WO2021037002A1 - 溶液样品处理装置、设备和系统以及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种处理溶液样品的装置，其具有容纳溶液的腔体和在腔体内的相对设置的超高频体声波谐振器。一种具有处理溶液样品的装置的用于提纯溶液样品中的靶物质的设备和用于检测溶液样品中的靶物质的系统。一种利用处理溶液样品的装置、具有处理溶液样品的装置的用于提纯溶液样品中的靶物质的设备和用于检测溶液样品中的靶物质的系统来处理、提纯或检测生物样品中的目标生物物质例如细胞或病毒的核酸或蛋白的方法。

Description

溶液样品处理装置、设备和系统以及其用途
本申请要求2019年8月23日提交的、申请号为201910794754.1、发明名称为“溶液样品处理装置、设备和系统以及其用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及细胞和分子生物学与医疗器械领域。具体的，本发明涉及一种利用相对设置的超高频体声波谐振器对溶液样品进行处理的装置、设备和系统，以及使用所述装置、设备和系统来分离和/或检测生物样品中的目标生物物质例如细胞或病毒的核酸或蛋白的方法。
背景技术
生物分子，例如代谢物等小分子，还有蛋白和核酸的提纯与检测是许多基础的生物机理研究、医学和疾病诊断以及医疗仪器开发等领域广泛关注的核心问题。分钟这些微米级的生物在小体积溶液中的富集和混合一直是生物化学领域的热门研究方向，特别是在如核酸提取，固相合成等应用中。在毫升量级乃至百微升和以下量级的样品的高效固液混合是进行有效的生化反应的先决条件。
现有技术中利用各种物理场来处理带有生物分子的溶液的富集和混合。目前已有的相关技术包括施加机械能或电能的驱动方式。然而这些技术受限于高能量、低通量等缺点，需要在局部产生非常大的场强分布，对分子操作存在较大的局限性。与此同时，直接使用物理场操作分子的特异性较差。
另外，检测设备的便携化是现代科学仪器发展的一大趋势。便携式的生物传感装置具有更为广泛的应用，例如家庭健康检测、人体健康指标实时检测、以及医疗资源匮乏的偏远地区的诊断等。一般而言，便携式传感 器具有体积小、操作简单、快捷可靠、价格相对较低等特点。相应地，只有符合上述特点的生物传感技术或者方式才有望率先被研发成为便携式生物传感器。
因此，目前亟需一种更有效、更方便的对溶液样品的富集和混合的方法和系统。
发明内容
为了提高固液混合效率，进一步提高生化反应效率，本发明提供了一种利用相对设置的超高频体声波谐振器来对溶液中的样品进行三维空间微粒操作的装置和含有该装置的设备和系统，以及使用该装置、设备或系统对含有生物分子等的溶液样品进行混合和富集的方法，通过调节输入功率可以高效地实现样品的混合功能，以及方便地在样品颗粒富集和混合之间的转换。
具体的，本发明提供了一种处理溶液样品的装置，其具有容纳溶液的腔体和在所述腔体内的相对设置的超高频体声波谐振器，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波，在溶液产生旋流。
在本发明的方法中，所述超高频体声波谐振器可产生高频(约0.5-50GHz，例如为不小于1.0GHz)的振动，在溶液中引发相应频率的体声波。在本发明的其中一个方面，所述超高频体声波谐振器为薄膜体声波谐振器(FBAR)或固态装配型谐振器(SMR)，优选为固态装配型谐振器。在本发明的其中又一个方面，所述超高频体声波谐振器为厚度伸缩振动模式的声波谐振器，压电材料薄膜层在垂直方向上生长而制成，通过d33压电系数耦合垂直电场激发振动。本发明采用的超高频体声波谐振器可以在装置和液体的界面产生局部化的声流，不需要耦合介质或结构的帮助。本发明的体声波谐振器包括由下往上依次设置的声波反射层、底电极层、压电层及顶电极层。所述底电极层、压电层、顶电极层及声波反射层相重叠区域构成体声波产生区域。所述超高频体声波谐振器的顶部表面可配置在腔体的壁或腔体内的其它器件上，向对侧产生传播方向与所述谐振器的顶部垂直的体声波。本发明的超高频体声波谐振器的压电层的厚度范围为 约1nm～2um。
在本专利中，所述相对设置是指对应的两个或多个体声波谐振器在腔体内的设置位置和方式使得其各自发射的体声波对向传播。例如，两个所述体声波谐振器分别设置在腔体的底部和顶部，声波发射方向相对。在本发明的装置中，所述相对设置的超高频体声波谐振器包括至少一组声波发射方向相对的体声波谐振器，每组声波发射方向相对的体声波谐振器可包括两个声波发射方向相对的体声波谐振器，也可为多个超高频体声波谐振器，例如其中一个声波传播方向的体声波谐振器为一个或多个，其对应的设置在对向的体声波谐振器也可为一个或多个。
在本发明的其中一个方面，所述相对设置的超高频体声波谐振器之间的距离为约0.1-5cm，优选为约0.5-2cm，例如为约0.8-1cm。在本发明的其中另一个方面，所述相对设置的超高频体声波谐振器之间的距离为约0.1-2.0cm，优选为约0.2-1.0cm，例如为约0.2-0.8cm。在本文中，所述距离是指各个体声波谐振器与其对应的设置在对向的体声波谐振器之间的距离。例如，所述相对设置的体声波谐振器为两个分别设置在腔体的底部和顶部，声波发射方向相对的所述体声波谐振器时，其距离是指所述两个体声波谐振器的声波发射表面之间的距离。在本发明的装置中，体声波谐振器发射的体声波在溶液中产生的声射流引起溶液的旋流，相对设置的体声波谐振器产生的旋流影响范围可到达其对应的设置在对向的体声波谐振器的位置。
在本发明的其中一个方面，所述相对设置的超高频体声波谐振器的位置为可调节的。例如，所述相对设置的体声波谐振器的其中一个固定设置在腔体的底部，另一个与设置在顶部的可上下移动的器件连接。
在本发明的其中一个方面，其中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约1000-50000μm 2，优选为约5000-20000μm 2。
在本发明的其中一个方面，所述装置具有功率调节装置，可独立调节所述相对设置的超高频体声波谐振器中各个超高频谐振器产生的体声波的功率。
在本发明的其中一个方面，所述装置中的超高频体声波谐振器产生体 声波的工作功率范围为约100mW以上，优选为150-3000mW，更优选为200-2000mW，例如为约400-800mW。
在本发明的其中一个方面，所述装置中的超高频体声波谐振器产生体声波的工作功率范围还包括约0.01-20mW，优选为0.1-10mW，更优选为0.5-5mW。
在本发明的其中一个方面，所述装置中的腔体的体积为约100微升-10毫升，优选为约200微升-5毫升，更优选为约500微升-1毫升。
在本发明的其中一个方面，所述装置中的腔体的高度为约0.5-5cm，优选为约1-3cm，例如为约1-2cm。
在本发明的其中一个方面，其中所述溶液样品为生物样品(例如体液、血液、细胞、病毒、蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸、适体、核苷)。所述溶液中还可具有可与生物样品结合的磁性或非磁性颗粒。优选的，所述样品或颗粒的尺寸为约0.01μm到约100μm，更优选是约0.05μm到约20μm，例如是约0.5μm到约10μm。
本发明是基于发明人的以下出乎意料的发现：
超高频体声波谐振器能够在溶液内通过发射体声波引起涡流(或称为声流涡旋)，声流涡旋中的粒子同时受到声辐射力和拖拽力的作用。当采用相对设置超高频体声波谐振器的方式，并且在相对设置的超高频体声波谐振器同时工作时，其具有混沌对流效应，涡旋范围增大，腔体边界的盲区的粒子也在拖拽力作用下进入3D的涡流空间运动。
当采用相对设置超高频体声波谐振器的方式，但只令其中一个方向的谐振器工作时，产生粒子聚集效应：当谐振器输入功率在合适的范围，例如在低于约20mW范围内时，由于粒子(如尺寸为0.01μm到约100μm的粒子)在靠近器件区域内主要受到声辐射力的影响，会沿着涡旋从外向内运动，当其运动到谐振器边缘时，此时中心液体正自下向上继续运动，粒子会因为受到了较大的声辐射力的水平分量，而被推向偏离涡旋轨迹的内侧的区域，当粒子远离器件边缘一定距离后，此时声辐射力因为距离变远而减小，粒子又会受到由上而下的微涡旋的流体拖拽力而再次移动至器件边缘，如此往复。当粒子粒径较小，受拖拽力的影响较小，难于聚集，聚 集所需要的时间更长。
在本发明的其中一个方面，提供了一种提纯溶液样品中的靶物质的设备，其包括上述描述的装置，其具有容纳溶液的腔体和在所述腔体内的相对设置的超高频体声波谐振器，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波，在溶液产生旋流。
本发明中，样品可为生物样品。所述样品可以是含有靶物质的培养液或其悬浮液或其上清、缓冲液，例如为各种病毒、细菌或细胞的培养液或其悬浮液或其上清。本发明适合用于各种动物如人的各种体液，包括血液、组织液、细胞外液、淋巴液、脑脊液、房水、尿液、汗液等。本发明的方法和装置特别适合用于具有复杂内含物的样品和/或具有较高粘度的样本，例如全血和呼吸道粘液，如痰液或鼻腔粘液。
本发明提供的方法处理的样品的靶物质可为生物物质，一般为具有特定结构的分子，例如为肽、多肽、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、核酸(DNA、RNA、PNA、适体(aptomer))以及核酸前体(核苷和核苷酸)、多糖、脂质例如脂囊泡等。其中，蛋白质可包括细胞因子、激素、维生素、表面受体、半抗原、抗原、抗体、酶、生长因子、重组蛋白质、毒素、以及其片段和组合。所述生物物质通常具有纳米数量级或更小的尺寸，例如小于100nm。
在本发明的其中一个方面，所述设备包括样本裂解模块。在所述裂解模块中采用裂解剂、酶、超声或物理研磨的方式裂解样本(例如细胞、病毒等)，使得样本的生物小分子靶物质(例如核酸)释放到溶液中。
在本发明的其中一个方面，所述设备包括靶物质结合模块。在所述靶物质结合模块中，磁性颗粒或非磁性颗粒可特异性地与经裂解步骤的样品接触，由此使得样品溶液中的靶物质(例如核酸)与所述磁性颗粒或非磁性颗粒结合。
在本发明的其中一个方面，所述设备包括靶物质清洗模块。在所述靶物质清洗模块中，样品溶液中的靶物质(例如核酸)与所述磁性颗粒或非磁性颗粒结合后可用水或缓冲液冲洗。特异性结合的核酸与所述磁性颗粒或非磁性颗粒保持结合状态，其它不需要的物质被清洗。
在本发明的其中一个方面，所述设备包括靶物质洗脱模块。在所述靶物质洗脱模块中，在合适的溶剂和条件下，与所述磁性颗粒或非磁性颗粒结合的靶物质(例如核酸)可与所述磁性颗粒或非磁性颗粒分离，进入到溶液中，而磁性颗粒或非磁性颗粒可通过磁场或其它方式分离和去除。
在本发明的其中一个方面，所述设备设置为所述样本裂解模块、靶物质结合模块、靶物质清洗模块和靶物质洗脱模块中的一个为前述具有所述相对设置的超高频体声波谐振器的腔体，或是其任意组合具有同一个腔体，所述腔体具有所述相对设置的超高频体声波谐振器。本发明的其中一个优点在于，在采用所述设备的方法中，样本裂解、靶物质结合、靶物质清洗和靶物质洗脱等步骤中的一个或多个都可以采用具有所述相对设置的超高频体声波谐振器的腔体和利用体声波对溶液中的颗粒的充分搅拌和混合而提高样本裂解、靶物质结合、靶物质清洗或靶物质洗脱的效率，特别是其中靶物质结合、靶物质清洗或靶物质洗脱的效率。另一个优点在于，在本发明的方法和装置中，可将样本裂解、靶物质结合、靶物质清洗和靶物质洗脱等步骤中的一个或多个在同一个腔室中进行。
在本发明的其中一个方面，所述装置是通过磁珠法对样品中的靶物质(例如核酸)进行分离。磁珠法是利用能够特异性识别细胞、蛋白质或核酸的磁珠，该磁珠能与靶分子例如核酸等特异性地结合，然后在磁场的作用下，从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的活性大分子分离出来。在本发明的其中又一个方面，所述设备具有磁体装置，所述磁体装置可施加磁场，控制磁性材料和/或结合靶物质(例如核酸)的所述磁性材料。
在本发明的其中又一个方面，提供了一种用于检测溶液样品中的靶物质的系统，其包括：如前所述的装置或设备，其具有容纳溶液的腔体和在所述腔体内的相对设置的超高频体声波谐振器，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波，在溶液产生旋流；
和
检测装置，其对靶物质携带的可识别的标记进行检测，包括但不限于荧光或其它形式的(例如化学发光，生物发光，辐射发光，电发光，电化 学发光，机械发光，结晶发光，热致发光，声致发光，磷光和光致发光等)发光，酶促反应，放射性等。
在本发明的其中又一个方面，提供了一种用于检测溶液样品中的靶物质的系统，其包括：如前所述的装置或设备，其具有容纳溶液的腔体和在所述腔体内的相对设置的超高频体声波谐振器，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波，在溶液产生旋流；
核酸扩增模块；核酸扩增模块为适合以任何方式进行核酸扩增的模块，包括但不限于各种恒温扩增或PCR，例如qPCR(荧光定量PCR)、RT-PCR、热启动PCR、巢式PCR、多重PCR、复原条件PCR、dsRNA合成、COLD-PCR、数字PCR等。
和
检测装置，其对靶物质携带的可识别的标记进行检测，包括但不限于荧光或其它形式的(例如化学发光，生物发光，辐射发光，电发光，电化学发光，机械发光，结晶发光，热致发光，声致发光，磷光和光致发光等)发光，酶促反应，放射性等。
本发明提供了一种处理溶液中样品的方法，所述方法包括，在容纳溶液的腔体内利用相对设置的超高频体声波谐振器产生体声波，在溶液产生旋流，对溶液中的样品进行混合，其中所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波。
在本发明的其中一个方面，提供了采用前面描述的装置或设备或系统来处理待测样品的方法：所述装置或设备具有容纳溶液的腔体和在所述腔体内的相对设置的超高频体声波谐振器，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波，在溶液产生旋流。
在本发明的其中一个方面，可独立调节所述相对设置的超高频体声波谐振器中的各个体声波谐振器产生体声波的功率。在溶液产生旋流以对溶液中的样品进行混合的体声波的功率范围为约100mW以上，优选为约150-3000mW，更优选为约200-2000mW，例如为约400-800mW。在本发明的方法中，体声波谐振器发射的体声波在溶液中产生的声射流引起溶液的旋流，相对设置的体声波谐振器产生的旋流影响范围可到达其对应的设 置在相对方向的体声波谐振器的位置。
在本发明的其中一个方面，所述方法中相对设置的超高频体声波谐振器中的各个谐振器同时产生体声波，产生的旋流作用范围涵盖其对应的设置在相对方向的体声波谐振器的位置，并且与其对应的设置在相对方向的体声波谐振器产生的旋流产生协同增效，使得整个溶液中的样品和/或颗粒充分混合和接触。
在本发明的其中一个方面，所述方法中还包括：所述相对设置的超高频体声波谐振器中的其中一个谐振器不工作，其对应的设置在相对方向的谐振器工作，产生体声波，使得体声波区域的溶液产生旋流，溶液中的样品或样品包含的靶物质或结合了所述靶物质的颗粒聚集到旋流中。在本发明的其中又一个方面，相对设置的超高频体声波谐振器中只有一个体声波发射方向的谐振器工作，在溶液产生旋流以使得溶液中的样品/靶物质/颗粒聚集的体声波的功率范围为约0.01-20mW，优选为0.1-10mW，更优选为0.5-5mW。
在本发明的其中一个方面，所述方法中样品为生物样品(例如体液、血液、细胞、病毒、蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸、适体、核苷)。本发明的方法和装置特别适合用于具有复杂内含物的样品和/或具有较高粘度的样本，例如全血和呼吸道粘液，如痰液或鼻腔粘液。
在本发明的其中一个方面，所述方法中靶物质是肽、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、PNA、核苷酸或多糖。
在本发明的其中一个方面，所述方法中的溶液中含有可与样品/靶物质结合的磁性或非磁性颗粒。优选的，所述样品或颗粒的尺寸为约0.01μm到约100μm，更优选是约0.05μm到约20μm，例如是约0.5μm到约10μm。
在本发明的其中一个方面，所述方法中所述溶液体积为约20微升-1毫升，优选为约50微升-500微升，更优选为约100微升-200微升。本发明的方法和装置在处理较小体积，如约20微升-1毫升，优选为约50微升-500微升，更优选为约100微升-200微升的溶液时有良好的表现，特别是在处理小体积的具有复杂内含物的样品和/或具有较高粘度的样本。在本发明的其中一个方面，所述方法中所述相对设置的超高频体声波谐振器之间 的距离为约0.1-2.0cm，优选为约0.2-1.0cm，例如为约0.2-0.8cm。
在本发明的其中一个方面，所述方法中，所述腔体的体积为约100微升-10毫升，优选为约200微升-5毫升，更优选为约500微升-1毫升。
在本发明的其中一个方面，所述方法中，所述腔体的高度为约0.5-5cm，优选为约1-3cm，例如为约1-2cm。
在本发明的其中一个方面，所述方法用于分离样品的核酸。在本发明的其中一个方面，所述方法通过磁珠法分离样品的核酸。
在本发明的其中一个方面，所述方法还包括扩增核酸的步骤。
本发明还提供了用于上述处理溶液中样品的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
容纳溶液的腔体和设置在腔体内的相对设置的超高频体声波谐振器，所述谐振器可产生体声波，在溶液产生旋流，对溶液中的样品进行混合或富集，其中所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中包括可与样品或样品中的靶物质(例如核酸)结合的磁性或非磁性颗粒。优选的，所述样品或颗粒的尺寸为约0.01μm到约100μm，优选是约0.05μm到约20μm，例如是约0.5μm到约10μm。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒用于分离样品的核酸。在本发明的其中一个方面，所述试剂盒含有通过磁珠法分离样品的核酸的试剂，例如核酸结合、核酸清洗或核酸洗脱试剂。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒还包括核酸扩增的试剂，例如用于PCR的试剂如扩增酶、引物等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明示例性的溶液样品混合和富集装置的示意图和结构图。
图2本发明示例性的装置中的超高频体声波谐振器在腔体内产生体声波和声流涡旋，以及对溶液内的颗粒的作用的示意图和实验结果图。
图3本发明示例性的装置中的超高频体声波谐振器在腔体内产生体声波和声流涡旋的实验结果图。
图4本发明示例性的装置中的超高频体声波谐振器在腔体内产生体声波和声流涡旋的实验结果图。
图5本发明示例性的装置用于提取腺病毒的实验结果图。
图6本发明示例性的装置用于提取冠状病毒的实验结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在根据本发明的公开和教导所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的区间。
实施例1溶液样品混合和富集装置
本实施例提供了一种示例性的本发明的溶液样品混合和富集装置。图1为本发明示例性的溶液样品混合和富集装置的示意图和结构图。
其中，图1(A)为所述溶液样品混合和富集装置的示意图。所述装置包括可容纳溶液的腔体，以及可具有溶液的入口和出口(未示出)。所述腔体的壁为对细胞或生物大分子如核酸和蛋白等具有生物相容性的聚四氟乙烯材料。在图1所示的装置的底部和顶部，分别设置两个超高频体声波谐振器，所述两个超高频体声波谐振器可在腔体内的溶液产生传播方向为腔体对侧的超高频体声波。所述超高频体声波谐振器表面可用牛血清蛋白溶液浸泡预处理，防止核酸粘附。
可用于本发明的超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波。所述超高频体声波谐振器包括薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振 器，例如为厚度伸缩振动模式的声波谐振器。
图1(B)为所述超高频体声波谐振器器件的结构图。该谐振器的表面为五角形，边长约为100μm，其通过金线将EVB板上的信号线与体声波器件顶电极(三分叉结构的中间位置)连接，将体声波器件的底电极(三分叉结构的两侧位置)与EVB板上的接地位置(非信号位置)连接，然后把EVB板通过SMA转接头接入信号发生器，实现高频信号的输入。
示例性的超高频体声波谐振器为具有布拉格声反射结构的谐振器，图1(C)为所述超高频体声波谐振器的内部结构图，其制备方法如下：
通过在硅基的晶圆上进行化学气相沉积、金属溅射、光刻等方法一步步完成芯片的制作。具体的方法如下：
1.使用浓硫酸与双氧水体积比为3∶1的食人鱼溶液对硅片的表面进行彻底的清洗，该方法可以有效地去除硅片上的有机物和无机物。
2.在清洗过的硅片上，通过表面溅射的方法形成一层氮化铝薄膜，再使用离子增强型化学气相沉积的方法，沉积一层二氧化硅薄膜。接着使用同样的方法，交替沉积氮化铝薄膜和二氧化硅薄膜，形成氮化铝和二氧化硅交替重叠的布拉格声反射结构。
3.在布拉格反射层结构上，溅射出一层600nm的钼薄膜作为底电极。接着采用标准光刻技术，包括涂胶、曝光、显影等，对钼电极薄膜进行光刻，之后进行刻蚀，形成有目标图案的底电极。
4.在钼电极上再溅射一层氮化铝薄膜作为压电层。使用干法刻蚀对氮化铝薄膜定义图案。在本示例性的实施方式中，采用五角形。
5.使用负光刻胶对掩模版上的图案进行转移，再溅射出一层50nm厚的钛钨合金，它作为粘附层可以增加金电极的粘附性。之后使用蒸镀的方法长出一层300nm厚的金薄膜的上电极。最后使用丙酮去除掉目标图案周围的金薄膜，形成有目标图案的金电极。
在本示例性的实施方式中，超高频谐振器表面为五角形，边长约100μm，面积约25000μm 2。
将谐振器装置用标准SMA接口与网络分析仪连接，通过测试频谱找到谐振峰，可测得在本示例性的实施方式中，超高频谐振器装置在腔体中 发出的体声波的频率为2.5GHz。
溶液样品混合和富集装置的制备
在本发明的其中一个方面，本发明提供的装置中所述腔体为圆柱形，底部直径为约0.2-2.0cm，优选为0.5-1.0cm。本发明的装置也可采用其它形状的腔体。本实施例中制备的腔体为圆柱形，底部直径为约0.6cm。将一个根据上述制备方法提供的超高频体声波谐振器与腔体的底部粘合集成，将另一个超高频体声波谐振器通过管壳转接件与EVB板连接，器件表面与EVB表面垂直，可从腔体顶部插入腔体内，由于顶部的体声波谐振器是与腔体分离的，因此双器件距离可根据要处理的样本量调节。在实验中，两个超高频体声波谐振器装置分别设置在腔体两端，可根据需要处理的样本量在0.1cm-2.0cm范围内调整。在本发明的其中一个方面，本发明提供的装置中所述腔体体积为约20微升-1毫升，优选为约50微升-500微升，更优选为约100微升-200微升。在本发明的其中一个方面，本发明提供的装置和方法适合处理约20微升-1毫升，优选为约50微升-500微升，更优选为约100微升-200微升的溶液。
在本发明的一种示例性实施方式中，所述装置的容纳溶液的腔体底部还可设置产生磁场的器件，如通过电磁作用产生磁性的器件，包括电磁体。产生磁场的器件通常可设置在底部的超高频体声波谐振器附近(例如其下方)。产生的磁场可用于吸附溶液中带磁性的颗粒，如磁珠(可结合/吸附目标生物大分子如核酸或蛋白)等。在本实施例中，在腔体底部的超高频体声波谐振器的下方设置电磁体。
实施例2
在本发明的方法和装置中，超高频体声波谐振器在腔体的溶液中发射传向对侧的超高频体声波，使得溶液中出现声流涡旋；溶液中的颗粒受到的力包括涡旋产生的流体拖拽力(Stokes drag force)和声辐射力(acoustic radiation force)。图2为是本发明提供的方法和设备中的超高频体声波谐振器在腔体内产生体声波和声流涡旋，以及对溶液内的颗粒的作用的示意图和实验结果图。
图2(A)是本发明提供的方法和设备中的超高频体声波谐振器在腔体内产生体声波和声流涡旋，以及对溶液内的颗粒的作用的示意图。如图2(A)所示，超高频体声波在溶液中产生声流涡旋，溶液中的颗粒受到流体拖拽力(F drag)和声辐射力(F rad)。在靠近超高频体声波谐振器区域内主要受到声辐射力的影响，会沿着涡旋从外向内运动，当其运动到谐振器边缘时，粒子会因为受到了较大的声辐射力的水平分量，而被推向偏离涡旋轨迹的内侧的区域，当粒子远离器件边缘一定距离后，此时声辐射力因为距离变远而减小，粒子又会受到由上而下的微涡旋的流体拖拽力而再次移动至器件边缘，如此往复。当溶液中的粒子离开超高频体声波谐振器较远时，超出声辐射力范围，主要受流体拖拽力作用，在空间散布。
图2(B)本发明提供的示例性方法和设备中，当超高频体声波谐振器在腔体内产生体声波和声流涡旋时溶液内的颗粒的受力和运动状态实验结果。实验中用200ul粒径为5um聚苯乙烯粒子(以下可称为PS颗粒或PS小球)进行测试，观察其在本发明的装置的腔体内运动的状况。微米尺度的粒子可以在常光下观测到粒子的运动。流场运动的速度表征通过高速显微镜下拍摄微球在腔体内的运动来完成。
图2(B)横坐标为时间，纵坐标为粒子占比(颗粒占指定范围的视野内全面积的比例)，图中曲线上的点为不同时间点测量的粒子占比值。如图2(b)所示，在实验的第1秒内(小图为高速相机拍摄的器件表面照片)，当超高频体声波谐振器输入功率低于某个功率(例如低于约20mW，优选低于10mW，图中实验采用5.4mW)，此时声流涡旋中心靠近器件表面，PS小球在涡旋中心形成聚集。而当功率增大到某个功率(例如大于约100mW，优选大于约200mW，图中实验采用200mW)时，腔体中涡旋中心上移，声流效应增强，此时溶液中的粒子已远离器件，超出声辐射力范围，主要受流体拖拽力作用，迅速从聚焦状态变为在空间散布。如图2(B)所示，其中小图为PS小球被打散到空间的散点图，结果显示，在体声波产生后1s内PS小球即可从聚焦状态变为在空间散布(即被打散)。
实施例3
在生物技术和临床医学领域，需要提取其中的生物大分子如核酸或蛋白等的生物样本可以是具有复杂内含物的样品，而且具有较高的粘度，例如全血样本和痰液样本。在其它形式的利用声学对溶液样本进行液体驱动和搅拌的应用中，通常需要高功率，因此导致溶液(特别是小体积溶液)产生高温，对需要的细胞或核酸等产生破坏，或者是需要加入额外的试剂，但由此对后续反应产生影响。
发明人利用本发明的采用超高频体声波谐振器在腔体的溶液中产生体声波和旋流的装置和方法在具有高粘度的液体中进行试验。将0.5μl荧光标记的粒径为30um的PS粒子(上海辉质生物科技有限公司，Cat.No：GF030C)加入100μl 20％乙二醇水溶液，然后加入如实施例1所述的示例性装置中，首先只开启一侧(底部)的超高频体声波谐振器。图3显示实验的结果。图3(A)显示，粒子在高速荧光显微镜下观察到的超高频体声波谐振器不同工作功率下示踪粒子的运动速度。图3(B)显示混合效率。其中，根据R.J.Shilton等，Sens.Actuators B：Chem.2011，160中描述的方法和定义，根据公式
Figure PCTCN2020110865-appb-000001
Figure PCTCN2020110865-appb-000002
其中M定义为混合效率(mixing index)，
以及通过matlab软件的灰度处理来计算得到混合效率。前12s超高频体声波谐振器处于关闭状态，开启后(工作功率为100mW)混合效率迅速达到70％左右然后再持续12s，混合效率基本稳定在约75％。图3(C)中重复图3(b)的实验步骤，在12s后开启超高频体声波谐振器，分别测试开启后第12s时功率0mW，100mW，200mW，400mW可达到的混合效率。如图所示，在400mW可达到约80％。然而，实验发现，在开启一侧超高频体声波谐振器时，混合效率在达到某一水平时通过调节体声波功率会出现出现平台现象：混合效率达到一定高度很难有显著提升，由此影响样品中的生物大分子(如核酸或蛋白)与用于结合和吸附目标生物大分子的颗 粒(如磁珠)的结合效率。
实施例4
发明人进一步对同时开启相对设置的超高频体声波谐振器进行了观测，以及与单独开启一侧的超高频体声波谐振器进行了比较。图4(A)为单独开启底部的超高频体声波谐振器，在400mW功率下，拍摄到的与超高频体声波谐振器表面的垂直切面中聚苯乙烯微球运动状态，可观察到体声波引起的双涡旋(图中箭头示出液流运动方向)以及对溶液中的微球的混合效果。图4(B)为同时开启顶部和底部的超高频体声波谐振器，在400mW功率下，拍摄到的与超高频体声波谐振器表面的垂直切面中聚苯乙烯微球运动状态。需要留意的是，图4(B)中上方箭头显示的两个涡流为设置在底部的体声波谐振器引起(如图4(A)中观察到的涡流)，图4(B)中下方箭头显示的两个涡流为设置在顶部的体声波谐振器引起。可观察到由于上下体声波谐振器引发的涡旋运动反向，因此涡旋作用体积增大，而且可以作用到设置在对侧的谐振器表面，互相起到清洗表面的作用，让更多的粒子运动到三维空间内，达到更强的对溶液中的微粒的混合作用。当溶液中存在生物大分子(如核酸或蛋白)以及可结合目标生物大分子的颗粒(如磁珠)时，更高的混合作用能够提高其结合效率。
图4(C)显示本发明提供的示例性方法和设备用于核酸提取的实验结果。
将前述实施例1制备的装置中的超高频体声波谐振器表面及腔体内壁用牛血清蛋白溶液进行浸泡，防止其表面吸附核酸。从SD小鼠(天津易生源生物技术有限公司提供)采集全血，采用全血基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)(常州金麦格生物技术有限公司，产品号NA001-1)中的试剂(包括磁珠、裂解液、结合液、洗涤液、洗脱液、蛋白酶及其缓冲液)提取核酸。主要步骤包括：
1、在1.5ml无核酸酶离心管中加入200μl老鼠血液样品、200μl裂解液、10μl蛋白酶K，充分混匀，于55℃水浴10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次。然后分别取出20.5μL、61.5μL、102.5μL裂解样本分别进行核酸提取；
2、将裂解后的3组样本加入腔体中，然后对应加入15μl、45μL、75μL结合液和10μl磁珠，单独开启底部或同时开启顶部和底部体声波谐振器(输入功率400mW)10min，核酸与磁珠结合；
3、底部体声波谐振器低功率(输入功率约1-10mW)工作1分钟，结合管外电磁磁吸，使粒子全部聚集在底部，吸走废液；
4、清洗液1用量500μL，单独开启底部或同时开启顶部和底部体声波谐振器(输入功率400mW)冲散磁珠30s，底部体声波谐振器低功率(输入功率约1-10mW)工作1分钟，结合管外电磁磁吸，使粒子全部聚集在底部，吸走废液；
5、清洗液2用量500μL，单独开启底部或同时开启顶部和底部体声波谐振器(输入功率400mW)冲散磁珠30s，底部体声波谐振器低功率(输入功率约1-10mW)工作1分钟，结合管外电磁磁吸，使粒子全部聚集在底部，吸走废液；
6、重复步骤5；
7、通风静置，室温晒干10min；
8、75摄氏度洗脱液，60μL洗脱，室温下洗脱5min；
9、收集60μL含核酸洗脱液，采用NanoDrop 2000 Spectrophotometer(Thermo Fisher，Waltham，MA)进行核酸定量检测。
结果如图4(C)所示，比较了单独开启底部一侧的超高频体声波谐振器以及同时开启上下两侧的超高频体声波谐振器的效果。在体声波谐振器功率为400mW下，同时开启上下两侧的超高频体声波谐振器的核酸提取效率由单独开启底部一侧的超高频体声波谐振器的50％显著提高到80％左右。在不受该理论限制的条件下，发明人认为，提取效果的提升，是由于上下体声波谐振器引发的涡旋运动得到了更强的对溶液中的微粒的混合作用，由此提高核酸与磁珠的结合效率以及最终提高了核酸提取效率。
实施例5对血清样本中的腺病毒的提取和检测
采用本发明的装置和方法对血清中的腺病毒进行病毒提取和检测。腺 病毒购自(汉恒生物技术(上海)有限公司，货号HB-AP2100001)，将其稀释在牛血清(购自杭州天杭生物科技股份有限公司，货号22012-8612)中，制备得到腺病毒含量分别是10 1IU/mL，10 2IU/mL，10 3IU/mL，10 4IU/mL，10 5IU/mL，10 6IU/mL的梯度测试液。
将前述实施例1制备的装置中的超高频体声波谐振器表面及腔体内壁用牛血清蛋白溶液进行浸泡，防止其表面吸附核酸。
采用病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)(常州金麦格生物技术有限公司)中的试剂(包括磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液、蛋白酶及其缓冲液)对配置得到的梯度测试液提取病毒RNA。主要步骤包括：
1、在腔体中加入50μl病毒样品、75μl裂解液、5μl蛋白酶K和10μl磁珠，同时开启顶部和底部体声波谐振器(输入功率400mW)10min，核酸与磁珠结合；
2、底部体声波谐振器低功率(输入功率约1-10mW)工作1分钟，结合管外电磁磁吸，使粒子全部聚集在底部，吸走废液；
3、清洗液1用量500μL，同时开启顶部和底部体声波谐振器(输入功率400mW)冲散磁珠30s，底部体声波谐振器低功率(输入功率约1-10mW)工作1分钟，结合管外电磁磁吸，使粒子全部聚集在底部，吸走废液；
4、清洗液2用量500μL，同时开启顶部和底部体声波谐振器(输入功率400mW)冲散磁珠30s，底部体声波谐振器低功率(输入功率约1-10mW)工作1分钟，结合管外电磁磁吸，使粒子全部聚集在底部，吸走废液；
5、通风静置；
6、75摄氏度洗脱液，60μL洗脱，室温下洗脱5min；
7、收集60μL含核酸洗脱液。
对前述采用本发明的方法和装置提取和纯化后的病毒进行RT-PCR检测，采用TaKaRa Taq TMHot Start Version试剂盒(Takara Bio Inc.日本，产品编号：R007Z)。正向引物5’-TGC TGC CCG ACA ACC ATC-3’，反向引物5’-TCA CGA ACT CCA GCA GGA CCA-3’，探针5’-TGA GCA CCC  AGT CCG CCC TGA GCA-3’(生工生物(上海)股份有限公司合成)。
结果如图5所示。图5(A)为RT-PCR的病毒量对数-循环数曲线图。扩增曲线在6个梯度中除了10 1IU/mL浓度以外，间距基本一致，检出限为10 2IU/mL浓度。图6(B)为RT-PCR的荧光值-循环数曲线图。结果证明，采用本发明的装置和方法能够有效地从血清中提取低浓度的腺病毒。
实施例6对冠状病毒的提取和检测
采用本发明的装置和方法对冠状病毒样品进行病毒提取和检测，并与商用病毒提取试剂盒进行比较。
冠状病毒样品为购自复百澳(苏州)生物科技有限公司的FNV-2019-nCOV-abEN假病毒(货号FNV2001)。样品原液浓度为10 8拷贝/mL，将其稀释在PBS中，得到10 6拷贝/mL，10 5拷贝/mL，10 4拷贝/mL，10 3拷贝/mL的梯度测试液。
将前述实施例1制备的装置中的超高频体声波谐振器表面及腔体内壁用牛血清蛋白溶液进行浸泡，防止其表面吸附核酸。
采用病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)(常州金麦格生物技术有限公司)中的试剂(包括磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液、蛋白酶及其缓冲液)对配置得到的梯度测试液提取病毒RNA。主要步骤包括：
1、在腔体中加入100μl病毒样品、150μl裂解液、10μl蛋白酶K和20μl磁珠，同时开启顶部和底部体声波谐振器(输入功率400mW)10min，核酸与磁珠结合；
2、底部体声波谐振器低功率(输入功率约1-10mW)工作1分钟，结合管外电磁磁吸，使粒子全部聚集在底部，吸走废液；
3、清洗液1用量500μL，同时开启顶部和底部体声波谐振器(输入功率400mW)冲散磁珠30s，底部体声波谐振器低功率(输入功率约1-10mW)工作1分钟，结合管外电磁磁吸，使粒子全部聚集在底部，吸走废液；
4、清洗液2用量500μL，同时开启顶部和底部体声波谐振器(输入 功率400mW)冲散磁珠30s，底部体声波谐振器低功率(输入功率约1-10mW)工作1分钟，结合管外电磁磁吸，使粒子全部聚集在底部，吸走废液；
5、通风静置；
6、75摄氏度洗脱液，60μL洗脱，室温下洗脱5min；
7、收集60μL含核酸洗脱液。
另外，采用病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)(常州金麦格生物技术有限公司)，根据其说明书提供的方法，并配合全自动核酸提取纯化仪DOF-9848(常州金麦格生物技术有限公司)，对配置得到的梯度测试液利用磁棒法进行核酸提取。
对前述采用本发明的方法和装置，以及采用商用核酸提取试剂盒和方法提取和纯化后的病毒核酸进行RT-PCR检测，采用TaKaRa Taq TMHot Start Version试剂盒(Takara Bio Inc.日本，产品编号：PR064A)。正向引物5’-CCC TGT GGG TTT TAC ACT TAA-3’，反向引物5’-ACG ATT GTG CAT CAG CTGA-3’，探针5’-CCG TCT GCG GTA TGT GGA AAG GTT ATGG-3’(生工生物(上海)股份有限公司合成)。
结果如图6所示。图6(A)为RT-PCR的病毒量对数-循环数曲线图。图6(B)为RT-PCR的荧光值-循环数曲线图。结果显示，采用本发明的装置和方法能够有效地提取低浓度的冠状病毒，提取效率相对采用磁棒法的仪器效率更高。
虽然关于本发明的示例实施例及其优点已经详细说明，应当理解在不脱离本发明的精神和所附权利要求限定的保护范围的情况下，可以对这些实施例进行各种变化、替换和修改。对于其他例子，本领域的普通技术人员应当容易理解在保持本发明保护范围内的同时，工艺步骤的次序可以变化。
此外，本发明的应用范围不局限于说明书中描述的特定实施例的工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法及步骤。从本发明的公开内容，作为本领域的普通技术人员将容易地理解，对于目前已存在或者以后即将开发 出的工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法或步骤，其中它们执行与本发明描述的对应实施例大体相同的功能或者获得大体相同的结果，依照本发明可以对它们进行应用。因此，本发明所附权利要求旨在将这些工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法或步骤包含在其保护范围内。

Claims (20)

  1. 一种处理溶液样品的装置，其具有容纳溶液的腔体和在所述腔体内的相对设置的超高频体声波谐振器，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波。
  2. 如权利要求1所述的装置，其中所述相对设置的超高频体声波谐振器之间的距离为约0.1-5cm，优选为约0.5-2cm，例如为约0.8-1cm。
  3. 如权利要求1所述的装置，其中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约1000-50000μm 2，优选为约5000-20000μm 2。
  4. 如权利要求1所述的装置，其具有功率调节装置，用于独立调节所述相对设置的超高频体声波谐振器中各个超高频谐振器产生的体声波以及产生的体声波的功率。
  5. 如权利要求1所述的装置，其中所述超高频体声波谐振器产生体声波的工作功率范围包括约100mW以上，优选为150-3000mW，更优选为200-2000mW，例如为约400-800mW，以及/或者
    其中所述超高频体声波谐振器产生体声波的工作功率范围还包括约0.01-20mW，优选为0.1-10mW，更优选为0.5-5mW
  6. 如权利要求1所述的装置，其中所述超高频体声波谐振器为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器，例如为厚度伸缩振动模式的声波谐振器。
  7. 如权利要求1所述的装置，其中所述腔体的体积为约100微升-10毫升，优选为约200微升-5毫升，更优选为约500微升-1毫升。
  8. 如权利要求1所述的装置，其中所述相对设置的超高频体声波谐振器之间的距离为约0.1-2.0cm，优选为约0.2-1.0cm，例如为约0.2-0.8cm。
  9. 如权利要求1所述的装置，其还具有磁场产生器件，如通过电磁作用产生磁性的器件包括电磁体。
  10. 如权利要求1所述的装置，其中所述溶液样品为生物样品(例如体液、血液、呼吸道粘液如痰液或鼻腔粘液、细胞、病毒、蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸、适体、核苷，优选为血液和呼吸道粘液，如痰液或鼻 腔粘液)和/或可与其结合的磁性或非磁性颗粒，优选的，所述样品或颗粒的尺寸为约0.01μm到约100μm，优选是约0.05μm到约20μm，例如是约0.5μm到约10μm。
  11. 一种提纯和/或检测溶液样品中的靶物质的设备，其包括：
    如权利要求1-10中任一项定义的装置，其具有容纳溶液的腔体和在所述腔体内的相对设置的超高频体声波谐振器，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波，在溶液产生旋流。
  12. 如权利要求11所述的设备，其包括以下模块中的一个或多个：样本裂解模块、靶物质结合模块、靶物质清洗模块、靶物质洗脱模块，
    优选的，所述设备设置为所述样本裂解模块、靶物质结合模块、靶物质清洗模块和靶物质洗脱模块中的一个或其任意组合或全部四个都为同一个腔体，所述腔体具有所述相对设置的超高频体声波谐振器。
  13. 如权利要求11或12所述的设备，其为用于检测溶液样品中的靶物质的系统，其还包括：
    检测装置，其对靶物质携带的可识别的标记进行检测，包括但不限于荧光或其它形式的(例如化学发光，生物发光，辐射发光，电发光，电化学发光，机械发光，结晶发光，热致发光，声致发光，磷光和光致发光等)发光，酶促反应，放射性等。
  14. 如权利要求11或12所述的设备，其为用于扩增和检测溶液样品中的靶物质的系统，其还包括：
    核酸扩增模块；核酸扩增模块为适合以任何方式进行核酸扩增的模块，包括但不限于各种恒温扩增或PCR，例如qPCR(荧光定量PCR)、RT-PCR、热启动PCR、巢式PCR、多重PCR、复原条件PCR、dsRNA合成、COLD-PCR、数字PCR等。
    和
    检测装置，其对靶物质携带的可识别的标记进行检测，包括但不限于荧光或其它形式的(例如化学发光，生物发光，辐射发光，电发光，电化学发光，机械发光，结晶发光，热致发光，声致发光，磷光和光致发光等)发光，酶促反应，放射性等。
  15. 一种处理溶液中样品的方法，所述方法包括，在容纳溶液的腔体内利用相对设置的超高频体声波谐振器产生体声波，在溶液产生旋流，对溶液中的样品进行混合，其中所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波，
    优选的，
    在溶液产生旋流以对溶液中的样品进行混合的体声波的功率范围为约100mW以上，优选为约150-3000mW，更优选为约200-2000mW，例如为约400-800mW。
  16. 如权利要求15所述的方法，其中还包括：所述相对设置的超高频体声波谐振器中的其中一个谐振器不工作，其对应的设置在相对方向的谐振器工作，产生体声波，使得体声波区域的溶液产生旋流，溶液中的样品或样品包含的靶物质或结合了所述靶物质的颗粒聚集到旋流中，
    优选的：
    单个体声波谐振器在溶液产生旋流以使得溶液中的样品/靶物质/颗粒聚集的体声波的功率范围为约0.01-20mW，优选为0.1-10mW，更优选为0.5-5mW。
  17. 如权利要求15或16所述的方法，其中所述样品为生物样品(例如体液、血液、细胞、病毒、蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸、适体、核苷，优选为血液和呼吸道粘液，如痰液或鼻腔粘液)。
  18. 如权利要求15或16所述的方法，其中所述溶液中含有可与样品/靶物质结合的磁性或非磁性颗粒，优选的，所述样品或颗粒的尺寸为约0.01μm到约100μm，优选是约0.05μm到约20μm，例如是约0.5μm到约10μm。
  19. 如权利要求15或16所述的方法，其中所述溶液体积为约20微升-1.0毫升，优选为约50微升-500微升，更优选为约100微升-200微升。
  20. 用于权利要求15-19中任一项所述的处理溶液中样品的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
    容纳溶液的腔体和设置在腔体内的相对设置的超高频体声波谐振器，所述谐振器可产生体声波，在溶液产生旋流，对溶液中的样品进行混合或 富集，其中所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波；
    优选的，其包含可与样品或样品中的靶物质(例如核酸)结合的磁性或非磁性颗粒，优选的，所述样品或颗粒的尺寸为约0.01μm到约100μm，优选是约0.05μm到约20μm，例如是约0.5μm到约10μm。
PCT/CN2020/110865 2019-08-23 2020-08-24 溶液样品处理装置、设备和系统以及其用途 WO2021037002A1 (zh)

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