WO2021111021A1 - Nanopartículas magnéticas estabilizadas con sistemas dendríticos carbosilano y sus usos - Google Patents

Nanopartículas magnéticas estabilizadas con sistemas dendríticos carbosilano y sus usos Download PDF

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WO2021111021A1
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magnetic
npm
dendron
magnetic nanoparticles
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Inventor
Rafael GÓMEZ RAMÍREZ
F. Javier DE LA MATA DE LA MATA
Andrea BARRIOS GUMIEL
Javier SÁNCHEZ-NIEVES FERNÁNDEZ
José L COPA PATIÑO
Juan Soliveri De Carranza
Original Assignee
Universidad De Alcalá
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    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages

Definitions

  • the present invention refers to magnetic iron oxide nanoparticles (magnetite; Fe304), coated on their surface with dendritic molecules with a carbosilane structure, functionalized on their periphery with active groups that are preferably in cationic form.
  • the present invention also relates to the process for obtaining nanoparticles from precursors, magnetic iron oxide nanoparticles and dendritic molecules with a carbosilane structure.
  • the invention relates to the uses of said compounds in biomedicine and more specifically in the concentration and elimination of microorganisms (bacteria, fungi and amoebae) and nucleic acids.
  • Magnetic nanoparticles are of great interest, among other reasons, because of their large surface / volume ratio and because they can be guided by an external magnetic field (Akbarzadeh, A. et al. Nanoscale Research Letters 2012, 7, 144). For its application in different fields, functionalization is the key, since it guides the utility and gives it the appropriate properties for it. In addition, the coating of the surface favors dispersion in the liquid state. Its applications include bioseparation, molecular detection or analyte concentration (Oksvold, M. P .; et al. Methods Mol Biol 2015, 1218, 465).
  • MD dendritic molecules
  • the MDs, dendrimers and dendrons are hyperbranched molecules of arborescent construction, of well-defined size and three-dimensional structure and that possess uniform chemical properties due in part to their low polydispersity as a consequence of their controlled synthesis.
  • Older generation dendrimers and dendrons have a spherical molecular topology. In both cases, its surface contains the active groups of these molecules.
  • MDs by themselves can have biological activity, acting for example as antibacterial agents (Chen, CZ, Cooper, SL, Biomaterials 2002, 23, 3359). They can also act as nucleic acid or drug transport agents (MA Mintzer and EE Simanek, Chem. Rev., 2009, 109, 259). This activity depends mainly on peripheral functions and is related to the multivalence of MDs, since they present a high number of functionalities on the same molecule.
  • MDs with cationic groups are used as nucleic acid transporters in therapies against HIV, cancer, etc., due to the formation of nanoconjugates through electrostatic interactions between the positive charge of the MDs and the negative charges of the acids.
  • nucleicos MJ Serram ⁇ a, et al. J. Control. Release, 2015, 200, 60.
  • This same type of systems have interesting bactericidal properties precisely because of the net positive charge they present and their ability to interact with bacterial membranes (Fuentes-Paniagua, E., et al. RSC Adv. 2016, 6, 7022).
  • the present invention provides magnetic nanoparticles (NPM) coated with dendritic molecules (MD) of carbosilane structure that are functionalized at their periphery with cationic (ammonium salts) or neutral (amino groups) groups.
  • NPM magnetic nanoparticles
  • MD dendritic molecules
  • This union between the MDs and the NPMs is preferably carried out by reaction between a trialkoxosilyl group present in the MDs and the hydroxyl groups on the surface of the NPMs.
  • the Nanoparticles are magnetite (FesCL) and MD are dendrons with a carbosilane structure functionalized on their surface with cationic or neutral groups through addition reactions of the thiol-ene type.
  • the process for obtaining the NPM of the invention allows, by means of a simple process, the synthesis of cationic systems. Furthermore, the invention provides its uses as a concentration system for bacteria or nucleic acids, which can serve to improve the detection of these agents or purification of contaminated media.
  • a first aspect of the present invention refers to an NPM (hereinafter compound of the invention) comprising:
  • This nucleus composed of magnetite, FesCL, of nanoscopic size.
  • This nucleus can have a spherical, cylindrical, prism or other arrangement of its atoms, with at least one dimension between 1 and 1000 nm.
  • dendritic molecule a highly branched macromolecule where the units, branches or growth branches have carbosilane skeleton and this dendritic molecule is functionalized in its outer layer with cationic (ammonium) or neutral (amino) groups.
  • the dendritic molecule is selected from dendron or dendrimer and comprises an anchor chain of formula -Si - (CH 2 ) bR 1 - (CH 2 ) a- where: the dendritic molecule is attached to the nucleus by the Si atom, a is a integer ranging from 0 to 10; b is an integer ranging from 1 to 10, preferably ranging from 1 to 5; Y
  • R 1 is selected from a group urea (-NH-CO-NH-), carbamate (-O-CO-NH- or -NH-CO-0-), thiocarbamate (-S-CO-NH-, -0 -CS-NH -, - NH-CO-S- or -NH-CS-0-), thiourea (-NH- CS-NH-) or a triazole group, preferably the N of the R 1 group is attached to the molecule dendritic through or not methylene groups.
  • R 1 is a urea group (-NH-CO-NH-).
  • This dendritic compound is preferably a dendron ( Figure 1), also called the latter as a dendritic wedge, which refers to a highly branched macromolecule with a cone shape and which is defined by a focal point, the units, branches or growth branches, that start from said focal point and the outer layer, surface or periphery of said branches, which incorporates functional groups.
  • Figure 1 also called the latter as a dendritic wedge, which refers to a highly branched macromolecule with a cone shape and which is defined by a focal point, the units, branches or growth branches, that start from said focal point and the outer layer, surface or periphery of said branches, which incorporates functional groups.
  • the focal point of the dendron is the anchor chain.
  • the union of the dendron to the NPM is carried out through the silicon atom present in the anchor chain of formula -Si - (CFhVR 1 - (CH2) a -; where: a and b are integers that vary from 1 to 10, preferably it varies from 1 to 5; and R 1 has been described above and preferably a urea group, and
  • the outer layer of the dendron consists of the same or different units of the formula group
  • R 2 is a (C1-C4) alkyl group, preferably R 2 is a methyl group; p is an integer and ranges from 1 to 3, preferably p is 2;
  • R 3 is the following group - (CH2) c -S- (CH2) dR 4 ; c represents an integer ranging from 2 to 5; preferably c is 2 or 3; d represents an integer ranging from 1 to 10; preferably d ranges from 1 to 5; R 4 is a group -NR'R "or a group -NR'R” R “', where R', R" and R '", independently represent a (C1-C4) alkyl group or a hydrogen; even more preferably R 4 is a group -N (CH) + or a 3-group-NH + . Even more preferably c is 2 and even more preferably d is 2.
  • the magnetic nanoparticle may also be coated by a carbosilane dendrimer ( Figure 2).
  • This dendrimer is heterofunctionalized (see for example WO 2014016460) and consists of an outer layer, which has units of the group of formula (II): where: R 2 is a (C1-C4) alkyl group, preferably R 2 is a methyl group; p is an integer and ranges from 1 to 3, preferably p is 2;
  • R 5 is the following group - (CH2) c -S- (CH2) dR 6 ; c represents an integer ranging from 2 to 5; preferably c is 2 or 3; d represents an integer ranging from 1 to 10; preferably d ranges from 1 to 5;
  • R 6 is a group -NR'R "or a group -NR'R” R "', where R', R" and R '", represent de independently a (C1-C4) alkyl group or a hydrogen; even more preferably R 6 is a -NMe3 + group or a -NH3 + group. Even more preferably c is 2 and even more preferably d is 2.
  • at least one of these R 6 groups of the outer layer consists of an anchor chain unit of formula -Si- (CH2) b -R 1 - (CH2) a - where the dendrimer is attached to the nucleus via the Si atom, a is 0; yb and R 1 are defined above. Therefore, this silicon atom present in said chain is what anchors the dendrimer to the surface of the NPM.
  • alkyl refers in the present invention to aliphatic chains, linear or branched, having 1 to 4 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, tert- butyl or sec-butyl, preferably having 1 to 2 carbon atoms, more preferably the alkyl group is a methyl or an ethyl.
  • the compound of the present invention is preferably cationic, formed by R 4 or R 6 by ammonium groups (for example -NH + 03-NMe + ). Therefore, the present invention includes not only the compounds themselves, but any of their salts.
  • the salts are halide salts, which can be selected from chloride, bromide, iodide salts; or another type of anions such as triflate.
  • the salts are iodide and chloride.
  • Another aspect of the present invention refers to the process for obtaining the compounds of the invention that comprises a reaction between the hydroxyl groups on the surface of the Fe304 nanoparticles, and trialkoxosilyl groups of the anchor chain of the dendritic molecule.
  • the functionalization of the NPMs with the MDs is preferably carried out by reaction between a trialkoxosilyl group present in the MDs and the hydroxyl groups on the surface of the NPMs.
  • the anchor chain of the dendron or dendrimer would be of the type - (CH2) aR 1 - (CH2) b -Si (OR 7 ) 3 ; where a, b and R 1 have been defined above and R 7 is an alkyl group.
  • the reaction is carried out in the presence of a polar solvent, preferably an alcohol, such as ethanol, or a mixture of solvents, preferably ethanol / DMF, without ruling out others.
  • a polar solvent preferably an alcohol, such as ethanol, or a mixture of solvents, preferably ethanol / DMF, without ruling out others.
  • n indicates the number of the G generation.
  • the compounds (R 7 0) 3 SiG n (R 4 ) used for the preparation of the NPM were previously described (A. Mart ⁇ nez et al. Chem. Eur. J. 2015, 21, 15651; M. Sánchez-Milla 2019, Doctoral Thesis (UAH)).
  • NPM of the invention containing drendrons are selected from: Fe 3 04 @ (SiG2 (NMe 3 CI) 4), Fe 3 04 (SiG3 (NMe 3 CI) 8) and Fe 3 0 4 @ (SiG3 (NMe 2 ) 8), Fe 3 04 @ (SiG2 (NMe 2 ) 4).
  • NPM of the invention that contain dendrimers would be: Fe 3 04 @ (SiG 1 (NMe 3 ⁇ ) and Fe 3 0 4 @ (SiG1 (NMe 2 ) 7 )
  • obtaining cationic NPMs of the invention can be produced by a quaternization reaction of the corresponding amino group present in neutral NPMs, which contain terminal amino groups, using a RX derivative, alkyl sulfates (C1-C5), methyl triflate, or any of its combinations as a quaternizing agent (where R is selected from hydrogen, alkyl (CrC 2 4), alcohol (CC 2 4) or an aryl, preferably benzyl; and X is a halogen, preferably Cl, Br or I), such as methyl iodide (Mel), HCl, methyl chloride, methyl bromide, ethyl chloride, ethyl bromide, propyl chloride, hexyl chloride, dodecyl chloride, benzyl chloride, benzyl bromide, ethanol bromide, ethanol iodide, or any combination thereof.
  • RX derivative alkyl sulfates (C
  • the present invention also relates to the uses of the dendronized NPMs of the present invention described above that have cationic end groups. These include the use of cationic derivatives as agents to trap selected microorganisms among bacteria, fungi or amoebae, preferably bacteria, both Gram + and Gram-, in such a way that they allow increasing their concentration for their analysis or the elimination (purification) of the medium that contains them.
  • Another aspect of the present invention refers to the use of the dendronized NPM of the present invention described above that have cationic end groups to trap nucleic acids, so as to increase their concentration for their analysis or the elimination (purification) of the medium. that contains them.
  • another aspect of the present invention refers to the use of these compounds as biocidal agents for non-therapeutic applications, such as, but without be limited to them, prevent the appearance of microorganisms on surfaces.
  • nucleic material or “nucleic acids” refers in the present invention to a material, isolated and / or purified, which comprises a nucleotide sequence and can be selected from oligonucleotides, RNA or DNA.
  • FIG. 9 Bacteria retention diagram (S. aureus, left; E. coli, right) with the NPM Fe 3 0 4 @ (SiG 2 (NMe 3 CI) 4 ) (G2) and Fe 3 0 4 @ (SiG 3 (NMe 3 CI) 8 ) (G3).
  • This diagram corresponds to procedure 2 described in Magnetic nanoparticles' bacterial capture capacity.
  • Figure 10 TEM images of the interaction of Fe 3 0 4 @ (SiG 2 (NMe 3 CI) 4 ) (G2) with S. aureus (A) and E. coli (B) and SEM images of the interaction of Fe 3 0 4 @ (SiG 2 (NMe 3 CI) 4 ) (G2) with S. aureus (C) and E. coli (D). These images correspond to procedure 2 described in Bacteria capture capacity of magnetic nanoparticles.
  • NPM functionalized with dendron carbosilane with neutral and cationic groups The latter are described with a chloride-type counterion, but without ruling out others.
  • TEM electron microscopy
  • Example 1 NPM functionalized with neutral groups Synthesis of Fe 3 04 @ (SiG2 (NMe 2 ) 4).
  • dendron (EtO) 3 SiG2 (NMe 2 ) 4 (0.72 g, 0.631 mmol, 1 equiv) in EtOH was added to the mixture and sonicated for a further 10 min.
  • the mixture was stirred at room temperature for 16 h.
  • the product was washed 5 times with ethanol, isolated by magnetic separation and dried under vacuum.
  • Example 2 NPM functionalized with cationic groups Synthesis of Fe 3 0 4 @ (SiG2 (NMe 3 CI) 4 ).
  • NPM of the invention The ability of the NPM of the invention to capture Gram + (eg S. aureus) and Gram- type bacteria (eg E. coli) in aqueous media, the subsequent elution and survival of these microorganisms has been studied. These studies can be applied to other bacteria or microorganisms, such as fungi or amoebae.
  • Gram + eg S. aureus
  • Gram- type bacteria eg E. coli
  • % bacteria capture [(OD control-OD supernatant) / OD control] x100
  • % bacteria capture [(OD control-OD supernatant) / OD control] x100
  • the NPM-bacteria system was washed twice with water. Then 1.5 mL of phosphate buffered saline (PBS) was added and stirred for 5 min. Subsequently uses an external magnet for magnetic separation of NPM-bacteria systems. The optical density of the supernatant is again measured.
  • PBS phosphate buffered saline
  • % capture [(OD without treatment -OD supernatant) / OD without treatment] x100
  • the results obtained using the NPM Fe 3 0 4 @ (SiG 2 (NMe 3 CI) 4 ) and Fe 3 0 4 @ (SiG 3 (NMe 3 CI) e) in their interaction with bacterial DNA from Gram-negative E. coli bacteria CECT434; WDCM00013.
  • the use of this type of nucleic acid is not exclusive for other nucleic acids.
  • the results indicate ( Figure 11) that retention is clearly dependent on dendron generation and time. For the case of NPM Fe 3 0 4 @ (SiG 2 (NMe 3 CI) 4 ), with a second-generation dendron, retention (around 16%) is only observed at times of 80 min. However, a close percentage of retention was obtained for Fe304 (SiG3 (NMe3CI) 8) at 10 min, reaching a maximum retention at 40 min (around 50%).

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Abstract

La presente invención se refiere a nanopartículas magnéticas (NPM), principalmente de magnetita (Fe3O4), recubiertas en su superficie con moléculas dendríticas, particularmente dendrones, de estructura carbosilano y funcionalizados en su periferia con grupos activos que preferiblemente están en forma catiónica. La presente invención también se refiere al procedimiento de obtención de las NPM a partir de los precursores (magnetita) y dendrones carbosilano. Además, la invención se refiere a los usos de dichos compuestos en concentración o eliminación de micoorganismos y ácidos nucleicos. Su capacidad de retención depende de la generación de los sistemas dendríticos soportados por la NPM. En cualquier caso, se observa la capacidad de interacción de las NPM con bacterias, tanto Gram+ como Gram-, y con ácidos nucleicos. La aplicación de un campo magnético a soluciones de dichas NPM en un medio con bacterias o ácidos nucleicos permite la retirada de estos de dicho medio.

Description

NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS ESTABILIZADAS CON SISTEMAS DENDRÍTICOS
CARBOSILANO Y SUS USOS
DESCRIPCION
La presente invención se refiere a nanopartículas magnéticas de óxido de hierro (magnetita; Fe304), recubiertas en su superficie con moléculas dendríticas de estructura carbosilano, funcionalizadas en su periferia con grupos activos que preferiblemente están en forma catiónica. La presente invención también se refiere al procedimiento de obtención de las nanopartículas a partir de los precursores, nanopartículas magnéticas de óxido de hierro y moléculas dendríticas de estructura carbosilano. Además, la invención se refiere a los usos de dichos compuestos en biomedicina y más concretamente en la concentración y eliminación de microorganismos (bacterias, hongos y amebas) y ácidos nucleicos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Las nanopartículas magnéticas (NPM) son de gran interés entre otras razones por su gran relación superficie/volumen y por poder ser guiadas por un campo magnético externo (Akbarzadeh, A. et al. Nanoscale Research Letters 2012, 7, 144). Para su aplicación en diferentes campos la funcionalización es la clave, ya que orienta la utilidad y le confiere las propiedades adecuadas para ello. Además, el recubrimiento de la superficie favorece la dispersión en estado líquido. Entre sus aplicaciones se puede destacar la bioseparación, la detección molecular o la concentración de analitos (Oksvold, M. P.; et al. Methods Mol Biol 2015, 1218, 465).
Un tipo de moléculas que se ha utilizado recientemente para estabilizar NP, y que además tiene un atractivo específico para aplicaciones biomédicas, son las moléculas dendríticas (MD) (Newkome, G. R.; Shreiner, C. D. Polymer 2008, 49, 1). Las MD, dendrímeros y dendrones, son moléculas hiperramificadas de construcción arborescente, de tamaño y estructura tridimensional bien definidos y que poseen unas propiedades químicas uniformes debidas en parte a su baja polidispersidad como consecuencia de su síntesis controlada. Los dendrímeros y dendrones de mayores generaciones presentan una topología molecular esférica. En ambos casos, su superficie contiene los grupos activos de estas moléculas. Además, en el caso de los dendrones, éstos presentan una posición adicional denominada punto focal, que puede servir para introducir una nueva función activa o como anclaje a otros sistemas, por ejemplo, a NP. Las MD por sí mismos pueden tener actividad biológica, actuando por ejemplo como agentes antibacterianos (Chen, C.Z., Cooper, S.L., Biomaterials 2002, 23, 3359). También pueden actuar como agentes de transporte de ácidos nucleicos o fármacos (M. A. Mintzer and E. E. Simanek, Chem. Rev., 2009, 109, 259). Esta actividad depende principalmente de las funciones periféricas y está relacionada con la multivalencia de las MD, ya que presentan un número elevado de funcionalidades sobre una misma molécula.
Por ejemplo, MD con grupos catiónicos se emplean como transportadores de ácidos nucleicos en terapias frente al VIH, cáncer, etc., debido a la formación de nanoconjugados a través de interacciones electrostáticas entre la carga positiva de las MD y las cargas negativas de los ácidos nucleicos (M. J. Serramía, et al. J. Control. Release, 2015, 200, 60). Este mismo tipo de sistemas presentan interesantes propiedades bactericidas precisamente por la carga positiva neta que presentan y su capacidad para interaccionar con membranas bacterianas (Fuentes-Paniagua, E., et al. RSC Adv. 2016, 6, 7022). La incorporación de MD a NP ha llevado a la formación de NP de oro y plata cubiertas en su superficie con MD que presentan propiedades como las comentadas anteriormente (Peña-González, C.E. et al. Int J. Pharm. 2017, 528, 55).
Si esta funcionalización con MD se realizara sobre NPM, se podría plantear que la interacción de estas con ácidos nucleicos o bacterias, en un medio en el cual estos sistemas estuvieran presentes, permitirían la concentración de estos agentes sobre las NPM, de modo que la aplicación de un campo magnético retiraría las NPM del medio arrastrando además los ácidos nucleicos y bacterias que están interaccionando con ellas. Es decir, este tipo de NPM serviría por ejemplo para concentrar bacterias o ácidos nucleicos para mejorar su análisis o para purificar aguas. Esto último es de especial relevancia, ya que para algunas aplicaciones el nivel de pureza requerido ha de ser mejorado y trazas de microorganismos o ácidos nucleicos pueden conllevar la aparición de complicaciones en pacientes de hospital, como por ejemplo en pacientes de diálisis (Bossola M, et al. Clin J Am Soc Nephrol. 2009, 4, 379).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona nanopartículas magnéticas (NPM) recubiertas de moléculas dendríticas (MD) de estructura carbosilano que están funcionalizados en su periferia con grupos catiónicos (sales de amonio) o neutros (grupos amino). Esta unión entre las MD y las NPM se realiza preferentemente por reacción entre un grupo trialcoxosililo presente en las MD y los grupos hidroxilo de la superficie de las NPM. Preferentemente, las nanopartículas son de magnetita (FesCL) y las MD son dendrones de estructura carbosilano funcionalizados en su superficie con grupos catiónicos o neutros a través de reacciones de adición de tipo tiol-eno.
El procedimiento de obtención de las NPM de la invención permite, mediante un proceso sencillo, la síntesis de sistemas catiónicos. Además, la invención proporciona sus usos como sistema de concentración de bacterias o ácidos nucleicos, que puede servir para la mejora de detección de estos agentes o purificación de medios contaminados.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una NPM (a partir de ahora compuesto de la invención) que comprende:
-Un núcleo compuesto por magnetita, FesCL, de tamaño nanoscópico. Este núcleo puede tener una disposición de sus átomos esférica, cilindrica, de prisma u otras, con al menos una dimensión entre 1 y 1000 nm.
-La superficie de la NPM está a su vez recubierta por al menos una molécula dendrítica (MD). Por “molécula dendrítica” se refiere en la presente invención a una macromolécula muy ramificada donde las unidades, ramas o ramificaciones de crecimiento tienen esqueleto carbosilano y esta molécula dendrítica está funcionalizada en su capa externa con grupos catiónicos (amonio) o neutros (amino). La molécula dendrítica se selecciona entre dendrón o dendrímero y comprende una cadena anclante de fórmula -Si - (CH2)b-R1-(CH2)a- donde: la molécula dendrítica está unida al núcleo por el átomo de Si, a es un número entero que varía entre 0 a 10; b es un número entero que varía de 1 a 10, preferiblemente varían de 1 a 5; y
R1 se selecciona de entre un grupo urea (-NH-CO-NH-), carbamato (-O-CO-NH- ó -NH-CO-0-), tiocarbamato (-S-CO-NH-, -0-CS-NH-,-NH-CO-S- o -NH-CS-0-), tiourea (-NH- CS-NH-) o un grupo triazol, preferiblemente el N del grupo R1 está unido a la molécula dendrítica a través o no de grupos metilenos. Preferiblemente R1 es un grupo urea (-NH-CO- NH-).
Este compuesto dendrítico es preferentemente un dendrón (Figura 1), también denominado este último como cuña dendrítica, que se refiere a una macromolécula muy ramificada con forma de cono y que está definida por un punto focal, las unidades, ramas o ramificaciones de crecimiento, que parten de dicho punto focal y la capa externa, superficie o periferia de dichas ramificaciones, que incorpora grupos funcionales. Cuando la molécula dendrítica es un dendrón:
-el punto focal del dendrón es la cadena anclante. La unión del dendrón a la NPM se realiza a través del átomo de silicio presente en la cadena anclante de fórmula -Si -(CFhVR1- (CH2)a- ; donde: a y b son números enteros que varían de 1 a 10, preferiblemente varía de 1 a 5;y R1 se ha descrito anteriormente y preferentemente un grupo urea, y
-la capa externa del dendrón consiste en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula
(I):
Figure imgf000005_0001
donde: R2es un grupo alquilo (C1-C4), preferiblemente R2es un grupo metilo; p es un número entero y varía entre 1 y 3, preferiblemente p es 2;
R3es el siguiente grupo -(CH2)c-S-(CH2)d-R4; c representa un número entero que varía de 2 a 5; preferiblemente c es 2 ó 3; d representa un número entero que varía de 1 a 10; preferiblemente d varía entre 1 y 5; R4 es un grupo -NR’R” o un grupo -NR’R”R”’, donde R’, R” y R’”, representan de manera independiente un grupo alquilo (C1-C4) o un hidrógeno; aún más preferiblemente R4es un grupo -N(CH ) +o un3gfupo-NH +. Aún más preferiblemente c es 2 y aún más preferiblemente d es 2. Cuando la molécula dendrítica es un dendrímero, la nanopartícula magnética puede estar también recubierta por un dendrímero carbosilano (Figura 2). Este dendrímero se encuentra heterofuncionalizado (ver por ejemplo WO 2014016460) y consiste en una capa externa, que presenta unidades del grupo de fórmula (II):
Figure imgf000005_0002
donde: R2es un grupo alquilo (C1-C4), preferiblemente R2es un grupo metilo; p es un número entero y varía entre 1 y 3, preferiblemente p es 2;
R5es el siguiente grupo -(CH2)c-S-(CH2)d-R6; c representa un número entero que varía de 2 a 5; preferiblemente c es 2 ó 3; d representa un número entero que varía de 1 a 10; preferiblemente d varía entre 1 y 5;
R6es un grupo -NR’R” o un grupo -NR’R”R”’, donde R’, R” y R’”, representan de manera independiente un grupo alquilo (C1-C4) o un hidrógeno; aún más preferiblemente R6 es un grupo -NMe3 + o un grupo -NH3 +. Aún más preferiblemente c es 2 y aún más preferiblemente d es 2. En este caso, al menos uno de estos grupos R6 de la capa externa consiste en una unidad de la cadena anclante de fórmula -Si-(CH2)b-R1-(CH2)a- donde el dendrímero está unido al núcleo por el átomo de Si, a es 0; y b y R1 están definidos anteriormente. Por lo tanto, este átomo de silicio presente en dicha cadena es el que ancla el dendrímero a la superficie de la NPM.
El término “alquilo” se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i- propilo, n-butilo, tert-butilo o sec-butilo, preferiblemente tiene de 1 a 2 átomos de carbono, más preferiblemente el grupo alquilo es un metilo o un etilo.
El compuesto de la presente invención es preferiblemente catiónico, formado R4o R6por grupos amonio (por ejemplo -NH + 03-NMe +). Ror lo tanto, la presente invención no solo incluye los compuestos por sí mismos, sino cualquiera de sus sales. Preferiblemente las sales son de halogenuro, que se pueden seleccionar entre sales de cloruro, bromuro, ioduro; u otro tipo de aniones como triflato. Preferiblemente las sales son de ioduro y cloruro.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de los compuestos de la invención que comprende una reacción entre los grupos hidroxilos de la superficie de las nanopartículas de Fe304, y grupos trialcoxosililos de la cadena anclante de la molécula dendrítica. La funcionalización de las NPM con las MD se realiza preferentemente por reacción entre un grupo trialcoxosililo presente en las MD y los grupos hidroxilo de la superficie de las NPM. De este modo, la cadena anclante del dendrón o del dendrímero serían del tipo -(CH2)a-R1-(CH2)b-Si(OR7)3; donde a, b y R1 se han definido anteriormente y R7es un grupo alquilo.
En una realización preferida del procedimiento de la invención, la reacción se lleva a cabo en presencia de un disolvente polar, preferentemente un alcohol, como por ejemplo etanol, o una mezcla de disolventes, preferentemente etanol/DMF, sin descartar otros.
La síntesis de estas NPM dendronizadas neutras o catiónicas puede representarse, de manera general, por el esquema 1. A partir de ahora los dendrones (Figura 1), se nombrarán como aparecen en este esquema. (R70)3Si
Figure imgf000007_0001
(R70)3SiGn(R4)p
Figure imgf000007_0002
NPM@(SiGn(R4)p)
Esquema 1. Síntesis de NPM a partir de dendrones carbosilano. i) Etanol/DMF. donde las NPM se nombrarán simplificadamente como NPM@(SiGn(R4) ), estando formadas preferentemente por magnetita (Fe304; NPM = Fe304), mientras que entre paréntesis se indica el ligando estabilizador de la NP de la siguiente manera (Figuras 3-8):
-Los dendrones neutros o catiónicos se nombran como SiGn(R4)P, donde: n indica el número de la generación G.
Si, indica que la funcionalización se realiza por reacción de las NPM con dendrímeros y dendrones que contienen una función del tipo -Si(OR7)3 R4 representa la naturaleza de los grupos funcionales situados en la periferia de las MD (preferentemente R4= NH +,3NMe H¼
Figure imgf000007_0003
el número de estos grupos funcionales, que va a depender de la generación dendrítica. Los compuestos (R70)3SiGn(R4) empleados para la preparación de las NPM fueron descritos previamente (A. Martínez et al. Chem. Eur. J. 2015, 21, 15651; M. Sánchez- Milla 2019, Tesis Doctoral (UAH)).
Ejemplos de NPM de la invención que contienen drendrones se selecciona de entre: Fe304@(SiG2(NMe3CI)4), Fe304(SiG3(NMe3CI)8) y Fe304@(SiG3(NMe2)8), Fe304@(SiG2(NMe2)4).
-Los dendrímeros neutros o catiónicos se nombran de la misma manera que los dendrones, donde R4 sería R6. Ejemplos de NPM de la invención que contienen dendrímeros serían: Fe304@(SiG1(NMe3^ ) yFe304@(SiG1(NMe2)7)
Por otro lado, la obtención de NPM catiónicas de la invención se puede producir mediante una reacción de cuaternización del correspondiente grupo amino presente en las NPM neutras, que contienen grupos amino terminales, utilizando un derivado RX, sulfatos de alquilo (C1-C5), triflato de metilo, o cualquiera de sus combinaciones como agente cuaternizante (donde R se selecciona de entre hidrógeno, alquilo (CrC24), alcohol (C C24) o un arilo, preferiblemente bencilo; y X es un halógeno, preferiblemente Cl, Br o I), como por ejemplo yoduro de metilo (Mel), HCI, cloruro de metilo, bromuro de metilo, cloruro de etilo, bromuro de etilo, cloruro de propilo, cloruro de hexilo, cloruro de dodecilo, cloruro de bencilo, bromuro de bencilo, bromuro de etanol, ioduro de etanol o cualquiera de sus combinaciones. También, en el caso de compuestos funcionalizados con grupos amonio del tipo -NR2 HCI, se neutralizan con medio básico y posteriormente se pueden cuaternizar con otros agentes alquilantes como los descritos anteriormente.
La presente invención se refiere también a los usos de las NPM dendronizadas de la presente invención descritas anteriormente que presentan grupos terminales catiónicos. Entre ellas destacan la utilización de los derivados catiónicos como agentes para atrapar microorganismos seleccionados entre bacterias, hongos o amebas, preferiblemente bacterias, tanto Gram+ como Gram-, de manera que permitan aumentar la concentración de estas para su análisis o la eliminación (purificación) del medio que las contiene.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de las NPM dendronizadas de la presente invención descritas anteriormente que presentan grupos terminales catiónicos para atrapar ácidos nucleicos, de manera que permitan aumentar la concentración de estos para su análisis o la eliminación (purificación) del medio que los contiene.
Teniendo en cuenta la actividad microcida, y en particular biocida, de las MD incorporadas a las NPM de la invención, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de estos compuestos como agentes biocidas para aplicaciones no terapéuticas, como por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, impedir la aparición de microorganismos en superficies.
Por “material nucleico” o “ácidos nucleicos” se refiere en la presente invención a un material, aislado y/o purificado, que comprende una secuencia nucleotídica y se puede seleccionar entre oligonucleotidos, ARN o ADN.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Representación de una cuña carbosilano catiónica de segunda generación (EtO)3S¡G2(NMe3 +MR4= NMe + 3 p = 4, n = 2, R7= Et).
Figure 2. Representación de un dendrímero carbosilano catiónico de primera generación (EtO)3SiG1 (NMe 5) R6 = NMe + 3p = 7, n = 1 , R7= Et).
Figura 3. Imagen TEM (izquierda) e histograma de distribución (derecha) de Fe304@(SiG2(NMe3CI)4) (tamaño promedio = 11±3 nm (134 NPM medidas con el programa Image J)).
Figura 4. Imagen TEM (izquierda) e histograma de distribución (derecha) de Fe304@(SiG3(NMe3CI)e) (tamaño promedio = 11±2 nm (103 NPM medidas con el programa Image J)).
Figura 5. Representación de Fe304@(SiG2(NMe2)4).
Figura 6. Representación de Fe304@(SiG3(NMe2)e).
Figura 7. Representación de Fe304@(SiG2(NMe3CI)4).
Figura 8. Representación de Fe304@(SiG3(NMe3CI)8).
Figura 9. Diagrama de retención de bacterias (S. aureus, izquierda; E. coli, derecha) con las NPM Fe304@(SiG2(NMe3CI)4) (G2) y Fe304@(SiG3(NMe3CI)8) (G3). Este diagrama corresponde al procedimiento 2 descrito en Capacidad de captura de bacterias de las nanopartículas magnéticas.
Figura 10. Imágenes TEM de la interacción de Fe304@(SiG2(NMe3CI)4) (G2) con S. aureus (A) y E.coli (B) e imágenes SEM de la interacción de Fe304@(SiG2(NMe3CI)4) (G2) con S. aureus (C) y E.coli (D). Estas imágenes corresponden al procedimiento 2 descrito en Capacidad de captura de bacterias de las nanopartículas magnéticas.
Figura 11. Diagrama de retención de ácidos nucleicos con las NPM Fe304@(SiG2(NMe3CI)4) (G2) y Fe304@(SiG3(NMe3CI)8) (G3).
EJEMPLOS
A continuación se describe la síntesis de ejemplos seleccionados de NPM funcionalizadas con dendrones carbosilano con grupos neutros y catiónicos. Estas últimas se describen con un contraión de tipo cloruro, pero sin descartar otros. Además, las estructuras de algunas NPM dendronizadas así como la imagen obtenida por microscopía electrónica (TEM) se muestran en las Figuras 3-8, y son representativas para el resto de sistemas que se describen en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1.- NPM funcionalizadas con grupos neutros Síntesis de Fe304@(SiG2(NMe2)4). Una disolución de nanopartículas sin funcionalizar (Fe304) en etanol (189 ml_, 146 mg, 3.33 mM) fue sonicada durante 20 min. Posteriormente, el dendrón (EtO)3SiG2(NMe2)4 (0.72 g, 0,631 mmol, 1 equiv) en EtOH fue añadido a la mezcla y sonicado 10 min más. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 16 h. El producto fue lavado 5 veces con etanol, aislado mediante separación magnética y secado a vacío. Estas NPM se pueden utilizar in situ para la preparación de las correspondientes NPM catiónicas.
Síntesis de Fe304@(SiG3(NMe2)8).
Una disolución de nanopartículas sin funcionalizar (Fe304) en etanol (171 mL, 132 mg, 3.33 mM) fue sonicada durante 20 min. Posteriormente, el dendrón (EtO)3SiG3(NMe2)8 (1.27 g, 0,570 mmol, 1 equiv) en EtOH fue añadido a la mezcla y sonicado 10 min más. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 16 h. El producto fue lavado 5 veces con etanol, aislado mediante separación magnética y secado a vacío. Estas NPM se pueden utilizar in situ para la preparación de las correspondientes NPM catiónicas.
Ejemplo 2.- NPM funcionalizadas con grupos catiónicos Síntesis de Fe304@(SiG2(NMe3CI)4).
Una disolución de nanopartículas sin funcionalizar (Fe304) en etanol (210 mL, 162 mg, 3.33 mM) fue sonicada durante 20 min. Posteriormente, el dendrón (EtO)3SiG2((NMe)3CI)4 (1.19 g, 0,699 mmol, 1 equiv) en DMF fue añadido a la mezcla y sonicado 10 minutos más. La mezcla fue agitada a temperature ambiente durante 16 horas. El producto fue lavado 5 veces con agua mediante separación magnética y aislado secándolo a vacío.
Datos para Fe304@(SiG2(NMe3CI)4): TGA (%): (Fe304) 89.8, (L) 10.2. Diámetro promedio del núcleo de Fe304; D = 11 nm (TEM).
Síntesis de NPM@(SiG3(NMe3CI)8).
Una disolución de nanopartículas sin funcionalizar (Fe304) en etanol (174 mL, 134 mg, 3.33 mM) fue sonicada durante 20 min. Posteriormente, el dendrón (EtO)3SiG3((NMe)3CI)8 (1.96 g, 0,580 mmol, 1 equiv) en DMF fue añadido a la mezcla y sonicado 10 minutos más. La mezcla fue agitada a temperatura ambiente durante 16 horas. El producto fue lavado 5 veces con agua mediante separación magnética y aislado secándolo a vacío.
Datos para Fe304@(SiG3(NMe3CI)8): TGA (%): (Fe304) 78.5, (L) 21.5. Diámetro promedio del núcleo de Fe304; D = 11 nm (TEM). ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS CATIÓNICAS FRENTE A BACTERIAS.
Se ha estudiado la capacidad de las NPM de la invención para capturar bacterias de tipo Gram+ (ej. S. aureus ) y Gram- (ej. E. col¡) en medios acuosos, la posterior elución y supervivencia de estos microorganismos. Estos estudios pueden ser aplicados a otras bacterias o microorganismos, como por ejemplo hongos o amebas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Capacidad de captura de bacterias de las nanopartículas magnéticas.
A continuación, se describen dos procedimientos seguidos para analizar la capacidad de las NPM para capturar bacterias, sin descartar otros posibles:
1) Para determinar la capacidad de captura de bacterias de las NPM, se preparó una serie de soluciones bacterianas (S. aureus y E. col¡) (1mL) de diferentes concentraciones (Densidad óptica D0625: 0.1-1.2). Posteriormente, se añadió 1 mg de las NPM a cada una de estas soluciones. Estas soluciones son agitadas vigorosamente durante un minuto. Posteriormente se emplea un imán externo para la separación magnética de los sistemas NPM-bacteria. La densidad óptica (DO) del sobrenadante es de nuevo medida, indicando la cantidad de bacteria que ha sido capturada por el sistema:
% captura de bacterias = [(DO control-DO sobrenadante)/DO control]x100
2) Para determinar la capacidad de captura de bacterias de las NPM, se preparó una serie de soluciones de NPM de diferentes concentraciones (2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 ppm). Posteriormente, a 750 pL de cada una de estas disoluciones se añaden 750 pL de una solución de bacterias (S. aureus y E. coli), cuya densidad óptica ha sido previamente medida a una longitud de onda de 625 nm (DO = 0.2). Estas soluciones son agitadas vigorosamente durante 1 min y se mantienen incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente se emplea un imán externo para la separación magnética de los sistemas NPM-bacteria. La densidad óptica (DO) del sobrenadante es de nuevo medida y comparada con la densidad óptica de la solución sin tratar, indicando la cantidad de bacteria que ha sido capturada por el sistema (Figura 9).
% captura de bacterias = [(DO control-DO sobrenadante)/DO control]x100
Para determinar la elución de las bacterias que han interaccionado con las NPM y han sido capturadas, el sistema NPM-bacteria fue lavado dos veces con agua. A continuación, se añadió 1.5 mL de tampón fosfato salino (PBS) y se agitó durante 5 min. Posteriormente se emplea un imán externo para la separación magnética de los sistemas NPM-bacteria. La densidad óptica del sobrenadante es de nuevo medida.
Para determinar la supervivencia tanto de las bacterias capturadas como de las bacterias que han quedado en el sobrenadante, 5 pL de cada una de las soluciones son añadidos a una placa de agar PCA que es incubada a 37°C durante 20 horas.
Capacidad de captura de ácidos nucleicos de las nanopartículas magnéticas.
A continuación, se describe el proceso realizado utilizando ADN bacteriano procedente de una cepa de E. coli (CECT434; WDCM00013), sin descartar otros procedimientos o ácidos nucleicos. 10 pL de disolución de NPM (1000 ppm) son añadidos sobre 10 pL de una disolución de ADN bacteriano. La mezcla se agita vigorosamente durante 2 min y se deja reposar durante un tiempo determinado (por ejemplo 10, 40 y 80 min). A continuación, se emplea un imán externo para la separación magnética de los sistemas NPM-ADN. La densidad óptica (D.O.) del sobrenadante es medida, así como un control de ADN (10 pL ADN y 10 pL agua). De esta manera puede calcularse el porcentaje de ADN que ha sido capturado por el sistema.
% captura = [(DO sin tratamiento -DO sobrenadante)/DO sin tratamiento]x100
RESULTADOS
Interacción con bacterias
Como ejemplo, se analizaron 2 NPM preparadas según se describe en la invención de tipo Fe304@(SiGn(NMe3CI)m) (n = 2, m = 4; n = 3, m = 8), funcionalizadas con dendrones de segunda y tercera generación respectivamente. Los resultados (Figura 9, método 2) muestran que en el caso de S. aureus la capacidad de captura de las NPM es claramente superior para la NPM de tercera generación Fe304@(SiG3(NMe3CI)e), consiguiendo porcentajes de captura del casi 100% a una concentración de 250 ppm, mientras que utilizando Fe304@(SiG2(NMe3CI)4) se requiere una concentración de 1000 ppm. En el caso de E. coli la capacidad de ambas NPM es similar, obteniéndose porcentajes del 90% a concentraciones de 250 ppm.
Mediante la incubación de las soluciones de los sistemas NPM-bacteria, el sobrenadante, y las soluciones de elución con PBS se demostró la supervivencia de los microorganismos. Las imágenes obtenidas por TEM y SEM de los sistemas NPM-bacteria (Figura 10, método 2) muestran como las NPM recubren totalmente la superficie de las bacterias. Interacción con ácidos nucleicos
Como ejemplo, se comentan los resultados obtenidos utilizando las NPM Fe304@(SiG2(NMe3CI)4) y Fe304@(SiG3(NMe3CI)e) en su interacción con ADN bacteriano procedente de bacterias Gram-negativa de tipo E. coli (CECT434; WDCM00013). El uso de este tipo de ácido nucleico no es excluyente para otros ácidos nucleicos. Los resultados indican (Figura 11) que la retención es claramente dependiente de la generación del dendrón y del tiempo. Para el caso de la NPM Fe304@(SiG2(NMe3CI)4), con un dendrón de segunda generación, solo se observa retención (en torno al 16%) a tiempos de 80 min. Sin embargo, un porcentaje próximo de retención se obtuvo para Fe304(SiG3(NMe3CI)8) a los 10 min, alcanzándose un máximo de retención a los 40 min (en torno al 50%).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Nanopartícula magnética (NPM) recubierta de al menos una molécula dendrítica de naturaleza carbosilano y funcionalizada en su capa externa con grupos catiónicos (amonio) 5 o neutros (amino), caracterizado por que:
-el núcleo de la nanopartícula está compuesto por Fe304; y
-la molécula dendrítica se selecciona entre dendrón o dendrímero y comprende una cadena anclante de fórmula -Si-(CH2)b-R1-(CH2)a- donde: la molécula dendrítica está unida al núcleo por el átomo de Si,
10 a es un número entero que varía entre 0 a 10; b es un número entero que varía de 1 a 10, preferiblemente varían de 1 a 5; y R1 se selecciona de entre un grupo urea, carbamato, tiocarbamato, tiourea o un grupo triazol.
152. Nanopartícula magnética según la reivindicación 1, donde la molécula dendrítica es un dendrón caracterizado por que:
-el punto focal del dendrón es la cadena anclante de fórmula -Si-(CH2)b-R1-(CH2)a- donde: el dendrón está unido al núcleo por el átomo de Si, a es un número entero que varía entre 1 a 10, preferiblemente entre 1 y 5; y b y R1 están definidos en la 20 reivindicación 1; y
-la capa externa del dendrón consiste en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula (I):
Figure imgf000014_0001
donde: R2es un grupo alquilo (C1-C4), preferiblemente R2es un grupo metilo;
25 p es un número entero y varía entre 1 y 3, preferiblemente p es 2;
R3es el siguiente grupo -(CH2)c-S-(CH2)d-R4; c representa un número entero que varía de 2 a 5; preferiblemente c es 2 ó 3; d representa un número entero que varía de 1 a 10; preferiblemente d varía entre 1 y 5; y
30 R4es un grupo -NR’R” o un grupo -NR’R”R”’, donde R’, R” y R’”, representan de manera independiente un grupo alquilo (C1-C4) o un hidrógeno.
3. Nanopartícula magnética según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la molécula dendrítica es un dendrímero caracterizado por que:
- la capa externa del dendrímero consiste en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula (II)
Figure imgf000015_0001
donde: R2es un grupo alquilo (C1-C4), preferiblemente R2es un grupo metilo; p es un número entero y varía entre 1 y 3, preferiblemente p es 2;
R5es el grupo -(CH2)c-S-(CH2)d-R6; c representa un número entero que varía de 2 a 5; preferiblemente c es 2 ó 3; d representa un número entero que varía de 1 a 10; preferiblemente d varía entre
1 y 5;
R6 es un grupo -NR’R” o un grupo -NR’R”R”’, donde R’, R” y R”\ representan de manera independiente un grupo alquilo (C1-C4) o un hidrógeno, con la condición que al menos un grupo R6de la capa externa del dendrímero consiste en la cadena anclante de fórmula -Si-(CH2)b-R1-(CH2)a- donde el dendrímero está unido al núcleo por el átomo de Si, a es 0; y b y R1 están definidos en la reivindicación 1.
4. Nanopartícula magnética según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, cuyo núcleo tiene una disposición de sus átomos de forma esférica, cilindrica o de prisma, con al menos una dimensión entre 1 y 1000 nm.
5. Nanopartícula magnética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde p es 2 y/o R2es un grupo metilo.
6. Nanopartícula magnética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde c es 2 ó 3 y/o d es 2.
7. Nanopartícula magnética según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R1 es un grupo urea.
8. Nanopartículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R4o R6son un grupo -NR’R”R”’.
9. Nanopartículas magnéticas según la reivindicación anterior, donde R4o R6son -NMe3+.
10. Nanopartícula magnética según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde dicha nanopartícula está en forma de sal.
11. Procedimiento de obtención de las nanopartículas mágneticas descritas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende una reacción entre los grupos hidroxilos de la superficie de las nanopartículas de FesCU, y grupos trialcoxosililos de la cadena anclante de la molécula dendrítica.
12. Uso de las nanopartículas magnéticas descritas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, como agente para concentrar y/o eliminar bacterias, hongos o amebas de un medio que las contenga. 13. Uso no terapéutico de las nanopartículas magnéticas descritas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, como biocida.
14. Uso de las nanopartículas magnéticas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, como agente para concentrar ácidos nucleicos de un medio que los contenga.
15. Uso de las nanopartículas magnéticas descritas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, como agente para eliminar ácidos nucleicos de un medio que los contenga.
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