diffracted light beams around the sample focal plane. In the 10 (b) For example, the patterned 3D pattern imaged on the sample has an axial extent comparable to the observable region of the microscope in the z-direction. Clearly, the arrangement of the light scattering element at position S2 most effectively destroys the coherence of the coherent laser light and thus enables the reconstruction of an SI-RLS image using incoherent imaging processes.

Die 11 zeigt die Projektionen (a) von Weitfeld-Bildern und (b) von SI-RLS-Bildern von 100 nm Gold-Nanopartikeln, die auf einem Deckglas in Wasser eingetaucht sind, und (c) die seitlichen und axialen Profile einzelner Gold-Nanopartikel. Die SI-RLS-Bilder zeigen einen verbesserten Bildkontrast und hervorragende Auflösung sowohl in seitlicher als auch axialer Richtung. Die durchschnittliche Halbwertsbreite (FWHM) beträgt 262 ± 6 nm bzw. 867 ± 19 nm in der seitlichen (lateralen) bzw. axialen Richtung des Weitfeld-Bildes. Die entsprechende Halbwertsbreite (FWHM) in dem SI-RLS.Bild beträgt 117 ± 10 nm bzw. 428 ± 18 nm. Die Auflösung ist um einen Faktor von etwa 2,2 seitlich und von etwa 2,0 axial verbessert. Diese Verbesserung ist vergleichbar mit derjenigen in der 3D-SIM-Fluoreszenz-Bildgebung.The 11 shows the projections (a) of wide-field images and (b) SI-RLS images of 100 nm gold nanoparticles immersed on a coverslip in water, and (c) the lateral and axial profiles of individual gold nanoparticles. The SI-RLS images show improved image contrast and excellent resolution in both the lateral and axial directions. The average half width (FWHM) is 262 ± 6 nm and 867 ± 19 nm, respectively, in the lateral (lateral) and axial directions of the wide field image, respectively. The corresponding half-width (FWHM) in the SI-RLS image is 117 ± 10 nm and 428 ± 18 nm, respectively. The resolution is laterally improved by a factor of about 2.2 and axially by about 2.0. This improvement is comparable to that in 3D SIM fluorescence imaging.

Die 12 zeigt das Differenzinterferenz-Kontrastbild einer HeLa-Zelle. Eine Mehrzahl von 100 nm Gold-Nanopartikel wurde zuvor in der HeLa-Zelle angeordnet. Innerhalb des in der 12(a) gezeigten Kastens sind zum Vergleich in der 12(b) ein 3D-Ansicht des Weitfeld-Bildes, das mit einer Halogen-Lichtquelle beleuchtet wurde, und in der 12(c) das SI-RLS-Bild gezeigt. Das SI-RLS-Bild erreicht einen reduzierten Hintergrund und verbessert die Auflösung, um die Differenzierung von benachbarten Nanopartikel zu ermöglichen. Die 12 belegt die biologischen Anwendungen des SI-RLS-Systems, das gemäß der vorliegenden Erfindung offenbart wird.The 12 shows the differential interference contrast image of a HeLa cell. A plurality of 100 nm gold nanoparticles were previously placed in the HeLa cell. Within the in the 12 (a) shown boxes are for comparison in the 12 (b) a 3D view of the wide field image, which was illuminated with a halogen light source, and in the 12 (c) shown the SI-RLS image. The SI-RLS image achieves a reduced background and improves resolution to allow differentiation of adjacent nanoparticles. The 12 documents the biological applications of the SI-RLS system disclosed in accordance with the present invention.

Wenngleich die vorliegende Offenbarung und ihre Vorteile im Detail beschrieben wurden, versteht es sich, dass zahlreiche Änderungen, Ersetzungen und Abwandlungen vorgenommen werden können, ohne vom allgemeinen Lösungsgedanken und vom Schutzumfang der Offenbarung abzuweichen, wie durch die beigefügten Patentansprüche festgelegt. Zum Beispiel können viele der oben diskutierten verschiedenen Methoden realisiert und durch andere Verfahren oder eine Kombination davon ersetzt werden.While the present disclosure and its advantages have been described in detail, it should be understood that numerous changes, substitutions and alterations can be made without departing from the general spirit and scope of the disclosure as defined by the appended claims. For example, many of the various methods discussed above may be implemented and replaced by other methods or a combination thereof.

Darüber hinaus ist der Schutzumfang der vorliegenden Anmeldung nicht auf die speziellen Ausführungsformen des Verfahrens, der Vorrichtung, der Herstellung und Zusammensetzung, Verfahren und Schritte, die in der Beschreibung beschrieben sind, beschränkt. Was ein durchschnittlicher Fachmann auf dem Gebiet leicht an der Offenbarung der vorliegenden Erfindung, Verfahren, Vorrichtungen, Herstellung, Zusammensetzungen, Mittel, Verfahren oder Schritte, die gegenwärtig existieren oder später entwickelt werden und im Wesentlichen die gleiche Funktion ausführen, schätzen wird, kann im Wesentlichen das gleiche Ergebnis wie nach den entsprechenden hierin beschriebenen Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung erzielt werden. Dementsprechend sollen die beigefügten Patentansprüche innerhalb ihres Schutzumfangs solche Prozesse, Vorrichtungen, Herstellungsverfahren, Zusammensetzungen, Mittel, Verfahren oder Schritte mit umfassen.Moreover, the scope of the present application is not limited to the particular embodiments of the method, apparatus, manufacture, and composition, methods, and steps described in the specification. What one of ordinary skill in the art will readily appreciate from the disclosure of the present invention, methods, devices, methods, compositions, means, methods or steps that exist or will be developed later and perform substantially the same function, may be substantially the same result as according to the respective embodiments described herein according to the present invention are achieved. Accordingly, the appended claims are intended to include within their scope such processes, devices, methods of manufacture, compositions, means, methods, or steps.

Claims

An optical imaging or imaging system using incoherent structured illumination, comprising: an optical microscope, comprising: an objective having a first side near a sample, a second side facing away from the sample, and a front focal plane, the front focal plane being superimposed with the sample; an adjustment stage disposed on the first side of the lens and configured to be moved in a direction toward or away from the lens and to receive the sample on the surface of the adjustment stage proximate to the sample; a 50/50 beam splitter disposed in the optical path for reflecting the rays of light incident on the second side of the objective and for transmitting or transmitting the light scattered by the sample to an imaging means; a coherent light source emitting a coherent light forming an optical path through which the objective passes; a spatial light modulator disposed in the optical path and configured to form a pattern from the coherent light at the front focal plane of the objective; a plurality of optical lenses disposed in the optical path, wherein at least one conjugate image plane of the pattern is formed on the optical path of the optical lenses; and a rotating or oscillating light scattering element configured to destroy the coherence of the coherent light and disposed on the at least one conjugate image plane.

The system of claim 1, further comprising a quarter wavelength plate disposed in the optical path.

The system of claim 1 or 2, further comprising a CCD camera disposed on the second side of the lens and configured to receive light scattered from the sample.

A system according to any one of the preceding claims, wherein the spatial light modulator comprises a patterned object, an optical grating or a spatial liquid crystal light modulator.

A system according to any one of the preceding claims, wherein the spatial light modulator comprises a plurality of pixels and a portion of the pixels is controlled to shift the phase of the incident light beam.

A system according to claim 4 or 5, wherein the spatial light modulator is adapted to generate at least diffracted light beams of the 0.th, + 1st, and -1st order of diffraction by means of the coherent light source.

A system according to any one of the preceding claims, wherein the patterned illumination pattern is formed from the intersection of a plurality of light beams or a projection of the illumination onto a patterned object.

A system according to any one of the preceding claims, wherein the spatial light modulator alters the phase and orientation of the pattern being patterned.

A system according to any one of the preceding claims, wherein the structured patterns having different orientations have substantially identical periodicity.

A system according to any one of the preceding claims, wherein the structured pattern comprises two-dimensional or three-dimensional patterns.

A system according to any one of the preceding claims, wherein the plurality of lenses are arranged at predetermined positions such that at least one conjugate image plane where three diffracted light beams intersect is formed on the optical path.

A system according to any one of the preceding claims, wherein the plurality of optical lenses are arranged at the predetermined positions such that the + 1st and -1st diffracted order diffracted light beams are received by the spatial light modulator in the vicinity of the edge of the lens are located.

The system of claim 12, wherein the plurality of optical lenses are disposed at the predetermined positions such that the diffracted light beams of the spatial light modulator are focused or imaged onto the rear focal plane of the objective.

A system according to any one of the preceding claims, wherein the rotating or vibrating light scattering element is a disc or a ground or frosted glass which is transparent to the light of the light source and has a roughened surface or an optical coating on the surface to enhance the light coherence to destroy.

A system according to claim 14, wherein the light scattering element continuously rotates 360 degrees about the axis of the optical path.

The system of claim 14, wherein the light scattering element swings rapidly and continuously about the axis of the optical beam path.

A system according to any one of the preceding claims, wherein the adjustment stage is controlled or adjusted by a piezoelectric transducer to move in the direction towards or away from the objective.

An optical system that generates incoherent structured illumination, comprising: a coherent light source emitting a coherent light forming an optical path; a spatial light modulator disposed in the optical path and receiving the coherent light, wherein the spatial light modulator generates and is configured to form a plurality of diffracted coherent light beams to form a pattern; a plurality of optical lenses arranged in the optical path and forming at least one conjugate image plane where the plurality of diffracted coherent light beams intersect; a rotating or oscillating light scattering element disposed on one of the conjugate image planes and configured to effectively destroy the coherence of the scattered coherent light rays; a lens that receives the plurality of diffracted light beams whose coherence is at least largely destroyed; and an adjustment stage near the lens that picks up a sample and is located near the front focal plane of the lens.

The optical system of claim 18, wherein the spatial light modulator comprises a patterned object, an optical grating, or a spatial liquid crystal light modulator.

The system of claim 18 or 19, wherein the patterned pattern is formed from the intersection of a plurality of light beams or a projection of the illumination onto a patterned object.

An optical system according to any one of claims 18 to 20, wherein the spatial light modulator generates at least diffracted light beams of the 0.th, + 1st, and -1st order of diffraction by means of the coherent light source.

An optical system according to any one of claims 18 to 21, wherein the rotating or vibrating light diffusing element is a disc or a ground or frosted glass which is transparent to the light of the light source and has a roughened surface or an optical coating on the surface to destroy the light coherence.

The optical system of claim 22, wherein the light scattering element continuously rotates 360 degrees about the axis of the optical path.

The system of claim 22, wherein the light scattering element swings rapidly and continuously about the axis of the optical beam path.

An optical system according to any one of claims 18 to 24, wherein the patterned pattern comprises two-dimensional or three-dimensional patterns.

The optical system according to any one of claims 18 to 25, wherein the plurality of lenses are arranged at predetermined positions so that the + 1st and -1st diffracted order diffracted light beams are received by the spatial light modulator in the vicinity of the edge of the lens are located.

The system of claim 26, wherein the plurality of optical lenses are disposed at the predetermined positions such that the diffracted light beams of the spatial light modulator are focused or imaged onto the rear focal plane of the objective.