WO2021104571A1 - Mit biologischen zellen besiedeltes 3d-gerüst aus biokompatiblem polymer und dessen herstellung - Google Patents

Mit biologischen zellen besiedeltes 3d-gerüst aus biokompatiblem polymer und dessen herstellung Download PDF

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WO2021104571A1
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photopolymerizable
biological cells
cells
photocrosslinkable
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Alexander Thomas
Tobias Lam
Lutz KLOKE
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Cellbricks Gmbh
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    • C12N2537/10—Cross-linking

Definitions

  • 3D scaffold made of biocompatible polymer and its production, colonized with biological cells
  • the present invention relates to a 3D framework made of biocompatible polymer and populated with biological cells, in which the biological cells can be cultivated to form a 3D cell culture construct which comes very close to a physiological architecture. Furthermore, the present invention also relates to a method for producing the 3D framework populated with biological cells.
  • Spheroids are tight packs of cells with a round shape. They lack any physiological form. If the user also wants to work with several cell types in parallel in one object, he has no choice but to form a spheroid from the desired cell types. Here, however, the shape of the spheroid is undirected and leads to a random distribution of the cells in the spheroid. The cells cannot be positioned discretely from one another through this process. This random distribution reduces the informative value of the models if, for example, tests with viruses, bacteria or substances such as pharmaceuticals are to be carried out on them. Since no physiological architecture is achieved, z. B. hardly any direct conclusions can be drawn about the in wVo behavior in the body.
  • ECM extracellular matrix
  • the interaction between the ECM and the cell also has a significant influence on the biology of the cell. It is important for the cell to find an environment that corresponds to its usual, physiological niche. If this is not the case, it can quickly lead to dedifferentiation, death or simply stasis of the cell. Furthermore, the ECM must be in the physical parameters such as stiffness or porosity are similar to those in wVo conditions. Lastly, the shape itself is a crucial factor. The shape of a physiological environment also has an impact on function. So z. B. a vascularization can be ensured if a supply of larger tissue is to be ensured. If a tissue cannot be adequately supplied due to a lack of vascularization, it threatens to die off or lose its function.
  • the method according to the invention offers the possibility of creating complex biological cell architectures.
  • the method described here is intended in particular for a user who does not have access to lithographic 3D printing or bioprinting.
  • EP 3 018 531 A1 describes a 3-D printing method that allows multiple bioinks or cell types to be used in parallel in a printing process.
  • this technology is used to generate the objects described herein in a first step, which can then be colonized with biological cells by a user in a second step.
  • the method described in EP 3 018 531 A1 forms the production basis for the cell framework.
  • the object of the present invention is to produce a 3D framework colonized with biological cells, with which a high similarity to a physiological architecture can be achieved, so that on these tissues, for example Tests with bacteria, viruses or active substances can be carried out.
  • a method for producing the 3D framework populated with biological cells is also to be provided.
  • the object according to the invention is achieved with a method for producing a 3D framework populated with biological cells from biocompatible polymer according to main claim 1 and according to the 3D framework populated with biological cells Main claim 10 solved.
  • Preferred embodiments are specified in subclaims 2 to 9, 11 and 12.
  • the present invention relates to a method for producing a 3D framework populated with biological cells from biocompatible polymer, the 3D framework having an at least partially covered cavity.
  • the method according to the invention is divided into the following two steps:
  • 3D framework made of biocompatible polymer using a lithographic 3D printing process offers the possibility of printing a biocompatible polymer in a physiological form so that the material and architecture resemble the structure to be imitated in the human body. Since, according to the invention, the biological cells can only then be introduced into the 3D framework for colonization, it is possible to build up a 3D cell culture construct of any cell type.
  • the expression “made of biocompatible polymer” is preferably understood to mean that the 3D framework is built up by a matrix made of one or more biocompatible polymers. Although it cannot be ruled out that the 3-D framework has other components in addition to biocompatible polymers, it is also possible that the 3-D framework consists only of biocompatible polymer.
  • the construction of the 3D framework is carried out using a stereolithographic 3D printing process.
  • a stereolithographic 3D printing process is one in which the structure of the 3D framework is gradually produced by curing in layers.
  • the The 3D framework is set up in step (a) by the following step:
  • the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably in liquid form, for example dissolved in a solvent. In the following, this is referred to as a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • Step (i) is preferably repeated by focusing a further electromagnetic radiation in a further focal plane.
  • a further photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably used.
  • Photopolymerizable is to be understood here as meaning that the corresponding substance can be polymerized by the action of electromagnetic radiation and, if appropriate, the presence of a photoinitiator.
  • photocrosslinkable should be understood to mean that an oligomer or polymer can be crosslinked by the action of electromagnetic radiation and, if appropriate, the presence of a photoinitiator.
  • step (a) is divided into the following method steps:
  • the further focal plane in step (V) preferably differs from the first focal plane at least with regard to the already produced polymerized or crosslinked structure or with regard to the layer of this polymerized or crosslinked structure.
  • connection of the polymerized or crosslinked structures produced in step (VI) is preferably a connection by means of covalent bonds.
  • non-covalent bonds for example based on physical interactions, are also possible.
  • a layered structure of the 3D framework is achieved. It is possible to form the at least partially covered cavity in the 3D framework. Furthermore, undercuts and overhanging structures can be formed, since a polymerization or crosslinking of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can also take place in a specific focal plane or layer if there is no already polymerized or crosslinked material arranged underneath, but only not yet polymerized or non-crosslinked liquid.
  • One or more of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids used can contain biological cells. If the radiation of electromagnetic radiation leads to polymerization or crosslinking, the cells contained in the liquid are also embedded in a corresponding polymer. According to the invention, however, it is preferred that no biological cells are used in the lithographic 3D printing process.
  • complex biological 3D cell culture constructs can be generated as models in order, for example, to depict and examine cell-cell interactions, organ biogenesis, diseases or organ functions.
  • Such a 3D cell culture construct has clear advantages over the classic two-dimensional cell culture, especially when it comes to modeling the interaction of several cell types.
  • the complexity of cell-cell interactions, the function of a natural barrier and the modeling of diseases or organs cannot be adequately represented with classic two-dimensional cell cultures.
  • the method according to the invention enables miniaturized models to be created in a particularly simple manner. Such miniaturized models have so far been partially built by hand. The effort required for this is very high; Many years of experience are also required.
  • the method according to the invention enables a high level of reproducibility different copies of the same 3D cell culture construct can be guaranteed.
  • the use of a 3D framework also enables the targeted construction of a 3D cell culture.
  • the method according to the invention not only enables the production to be accelerated compared to other methods known from the prior art, but the 3D cell culture constructs generated also always have the same quality.
  • Such a high reproducibility is particularly advantageous in biotechnology. Because when analyzing and developing new pharmaceutical products, a test on three-dimensional cell cultures that always remain the same reduces development costs considerably. When such complex three-dimensional structures are built by hand, however, individual fluctuations are inevitable. However, this makes it practically impossible to obtain reproducible test results. In contrast, the method according to the invention provides 3D cell culture constructs which are excellently suited for generating reproducible test results.
  • microtiter plates for example microtiter plates with 6, 12, 24, 48, 96, 384 or 1536 wells
  • cell culture bottles or Petri dishes can be used as reaction vessels in the method according to the invention.
  • the 3D framework produced by means of the method according to the invention can be constructed from a homogeneous material and consequently comprise only one polymer of a single type.
  • the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and at least one of the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquids are different liquids.
  • different polymer structures can be realized within the 3D framework.
  • the at least partially covered cavity can be surrounded by a polymer structure that differs from the polymer structure of the outer framework of the 3D framework, for example to have a greater porosity that enables the biological cells to penetrate into the matrix of the 3D framework .
  • the at least partially covered cavity can also have columns, a grid or cross braces, on the one hand to support the roof of the cavity and on the other hand to allow the biological cells to adhere to the surface within the Allow cavity.
  • the properties of the polymer structure or of the various polymer structures within the 3D framework can be influenced by the choice of the monomers to be polymerized or the polymers to be crosslinked in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid (s). The smaller the molecular weight of the polymerizable or crosslinkable units, the smaller the interstices or pores of the resulting matrix of the 3D framework are as a rule. In the latter case, however, it also depends heavily on the number of crosslinkable units on the polymers and thus the degree of crosslinking.
  • a biocompatible polymer is understood to mean a biological or biologically compatible polymer. “Biologically compatible” is to be understood here as meaning that this does not affect the lifespan of the biological cells, in particular that it does not have a toxic effect on the biological cells.
  • the 3D framework is one that is transparent at least in the range of visible light. In this way, the colonization with biological cells can be optically followed and recorded.
  • the photopolymerizable or photocrosslinkable substance in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is preferably one which has a photoreactive group which can form covalent bonds with further photoreactive groups.
  • the photoreactive group is an acrylic group, by means of which the polymerization or crosslinking is brought about. That is, the photopolymerizable or photocrosslinkable substance is preferably an acrylic compound, for example one from the following group: methacrylates, methyl acrylates, ethyl acrylates,
  • the substance to be polymerized or crosslinked can be a polymer, an oligomer or a monomer. These are preferably carbon-based substances. In the case of the monomers, it is photopolymerized. In the case of polymers or oligomers, photocrosslinking is preferred.
  • acrylamides vinyl chloride, ethylene, propylene, isoprene, caprolactam, all amino acids, (de) oxyribonucleotides, glucose, or all monosaccharides and the aforementioned acrylates.
  • oligomers or polymers polyethylene glycol (PEG), polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyketone (PK), polyvinyl chloride (PVC), polystyrene (PS), polytetrafluoroethylene (PTFE), polymethyl methacrylate (PMMA), Polycarbonate (PC), polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU).
  • Synthetic polymers such as silicones, polydimethylsiloxane (PDMS) or resins such as melamine or melamine-formaldehyde resins are also suitable as starting substances.
  • Biopolymers such as proteins, DNA, RNA, carbohydrates and carbohydrate derivatives, collagens, fibrins, alginates, gelatine, hyaluronic acids or polylactides are also suitable as starting substances.
  • the monomer precursors or oligomer precursors of these polymers as starting substances, provided that they can be provided in a stable manner in the solid or liquid state of aggregation.
  • a photoreactive group for example an acrylic group
  • photopolymerizable PDMS is used as a matrix or as a covering substance, gas exchange between the cells embedded in this matrix is possible.
  • different coating substances or matrices can be used.
  • a stable plastic can be used for the rest of the matrix in order to create an object that is stable on the outside and inside which a Cell growth-enabling matrix with lower stability is present.
  • the starting substance supplemented by the photoreactive group is used in a liquid manner, with different viscosities being possible. That is, the method described here is not limited to photopolymerizable or photocrosslinkable liquids with a certain viscosity, but low-viscosity liquids can also be used. Both Newtonian and non-Newtonian liquids can be used.
  • the liquids can be solutions or colloid-disperse mixtures such as suspensions.
  • the liquids can have an aqueous to oily character. This is determined, among other things, by the choice of the starting substances and their particle size.
  • a radical generator (a so-called photoinitiator) is also used, which forms radicals at a selected wavelength of the electromagnetic radiation used in the process.
  • Suitable radical formers are, for example, anthrone derivatives such as violanthrone or isoviolanthrone, fluorescein, rubrene, anthrazine derivatives, tetrazene derivatives, benzanthrone, benzanthronil, eosin, levolinic acid derivatives, phosphine derivatives, mono- and bis-acyl phosphines, metallocenes, acetophenones, xanthones, Ketone derivatives, hydroxy ketones, amino ketones, benzoyl peroxides, pyridine salts, phenyl glyoxylates and / or iodonium salts.
  • anthrone derivatives such as violanthrone or isoviolanthrone, fluorescein, rubrene, anthrazine derivatives, tetrazene derivatives, benzanthrone, benzanthronil, eosin, levolinic acid
  • a vinyl macromer and an amine-based co-initiator are preferably used in order to allow the photopolymerization or photocrosslinking to proceed in a particularly suitable manner.
  • a co-initiator for example, ascorbic acid and tertiary amine derivatives, such as methyldiethanolamine or tetraethylamine, are suitable.
  • the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid has a thiol derivative.
  • Suitable thiol derivatives are dithiothreitol, monofunctional cysteines, bifunctional peptides and similar compounds.
  • a substance can be added to the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid which prevents photopolymerization or photocrosslinking of deeper, liquid layers.
  • liquid solution outside the focal plane remains liquid, even if it is in the irradiation area of the focal plane lying above it. This works by absorbing the substance at the wavelength at which the polymerisation takes place (polymerising wavelength). The interception takes place in the focal plane, so that no penetration of the polymerizing wavelength into deeper layers is possible. All substances that absorb in the desired wavelength, such as dyes, are suitable.
  • the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and / or one of the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquids and / or another liquid that does not have to be photopolymerizable have a temperature-sensitive gel former.
  • a temperature-sensitive gel former In particular, the use of an inverse temperature-sensitive (also referred to as reverse temperature-sensitive) gel former is provided. Such a gel former becomes firmer with increasing temperature.
  • the reaction liquid solidifies and initially only forms a metastable gel. If the liquid is not photopolymerized or photocrosslinked at the same time, the metastable gel can be liquefied again and pumped out by subsequent cooling of the 3D framework.
  • the temperature conditions to be used are exactly the opposite. If necessary, for example, a support structure can be created so that hanging structures can be created. If, on the other hand, the metastable gel is at least partially irradiated with electromagnetic radiation at a suitable wavelength, photopolymerization occurs, so that the metastable gel is converted into a stable gel or polymer in these areas.
  • the temperature-sensitive, in particular inverse-temperature-sensitive, gel former and temperature control of the reaction space make it even easier to work with hanging parts and undercuts or cavities.
  • you can continue to use liquid Structures are worked as a support.
  • the aforementioned individual components can be contained as individual substances in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • the substances or groups preferably used for gel formation in a single polymer by appropriate synthesis.
  • such a polymer would then have different functional groups which combine all of the functions required or preferably to be used for photopolymerization or photocrosslinking.
  • enzymes can also be used to digest the polymer.
  • the principle is as follows: A 3D framework with cavities / undercuts (e.g. a canal system) is printed as a solid body in that all cavities are filled with a sacrificial material during printing, which is later (i.e. after the printing is completed) by giving the correct enzyme can be resolved.
  • the sacrificial material is, for example, a digestible polymer that is digested by adding a digestive enzyme. This is an elegant strategy for creating voids with stereolithographic printing processes.
  • a hyaluronidase digesting enzyme
  • hyaluronic acid sacrificial material
  • a photo blocker in the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can be used, the photoblocker restricting the curing depth of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is only introduced into the reaction vessel when the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid previously in the reaction vessel (this can be, for example, the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid or another photopolymerizable or photocrosslinkable liquid) has been removed from the reaction vessel has been.
  • the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid previously in the reaction vessel this can be, for example, the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid or another photopolymerizable or photocrosslinkable liquid
  • two or more different pumps can also be used for such processes.
  • the 3D framework can be irradiated during or at the end of its manufacturing process in step (a) of the method according to the invention with electromagnetic radiation of a low wavelength (for example in the UV range, i.e. below 380 nm) in order to sterilize in this way to reach.
  • electromagnetic radiation of a low wavelength for example in the UV range, i.e. below 380 nm
  • Such UV sterilizations are known in principle.
  • a carrier plate or carrier structure is arranged in the reaction vessel, to which the first polymerized or crosslinked structure is bound.
  • the use of such a carrier plate is advisable when the 3D framework created is not to be examined later in the reaction vessel itself, but is to be removed from the reaction vessel.
  • screw connections (such as DIN screw connections) can be present in the carrier plate in order to enable a subsequent supply of the generated 3D framework with liquids and gases. It is also possible to introduce such screw connections into the matrix of the 3D framework within the scope of the manufacturing process, that is to say to generate these screw connections there in the matrix. The creation of such screw connections in the matrix can be carried out regardless of whether a carrier plate is used or not.
  • a carrier plate is, before the step of generating a first polymerized or crosslinked structure, by irradiating electromagnetic radiation into a focal plane which is contained within a photopolymerizable or photocrosslinkable liquid (in particular with the first or one of the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid) Filled area of the reaction vessel is generated by a polymerized or crosslinked support structure is formed, which has the support plate or is.
  • the support structure can have such a shape that a spacing is formed between the support plate and a bottom of the reaction vessel.
  • the focal planes of the actual polymerization or crosslinking reactions then have a greater distance from the bottom of the reaction vessel.
  • the first polymerized or crosslinked structure formed then has a greater distance from the bottom of the reaction vessel. Polymerizable or crosslinkable liquids that are no longer required can then be suctioned out of the reaction vessel particularly easily.
  • an optical system is arranged between a source for the electromagnetic radiation (radiation source), which is used to generate one and / or the other electromagnetic radiation, and the reaction vessel, which is used to focus the electromagnetic radiation on the respective focal plane in the reaction vessel serves.
  • this optical system can be refocused in order to change the focal plane within the reaction vessel.
  • Such a refocusing can be achieved, for example, by changing the distance between the optical system and the radiation source.
  • a computer-controlled stepper motor can be provided in order to convey a corresponding movement of the optical system.
  • the optical system can be, for example, a system of optical lenses or - in a case that is particularly simple in terms of construction - a single focusing lens.
  • a relative movement which can be brought about, for example, by moving the reaction vessel, by moving the carrier plate arranged in the reaction vessel, or by moving the radiation source, can also change the focal plane within the reaction vessel.
  • no refocusing of an optional optical system is consequently required. This can reduce the risk of optical misalignments.
  • the one and / or the further electromagnetic radiation is directed to a defined and predeterminable area in the respective focal plane within the one photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and / or the further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • a specific radiation pattern can be specified which strikes the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid and serves at these points to polymerize or crosslink the liquid to form a polymer or a gel (the matrix).
  • a radiation pattern can be generated, for example, through the use of masks or diaphragms, but also through the use of pulsed radiation or the digital modulation of a radiation signal.
  • Polymerization or crosslinking occurs in the areas of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid that are hit by the radiation. In the other areas not struck by the radiation, the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid remains in its unpolymerized or uncrosslinked state. As a result, the radiation defines the areas where printing of the polymerized or crosslinked structure takes place.
  • the resolution depends on the wavelength of the radiation used. Even with long wavelengths that are regularly used, it is better than the resolution that can be achieved with the conventional methods known from the prior art. The more precise the Radiation source can be focused, the greater the resulting resolution. For example, very high resolutions can be achieved with a laser.
  • the electromagnetic radiation can be directed to the respective focal plane via mirrors.
  • the irradiation pattern selected in each case can be provided by a computer program, for example. It is thus conceivable that a user creates the 3D framework to be produced by means of a CAD program. The digital object created in this way is then cut into individual irradiation planes by a suitable computer program. Furthermore, a specific photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is assigned to each level or to different locations of each level. Control information for a printer, by means of which the method described is carried out, is created for this information. This control information specifies when which photopolymerizable or photocrosslinkable liquid has to be introduced into the reaction vessel. This control information also specifies when which image of an irradiation plane is to be projected onto the respective focal plane in the reaction vessel. In this way, the 3D framework previously created on the computer can then be converted into a real 3D framework.
  • more than one polymerized or crosslinked structure is produced in the same layer (that is to say in the same focal plane).
  • a first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is first polymerized or crosslinked.
  • the first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is then removed from the reaction vessel and a second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is introduced into the reaction vessel.
  • a second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid is introduced into the reaction vessel.
  • the second photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can then be removed from the reaction vessel and another photopolymerizable or photocrosslinkable liquid are introduced into the reaction vessel.
  • the fill level of this further photopolymerizable or photocrosslinkable liquid can now be brought to a level such that the previously formed layer is completely covered.
  • the focal plane can then be shifted and a further layer of the 3D framework to be generated can be built up using a corresponding polymerized or networked structure.
  • individual layers of the generated 3D framework are homogeneous (comprising a polymerized or crosslinked structure of a single type) and other layers are heterogeneous (comprising polymerized or crosslinked structures of different types), whereby the number of individual structures per layer is not is limited.
  • heterogeneously composed layers with 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 polymerized or crosslinked structures have proven to be useful.
  • At least the first structure of the first layer is irradiated with the first radiation from two different directions.
  • these two different directions are preferably opposite to one another.
  • a particularly firm anchoring of the first layer on the inner surface of the reaction vessel or on a carrier plate which is arranged in the reaction vessel is achieved.
  • a later secure hold of the entire generated 3D framework on the reaction vessel or on a carrier plate in the reaction vessel is achieved, whereby subsequent examinations on the 3D framework can be facilitated.
  • the irradiation is typically carried out from above in a reaction vessel that is open at the top.
  • the first layer is then preferably additionally irradiated from below through the bottom of the reaction vessel.
  • the reaction vessel must be made of a material that is permeable to radiation with the selected wavelength.
  • the subsequent layers, which are arranged above the first layer, are then preferably exposed from only one direction (namely preferably from above) so that the polymerized or crosslinked structures already formed are not between the focal plane of the radiation and a radiation source used to emit the radiation and thus not from the radiation in front of its focal plane again be irradiated.
  • the first electromagnetic radiation and / or the further electromagnetic radiation have a wavelength in the range from 200 nm to 1000 nm (i.e. a wavelength that lies between the UV range and the infrared range), more preferably in the range of 350 nm and 800 nm.
  • the substances preferably used as radical formers can be excited particularly well, so that radicals are formed in order to enable polymerization or crosslinking of starting substances bearing acrylic residues.
  • wavelengths of the electromagnetic radiation used are in the range from 250 nm to 950 nm, in particular from 250 nm to 850 nm, in particular from 300 nm to 800 nm, in particular from 300 nm to 750 nm, in particular from 300 nm to 700 nm, in particular from 350 nm to 650 nm and especially from 350 nm to 400 nm.
  • the radiation used for the polymerization or crosslinking can comprise the same wavelength or different wavelengths from the aforementioned wavelength range in order to enable suitable polymerization of the different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids.
  • the individual radiations can be generated by different or by one and the same radiation source. It is also possible to use different wavelengths one after the other within a layer (and thus within a focal plane) in order to polymerize or crosslink different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids in the same layer, if a heterogeneous layer is to be formed from different polymerized or crosslinked structures.
  • the method is carried out in such a way that at least one functional element is introduced into the 3D framework while the 3D framework is being generated.
  • the functional element is selected from the group consisting of membranes, channels, pores, sensors, columns, grids, cross struts, or electrically conductive supports and chemotactic preparations. Channels and pores can be integrated into the object, for example, by defining certain areas of the formed polymerized or crosslinked structure can be left exposed in several layers one on top of the other.
  • Membranes can be formed by introducing lipid molecules into the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid.
  • salt bridges can also be introduced within the 3D framework with the help of photopolymerization or photocrosslinking. This is particularly easy if the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid contains salts, that is to say contains salts. In this way, electrical derivation and enervation of the printed 3D framework can then take place.
  • the 3D framework no longer needs to be manipulated afterwards, but can be read out directly via the sensors that have already been introduced.
  • the targeted growth / colonization of biological cells within the 3D framework can be made possible after its completion.
  • the chemotactic preparation is an attractant, it exerts a positive chemotaxis, so that the biological cells in the 3D framework will orient themselves towards areas of higher concentration of the attractant.
  • the chemotactic preparation is a deterrent, it exerts a negative chemotaxis, so that the biological cells in the 3D framework orient themselves to areas with a lower concentration of the deterrent or to areas in which the deterrent is not even present become. This enables targeted growth / colonization of cells within the 3D framework.
  • At least one level sensor is preferably used to measure the level of the liquid always clearly visible in the reaction vessel.
  • the focal plane can then be determined in which the next polymerization or crosslinking step is to be carried out.
  • the data provided by such a fill level sensor can also be used to automatically adapt the focal plane.
  • the data provided by a fill level sensor can also be used to control a pump which mediates the flow of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids into the reaction vessel. In this way, exactly such amount of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids can always be introduced into the reaction vessel as is required to build up the layer that is currently desired. This keeps the amount of waste low. Furthermore, an inexpensive implementation of the entire method is made possible as a result.
  • step (a) of the method according to the invention the step of 3D printing the 3D framework can be carried out in a completely automated manner, so that intervention by a user is not required. This additionally facilitates the application of the method.
  • the period of time during which the electromagnetic radiation is radiated onto the respective focal plane can be adapted to the respective requirements of the photopolymerizable or photocrosslinkable liquids used. This means that each material is allowed to cure in such a time that is necessary and meaningful for the desired polymerization or crosslinking.
  • a carrier is arranged within the reaction vessel, when this carrier is raised relative to the reaction vessel, a negative pressure can result between a surrounding liquid bed and the already polymerized or crosslinked structures on the carrier.
  • a potentially prevailing negative pressure can, however, be released.
  • the carrier can be moved relative to the reaction vessel without fear of tearing off the already polymerized or crosslinked structures of the 3D framework from the carrier must become.
  • this carrier plate can be lifted completely out of the remaining liquid in the reaction vessel at the end of the manufacturing process.
  • the 3D framework created can then be removed from the carrier plate by the user.
  • step (a) of the method according to the invention it is possible, for example, to use a 3D printing device as described in EP 3 018 531 A1.
  • a temperature-sensitive, in particular an inversely temperature-sensitive, substance By adding a temperature-sensitive, in particular an inversely temperature-sensitive, substance, the creation of hanging objects and cavities in the 3D framework can be additionally improved.
  • a substance such as a poloxamer can be added in such a concentration that the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid or a non-photopolymerizable or non-photocrosslinkable liquid gels even without irradiation in a desired temperature range.
  • the process can run as follows: If gelation is to be achieved at a temperature of approx. 20 ° C (to be referred to as "gelation temperature"), a poloxamer is added to the photopolymerizable or photocrosslinkable liquid in such a concentration that the liquid gelled in this area. Mixtures of several poloxamers are also possible. If possible, the liquid can first be cooled to a temperature below the gelation point. If a hanging structure within the object is desired, the liquid containing the temperature-sensitive gelling agent can be heated to a temperature which is above the gelling temperature. The liquid then gels. At the same time, the liquid can also be photopolymerized or photocrosslinked.
  • the temperature-sensitive liquid If an area of the temperature-sensitive liquid is not photopolymerized or photocrosslinked, it is solid at the increased temperature, but can be liquefied again at any time if the temperature drops below the gelation temperature. In this way, the temperature-sensitive, gelled part can function as a support structure until the end of the printing process. When you have finished pressing the Temperature can be reduced again below the above-mentioned exemplary gelation temperature of 20 ° C. As a result, the non-polymerized or non-crosslinked, temperature-sensitive part of the liquid liquefies again and can be pumped out. If the gel liquefies, the support structure is removed and the previously supported part of the printed object, which is now photopolymerized or photocrosslinked, hangs freely.
  • the 3D framework has a filling opening through which the at least partially covered cavity is accessible.
  • the filling opening is preferably arranged on the upper surface of the 3D framework, so that the cavity can be filled from above with a suspension (also called cell suspension) containing biological cells.
  • a suspension also called cell suspension
  • the cell suspension is filled through a filling opening on the 3D framework.
  • the filling opening can, for example, be in the form of a filler neck which, for example, enables a pipette to be positioned precisely to fill in the cell suspension.
  • the 3D framework has one or more outlet openings which are also spatially connected to the cavity in the interior of the 3D framework. If, for example, the cavity is filled with a solution before step (b), then this can escape via the outlet openings when the cell suspension is filled.
  • the outlet opening (s) is / are preferably arranged spatially below the filling opening, preferably as lateral outlets on the 3D framework.
  • the partially covered cavity can, however, also be arranged in the form of a vascular vessel, for example in order to supply a biological cell tissue to be arranged in a further cavity with a nutrient solution, such as blood.
  • the 3D framework is dried between step (a) and step (b).
  • the 3D framework is given a more durable and easily transportable shape.
  • the 3D framework can be stored in the refrigerator for at least six weeks, protected from light and moisture.
  • the 3D framework shrinks slightly and becomes harder. If stored wet, the 3D framework runs the risk of spoiling more quickly.
  • the drying / vitrification is preferably carried out in a sterile environment. Suitable drying temperatures are in the range from 4 ° C to 50 ° C, more preferably in the range of 15 ° C to 25 ° C.
  • the drying can be carried out, for example, in a drying cabinet, in a climatic chamber or the like.
  • All naturally occurring eukaryotic and prokaryotic cells come into consideration as biological cells which are used for the construction of the 3D framework populated with biological cells.
  • the cells used are preferably eukaryotic cells. All cells and cell types which occur in the body of a mammal, in particular a rodent and very particularly a human, are particularly suitable.
  • the biological cells used are omnipotent or pluripotent cells.
  • the invention relates only to the use of cells that can be obtained without destroying human embryos.
  • cells from non-naturally occurring cell lines can also be used as biological cells. Artificially generated cell lines of this kind enable the customized structure of the 3D cell culture construct to be produced.
  • suspension cells can be used as biological cells. With previous systems it was not possible to generate 3D cell culture constructs from suspension cells, as these do not grow together on their own. However, if there is a support structure, such as columns or a grid, in the cavity of the 3D framework, the 3D framework can be used to provide a cell culture construct from suspension cells, such as a lymph node, on which experiments can then be carried out.
  • suspension cells such as a lymph node
  • the method according to the invention enables a combination of different cell types to form a 3D cell culture construct, it is particularly suitable for the production of artificial organs.
  • artificial organs can be, for example, miniaturized model objects of a naturally occurring organ, in particular a naturally occurring organ of a person or an animal, such as a mammal or a rodent.
  • different photopolymerizable or photocrosslinkable liquids can be used, different types of gel in which the biological cells are embedded are also possible.
  • several 3D frameworks even with different shapes, can be created at the same time.
  • the 3D framework is rehydrated - provided it has been dried beforehand.
  • the 3D framework is preferably placed in water, a saline solution, a buffer, cell medium or a similar physiologically compatible liquid for a period of 60 s to 60 min. Ideally, this action takes place in a Petri dish or the like under sterile conditions. As a result, the framework regains its original size, strength and texture.
  • a suspension of biological cells also called cell suspension herein
  • a desired solvent is preferably mixed. All solutions compatible with cells can be used as solvents. This includes all aqueous solutions that ensure cell survival. Usually substances are used to set a neutral pH value (pH 7.4) and an isotonic environment in order to get close to the fluids in the human body (e.g. blood) with the solutions.
  • the concentration of the biological cells in the solvent is preferably in a range from 100,000 to 300,000,000 cells per milliliter.
  • the cell suspension is preferably introduced into the framework via the filling opening.
  • the total volume of the cell suspension to be filled in is at most as large as the volume of the cavity of the 3D framework.
  • the user can rinse the volume into the framework, for example with the aid of a pipette.
  • the 3D framework is already filled with a liquid when the cell suspension is poured in, which liquid can then flow out via optional outlet openings. In the ideal case, however, the framework is removed from the medium used for rehydration in order to fill in the cell suspension.
  • the liquid used to colonize the cavity preferably contains cell spheroids.
  • the liquid used preferably contains a gelling agent, which after Filling forms a stable hydrogel, whereby the incorporated cells or cell spheroids are immobilized.
  • enzymatically crosslinking gels eg fibrin
  • physically crosslinking gels eg collagens
  • photopolymerizable or photocrosslinkable liquids can be used.
  • the cavity is preferably colonized by inserting a tissue resection or a biopsy (so-called ex vivo culture).
  • tissue resection / biopsy can be glued in with a gel-forming liquid.
  • Possible columns, grids or cross struts in the cavity of the 3D framework can serve as an anchor or restraint for the biological cells when colonizing with biological cells, so that - in the case of adherent cells - they can adhere to the 3D framework, or - in the case of suspension cells -can be cultivated floating freely in the 3D framework.
  • the now cell-containing construct can be further cultivated.
  • a new 3D cell culture model can now develop.
  • the biological cells adhere to all available structures and to themselves, so that a 3D structure is created in the shape of the cavity of the 3D framework.
  • a controlled 3D cell culture model / construct is created.
  • the 3D framework is to be colonized with tumor cells, for example, a 3D tumor model is created.
  • the model is colonized with suspension cells such as T cells or B lymphocytes, a lymph node-like model or a diffuse B cell lymphoma is created.
  • the cavity or the pore volume of the matrix of the 3D framework is completely populated, the cells can leave the 3D framework, for example via the optional lateral channels. In this way, z. B. pinch off small spheroids from cells.
  • the step of culturing the biological cells after step (b) to form a 3D cell culture construct can also take place in the method according to the invention.
  • the cultivation conditions depend on the type of cells used. Those skilled in the field of biology are the ideal ones Cultivation conditions for various biological cells are usually known.
  • the culture conditions to be determined on the basis of the cell type are temperature, composition of the respective nutrient solution and procurement of the culture vessel.
  • the conditions for human blood vessel cells from the umbilical cord can be named here as an example: 37 ° C and 5% CO2, minimal medium with glucose, all essential amino acids, vitamins and minerals.
  • the culture is preferably located on Petri dishes or cell culture bottles that have been coated for tissue cultures (so-called tissue culture-treated surfaces). These culture conditions mentioned are favorable for numerous human cells. In the case of vascular cells, it is also necessary to use growth factors that are added to the minimal medium.
  • the 3D cell culture construct can then be penetrated with further cells, viruses, bacteria, enzymes or active substances in order to carry out tests on the construct.
  • the filling opening or the lateral channels can be used, but some substances or cells can also penetrate the material of the 3D framework in this way. In this way, for example, tumor cells can be attacked with Car-T cells.
  • the present invention also relates to a 3D framework colonized with biological cells, which can be obtained by the method according to the invention. All features and configurations which are mentioned herein in connection with the method according to the invention also apply - if possible - to the 3D framework according to the invention that is colonized with biological cells, and vice versa.
  • the present invention has the following advantages: So far, no frameworks with undercuts or complex architectures have been possible that can be populated by a user himself.
  • the 3D framework itself functions as a hollow body, which would not have been possible until now without multi-material stereolithography.
  • the complex architecture with which the behavior of the cells is influenced could not be represented in this way.
  • the production method according to the invention can ensure a high level of reproducibility and parallelism.
  • the 3D framework can be reproduced with millimeter precision.
  • the system allows for the first time the cultivation of suspension cells in one 3D construct, or the creation of vascular structures. The system does not have to be actively shaken, as is otherwise the case in a classic shaking culture. The cells remain alive in the scaffold.
  • the populated system can be cultivated over periods of several weeks so that it can be used as a substitute for animal experiments. Cultivation periods of several weeks have not been possible for some cell types up to now.
  • the behavior of the cells can be tracked online, since the system is preferably transparent to visible light. Continuous measurement using optical methods is guaranteed.
  • the structure is a novelty due to its shape, architecture, method of application and physical parameters.
  • the 3D framework which can be used according to the invention preferably has a flat shape, i.e. it is preferably larger in its horizontal dimensions than in the vertical dimension.
  • the 3D framework can have any base area, such as, for example, circular, oval, rectangular or square, the last two also with rounded corners.
  • the 3-D framework preferably extends prismatically in the vertical, i.e. the base area does not change significantly in the vertical direction.
  • the diameter is preferably in the range from 500 ⁇ m to 10 cm, but in particular the diameter is based on the size of corrugated plates, ie is preferably 6.8 mm (96-well), 10.4 mm (48-well), 16.2 mm (24-well) and 34.6 mm (6-well).
  • the height is preferably in the range from 500 ⁇ m to 10 cm. If the hollow body is a centrally arranged hollow body, its volume is preferably in the range from 10 pL to 50 mL. If the hollow body is designed in the form of a vascular vessel (channel), the diameter of the channel is preferably in the range from 1 ⁇ m to 5 cm.
  • Fig. 1 shows a view of an uninhabited 3D framework of a CAD file with a central roofed hollow body, a filling opening on the top and several lateral outlet openings.
  • Fig. 2 shows a photograph in plan view of a through 3D framework produced by lithographic 3D printing according to the CAD file of Fig.
  • FIG. 3 shows a photographic image in a top view of a 3-D framework according to FIG. 2 that is populated with tumor cells from a neuroblastoma.
  • FIG. 4 shows a view of an uninhabited 3D framework of a CAD file with a central, upwardly open depression and covered cavities in the form of vascular vessels with two filling openings on the top for the vascular vessels and two lateral outlet openings of the vascular vessels.
  • FIG. 5 shows a microscopic image of a printed model according to the CAD file according to FIG. 4 from below.
  • the 3D framework 1 shows a model of a 3D framework 1 created in a CAD file, which can be used according to the invention.
  • the 3D framework 1 preferably has a central, largely roofed cavity 2.
  • the cavity 2 is preferably accessible via a filler opening 3 designed as a filler neck.
  • the area above the cavity 2 is preferably supported with columns 5 within the cavity 2.
  • the 3-D framework 1 preferably has a plurality of lateral outlet openings 4 in the form of outlet channels.
  • FIG. 2 shows a photographic image of a 3D framework 1 which was produced with the aid of a lithographic 3D printing process on the basis of the CAD file according to FIG. 1.
  • the upper filler neck 3, the lateral channels 4 and the columns 5 in the cavity 2 can be clearly seen.
  • the 3D framework shown in FIG. 2 is produced by the following process steps:
  • the print platform is lowered to the first print level for the first photopolymerizable or photocrosslinkable liquid;
  • the 3D framework can be stored under sterile conditions.
  • volume cavity 9.9 mm 3 inner diameter filling opening: 1.6 mm
  • composition of the first photocrosslinkable liquid is composition of the first photocrosslinkable liquid
  • Photocrosslinkable substance gelatin methacrylate, 50 g / kg;
  • FIG. 3 shows a photographic image of a 3D framework 1 according to FIG. 2, which was colonized with tumor cells from a neuroblastoma. The following additional procedural steps are carried out for this purpose:
  • the suspension is distributed within the 3D framework and the cells can be cultivated within the 3D framework;
  • a cell suspension (solvent: DMEM high glucose + 10% FCS + 1% penicillin / streptomycin; cell concentration: 150 ⁇ 10 6 cells / L) is prepared. 6 pL mm of this suspension are pipetted into the cavity of the 3D framework via the filler neck. The construct is then cultivated at 37 ° C. and 5% CO2.
  • the 3D framework 1 has a central, upwardly open depression as a colonization area 5 for biological cells. Furthermore, it has upwardly closed, i.e. roofed, cavities 2 in the form of vascular vessels, which preferably extend in the horizontal plane around the central colonization area.
  • FIG. 5 shows an actually printed 3D framework 1 under the microscope from its underside. Filler neck 3, cavities 2 in the form of vascular vessels and colonization area 6 can be clearly seen.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer, in dem die biologischen Zellen zu einem 3D-Zellkulturkonstrukt kultiviert werden können, das einer physiologischen Architektur sehr nahe kommt. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung des mit biologischen Zellen besiedelten 3D-Gerüsts.

Description

Mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer und dessen Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer, in dem die biologischen Zellen zu einem 3D- Zellkulturkonstrukt kultiviert werden können, das einer physiologischen Architektur sehr nahe kommt. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung des mit biologischen Zellen besiedelten 3D-Gerüsts.
Bislang gibt es nur wenige Möglichkeiten, 3D-Zellkulturen in einer gerichteten Form herzustellen. Die einzigen Möglichkeiten sind bis jetzt die Herstellung von Sphäroiden oder mikrofluidischen Plattformen, oder der Guss eines Gels mit darin suspendierten Zellen. Dagegen besteht mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erstmals die Möglichkeit, biologische Zellen in speziellen dreidimensionalen Architekturen zu kultivieren, die einer physiologischen Architektur deutlich näher sind.
Sphäroide sind enge Packungen aus Zellen mit einer runden Form. Sie lassen jegliche physiologische Form vermissen. Möchte der Anwender darüber hinaus mit mehreren Zelltypen parallel in einem Objekt arbeiten, so bleibt ihm nichts weiter übrig, als ein Sphäroid aus den gewünschten Zelltypen zu formen. Hierbei ist die Form des Sphäroids jedoch ungerichtet und führt zu einer zufälligen Verteilung der Zellen im Sphäroid. Die Zellen können durch diesen Prozess also nicht diskret voneinander positioniert werden. Diese zufällige Verteilung verringert die Aussagekraft der Modelle, wenn daran beispielsweise Versuche mit Viren, Bakterien oder Substanzen wie Pharmazeutika durchgeführt werden sollen. Da keine physiologische Architektur erreicht wird, können z. B. auch kaum direkte Rückschlüsse auf das in wVo-Verhalten im Körper gezogen werden. Darüber hinaus fehlt ebenfalls die extrazelluläre Matrix (ECM) des Körpers. Die Interaktion zwischen ECM und der Zelle hat ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf die Biologie der Zelle. Es ist wichtig für die Zelle, eine Umgebung vorzufinden, die ihrer gewohnten, physiologischen Nische entspricht. Ist dies nicht der Fall, kann es schnell zu einer Dedifferenzierung, einem Absterben oder einfach zur Stasis der Zelle kommen. Des Weiteren muss die ECM in den physikalischen Parametern wie bspw. Steifigkeit oder Porosität den in wVo-Bedingungen ähneln. Als letztes ist die Form selbst ein entscheidender Faktor. Die Form einer physiologischen Umgebung hat ebenfalls einen Einfluss auf die Funktion. So muss z. B. eine Vaskularisierung gesichert sein, wenn eine Versorgung von größerem Gewebe gewährleistet werden soll. Kann ein Gewebe aufgrund fehlender Vaskularisierung nur unzureichend versorgt werden, droht es abzusterben oder seine Funktion zu verlieren.
Mit den bisherigen Möglichkeiten lassen sich diese oben genannten Bedingungen nur unzureichend oder gar nicht reproduzieren. Im Gegensatz dazu bietet das erfindungsgemäße Verfahren eine Möglichkeit, um komplexe biologische Zellarchitekturen zu schaffen. Das hier beschriebene Verfahren soll insbesondere für einen Anwender gedacht sein, der keinen Zugang zu lithographischem 3D-Druck oder Bioprinting hat.
In der EP 3 018 531 A1 wird ein 3D-Druckverfahren beschrieben, das es erlaubt, mit multiplen Bioinks oder Zelltypen parallel in einem Druckprozess zu arbeiten. Diese Technologie wird vorliegend eingesetzt, um in einem ersten Schritt die hierin beschriebenen Objekte zu erzeugen, die dann in einem zweiten Schritt von einem Anwender mit biologischen Zellen besiedelt werden können. In anderen Worten bildet das in der EP 3 018 531 A1 beschriebene Verfahren die Produktionsgrundlage für das Zellgerüst.
Aufgrund der Nachteile der im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung von Zellkulturkonstrukten ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst herzustellen, mit dem eine hohe Ähnlichkeit zu einer physiologischen Architektur erreicht werden kann, damit an diesen Geweben beispielsweise Tests mit Bakterien, Viren oder Wirkstoffen durchgeführt werden können. Auch soll ein Verfahren zur Herstellung des mit biologischen Zellen besiedelten 3D- Gerüsts bereitgestellt werden.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird mit einem Verfahren zur Herstellung eines mit biologischen Zellen besiedelten 3D-Gerüsts aus biokompatiblem Polymer gemäß dem Hauptanspruch 1 und dem mit biologischen Zellen besiedelten 3D-Gerüst gemäß Hauptanspruch 10 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen 2 bis 9, 11 und 12 angegeben.
So betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausgestaltung ein Verfahren zur Herstellung eines mit biologischen Zellen besiedelten 3D-Gerüsts aus biokompatiblem Polymer, wobei das 3D-Gerüst einen zumindest teilweise überdachten Hohlraum aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dabei in die folgenden zwei Schritte unterteilt:
(a) Aufbau eines 3D-Gerüsts aus biokompatiblem Polymer durch ein lithographisches 3D-Druckverfahren; und
(b) Einfüllen einer biologische Zellen enthaltenden Suspension in den zumindest teilweise überdachten Hohlraum zur Besiedlung des 3D-Gerüsts mit biologischen Zellen.
Der Aufbau eines 3D-Gerüsts aus biokompatiblem Polymer durch ein lithographisches 3D-Druckverfahren bietet die Möglichkeit, ein biokompatibles Polymer in eine physiologische Form zu drucken, so dass Material und Architektur der nachzuahmenden Struktur im menschlichen Körper ähneln. Da erfindungsgemäß die biologischen Zellen erst anschließend zur Besiedlung in das 3D-Gerüst eingebracht werden können, ist es möglich, ein 3D-Zellkulturkonstrukt jeglichen Zelltyps aufzubauen.
Unter dem Ausdruck „aus biokompatiblem Polymer“ wird vorzugsweise verstanden, dass das 3D-Gerüst durch eine Matrix aus einem oder mehreren biokompatiblen Polymeren aufgebaut ist. Es ist zwar nicht ausgeschlossen, dass das 3D-Gerüst weitere Bestandteile neben biokompatiblen Polymeren aufweist, es ist jedoch auch möglich, dass das 3D-Gerüst lediglich aus biokompatiblem Polymer besteht.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, dass der Aufbau des 3D-Gerüsts durch ein stereolithographisches 3D-Druckverfahren erfolgt. Unter einem stereolithographischen 3D-Druckverfahren versteht man eines, bei dem die Struktur des 3D-Gerüsts nach und nach durch schichtweises Aushärten hergestellt wird.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, dass der Aufbau des 3D-Gerüsts in Schritt (a) durch folgenden Schritt erfolgt:
(i) Aushärten einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Substanz durch Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung in einer Fokusebene, in der die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz vorliegt.
Vorzugsweise liegt dabei die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz flüssig, beispielsweise gelöst in einem Lösungsmittel vor. Hier wird im Folgenden von einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit gesprochen.
Der Schritt (i) wird dabei vorzugsweise durch Fokussieren einer weiteren elektromagnetischen Strahlung in einer weiteren Fokusebene wiederholt. Bei der Wiederholung des Schritts (i) wird vorzugsweise eine weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz eingesetzt.
Unter „photopolymerisierbar“ soll hierin verstanden werden, dass die entsprechende Substanz durch Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung und gegebenenfalls der Anwesenheit eines Photoinitiators polymerisierbar ist. Ebenso soll unter „photovernetzbar“ verstanden werden, dass ein Oligomer oder Polymer durch Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung und gegebenenfalls der Anwesenheit eines Photoinitiators vernetzt werden kann.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, dass sich der Schritt (a) in folgende Verfahrensschritte unterteilt:
(I) Einbringen einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit in ein Reaktionsgefäß,
(II) Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung auf eine Fokusebene, die innerhalb eines mit der Flüssigkeit gefüllten Bereichs des Reaktionsgefäßes liegt,
(III) Erzeugen einer polymerisierten oder vernetzten Struktur in einer Schicht der Fokusebene in dem Reaktionsgefäß durch die elektromagnetische Strahlung, (IV) Einbringen einer weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren
Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß, so dass eine zuvor erzeugte polymerisierte oder vernetzte Struktur zumindest teilweise mit der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit bedeckt ist,
(V) Fokussieren einer weiteren elektromagnetischen Strahlung auf eine weitere Fokusebene, die innerhalb eines mit der weiteren Flüssigkeit gefüllten Bereichs des Reaktionsgefäßes liegt,
(VI) Erzeugen einer weiteren polymerisierten oder vernetzten Struktur in einer weiteren Schicht in dem Reaktionsgefäß durch die weitere elektromagnetische Strahlung, wobei die weitere polymerisierte oder vernetzte Struktur unmittelbar auf der zuvor erzeugten polymerisierten oder vernetzten Struktur angeordnet und mit dieser verbunden ist,
(VII) Wiederholen der Schritte (IV) bis (VI) mit jeweils einer weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit, bis das 3D-Gerüst erzeugt ist.
Die weitere Fokusebene in Schritt (V) unterscheidet sich vorzugsweise von der ersten Fokusebene zumindest in Bezug auf die bereits erzeugte polymerisierte oder vernetzte Struktur bzw. in Bezug auf die Schicht dieser polymerisierten oder vernetzten Struktur.
Bei der Verbindung der in Schritt (VI) erzeugten polymerisierten oder vernetzten Strukturen handelt es sich vorzugsweise um eine Verbindung durch kovalente Bindungen. Es sind jedoch auch nicht-kovalente Bindungen, beispielsweise auf der Grundlage physikalischer Wechselwirkungen möglich.
Durch die unterschiedlichen Fokusebenen, in denen eine Polymerisierung oder Vernetzung der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten stattfindet, wird folglich ein schichtweiser Aufbau des 3D-Gerüsts erreicht. Dabei ist es möglich, den zumindest teilweise überdachten Hohlraum in dem 3D-Gerüst auszubilden. Weiterhin können auch Hinterschnitte und überhängende Strukturen ausgebildet werden, da eine Polymerisierung oder Vernetzung der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit in einer bestimmten Fokusebene beziehungsweise Schicht auch dann erfolgen kann, wenn darunter kein bereits polymerisiertes oder vernetztes Material angeordnet ist, sondern lediglich noch nicht polymerisierte oder nicht vernetzte Flüssigkeit. Eine Polymerisierung oder Vernetzung von einer außerhalb der Fokusebene vorliegenden photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit bleibt aus; vielmehr wird nur diejenige photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit polymerisiert oder vernetzt, die innerhalb der Fokusebene liegt. Dennoch dient die außerhalb der Fokusebene vorhandene Flüssigkeit zur temporären Stützung der in der Fokusebene vorhandenen Flüssigkeit, ohne dass hierfür feste Stützstrukturen erforderlich wären.
Eine oder mehrere der verwendeten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten können biologische Zellen enthalten. Wenn es infolge der Einstrahlung der elektromagnetischen Strahlung zu einer Polymerisierung oder Vernetzung kommt, werden die in der Flüssigkeit enthaltenen Zellen mit in ein entsprechendes Polymer eingebettet. Es ist erfindungsgemäß jedoch bevorzugt, dass in dem lithographischen 3D- Druckverfahren keine biologischen Zellen eingesetzt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können komplexe biologische 3D- Zellkulturkonstrukte als Modelle erzeugt werden, um beispielsweise Zell-Zell- Interaktionen, die Organbiogenese, Krankheiten oder Organfunktionen darzustellen und zu untersuchen. Ein derartiges 3D-Zellkulturkonstrukt hat gegenüber der klassischen zweidimensionalen Zellkultur deutliche Vorteile, insbesondere, wenn es um die Modellierung des Zusammenspiels mehrerer Zelltypen geht. Denn die Komplexität von Zell-Zell-Interaktionen, die Funktion einer natürlichen Barriere und die Modellierung von Krankheiten oder Organen können mit den klassischen zweidimensionalen Zellkulturen nicht hinreichend abgebildet werden.
Darüber hinaus ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Erstellung miniaturisierter Modelle in besonders einfacher Art und Weise. Derartige miniaturisierte Modelle wurden bislang teilweise von Hand aufgebaut. Der hierfür erforderliche Aufwand ist sehr hoch; zudem ist langjährige Erfahrung notwendig.
Schließlich kann durch das erfindungsgemäße Verfahren eine hohe Reproduzierbarkeit unterschiedlicher Exemplare des gleichen 3D-Zellkulturkonstrukts gewährleistet werden. Die Verwendung eines 3D-Gerüsts ermöglicht zudem den gerichteten Aufbau einer 3D- Zellkultur. Folglich lässt sich durch das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur die Herstellung gegenüber anderen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren beschleunigen, vielmehr weisen die erzeugten 3D-Zellkulturkonstrukte auch stets die gleiche Qualität auf. Eine derart hohe Reproduzierbarkeit ist in der Biotechnologie besonders vorteilhaft. Denn bei der Analyse und Entwicklung neuer pharmazeutischer Produkte reduziert ein Test an stets gleich bleibenden dreidimensionalen Zellkulturen die Entwicklungskosten erheblich. Wenn derart komplexe dreidimensionale Strukturen hingegen per Hand aufgebaut werden, sind individuelle Schwankungen unvermeidlich. Damit wird es aber praktisch unmöglich, reproduzierbare Testergebnisse zu erhalten. Demgegenüber liefert das erfindungsgemäße Verfahren 3D-Zellkulturkonstrukte, die für die Erzeugung reproduzierbarer Testergebnisse hervorragend geeignet sind.
Als Reaktionsgefäße können in dem erfindungsgemäßen Verfahren Kavitäten (sogenannte wells) handelsüblicher Mikrotiterplatten (beispielsweise Mikrotiterplatten mit 6, 12, 24, 48, 96, 384 oder 1536 Kavitäten), Zellkulturflaschen oder Petrischalen verwendet werden.
Das mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte 3D-Gerüst kann aus einem homogenen Material aufgebaut sein und folglich nur ein Polymer eines einzigen Typs umfassen. In einer Variante handelt es sich bei der einen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit und bei zumindest einer der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten jedoch um unterschiedliche Flüssigkeiten. Dadurch wird es möglich, heterogen aufgebaute 3D- Gerüste aus verschiedenen Polymeren zu erzeugen. Auf diese Weise können unterschiedliche Polymerstrukturen innerhalb des 3D-Gerüsts verwirklicht werden. So kann beispielsweise der zumindest teilweise überdachte Hohlraum von einer Polymerstruktur umgeben sein, die sich von der Polymerstruktur des äußeren Gerüsts des 3D-Gerüsts unterscheidet, um beispielsweise eine größere Porosität aufzuweisen, die ein Eindringen der biologischen Zellen in die Matrix des 3D-Gerüsts zu ermöglichen. Weiterhin kann der zumindest teilweise überdachte Hohlraum auch Säulen, ein Gitter oder Querstreben aufweisen, um zum einen das Dach des Hohlraums zu stützen und zum anderen ein Adhärieren der biologischen Zellen an der Oberfläche innerhalb des Hohlraums zu ermöglichen. Die Eigenschaften der Polymerstruktur oder der verschiedenen Polymerstrukturen innerhalb des 3D-Gerüsts können durch die Wahl der zu polymerisierenden Monomere oder der zu vernetzenden Polymere in der/den photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit(en) beeinflusst werden. Je kleiner das Molekulargewicht der polymerisierbaren oder vernetzbaren Einheiten, desto kleiner sind in der Regel die Zwischenräume oder Poren der entstehenden Matrix des 3D-Gerüsts. Im zuletzt genannten Fall hängt es jedoch auch stark von der Anzahl der vernetzbaren Einheiten an den Polymeren und somit dem Vernetzungsgrad ab. Je höher der Vernetzungsgrad, desto kleiner sind in der Regel die Zwischenräume oder Poren der entstehenden Matrix des 3D-Gerüsts. Es ist prinzipiell möglich, mit dem lithographischen 3D-Druckverfahren in jeder Schicht unterschiedliche Polymer- oder Monomerlösungen einzusetzen, um ein 3D-Gerüst mit hoher Komplexität oder Diversität zu erhalten.
Unter einem biokompatiblen Polymer wird ein biologisches oder biologisch verträgliches Polymer verstanden. Unter „biologisch verträglich“ soll hierin verstanden werden, dass dieses die Lebensdauer der biologischen Zellen nicht beeinflusst, insbesondere also nicht toxisch auf die biologischen Zellen wirkt.
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das 3D-Gerüst eines, das zumindest im Bereich des sichtbaren Lichts transparent ist. Auf diese Weise kann die Besiedlung mit biologischen Zellen optisch verfolgt und festgehalten werden.
Die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz in der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit ist vorzugsweise eine, die eine photoreaktive Gruppe aufweist, die mit weiteren photoreaktiven Gruppen kovalente Bindungen eingehen kann.
In einer Variante ist die photoreaktive Gruppe eine Acrylgruppe, mittels derer die Polymerisierung oder Vernetzung bewerkstelligt wird. D.h. die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz ist vorzugsweise eine Acrylverbindung, bspw. eine aus der folgenden Gruppe: Methacrylate, Methylacrylate, Ethylacrylate,
Hydroxyethylacrylate, Butylacrylate, Trimethylolpropanacrylate, Triacrylatacrylate und Polyacrylate (PA) im Allgemeinen. Bei der zu polymerisierenden oder zu vernetzenden Substanz kann es sich um ein Polymer, ein Oligomer oder ein Monomer handeln. Vorzugsweise handelt es sich hier um Substanzen auf Kohlenstoffbasis. Im Fall der Monomere wird photopolymerisiert. Im Falle der Polymere oder Oligomere wird vorzugsweise photovernetzt.
Als zu polymerisierende Monomere können beispielsweise die Folgenden eingesetzt werden: Acrylamide, Vinylchlorid, Ethylen, Propylen, Isopren, Caprolactam, sämtliche Aminosäuren, (Des-)Oxyribonucleotide, Glucose, bzw. sämtliche Monosaccharide sowie die zuvor genannten Acrylate.
Als Oligomere oder Polymere können die Folgenden eingesetzt werden: Polyethylenglykol (PEG), Polyethylen (PE), Polypropylen (PP), Polyketon (PK), Polyvinylchlorid (PVC), Polystyrol (PS), Polytetrafluorethylen (PTFE), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU). Ferner sind synthetische Polymere wie Silikone, Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Harze wie etwa Melamin- oder Melamin-Formaldehyd-Harze als Ausgangssubstanz geeignet. Ferner sind Biopolymere wie etwa Proteine, DNA, RNA, Kohlenhydrate und Kohlenhydratderivate, Kollagene, Fibrine, Alginate, Gelatine, Hyaluronsäuren oder Polylactide als Ausgangssubstanzen geeignet. Statt der vorgenannten Polymere können auch jeweils die Monomervorstufen oder Oligomervorstufen dieser Polymere als Ausgangssubstanzen eingesetzt werden, sofern diese in stabiler Weise im festen oder flüssigen Aggregatzustand bereitgestellt werden können. Durch das Einbringen einer photoreaktiven Gruppe, bspw. einer Acrylgruppe, in die Ausgangssubstanz wird diese photopolymerisierbar bzw. photovernetzbar gemacht. Durch die strahlungsinduzierte Kopplung der Acrylreste zwischen verschiedenen Molekülen der Ausgangssubstanz wird eine polymerisierte oder vernetzte Matrix hergestellt.
Wenn photopolymerisierbares PDMS als Matrix bzw. als Hüllsubstanz eingesetzt wird, ist ein Gasaustausch zwischen den in dieser Matrix eingebetteten Zellen möglich. Wie bereits erwähnt, können unterschiedliche Hüllsubstanzen bzw. Matrices eingesetzt werden. So kann beispielsweise neben PDMS oder einer anderen Matrix, die eine gute Biokompatibilität aufweist, ein stabiler Kunststoff für die restliche Matrix eingesetzt werden, um so ein nach außen stabiles Objekt, in dessen Innerem eine das Zellwachstum ermöglichende Matrix mit geringerer Stabilität vorliegt, zu erzeugen.
Die um die photoreaktive Gruppe ergänzte Ausgangssubstanz wird in flüssiger Weise eingesetzt, wobei unterschiedliche Viskositäten möglich sind. Das heißt, das vorliegend beschriebene Verfahren ist nicht auf photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeiten mit einer bestimmten Viskosität beschränkt, sondern es können auch niedrigviskose Flüssigkeiten eingesetzt werden. Es können sowohl Newton’sche als auch nicht-Newton’sche Flüssigkeiten eingesetzt werden.
Die Flüssigkeiten können Lösungen oder kolloid-disperse Gemische, wie etwa Suspensionen, sein. Die Flüssigkeiten können dabei einen wässrigen bis öligen Charakter haben. Dies wird u.a. durch die Wahl der Ausgangssubstanzen und deren Partikelgröße bestimmt.
Damit eine Photopolymerisierung oder Photovernetzung der eine photoreaktive Gruppe tragenden Ausgangssubstanz erreicht werden kann, wird zudem ein Radikalbildner (ein sogenannter Photoinitiator) eingesetzt, der bei einer ausgewählten Wellenlänge der im Rahmen des Verfahrens eingesetzten elektromagnetischen Strahlung Radikale bildet.
Geeignete Radikalbildner sind beispielsweise Anthronderivate wie etwa Violanthron oder Isoviolanthron, Fluoreszein, Rubren, Anthrazinderivate, Tetrazenderivate, Benzanthron, Benzanthronil, Eosin, Levolinsäurederivate, Phospin-Derivate, Mono- und Bis-Acyl- Phosphine, Metallocene, Acetophenone, Benzophenone, Xanthone, Quinone, Keton- Derivate, Hydroxyketone, Aminoketone, Benzoyl-Peroxide, Pyridin-Salze, Phenylglyoxylate und/oder lodonium-Salze.
Vorzugsweise werden zusätzlich zu dem Radikalbildner auch noch ein Vinylmakromer und ein Amin-basierter Co-Initiator eingesetzt, um die Photopolymerisation oder Photovernetzung in besonders geeigneter Weise ablaufen zu lassen. Als Co-Initiator sind beispielsweise Ascorbinsäure und tertiäre Aminderivate, wie etwa Methyldiethanolamin oder Tetraethylamin geeignet.
In einer Variante weist die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit ein Thiolderivat auf. Geeignete Thiolderivate sind Dithiothreitol, monofunktionale Cysteine, bifunktionale Peptide und ähnliche Verbindungen.
Darüber hinaus kann der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit eine Substanz zugesetzt werden, die eine Photopolymerisation oder Photovernetzung tieferer, flüssiger Schichten verhindert. So bleibt flüssige Lösung außerhalb der Fokusebene flüssig, auch wenn sie sich im Einstrahlbereich der über ihr liegenden Fokusebene befindet. Dies funktioniert durch eine Absorption der Substanz bei der Wellenlänge, bei der die Polymerisation stattfindet (polymerisierende Wellenlänge). Das Abfangen findet in der Fokusebene statt, so dass kein Eindringen der polymerisierenden Wellenlänge in tiefere Schichten möglich ist. Geeignet sind alle Substanzen, die in der gewünschten Wellenlänge absorbieren, wie etwa Farbstoffe.
Darüber hinaus ist es in einer Variante möglich, dass die eine photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit und/oder eine der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten und/oder eine andere Flüssigkeit, die nicht photopolymerisierbar sein muss, einen temperatursensitiven Gelbildner aufweisen. Insbesondere ist der Einsatz eines invers-temperatursensitiven (auch als revers temperatursensitiv bezeichneten) Gelbildners vorgesehen. Ein solcher Gelbildner wird mit steigender Temperatur fester. Durch ein Erwärmen des Reaktionsgefäßes erstarrt die Reaktionsflüssigkeit und bildet ein zunächst nur metastabiles Gel. Sollte die Flüssigkeit nicht gleichzeitig photopolymerisiert oder photovernetzt werden, kann durch ein nachfolgendes Abkühlen des 3D-Gerüsts das metastabile Gel wieder verflüssigt und abgepumpt werden. Bei gewöhnlichen temperatursensitiven Gelbildnern liegen die anzuwendenden Temperaturverhältnisse genau umgekehrt. So kann bei Bedarf beispielsweise eine Stützstruktur erstellt werden, so dass hängende Strukturen erzeugbar sind. Wird das metastabile Gel hingegen zumindest teilweise mit elektromagnetischer Strahlung in geeigneter Wellenlänge bestrahlt, kommt es zu einer Photopolymerisierung, so dass das metastabile Gel in diesen Bereichen in ein stabiles Gel bzw. Polymer umgesetzt wird.
Mit anderen Worten ausgedrückt, kann durch den temperatursensitiven, insbesondere invers-temperatursensitiven, Gelbildner und eine Temperaturkontrolle des Reaktionsraumes noch einfacher mit hängenden Partien und Hinterschnitten oder Hohlräumen gearbeitet werden. Auch in dieser Variante kann weiterhin mit flüssigen Strukturen als Stütze gearbeitet werden.
Es ist darüber hinaus möglich, einen Temperaturgradienten vorzusehen, so dass ein metastabiles Gel nicht in allen Bereichen der mit dem temperatursensitiven, insbesondere invers-temperatursensitiven, Gelbildner versetzten Flüssigkeit erfolgt. Mit Hilfe eines solchen Gradienten können noch komplexere Strukturen erzeugt werden.
Die vorgenannten einzelnen Komponenten können als individuelle Substanzen in der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit enthalten sein. Alternativ ist es auch möglich, die zur Gelbildung vorzugsweise eingesetzten Substanzen bzw. Gruppen in einem einzigen Polymer durch entsprechende Synthese zu realisieren. Statt einer Mischung aus einzelnen Komponenten würde ein derartiges Polymer dann unterschiedliche funktionelle Gruppen aufweisen, die alle für eine Photopolymerisation oder Photovernetzung benötigten bzw. vorzugsweise einzusetzenden Funktionen in sich vereinen. Ferner ist es auch denkbar, lediglich einige der für die Photopolymerisation oder Photovernetzung vorzugsweise eingesetzten Funktionen bzw. Gruppen in einem Polymer vorzusehen und andere für die Photopolymerisation oder Photovernetzung vorzugsweise einzusetzende Funktionen bzw. Gruppen in separaten Einzelkomponenten der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit zuzumischen.
Alternativ oder zusätzlich zu der Bildung von Hohlräumen über die Verwendung eines Gelbildners können auch Enzyme zur Verdauung des Polymers eingesetzt werden. Das Prinzip ist das Folgende: Ein 3D-Gerüst mit Hohlräumen/Hinterschnitten (z.B. einem Kanalsystem) wird als solider Körper gedruckt, indem alle Hohlräume beim Druck mit einem Opfermaterial ausgefüllt sind, welches später (d.h. nach Abschluss des Drucks) durch Gabe des richtigen Enzyms aufgelöst werden kann. Das Opfermaterial ist bspw. ein verdaubares Polymer, das durch Zugabe eines verdauenden Enzyms verdaut wird. Dies ist eine elegante Strategie zum Schaffen von Hohlräumen mit stereolithografischen Druckverfahren. Beispielsweise kann eine Hyaluronidase (verdauendes Enzym) Hyaluronsäure (Opfermaterial) verdauen, so dass an der Stelle im 3D-Gerüst, in der die Hyaluronidase eingesetzt wird, ein Hohlraum entsteht. Dieses Prinzip ist bereits in der Patentanmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen DE 102019200 792.9 beschrieben. Alternativ kann zur Schaffung eines Hohlraums/Hinterschnittes auch ein Photoblocker in der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit eingesetzt werden, wobei der Photoblocker die Aushärtetiefe der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit einschränkt.
In einer Variante wird die weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit erst dann in das Reaktionsgefäß eingebracht, wenn die zuvor im Reaktionsgefäß befindliche photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit (dies kann beispielsweise die eine photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit oder eine weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit sein) aus dem Reaktionsgefäß entfernt wurde. Hierzu ist es beispielsweise möglich, dass eine Pumpe vorgesehen ist, welche eine bereits verwendete photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß herauspumpt und eine neue weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß hineinpumpt. Statt einer einzelnen Pumpe können für derartige Vorgänge auch zwei oder mehr unterschiedliche Pumpen verwendet werden.
In einer Variante kann das 3D-Gerüst während oder am Ende seines Herstellungsprozesses in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit elektromagnetischer Strahlung einer niedrigen Wellenlänge (beispielsweise im UV- Bereich, also unterhalb von 380 nm) bestrahlt werden, um auf diese Weise eine Sterilisation zu erreichen. Derartige UV-Sterilisationen sind grundsätzlich bekannt.
In einer Variante ist eine Trägerplatte oder Trägerstruktur in dem Reaktionsgefäß angeordnet, an die die erste polymerisierte oder vernetzte Struktur gebunden wird. Der Einsatz einer derartigen Trägerplatte bietet sich dann an, wenn das erzeugte 3D-Gerüst später nicht im Reaktionsgefäß selbst untersucht werden soll, sondern aus dem Reaktionsgefäß entnommen werden soll. In der Trägerplatte können beispielsweise Schraubanschlüsse (wie etwa DIN-Schraubanschlüsse) vorhanden sein, um eine nachfolgende Versorgung des erzeugten 3D-Gerüsts mit Flüssigkeiten und Gasen zu ermöglichen. Es ist auch möglich, derartige Schraubanschlüsse in die Matrix des 3D- Gerüsts im Rahmen des Herstellungsverfahrens einzubringen, diese Schraubanschlüsse also dort in der Matrix zu generieren. Das Erzeugen derartiger Schraubanschlüsse in der Matrix kann unabhängig davon vorgenommen werden, ob eine Trägerplatte eingesetzt wird oder nicht. In einer Variante wird eine Trägerplatte vor dem Schritt des Erzeugens einer ersten polymerisierten oder vernetzen Struktur durch das Einstrahlen einer elektromagnetischen Strahlung in eine Fokusebene, die innerhalb eines mit einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit (insbesondere mit der ersten oder einer der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit) gefüllten Bereichs des Reaktionsgefäßes liegt, erzeugt, indem eine polymerisierte oder vernetzte Trägerstruktur gebildet wird, die die Trägerplatte aufweist oder darstellt. Das heißt, in dieser Variante werden nicht nur die eigentlichen polymerisierten oder vernetzten Strukturen, sondern auch die Trägerstruktur durch eine Polymerisierungs- oder Vernetzungsreaktion erzeugt.
Die Trägerstruktur kann eine solche Form haben, dass zwischen der Trägerplatte und einem Boden des Reaktionsgefäßes ein Abstand gebildet ist. Dadurch weisen dann die Fokusebenen der eigentlichen Polymerisierungs- oder Vernetzungsreaktionen einen größeren Abstand zum Boden des Reaktionsgefäßes auf. Insbesondere weist die erste gebildete polymerisierte oder vernetzte Struktur dann einen größeren Abstand zum Boden des Reaktionsgefäßes auf. Dann lassen sich nicht mehr benötigte polymerisierbare oder vernetzbare Flüssigkeiten besonders leicht aus dem Reaktionsgefäß absaugen.
In einer Variante wird zwischen einer Quelle für die elektromagnetische Strahlung (Strahlungsquelle), die zur Erzeugung der einen und/oder der weiteren elektromagnetischen Strahlung dient, und dem Reaktionsgefäß ein optisches System angeordnet, das zur Fokussierung der elektromagnetischen Strahlung auf die jeweilige Fokusebene in dem Reaktionsgefäß dient. Dabei ist es in einer Variante vorgesehen, dass eine Refokussierung dieses optischen Systems erfolgen kann, um die Fokusebene innerhalb des Reaktionsgefäßes zu ändern. Eine derartige Refokussierung kann beispielsweise durch eine Veränderung des Abstands des optischen Systems zur Strahlungsquelle erreicht werden. Dabei kann ein computergesteuerter Schrittmotor vorgesehen sein, um eine entsprechende Bewegung des optischen Systems zu vermitteln. Beim optischen System kann es sich beispielsweise um ein System optischer Linsen oder - in einem konstruktiv besonders einfach gelagerten Fall - um eine einzelne Fokussierlinse handeln. In einer Variante ist es auch möglich, eine Relativbewegung zwischen dem Reaktionsgefäß oder einer in dem Reaktionsgefäß angeordneten Trägerplatte auf der einen Seite und der Strahlungsquelle, die zur Erzeugung der einen und/oder der weiteren Lichtstrahlung dient, auf der anderen Seite durchzuführen. Denn durch eine derartige Relativbewegung, die beispielsweise durch eine Bewegung des Reaktionsgefäßes, durch eine Bewegung der in dem Reaktionsgefäß angeordneten Trägerplatte oder durch eine Bewegung der Strahlungsquelle bewerkstelligt werden kann, kann die Fokusebene innerhalb des Reaktionsgefäßes ebenfalls geändert werden. Bei dieser Variante ist folglich keine Refokussierung eines optional einzusetzenden optischen Systems erforderlich. Dadurch kann die Gefahr optischer Dejustagen reduziert werden.
In einer weiteren Verfahrensvariante werden die eine und/oder die weitere elektromagnetische Strahlung auf einen definierten und vorbestimmbaren Bereich in der jeweiligen Fokusebene innerhalb der einen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit und/oder der weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit gelenkt. Das heißt, es kann ein spezifisches Strahlungsmuster vorgegeben werden, das auf die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit trifft und an diesen Stellen zu einer Polymerisierung oder Vernetzung der Flüssigkeit zur Bildung eines Polymers bzw. eines Gels (der Matrix) dient. Ein derartiges Strahlungsmuster kann beispielsweise durch den Einsatz von Masken oder Blenden, aber auch durch den Einsatz einer gepulsten Strahlung oder die digitale Modulierung eines Strahlungssignals erzeugt werden. An den Bereichen der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit, die von der Strahlung getroffen werden, kommt es zu einer Polymerisierung oder Vernetzung. An den anderen, nicht von der Strahlung getroffenen Bereichen verbleibt die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit indes in ihrem nicht polymerisierten oder nicht vernetzten Zustand. Dadurch definiert die Strahlung die Bereiche, an denen ein Drucken der polymerisierten oder vernetzten Struktur erfolgt. Mit einem derartigen lichtunterstützten Drucken sind weitaus höhere Auflösungen möglich, als dies bei den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren der Fall ist. Die Auflösung hängt dabei von der Wellenlänge der eingesetzten Strahlung ab. Sie ist selbst bei regelmäßig eingesetzten großen Wellenlängen besser als die Auflösung, die mit den herkömmlichen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, realisierbar ist. Je genauer die Strahlungsquelle fokussiert werden kann, desto größer ist die resultierende Auflösung. Beispielsweise können mit einem Laser sehr hohe Auflösungen erreicht werden.
Die elektromagnetische Strahlung kann bei Bedarf über Spiegel auf die jeweilige Fokusebene gelenkt werden.
Das jeweils gewählte Bestrahlungsmuster kann beispielsweise von einem Computerprogramm bereitgestellt werden. So ist es denkbar, dass ein Anwender das herzustellende 3D-Gerüst mittels eines CAD-Programms erstellt. Das derart erstellte digitale Objekt wird dann von einem geeigneten Computerprogramm in einzelne Bestrahlungsebenen zerschnitten. Ferner wird jeder Ebene bzw. unterschiedlichen Orten einer jeden Ebene eine bestimmte photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit zugeordnet. Zu diesen Informationen werden Steuerinformationen für einen Drucker erstellt, mittels dessen das beschriebene Verfahren durchgeführt wird. Diese Steuerinformationen geben vor, wann welche photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht werden muss. Ferner geben diese Steuerinformationen vor, wann welches Bild einer Bestrahlungsebene auf die jeweilige Fokusebene im Reaktionsgefäß projiziert werden soll. Auf diese Weise lässt sich dann das zuvor am Computer erstellte 3D-Gerüst in ein reales 3D-Gerüst überführen.
In einer Variante wird mehr als eine polymerisierte oder vernetzte Struktur in derselben Schicht (das heißt, in derselben Fokusebene) erzeugt. Dazu erfolgt zunächst eine Polymerisierung oder Vernetzung einer ersten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit. Anschließend wird die erste photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß entfernt und eine zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht. Nun werden nur solche Bereiche innerhalb der Fokusebene im Reaktionsgefäß bestrahlt, die zuvor nicht bestrahlt wurden und an denen folglich noch keine polymerisierte oder vernetzte Struktur vorliegt. Dadurch können unterschiedliche Matrices in ein und derselben Schicht erzeugt werden. Es werden folglich mehrere polymerisierte oder vernetzte Strukturen in ein und derselben Schicht gebildet, so dass eine heterogene Schicht resultiert. Anschließend kann die zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß entfernt und eine weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht werden. Der Füllstand dieser weiteren photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit kann nun auf ein solches Niveau gebracht werden, dass die zuvor gebildete Schicht vollständig überdeckt ist. Dann kann die Fokusebene verschoben werden und eine weitere Schicht des zu erzeugenden 3D-Gerüsts durch eine entsprechende polymerisierte oder vernetzte Struktur aufgebaut werden. Dabei ist es grundsätzlich möglich, dass einzelne Schichten des erzeugten 3D-Gerüsts homogen (umfassend eine polymerisierte oder vernetzte Struktur eines einzigen Typs) und andere Schichten heterogen (umfassend polymerisierte oder vernetzte Strukturen unterschiedlichen Typs) vorliegen, wobei die Anzahl der einzelnen Strukturen pro Schicht nicht begrenzt ist. In der Praxis haben sich neben einer einzigen polymerisierten oder vernetzten Struktur pro Schicht heterogen zusammengesetzte Schichten mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 polymerisierten oder vernetzten Strukturen als sinnvoll herausgestellt.
In einer Variante wird zumindest die erste Struktur der ersten Schicht, insbesondere aber jede Struktur der ersten Schicht, aus zwei unterschiedlichen Richtungen mit der ersten Strahlung bestrahlt. Dabei sind diese beiden unterschiedlichen Richtungen vorzugsweise einander entgegengesetzt. Mit einer derartigen Bestrahlung aus zwei unterschiedlichen Richtungen wird eine besonders feste Verankerung der ersten Schicht auf der inneren Oberfläche des Reaktionsgefäßes bzw. auf einer Trägerplatte, die in dem Reaktionsgefäß angeordnet ist, erreicht. Dadurch wird ein späterer sicherer Halt des gesamten erzeugten 3D-Gerüsts an dem Reaktionsgefäß bzw. an einer Trägerplatte in dem Reaktionsgefäß erreicht, wodurch nachfolgende Untersuchungen an dem 3D- Gerüst erleichtert werden können. Typischerweise erfolgt die Bestrahlung bei einem nach oben offenen Reaktionsgefäß von oben. Die erste Schicht wird in dieser Variante dann vorzugsweise zusätzlich von unten durch den Boden des Reaktionsgefäßes hindurch bestrahlt. Dazu muss das Reaktionsgefäß aus einem Material gefertigt sein, das für die Strahlung mit der gewählten Wellenlänge durchlässig ist. Die nachfolgenden Schichten, die oberhalb der ersten Schicht angeordnet sind, werden dann vorzugsweise wiederum nur aus einer Richtung (nämlich vorzugsweise von oben) belichtet, damit die bereits gebildeten polymerisierten oder vernetzten Strukturen nicht zwischen der Fokusebene der Strahlung und einer zur Aussendung der Strahlung eingesetzten Strahlungsquelle liegen und somit nicht von der Strahlung vor deren Fokusebene erneut durchstrahlt werden.
In einer Variante weisen die erste elektromagnetische Strahlung und/oder die weitere elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge im Bereich von 200 nm bis 1000 nm (also eine Wellenlänge, die zwischen dem UV-Bereich und dem Infrarot-Bereich liegt), stärker bevorzugt im Bereich von 350 nm und 800 nm auf. Mit derartigen Wellenlängen lassen sich die bevorzugt als Radikalbildner eingesetzten Substanzen besonders gut anregen, so dass Radikale gebildet werden, um eine Polymerisierung oder Vernetzung von Acrylreste tragenden Ausgangssubstanzen zu ermöglichen.
Weitere geeignete Wellenlängen der eingesetzten elektromagnetischen Strahlung liegen im Bereich von 250 nm bis 950 nm, insbesondere von 250 nm bis 850 nm, insbesondere von 300 nm bis 800 nm, insbesondere von 300 nm bis 750 nm, insbesondere von 300 nm bis 700 nm, insbesondere von 350 nm bis 650 nm und ganz besonders von 350 nm bis 400 nm.
Die zur Polymerisation oder Vernetzung eingesetzten Strahlungen können dieselbe Wellenlänge oder aber verschiedene Wellenlängen aus dem vorgenannten Wellenlängenbereich umfassen, um eine geeignete Polymerisation der unterschiedlichen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten zu ermöglichen. Dabei können die einzelnen Strahlungen durch unterschiedliche oder aber durch ein und dieselbe Strahlungsquelle erzeugt werden. Es ist auch möglich, innerhalb einer Schicht (und damit innerhalb einer Fokusebene) nacheinander verschiedene Wellenlängen einzusetzen, um unterschiedliche photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeiten in derselben Schicht zu polymerisieren oder zu vernetzen, wenn eine heterogene Schicht aus unterschiedlichen polymerisierten oder vernetzten Strukturen gebildet werden soll.
In einer Variante wird das Verfahren derart durchgeführt, dass während der Erzeugung des 3D-Gerüsts mindestens ein funktionelles Element in das 3D-Gerüst eingebracht wird. Das funktionelle Element ist dabei ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Membranen, Kanälen, Poren, Sensoren, Säulen, Gittern, Querstreben, oder elektrisch leitenden Trägern und chemotaktischen Präparaten. Kanäle und Poren können beispielsweise in das Objekt integriert werden, indem bestimmte Bereiche der gebildeten polymerisierten oder vernetzten Struktur in mehreren Schichten übereinander freigelassen werden. Membranen können durch das Einbringen von Lipidmolekülen in die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit gebildet werden.
Darüber hinaus können mit Hilfe der Photopolymerisation oder Photovernetzung ebenfalls Salzbrücken innerhalb des 3D-Gerüsts eingebracht werden. Dies ist besonders einfach möglich, wenn die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit Salze enthält, also salzhaltig ist. Auf diesem Wege kann nachfolgend eine elektrische Ableitung und Enervierung des gedruckten 3D-Gerüsts erfolgen.
Über bereits während des Herstellungsprozesses in das 3D-Gerüst eingebrachte Sensoren braucht das hergestellte 3D-Gerüst nachträglich nicht mehr manipuliert zu werden, sondern kann unmittelbar über die bereits eingebrachten Sensoren ausgelesen werden. Dies erleichtert nachfolgende Analysen des mit biologischen Zellen besiedelten 3D-Gerüsts erheblich. Beispielsweise durch das Einbringen elektrisch leitender Träger, wie etwa Elektroden, wird es besonders einfach, bei einer nachfolgenden Untersuchung des gebildeten 3D-Gerüsts das elektrische Potential bzw. die elektrischen Eigenschaften des besiedelten 3D-Gerüsts zu analysieren.
Durch das Einbringen chemotaktischer Präparate, die in einer Variante in unterschiedlichen Schichten in unterschiedlichen Konzentrationen eingebracht werden können, um so einen Gradienten zu erzeugen, lässt sich das gezielte Wachstum/Besiedeln von biologischen Zellen innerhalb des 3D-Gerüsts nach dessen Fertigstellung ermöglichen. Wenn es sich bei dem chemotaktischen Präparat um einen Lockstoff handelt, übt er eine positive Chemotaxis aus, so dass sich die biologischen Zellen im 3D-Gerüst zu Bereichen höherer Konzentration des Lockstoffes hin orientieren werden. Handelt es sich bei dem chemotaktischen Präparat indes um einen Schreckstoff, übt er eine negative Chemotaxis aus, so dass sich die biologischen Zellen im 3D-Gerüst zu Bereichen niedrigerer Konzentration des Schreckstoffes bzw. zu Bereichen, in denen der Schreckstoff gar nicht vorhanden ist, orientieren werden. Dadurch lässt sich ein zielgerichtetes Wachstum/Besiedeln von Zellen innerhalb des 3D- Gerüsts erreichen.
Vorzugsweise wird zumindest ein Füllstandssensor eingesetzt, um die Flüssigkeitshöhe im Reaktionsgefäß stets genau zu erkennen. Aufgrund dieser Füllstandsinformationen kann dann die Fokusebene bestimmt werden, in der der nächste Polymerisations- oder Vernetzungsschritt durchgeführt werden soll. Die von einem derartigen Füllstandssensor bereitgestellten Daten können auch dazu dienen, die Fokusebene automatisiert anzupassen. Über die von einem Füllstandssensor bereitgestellten Daten kann auch eine Pumpe gesteuert werden, die den Zufluss der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten in das Reaktionsgefäß vermittelt. Auf diese Weise kann stets genau eine solche Menge der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten in das Reaktionsgefäß eingebracht werden, die zum Aufbau der gerade gewünschten Schicht erforderlich ist. Dadurch werden Abfallmengen gering gehalten. Ferner wird dadurch eine kostengünstige Realisierung des gesamten Verfahrens ermöglicht.
Wie sich aus der vorherigen Darstellung des Schrittes (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt, kann der Schritt des 3D-Drucks des 3D-Gerüsts vollständig automatisiert durchgeführt werden, so dass ein Eingriff eines Benutzers nicht erforderlich ist. Dies erleichtert die Verfahrensanwendung zusätzlich.
Die Zeitdauer, während der die elektromagnetische Strahlung auf die jeweilige Fokusebene eingestrahlt wird, kann an die jeweiligen Anforderungen der eingesetzten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten angepasst werden. Das heißt, jedem Material wird zur Aushärtung eine solche Zeit zugestanden, die für die gewünschte Polymerisierung oder Vernetzung erforderlich und sinnvoll ist.
Wenn ein Träger innerhalb des Reaktionsgefäßes angeordnet ist, kann sich beim Anheben dieses Trägers relativ zum Reaktionsgefäß ein Unterdrück zwischen einem umgebenden Flüssigkeitsbett und den bereits polymerisierten oder vernetzen Strukturen auf dem Träger ergeben. Durch das Absaugen der Reste der für den vorherigen Polymerisations- oder Vernetzungsschritt noch im Reaktionsgefäß befindlichen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit und das Einbringen einer neuen photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit kann ein potentiell herrschender Unterdrück jedoch entspannt werden. Dadurch kann der Träger relativ zum Reaktionsgefäß bewegt werden, ohne dass ein Abreißen der bereits polymerisierten oder vernetzten Strukturen des 3D-Gerüsts von dem Träger befürchtet werden muss.
Wenn das 3D-Gerüst auf einer Trägerplatte erzeugt wird, kann diese Trägerplatte nach Ende des Herstellungsprozesses komplett aus der noch verbliebenen Flüssigkeit im Reaktionsgefäß herausgehoben werden. Anschließend kann das erzeugte 3D-Gerüst vom Anwender von der Trägerplatte entfernt werden.
Zur Herstellung eines 3D-Gerüsts in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise eine 3D-Druckvorrichtung verwendet werden, wie sie in EP 3 018 531 A1 beschrieben ist.
Durch Zusatz einer temperatursensitiven, insbesondere einer invers temperatursensitiven, Substanz kann die Erzeugung von hängenden Objekten und Hohlräumen in dem 3D-Gerüst zusätzlich verbessert werden. Hierbei kann beispielsweise eine Substanz wie etwa ein Poloxamer in einer solchen Konzentration zugemischt werden, dass die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit oder eine nicht photopolymerisierbare oder nicht photovernetzbare Flüssigkeit auch ohne Bestrahlung in einem gewünschten Temperaturbereich geliert.
Beispielhaft kann das Verfahren so ablaufen: Wenn eine Gelierung bei einer Temperatur von ca. 20 °C (beispielhaft als „Geliertemperatur“ zu bezeichnen) erreicht werden soll, mischt man der photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit ein Poloxamer in einer solchen Konzentration bei, dass die Flüssigkeit in diesem Bereich geliert. Es sind auch Mischungen aus mehreren Poloxameren möglich. Wenn möglich, kann die Flüssigkeit zunächst auf eine Temperatur unter den Gelierpunkt gekühlt werden. Ist eine hängende Struktur innerhalb des Objekts gewünscht, kann die Flüssigkeit, die den temperatursensitiven Gelbildner enthält, auf eine Temperatur erwärmt werden, die über der Geliertemperatur liegt. Die Flüssigkeit geliert dann. Parallel dazu kann die Flüssigkeit ebenfalls photopolymerisiert oder photovernetzt werden. Sollte ein Bereich der temperatursensitiven Flüssigkeit nicht photopolymerisiert oder photovernetzt werden, ist diese bei der erhöhten Temperatur zwar fest, bei einer Absenkung der Temperatur unterhalb der Geliertemperatur jedoch jederzeit wieder verflüssigbar. So kann der temperatursensitive, gelierte Teil als Stützstruktur bis zum Ende des Druckprozesses fungieren. Nach Abschluss des Drückens kann die Temperatur wieder unter die oben genannte beispielhafte Geliertemperatur von 20 °C gesenkt werden. Als Folge verflüssigt sich der nicht polymerisierte oder nicht vernetzte, temperatursensitive Teil der Flüssigkeit wieder und kann abgepumpt werden. Wird das Gel verflüssigt, wird die Stützstruktur entfernt und der ehemals gestützte Teil des gedruckten Objektes, das nun photopolymerisiert oder photovernetzt ist, hängt frei.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass das 3D-Gerüsteine Einfüllöffnung aufweist, über die der zumindest teilweise überdachte Hohlraum zugänglich ist. Die Einfüllöffnung ist vorzugsweise an der oberen Fläche des 3D-Gerüsts angeordnet, so dass der Hohlraum von oben mit einer biologische Zellen enthaltenden Suspension (auch Zellsuspension genannt) befüllt werden kann. Somit ist es in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt, dass das Einfüllen der Zellsuspension durch eine Einfüllöffnung am 3D-Gerüst durchgeführt wird. Die Einfüllöffnung kann beispielsweise in der Form eines Einfüllstutzens vorliegen, der beispielsweise das exakte Ansetzen einer Pipette zum Einfüllen der Zellsuspension ermöglicht.
Weiterhin ist es bevorzugt, dass das 3D-Gerüst einen oder mehrere Auslassöffnungen aufweist, die ebenso mit dem Hohlraum im Inneren des 3D-Gerüsts räumlich verbunden sind. Ist beispielsweise der Hohlraum vor Schritt (b) mit einer Lösung gefüllt, so kann diese bei Einfüllen der Zellsuspension über die Auslassöffnungen entweichen. Dazu ist/sind die Auslassöffnung(en) vorzugsweise räumlich unterhalb der Einfüllöffnung angeordnet, vorzugsweise als seitliche Auslässe am 3D-Gerüst. Der teilweise überdachte Hohlraum kann aber auch in der Form eines vaskulären Gefäßes angeordnet sein, bspw. um ein in einem weiteren Hohlraum anzuordnendes biologisches Zellgewebe mit einer Nährlösung, wie Blut, zu versorgen.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, dass das 3D-Gerüst zwischen Schritt (a) und Schritt (b) getrocknet wird. Dabei bekommt das 3D- Gerüst eine haltbarere und besser zu transportierende Form. Nach Abschluss der Trocknung/Vitrifikation ist das 3D-Gerüst licht- und feuchtigkeitsgeschützt im Kühlschrank für mindestens sechs Wochen lagerfähig. Hierbei schrumpft das 3D-Gerüst leicht und wird härter. Eine nasse Lagerung lässt das 3D-Gerüst Gefahr laufen, schneller zu verderben. Die Trocknung/Vitrifikation wird vorzugsweise in einer sterilen Umgebung durchgeführt. Geeignete Trocknungstemperaturen liegen im Bereich von 4°C bis 50°C, stärker bevorzugt im Bereich von 15°C bis 25°C. Die Trocknung kann beispielsweise in einem Trockenschrank, in einer Klimakammer oder in Ähnlichem durchgeführt werden.
Als biologische Zellen, die für den Aufbau des mit biologischen Zellen besiedelten 3D- Gerüsts eingesetzt werden, kommen sämtliche natürlich vorkommenden eukaryotischen und prokaryotischen Zellen in Betracht. Vorzugsweise handelt es sich bei den eingesetzten Zellen um eukaryotische Zellen. Besonders geeignet sind alle Zellen und Zelltypen, die im Körper eines Säugetiers, insbesondere eines Nagers und ganz besonders eines Menschen, Vorkommen bzw. diesen Körper aufbauen. In einer Variante handelt es sich bei den eingesetzten biologischen Zellen um omnipotente oder pluripotente Zellen. Dabei bezieht sich die Erfindung in einer Variante nur auf den Einsatz solcher Zellen, die ohne die Zerstörung menschlicher Embryonen gewonnen werden können. Neben natürlich vorkommenden Zellen können als biologische Zellen auch Zellen nicht natürlich vorkommender Zelllinien verwendet werden. Derartige künstlich generierte Zelllinien ermöglichen den maßgeschneiderten Aufbau des herzustellenden 3D-Zellkulturkonstrukts. Als biologische Zellen können nicht nur adhärente Zellen, sondern auch Suspensionszellen eingesetzt werden. Mit bisherigen Systemen war es bisher nicht möglich, 3D-Zellkulturkonstrukte aus Suspensionszellen zu generieren, da diese von alleine nicht aneinanderwachsen. Befindet sich jedoch im Hohlraum des 3D-Gerüsts eine Stützstruktur, wie Säulen oder ein Gitter, so ist es mit dem 3D-Gerüst möglich, ein Zellkulturkonstrukt aus Suspensionszellen bereitzustellen, wie beispielsweise einen Lymphknoten, an dem dann Versuche durchgeführt werden können.
Da das erfindungsgemäße Verfahren eine Kombination verschiedener Zelltypen zu einem 3D-Zellkulturkonstrukt ermöglicht, eignet es sich insbesondere zur Herstellung künstlicher Organe. Derartige künstliche Organe können beispielsweise miniaturisierte Modellobjekte eines natürlich vorkommenden Organs, insbesondere eines natürlich vorkommenden Organs eines Menschen oder eines Tieres, wie etwa eines Säugetieres oder eines Nagers sein. Da unterschiedliche photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeiten eingesetzt werden können, sind auch unterschiedliche Geltypen, in denen die biologischen Zellen eingebettet sind, möglich. Zudem ist es möglich, Kunststoffpolymere und Biopolymere zu kombinieren, so dass sehr stabile Gebilde hergestellt werden können, in denen die biologischen Zellen eingebettet sind. Während eines einzelnen Druckvorganges können mehrere 3D-Gerüste, auch mit unterschiedlichen Formen, gleichzeitig erzeugt werden.
Damit der Anwender das in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte 3D-Gerüst für den Schritt (b) verwenden kann, wird das 3D-Gerüst - sofern es vorher getrocknet wurde - rehydratisiert. Dafür wird das 3D-Gerüst vorzugsweise über einen Zeitraum von 60 s bis 60 min vorzugsweise in Wasser, einer Salzlösung, einem Puffer, Zellmedium oder einer ähnlichen physiologisch verträglichen Flüssigkeit eingelegt. Idealerweise erfolgt diese Handlung in einer Petrischale oder Ähnlichem unter sterilen Bedingungen. Hierdurch gewinnt das Gerüst wieder seine ursprüngliche Größe, Festigkeit und Beschaffenheit zurück.
Zur Besiedlung des Gerüsts mit biologischen Zellen wird vorzugsweise eine Suspension aus biologischen Zellen (hierin auch Zellsuspension genannt) und einem gewünschten Lösungsmittel gemischt. Als Lösungsmittel können alle mit Zellen kompatiblen Lösungen eingesetzt werden. Das umfasst alle wässrigen Lösungen, die das Überleben von Zellen gewährleisten. Für gewöhnlich werden Stoffe zum Einstellen eines neutralen pH-Wertes (pH 7.4) und eines isotonischen Milieus eingesetzt, um mit den Lösungen den Flüssigkeiten im menschlichen Körper (z.B. Blut) nahe zu kommen. Die Konzentration der biologischen Zellen in dem Lösungsmittel liegt dabei vorzugsweise in einem Bereich von 100.000 bis 300.000.000 Zellen pro Milliliter. Für die Besiedlung des 3D-Gerüsts wird die Zellsuspension vorzugsweise über die Einfüllöffnung in das Gerüst eingebracht. Es ist dabei bevorzugt, dass das Gesamtvolumen der einzufüllenden Zellsuspension maximal so groß wie das Volumen des Hohlraums des 3D-Gerüsts ist. Wenn die gewünschte Zellkonzentration eingestellt ist, kann der Anwender das Volumen beispielsweise mit Hilfe einer Pipette in das Gerüst einspülen. Es ist bevorzugt, dass das 3D-Gerüst beim Einfüllen der Zellsuspension bereits mit einer Flüssigkeit gefüllt ist, die dann über optionale Auslassöffnungen ausströmen kann. Im Idealfall wird das Gerüst aber zum Einfüllen der Zellsuspension aus dem für die Rehydratisierung verwendeten Medium entfernt.
In einer weiteren Ausführungsform enthält die zur Besiedlung des Hohlraums verwendete Flüssigkeit vorzugsweise Zellsphäroide. In einer weiteren Ausführungsform enthält die verwendete Flüssigkeit vorzugsweise einen Gelbildner, der nach dem Einfüllen ein stabiles Hydrogel bildet, wodurch die inkorporierten Zellen bzw. Zellsphäroide immobilisiert werden. Als stoffliche Grundlage des Gelbildners können enzymatisch vernetzende Gele (z.B. Fibrin), physikalisch vernetzende Gele (z.B. Kollagene) oder photopolymerisierbare bzw. photovernetzbare Flüssigkeiten eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Besiedlung des Hohlraums vorzugsweise durch Einsetzen eines Geweberesektats oder einer Biopsie (sog. ex vivo Kultur). In einer weiteren Ausführungsform kann das Geweberesektat/die Biopsie mit einer gelbildenden Flüssigkeit eingeklebt werden.
Mögliche Säulen, Gitter oder Querstreben in dem Hohlraum des 3D-Gerüsts können bei der Besiedlung mit biologischen Zellen als Anker oder Rückhalt für die biologischen Zellen dienen, so dass sie - bei adhärenten Zellen - an dem 3D-Gerüst anhaften können, oder - bei Suspensionszellen -frei schwimmend im 3D-Gerüst kultiviert werden können.
Nachdem die Zellsuspension in das 3D-Gerüst eingefüllt wurde, kann das jetzt zellhaltige Konstrukt weiter kultiviert werden. Je nach innerem Konstrukt des Hohlraums kann sich jetzt ein neues 3D-Zellkulturmodell ausbilden. Bei adhärenten Zellen adhärieren die biologischen Zellen an alle verfügbaren Strukturen und sich selbst, so dass eine 3D- Struktur in der Form des Hohlraums des 3D-Gerüsts entsteht. Auf diesem Weg entsteht kontrolliert ein 3D-Zellkulturmodell/-konstrukt. Sollte das 3D-Gerüst beispielsweise mit Tumorzellen besiedelt werden, entsteht ein 3D-Tumormodell. Wird das Modell mit Suspensionszellen, wie T-Zellen oder B-Lymphozyten, besiedelt, entsteht ein lymphknotenähnliches Modell oder ein diffuses B-Zelllymphom. Ist der Hohlraum oder auch das Porenvolumen der Matrix des 3D-Gerüsts vollständig besiedelt, können die Zellen das 3D-Gerüst beispielsweise über die optionalen seitlichen Kanäle verlassen. Auf diesem Weg können sich z. B. kleine Sphäroide aus Zellen abschnüren.
In anderen Worten kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren auch der Schritt der Kultivierung der biologischen Zellen nach Schritt (b) zu einem 3D-Zellkulturkonstrukt stattfinden. Die Kultivierungsbedingungen sind abhängig von dem Typ der verwendeten Zellen. Einem Fachmann auf dem Gebiet der Biologie sind die idealen Kultivierungsbedingungen für verschiedene biologische Zellen in der Regel bekannt. Die anhand des Zelltyps zu bestimmenden Kulturbedingungen sind Temperatur, Zusammensetzung der jeweiligen Nährlösung und Beschaffung des Kulturgefäßes. Beispielhaft können hier die Bedingungen für humane Blutgefäßzellen aus der Nabelschnur genannt werden: 37°C und 5% CO2, Minimalmedium mit Glucose, alle essenziellen Aminosäuren, Vitamine und Mineralien. Die Kultur befindet sich hierbei vorzugsweise auf Petrischalen oder Zellkulturflaschen, die für Gewebekulturen (sog. tissue culture-treated surfaces) beschichtet wurden. Diese genannten Kulturbedingungen sind für zahlreiche humane Zellen günstig. Bei Gefäßzellen ist zusätzlich der Einsatz von Wachstumsfaktoren notwendig, die dem Minimalmedium hinzugegeben werden.
Anschließend kann das 3D-Zellkulturkonstrukt mit weiteren Zellen, Viren, Bakterien, Enzymen oder Wirkstoffen penetriert werden, um Tests an dem Konstrukt vorzunehmen. Hierzu können einerseits die Einfüllöffnung oder die seitlichen Kanäle benutzt werden, manche Substanzen oder Zellen können das Material des 3D-Gerüsts jedoch auch so durchdringen. Auf diesem Weg können beispielsweise Tumorzellen mit Car-T-Zellen angegriffen werden.
In einer Ausgestaltung betrifft die vorliegende Erfindung auch ein mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. Alle Merkmale und Ausgestaltungen, die in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hierin genannt sind, treffen - sofern möglich - auch für das erfindungsgemäße mit biologischen Zellen besiedelte 3D-Gerüst zu, und umgekehrt.
Die vorliegende Erfindung weist folgende Vorteile auf: Bisher waren keine Gerüste mit Hinterschnitten oder komplexen Architekturen möglich, die von einem Anwender selbst besiedelt werden können. Das 3D-Gerüst fungiert selbst als Hohlkörper, der ohne Multimaterial-Stereolithographie bis jetzt nicht möglich gewesen wäre. Die komplexe Architektur, mit der auf das Verhalten der Zellen Einfluss genommen wird, wäre so nicht abzubilden. Durch den erfindungsgemäßen Herstellungsweg kann eine hohe Reproduzierbarkeit und Parallelität gewährleistet werden. Das 3D-Gerüst lässt sich trotz komplexer Architektur mit einer millimetergenauen Präzision reproduzieren. Darüber hinaus erlaubt das System erstmals die Kultivierung von Suspensionszellen in einem 3D-Konstrukt, oder die Herstellung von vaskulären Strukturen. Dabei muss das System nicht aktiv geschüttelt werden, wie sonst in einer klassischen Schüttelkultur. Die Zellen verbleiben lebend im Gerüst. Durch den Einfluss des Systems lassen sich deutlich längere Kultivierungszeiten erreichen. So kann das besiedelte System beispielsweise über Zeiträume von mehreren Wochen kultiviert werden, so dass es Einsatz als Ersatzprodukt für Tierversuche finden kann. Kultivierungszeiträume von mehreren Wochen waren für manche Zelltypen bislang nicht möglich. Des Weiteren lässt sich das Verhalten der Zellen online verfolgen, da das System für sichtbares Licht vorzugsweise transparent ist. Eine kontinuierliche Messung durch optische Methoden ist gewährleistet. Zusammenfassend stellt das Gerüst durch seine Form, Architektur, Methode der Anwendung, physikalische Parameter eine Neuerung dar.
Das erfindungsgemäß verwendbare 3D-Gerüst hat vorzugsweise eine flache Form, d.h. ist in seinen horizontalen Dimensionen vorzugsweise größer als in der vertikalen Dimension. Das 3D-Gerüst kann jegliche Grundfläche aufweisen, wie beispielsweise kreisförmig, oval, rechteckig oder quadratisch, die beiden letzten auch mit abgerundeten Ecken. Vorzugsweise erstreckt sich das 3D-Gerüst in der Vertikalen prismatisch, d.h. die Grundfläche ändert sich in der vertikalen Richtung nicht wesentlich. Der Durchmesser liegt vorzugsweise im Bereich von 500 pm bis 10 cm, insbesondere aber orientiert sich der Durchmesser an der Größe von Wellplatten, d.h. liegt vorzugsweise konkret bei 6,8 mm (96- Well), 10,4 mm (48-Well), 16,2 mm (24-Well) und 34,6 mm (6-Well). Die Höhe liegt vorzugsweise im Bereich von 500 pm bis 10 cm. Ist der Hohlkörper ein zentral angeordneter Hohlkörper, liegt sein Volumen vorzugsweise im Bereich von 10 pL bis 50 mL. Ist der Hohlkörper in der Form eines vaskulären Gefäßes (Kanal) ausgebildet, so liegt der Durchmesser des Kanals vorzugsweise im Bereich von 1 pm bis 5 cm.
Die vorliegende Erfindung soll nun anhand von konkreten Ausführungsformen veranschaulicht werden, die in den folgenden Figuren gezeigt sind:
Fig. 1 : Fig. 1 zeigt eine Ansicht eines unbesiedelten 3D-Gerüsts einer CAD-Datei mit einem zentralen überdachten Hohlkörper, einer Einfüllöffnung an der Oberseite und mehreren seitlichen Auslassöffnungen.
Fig. 2: Fig. 2 zeigt eine fotographische Aufnahme in der Draufsicht auf ein durch lithographischen 3D-Druck hergestelltes 3D-Gerüst nach der CAD-Datei der Fig.
1.
Fig. 3: Fig. 3 zeigt eine fotographische Aufnahme in der Draufsicht auf ein mit Tumorzellen aus einem Neuroblastom besiedeltes 3D-Gerüst nach Fig. 2.
Fig. 4: Fig. 4 zeigt eine Ansicht eines unbesiedelten 3D-Gerüsts einer CAD-Datei mit einer zentralen, nach oben offenen Vertiefung sowie überdachten Hohlräumen in der Form von vaskulären Gefäßen mit zwei Einfüllöffnungen an der Oberseite für die vaskulären Gefäße und zwei seitlichen Auslassöffnungen der vaskulären Gefäße.
Fig. 5: Fig. 5 zeigt eine mikroskopische Aufnahme eins gedruckten Modells nach der CAD-Datei nach Fig. 4 von unten.
Fig. 1 zeigt ein in einer CAD-Datei erstelltes Modell eines 3D-Gerüsts 1 , das erfindungsgemäß verwendet werden kann. Das 3D-Gerüst 1 weist vorzugsweise einen zentralen, größtenteils überdachten Hohlraum 2 auf. Der Hohlraum 2 ist vorzugsweise über eine als Einfüllstutzen ausgebildete Einfüllöffnung 3 zugänglich. Die Fläche über dem Hohlraum 2 ist vorzugsweise mit Säulen 5 innerhalb des Hohlraums 2 abgestützt. Das 3D-Gerüst 1 weist vorzugsweise mehrere seitliche Auslassöffnungen 4 in der Form von Auslasskanälen auf.
Fig. 2 zeigt eine fotographische Aufnahme eines 3D-Gerüsts 1 , das mit Hilfe eines lithographischen 3D-Druckverfahrens auf Basis der CAD-Datei nach Fig. 1 hergestellt wurde. Deutlich zu erkennen sind der ober Einfüllstutzen 3, die seitlichen Kanäle 4 sowie die Säulen 5 im Hohlraum 2. Das in Fig. 2 gezeigte 3D-Gerüst wird durch folgende Verfahrensschritte hergestellt:
1.) Erstellung des CAD-Files und Berechnung der Druckvorlage;
2.) Rüsten des Druckers mit zu verwendenden photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeiten;
3.) Kalibrieren des Druckers, der Achsen und des Druckkopfs;
4.) Ausführung des Druckes, Druckplattform senkt sich auf die erste Druckebene für die erste photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit; Druck eines ersten Polymers aus der ersten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit für Architekturen bestehend aus Polymer 1 für die erste Schichthöhe des zu druckenden Konstrukts; dabei wird der berechnete Bauplan des ersten Polymers für die erste Schichthöhe des Konstrukts auf die Druckebene projiziert, in der sich der Druckkopf befindet; hierbei können ein oder mehrere Konstrukte gleichzeitig hergestellt werden, je nach Wunsch und Planung des Anwenders; begrenzender Faktor ist dabei die Größe der Druckplattform bzw. des Bauraums; Wenn nötig, Waschschritt des Druckers um ein Verschleppen von dem ersten
Polymer in eine zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit und umgekehrt zu verhindern - optional (sofern ein zweites Polymer benötigt wird); Wenn nötig, Druck des zweiten Polymers für Architekturen bestehend aus dem zweiten Polymer für die erste Schicht - optional (sofern ein zweites Polymer verwendet wird); Wiederholung der Schritte sechs und sieben wenn ein drittes Polymer verwendet wird; Veränderung der Druckebene um die zweite Schichthöhe drucken zu können; Druck des ersten Polymers für Architekturen bestehend aus dem ersten Polymer für die zweite Schichthöhe des zu druckenden Konstrukts; Wenn nötig, Waschschritt des Druckers um ein Verschleppen von des ersten
Polymers in die zweite photopolymerisierbare oder photovernetzbare Flüssigkeit und umgekehrt zu verhindern - optional (sofern zweites Polymer verwendet wird); Wenn nötig, Druck des zweiten Polymers aus einer zweiten photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren Flüssigkeit für Architekturen bestehend aus dem zweiten Polymer für die zweite Schicht - optional (sofern ein zweites Polymer verwendet wird); Wiederholung der Schritte 11 und 12 wenn ein drittes Polymer benötigt wird; Veränderung der Druckebene um die dritte Schichthöhe drucken zu können; Wiederholung der Schritte fünf bis acht bis die vollständige Architektur gedruckt wurde; Nach Abschluss des Druckes wird die Druckplattform in die Ausgangsebene gefahren und das erhaltene 3D-Gerüst entfernt; Im Anschluss kann das 3D-Gerüst getrocknet oder sofort verwendet werden. 18.) Wird das 3D-Gerüst getrocknet, findet dies in einer sterilen Atmosphäre statt; hierbei wird dem 3D-Gerüst sämtliches Wasser entzogen, so dass ein trockenes Polymergerüst entsteht;
19.) Nach dem Trocknen kann das 3D-Gerüst unter sterilen Bedingungen gelagert werden.
Konkrete Bedingungen und Parameter für die Herstellung des 3D-Gerüsts nach Fig. 2:
Äußerer Durchmesser 3D-Gerüst: 6 mm Höhe 3D-Gerüst: 2 mm
Volumen Hohlraum: 9,9 mm3 Innendurchmesser Einfüllöffnung: 1,6 mm Querschnitt seitliche Kanäle (eckig) und Auslassöffnungen: 0,4 mm x 0,4 mm
Zusammensetzung der ersten photovernetzbaren Flüssigkeit:
Lösungsmittel: RPMI 1640 + 25 mM HEPES (Biochrom FG
1383), Phosphate-buffered Saline
Photovernetzbare Substanz: Gelatine-Methacrylat, 50 g/kg;
Polyethylenglycol-Diacrylat, 50 g/L Weitere Additive: Lithiumphenyl-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinat, 5 g/kg; Tartrazin, 2 mM;
Aus der ersten photovernetzbaren Flüssigkeit wird das gesamte 3D-Gerüst gedruckt. Durch Zusatz des Photoblockers Tartrazin in der photovernetzbaren Flüssigkeit wird die Penetrationstiefe des zur Polymerisation verwendeten Lichts reguliert, sodass die Herstellung des überdachten Hohlraums ermöglicht wird. Alternativ könnten zur Herstellung des überdachten Hohlraums Opfertinten (eingesetzt in einer weiteren photovernetzbaren Flüssigkeit; z.B. 15 g/kg Hyaluronsäure gelöst in RPMI + 5 g/kg Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat gedruckt und anschließend mit Hyaluronidase verdaut, um den Hohlraum zu erzeugen) verwendet werden, die nach Abschluss des Drucks hydrolytisch oder durch enzymatisches Verdauen aufgelöst werden. Fig. 3 zeigt eine fotographische Aufnahme eines 3D-Gerüsts 1 nach Fig. 2, das mit Tumorzellen aus einem Neuroblastom besiedelt wurde. Dazu werden folgende weitere Verfahrensschritte durchgeführt:
20.) Es wird eine Zellsuspension mit einer vom Anwender vorher eingestellten
Konzentration über den Einfüllstutzen in ein gemäß 1.) bis 19.) hergestellten 3D- Gerüst pipettiert; dabei wird ein Zellsuspensionsvolumen verwendet, das maximal dem Volumen des Hohlraums des 3D-Gerüsts entspricht; wird das 3D-Gerüst in Schritt 18.) getrocknet, muss es zuvor zur erneuten Verwendung vom Anwender wieder hydratisiert werden; hierzu eignet sich ein steriles Medium, wie Wasser, PBS, Zellkulturmedium oder ähnliches;
21.) Durch das Einpipettieren wird die Suspension innerhalb des 3D-Gerüsts verteilt und die Zellen können innerhalb des 3D-Gerüsts kultiviert werden;
Zur Besiedlung des Hohlraums mit Neuroblastomzellen (SK-N-BE(2)) wird eine Zellsuspension (Lösungsmittel: DMEM high glucose + 10% FCS + 1% Penicillin/Streptomycin; Zellkonzentration: 150 x 106 Zellen/L) hergestellt. 6 pL mm dieser Suspension werden über den Einfüllstutzen in den Hohlraum des 3D-Gerüsts pipettiert. Anschließend wird das Konstrukt bei 37°C und 5% CO2 kultiviert.
Fig. 4 zeigt ein in einer CAD-Datei erstelltes Modell eines 3D-Gerüsts 1, das erfindungsgemäß verwendet werden kann. Das 3D-Gerüst 1 weist eine zentrale, nach oben offene Vertiefung als Besiedlungsbereich 5 für biologische Zellen auf. Weiterhin weist es nach oben geschlossene, d.h. überdachte Hohlräume 2 in der Form von vaskulären Gefäßen auf, die sich vorzugsweise in der horizontalen Ebene um den zentralen Besiedlungsbereich erstrecken.
Fig. 5 zeigt ein tatsächlich gedrucktes 3D-Gerüst 1 unter dem Mikroskop von seiner Unterseite. Einfüllstutzen 3, Hohlräumen 2 in Form von vaskulären Gefäßen und Besiedlungsbereich 6 sind deutlich zu erkennen.
Liste der Bezugszeichen: 3D-Gerüst Hohlraum Einfüllöffnung Auslassöffnung Säulen Besiedlungsbereich

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines mit biologischen Zellen besiedelten 3D-Gerüsts (1) aus biokompatiblem Polymer, wobei das 3D-Gerüst (1) einen zumindest teilweise überdachten Hohlraum (2) aufweist, mit folgenden Schritten:
(a) Aufbau eines 3D-Gerüsts (1) aus biokompatiblem Polymer durch ein lithographisches 3D-Druckverfahren; und
(b) Einfüllen einer biologische Zellen enthaltenden Suspension in den zumindest teilweise überdachten Hohlraum (2) zur Besiedlung des 3D- Gerüsts (1) mit biologischen Zellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Aufbau des 3D-Gerüsts (1) durch ein stereolithographisches 3D-Druckverfahren erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Aufbau des 3D-Gerüsts (1) in Schritt (a) durch folgenden Schritt erfolgt:
(i) Aushärten einer photopolymerisierbaren oder photovernetzbaren
Substanz durch Fokussieren einer elektromagnetischen Strahlung in einer Fokusebene, in der die photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz vorliegt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt (i) durch Fokussieren einer weiteren elektromagnetischen Strahlung in einerweiteren Fokusebene wiederholt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei bei der Wiederholung des Schritts (i) eine weitere photopolymerisierbare oder photovernetzbare Substanz eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Einfüllen einer biologische Zellen enthaltenden Suspension durch eine Einfüllöffnung (3) am 3D- Gerüst (1) durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das 3D-Gerüst (1) zwischen Schritt (a) und Schritt (b) getrocknet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die biologischen Zellen nach Schritt (b) zu einem 3D-Zellkulturkonstrukt kultiviert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das 3D-Zellkulturkonstrukt mit weiteren Zellen, Viren, Bakterien, Enzymen oder Wirkstoffen penetriert wird.
10. Mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst (1), das nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 erhältlich ist.
11. Mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst nach Anspruch 10, das einen oder mehrere Auslassöffnungen (4) aufweist.
12. Mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst nach Anspruch 10 oder 11 , das in dem überdachten Hohlraum Säulen (5), Gitter oder Querstreben aufweist.
PCT/DE2020/100986 2019-11-27 2020-11-20 Mit biologischen zellen besiedeltes 3d-gerüst aus biokompatiblem polymer und dessen herstellung WO2021104571A1 (de)

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CN202080082748.4A CN115943076A (zh) 2019-11-27 2020-11-20 由生物相容性聚合物构成的定植有生物细胞的3d支架及其制造
US17/779,100 US11993767B2 (en) 2019-11-27 2020-11-20 Method for producing 3D, biocompatible polymer scaffold with a cell-filled cavity
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IL293339A IL293339A (en) 2019-11-27 2020-11-20 A three-dimensional scaffold of a biocompatible polymer populated in biological cells, and its production
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