WO2021024985A1 - ポドサイトの培養方法、ポドサイトの培養用キット、被検物質の毒性判定方法、及び、生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法 - Google Patents

ポドサイトの培養方法、ポドサイトの培養用キット、被検物質の毒性判定方法、及び、生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2021024985A1
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WO
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podocytes
podocyte
culturing
temperature
test substance
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PCT/JP2020/029676
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藤井　輝夫
南学　正臣
浩太郎 土肥
啓志 木村
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国立大学法人東京大学
学校法人東海大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing podocytes, a kit for culturing podocytes, a method for determining toxicity of a test substance, and a method for screening a podocyte protective agent in vivo.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-146636 filed in Japan on August 8, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Nephrotic syndrome in renal pathology is a syndrome whose main symptom is proteinuria / hypoalbuminemia caused by damage to glomerular epithelial cells (podocytes), and is a disease leading to renal death requiring renal replacement therapy. It has become a global problem as a group. In podocyte injury, the disappearance of dendrite structures observed in vivo during maturity is regarded as a pathological change. The technique of culturing cultured podocytes on a flat substrate with in vivo traits is expected to bring great benefits in toxicity tests in drug discovery research and in elucidating the pathophysiology of nephrotic syndrome.
  • Non-Patent Document 1 a culture method that reproduces the intricate dendrite structure in rat primary culture podocytes (Non-Patent Document 1), but it is difficult to reproduce in other cell types.
  • Non-Patent Document 1 since it is a primary culture system, it is necessary to isolate organs from animals every time, which causes time, cost and ethical problems.
  • the present invention is a method for culturing podocytes having an intricate dendritic structure different from paving stone-like arrangement in a short time and at low cost without isolating an organ each time, culturing podocytes having the dendritic structure. It is an object of the present invention to provide a kit, a method for determining toxicity of a test substance using podocytes obtained by the above culturing method, and a method for screening a biological podocyte protective agent using the podocytes obtained by the above culturing method.
  • the present inventors established confluent temperature-sensitive immortalized podocytes by culturing them on the extracellular matrix (ECM) laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1 in the presence of a ROCK inhibitor without serum.
  • ECM extracellular matrix
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for culturing podocytes having a dendrite structure which comprises culturing temperature-sensitive immortalized podocytes that have reached confluence on laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1 in the presence of a ROCK inhibitor without serum.
  • the culture method according to [1] wherein the laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1 is immobilized on a substrate.
  • the main body portion and an insertion portion detachably attached to the main body portion are provided, the main body portion includes a liquid storage cavity capable of accommodating a culture solution, and the insertion portion is a cell capable of accommodating cells.
  • the cell accommodating portion including the accommodating space and the membrane member defining the lower surface of the cell accommodating space through which the culture solution can permeate are included, and when the insertion portion is attached to the main body portion, the membrane member becomes liquid.
  • Cells located in the containment cavity the culture medium supplied to the solution containing cavity flows into the cell containing space, and the cells contained in the cell containing space can be cultured in the flow of the culture medium.
  • the culturing method according to any one of [1] to [5], which is cultivated using a culturing device.
  • a kit for culturing podocytes having a dendrite structure which comprises a temperature-sensitive immortalized podocyte, laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1, and a ROCK inhibitor.
  • a test substance was added to podocytes having a dendritic structure obtained by culturing temperature-sensitive immortalized podocytes that reached confluence on laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1 in the presence of a ROCK inhibitor without serum. After that, the presence or absence of damage to the dendritic structure of the podocyte is verified, and when the dendritic structure of the podocyte is damaged, it is determined that the test substance is toxic to the podocyte in the living body.
  • the verification of the presence or absence of damage to the dendrite structure is based on the detection of a substance that increases the rate of passage through the dendrite structure of the podocyte when the podocyte is damaged [8].
  • Judgment method described in. [10] The determination method according to [9], wherein the substance is at least one selected from the group consisting of albumin, transferrin and IgG. [11] The determination method according to [9] or [10], wherein the substance is fluorescently labeled. [12] The determination method according to any one of [9] to [11], wherein at the same time as the detection of the substance, the passage of inulin through the dendrite structure of the podocyte is detected.
  • the dendrites of the podocytes obtained by culturing the temperature-sensitive immortalized podocytes that have reached confluence on laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1 in the presence of a ROCK inhibitor without serum and having a dendrite structure. After adding the test substance under conditions that damage the structure, it is verified whether or not the dendrite structure of the podocyte is damaged, and the test substance that suppresses the damage to the dendrite structure is selected. A method for screening an in vivo podocyte protective agent.
  • the present invention it is possible to provide a method for culturing podocytes, a kit for culturing podocytes, a method for determining toxicity of a test substance, and a method for screening an in vivo podocyte protective agent.
  • a light-field micrograph (upper), vimentin and DAPI-stained image (lower) of the mouse podocytes prepared in Example 1 are shown.
  • the left shows podocytes cultured by the control culture method, and the right shows podocytes cultured using laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1 (hereinafter, also referred to as L521) and Y27632.
  • L521 laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1
  • Y27632 laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1
  • the vimentin and DAPI stained image of the rat podocyte prepared in Example 2 is shown.
  • the upper row shows podocytes cultured by the control culture method
  • the lower row shows podocytes cultured using L521 and Y27632.
  • FIG. 1 It is a graph which showed the expression of each marker of the mouse podocyte podocalyxin (PODXL), synaptopodin (SYNPO), vimentin (Vim) and integrin ⁇ 3 (ITGA3) prepared in Example 1.
  • PGC on the horizontal axis is podocytes cultured under growth conditions
  • STDs are podocytes cultured under differentiation conditions with serum added using L521 and Y27632
  • PRCs are serum-free and differentiated using L521 and Y27632.
  • the podocytes cultured under the conditions are shown respectively.
  • the vertical axis shows the expression level of each marker.
  • the bright-field micrographs of the mouse podocytes prepared in Comparative Examples 1 to 3 are shown.
  • the first photograph from the left is the podocyte cultured without serum in the absence of Y27632 and the presence of L521 shown in Comparative Example 1, and the second photograph from the left is the presence of Y27632 and L511 shown in Comparative Example 2.
  • serum-free cultivated podocytes the third photograph from the left is the podocytes cultured in serum medium in the presence of Y27632 and L521, shown in Comparative Example 3, and the fourth photograph from the left is Example 1.
  • the podocytes cultured in serum-free in the presence of Y27632 and L521 shown in the above are shown respectively.
  • the method for culturing podsites having a dendrite structure of the present invention is to cultivate temperature-sensitive immortalized podocytes that have reached confluence on L521 in the presence of a ROCK inhibitor, preferably in the presence of Y27632, without serum. It is a feature.
  • podocytes are glomerular epithelial cells or glomerular podocytes, which exert an important function for filtering blood in the kidney in the living body. Then, in the kidney of the living body, the podocyte has a form (scrum structure) in which several protrusions (primary protrusions) extend from the cell body and many protrusions (foot protrusions) extending from the primary protrusions are entwined with the adjacent ones.
  • a protein called Slit Diaphragm Protein is retained in the gaps between the foot protrusions of the scrum structure, and when blood is filtered, waste products such as urinary toxins and unnecessary electrolytes and plasma necessary for the living body are retained.
  • nephrotic syndrome It functions as a size barrier that filters while selecting proteins (albumin, etc.) (urine toxins and electrolytes have a smaller molecular size than plasma proteins). The disease in which this size barrier disappears presents a large amount of proteinuria called nephrotic syndrome.
  • the temperature-sensitive immortalized podocyte is not particularly limited as long as it is a temperature-sensitive immortalized podocyte derived from an animal such as a mouse, rat, or human, and examples thereof include cells immortalized by the SV40 virus. .. Temperature-sensitive immortalized podocytes can be prepared using known methods, such as isolation from renal glomeruli of animals introduced with the temperature-sensitive SV40 large T antigen, or glomeruli of wild-type animals. It can be prepared by a method of gene transfer of SV40 large T antigen into an isolated podocyte.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes are grown until they become confluent.
  • the growth is preferably carried out under growth conditions (Permissive growth condition; also referred to as PGC).
  • the growth conditions include conditions for culturing at 25 to 35 ° C., preferably 33 ° C.
  • the growth of the temperature-sensitive immortalized podocytes is promoted.
  • the "confluent" refers to a state in which cells proliferate and gaps between cells begin to disappear.
  • the temperature-sensitive immortalized podsite when a gene is introduced in which a promoter region in which transcription is promoted by interferon gamma is provided upstream of the T antigen transcription region, interferon gamma (in order to proliferate more efficiently) is used. Hereinafter, it is also referred to as IFN ⁇ ), and it is preferable to add it.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes may be cultured in the presence of extracellular matrix or in the absence of extracellular matrix, but are preferably cultured in the absence of extracellular matrix. ..
  • the extracellular matrix L521 is preferably immobilized on a substrate.
  • the substrate is not particularly limited, but is, for example, a perforated material made of plastic such as polystyrene, polyester, polycarbonate, cycloolefin polymer, glass dish or plate, polyethylene terephthalate, polycarbonate, polystyrene, polyester, silicone, etc. Examples include membranes. Since L521 is fixed on the substrate, podocytes having a dendrite structure can be stably cultured.
  • laminin is a glycoprotein which is a main constituent molecule of the basement membrane, and has a structure in which an ⁇ chain, a ⁇ chain, and a ⁇ chain are associated with each other.
  • the laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1 is a laminin having an ⁇ -chain subunit number of 5, a ⁇ -chain subunit number of 2, and a ⁇ -chain subunit number of 1.
  • Laminin ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ 1 (L521) is also referred to as laminin-11.
  • L521 is a major subtype of laminin in the mature glomerular basement membrane where podocytes have a dendrite structure, and has a high affinity for integrin ⁇ 3 ⁇ 1, which is a major focal adhesion molecule expressed in mature podocytes.
  • integrin ⁇ 3 ⁇ 1 which is a major focal adhesion molecule expressed in mature podocytes.
  • the ROCK inhibitor is a Rho-associated coiled-coil forming kinase (Rho-binding kinase) inhibitor.
  • Rho-binding kinase Rho-binding kinase
  • the ROCK inhibitor used in the culture method of the present invention is not particularly limited, but Y27632 is preferable.
  • the medium for culturing without serum used in the culturing method of the present invention is not particularly limited as long as it is a serum-free medium, and examples thereof include a serum-free RPMI medium.
  • the conditions for culturing the temperature-sensitive immortalized podocytes that have reached the confluence on L521 in the presence of a ROCK inhibitor without serum are differentiation conditions (Non-Permissive glow podocytes; hereinafter also referred to as Non-PGC). Is preferable.
  • Examples of the differentiation condition include culturing at 35 to 40 ° C., preferably 37 ° C.
  • the podocytes have a dendrite structure can be confirmed by observing the structure with a microscope, staining with vimentin, or the like. It can also be confirmed by the expression of genes whose expression is observed in mature podocytes. Examples of genes whose expression is observed in mature podocytes include podocalyxin (PODXL), synaptopodin (SYNCO), vimentin (Vim), integrin ⁇ 3 (integrin- ⁇ 3; ITGA3), and the like.
  • PODXL podocalyxin
  • SYNCO synaptopodin
  • Vim vimentin
  • integrin ⁇ 3 integrin- ⁇ 3
  • ITGA3 integrin- ⁇ 3
  • the culturing method of the present invention may be cultivated using the culturing apparatus disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-42556.
  • the culture apparatus includes, for example, a main body portion and an insertion portion that is detachably attached to the main body portion.
  • the main body portion includes a liquid storage cavity capable of accommodating a culture solution, and the insertion portion is a cell.
  • a cell accommodating portion including a cell accommodating space capable of accommodating the cells and a membrane member defining the lower surface of the cell accommodating space and allowing the culture solution to permeate
  • the insertion portion is attached to the main body portion
  • the membrane member is located in the liquid containing cavity, the culture solution supplied to the liquid containing cavity flows into the cell containing space, and the cells housed in the cell containing space flow in the culture solution.
  • Examples thereof include a cell culture device that enables culturing.
  • Specific examples of the method of culturing using the above device include a method performed by the following procedure. (Step 1)
  • the porous membrane in the insertion portion is coated with L521.
  • Step 2 The inside of the insertion portion is replaced with a serum-free medium containing Y27632, and the medium is also injected into the main body portion.
  • Step 3 The cells are cultured in the cell containing space.
  • Step 4 After exfoliating cells with a cell exfoliation solution, the obtained cell exfoliation solution is neutralized with a serum-free medium containing no Y27632, and the cells are centrifuged to form a cell mass. The supernatant other than the cell mass is removed, and the cell mass is diluted with a serum-free medium containing Y27632 to obtain a cell suspension containing podocytes having a dendrite structure.
  • the kit for culturing podocytes having a dendrite structure of the present invention contains a temperature-sensitive immortalized podocyte, L521, and a ROCK inhibitor.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes, L521, and ROCK inhibitors include those described above.
  • the podocyte culture kit having a dendrite structure of the present invention it is preferable to use L521 fixed on a substrate.
  • the substrate the substrate mentioned in the method for culturing podocytes can be used. Since L521 is fixed on the substrate, podocytes having a dendrite structure can be stably cultured.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes may be cultured in the presence or absence of extracellular matrix, or may be cultured in the absence of extracellular matrix. It is preferable that the product is made.
  • the temperature-sensitive immortalized podocyte is preferably cultured at 25 to 35 ° C, preferably 33 ° C.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes are preferably cultured at 25 to 35 ° C, preferably 33 ° C.
  • the kit of the present invention may contain other components in addition to the temperature-sensitive immortalized podocytes, L521, and ROCK inhibitors.
  • it may contain an IFN ⁇ -free serum-free medium capable of differentiating temperature-sensitive immortalized podocytes.
  • the kit of the present invention may include the cell culture apparatus disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-42556 used in the culture method.
  • the method for determining the toxicity of a test substance to in vivo podocytes of the present invention is a dendrite obtained by culturing temperature-sensitive immortalized podocytes that have reached confluence on L521 in the presence of a ROCK inhibitor without serum. After adding the test substance to the podocyte having a structure, it is verified whether or not the dendrite structure of the podocyte is damaged, and if the podocyte structure of the podocyte is damaged, the test substance is found. Can be done by determining that is toxic to podocytes in vivo.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes, L521, and ROCK inhibitors include those described above.
  • the extracellular matrix of L521 is fixed on the substrate.
  • the substrate the substrate mentioned in the method for culturing podocytes can be used. Since L521 is fixed on the substrate, the toxicity of the test substance can be efficiently determined.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes may be cultured in the presence of extracellular matrix or in the absence of extracellular matrix, but the extracellular matrix may be used. It is preferable to use the one cultured in the absence.
  • the temperature-sensitive immortalized podocyte is preferably cultured at 25 to 35 ° C, preferably 33 ° C.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes By culturing the temperature-sensitive immortalized podocytes under growth conditions of 25 to 35 ° C., preferably 33 ° C., the growth of the temperature-sensitive immortalized podocytes is promoted, so that the toxicity of the test substance can be efficiently determined. Can be done.
  • Verification of whether or not the dendritic structure of the podocyte is damaged is as follows: (1) From the basal side (the side opposite to the side on which the podocyte is immobilized), when the podocyte is damaged, the podocyte A method of perfusing a culture solution containing a substance containing an increasing rate of passage through a dendritic structure to determine the rate of passage of the substance through the podocyte dendritic structure on a porous membrane on which podocytes are immobilized. , (2) A method for detecting a molecule that changes when the podocyte dendritic structure is damaged by a change at the mRNA level by a quantitative PCR method or the like, or a change by a protein expression quantification method such as Western blot or ELISA.
  • a substrate on which temperature-sensitive immortalized podocytes are immobilized is cultured on a porous membrane by the above-mentioned culture method, a test substance is added, and then the basal side ( From the side opposite to the side on which the podocyte is immobilized), a substance that increases the rate of passage through the dendritic structure of the podocyte when the podocyte is injured (hereinafter, also referred to as an injury-passing substance).
  • the podocyte dendritic structure on the porous membrane on which the podocyte is immobilized can be obtained by perfusing the culture solution containing the podocyte to determine the rate at which the passing substance at the time of injury passes.
  • the test substance When the test substance is toxic to the podocyte, the dendrite structure of the podocyte is disrupted, so that the ratio of the passing substance at the time of injury flowing from the basal side to the podocyte side increases, and the podocyte side at the time of the injury The rate at which passing substances are detected increases compared to the case where there is no test substance.
  • the test substance when the test substance is not toxic to the podocyte, the dendrite structure of the podocyte is maintained, so that the ratio of the substance passing through the injury from the basal side to the podocyte side does not change. Or, since the increase is small, the rate at which the substance passing through the injury is detected on the podocyte side does not change or increases as compared with the case where there is no test substance.
  • Examples of substances that increase the rate of passage through the dendrite structure of podocytes when the podocytes are injured include high molecular weight substances such as albumin, transferrin, and IgG. These polymer substances may be used alone or in combination.
  • a method for detecting a substance whose rate of passing through the dendrite structure of the podocyte increases when the podocyte is injured for example, a method using a mass spectrometer, when the podocyte is injured
  • Examples thereof include a method of labeling a substance whose rate of passing through the dendrite structure of a podocyte increases with a labeling substance and detecting the labeling.
  • Examples of the labeling substance include a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioisotope, an enzyme and the like, and a fluorescent substance is preferable.
  • the detection method of (1) when the podocyte is injured, a substance that increases the rate of passing through the dendrite structure of the podocyte, and at the same time, a glomerular filtration barrier regardless of whether the podocyte is injured or not.
  • the low molecular weight substance include inulin and the like.
  • inulin can pass through the dendritic structure of podocytes and the passage of albumin is suppressed, but when podocytes are injured, both inulin and albumin can pass. Therefore, it is possible to determine whether the test substance is toxic to podocytes by detecting whether or not there is a difference in clearance between inulin and albumin before and after the injury.
  • transferrin and IgG are previously contained in a culture solution perfused from the basal side in a state in which transferrin and IgG are fluorescently labeled to shine at different wavelengths and in a known state, and the culture flows into the podsite side.
  • To determine whether the test substance is toxic to podocytes by making it possible to determine the concentration of transferrin and IgG from each fluorescence intensity in the solution and taking the ratio of the clearance between transferrin and IgG before and after the injury. You can also.
  • the molecules that change when the dendrite structure of the podocyte is damaged include WT1, MafB, Lmx1b, Pod1, Foxc2, nephrin (NPHS1), podocin (NPHS2), synaptopodin, and podocal. , ⁇ -actinin-4, NEPH1, FAT, P-cadherin, Laminin ⁇ 2 (LAMB2) and the like.
  • the dendritic structure is changed to the paving stone arrangement by a scanning electron microscope.
  • Intermediate filaments are interspersed from the dendritic structure to the cytoskeleton by the method of observing changes, the method of observing the disappearance of podocyte foot process and the disappearance of slit membrane by a transmission electron microscope, and the method of immunostaining. Examples include a method of observing findings that change to a pattern and findings that actin changes from a punctate arrangement to a stress fiber-like pattern.
  • the test substance when the number of marker-positive cells such as podocalyxin, which is expressed in mature podocytes, is increased in the basal culture medium as compared with the absence of the test substance, the subject is subjected to. It can be determined that the test substance is toxic to podocytes. In addition, if the ratio of markers such as podocalyxin expressed in mature podocytes to low molecular weight substances capable of passing through podocytes such as creatinine is increasing, the test substance is toxic to podocytes. Can be determined. In addition, when WTI exosomes are increased as compared with the absence of the test substance, it can be determined that the test substance is toxic to podocytes.
  • the method for screening an in vivo podocyte protectant of the present invention has a dendrite structure obtained by culturing confluent temperature-sensitive immortalized podocytes on L521 in the presence of a ROCK inhibitor without serum. After adding the test substance to the podocyte under the condition of damaging the dendrite structure of the podocyte, it is verified whether or not the dendrite structure of the podocyte is damaged, and the dendrite structure is damaged. This can be done by selecting a test substance that suppresses.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes, L521, and ROCK inhibitors include those described above.
  • L521 is fixed on a substrate.
  • the substrate the substrate mentioned in the method for culturing podocytes can be used. Since L521 is fixed on the substrate, the in vivo podocyte protective agent can be efficiently screened.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes may be cultured in the presence of extracellular matrix or in the absence of extracellular matrix, but are not extracellular matrix. It is preferable to use those cultured in the presence.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes are preferably cultured at 25 to 35 ° C, preferably 33 ° C.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes are promoted, so that an in vivo podocyte protective agent can be efficiently screened. Can be done.
  • Verification of whether or not the dendrite structure of the podocyte is damaged can be performed by the method described in the toxicity determination method.
  • a substrate on which a temperature-sensitive immortalized podocyte is immobilized is cultured on a porous membrane by the above culture method, and the podocyte having the dendritic structure is formed. After adding the substance that damages the podocyte and the test substance, from the basal side (the side opposite to the side where the podocyte is immobilized), when the podocyte is injured, it passes through the dendritic structure of the podocyte. Perfuse a culture solution containing a substance (passing substance during injury) that increases the proportion of podocytes, and prevent the passing substance during injury from passing through the podocyte dendritic structure on the porous membrane on which podocytes are immobilized.
  • Examples thereof include a method of screening an in vivo podocyte protective agent by selecting a test substance to be tested.
  • the test substance has a podocyte protective effect
  • the podocyte dendritic structure is maintained even if there is a substance that damages the podocyte having the podocyte structure, so that the substance passing through the injury is the basis.
  • the inflow from the side to the podocyte side is suppressed, and the proportion of the substance passing through during injury detected on the podocyte side is reduced as compared with the absence of the test substance.
  • the test substance does not have a protective effect on the podocyte
  • the substance that damages the podocyte having the podocyte structure causes the podocyte dendritic structure to collapse, and the substance passing through during the injury Since the inflow from the basal side to the podocyte side is not suppressed, the proportion of the substance passing through during injury detected on the podocyte side does not decrease as compared with the absence of the test substance.
  • Examples of the substance whose rate of passing through the dendrite structure of the podocyte increases when the podocyte is injured include the substances mentioned in the toxicity determination method.
  • the conditions for damaging the dendrite structure of the podocyte are not particularly limited as long as they are conditions for damaging the dendrite structure of the podocyte, but for example, conditions for adding an antitumor agent such as adriamycin may be used. Can be mentioned.
  • the screening method of the present invention when a podocyte is injured, a substance that increases the rate of passing through the dendrite structure of the podocyte, and at the same time, glomerular filtration regardless of whether the podocyte is injured or not. It is preferable to combine low molecular weight materials that can freely pass through the barrier. Examples of the low molecular weight substance include inulin and the like. For example, in the physiological situation before the injury, inulin can pass and albumin cannot pass, but when the podocyte is injured, both inulin and albumin can pass, so the clearance between inulin and albumin before and after the injury By detecting whether or not there is a difference, it is possible to determine whether or not the test substance has a protective effect on podocytes.
  • transferrin and IgG are previously contained in a culture solution perfused from the basal side in a state in which transferrin and IgG are fluorescently labeled to shine at different wavelengths and in a known state, and the culture flows into the podsite side.
  • Whether or not the test substance has a protective effect on podocytes is determined by making it possible to determine the concentration of transferrin and IgG from each fluorescence intensity in the liquid and taking the ratio of the clearance between transferrin and IgG before and after the injury. It can also be determined.
  • Example 1 Culture of temperature-sensitive immortalized podocytes (1) Mice SV40 large T antigen has been introduced to (H-2Kb-tsA58 transgenic mouse ) from isolated mouse temperature sensitive immortalized podocyte were dishes; on (PRIMARIA Dish Corning Corp.), a seeding density 1.35 ⁇ 10 5 RPMI1640 containing 10 mM sodium pyruvate, 1 mM HEPES-KOH and 10% Fetal Bovine Serum (FBS) at cells / cm 2 in the presence of IFN ⁇ (# 315-05, manufactured by Pepro-tech) at a final concentration of 5 ng / mL. The cells were cultured in a medium (R8758, manufactured by Sigma-Aldrich) at 33 ° C. for 3 days. Temperature-sensitive immortalized podocytes reached confluence by culturing for 3 days.
  • a medium R8758, manufactured by Sigma-Aldrich
  • ITS-X 51500056, manufactured by Gibco
  • MEM non-essential amino acid solution M7145-100ML, manufactured by Merck
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes were cultured in 0.1% MEM medium containing 10% FBS, 100 ⁇ g / mL penicillin / streptomycin (manufactured by Gibco) on a substrate on which L521 was not immobilized.
  • Cells were stained with vimentin and DAPI. If the cell does not have a dendrite structure, vimentin will be scattered in the cytoplasm, but if it has a dendrite structure, the localization pattern of vimentin will extend from the center of the cell body in all directions. It becomes a pattern. Since DAPI can stain the nucleus of cells, the presence of cells can be confirmed by DAPI staining. The results are shown in FIG.
  • podocytes cultured in a serum-free medium containing Y27632 on a substrate on which L521 was immobilized had a dendrite structure.
  • podocytes cultured in a serum medium containing no Y27632 using a substrate on which L521 was not immobilized did not have a dendrite structure.
  • Example 2 Culture of temperature-sensitive immortalized podocytes (2) Example 1 except that temperature-sensitive immortalized podocytes isolated from rats into which SV40 large T antigen has been introduced are used instead of temperature-sensitive immortalized podocytes isolated from mice into which SV40 large T antigen has been introduced.
  • the temperature-sensitive immortalized podocytes were cultured in the same manner as above. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 2 (lower), even when rat temperature-sensitive immortalized podocytes were used, podocytes having a dendrite structure could be reproduced.
  • Example 3 Expression of dendrite structure-specific gene The expression of PODXL, SYNPO, Vim, and ITGA3, which are the dendrite structure-specific genes of the podocyte obtained in Example 1, was confirmed by a quantitative PCR method.
  • FIG. 3 PGC shows the results of podocytes when temperature-sensitive immortalized podocytes that reached confluence were cultured under growth conditions (L521 unfixed, IFN ⁇ addition, serum addition conditions, culturing at 33 ° C.). ..
  • the podocytes obtained by culturing in Example 1 express the dendrite structure-specific genes PODXL, SYNPO, Vim, and ITGA3.
  • Serum was added and cultured under differentiation conditions (fixed to L521, no IFN ⁇ was added, cultured at 37 ° C. under serum addition conditions, indicated by STD in the figure), and significantly compared with the case of culturing under growth conditions. It was confirmed that it was rising to.
  • Example 1 Temperature-sensitive immortalized podocytes were cultured in the same manner as in Example 1 except that a serum-free medium containing no Y27632 was used. The result is shown in FIG. 4 (first from the left). As shown in FIG. 4, podocytes cultured in a serum-free medium containing Y27632 have a dendrite structure as compared with podocytes cultured in a serum-free medium containing Y27632 (fourth from the left). I didn't.
  • Example 2 The temperature-sensitive immortalized podocytes were cultured in the same manner as in Example 1 except that laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1 (hereinafter, also referred to as L511) was used instead of L521. The result is shown in FIG. 4 (second from the left). As shown in FIG. 4, when cultured with L511, the podocytes did not have a dendrite structure as compared with the podocytes cultured with L521 (fourth from the left).
  • L511 laminin ⁇ 5 ⁇ 1 ⁇ 1
  • Example 3 Temperature-sensitive immortalized podocytes were cultured in the same manner as in Example 1 except that 10% FBS was added to the medium. The result is shown in FIG. 4 (third from the left). As shown in FIG. 4, when the serum medium was used, the podocytes did not have a dendrite structure as compared with the podocytes cultured in the serum-free medium (fourth from the left).
  • the present invention it is possible to provide a method for culturing podocytes, a kit for culturing podocytes, a method for determining toxicity of a test substance, and a method for screening an in vivo podocyte protective agent.

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Abstract

コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、ラミニンα５β２γ１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養することを特徴とする樹状突起構造を有するポドサイトの培養方法、温度感受性不死化ポドサイト、ラミニンα５β２γ１、及びＲＯＣＫ阻害剤を含む、樹状突起構造を有するポドサイトの培養用キット、前記培養方法で得られたポドサイトを用いる被検物質の毒性判定方法、及び、前記培養方法で得られたポドサイトを用いる生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法。

Description

ポドサイトの培養方法、ポドサイトの培養用キット、被検物質の毒性判定方法、及び、生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法
　本発明は、ポドサイトの培養方法、ポドサイトの培養用キット、被検物質の毒性判定方法、及び、生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法に関する。
　本願は、２０１９年８月８日に、日本に出願された特願２０１９－１４６６３６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　腎臓病学におけるネフローゼ症候群は、糸球体上皮細胞（ポドサイト）が傷害されることにより惹起される蛋白尿・低アルブミン血症を主な症状とする症候群であり、腎代替療法を要する腎死に至る疾患群として世界的に問題となっている。
　ポドサイトの傷害においては、成熟期の生体内で観察される樹状突起構造が消失する知見が、病的変化として位置づけられている。培養ポドサイトを平面基板上で生体内の形質を伴った状態で培養する技術は、創薬研究における毒性試験や、ネフローゼ症候群の病態解明において大きな恩恵をもたらすことが期待される。
　しかし、従来の培養技術においては培養ポドサイトの形態は樹状突起構造を再現することができず、ネフローゼ症候群領域の創薬・病態解明の研究発展を阻んでいる。２０１７年に新潟大学の矢尾板らより、ラット初代培養ポドサイトにおける入り組む樹状突起構造を再現する培養法が報告された（非特許文献１）が、他の細胞種での再現が困難であり、また、初代培養系なので、毎回動物から臓器単離を行うことが必要となり、時間、コスト及び倫理上の問題がある。
Kidney Int. 2018 Feb;93(2):519-524.
　より短時間、低コストで、倫理上問題なく、樹脂突起構造を有するポトサイドを培養する方法が可能になれば大きな恩恵をもたらす。本発明は、毎回臓器を単離することなく、短時間、低コストで、敷石状配列とは異なる入り組む樹状突起構造を有するポドサイトを培養する方法、前記樹状突起構造を有するポドサイトの培養キット、前記培養方法によって得られたポドサイトを用いる被検物質の毒性判定方法、及び前記培養方法によって得られたポドサイトを用いる生体ポドサイト保護剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、細胞外マトリクス（ＥＣＭ：Extracellular Matrix）であるラミニンα５β２γ１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養することにより、株化細胞で、従来の敷石状配列とは異なる入り組む樹状突起構造を再現することができることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］　コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、ラミニンα５β２γ１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養することを特徴とする樹状突起構造を有するポドサイトの培養方法。
［２］　前記ラミニンα５β２γ１が、基板上に固定化されている、［１］に記載の培養方法。
［３］　前記温度感受性不死化ポドサイトが、細胞外マトリックス非存在下で培養したものである、［１］又は［２］に記載の培養方法。
［４］　前記温度感受性不死化ポドサイトが、３３℃、増殖条件下で培養したものである、［１］～［３］のいずれか一項に記載の培養方法。
［５］　前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ２７６３２である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の培養方法。
［６］　本体部と、前記本体部に着脱可能に取り付けられる挿入部とを備え、前記本体部は、培養液を収容可能な液収容空洞を含み、前記挿入部は、細胞を収容可能な細胞収容空間を含む細胞収容部と、前記細胞収容空間の下面を画定する膜部材であって培養液が透過可能な膜部材とを含み、前記本体部に挿入部が取り付けられると前記膜部材が液収容空洞内に位置し、前記液収容空洞に供給された培養液が前記細胞収容空間内に流入し、前記細胞収容空間内に収容された細胞が培養液の流れの中で培養可能になる細胞培養装置を用いて培養する、［１］～［５］のいずれか一項に記載の培養方法。
［７］　温度感受性不死化ポドサイト、ラミニンα５β２γ１、及びＲＯＣＫ阻害剤を含む、樹状突起構造を有するポドサイトの培養用キット。
［８］　コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、ラミニンα５β２γ１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養して得られた樹状突起構造を有するポドサイトに、被検物質を添加した後、前記ポドサイトの樹状突起構造の傷害の有無を検証し、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害がある場合に、前記被検物質が生体内のポドサイトに対し毒性があると判定することを特徴とする生体内ポドサイトに対する被検物質の毒性判定方法。
［９］　前記樹状突起構造の傷害の有無の検証が、前記ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質の検出によるものである、［８］に記載の判定方法。
［１０］　前記物質が、アルブミン、トランスフェリン及びＩｇＧからなる群から選ばれる少なくとも一種である、［９］に記載の判定方法。
［１１］　前記物質が、蛍光標識されている、［９］又は［１０］に記載の判定方法。
［１２］　前記物質の検出と同時に、イヌリンの、前記ポドサイトの樹状突起構造の通過を検出する、［９］～［１１］のいずれか一項に記載の判定方法。
［１３］　コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、ラミニンα５β２γ１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養して得られた樹状突起構造を有するポドサイトに、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害を与える条件下で被検物質を添加した後、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害があるか否かを検証し、前記樹状突起構造の傷害を抑制する被検物質を選択することを特徴とする生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法。
　本発明によれば、ポドサイトの培養方法、ポドサイトの培養用キット、被検物質の毒性判定方法、及び、生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法を提供することができる。
実施例１で作製されたマウスポドサイトの明視野での顕微鏡写真（上段）、ビメンチン及びＤＡＰＩ染色像（下段）を示す。左が対照の培養方法で培養したポドサイト、右がラミニンα５β２γ１（以下、Ｌ５２１とも称する）とＹ２７６３２を用いて培養したポドサイトを示す。 実施例２で作製されたラットポドサイトのビメンチン及びＤＡＰＩ染色像を示す。上段が対照の培養方法で培養したポドサイト、下段がＬ５２１とＹ２７６３２を用いて培養したポドサイトを示す。 実施例１で作製されたマウスポドサイトのポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）、シナプトポジン（ＳＹＮＰＯ）、ビメンチン（Ｖｉｍ）及びインテグリンα３（ＩＴＧＡ３）の各マーカーの発現を示したグラフである。横軸のＰＧＣは、増殖条件で培養したポドサイト、ＳＴＤは、Ｌ５２１及びＹ２７６３２を用いて、血清を添加して分化条件で培養したポドサイト、ＰＲＣは、Ｌ５２１及びＹ２７６３２を用いて、無血清で、分化条件で培養したポドサイトをそれぞれ示す。縦軸は、各々のマーカーの発現量を示す。 比較例１～３で作製されたマウスポドサイトの明視野の顕微鏡写真を示す。左から１番目の写真は、比較例１に示した、Ｙ２７６３２非存在下、Ｌ５２１存在下で無血清で培養したポドサイト、左から２番目の写真は、比較例２に示した、Ｙ２７６３２及びＬ５１１存在下で、無血清で培養したポドサイト、左から３番目の写真は、比較例３で示した、Ｙ２７６３２及びＬ５２１存在下で、血清培地で培養したポドサイト、左から４番目の写真は、実施例１で示した、Ｙ２７６３２及びＬ５２１存在下で、無血清で培養したポドサイトをそれぞれ示す。
［ポドサイトの培養方法］
　本発明の樹状突起構造を有するポドサイトの培養方法は、コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、Ｌ５２１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下、好ましくはＹ２７６３２存在下で、無血清で培養することを特徴とする。
　本発明の培養方法において、ポドサイトとは、糸球体上皮細胞乃至糸球体足細胞であって、生体内の腎臓において血液を濾過するために重要な機能を発揮する。そして、生体の腎臓内で、ポドサイトは、細胞体より数本の突起(一次突起)が伸長し、一次突起より伸長する多数の突起(足突起)が隣のそれと絡み合った形態(スクラム構造)を有している。スクラム構造の足突起間に生じた隙間にＳｌｉｔ　Ｄｉａｐｈｒａｇｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎと称される蛋白質が保持され、血液を濾過する際には、老廃物である尿毒素や不要な電解質等と生体内にとっては必要な血漿蛋白（アルブミン等）とを選別しながら濾過するサイズバリアとして機能する（尿毒素や電解質は血漿蛋白よりも分子サイズが小さい）。このサイズバリアが消失する疾患がネフローゼ症候群という多量の蛋白尿を呈するものである。
　前記温度感受性不死化ポドサイトとしては、マウス、ラット、ヒト等の動物由来のポドサイトを温度感受性不死化したものであれば、特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０ウイルスによって不死化した細胞等が挙げられる。温度感受性不死化ポドサイトは、公知の方法を用いて作製することができ、例えば、温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原を導入した動物の腎糸球体から単離する方法や、野生型の動物の糸球体から単離したポドサイトにＳＶ４０ラージＴ抗原を遺伝子導入する方法等により作製することができる。
　本発明の培養方法においては、まず、温度感受性不死化ポドサイトを、コンフルエントになるまで増殖させる。増殖は、増殖条件（Ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；ＰＧＣとも称する）下で行うことが好ましい。増殖条件としては、例えば、２５～３５℃、好ましくは、３３℃で培養する条件が挙げられる。２５～３５℃、好ましくは３３℃の増殖条件下で培養することにより、前記温度感受性不死化ポドサイトの増殖が促進される。ここで、「コンフルエント」とは、細胞が増殖し、細胞間に隙間がなくなりはじめた状態のことを言う。なお、前記温度感受性不死化ポドサイトにおいて、Ｔ抗原転写領域の上流にインターフェロンγによって転写が促進するプロモーター領域を設けた遺伝子導入を行っている場合は、より効率的に増殖させるために、インターフェロンγ（以下、ＩＦＮγとも称する）を添加することが好ましい。
　前記温度感受性不死化ポドサイトは、細胞外マトリックス存在下で培養したものであっても、非存在下で培養したものであってもよいが、細胞マトリックス非存在下で培養したものであることが好ましい。
　次に、前記コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、細胞外マトリックスであるＬ５２１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養することにより、樹状突起構造を有するポドサイトを再現することができる。
　細胞外マトリックスであるＬ５２１は、基板上に固定されていることが好ましい。基板としては、特に制限はないが、例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー等のプラスチック製、あるいはガラス製のディッシュやプレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエステル、シリコーン等の材料から成る多孔膜等が挙げられる。Ｌ５２１が基板上に固定されていることにより、安定して樹状突起構造を有するポドサイトを培養することができる。
　本発明の培養方法において、ラミニンとは、基底膜の主要な構成分子である糖タンパク質であり、α鎖と、β鎖、γ鎖が会合した構造を有する。ラミニンのこれらのポリペプチド鎖はそれぞれ数種類存在し、その組み合わせにより十数種類のラミニンが存在する。ラミニンα５β２γ１は、α鎖のサブユニット番号が５、β鎖のサブユニット番号が２、γ鎖のサブユニット番号が１のラミニンである。ラミニンα５β２γ１（Ｌ５２１）は、ラミニン－１１とも言う。Ｌ５２１は、ポドサイトが樹状突起構造を有する成熟期の糸球体基底膜におけるラミニンの主要なサブタイプであり、成熟期ポドサイトに発現する主要な接着斑分子であるインテグリンα３β１と親和性が高いことが知られている。
　ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤である。本発明の培養方法において用いられるＲＯＣＫ阻害剤としては、特に制限はないが、Ｙ２７６３２が好ましい。
　本発明の培養方法において用いられる無血清で培養するための培地としては、無血清培地であれば特に制限はないが、例えば、血清を含まないＲＰＭＩ培地等が挙げられる。
　前記コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、Ｌ５２１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養するための条件は、分化条件（Ｎｏｎ－Ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；以下、Ｎｏｎ－ＰＧＣとも称する）が好ましい。前記分化条件としては、例えば、３５～４０℃、好ましくは、３７℃で培養することが挙げられる。
　本発明の培養方法において、ポドサイトが樹状突起構造を有するかは、顕微鏡による構造観察、ビメンチンによる染色等によって確認することができる。また、成熟期ポドサイトにおいて発現が認められる遺伝子の発現により確認することもできる。成熟期ポドサイトにおいて発現が認められる遺伝子としては、例えば、ポドカリキシン（ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ；ＰＯＤＸＬ）、シナプトポジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ；ＳＹＮＰＯ）、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ；Ｖｉｍ）、インテグリンα３（ｉｎｔｅｇｒｉｎ－α３；ＩＴＧＡ３）等が挙げられる。
　本発明の培養方法は、特開２０１８－４２５５６号に開示された培養装置を用いて培養してもよい。前記培養装置としては、例えば、本体部と、前記本体部に着脱可能に取り付けられる挿入部とを備え、前記本体部は、培養液を収容可能な液収容空洞を含み、前記挿入部は、細胞を収容可能な細胞収容空間を含む細胞収容部と、前記細胞収容空間の下面を画定する膜部材であって培養液が透過可能な膜部材とを含み、前記本体部に挿入部が取り付けられると前記膜部材が液収容空洞内に位置し、前記液収容空洞に供給された培養液が前記細胞収容空間内に流入し、前記細胞収容空間内に収容された細胞が培養液の流れの中で培養可能になる細胞培養装置等が挙げられる。
　上記装置を用いて培養する方法としては、具体的には、下記の手順で行う方法が挙げられる。
（工程１）挿入部内の多孔膜に対しＬ５２１のコーティングを行う。
（工程２）挿入部内に対しＹ２７６３２を含む無血清培地へ置換を行い、本体部にも前記培地を注入する。
（工程３）細胞収容空間内で細胞を培養する。
（工程４）細胞剥離溶液で細胞を剥離した後、得られた細胞剥離溶液を、Ｙ２７６３２を含まない無血清培地で中和し、細胞を遠心分離にて細胞塊とする。細胞塊以外の上清液を除去し、細胞塊をＹ２７６３２含有無血清培地で希釈し、樹状突起構造を有するポドサイトを含む細胞懸濁液を得る。
［ポドサイトの培養用キット］
　本発明の樹状突起構造を有するポドサイトの培養用キットは、温度感受性不死化ポドサイト、Ｌ５２１、及びＲＯＣＫ阻害剤を含む。本発明の樹状突起構造を有するポドサイトの培養用キットにおいて、温度感受性不死化ポドサイト、Ｌ５２１、及びＲＯＣＫ阻害剤は、前記したものが挙げられる。
　本発明の樹状突起構造を有するポドサイトの培養用キットにおいて、Ｌ５２１は、基板上に固定されているものを用いることが好ましい。前記基板としては、前記ポドサイトの培養方法において挙げられた基板を用いることができる。Ｌ５２１が基板上に固定されていることにより、安定して樹状突起構造を有するポドサイトを培養することができる。
　本発明のキットにおいて、前記温度感受性不死化ポドサイトは、細胞外マトリックス存在下で培養したものであっても、非存在下で培養したものであってもよいが、細胞外マトリックス非存在下で培養したものであることが好ましい。
　本発明のキットにおいて、前記温度感受性不死化ポドサイトは、２５～３５℃、好ましくは、３３℃で培養したものが好ましい。前記温度感受性不死化ポドサイトを２５～３５℃、好ましくは３３℃の増殖条件で培養することにより、前記温度感受性不死化ポドサイトの増殖が促進される。
　本発明のキットには、温度感受性不死化ポドサイト、Ｌ５２１、及びＲＯＣＫ阻害剤以外に、他の構成要素を含んでいてもよい。例えば、温度感受性不死化ポドサイトを分化可能なＩＦＮγ非含有の無血清培地を含んでいてもよい。
　本発明のキットには、前記培養方法で用いる特開２０１８－４２５５６号に開示された前記細胞培養装置を含んでいてもよい。
［生体内ポドサイトに対する被検物質の毒性判定方法］
　本発明の生体内ポドサイトに対する被検物質の毒性判定方法は、コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、Ｌ５２１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養して得られた樹状突起構造を有するポドサイトに、被検物質を添加した後、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害があるか否かを検証し、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害がある場合に、前記被検物質が生体内のポドサイトに対し毒性があると判定することにより行うことができる。
　本発明の毒性判定方法において、温度感受性不死化ポドサイト、Ｌ５２１、及びＲＯＣＫ阻害剤は、前記したものが挙げられる。
　本発明の毒性判定方法において、Ｌ５２１の細胞外マトリックスは、基板上に固定されていることが好ましい。前記基板としては、前記ポドサイトの培養方法において挙げられた基板を用いることができる。Ｌ５２１が基板上に固定されていることにより、効率よく被検物質の毒性を判定することができる。
　本発明の毒性判定方法において、前記温度感受性不死化ポドサイトは、細胞外マトリックス存在下で培養したものであっても、細胞外マトリックス非存在下で培養したものであってもよいが、細胞外マトリックス非存在下で培養したものを用いることが好ましい。
　本発明の毒性判定方法において、前記温度感受性不死化ポドサイトは、２５～３５℃、好ましくは、３３℃で培養したものが好ましい。前記温度感受性不死化ポドサイトを２５～３５℃、好ましくは３３℃の増殖条件で培養することにより、前記温度感受性不死化ポドサイトの増殖が促進されるため、効率よく被検物質の毒性を判定することができる。
　前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害があるか否かの検証は、（１）基底側（ポドサイトが固定化されている側とは反対側）から、ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質を含む培養液を灌流し、ポドサイトが固定化されている多孔質膜上のポドサイトの樹状突起構造を、前記物質が通過する割合を判定する方法、（２）前記ポドサイトの樹状突起構造が傷害された際に変化する分子を、定量ＰＣＲ法等によるｍＲＮＡレベルでの変化、ウェスタンブロットやＥＬＩＳＡ等の蛋白質発現定量法による変化により検出する方法、（３）前記ポドサイトの樹状突起構造が傷害された際に観察される細胞骨格の変化を観察する方法、（４）前記ポドサイトの樹状突起構造が傷害された際にアポトーシス等による細胞死に陥り、細胞密度が減少する所見を位相差顕微鏡等による細胞数カウント、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ等を用いた核染色による核カウント、又は基底側の培養液に脱落するポドサイトの数のカウントによって検証する方法、（５）基底側の培養液中において、成熟期ポドサイトにおいて発現が認められるポドカリキシン等のマーカー陽性細胞数が被検物質非存在下と比較して増加しているかの検証、成熟期ポドサイトにおいて発現が認められるポドカリキシン等のマーカーの、クレアチニンなどのポドサイトを通過することが可能な低分子物質に対する比が増大しているかの検証、ＷＴＩエクソソームが、被検物質非存在下と比較して増加しているかの検証等により行うことができる。
　上記（１）の検証方法は、具体的には、温度感受性不死化ポドサイトが固定化されている基板を多孔質膜上で前記培養方法により培養し、被検物質を添加した後、基底側（ポドサイトが固定化されている側とは反対側）から、前記ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質（以下、傷害時通過物質とも称する）を含む培養液を灌流し、ポドサイトが固定化されている多孔質膜上のポドサイトの樹状突起構造を、前記傷害時通過物質が通過する割合を判定することにより行うことができる。前記被検物質がポドサイトに対し毒性がある場合は、ポドサイトの樹状突起構造が破綻するため、前記傷害時通過物質が基底側からポドサイト側に流入する割合が増加し、ポドサイト側で前記傷害時通過物質が検出される割合が、被検物質がない場合と比較して増加する。
　それに対し、被検物質がポドサイトに対し毒性を有さない場合は、ポドサイトの樹状突起構造が維持されるため、前記傷害時通過物質が基底側からポドサイト側に流入する割合が変化しないか、又は増加することが少ないため、ポドサイト側で前記傷害時通過物質が検出される割合が、被検物質がない場合と比較して変化しないか、又は増加することが少なくなる。
　前記ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ等の高分子物質が挙げられる。これらの高分子物質は、一種で用いても組み合わせて用いてもよい。前記ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質を検出する方法としては、例えば、質量分析装置を用いる方法、前記ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質を標識物質で標識し、前記標識を検出する方法等が挙げられる。前記標識物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素等が挙げられるが、蛍光物質が好ましい。
　（１）の検出方法において、ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質と同時に、ポドサイトが傷害を受けたか否かに関わらず、糸球体濾過障壁を自由に通過することができる低分子物質を組み合わせることが好ましい。前記低分子物質としては、イヌリン等が挙げられる。例えば、傷害前の生理的な状況ではイヌリンは、ポドサイトの樹状突起構造を通過でき、アルブミンの通過は抑制されているが、ポドサイトが傷害を受けると、イヌリンとアルブミンの両者とも通過できてしまうため、傷害の前後でイヌリンとアルブミンのクリアランスの差があるか否かを検出することにより、被検物質がポドサイトに対して毒性があるかを判定することができる。
　また、例えば、基底側から灌流させる培養液中にあらかじめトランスフェリンとＩｇＧを、それぞれ別々の波長で光る蛍光標識を行った状態でかつ濃度を既知の状態で含ませ、ポドサイト側に流入してくる培養液中の各々の蛍光強度よりトランスフェリンとＩｇＧの濃度を割り出せるようにし、傷害の前後でトランスフェリンとＩｇＧのクリアランスの比をとることにより、被検物質がポドサイトに対して毒性があるかを判定することもできる。
　（２）の検証方法において、前記ポドサイトの樹状突起構造が傷害された際に変化する分子としては、ＷＴ１、ＭａｆＢ、Ｌｍｘ１ｂ、Ｐｏｄ１、Ｆｏｘｃ２、ｎｅｐｈｒｉｎ（ＮＰＨＳ１）、ｐｏｄｏｃｉｎ（ＮＰＨＳ２）、ｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ、ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ、α－ａｃｔｉｎｉｎ－４、ＮＥＰＨ１、ＦＡＴ、Ｐ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｌａｍｉｎｉｎβ２（ＬＡＭＢ２）等が挙げられる。
　（３）の検証方法において、前記ポドサイトの樹状突起構造が傷害された際に観察される細胞骨格の変化を観察する方法としては、走査型電子顕微鏡により樹状突起構造から敷石状配列への変化を観察する方法、透過型電子顕微鏡によりポドサイトのＦｏｏｔ　ｐｒｏｃｅｓｓ消失、スリット膜の消失を観察する方法、免疫染色により、中間径フィラメント(ビメンチン、ネスティン、デスミン等)が樹状突起構造から細胞質内散在パターンへ変化する所見、アクチンが点状配列からストレスファイバー様へ変化する所見を観察する方法等が挙げられる。
　（５）の検証方法において、基底側の培養液中において、成熟期ポドサイトにおいて発現が認められるポドカリキシン等のマーカー陽性細胞数が、被検物質非存在下と比較して増加している場合、被検物質がポドサイトに対して毒性があると判定することができる。また、成熟期ポドサイトにおいて発現が認められるポドカリキシン等のマーカーの、クレアチニンなどのポドサイトを通過することが可能な低分子物質に対する比が増大している場合、被検物質がポドサイトに対して毒性があると判定することができる。また、ＷＴＩエクソソームが、被検物質非存在下と比較して増加している場合、被検物質がポドサイトに対して毒性があると判定することができる。
［生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法］
　本発明の生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法は、コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、Ｌ５２１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養して得られた樹状突起構造を有するポドサイトに、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害を与える条件下で被検物質を添加した後、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害があるか否かを検証し、前記樹状突起構造の傷害を抑制する被検物質を選択することにより行うことができる。
　本発明のスクリーニング方法において、温度感受性不死化ポドサイト、Ｌ５２１、及びＲＯＣＫ阻害剤は、前記したものが挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法において、Ｌ５２１は、基板上に固定されていることが好ましい。前記基板としては、前記ポドサイトの培養方法において挙げられた基板を用いることができる。Ｌ５２１が基板上に固定されていることにより、効率よく生体内ポドサイト保護剤をスクリーニングすることができる。
　本発明のスクリーニング方法において、前記温度感受性不死化ポドサイトは、細胞外マトリックス存在下で培養したものであっても、細胞外マトリックス非存在下で培養したものであってもよいが、細胞外マトリックス非存在下で培養したものを用いることが好ましい。
　本発明のスクリーニング方法において、前記温度感受性不死化ポドサイトは、２５～３５℃、好ましくは、３３℃で培養したものが好ましい。前記温度感受性不死化ポドサイトを２５～３５℃、好ましくは３３℃の増殖条件で培養することにより、前記温度感受性不死化ポドサイトの増殖が促進されるため、効率よく生体内ポドサイト保護剤をスクリーニングすることができる。
　前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害があるか否かの検証は、前記毒性判定方法において挙げた方法より行うことができる。
　本発明の生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法としては、例えば、温度感受性不死化ポドサイトが固定化されている基板を多孔質膜上で、前記培養方法により培養し、前記樹状突起構造を有するポドサイトに傷害を与える物質と被検物質とを添加した後、基底側（ポドサイトが固定化されている側とは反対側）から、ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質（傷害時通過物質）を含む培養液を灌流し、ポドサイトが固定化されている多孔質膜上のポドサイト樹状突起構造を、前記傷害時通過物質が通過することを抑制する被検物質を選択することにより、生体内ポドサイト保護剤をスクリーニングする方法等が挙げられる。被検物質にポドサイト保護作用がある場合は、前記樹状突起構造を有するポドサイトに傷害を与える物質が存在しても、ポドサイトの樹状突起構造が維持されるため、前記傷害時通過物質が基底側からポドサイト側に流入することが抑制され、ポドサイト側で検出される前記傷害時通過物質の割合が、被検物質非存在下と比較して減少する。
　それに対し、被検物質がポドサイトに対し保護作用を有さない場合は、前記樹状突起構造を有するポドサイトに傷害を与える物質により、ポドサイトの樹状突起構造が破綻し、前記傷害時通過物質が基底側からポドサイト側に流入することが抑制されないため、ポドサイト側で検出される前記傷害時通過物質の割合が、被検物質非存在下と比較して減少しない。
　前記ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質としては、前記毒性判定方法で挙げた物質が挙げられる。
　前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害を与える条件としては、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害を与える条件であれば特に制限はないが、例えば、アドリアマイシン等の抗腫瘍剤を添加する条件等が挙げられる。
　また、本発明のスクリーニング方法において、ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質と同時に、ポドサイトが傷害を受けたか否かに関わらず、糸球体濾過障壁を自由に通過することができる低分子物質を組み合わせることが好ましい。前記低分子物質としては、イヌリン等が挙げられる。例えば、傷害前の生理的な状況ではイヌリンは通過でき、アルブミンは通過できないが、ポドサイトが傷害を受けると、イヌリンとアルブミンの両者とも通過できてしまうため、傷害の前後でイヌリンとアルブミンのクリアランスの差がないか否かを検出することにより、被検物質がポドサイトに対して保護作用を有するか否かを判定することができる。
　また、例えば、基底側から灌流させる培養液中にあらかじめトランスフェリンとＩｇＧを、それぞれ別々の波長で光る蛍光標識を行った状態でかつ濃度を既知の状態で含ませ、ポドサイト側に流入してくる培養液中の各々の蛍光強度よりトランスフェリンとＩｇＧの濃度を割り出せるようにし、傷害の前後でトランスフェリンとＩｇＧのクリアランスの比をとることにより、被検物質がポドサイトに対して保護作用を有するか否かを判定することもできる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］温度感受性不死化ポドサイトの培養（１）
　ＳＶ４０ラージＴ抗原が導入されたマウス（Ｈ－２Ｋｂ－ｔｓＡ５８　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｏｕｓｅ）より単離されたマウス温度感受性不死化ポドサイトをディッシュ（ＰＲＩＭＡＲＩＡ　Ｄｉｓｈ；Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）上で、播種密度１．３５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で、ＩＦＮγ（＃３１５－０５、Ｐｅｐｒｏ－ｔｅｃｈ社製）を終濃度で５ｎｇ／ｍＬ存在下、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ及び１０％Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｒ８７５８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で、３３℃で３日間培養した。温度感受性不死化ポドサイトは、３日間培養することによりコンフルエントに達した。
　上記で得られたコンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、０．５％ＩＴＳ－Ｘ（５１５０００５６、Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｍ７１４５－１００ＭＬ、Ｍｅｒｃｋ社製）、１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＧＦ１（２５０－１９、Ｐｅｐｒｏ－Ｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ（３１５－０９、Ｐｅｐｒｏ－Ｔｅｃｈ社製）、１ｎｇ／ｍＬ　ＨＧＦ（３１５－２３、Ｐｅｐｒｏ－Ｔｅｃｈ社製）、１ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２（４５０－３３、Ｐｅｐｒｏ－Ｔｅｃｈ社製）及び１０μＭ　Ｙ２７６３２（０３６－２４０２３、富士フィルム和光純薬社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｒ８７５８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で、Ｌ５２１が固定化されたポリスチレン樹脂製の基板上で、３７℃で２時間培養した。対照として、前記温度感受性不死化ポドサイトを、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）を含む０．１％ＭＥＭ培地で、Ｌ５２１が固定化されていない基板上で培養した。細胞は、ビメンチン及びＤＡＰＩを用いて染色を行った。細胞が樹状突起構造を有さなければ、ビメンチンは細胞質内に散在するパターンとなるが、樹状突起構造を有していれば、ビメンチンの局在パターンが、細胞体中心から四方に伸びたパターンとなる。ＤＡＰＩは細胞の核を染色できるため、ＤＡＰＩ染色により、細胞の存在を確認することができる。結果を図１に示す。
　図１に示したように、Ｌ５２１が固定化された基板上で、Ｙ２７６３２を含む無血清培地で培養したポドサイトは、樹状突起構造を有していた。それに対し、Ｌ５２１が固定化されていない基板を用い、Ｙ２７６３２を含まない血清培地で培養したポドサイトは、樹状突起構造を有していなかった。
［実施例２］温度感受性不死化ポドサイトの培養（２）
　ＳＶ４０ラージＴ抗原が導入されたマウスより単離された温度感受性不死化ポドサイトの代わりに、ＳＶ４０ラージＴ抗原が導入されたラットより単離された温度感受性不死化ポドサイトを用いる以外は、実施例１と同様にして温度感受性不死化ポドサイトを培養した。その結果を図２に示す。図２（下段）に示したように、ラット温度感受性不死化ポドサイトを用いた場合でも、樹状突起構造を有するポドサイトを再現することができた。
［実施例３］樹状突起構造特異的遺伝子の発現
　実施例１で得られたポドサイトの樹状突起構造特異的遺伝子であるＰＯＤＸＬ、ＳＹＮＰＯ、Ｖｉｍ、及びＩＴＧＡ３の発現を定量ＰＣＲ法により確認した。
　その結果を図３に示す。なお、図３中、ＰＧＣは、コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、増殖条件（Ｌ５２１非固定、ＩＦＮγ添加、血清添加条件で、３３℃で培養）で培養した場合のポドサイトの結果を示す。図３に示したように、実施例１で培養して得られたポドサイト（図中、ＰＲＣで示す）は、樹状突起構造特異的な遺伝子であるＰＯＤＸＬ、ＳＹＮＰＯ、Ｖｉｍ、及びＩＴＧＡ３の発現が、血清を添加して分化条件で培養した場合（Ｌ５２１固定、ＩＦＮγ無添加、血清添加条件で、３７℃で培養、図中、ＳＴＤで示す）と、増殖条件で培養した場合と比較して有意に上昇していることが確認された。
［比較例１］
　Ｙ２７６３２を含まない無血清培地を用いる以外は、実施例１と同様にして、温度感受性不死化ポドサイトを培養した。その結果を図４（左から１番目）に示す。図４に示したように、Ｙ２７６３２を含まない無血清培地を用いて培養したポドサイトは、Ｙ２７６３２を含む無血清培地で培養したポドサイト（左から４番目）と比較して、樹状突起構造を有していなかった。
［比較例２］
　Ｌ５２１の代わりに、ラミニンα５β１γ１（以下、Ｌ５１１とも称する）を用いた以外は、実施例１と同様にして、温度感受性不死化ポドサイトを培養した。その結果を図４（左から２番目）に示す。図４に示したように、Ｌ５１１を用いて培養した場合は、Ｌ５２１を用いて培養したポドサイト（左から４番目）と比較して、ポドサイトは樹状突起構造を有していなかった。
［比較例３］
　培地に１０％ＦＢＳを添加する以外は、実施例１と同様にして、温度感受性不死化ポドサイトを培養した。その結果を図４（左から３番目）に示す。図４に示したように、血清培地を用いた場合は、無血清培地で培養したポドサイト（左から４番目）と比較して、ポドサイトは樹状突起構造を有していなかった。
　本発明によれば、ポドサイトの培養方法、ポドサイトの培養用キット、被検物質の毒性判定方法、及び、生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法を提供することができる。

Claims (13)

  1. 　コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、ラミニンα５β２γ１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養することを特徴とする樹状突起構造を有するポドサイトの培養方法。
  2. 　前記ラミニンα５β２γ１が、基板上に固定化されている、請求項１に記載の培養方法。
  3. 　前記温度感受性不死化ポドサイトが、細胞外マトリックス非存在下で培養したものである、請求項１又は２に記載の培養方法。
  4. 　前記温度感受性不死化ポドサイトが、３３℃、増殖条件下で培養したものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の培養方法。
  5. 　前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ２７６３２である、請求項１～４のいずれか一項に記載の培養方法。
  6. 本体部と、前記本体部に着脱可能に取り付けられる挿入部とを備え、前記本体部は、培養液を収容可能な液収容空洞を含み、前記挿入部は、細胞を収容可能な細胞収容空間を含む細胞収容部と、前記細胞収容空間の下面を画定する膜部材であって培養液が透過可能な膜部材とを含み、前記本体部に挿入部が取り付けられると前記膜部材が液収容空洞内に位置し、前記液収容空洞に供給された培養液が前記細胞収容空間内に流入し、前記細胞収容空間内に収容された細胞が培養液の流れの中で培養可能になる細胞培養装置を用いて培養する、請求項１～５のいずれか一項に記載の培養方法。
  7. 　温度感受性不死化ポドサイト、ラミニンα５β２γ１、及びＲＯＣＫ阻害剤を含む、樹状突起構造を有するポドサイトの培養用キット。
  8. 　コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、ラミニンα５β２γ１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養して得られた樹状突起構造を有するポドサイトに、被検物質を添加した後、前記ポドサイトの樹状突起構造の傷害の有無を検証し、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害がある場合に、前記被検物質が生体内のポドサイトに対し毒性があると判定することを特徴とする生体内ポドサイトに対する被検物質の毒性判定方法。
  9. 　前記樹状突起構造の傷害の有無の検証が、前記ポドサイトが傷害を受けたときに、ポドサイトの樹状突起構造を通過する割合が増加する物質の検出である、請求項８に記載の判定方法。
  10. 　前記物質が、アルブミン、トランスフェリン及びＩｇＧからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項９に記載の判定方法。
  11. 　前記物質が、蛍光標識されている、請求項９又は１０に記載の判定方法。
  12. 前記物質の検出と同時に、イヌリンの、前記ポドサイトの樹状突起構造の通過を検出する、請求項９～１１のいずれか一項に記載の判定方法。
  13. 　コンフルエントに達した温度感受性不死化ポドサイトを、ラミニンα５β２γ１上で、ＲＯＣＫ阻害剤存在下で、無血清で培養して得られた樹状突起構造を有するポドサイトに、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害を与える条件下で被検物質を添加した後、前記ポドサイトの樹状突起構造に傷害があるか否かを検証し、前記樹状突起構造の傷害を抑制する被検物質を選択することを特徴とする生体内ポドサイト保護剤のスクリーニング方法。
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