WO2021104787A1 - Dispositif et procédé d'exposition de cellules à un aérosol - Google Patents

Dispositif et procédé d'exposition de cellules à un aérosol Download PDF

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WO2021104787A1
WO2021104787A1 PCT/EP2020/080282 EP2020080282W WO2021104787A1 WO 2021104787 A1 WO2021104787 A1 WO 2021104787A1 EP 2020080282 W EP2020080282 W EP 2020080282W WO 2021104787 A1 WO2021104787 A1 WO 2021104787A1
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WO
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atmosphere
exposure
study
duct
culture
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PCT/EP2020/080282
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Sophie MARIA
Hélène Lalo
Charly Pairaud
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Ingesciences
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/18—Heat exchange systems, e.g. heat jackets or outer envelopes
    • C12M41/24—Heat exchange systems, e.g. heat jackets or outer envelopes inside the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity

Definitions

  • TITLE DEVICE AND METHOD FOR EXPOSING CELLS TO A
  • the invention relates to a device and method for exposing cell cultures to an atmosphere such as an aerosol for toxicological studies.
  • Cellular exposure devices to a gas or an aerosol have been proposed to study in vitro the toxic or therapeutic effects associated with the inhalation of substances through the respiratory tract.
  • To reproduce the characteristics of lung tissue cell cultures are adhered to a permeable support maintained in liquid culture medium, so as to reproduce the air / liquid interface of lung cells. Exposure of cells is achieved by diluting a test substance in a gas, vapor, or aerosol.
  • This atmosphere to be studied is then injected into a cell exposure device comprising an atmosphere inlet connected to a network of conduits supplying a plurality of cell culture chambers.
  • the different cell samples thus receive the same atmosphere injected into the device, and these samples are then used to measure a cellular response to the atmosphere tested.
  • Vitrocell Systems GmbH and Cultex Laboratories GmbH market these devices.
  • the American patent application No. US 2018/0171280 A1 discloses a cell exposure device comprising an aerosol discharge upper part comprising an aerosol inlet dividing into a network of vertical conduits adapting to a plurality of exposure chambers of a cell culture plate.
  • this document suggests creating a temperature gradient in the ducts to ensure the deposition on the cells of all of the aerosol pushed through the ducts.
  • the aim of the present invention is to provide a cellular exposure device making it possible to approximate the natural conditions of exposure of lung tissue to an atmosphere such as an aerosol or a gas.
  • a second aim of the invention is to study the toxicological or therapeutic effect of an atmosphere as a function of a time of exposure of a cell culture to said atmosphere, as well as to observe its effects on cell cultures. medium and long term.
  • the invention provides a device for cell exposure to an atmosphere comprising an upper study atmosphere discharge part and a lower part comprising a cell culture plate provided with a plurality of exposure chambers, said upper part being supplied by a study atmosphere and comprising a network of conduits conveying said atmosphere to the exposure chambers, characterized in that:
  • the upper part has at least one pair of conduits, an inlet conduit and an atmosphere outlet conduit connected to a deposit nozzle,
  • said nozzle is connected in a sealed manner to one of the exposure chambers of the lower part, and comprises a partition separating an atmosphere inlet sub-duct from an atmosphere outlet sub-duct of said exposure chamber, and wherein an atmosphere injected to said exposure chamber is discharged through the outlet sub-duct of the deposition nozzle by suction, in a controlled time and by creating a passing flow of atmosphere.
  • the device of the invention makes it possible to control the exposure time of cultures to an atmosphere by programming the evacuation of the atmosphere from the culture chamber. A passing flow of atmosphere is also created on the surface of cell cultures to mimic the process of the respiratory cycle.
  • the entry of atmosphere is controlled by opening a solenoid valve connected to the inlet conduit, and the discharge of atmosphere from the exposure chamber is controlled by a proportional solenoid valve connected. to the outlet duct.
  • a solenoid valve connected to the inlet conduit
  • a proportional solenoid valve connected to the outlet duct.
  • the upper discharge portion may include all or some of the following features:
  • the at least one pair of atmosphere inlet and outlet conduits is connected to a plurality of deposition nozzles, and preferably to three deposition nozzles;
  • the inlet duct comprises successive outlets for supplying a plurality of nozzles, and an internal structure gradually reducing an internal section of the inlet duct as a flow of atmosphere is divided into its interior to supply said successive outlets .
  • At least one pair of the atmosphere inlet and outlet ducts is arranged in a horizontal axis, and is connected to S at least one deposition nozzle by means of an inlet pipe and a outlet pipe arranged in a substantially vertical axis, said pipes being optionally connected, respectively, to the deposition nozzle by a fitting.
  • the device comprises a plurality of pairs of aerosol inlet and outlet conduits, each inlet conduit allowing independent power supply of a study atmosphere.
  • the exposure device comprises an incubator in which are integrated the upper atmosphere discharge part and the lower part, said incubator comprising:
  • This embodiment makes it possible to continue culturing cells following their temporary exposure to a specific study atmosphere (such as an aerosol) in a controlled environment, i.e. in a configurable culture atmosphere, and without the need for additional manipulations that could stress or contaminate cells.
  • a specific study atmosphere such as an aerosol
  • the incubator also includes:
  • -a robotic arm comprising interchangeable gripping tools and allowing to manipulate the culture plates of the lower cell exposure part
  • a culture step in which samples of cells are cultured in a cell culture plate comprising a plurality of exposure chambers, each exposure chamber being provided with a well comprising liquid culture medium and a sample cells supported by an insert, said insert being introduced into the well so that the cells are located at the air / liquid interface;
  • an exposure step in which a study atmosphere is injected into the plurality of exposure chambers by means of an atmosphere discharge device comprising nozzles sealingly connecting to the plurality of exposure chambers , and in which a passing flow study atmosphere is created on the cells by a concomitant exit from said injected study atmosphere.
  • the method of the invention may include all or some of the following characteristics:
  • a time of exposure of cells to said study atmosphere is controlled by an output rate of the study atmosphere injected into the exposure chamber.
  • the atmosphere discharge device is disconnected from the exposure chambers and a post-exposure culture step is carried out.
  • FIG. 1 A simplified front perspective view of the upper atmosphere discharge portion and the lower portion of the device of the invention according to one embodiment.
  • FIG. 2 A simplified side perspective view of the upper atmosphere discharge portion and the lower portion of the device of the invention according to one embodiment.
  • FIG. 3 A schematic view of an example of the internal structure of an inlet duct.
  • FIG. 4 A schematic view of a longitudinal section of a deposition nozzle and insert, exploded, according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 5 A schematic view of a longitudinal section of a deposition nozzle inserted into an insert according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 6 A perspective view of a deposition nozzle according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 7 A schematic example of an incubator according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 8 A schematic example showing the inside of the incubator.
  • FIG. 9 A diagram of the steps in the process of the invention.
  • the present invention provides an exposure device making it possible to control the exposure time of cells to a study atmosphere, as well as reproducing the natural conditions of exposure of lung cells during inhalation of an atmosphere such as a gas or a vapor.
  • the device of the invention makes it possible to study the effects of the controlled passage of an atmosphere on cell tissues cultured at the liquid / air interface.
  • atmosphere is meant a gas mixture (i.e. air) having a specific chemical composition and which may include liquid or solid particles in suspension.
  • the study atmosphere is, for example, an aerosol, vapor, smoke, gas or a suspension of particles in the air.
  • the exposure device of the invention has an upper atmosphere discharge portion and a lower cell culture portion having a plurality of exposure chambers.
  • the upper part of the device is fed by an atmosphere and comprises a network of conduits conveying said atmosphere to the exposure chambers.
  • the device of the invention has the following configuration:
  • the upper part has at least one pair of ducts, an inlet duct and an atmosphere outlet duct connected to a deposit nozzle;
  • the deposition nozzle connects in a sealed manner to one of the exposure chambers of the lower part, and comprises a partition separating an atmosphere inlet sub-duct from an atmosphere outlet sub-duct .
  • this configuration allows the atmosphere to be evacuated through the outlet sub-duct of the suction deposition nozzle, in a controlled time.
  • the injection of the atmosphere and its evacuation by suction can be adjusted so as to create a flow of passage of atmosphere on the inserts of the cell cultures present in the exposure chambers.
  • This flow of passage prevents the atmosphere from stagnating on cells, so as to mimic the natural conditions of inhaling air or vapor on a person's lung tissue.
  • the device helps prevent condensation of droplets on cell cultures.
  • a pair of conduits comprising an atmosphere inlet conduit and an atmosphere outlet conduit is understood, within the meaning of the present invention as a pair of inlet conduits. and exit of atmosphere.
  • injection is used to describe the introduction of an atmosphere into the inlet duct, and into the exposure chamber, regardless of the mechanism or method used to effect said introduction.
  • the atmosphere inlet pipe and the atmosphere outlet pipe are provided, respectively, with a solenoid valve opening or closing the access and the outlet of the atmosphere. 'atmosphere.
  • the outlet duct is provided with a proportional solenoid valve making it possible to adjust the flow rate of the atmosphere passing through.
  • the exposure time of the cells can thus be easily controlled by programming the opening and closing of the solenoid valves, and in particular the degree of opening of the proportional solenoid valve connected to the outlet duct.
  • the proportional solenoid valve of the outlet duct when an atmosphere is injected into the exposure chamber, is in a partially open configuration to avoid a pressure differential that can take off the cells during the evacuation of the cell. the atmosphere injected into the exposure chamber.
  • FIGS 1 and 2 illustrate schematically and in a simplified manner an embodiment of the upper part 100 for discharging atmosphere and the lower part 200 for cell culture.
  • the lower culture part comprises a support 210 adapted to receive a cell culture plate comprising a plurality of wells for cultivating individual samples of cells on membrane inserts for cell culture adapted to said wells.
  • the inserts are, for example, inserts available commercially and marketed under the registered trademark Corning Transwell R comprising a polyethylene terephthalate (PET) membrane.
  • PET polyethylene terephthalate
  • the upper part 100 comprises three pairs of inlet 120 and outlet 130 atmosphere conduits, each pair of conduits being connected to one or more deposit nozzles 150 by means of pipes 141 and a connector 145.
  • each inlet duct is arranged in a horizontal axis and supplies three deposition nozzles with the same atmosphere.
  • the inlet duct 120 is provided with an internal structure 121 gradually reducing the internal section of the duct to supply the three nozzles with the same pressure.
  • FIG. 3 shows an exemplary embodiment of the internal structure 121 in which an internal diameter of the duct gradually decreases in the direction of arrival of the flow of atmosphere and forms three segments, each supplying an outlet S1, S2, S3 of atmosphere. connected to a deposit nozzle.
  • a segment of pipe of constant section is left before supplying an outlet.
  • the deposition nozzles 150 are supported by a movable base 110 of the upper part superimposing said nozzles on the wells of the cell culture plate of the lower part 200.
  • the deposition nozzles 150 are positioned on the cell culture wells, forming a sealed connection between the tube-inserts of the wells and said nozzles. This sealed connection is for example ensured by means of an O-ring.
  • the movable base 110 comprises two plates 111, 11 T horizontal, parallel and provided with orifices 115 for positioning and receiving the deposition nozzles.
  • the nozzles deposition are illustrated in the process of insertion and in FIG. 2 the nozzles 150 are illustrated inserted into their orifices 115 for positioning.
  • the device of the invention is very advantageous in that it makes it possible to use commercially available cell culture plates and to adapt the dimensions and the number of exposure chambers of the device according to a type of culture plate. desired cell phone.
  • the device is compatible with an 18-well culture plate, and includes 9 deposition nozzles so as to leave one control cell culture well for each cell culture well exposed to an aerosol.
  • Figure 4 shows a schematic view of a longitudinal section of the deposition nozzle and an insert.
  • the deposition nozzle 150 has a general "Y" structure having in an upper part an inlet port 152, and an outlet port 153 for connecting said deposition nozzle to the inlet 120 and outlet 130 conduits respectively.
  • An internal septum 155 of the nozzle divides an inlet flow of atmosphere, descending over a cell culture insert 250, from an exhaust flow of atmosphere ascending through said deposition nozzle 150.
  • the deposition nozzle is connected to the inlet pipe and to the outlet pipe by means of deposition pipes and fittings 145.
  • the deposition nozzle is designed as a pipe having an internal partition and being connected directly to the aerosol inlet and outlet duct.
  • the deposition nozzle comprises a cylindrical lower part comprising a lower groove 159 for receiving an O-ring, and a collar 151 making it possible to block the insertion of the nozzle with an upper part of the nozzle. insert 250.
  • nozzle collar 151 locks against an upper ring 259 of insert 250 shown in Figure 5.
  • the collar 151 has a hexagonal profile making it possible to immobilize the deposition nozzle against an internal wall of the ring 259 of the insert 250.
  • the invention proposes to introduce the deposition nozzle 150 into the insert 250 to position it as close as possible to the cells cultured at the bottom of the insert (Fig. 5).
  • a lower end of the deposition nozzle is located 7 mm ⁇ 1 mm from the cells when the nozzle is inserted into the insert.
  • the dimensions of the cylindrical part of the deposition nozzle are therefore adapted to the dimensions of the insert in order to allow this positioning.
  • a second object of the invention is to provide an exposure device allowing prolonged culture of cell cultures under controlled conditions following their exposure to a study atmosphere.
  • the cell exposure device comprises an incubator (Fig. 7) in which the upper atmosphere discharge part and the lower cell culture part are integrated.
  • the incubator 300 makes it possible to control atmospheric conditions in which cells are cultured following their exposure to a study atmosphere such as an aerosol generated by the vaporization of an electronic cigarette liquid, smoke, etc.
  • the device incubator includes:
  • - means for controlling and adjusting the parameters of a culture atmosphere prevailing inside said incubator, such as relative humidity, air composition, and temperature.
  • At least one airlock 310 for entering and / or leaving equipment and reagents making it possible to maintain the atmospheric conditions configured during the entry and exit of said elements.
  • the device of the invention makes it possible to maintain the cells under controlled conditions for a total duration of exposure and of the desired cell culture.
  • the risks of microbial contamination and of cellular stress associated with the handling of cultures following their exposure to an atmosphere are advantageously reduced.
  • the culture chambers will be exposed to the study atmosphere injected through the upper part of the device. Once the exposure is complete, the top is disconnected and the exposure chambers are in direct contact with the controlled culture atmosphere inside the incubator.
  • part of the exposure chambers are not connected by deposition nozzles during the step of exposure to the study atmosphere, these “control” exposure chambers are therefore in direct and constant contact with the culture atmosphere prevailing inside the incubator. Thanks to these controls, the effect of the culture atmosphere on the response of the cells can be advantageously taken into account.
  • the culture atmosphere can be configured to best resemble an atmosphere in the lungs with 100% relative humidity, 5% CO2, and 37 ° C temperature.
  • Figure 7 shows a schematic view of the incubator 300 of the device of the invention.
  • the upper discharge part 100 and the lower cell exposure part 200 are integrated in a sealed enclosure supported by feet 312 and comprising a lateral airlock 310 for the entry and exit of material, in particular the plates of. cell culture, in se rts and culture medium.
  • a front wall of the enclosure is advantageously made of a transparent material making it possible to observe the interior of the enclosure and also comprises a pair of gloves making it possible to carry out manipulations inside the enclosure without losing the atmosphere confined to its interior.
  • FIG. 8 illustrates in a very simplified manner the interior of the enclosure of the incubator.
  • the interior of the enclosure is configured to receive two lower parts 200, 200 'of cell culture and two upper atmosphere discharge parts (pipes 141 not visible).
  • each lower part 200, 200 'of cell culture is installed on a heating block 340 and between a pair of vertical rails 315 serving to support the part.
  • an elevator 350 and a motor provide automated movement of the upper part.
  • the enclosure of the incubator also includes sealed inlets (not shown) to supply an atmosphere to the aerosol inlet conduits 120 of the device, as well as to evacuate the atmosphere from the outlet conduits 130.
  • enclosure can also be fitted with one or more electrical outlets, temperature, pressure and / or humidity sensors, lamps, air filters, additional doors allowing entry of bulky materials or equipment , etc.
  • the roof of the enclosure follows an inclined plane so as to promote the flow of condensation inside the enclosure and to collect and discharge this water by means of a water collection channel.
  • the cell exposure device includes a robotic arm 320 within the enclosure of the incubator.
  • This arm automates the preparation of culture plates and features interchangeable gripping tools for handling culture plates, placing in se rts in wells, and adding culture medium.
  • the robotic arm uses plate carriers 321 to move heat blocks and culture plates.
  • the invention also relates to a method of studying the effects of exposure of cell cultures to an aerosol.
  • the method 20 of the invention comprises the following steps shown diagrammatically in Figure 9:
  • a culture step 21 in which samples of cells are cultivated in a cell culture plate comprising a plurality of exposure chambers, each exposure chamber being provided with a well comprising liquid culture medium and a sample of cells supported by an insert, said insert being introduced into said well so that the cells are located at the liquid / air interface;
  • an exposure step 22 in which an aerosol is injected into the plurality of exposure chambers by means of an aerosol discharge device comprising nozzles sealingly connecting to said plurality of exposure chambers, and in which an aerosol passage flow is created on the cells by a concomitant exit of said injected aerosol.
  • the method of the invention is advantageous in that it proposes to expose the cells to a passing flow of aerosol approximating the natural conditions of inhalation / exhalation.
  • the method of the invention is particular in that it proposes to expose only part of the plurality of exposure chambers present in a single culture plate. Exposure chambers, or unexposed wells, can be used as controls. Advantageously, these controls will have followed a manipulation almost identical to the exposed samples, thus improving the precision of the results and facilitating the organization of the tests.
  • the method of the invention proposes to control the exposure time of the cells by configuring an output rate of the atmosphere injected into the exposure chambers.
  • a third post-exposure culture step 23 is then carried out for a given time t, and at the end of which the cell culture samples will be studied to assess their response to the study atmosphere.
  • the method of the invention proposes to carry out all the steps of culture 21, exposure 22, and post-exposure culture 23 in a single confined environment and in which the parameters of a culture atmosphere such as temperature, relative humidity and air composition. Carrying out all three steps in a single environment or location minimizes handling of cells and prolongs their life capacity, as well as observing the effect of the culture atmosphere.
  • the device and method of the invention are particularly useful in studies of the toxicology of electronic cigarette liquids.
  • a vaping robot is connected to the device of the invention, supplying with a single vapor, or different vapors, the atmosphere inlet conduits of the device.
  • the device is also compatible with a smoking robot, and other steam or gas generating devices, as well as devices allowing the injection of an atmosphere of particles suspended in the air (nebulizer type).

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Abstract

La présente invention concerne un dispositif d'exposition permettant de maîtriser le temps d'exposition des cellules à une atmosphère d'étude, tel qu'un aérosol ou un gaz. En particulier, l'invention propose un dispositif d'exposition cellulaire à une atmosphère comportant une partie supérieure (100) de décharge d'atmosphère d'étude et une partie inférieure (200) comportant une plaque de culture cellulaire pourvue d'une pluralité de chambres d'exposition, ladite partie supérieure (100) étant alimentée par une atmosphère d'étude et comportant un réseau de conduits acheminant ladite atmosphère aux chambres d'exposition, caractérisé en ce que : - la partie supérieure (100) comporte au moins une paire de conduits, un conduit d'entrée (120) et un conduit de sortie (130) d'atmosphère reliés à une buse (150) de dépôt, - ladite buse (150) se connecte de manière étanche à l'une des chambres d'exposition de la partie inférieure (200), et comporte une cloison (155) séparant un sous-conduit d'entrée (154) d'atmosphère d'un sous-conduit de sortie (156) d'atmosphère de ladite chambre d'exposition, et dans lequel une atmosphère d'étude injectée à ladite chambre d'exposition est évacuée à travers le sous-conduit de sortie (156) de la buse de dépôt (155) par aspiration, dans un temps contrôlé, et en créant un flux de passage d'atmosphère. L'invention concerne également un procédé d'étude des effets de l'exposition de cultures cellulaires à une atmosphère.

Description

TITRE : DISPOSITIF ET PROCÉDÉ D’EXPOSITION DE CELLULES A UN
AÉROSOL
DOMAINE DE L’INVENTION L’invention porte sur un dispositif et procédé d’exposition de cultures cellulaires à une atmosphère tel qu’un aérosol pour des études toxicologiques.
ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE
Des dispositifs d’exposition cellulaire à un gaz ou à un aérosol ont été proposés pour étudier in vitro les effets toxiques ou thérapeutiques liés à l’inhalation de substances par voie respiratoire. Pour reproduire les caractéristiques du tissu pulmonaire, des cultures cellulaires sont adhérées sur un support perméable maintenu dans du milieu de culture liquide, de sorte à reproduire l’interface air/liquide des cellules pulmonaires. L’exposition des cellules est réalisée en diluant une substance à tester dans un gaz, un vapeur, ou un aérosol. Cette atmosphère à étudier est ensuite injectée dans un dispositif d’exposition cellulaire comportant une entrée d’atmosphère reliée à un réseau de conduits alimentant une pluralité de chambres de culture cellulaire.
Les différents échantillons de cellules reçoivent ainsi une même atmosphère injectée dans le dispositif, et ces échantillons sont ensuite utilisés pour mesurer une réponse cellulaire à l’atmosphère testée. Par exemple, Vitrocell Systems GmbH et Cultex Laboratories GmbH commercialisent ces dispositifs.
L’optimisation des dispositifs d’exposition cellulaire a souvent été centrée sur le perfectionnement de la sédimentation de l’atmosphère injectée sur les cellules. L’intérêt étant d’associer une dose exacte de substance étudiée aux effets mesurés, ainsi que d’améliorer la reproductivité des essais.
Par exemple, la demande de brevet américaine No. US 2018/0171280 A1 divulgue un dispositif d’exposition cellulaire comportant une partie supérieure de décharge d’aérosol comportant une entrée d’aérosol se divisant dans un réseau de conduits verticaux s’adaptant à une pluralité de chambres d’exposition d’une plaque de culture cellulaire. En particulier, ce document suggère de créer un gradient de température dans les conduits pour assurer le dépôt sur les cellules de la totalité de l’aérosol poussé au travers des conduits.
La demande internationale No. WO2013/155513A1 propose de perfectionner la sédimentation d’un aérosol sur des cultures cellulaires en rapprochant au maximum des cellules un nébuliseur pour générer l’aérosol.
L’inconvénient de ces dispositifs réside dans le fait qu’ils ne reproduisent les conditions naturelles d’inhalation des poumons, notamment du fait que l’atmosphère injectée stagne sur les cellules. Au contraire, le processus respiratoire conditionne un flux de passage d’une atmosphère inhalée sur la surface des tissus pulmonaires.
D’autre part, ces dispositifs ont été conçus pour étudier les effets d’une exposition dans un temps relativement court après cette exposition. Ces études ne sont donc pas représentatives des effets à moyen et à long terme de l’inhalation d’une atmosphère, voire de l’inhalation répétée d’une atmosphère.
EXPOSÉ DE L’INVENTION
Le but de la présente invention est de proposer un dispositif d’exposition cellulaire permettant de se rapprocher des conditions naturelles d’exposition des tissus pulmonaires à une atmosphère tel qu’un aérosol ou un gaz.
Un deuxième but de l’invention est d’étudier l’effet toxicologique ou thérapeutique d’une atmosphère en fonction d’un temps d’exposition d’une culture cellulaire à ladite atmosphère, ainsi que d’observer ses effets sur des cultures cellulaires à moyenne et à longue durée.
À cette fin, l’invention propose un dispositif d’exposition cellulaire à une atmosphère comportant une partie supérieure de décharge d’atmosphère d’étude et une partie inférieure comportant une plaque de culture cellulaire pourvue d’une pluralité de chambres d’exposition, ladite partie supérieure étant alimentée par une atmosphère d’étude et comportant un réseau de conduits acheminant ladite atmosphère aux chambres d’exposition, caractérisé en ce que :
-la partie supérieure comporte au moins une paire de conduits, un conduit d’entrée et un conduit de sortie d’atmosphère reliés à une buse de dépôt,
-ladite buse se connecte de manière étanche à l’une des chambres d’exposition de la partie inférieure, et comporte une cloison séparant un sous- conduit d’entrée d’atmosphère d’un sous-conduit de sortie d’atmosphère de ladite chambre d’exposition, et dans lequel une atmosphère injectée à ladite chambre d’exposition est évacuée à travers le sous-conduit de sortie de la buse de dépôt par aspiration, dans un temps contrôlé et en créant un flux de passage d’atmosphère.
Le dispositif de l’invention permet de contrôler le temps d’exposition des cultures à une atmosphère en programmant l’évacuation de l’atmosphère de la chambre de culture. Il est également créé un flux de passage d’atmosphère sur la surface des cultures cellulaires pour mimétiser le processus du cycle respiratoire.
Dans un mode de réalisation, l’entrée de l’atmosphère est contrôlée par l’ouverture d’une électrovanne reliée au conduit d’entrée, et l’évacuation d’atmosphère de la chambre d’exposition est contrôlée par une électrovanne proportionnelle reliée au conduit de sortie. Avantageusement, lorsqu’une atmosphère est injectée à la chambre d’exposition l’électrovanne proportionnelle du conduit de sortie est dans une configuration partiellement ouverte, prévenant ainsi un changement de pression interne pouvant décoller les cellules lorsque l’électrovanne est ouverte dans un degré assurant l’évacuation de l’atmosphère.
Le principe de fonctionnement de la partie supérieure de décharge d’atmosphère peut être adapté de nombreuses manières pour délivrer une atmosphère tel qu’un aérosol à une pluralité de chambres d’exposition de la plaque de culture cellulaire. Dans des modes de réalisation préférés, la partie supérieure de décharge peut comporter toutes ou partie des caractéristiques suivantes :
- l’au moins une paire de conduits d’entrée et de sortie d’atmosphère est reliée à une pluralité de buses de dépôt, et de préférence à trois buses de dépôt ; - le conduit d’entrée comporte des sorties successives pour alimenter une pluralité de buses, et une structure interne réduisant graduellement une section interne du conduit d’entrée à mesure qu’un flux d’atmosphère est divisé en son intérieur pour alimenter lesdites sorties successives.
- S’au moins une paire des conduits d’entrée et de sortie d’atmosphère est disposée dans un axe horizontal, et est reliée à S’au moins une buse de dépôt au moyen d’un tuyau d’entrée et d’un tuyau de sortie disposés dans un axe sensiblement vertical, lesdits tuyaux étant optionnellement reliés, respectivement, à la buse de dépôt par un raccord.
- le dispositif comporte une pluralité de paires de conduits d’entrée et de sortie d’aérosol, chaque conduit d’entrée permettant une alimentation indépendante d’une atmosphère d’étude.
Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif d’exposition comporte un incubateur dans lequel sont intégrées la partie supérieure de décharge d’atmosphère et la partie inférieure, ledit incubateur comportant :
- des moyens de contrôle et de réglage d’une atmosphère de culture régnant à l’intérieur dudit incubateur ;
- au moins un sas d’entrée et/ou de sortie de matériel et de réactifs.
Ce mode de réalisation permet de continuer la culture de cellules suite à leur exposition temporaire à une atmosphère d’étude spécifique (tel qu’un aérosol) dans un environnement contrôlé, c'est-à-dire dans une atmosphère de culture configurable, et sans nécessité de manipulations supplémentaires pouvant stresser ou contaminer les cellules.
De préférence, l’incubateur comporte également :
-des moyens de guidage et de mouvement de la partie supérieure pour la connecter et la déconnecter de la partie inférieure ;
-un bras robotique comportant des outils de préhension interchangeables et permettant de manipuler les plaques de culture de la partie inférieure d’exposition cellulaire ;
-une paroi avant permettant une visibilité de l’intérieur de l’incubateur et comportant une paire de gants reliés de manière étanche.
L’invention concerne également un procédé d’étude des effets de l’exposition de cultures cellulaires à une atmosphère comportant les étapes suivantes :
-une étape de culture dans laquelle des échantillons de cellules sont cultivés dans une plaque de culture cellulaire comportant une pluralité de chambres d’exposition, chaque chambre d’exposition étant pourvue d’un puits comportant du milieu de culture liquide et d’un échantillon de cellules soutenu par un insert, ledit insert s’introduisant dans le puits de manière à que les cellules soient situées à l’interface air/liquide ;
- une étape d’exposition dans laquelle une atmosphère d’étude est injectée dans la pluralité des chambres d’exposition au moyen d’un dispositif de décharge d’atmosphère comportant des buses se connectant de manière étanche à la pluralité des chambres d’exposition, et dans laquelle un flux de passage d’atmosphère d’étude est créé sur les cellules par une sortie concomitante de ladite atmosphère d’étude injecté.
Dans des modes de réalisation préférés, le procédé de l’invention peut comporter toutes ou partie des caractéristiques suivantes :
- lors de l’étape d’exposition, uniquement une partie des chambres d’exposition est connectée et exposée par les buses de dépôt à l’atmosphère d’étude, et une partie des chambres d’exposition non exposées est utilisée comme témoin (contrôle) pour l’étude.
- lors de l’étape d’exposition, un temps d’exposition de cellules à ladite atmosphère d’étude est contrôlé par un débit de sortie de l’atmosphère d’étude injectée à la chambre d’exposition.
- à la fin de l’étape d’exposition le dispositif de décharge d’atmosphère est déconnecté des chambres d’exposition et l’on réalise une étape de culture post exposition.
- les étapes de culture, d’exposition et de culture post-exposition sont réalisées dans un seul environnement confiné et dans lequel l’on configure des paramètres d’une atmosphère de culture tels qu’une température, une humidité relative et une composition d’air. Le fait de réaliser les trois étapes dans un environnement ou endroit unique permet en outre d’observer l’effet de l’atmosphère de culture sur les cultures cellulaires. Notamment, lorsqu’une partie des chambres d’exposition désignée comme témoin (contrôle) est uniquement exposée à ladite atmosphère de culture, et pas à l’atmosphère d’étude. Ce mode de réalisation permet également de prolonger la durée de vie de cultures cellulaires.
PRÉSENTATION DES FIGURES
D’autres avantages, buts et caractéristiques particulières de la présente invention ressortiront de la description qui va suivre faite, dans un but explicatif et nullement limitatif, en regard des dessins annexés.
[Fig. 1] Une vue simplifiée d’une perspective avant de la partie supérieure de décharge d’atmosphère et de la partie inférieure du dispositif de l’invention selon un mode de réalisation.
[Fig. 2] Une vue simplifiée d’une perspective latérale de la partie supérieure de décharge d’atmosphère et de la partie inférieure du dispositif de l’invention selon un mode de réalisation.
[Fig. 3] Une vue schématique d’un exemple de structure interne d’un conduit d’entrée.
[Fig. 4] Une vue schématique d’une section longitudinale d’une buse de dépôt et d’un insert, éclatés, selon un mode de réalisation de l’invention.
[Fig. 5] Une vue schématique d’une section longitudinale d’une buse de dépôt insérée dans un insert selon un mode de réalisation de l’invention.
[Fig. 6] Une vue en perspective d’une buse de dépôt selon un mode de réalisation de l’invention.
[Fig. 7] Un exemple schématique d’un incubateur selon un mode de réalisation de l’invention. [Fig. 8] Un exemple schématique montrant l’intérieur de l’incubateur.
[Fig. 9] Un diagramme des étapes du procédé de l’invention.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE MODES DE RÉALISATION DE L’INVENTION
La présente invention propose un dispositif d’exposition permettant de maîtriser le temps d’exposition des cellules à une atmosphère d’étude, ainsi que reproduisant les conditions naturelles d’exposition de cellules pulmonaires lors de l’inhalation d’une atmosphère telle qu’un gaz ou qu’un vapeur. En particulier, le dispositif de l’invention permet d’étudier les effets du passage contrôlé d’une atmosphère sur des tissus cellulaires cultivés à l’interface liquide/air.
Par atmosphère on entend un mélange gazeux (i. e. de l’air) comportant une composition chimique spécifique et pouvant comporter des particules liquides ou solides en suspension. L’atmosphère d’étude est par exemple un aérosol, de la vapeur, de la fumée, un gaz ou une suspension de particules dans l’air.
Le dispositif d’exposition de l’invention comporte une partie supérieure de décharge d’atmosphère et une partie inférieure de culture cellulaire comportant une pluralité de chambres d’exposition. La partie supérieure du dispositif est alimentée par une atmosphère et comporte un réseau de conduits acheminant ladite atmosphère aux chambres d’exposition. En particulier, le dispositif de l’invention comporte la configuration suivante :
- La partie supérieure comporte au moins une paire de conduits, un conduit d’entrée et un conduit de sortie d’atmosphère reliés à une buse de dépôt ;
-La buse de dépôt se connecte de manière étanche à l’une des chambres d’exposition de la partie inférieure, et comporte une cloison séparant un sous- conduit d’entrée d’atmosphère d’un sous-conduit de sortie d’atmosphère.
Lorsqu’une atmosphère d’étude est injectée à ladite chambre d’exposition, cette configuration permet d’évacuer l’atmosphère à travers le sous-conduit de sortie de la buse de dépôt par aspiration, dans un temps contrôlé.
Avantageusement, l’injection de l’atmosphère et son évacuation par aspiration peuvent être réglées de manière à créer un flux de passage d’atmosphère sur des inserts des cultures cellulaires présentes dans les chambres d’exposition. Ce flux de passage empêche que l’atmosphère stagne sur les cellules, de sorte à imiter les conditions naturelles d’inhalation d’air ou d’un vapeur sur les tissus pulmonaires d’une personne. Par exemple, lorsque l’atmosphère est un aérosol, le dispositif permet de prévenir la condensation de gouttelettes sur les cultures cellulaires.
Par ailleurs, pour faciliter la description de l’invention, une paire de conduits comportant un conduit d’entrée d’atmosphère et un conduit de sortie d’atmosphère est entendue, au sens de la présente invention comme une paire de conduits d’entrée et de sortie d’atmosphère. Le terme injection est utilisé pour décrire l’introduction d’une atmosphère dans le conduit d’entrée, et à la chambre d’exposition, indépendamment du mécanisme ou de la méthode utilisés pour effectuer ladite introduction. Pour contrôler l’injection et l’évacuation de l’atmosphère, le conduit d’entrée d’atmosphère et le conduit de sortie d’atmosphère sont pourvus, respectivement, d’une électrovanne ouvrant ou fermant l’accès et la sortie de l’atmosphère. En particulier, le conduit de sortie est pourvu d’une électrovanne proportionnelle permettant d’ajuster le débit du flux de passage d’atmosphère.
Le temps d’exposition des cellules peut être ainsi aisément contrôlé en programmant l’ouverture et la fermeture des électrovannes, et notamment le degré d’ouverture de l’électrovanne proportionnelle relié au conduit de sortie.
Dans un mode de réalisation préféré, lorsqu’une atmosphère est injectée à la chambre d’exposition, l’électrovanne proportionnelle du conduit de sortie est dans une configuration partiellement ouverte pour éviter un différentiel de pression pouvant décoller les cellules lors de l’évacuation de l’atmosphère injectée à la chambre d’exposition.
Les figures 1 et 2 illustrent de manière schématique et simplifiée un mode de réalisation de la partie supérieure 100 de décharge d’atmosphère et la partie inférieure 200 de culture cellulaire. La partie inférieure de culture comporte un support 210 apte à recevoir une plaque de culture cellulaire comportant une pluralité de puits pour cultiver des échantillons individuels de cellules sur des in se rts à membrane pour culture cellulaire s’adaptant audits puits. Les in se rts sont par exemple des inserts disponibles dans le commerce et commercialisés sous la marque enregistrée Corning TranswellR comportant une membrane de polyéthylène téréphtalate (PET).
Comme illustré, la partie supérieure 100 comporte trois paires de conduits d’entrée 120 et de sortie 130 d’atmosphère, chaque paire de conduits étant relié à une ou plusieurs buses 150 de dépôt au moyen des tuyaux 141 et d’un raccord 145. Dans un mode de réalisation préféré, chaque conduit d’entrée est disposé dans un axe horizontal et alimente avec la même atmosphère trois buses de dépôt.
Avantageusement, le conduit d’entrée 120 est pourvu d’une structure 121 interne diminuant graduellement la section interne du conduit pour alimenter les trois buses avec la même pression.
La figure 3 montre un exemple de réalisation de la structure 121 interne dans lequel un diamètre interne du conduit diminue graduellement dans le sens d’arrivée du flux d’atmosphère et forme trois segments, chacun alimentant une sortie S1 , S2, S3 d’atmosphère reliée à une buse de dépôt. De préférence, un segment de conduit à section constante est laissé avant d’alimenter une sortie.
En particulier, les buses 150 de dépôt sont supportées par une base mobile 110 de la partie supérieure superposant lesdites buses aux puits de la plaque de culture cellulaire de la partie inférieure 200. Les buses 150 de dépôt sont positionnées sur les puits de culture cellulaire, formant une connexion étanche entre les tube-inserts des puits et lesdites buses. Cette connexion étanche est par exemple assurée au moyen d’un joint torique.
Dans le mode de réalisation illustré aux figures 1 et 2, la base mobile 110 comporte deux plaques 111 , 11 T horizontales, parallèles et pourvues des orifices 115 de positionnement et de réception des buses de dépôt. Sur la figure 1 , les buses de dépôt sont illustrées en voie d’insertion et sur la figure 2 les buses 150 sont illustrées insérées dans leurs orifices 115 de positionnement.
Le dispositif de l’invention est très avantageux en ce qu’il permet d’utiliser des plaques de cultures cellulaires disponibles dans le commerce et d’adapter les dimensions et le nombre de chambres d’exposition du dispositif suivant un type de plaque de culture cellulaire souhaitée.
Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif est compatible avec une plaque de culture de 18 puits, et comporte 9 buses de dépôt de manière à laisser un puits de culture cellulaire témoin pour chaque puits de culture cellulaire exposé à un aérosol.
La figure 4 illustre une vue schématique d’une section longitudinale de la buse de dépôt et d’un insert. La buse 150 de dépôt comporte une structure générale en « Y » présentant dans une partie supérieure un port d’entrée 152, et un port de sortie 153 pour relier ladite buse de dépôt aux conduits d’entrée 120 et de sortie 130 respectivement. Une cloison 155 interne de la buse permet de diviser un flux d’entrée d’atmosphère, descendant sur un insert 250 de culture cellulaire, d’un flux d’évacuation d’atmosphère ascendant par ladite buse 150 de dépôt. Suivant ce mode de réalisation, la buse de dépôt est reliée au conduit d’entrée et au conduit de sortie au moyen de tuyaux de dépôt et de raccords 145.
Néanmoins, plusieurs modes de réalisation peuvent être envisagés pour relier la buse 150 de dépôt et les conduits d’entrée 120 et de sortie 130 d’aérosol sans que cela sorte du cadre de l’invention. A titre d’exemple, la buse de dépôt est réalisée comme un tuyau comportant une cloison interne et étant relié directement au conduit d’entrée et de sortie d’aérosol.
Dans le mode de réalisation illustré aux figures 4 à 6, la buse de dépôt comporte une partie inférieure cylindrique comportant une gorge 159 inférieure pour recevoir un joint torique, et un collet 151 permettant de bloquer l’insertion de la buse avec une partie supérieure de l’insert 250. Par exemple, le collet 151 de la buse se bloque contre un anneau 259 supérieur de l’insert 250 illustré à la figure 5.
Avantageusement, le collet 151 comporte un profil hexagonal permettant d’immobiliser la buse de dépôt contre une paroi interne de l’anneau 259 de l’insert 250.
L’invention propose d’introduire la buse 150 de dépôt dans l’insert 250 pour la positionner au plus près des cellules cultivées au fond de l’insert (Fig. 5). De préférence, une extrémité inférieure de la buse de dépôt est située à 7 mm ± 1 mm des cellules lorsque la buse est insérée dans l’insert. Les dimensions de la partie cylindrique de la buse de dépôt sont donc adaptées aux dimensions de l’insert afin de permettre ce positionnement.
Un deuxième but de l’invention et de fournir un dispositif d’exposition permettant une culture prolongée des cultures cellulaires dans des conditions contrôlées suite à leur exposition à une atmosphère d’étude.
À cette fin, le dispositif d’exposition cellulaire comporte un incubateur (Fig. 7) dans lequel sont intégrées la partie supérieure de décharge d’atmosphère et la partie inférieure de culture cellulaire. L’incubateur 300 permet de contrôler les conditions atmosphériques dans lesquelles sont cultivées les cellules suite à leur exposition à une atmosphère d’étude telle qu’un aérosol généré par la vaporisation d’un liquide de cigarette électronique, une fumée etc.
L’incubateur du dispositif comporte :
- des moyens de contrôle et de réglage des paramètres d’une atmosphère de culture régnant à l’intérieur dudit incubateur tels que l’humidité relative, la composition de l’air, et la température.
- au moins un sas 310 d’entrée et/ou de sortie de matériel et de réactifs permettant de maintenir les conditions atmosphériques configurées lors de l’entrée et la sortie desdits éléments.
Le dispositif de l’invention permet de maintenir les cellules dans des conditions contrôlées pendant une durée totale d’exposition et de culture cellulaire souhaitée. Ainsi, les risques de contamination microbienne et de stress cellulaire liés à la manipulation des cultures suite à leur exposition à une atmosphère sont avantageusement réduits. Bien entendu, lors de la phase d’exposition, les chambres de cultures seront exposées à l’atmosphère d’étude injectée au moyen de la partie supérieure du dispositif. Une fois l’exposition terminée, la partie supérieure est déconnectée et les chambres d’exposition sont en contact direct de l’atmosphère de culture contrôlée régnant à l’intérieur de l’incubateur.
Dans un mode de réalisation préféré, une partie des chambres d’exposition n’est pas connectée par des buses de dépôt lors de l’étape d’exposition à l’atmosphère d’étude, ces chambres d’exposition « témoin » sont donc en contact direct et constant avec l’atmosphère de culture régnant à l’intérieur de l’incubateur. Grâce à ces témoins, il peut être avantageusement pris en compte l’effet de l’atmosphère de culture sur la réponse des cellules.
À titre d’exemple, l’atmosphère de culture peut être configurée pour ressembler au mieux à une atmosphère dans les poumons avec 100% d’humidité relative, 5 % de CO2, et 37°C de température.
La figure 7 représente une vue schématique de l’incubateur 300 du dispositif de l’invention. En particulier, la partie supérieure de décharge 100 et la partie inférieure 200 d’exposition cellulaire sont intégrées dans une enceinte étanche supportée par des pieds 312 et comportant un sas 310 latéral pour l’entrée et pour la sortie de matériel, notamment des plaques de culture cellulaire, des in se rts et du milieu de culture.
Une paroi avant de l’enceinte est avantageusement réalisée dans un matériau transparent permettant d’observer l’intérieur de l’enceinte et comporte également une paire de gants permettant d’effectuer des manipulations à l’intérieur de l’enceinte sans perdre l’atmosphère confinée en son intérieur.
La figure 8 illustre de manière très simplifiée l’intérieur de l’enceinte de l’incubateur. Dans ce mode de réalisation, l’intérieur de l’enceinte est configuré pour recevoir deux parties inférieures 200, 200‘ de culture cellulaire et deux parties supérieures de décharge d’atmosphère (tuyaux 141 non visibles). En particulier, chaque partie inférieure 200, 200’ de culture cellulaire est installée sur un bloc chauffant 340 et entre une paire de rails 315 verticaux servant de support à la partie supérieure de décharge d’aérosol et guidant son mouvement descendant et ascendant sur la partie inférieure. De préférence, un ascenseur 350 et un moteur assurent un mouvement automatisé de la partie supérieure.
Bien entendu, l’enceinte de l’incubateur comporte également des entrées étanches (non illustrées) pour alimenter une atmosphère aux conduits d’entrée 120 d’aérosol du dispositif, ainsi que pour évacuer l’atmosphère des conduits de sortie 130. L’enceinte peut également être pourvue d’une ou plusieurs prises électriques, des capteurs de température, de pression et/ou d’humidité, des lampes, des filtres d’air, des portes supplémentaires permettant l’entrée de matériaux ou d’équipement volumineux, etc. De préférence, le toit de l’enceinte suit un plan incliné de sorte à promouvoir l’écoulement de la condensation à l’intérieur de l’enceinte et de récupérer et évacuer cette eau au moyen d’une rigole de récupération d’eau.
Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif d’exposition cellulaire comporte un bras robotique 320 à l’intérieur de l’enceinte de l’incubateur. Ce bras permet d’automatiser la préparation des plaques de culture et comporte des outils de préhension interchangeables permettant de manipuler les plaques de culture, de placer les in se rts dans les puits, et de rajouter le milieu de culture. Par exemple, le bras robotique utilise des porte plaques 321 pour déplacer les blocs chauffants et les plaques de culture.
L’invention concerne également un procédé d’étude des effets de l’exposition de cultures cellulaires à un aérosol. En particulier, le procédé 20 de l’invention comporte les étapes suivantes schématisées sur la figure 9 :
-une étape de culture 21 dans laquelle des échantillons de cellules sont cultivés dans une plaque de culture cellulaire comportant une pluralité de chambres d’exposition, chaque chambre d’exposition étant pourvue d’un puits comportant du milieu de culture liquide et d’un échantillon de cellules soutenu par un insert, ledit insert s’introduisant dans ledit puits de manière à que les cellules soient situées à l’interface liquide/air ;
- une étape d’exposition 22 dans laquelle un aérosol est injecté dans la pluralité des chambres d’exposition au moyen d’un dispositif de décharge d’aérosol comportant des buses se connectant de manière étanche à ladite pluralité des chambres d’exposition, et dans laquelle un flux de passage d’aérosol est créé sur les cellules par une sortie concomitante dudit aérosol injecté.
De même manière que le dispositif de l’invention, le procédé de l’invention est avantageux en ce qu’il propose d’exposer les cellules à un flux de passage d’aérosol se rapprochant des conditions naturelles d’inhalation/expiration.
D’autre part, le procédé de l’invention est particulier en ce qu’il propose d’exposer uniquement une partie de la pluralité des chambres d’exposition présentes dans une seule plaque de culture. Les chambres d’exposition, ou puits non exposés, peuvent être utilisées comme des témoins. Avantageusement, ces témoins auront suivi une manipulation quasi-identique aux échantillons exposés, améliorant ainsi la précision de résultats et facilitant l’organisation des essais. Le procédé de l’invention propose de contrôler le temps d’exposition des cellules en configurant un débit de sortie de l’atmosphère injectée aux chambres d’exposition.
Une troisième étape de culture post-exposition 23 est ensuite effectuée pour un temps t donné, et à la fin de laquelle les échantillons de cultures cellulaires seront étudiés pour évaluer leur réponse à l’atmosphère d’étude. En particulier, le procédé de l’invention propose de réaliser l’ensemble des étapes de culture 21 , d’exposition 22, et de culture post-exposition 23 dans un seul environnement confiné et dans lequel l’on configure des paramètres d’une atmosphère de culture tels qu’une température, une humidité relative et une composition d’air. Le fait de réaliser les trois étapes dans un environnement ou endroit unique permet de limiter au maximum la manipulation des cellules et de prolonger leur capacité de vie, ainsi que d’observer l’effet de l’atmosphère de culture.
Ces trois étapes peuvent être réalisées au moyen du dispositif d’exposition de l’invention comportant un incubateur dans lequel sont intégrées la partie supérieure de décharge d’atmosphère et la partie inférieure de culture cellulaire.
Le dispositif et procédé de l’invention sont particulièrement utiles dans les études de toxicologie de liquides pour cigarette électronique. Dans ce mode de mise en oeuvre de l’invention, un robot vapoteur est relié au dispositif de l’invention, alimentant avec une seule vapeur, ou différentes vapeurs, les conduits d’entrée d’atmosphère du dispositif. Bien entendu, le dispositif est également compatible avec un robot fumeur, et d’autres dispositifs générateurs de vapeur ou de gaz, ainsi que des dispositifs permettant l’injection d’une atmosphère des particules suspendues dans l’air (type nébulisateur).

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif d’exposition cellulaire à une atmosphère comportant une partie supérieure (100) de décharge d’atmosphère d’étude et une partie inférieure (200) comportant une plaque de culture cellulaire pourvue d’une pluralité de chambres d’exposition, ladite partie supérieure (100) étant alimentée par une atmosphère d’étude et comportant un réseau de conduits acheminant ladite atmosphère aux chambres d’exposition, caractérisé en ce que :
-la partie supérieure (100) comporte au moins une paire de conduits, un conduit d’entrée (120) et un conduit de sortie (130) d’atmosphère reliés à une buse (150) de dépôt,
-ladite buse (150) se connecte de manière étanche à l’une des chambres d’exposition de la partie inférieure (200), et comporte une cloison (155) séparant un sous-conduit d’entrée (154) d’atmosphère d’un sous-conduit de sortie (156) d’atmosphère de ladite chambre d’exposition, et dans lequel une atmosphère d’étude injectée à ladite chambre d’exposition est évacuée à travers le sous-conduit de sortie (156) de la buse de dépôt (150) par aspiration, dans un temps contrôlé, et en créant un flux de passage d’atmosphère.
2. Dispositif d’exposition cellulaire selon la revendication 1 , dans lequel : -l’entrée ou injection de l’aérosol est contrôlé par l’ouverture d’une électrovanne reliée au conduit d’entrée (120) ;
-l’évacuation d’aérosol de la chambre d’exposition est contrôlée par une électrovanne proportionnelle reliée au conduit de sortie (130), et lorsqu’une atmosphère est injectée à la chambre d’exposition l’électrovanne proportionnelle du conduit de sortie (130) est dans une configuration partiellement ouverte.
3. Dispositif d’exposition cellulaire selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’au moins une paire des conduits d’entrée (120) et de sortie (130) d’atmosphère est disposée dans un axe horizontal, et est reliée à l’au moins une buse (150) de dépôt au moyen d’un tuyau d’entrée et d’un tuyau de sortie disposés dans un axe sensiblement vertical.
4. Dispositif d’exposition cellulaire suivant l’une des revendications précédentes, dans lequel l’au moins une paire de conduits d’entrée (120) et de sortie (130) d’atmosphère est reliée à une pluralité de buses (150) de dépôt, et de préférence à trois buses de dépôt, et dans lequel le conduit d’entrée (120) comporte :
- des sorties (Si,S2, Sa) successives pour alimenter ladite pluralité de buses (155), et
- une structure interne (121 ) réduisant graduellement une section interne dudit conduit d’entrée (120) à mesure qu’un flux d’atmosphère se divise en son intérieur pour alimenter lesdites sorties (Si,S2, S3) successives.
5. Dispositif d’exposition cellulaire selon l’une des revendications précédentes, dans lequel le dispositif comporte une pluralité de paires de conduits d’entrée (120) et de sortie d’aérosol (130), chaque conduit d’entrée (120) permettant une alimentation indépendante d’une atmosphère d’étude.
6. Dispositif d’exposition cellulaire suivant l’une des revendications précédentes, comportant un incubateur (300) dans lequel sont intégrées la partie supérieure (100) de décharge d’atmosphère et la partie inférieure (200), ledit incubateur (300) comportant :
- des moyens de contrôle et de réglage d’une atmosphère de culture régnant à l’intérieur dudit incubateur ;
- au moins un sas (310) d’entrée et/ou de sortie de matériel et de réactifs.
7. Dispositif d’exposition cellulaire suivant la revendication 6, dans lequel l’incubateur (300) comporte en son intérieur :
-des moyens de guidage (315) et de mouvement de la partie supérieure (100) pour la connecter et la déconnecter de la partie inférieure (200), et/ou
-un bras (320) robotique comportant des outils de préhension interchangeables et permettant de manipuler les plaques de culture de la partie inférieure, et/ou
-une paroi avant permettant une visibilité de l’intérieur de l’incubateur (300) et comportant une paire de gants reliés (330) de manière étanche.
8. Procédé (20) d’étude des effets de l’exposition de cultures cellulaires à une atmosphère au moyen du dispositif d’exposition suivant l’une des revendications 1 à 7, ledit procédé comportant une étape de culture (21 ) dans laquelle des échantillons de cellules sont cultivés dans une plaque de culture cellulaire comportant une pluralité de chambres d’exposition, chaque chambre d’exposition étant pourvue d’un puits comportant du milieu de culture liquide et d’un échantillon de cellules soutenu par un insert, ledit insert s’introduisant dans ledit puits de manière à que les cellules soient situées à l’interface air/liquide, ledit procédé étant caractéristique en ce que l’on réalise :
- une étape d’exposition (22) dans laquelle une atmosphère d’étude est injectée dans la pluralité des chambres d’exposition au moyen d’un dispositif de décharge d’atmosphère comportant des buses se connectant de manière étanche à ladite pluralité des chambres d’exposition, et dans laquelle un flux de passage d’atmosphère d’étude est créé sur les cellules par une sortie concomitante de ladite atmosphère d’étude injectée.
9. Procédé d’étude suivant la revendication 8, dans lequel lors de l’étape d’exposition (22), uniquement une partie des chambres d’exposition est connectée et exposée par les buses de dépôt à l’atmosphère d’étude, et une partie des chambres d’exposition non exposées est utilisée comme témoin pour l’étude.
10. Procédé suivant l’une des revendications 8 ou 9, dans lequel lors de l’étape d’exposition (22), un temps d’exposition de cellules à ladite atmosphère d’étude est contrôlé par un débit de sortie de l’atmosphère d’étude injectée à la chambre d’exposition.
11. Procédé suivant l’une des revendications 8 à 10, dans lequel à la fin de l’étape d’exposition le dispositif de décharge d’atmosphère est déconnecté des chambres d’exposition et l’on réalise une étape de culture post-exposition (23), et les étapes de culture (21), d’exposition (22) et de culture post-exposition (23) sont réalisées dans un seul environnement confiné et dans lequel l’on configure des paramètres d’une atmosphère de culture tels qu’une température, une humidité relative et une composition d’air.
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