WO2021025582A1 - Штамм гриба fusarium equiseti д-117 - Google Patents

Штамм гриба fusarium equiseti д-117 Download PDF

Info

Publication number
WO2021025582A1
WO2021025582A1 PCT/RU2019/000634 RU2019000634W WO2021025582A1 WO 2021025582 A1 WO2021025582 A1 WO 2021025582A1 RU 2019000634 W RU2019000634 W RU 2019000634W WO 2021025582 A1 WO2021025582 A1 WO 2021025582A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
soil
plants
producer
metabolites
culture medium
Prior art date
Application number
PCT/RU2019/000634
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Святослав Петрович ФЕОКТИСТОВ
Original Assignee
Святослав Петрович ФЕОКТИСТОВ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Святослав Петрович ФЕОКТИСТОВ filed Critical Святослав Петрович ФЕОКТИСТОВ
Publication of WO2021025582A1 publication Critical patent/WO2021025582A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Definitions

  • the invention relates to a selectively obtained strain of the fungus Fusarium equiseti D -117, which is a producer of a wide range of active compounds that have an antagonistic effect on root rot pathogens, reducing the content of toxic substances: herbicides, pesticides and heavy metal salts in the soil, eliminating the toxic effect of herbicides, pesticides and other chemicals on the population of soil microflora and plants, increasing the growth and activity of soil microflora, including after chemical soil treatment, increasing the formation and rate of accumulation of organic substances in the soil, increasing the concentration and activity of soil enzymes in the soil, restoring and protecting the fertile layer soil from destruction. And the creation on the basis of its metabolites of the enzyme preparation "Agroflorin".
  • the Fusarium equiseti D - 117 strain was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms under the registration number VKPM F-1455 and can be used to create biological products for agriculture on the basis of its active metabolites.
  • the invention makes it possible to obtain, during the cultivation of the producer, active compounds of metabolites in the native solution of the filtrate of the culture medium of the producer and to create on their basis biological products exhibiting antagonistic activity against pathogens of root rot, neutralizing the toxic effect of pesticides, herbicides on soil microflora and plants, reducing the content of salts of heavy metals in the soil that increase the formation and rate of accumulation of organic matter, the concentration and activity of soil enzymes in the soil and restore the fertile soil layer.
  • soil mineralization sharply increases, the content of carbon and nutrients decreases, the mobility of soil-forming elements and their leaching increase, which leads to the degradation and destruction of the soil cover and the destruction of the humus (fertile) soil layer.
  • this group of biological products has a number of significant disadvantages: they are not stable and very sensitive to changes in temperature, humidity and soil conditions and have a short period of action (the life of colonies of microorganisms is up to 2 weeks).
  • the effectiveness and spectrum of action of biological products based on living microorganisms is very low, since bacteria have a narrow set and low concentrations of the metabolites produced, which makes them ineffective and economically unprofitable. Therefore, to increase the efficiency of biological products, it is advisable to use ready-made active metabolites, rather than living microorganisms.
  • the presented data of scientific and laboratory studies reliably confirm the claimed biological effects and actions of metabolites of the native solution of the culture medium filtrate produced by the Fusarium equiseti D-117 fungus strain, consisting in the fact that metabolites of the native filtrate of the producer's culture medium have an antagonistic effect on pathogens of root rot, reduce the content of salts of heavy metals in the soil, eliminate the toxic effect of herbicides, pesticides and other chemicals on the state and activity of soil microflora and plants, increase the formation and rate accumulation of organic substances, increase the concentration and activity of soil enzymes in the soil, enhance the biochemical reactions in the soil and plants, improve the bioavailability and assimilation of nutrients by plants.
  • the invention relates to a method and technology for the cultivation of a producer of active metabolites, including organic acids and gibberellins, of a new selection strain of the fungus Fusarium equiseti D-117 and consists in growing the producer on a liquid nutrient medium, in which, in order to increase the synthesis of gibberellins, increase the filtration rate of the culture liquid and reducing the cost of the medium, a combination of glucose and beet molasses is used as the main source of glucose, which simultaneously stimulates the synthesis of gibberellins, and ammonium nitrate is the main source of organic nitrogen, with the following ratios: beet molasses 40.0-60.0 g / l, glucose 4, 0-7.0 g / l ammonium nitrate 0.6-0.8 g / l; potassium phosphate 3.0-6.0 g / l, trace elements 0.25-1.0 mg / l, balanced amount of water.
  • the cultivation process is carried out for 36-48 hours at a temperature of 22 + 1 C and until the content of reducing substances in the culture medium is 0.9-1.5%, which makes it possible to obtain significant concentrations of active metabolites, including organic acids and gibberellic acid. in the native filtrate of the culture medium, significantly increase the rate of filtration of the culture fluid and, as a consequence, significantly reduce the production cost of the drug.
  • the conducted studies of the nutritional requirements of the culture of the selection strain of the fungus made it possible to determine the optimal concentration of nutrient medium components, to determine the optimal time and temperature of the cultivation of the strain, with the achievement of significant concentrations of active metabolites in the native filtrate of the culture medium and an increase in the filtration rate of the culture fluid up to 110 ml per minute compared to other nutrient media. This allows you to significantly reduce the cost of manufacturing drugs.
  • the optimal cultivation time of the fungus was determined, which was 36-48 hours and ensured the achievement of maximum concentrations and the ratio of metabolites in the native filtrate of the culture medium, which was confirmed in a number of scientific experiments carried out at the All-Russian Research Institute of Plant Industry named after V.I. I. V. Michurina.
  • FIG. 5 Photosynthetic activity of apple rootstocks leaves under the influence of stressors.
  • FIG. 6 Intensity of photosynthesis of leaves of apple tree rootstocks when exposed to stressors.
  • the stomatal conductivity of leaves also largely depended on the impact of stress factors of high soil moisture and drought.
  • the high temperature of the leaf blade also negatively affects all physiological processes, and therefore this indicator was not measured.
  • the temperature of the leaf blade of the treated plants was 1-1.5 ° C lower than the control in the “overmoistening” variant and by 1.7-2.2 ° C in the “drought” variant (Fig. 3).
  • the stomatal conductance of the leaves of the treated plants exceeded the control by 3.2-4.7 times in the “overmoistening” variant and by 1.1-1.5 times in the “drought” variant.
  • the most effective were the concentration of metabolites in the native solution of the culture medium filtrate in the variants of the producer's cultivation for 48 and 36 hours (Fig. 7).
  • FIG. 8 Anatomical structure of the leaf blade of apple rootstocks when exposed to stressors.
  • the proposed method of cultivating a producer of active metabolites, including organic acids and gibberellins, a selection strain of the fungus Fusarium equiseti D-117 consists in growing the producer on a liquid nutrient medium containing the main components with the following optimal ratio: beet molasses 40.0-60.0 g / l; glucose 4.0-7.0 g / l; ammonium nitrate 0.6-0.8 g / l; potassium phosphate 0.3-0.5 g / l; microelements 0.25-1.0 mg / l, balance amount of water, pH 5, 5-6, 2.
  • the content of active metabolites in the native filtrate of the culture liquid is: mass fraction of dry residue 1.5-1, 7; mass fraction of protein 2, 5-3, 5; mass fraction of carbohydrates 13.0-15.0; mass fraction of fat 0.05; balance amount of water up to 100.0.
  • the concentration of organic acids and gibberellins in the culture solution is 9.0-10.9 g / l and 2850-3650 ⁇ g / ml, respectively.
  • the filterability of the culture liquid (by the amount of the resulting native solution) per unit time is 95-110 ml / min.
  • the optimal cultivation time for the producer is 36 - 48 hours.
  • the seed mycelium for the working fermentation apparatus is grown first in test tubes on a solid nutrient medium (wort agar), then in flasks on a rocking chair in a liquid nutrient medium and then in an inoculator under the following technological regime: temperature 24 ⁇ 2 ⁇ ; pH 5, 5-6, 2; aeration 1 m3 / m3 / min.
  • a solid nutrient medium wort agar
  • pH 5, 5-6, 2 aeration 1 m3 / m3 / min.
  • rocking flasks with a capacity of 550 ml with 100 ml of sterile nutrient medium of the following composition: sugar beet molasses 4.0 g; glucose 0.4 g; ammonium nitrate 0.3 g; monosubstituted potassium phosphate 0.2 g; pH 6.0, inoculated with agar culture blocks from test tubes.
  • the seed culture is grown on a rocking chair at a temperature of 24-26 C for 20-24 hours and is used for seeding a production seeding apparatus.
  • the seed is considered ready when the concentration of dry matter of the mycelium in the culture medium reaches 12-15 g / l. 5-10 volume percent of such a medium serves as inoculum, which is transferred aseptically into a working fermentation apparatus.
  • a sowing apparatus with a capacity of 1500 l with 1000 l of sterile nutrient medium of the following composition (g / l): sugar beet molasses 40.0; glucose 4.0; ammonium nitrate 0.6; potassium phosphate monobasic 3.0; microelements 25.0, pH 6.0, 5-10 volume percent of the culture medium, which is the seed material, is introduced from the inoculator.
  • the fermentation process is carried out by the method of submerged cultivation at a temperature of 22 ⁇ 1 C without mechanical stirring and with aeration of 600 cubic meters. m / h for 36 hours.
  • the culture liquid is fed to a filter press to separate the biomass.
  • the next stage of the technological process is the thickening of the culture medium using vacuum filtering devices.
  • the amount of the finished enzyme preparation obtained is 1000 liters.
  • the content of active metabolites in the finished product is (wt%): mass fraction of dry residue 1.5; mass fraction of protein 2.5; mass fraction of carbohydrates 15.0; mass fraction of fat 0.05; the rest is water up to 100.0.
  • the concentration of organic acids and gibberellins in the native solution is 9.5 g / l and 2850 ⁇ g / ml, respectively.
  • the filterability of the culture liquid (by the amount of the resulting native solution) per unit time is 95 ml / min.
  • the cultivation time is 36 hours.
  • the seed mycelium for the working fermentation apparatus is grown first in test tubes on a solid nutrient medium (wort agar), then in flasks on a rocking chair in a liquid nutrient medium and then in an inoculator under the following technological regime: temperature 24 ⁇ 2 ⁇ ; pH 5, 5-6, 2; aeration 1 m3 / m3 / min.
  • a solid nutrient medium wort agar
  • pH 5, 5-6, 2 aeration 1 m3 / m3 / min.
  • agar culture blocks from test tubes For the preparation of the seed culture, he pumped 550 ml in-person flasks with 100 ml of sterile nutrient medium of the following composition: maltose 2.6 g; ammonium nitrate 0.5 g; monosubstituted potassium phosphate 0.3 g; pH 5, 8, -6, 2 are inoculated with agar culture blocks from test tubes.
  • the seed culture is grown on a rocking chair at a temperature of 24-26 C for 20-24 hours and is used for seeding a production seeding apparatus. Further, 5-10 volume percent of such a medium serves as inoculum, which, in compliance with the rules of asepsis, is transferred into a working fermentation apparatus.
  • the mycelium of the fungus was grown under submerged cultivation in a fermentation apparatus with a volume of 1500 l, using 1000 l of the following nutrient medium (g / l): sugar beet molasses 60.0; glucose 7.0; ammonium nitrate 0.5; potassium phosphate monobasic 3.0; microelements 28.0; pH 6.2.
  • the seed was applied in an amount of 5 percent by volume.
  • the cultivation temperature is 22 ⁇ 1 ° C, the cultivation time is 48 hours.
  • the preparation thus obtained had the following composition (wt%): mass fraction of dry residue 1.7; mass fraction of protein 3.5; mass fraction of carbohydrates 13.0; mass fraction of fat 0.05; the rest leading to 100.0.
  • the concentration of organic acids and gibberellins in the native solution is 10.9 g / l and 3650 ⁇ g / ml, respectively.
  • the filterability of the culture liquid (by the amount of the resulting native solution) per unit time is 110 ml / min.
  • the enzyme preparation "Agroflorin” is characterized by a high content for natural compounds and a unique ratio of biologically active compounds: proteins (polypeptides, enzymes), carbohydrates
  • the enzyme preparation "Agroflorin” contains a large number of amino acids, including essential amino acids (table 8).
  • the composition of the preparation "Agroflorin” includes vitamins of group B, folic and niacin (table 11).
  • the mineral composition of the enzyme preparation "Agroflorin” is represented by macro- and microelements important for plants (table 10).
  • Agroflorin is a catalyst for biochemical reactions occurring in soil and plants and is designed to protect and restore the activity of a population of useful soil microflora after chemical soil treatment (for example, the use of nematicides, soil herbicides, etc.), to neutralize the toxic effects of pesticides, herbicides, to reduce the concentration of toxic chemicals and salts of heavy metals in the soil, to restore the fertile (humus) soil layer, to prevent the development of root rot and other phytopathogens, to accelerate the decomposition of plant residues in the surface soil layer, to protect and restore the mulching soil layer, to protect the soil from the formation of a soil crust; to improve the structure of the soil and increase the resistance of the soil to salinization and cleaning the soil from salts of heavy metals.
  • FIG. 1 Influence of the enzyme preparation "Agroflorin" on the yield
  • the action of the drug lasts 4-6 months in a wide temperature range - +1 ... + 50 ° C. While biological products are not stable and very sensitive to changes in temperature, humidity and soil conditions.
  • the duration of action of biological products is short (the life of colonies of microorganisms is up to 2 weeks).
  • the seed mycelium of the selection strain of the fungus for the working fermentation apparatus is grown first in test tubes on a solid nutrient medium (wort agar), then in flasks on a rocking chair in a liquid nutrient medium and then in an inoculator with the following technological regime: temperature 24 ⁇ 2 ⁇ ; pH 6.0; aeration 1 m3 / m3 / min.
  • rocking flasks with a capacity of 550 ml with 100 ml of sterile nutrient medium of the following composition: sugar beet molasses 4.0 g; glucose 0.4 g; ammonium nitrate 0.3 g; monosubstituted potassium phosphate 0.2 g; pH 6.0, inoculated with agar culture blocks from test tubes.
  • the seed culture is grown on a rocking chair at a temperature of 24-26 C for 20-24 hours and is used for seeding a production seeding apparatus.
  • the seed is considered ready when the concentration of dry matter of the mycelium in the culture medium reaches 12-15 g / l. 5-10 volume percent of such a medium serves as inoculum, which is transferred aseptically into a working fermentation apparatus.
  • a sowing apparatus with a capacity of 1500 l with 1000 l of sterile nutrient medium of the following composition (g / l): sugar beet molasses 40.0; glucose 4.0; ammonium nitrate 0.6; potassium phosphate monobasic 3.0; microelements 25.0; pH 6.0, 5-10 volume percent of the culture medium, which is the seed material, is introduced from the inoculator.
  • the fermentation process is carried out by the method of submerged cultivation at 22 ⁇ 1 C without mechanical stirring and with aeration of 600 cubic meters. m / h for 36 hours.
  • the native solution of the culture liquid is fed to a filter press to separate the biomass.
  • the next stage of the technological process is the addition of boric acid to the native solution of the filtrate of the culture medium at the rate of 2-4 mg / l. and thickening the native culture medium filtrate solution using vacuum filtering apparatus.
  • the native solution of the culture medium filtrate is characterized by the content of organic acids, dry substances, pH value.
  • the amount of the finished enzyme preparation obtained is 1000 liters.
  • the content of active metabolites in the finished product is (wt%): mass fraction of dry residue 1.5; mass fraction of protein 2.5; mass fraction of carbohydrates 15.0; mass fraction of fat 0.05; the rest is water up to 100.0.
  • the concentration of organic acids and gibberellins in the finished product is 9.5 g / l and 2850 ⁇ g / ml, respectively.
  • the cultivation time is 36 hours.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, а именно, к штамму гриба Fusarium equiseti Д-117 для создания на его основе активных метаболитов биопрепаратов для сельского хозяйства, способу культивирования продуцента активных метаболитов Fusarium equiseti Д-117 и биопрепарату, полученному данным способом. Способ заключается в выращивании продуцента на жидкой питательной среде, содержащей питательные компоненты: меласса свекловичная, глюкоза, аммоний азотнокислый, фосфат калия, микроэлементы, балансное количество воды. Процесс культивирования осуществляется в течение 36-48 часов при температуре 22±1°С, pH 5, 5-6, 2 и до содержания редуцирующих веществ в культуральной среде 0,9- 1,5 мае %. Метаболиты нативного фильтрата культуральной среды продуцента оказывают антагонистическое действие на возбудителей корневой гнили, снижают содержание солей тяжелых металлов в почве, устраняют токсическое действие гербицидов, пестицидов и других химических веществ на состояние и активность почвенной микрофлоры и растения, повышают образование и скорость накопления органических веществ, повышают концентрацию и активность почвенных ферментов в почве, усиливают биохимические реакции в почве и растениях, улучшают биодоступность и усвояемость питательных веществ растениями.

Description

ШТАММ ГРИБА FUSARIUM EQUISETI Д-117
Описа ние.
Изобретение относится к полученному селекционным путем штамму гриба Fusarium equiseti Д -117, являющийся продуцентом широкого спектра активных соединений, оказывающих антагонистическое действие на возбудителей корневой гнили, снижающие содержание токсических веществ: гербицидов, пестицидов и солей тяжелых металлов в почве, устраняющие токсическое действие гербицидов, пестицидов и др. химических веществ на популяцию почвенной микрофлоры и растения, повышающие рост и активность микрофлоры почвы в том числе после химической обработки почвы, повышающие образование и скорость накопления органических веществ в почве, повышающие концентрацию и активность почвенных ферментов в почве, восстанавливающие и защищающие плодородный слой почвы от разрушения. И создание на основе его метаболитов ферментного препарата «Агрофлорин».
Штамм Fusarium equiseti Д - 117 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1455 и может быть использован для создания на основе его активных метаболитов биопрепаратов для сельского хозяйства.
Изобретение позволяет получать в процессе культивирования продуцента активные соединения метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды продуцента и создавать на их основе биопрепараты проявляющие антагонистическую активность против возбудителей корневой гнили, нейтрализующие токсическое действие пестицидов, гербицидов на почвенную микрофлору и растения, уменьшающие содержание солей тяжелых металлов в почве, повышающие образование и скорость накопления органических веществ, концентраций и активность почвенных ферментов в почве и восстанавливающие плодородный слой почвы. Актуальность проблемы
Ежегодно увеличивающийся рост использования пестицидов, минеральных удобрений и химических средств защиты растений в сельском хозяйстве в ущерб экологии и здравому смыслу ведет к антропогенным разрушительным последствиям (Добровольский Г.В. "Тихий кризис планеты", Вестник Российской академии наук, 1997, т. 67, N° 4, с. 313-320):
• Разрушается почва и уничтожается гумусный (плодородный) слой.
В результате применения пестицидов и минеральных удобрений резко растет минерализация почв, снижается содержание углерода и питательных веществ, увеличивается подвижность почвообразующих элементов и их вымывание, что приводит к деградации и разрушению почвенного покрова и уничтожению гумусного (плодородного) слоя почвы.
• Разрушается естественная биоцинозная система почв. Использование в сельском хозяйстве химических препаратов приводит к резкому снижению численности специфической сапротрофной почвенной микрофлоры. И как следствие этого к резкому снижению в почве концентраций и активности почвенных ферментов, ухудшению условий иммобилизации различных ферментов и резкому снижению содержания в почве органических соединений, таких как углеводы, фосфорорганические и азоторганические соединения, являющиеся основными носителями молекул внеклеточных ферментов, участвующих в почвенных биохимических обменных процессах. В результате этого резко замедляются процессы разложения растительных остатков, органических удобрений, пестицидов и других химических веществ, что приводит к накоплению в почве лигнина, фенолов, других фитотоксинов и солей тяжелых металлов.
• Увеличивается рост фитопатогенной флоры и накопление токсических веществ в почве и растениях.
Нарушение равновесия, гибель и угнетение активности полезной почвенной микрофлоры приводят к утомлению и истощению почв, снижению активности биохимических обменных процессов, накоплению в почве токсических веществ, что создает благоприятные условия для роста и развития корневой гнили, патогенных грибов и других фитопатогенов. В результате чего растет поражаемость сельскохозяйственных культур и посевного материала фитопатогенами, фитотоксинами и корневой гнилью, резко падает урожайность сельскохозяйственных культур и снижается рентабельность сельскохозяйственного производства.
Новизна изобретения.
В сложившихся условиях для восстановления почв, повышения качества сельхозпродукции и борьбы с фитопатогенной флорой возникает необходимость создания и использования в сельскохозяйственном производстве биопрепаратов (биологических средств защиты, биоудобрений, ферментных препаратов) не наносящих вред растениям, животным и человеку, которые позволяют создать оптимальный баланс между показателями экологичности, экономичности и энергоэффективности агропроизводства. На данном этапе их основу в основном составляют биопрепараты на основе живых бактерий или продуктов их жизнедеятельности.
Однако данная группа биопрепаратов имеет ряд значительных недостатков: они не устойчивы и очень чувствительны к изменениям температур, влажности и состоянию почв и имеют короткий период действия (срок жизни колоний микроорганизмов составляет до 2 недель). Эффективность и спектр действия биопрепаратов на основе живых микроорганизмов очень мала, так как бактерии имеют узкий набор и малые концентрации продуцируемых метаболитов, что делает их малоэффективными и экономически не выгодными. Поэтому, для повышения эффективности действия биопрепаратов целесообразно использовать готовые активные метаболиты, а не живые микроорганизмы.
Наиболее эффективными оказываются активные метаболиты грибов, так как метаболическая активность грибов, набор и концентрации синтезируемых ими метаболитов в десятки раз превышает возможности других микроорганизмов, в том числе бактерий. При этом, биологическая активность метаболитов практически не зависит от состояния почв и температуры окружающей среды. Что делает их более экономически выгодными, более эффективными и удобными для применения. Кроме того, по сравнению с бактериями, метаболиты грибов оказывают более широкий спектр биологического действия и способны подавлять рост и развитие фитопатогенной флоры, в том числе патогенных грибов. По данным ряда авторов: Зубейру (1995, 1997), Шкаликов (1995), Моисеева (1997), Хашим (2000), Дорофеев В. А (2001) была показана антагонистическая активность ряда грибов против корневой гнили.
В последние годы опубликовано большое количество исследований, доказывающих эффективность использования в качестве компонентов биопрепаратов белки и аминокислоты. Внесение аминокислот в почву рассматривается как одно из наиболее перспективных направлений оптимизации минерального питания растений и повышения их устойчивости к действию стрессовых факторов внешней среды. Кроме того, растения способны так же усваивать такие сложные органические соединения, как полипептиды, полисахариды, витамины, сахара, органические кислоты, ферменты и др. (Пилыцикова Н.В. "Физиология растений с основами микробиологии" 2004).
В литературе имеются сведения об участии высокомолекулярных соединений (полипептидов, ферментов, полисахаридов) различных микроорганизмов во взаимоотношениях с растениями (Морозова 1990, Duijiff 1994, Фиофилова 1994, Nihei 1998). Из научных исследований известно, что белки, ферменты, полисахариды, фитогормоны и другие активные соединения, выделенные из микроорганизмов, в том числе из грибов положительно влияют на физиологию растений (Г.Н. Чупахина, А.Ю. Романчук. Возможный механизм стимулирования ростовых процессов янтарной кислотой. 1999, Емельянова Е. П. Влияние ауксинов на укоренение растений.) Основываясь на научных данных и в ходе проведения научных работ, был получен селекционным путем новый штамм гриба Fusarium equiseti Д - 117. Данный селекционный штамм гриба обладает высокой ферментативной активностью и широким спектром продуцируемых активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллинов. Метаболиты нативного раствора фильтрата культуральной среды данного штамма гриба проявляют высокую биологическую активность на почвообразующие процессы, а также проявляют высокую антагонистическую активность в отношении корневой гнили и других фитопатогенных грибов, что было изучено и показано в ряде научных исследований, проведенных в ведущих научных центрах страны.
Для оценки продуктивности нового штамма, как продуцента биологически активных метаболитов нами был исследован химический состав нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцента (таблица 1). Показано, что в его состав входят белки (полипептиды, ферменты), аминокислоты, углеводы (полисахариды), жиры, большое количество органических кислот, витамины группы В, комплекс микро- и макроэлементов в виде органических соединений (таблица 2-4).
Таблица 1
Figure imgf000007_0001
Таблица 2
Figure imgf000007_0002
Таблица 3
Figure imgf000007_0003
Figure imgf000008_0001
Таблица 4
Figure imgf000008_0002
Таким образом, представленные данные лабораторных исследований нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцента подтверждают, что штамм гриба Fusarium equiseti Д-117 в процессе своего роста продуцирует большое количество активных соединений: белков (полипептидов, ферментов), углеводов (полисахаридов), аминокислот, витаминов, органических кислот и гиббереллинов, а также микро и макроэлементов.
Нами впервые было изучено и показано эффективное положительное действие метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцируемые новым селекционным штаммом гриба Fusarium equiseti Д -117 по защите популяции почвенной микрофлоры и восстановлении ее активности после токсического действия гербицидов, пестицидов и др. химических веществ, по снижению содержания в почве солей тяжелых металлов, на подавление роста и развития фитопатогенной флоры, в том числе корневых гнилей. А также, было показано их действие на повышение органической составляющей почвы, активацию биохимических реакций в почве и растениях и восстановления гумусного (плодородного) слой почвы. Что было показано в ряде научных исследований, проведенных в ведущих научных центрах страны.
Из материалов научного исследования, проведенного во Всероссийском Научно-Исследовательском Институте Биологической Защиты Растений: фиг. 1.
«При исследовании образцов почв, обработанных гербицидным препаратом, наибольшее количество полезной почвенной микрофлоры было выделено в образцах почв, с применением активных метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды штамма гриба Fusarium equiseti Д-117 и составило 65,5%. В первом контрольном варианте почвенных образцов (не обработанных гербицидом препаратом) данный показатель составил 13,4%, а во втором контрольном варианте почвенных образцов (обработанных гербицидом) данный показатель составил 7,2%. В то же время максимальное количество патогенных грибов, свидетельствующих об утомленности почв (Penicillium и Aspergillus), было отмечено в варианте с применением гербицида - 84,5 %. В контрольном, варианте с применением метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды количество указанных грибов было на уровне 23 %».
Полученные результаты исследования состояния микрофлоры почвенных образцов, обработанные метаболитами нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцируемые штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117, достоверно указывают на восстановление (сохранение) и активацию почвенной микрофлоры после обработки гербицидом и свидетельствует об отсутствии токсического и угнетающего действия гербицида на почвенную микрофлору и биологическое состояние почвы в целом. А также, достоверно показывают угнетающее действие метаболитов, продуцируемые штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117 на рост и развитие патогенных грибов.
Из материалов научно-лабораторных исследований, проведенного в Мадридском Политехническом Университете и Центральной Испытательной лаборатории ФГБУ ГЦАС: «Так однократное внесение активных метаболитов продуцента в почвенные образцы позволило повысить концентрацию органических веществ в почве в 2,3 раза по отношению к контролю и значительно снизить концентрации солей свинца и кадмия в почве (фиг. 2 и 3).
Данные анализа почвенных образцов, полученных под действием метаболитов (ферментов) продуцируемых штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117 достоверно свидетельствуют об их существенной роли на трансформацию и снижение содержания солей тяжелых металлов в почве и повышению концентрации органического вещества в почвенных образцах.
Из материалов научно-полевых исследований, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И. В Мичурина: фиг. 4
«Так спустя 15 дней после внесения метаболитов продуцента в почву все элементы качества (Р, К, Mg, Са), отвечающие за полноценное развитие растений оказались выше, чем перед внесением. Так внесенные метаболиты способствовали увеличению содержания в листьях фосфора на 32 пункта, калия - на 192, кальция - на 84, магния - на 51. Анализ проведен на сертифицированном экспресс оборудовании «Аквадонис».
Данные анализа растительных образцов, полученные под действием метаболитов продуцента на трансформацию элементов питания в почве, свидетельствуют о существенной роли ферментов нативного фильтрата культуральной среды, продуцируемые данным штаммом гриба в активации биохимических реакций в почве и растениях и оптимизации минерального питания растений.
«Полученные в ходе научного исследования данные достоверно свидетельствуют, что внесение метаболитов продуцента в почву: повышает образование и скорость накопления (концентрации) полезных органических веществ и микроэлементов в почве и растениях. Значительно повышается концентрация и активность почвенных ферментов, увеличивается способность иммобилизовать молекулы внеклеточных ферментов, тем самым существенно увеличивается скорость течения биохимических реакций и процессов в почве и растениях и значительно повышается био доступность и усвояемость питательных веществ растениями».
Таким образом, представленные данные проведенных научных и лабораторных исследований достоверно подтверждают заявляемые биологические эффекты и действия метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцируемые штаммом гриба Fusarium equiseti Д-117, заключающиеся в том, что метаболиты нативного фильтрата культуральной среды продуцента, оказывают антагонистическое действие на возбудителей корневой гнили, снижают содержание солей тяжелых металлов в почве, устраняют токсическое действие гербицидов, пестицидов и др. химических веществ на состояние и активность почвенной микрофлоры и растения, повышают образование и скорость накопления органических веществ, повышают концентрацию и активность почвенных ферментов в почве, усиливают биохимические реакции протекающие в почве и растениях, улучшают био доступность и усвояемость питательных веществ растениями.
Практическая ценность работы
Изобретение относится к способу и технологии культивирования продуцента активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллинов, нового селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д-117 и заключается в выращивании продуцента на жидкой питательной среде, в которой с целью повышения синтеза гиббереллинов, увеличения скорости фильтрации культуральной жидкости и снижения себестоимости среды, в качестве основного источника глюкозы используют комбинацию глюкозы и свекловичной мелассы, являющуюся одновременно стимулятором синтеза гиббереллинов, а в качестве основного источника органического азота - аммоний азотнокислый, при следующих соотношениях: меласса свекловичная 40,0-60,0 г/л, глюкоза 4, 0-7,0 г/л аммоний азотнокислый 0,6-0, 8 г/л; фосфат калия 3, 0-6,0 г/л, микроэлементы 0,25-1,0 мг/л, балансное количество воды. При этом процесс культивирования осуществляется в течении 36-48 часов при температуре 22+1 С и до содержания редуцирующих веществ в культуральной среде 0,9- 1,5%, что позволяет получить значимые концентрации активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллиновой кислоты в нативном фильтрате культуральной среды, значительно увеличить скорость фильтрации культуральной жидкости и как следствие этого, значительно снизить себестоимость производства препарата.
Известно, что вегетативный рост грибов и их продуктивность можно эффективно регулировать источниками питания. В любой питательной среде для грибов значительную роль играют источник углерода и азота, а также их концентрации. В ходе изучения вегетативных особенностей нового штамма гриба, был определен наиболее эффективный источник углерода и азота, и их оптимальные концентрации, обеспечивающие максимальный рост биомассы мицелия гриба и высокий синтеза активных метаболитов (таблица 5 и 6).
Таблица 5
Figure imgf000012_0001
Таблица 6
Figure imgf000012_0002
Анализ полученных данных показал, что наиболее эффективным источником углеводов для максимального роста грибного мицелия является комбинация мелассы свекловичной и глюкозы. Оптимальными для роста мицелия гриба оказались соотношения концентраций мелассы 40,0-60,0 г/л и глюкозы - 4, 0-7,0 г/л и органического азота - 0,6-0, 8 г/л. При этом было отмечено, что, максимальный рост мицелия (набор биомассы мицелия) наблюдался на 2 сутки. А интенсивность лизиса мицелия наблюдалась на 4-6 сутки культивирования и находилась в прямой зависимости от времени и температуры культивирования. В других вариантах мицелий гриба находился в стадии активного роста до конца эксперимента.
Таким образом, проведенные исследования питательной потребности культуры селекционного штамма гриба позволили определить оптимальные концентрации компонентов питательной среды, определить оптимальные сроки и температуру культивации штамма, с достижением значимых концентраций активных метаболитов в нативном фильтрате культуральной среды и увеличением скорости фильтрации культуральной жидкости до 110 мл в минуту по сравнению с другими питательными средами. Что позволяет значительно снизить себестоимость производства препаратов.
Анализируя результаты научных исследований вегетативных особенностей штамм гриба Fusarium equiseti Д - 117, было отмечено, что штамм гриба Fusarium equiseti Д-117 на всех стадиях своего развития продуцировал активные метаболиты и гиббереллины, однако в фазу активного роста мицелия, гриб накапливает полипептиды в мицелии и практически не выделяет их в культуральную среду, зато выделял большое количество ферментов, углеводов (полисахаридов), витаминов и органических кислот. А в фазу активного лизиса мицелий выделял в культуральную среду большое количество полипептидов, но при этом его ферментативная активность резко снижалась. Исходя из полученных данных было определено оптимальное время культивации гриба, которое составило 36-48 часов и обеспечивало достижения максимальных концентраций и соотношение метаболитов в нативном фильтрате культуральной среды, что было подтверждено в ряде научных экспериментов, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И. В Мичурина.
В первую очередь была проведена оценка эффективности действия метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды продуцента в зависимости от времени культивирования гриба. В результате проведенного исследования была достоверно показана прямая зависимость эффективности действия различных концентраций метаболитов в нативном фильтрате культуральной среды на растения, подвергнутые воздействию моделированных стрессоров от времени культивирования продуцента. В ходе научного эксперимента было установлено, что не все концентрации метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды продуцента в зависимости от времени культивирования продуцента были одинаково эффективны. Так изучение фотосинтетической активности и интенсивности фотосинтеза показало, что наиболее эффективны были варианты концентраций метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды при культивировании продуцента в интервале 36- 48 часов (фиг. 5 и 6). Фиг. 5 Фотосинтетическая активность листьев подвоев яблони при воздействии стрессоров.
Фиг. 6 Интенсивность фотосинтеза листьев подвоев яблони при воздействии стрессоров.
Так анализ работы фотосистемы листьев показал, что показатель Fv/Fm в вариантах культивирования продуцента в течении 48 и 36 часов (переувлажнение) в среднем за период исследований составил 0,6 и 0,63 отн. ед. соответственно, тогда как в контроле он был 0,42 отн. ед. (что соответствует состоянию близкому к гибели). Подобные показатели, но несколько ниже (0,57 и 0,52 отн. ед. соответственно) отмечены в данных вариантах при воздействии засухи.
Аналогичные результаты были получены и при анализе интенсивности фотосинтеза листьев, однако в данном случае различия с контролем были более существенны - в вариантах 48 и 36 часов искомый показатель превышал контроль более чем в 2 раза.
Устьичная проводимость листьев так же в значительной степени зависела от воздействия стрессовых факторов высокой влажности почвы и засухи. Помимо этого известно, что высокая температура листовой пластинки, также, отрицательно сказывается на всех физиологических процессах в связи с чем на были проведены замеры данного показателя.
На основании проведенных анализов выявлено положительное влияние на растения всех видов обработок. Так температура листовой пластинки обработанных растений была на 1-1,5°С ниже контрольных в варианте «переувлажнение» и на 1,7- 2,2°С - в варианте «засуха» (рис. 3). Устьичная проводимость листьев обработанных растений превышала контроль в 3,2-4, 7 раза в варианте «переувлажнение» и в 1,1 - 1,5 раз в варианте «засуха». По данным показателям, также, наиболее эффективным были концентрации метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды в вариантах культивирования продуцента в течении 48 и 36 часов (Фиг. 7).
Фиг.7. Устьичная проводимость и температура листовой пластинки подвоев яблони при воздействии стрессоров
Значимым показателями состояния растения являются анатомические характеристики листовой пластинки. Применение активных метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды во всех вариантах оказал положительное воздействие и на анатомическую структуру листовой пластинки в опыте с моделированием как переувлажнения, так и засухи. По результатам анализов наиболее эффективными в варианте «переувлажнение» были обработки с концентрациями метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды в вариантах культивирования продуцента в течении 48 и 36 часов (фиг. 8).
Фиг. 8. Анатомическая структура листовой пластинки подвоев яблони при воздействии стрессоров.
Так же, было отмечено увеличение площади листовой пластинки, в варианте переувлажнение при обработке растения концентрациями метаболитов нативного раствора фильтрата культуральной среды с культивацией продуцента в течении 36 и 48 часов, величина данного показателя превысила контроль почти в 2 раза общей площади листовой поверхности, (фиг 10).
Исходя из полученных данных было показано и еще раз подтверждено, что максимальные концентрации и соотношение метаболитов в нативном растворе фильтрата культуральной среды и их положительное влияние на биохимические процессы, протекающие в растения, достигаются при культивировании продуцента в течении 36-48 часов.
Технический регламент производства.
Предлагаемый способ культивирования продуцента активных метаболитов, в том числе органических кислот и гиббереллинов, селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д-117, заключается в выращивании продуцента на жидкой питательной среде содержащей основные компоненты при следующем оптимальном соотношении: меласса свекловичная 40,0-60,0 г/л; глюкоза 4, 0-7,0 г/л; аммоний азотнокислый 0,6-0, 8 г/л; фосфат калия 0,3-0, 5 г/л; микроэлементы 0,25-1,0 мг/л, балансовое количество воды, pH 5, 5-6, 2. При этом содержание активных метаболитов в нативном фильтрате культуральной жидкости составляет: массовая доля сухого остатка 1,5-1, 7; массовая доля белка 2, 5-3, 5; массовая доля углеводов 13,0-15,0; массовая доля жиров 0,05; балансовое количество воды до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в культуральном растворе составляет соответственно 9,0-10,9 г/л и 2850-3650 мкг/мл. Фильтруемость культуральной жидкости (по количеству образующегося нативного раствора) в единицу времени составляет 95- 110 мл/мин. Оптимальное время культивации продуцента составляет 36 - 48 часов. Возможность получения препарата указанного состава промышленным способом иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1.
Посевной мицелий для рабочего ферментационного аппарата выращивается сначала в пробирках на твердой питательной среде (сусло-агаре), затем в колбах на качалке в жидкой питательной среде и далее в инокуляторе при следующем технологическом режиме: температура 24±2 С; pH 5, 5-6, 2; аэрация 1 мЗ/мЗ/мин.
Для приготовления посевной культуры качалочные колбы емкостью 550 мл со 100 мл стерильной питательной среды следующего состава: меласса свеклосахарная 4,0 г.; глюкоза 0,4 г.; аммоний азотнокислый 0,3 г.; фосфат калия однозамещенный 0,2 г.; pH 6,0, засевают агаровыми блоками культуры из пробирок. Посевную культуру выращивают на качалке при температуре 24-26 С в течение 20-24 ч и используют для засева производственного посевного аппарата. Посевной материал считается готовым, когда концентрация сухих веществ мицелия в культуральной среде достигает 12-15 г/л. 5-10 объемных процентов такой среды служат посевным материалом, который с соблюдением правил асептики переносится в рабочий ферментационный аппарат.
В посевной аппарат емкостью 1500 л с 1000 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л): меласса свеклосахарная 40,0; глюкоза 4,0; аммоний азотнокислый 0,6; фосфат калия однозамещенного 3,0; микроэлементы 25,0, pH 6,0, из инокулятора вносят 5-10 объемных процентов культуральной среды, являющейся посевным материалом.
Процесс ферментации осуществляют методом глубинного культивирования при температуре 22±1 С без механического перемешивания и при аэрации 600 куб. м/ч в течение 36 часов. По окончании ферментации культуральную жидкость подают на фильтр-пресс для отделения биомассы. Следующей стадией технологического процесса является сгущение культуральной среды с помощью вакуумных фильтрующих аппаратов. Количество полученного готового ферментного препарата составляет 1000 л. При этом содержание активных метаболитов в готовом препарате составляет (масс%): массовая доля сухого остатка 1,5; массовая доля белка 2,5; массовая доля углеводов 15,0; массовая доля жиров 0,05; остальное вода до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в нативном растворе составляет соответственно 9,5 г/л и 2850 мкг/мл. Фильтруемость культуральной жидкости (по количеству образующегося нативного раствора) в единицу времени составляет 95 мл/мин. Время культивации 36 часов.
Пример 2.
Посевной мицелий для рабочего ферментационного аппарата выращивается сначала в пробирках на твердой питательной среде (сусло-агаре), затем в колбах на качалке в жидкой питательной среде и далее в инокуляторе при следующем технологическом режиме: температура 24±2 С; pH 5, 5-6, 2; аэрация 1 мЗ/мЗ/мин.
Для приготовления посевной культуры качал очные колбы емкостью 550 мл со 100 мл стерильной питательной среды следующего состава: мальтоза 2,6 г.; аммоний азотнокислый 0,5 г.; фосфат калия однозамещенный 0,3 г.; pH 5, 8, -6, 2 засевают агаровыми блоками культуры из пробирок. Посевную культуру выращивают на качалке при температуре 24-26 С в течение 20-24 ч и используют для засева производственного посевного аппарата. Далее 5-10 объемных процентов такой среды служат посевным материалом, который с соблюдением правил асептики переносится в рабочий ферментационный аппарат.
Мицелий гриба выращивали в условиях глубинного культивирования в ферментационном аппарате объемом 1500 л, с использованием 1000 л следующей питательной среды (г/л): меласса свеклосахарная 60,0; глюкоза 7,0; аммоний азотнокислый 0,5; фосфат калия однозамещенного 3,0; микроэлементы 28,0; pH 6,2. Посевной материал вносили в количестве 5 объемных процентов. Температура культивирования 22±1оС, продолжительность культивирования 48 часов. Полученный таким образом препарат имел следующий состав (масс%): массовая доля сухого остатка 1,7; массовая доля белка 3,5; массовая доля углеводов 13,0; массовая доля жиров 0,05; остальное водя до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в нативном растворе составляет соответственно 10,9 г/л и 3650 мкг/мл. Фильтруемость культуральной жидкости (по количеству образующегося нативного раствора) в единицу времени составляет 110 мл/мин. Ферментный препарат «Агрофлорин»
Основываясь на проведенных научных работах по изучению нового селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д -117, и его активных метаболитов, оказывающих антагонистическое действие на возбудителей корневой гнили, снижающие содержание токсических веществ: гербицидов, пестицидов и солей тяжелых металлов в почве, устраняющие токсическое действие гербицидов, пестицидов и др. химических веществ на популяцию почвенной микрофлоры и растения, повышающие рост и активность микрофлоры почвы в том числе после химической обработки почвы, повышающие образование и скорость накопления органических веществ в почве, повышающих активность и скорость биохимических реакций протекающих в почве и растениях, восстанавливающие и защищающие плодородный слой почвы от разрушения был создан ферментный препарат «Агрофлорин».
Ферментный препарат «Агрофлорин» характеризуется высоким для природных соединений содержанием и уникальным соотношением биологически активных соединений: белков (полипептидов, ферментов), углеводов
(полисахаридов), жиров и органических кислот (таблица 7 и 9). Ферментный препарат «Агрофлорин» содержит большое количество аминокислот, в том числе незаменимые аминокислоты (таблица 8). В состав препарата «Агрофлорин» входят витамины группы В, фолиевая и никотиновая кислоты (таблица 11). Минеральный состав ферментного препарата «Агрофлорин» представлен важными для растений макро- и микроэлементами (таблица 10).
Таблица 7
Figure imgf000018_0001
Таблица 8
Figure imgf000019_0001
Таблица 9
Figure imgf000019_0002
Таблица 10
Figure imgf000019_0003
Figure imgf000020_0001
Таблица 11 j
Figure imgf000020_0002
Ферментный препарат «Агрофлорин» является катализатором биохимических реакций протекающих в почве и растениях и предназначен для зашиты и восстановления активности популяции полезной почвенной микрофлоры после химической обработки почв (например, применения нематицидов, почвенных гербицидов и др.), для нейтрализации токсического действия пестицидов, гербицидов, для уменьшения концентраций токсических химических веществ и солей тяжелых металлов в почве, для восстановления плодородного (гумусного) слоя почв, для предупреждения развития корневых гнилей и других фитопатогенов, для ускорения процессов разложения растительных остатков в поверхностном слое почвы, для защиты и восстановления мульчирующего слоя почвы, для предохранения почвы от образования почвенной корки; для улучшения структуры почвы и повышения устойчивости почвы к засолению и очистки почв от солей тяжелых металлов. Для восстановления и активации обменных процессов в семенах и растениях. Для улучшения развития корневой и вегетативной частей растения. Нами в первые была изучена и оценена перспективность и эффективность действия ферментного препарата «Агрофлорин» на основе активных метаболитов нового селекционного штамма гриба Fusarium equiseti Д -117 на восстановления почвенной микрофлоры и состояния почв после обработки (гербицидом) и подавлению роста и активности патогенных грибов родов: Cephalosporium, Rizopus, Altemaria, Mucor, Penicillium и Aspergillus, поражающих большинство семян и растений сельскохозяйственных культур и подавляющих полезную почвенную микрофлору (таблица 12-13).
Таблица 12 - Структура почвенных образцов
Figure imgf000021_0001
Таблица 13 - Содержание микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000022_0001
Анализ данных, приведенных данных в таблице 12, свидетельствует о том, что наибольшее процентное количество грибов рода Trichoderma, которые относятся к супрессивной, т.е. полезной, микрофлоре почв было отмечено в вариантах с применением ферментного препарата «Агрофлорин» на основе метаболитов нового штамма в различных концентрациях. Максимальное количество грибов рода Penicillium, которые свидетельствуют об утомленности почв, было выделено в варианте с обработкой почв гербицидом — вариант 1а. Грибы рода Aspergillus выделялись только в варианте с применением гербицида - вариант 1а. Во всех вариантах, где почва обрабатывалась гербицидом (вариант 1а, 16 и 1в), были выделены одиночные колонии грибов рода Mucor. В некоторых отмечались представители других родов, относящихся к патогенной группе: Cephalosporium, Rizopus, Altemaria. Таким образом было показано, что среди исследуемых образцов наибольшее количество супрессивной, т.е. полезной, микробиоты (грибов р. Trichoderma) выделено в вариантах с применением ферментного препарата «Агрофлорин», что свидетельствует об отсутствии токсического действия гербицида на почвенную микрофлору и биологическое состояние почвы в целом. А также, достоверно показано угнетающее действие ферментного препарата Агрофлорин на рост и развитие патогенных грибов.
Нами впервые было изучено и показано действие ферментного препарата «Агрофлорин» на восстановления и активацию почвенных процессов: повышение образования и скорость накопления (концентрацию) полезных органических веществ и микроэлементов в почве и растениях, в результате чего значительно повышается скорость и активность биохимических реакций в почве и растениях, увеличивается усвояемость растениями питательных веществ и микроэлементов.
Из материалов научно-полевых исследований, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И. В Мичурина:
«Полученные в ходе научного исследования данные достоверно свидетельствуют, что внесение ферментного препарата «Агрофлорин» в почву: повышает образование и скорость накопления (концентрации) полезных органических веществ и микроэлементов в почве и растениях. Значительно повышается концентрация и активность почвенных ферментов, увеличивается способность иммобилизовать молекулы внеклеточных ферментов, тем самым существенно увеличивается скорость течения биохимических реакций и процессов в почве и растениях. Так однократное внесение ферментного препарата «Агрофлорин» в прикорневую зону растений позволило повысить содержания в листьях растений калия - на 192 пункта, а также кальция - на 84 и магния - на 51, по отношению к контрольным образцам».
Увеличение калия, являющегося важнейшим элементом, регулирующим поступление влаги в растения и ее транспирацию, позволило растениям сохранить активность физиологических процессов в условиях засухи. Данные анализа растительных образцов, полученные под действием ферментного препарата «Агрофлорин» на трансформацию элементов питания в почве, свидетельствуют о существенной роли ферментов в оптимизации минерального питания растений и увеличении биодоступности и усвояемости питательных веществ и микроэлементов растениями. На всех культурах, где препарат вносился с капельным поливом, отмечалась повышенная устойчивость к засухе, интенсивное цветение и плодоношение, увеличение размеров плодов и их вкусовых качеств.
Из материалов научно-полевых исследований, проведенных во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. И. В Мичурина: «Полученные в ходе научного исследования данные достоверно свидетельствуют, что внесение ферментного препарата «Агрофлорин» в прикорневую зону растений позволило значительно увеличить скорость течения биохимических процессов в растениях: развитие вторичной корневой системы превысило контроль в 2 раза, работа интенсивности фотосинтеза листьев превысила контроль более чем в 2, 5 раза, суммарный прирост, общий вес растений по отношению к контрольным образцам составил 75%, увеличение массы и количества плодов по отношению к контролю превысило 1,5 раза», (см. фиг. 10 и 11)».
На основании полученных данных проведенных полномасштабных полевых исследований эффективности действия препарата «Агрофлорин» в различных климатических зонах (Брянская обл., Псковская обл., Астраханская обл., Кабардино- Балкарская Республика, Чеченская Республика, Самарская обл., Республика Татарстан и ряд других) и на различных культурах (озимые и яровые зерновые, картофель, подсолнечник, кукуруза, рапс, горчица, хлопчатник, кормовые культуры и т.д.) было достоверно показано, положительное влияние ферментного препарата «Агрофлорин» на развитие растений, увеличение роста и развития корневой и вегетативной системы растений, увеличение и суммарный прирост зеленой части и общего веса растений, увеличения прироста по урожайности. Увеличение устойчивости растений к засухе. Восстановление биоактивности почвы после химических обработок, увеличение интенсивность вовлечения пожнивных остатков в процесс гумусообразования. (Фиг. 9, 12-15).
Фиг. 1. Влияние ферментного препарата «Агрофлорин» на урожайность
Преимущества и отличия ферментного препарата «Агрофлорин» от биопрепаратов на основе живых микроорганизмов.
• Ферментный препарат «Агрофлорин» в отличие от биопрепаратов, содержащие живые бактерии, устойчив к перепадам температур, состоянию и химическому загрязнению почв. Действие препарата продолжается 4-6 месяцев в широком диапазоне температур - +1...+50°С. Тогда, как биопрепараты не устойчивы и очень чувствительны к изменениям температур, влажности и состоянию почв. Продолжительность действия биопрепаратов короткое (срок жизни колоний микроорганизмов составляет до 2 недель).
• Действия ферментного препарата «Агрофлорин» начинается сразу при внесении в почву, тогда как, для начала действия биопрепаратов требуется определенное время и оптимальные условия среды (колонии живых микроорганизмов должны адаптироваться в новой среде, должны иметь достаточно питания для начала активной работы. Что при современном состоянии почв практически не реально).
• Эффективность и спектр действия ферментного препарата «Агрофлорин» в десятки раз превышает эффективность и спектр действия биопрепаратов. Причиной тому служат, количество, высокие концентрации и особенности ферментов, в частности их способность сохранять активность в большом диапазоне температурного режима от минусовых до + 70°С. При этом каждая молекула фермента способна вступать в реакцию с более чем ста молекулами субстрата в течение одной секунды, что делает ферментный биопрепарат особенно ценными для сельскохозяйственного производства, как в условиях низких температур, так и при засухе.
• Очень низкий расход ферментного препарата на единицу площади, в отличие от биопрепаратов. Причиной тому служат, количества и очень высокие концентрации ферментов, питательных веществ и микроэлементов в ферментном препарате. 1 литр ферментного препарата обрабатывает 3 гектара почвы.
Регламент производства ферментного препарата «Агрофлорин»
Посевной мицелий селекционного штамма гриба для рабочего ферментационного аппарата выращивается сначала в пробирках на твердой питательной среде (сусло-агаре), затем в колбах на качалке в жидкой питательной среде и далее в инокуляторе при следующем технологическом режиме: температура 24±2 С; pH 6,0; аэрация 1 мЗ/мЗ/мин.
Для приготовления посевной культуры качалочные колбы емкостью 550 мл со 100 мл стерильной питательной среды следующего состава: меласса свеклосахарная 4,0 г.; глюкоза 0,4 г.; аммоний азотнокислый 0,3 г.; фосфат калия однозамещенный 0,2 г.; pH 6,0, засевают агаровыми блоками культуры из пробирок. Посевную культуру выращивают на качалке при температуре 24-26 С в течение 20-24 ч и используют для засева производственного посевного аппарата. Посевной материал считается готовым, когда концентрация сухих веществ мицелия в культуральной среде достигает 12-15 г/л. 5-10 объемных процентов такой среды служат посевным материалом, который с соблюдением правил асептики переносится в рабочий ферментационный аппарат.
В посевной аппарат емкостью 1500 л с 1000 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л): меласса свеклосахарная 40,0; глюкоза 4,0; аммоний азотнокислый 0,6; фосфат калия однозамещенного 3,0; микроэлементы 25,0; pH 6,0, из инокулятора вносят 5-10 объемных процентов культуральной среды, являющейся посевным материалом.
Процесс ферментации осуществляют методом глубинного культивирования при 22±1 С без механического перемешивания и при аэрации 600 куб. м/ч в течение 36 часов. По окончании ферментации нативный раствор культуральной жидкости подают на фильтр-пресс для отделения биомассы. Следующей стадией технологического процесса является добавление в нативный раствор фильтрата культуральной среды борной кислоты из расчета 2 - 4 мг/л. и сгущение нативного раствора фильтрата культуральной среды с помощью вакуумных фильтрующих аппаратов. Нативный раствор фильтрата культуральной среды характеризуют по содержанию органических кислот, сухих веществ, величине pH. Количество полученного готового ферментного препарата составляет 1000 л. При этом содержание активных метаболитов в готовом препарате составляет (масс%): массовая доля сухого остатка 1,5; массовая доля белка 2,5; массовая доля углеводов 15,0; массовая доля жиров 0,05; остальное вода до 100,0. Концентрация органических кислот и гиббереллинов в готовом препарате составляет соответственно 9,5 г/л и 2850 мкг/мл. Время культивации 36 часов.

Claims

Формула изобретения
1. Штамм гриба Fusarium equiseti Д -117 для создания на его основе активных метаболитов биопрепаратов для сельского хозяйства.
2. Способ культивирования продуцента активных метаболитов штамма гриба Fusarium equiseti Д -117 по п. 1, заключающийся в выращивании продуцента на жидкой питательной среде, содержащей питательные компоненты при следующих соотношениях: меласса свекловичная 40,0-60,0 г/л, глюкоза 4, 0-7,0 г/л, аммоний азотнокислый 0,6-0, 8 г/л, фосфат калия 3, 0-6,0 г/л, микроэлементы 0,25-1,0 мг/л, балансное количество воды, при этом процесс культивирования осуществляется в течение 36-48 часов при температуре 22±1°С, pH 5, 5-6, 2 и до содержания редуцирующих веществ в культуральной среде 0,9- 1,5 мае %.
3. Биопрепарат для сельского хозяйства, полученный способом по п. 2.
PCT/RU2019/000634 2019-08-06 2019-09-13 Штамм гриба fusarium equiseti д-117 WO2021025582A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019124933A RU2732915C1 (ru) 2019-08-06 2019-08-06 Штамм гриба Fusarium equiseti ВКПМ F-1455 для получения биопрепарата, восстанавливающего почву для сельскохозяйственных растений, биопрепарат и способ его получения
RU2019124933 2019-08-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021025582A1 true WO2021025582A1 (ru) 2021-02-11

Family

ID=72922349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/000634 WO2021025582A1 (ru) 2019-08-06 2019-09-13 Штамм гриба fusarium equiseti д-117

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2732915C1 (ru)
WO (1) WO2021025582A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113559454A (zh) * 2021-07-09 2021-10-29 生态环境部南京环境科学研究所 一种用于增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法
CN113832038A (zh) * 2021-09-27 2021-12-24 中国农业科学院植物保护研究所 木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）K2017-696及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2149008C1 (ru) * 1999-10-13 2000-05-20 Михайлова Наталья Александровна Способ получения биопрепарата
RU2478290C2 (ru) * 2011-11-11 2013-04-10 Общество с ограниченной ответственностью "Бациз" Биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, повышения урожайности и почвенного плодородия
RU2634415C1 (ru) * 2016-08-02 2017-10-26 Общество с ограниченной ответственностью "Органик парк" Штамм гриба Trichoderma asperellum для получения биопрепарата комплексного действия для растениеводства
RU2658430C1 (ru) * 2016-12-26 2018-06-21 Общество с ограниченной ответственностью "Органик парк" Способ получения биопрепарата для обработки растений

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2149008C1 (ru) * 1999-10-13 2000-05-20 Михайлова Наталья Александровна Способ получения биопрепарата
RU2478290C2 (ru) * 2011-11-11 2013-04-10 Общество с ограниченной ответственностью "Бациз" Биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, повышения урожайности и почвенного плодородия
RU2634415C1 (ru) * 2016-08-02 2017-10-26 Общество с ограниченной ответственностью "Органик парк" Штамм гриба Trichoderma asperellum для получения биопрепарата комплексного действия для растениеводства
RU2658430C1 (ru) * 2016-12-26 2018-06-21 Общество с ограниченной ответственностью "Органик парк" Способ получения биопрепарата для обработки растений

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113559454A (zh) * 2021-07-09 2021-10-29 生态环境部南京环境科学研究所 一种用于增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法
CN113559454B (zh) * 2021-07-09 2022-04-19 生态环境部南京环境科学研究所 一种用于增强土壤降解环丙酰草胺的生物降解方法
CN113832038A (zh) * 2021-09-27 2021-12-24 中国农业科学院植物保护研究所 木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）K2017-696及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
RU2732915C1 (ru) 2020-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK1713333T3 (en) Modulators of the development of arbuscular mycorrhizal fungi and their applications
US9150461B2 (en) Bioorganic agent for treating plants (variants)
Ebrahimi et al. Effect of humic acid on seed germination and seedling growth of Borago officinalis and Cichorium intybus
US9386774B2 (en) Application of mixotrophic chlorella for the improved yield and quality of solanaceae plants
CA2924786C (en) Hydroponic method utilizing beneficial micro-organisms
RU2626543C2 (ru) Штамм бактерий Paenibacillus mucilaginosus, способ стимуляции роста и защиты растений от болезней и применение штамма бактерий Paenibacillus mucilaginosus в качестве удобрения и агента биологического контроля (противопатогенного средства) в профилактике и/или лечении заболевания растений
CN102499265A (zh) 一种防治设施蔬菜土传病害的钩状木霉生物制剂
RU2732915C1 (ru) Штамм гриба Fusarium equiseti ВКПМ F-1455 для получения биопрепарата, восстанавливающего почву для сельскохозяйственных растений, биопрепарат и способ его получения
Idrees et al. Functional activities and essential oil production in coriander plants supported with application of irradiated sodium alginate
CN111052997B (zh) 一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法
CN105061068B (zh) 一种辣木多糖富集生物液体肥料及其制备方法
WO2018027198A1 (en) Compositions and methods for enhancing plant growth
Ningsih et al. Application of liquid bioactivator contains Trichoderma spp. and elements of boron (B) as growth of growth and improvement of red onion (Allium cepa L.) results
Anandyawati et al. Study of root exudate organic acids and microbial population in the rhizosphere of oil palm seedling
RU2662992C1 (ru) Способ предпосевной обработки семян сельскохозяйственных растений
Merwad Effect of nitrogen sources, rates, some biostimulants and antioxidants on growth and productivity of banana plants
CN111087266A (zh) 一种发酵肥及其制备方法
RU2640286C1 (ru) Способ выращивания льна-долгунца
Sumarsih et al. Study of Root Exudate Organic Acids and Microbial Population in the Rhizosphere of Oil Palm Seedling
CN114190406B (zh) 一种促进作物生长的植物生物刺激素及其使用方法
Djumaniyazova et al. Biotechnologic farming: an innovative approach to sustainable agriculture
RU2803623C1 (ru) Штамм Phialocephala fortinii шт. F-833МКС661Ч1Н - продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами
RU2760337C1 (ru) Препарат для увеличения урожайности яровой пшеницы
RU2820870C1 (ru) Состав и способ получения жидкого органоминерального удобрения
RU2759689C1 (ru) Способ получения сорбционного препарата для снижения аллелотоксичности почв

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19940697

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM XXXX DATED 05/07/2022)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19940697

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1