WO2021006568A1 - 미생물 콜로니 검출 시스템 - Google Patents

미생물 콜로니 검출 시스템 Download PDF

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WO2021006568A1
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colonies
concentration
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PCT/KR2020/008756
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김영덕
양승범
박용근
한승윤
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(주)더웨이브톡
한국과학기술원
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
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    • G01N15/075—Investigating concentration of particle suspensions by optical means
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    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N2015/03—Electro-optical investigation of a plurality of particles, the analyser being characterised by the optical arrangement

Definitions

  • Embodiments of the present invention relate to a microbial colony detection system.
  • a culture-type counting method using a medium was used as a microorganism detection system.
  • a method of measuring the number of colonies of microorganisms grown using an agar medium is used as a microorganism counting method.
  • a method of visually counting the number of colonies generated on an agar medium or the like a method of counting the number of colonies by processing image data of a medium to be counted using a CCD camera or the like has recently been proposed.
  • the above-described counting methods do not directly count the number of microorganisms, and have no choice but to count by culturing in a colony state that can be seen with the naked eye, so at least one day or more is required for counting.
  • An object of the present invention is to provide a system for rapidly detecting microbial colonies from a sample image.
  • a method for detecting a microbial colony comprising the step of obtaining a spatial correlation of the interference pattern and determining information on the concentration of the colony in the sample based on a change over time in the spatial correlation of the interference pattern is provided.
  • the microbial colony detection system can detect colonies in a sample within a short time. Since the degree of interference pattern formation is only affected by colony formation, the microbial colony detection system may not be sensitive to vibration or external noise. In addition, the microbial colony detection system has the advantage of enabling fast and accurate measurement because there is no effect even when the culture material of the sample unit is unstable. In addition, since the microbial colony detection system analyzes by reflecting the area occupied by the colonies on the surface, even a small number of colonies can be observed after a certain period of time, and a single colony can be measured within a short time.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram schematically showing a microbial colony detection system according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing another embodiment of the microbial colony detection system of FIG. 1.
  • FIG. 3 is a flowchart sequentially showing a method for detecting microbial colonies according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a method of irradiating light onto a sample unit.
  • 5 is a conceptual diagram for explaining a first condition.
  • 6 to 8 are diagrams for explaining a principle in which the microbial colony detection system according to an embodiment of the present invention determines concentration information of a high concentration sample.
  • 9 is an image photographing the degree of colony growth in samples by concentration.
  • FIG. 10 is a view for explaining the principle of performing an antibiotic susceptibility test (antimicrobial susceptibility test) using the microbial colony detection system according to embodiments of the present invention.
  • a method for detecting a microbial colony comprising the step of obtaining a spatial correlation of the interference pattern and determining information on the concentration of the colony in the sample based on a change over time in the spatial correlation of the interference pattern is provided.
  • the determining of the concentration level of the colonies in the sample includes determining a high concentration when the number of colonies detected per unit area of the sample image is greater than or equal to a preset reference value, and a low concentration when the number is less than the reference value. I can judge.
  • the determining of the concentration level of the colonies in the sample includes determining a high concentration when the degree of overlapping of single colonies detected in the sample image is greater than or equal to a preset reference value, and is less than the reference value. It can be judged as a low concentration.
  • the determining of the concentration information of the colonies in the sample comprises: when the determined concentration level by the control unit is a low concentration that is less than a preset reference value, a single colony in the entire area of the sample image The number of colonies in the sample may be counted by detecting the images of the cells.
  • An embodiment of the present invention provides a sample unit accommodating a sample, a light source for irradiating coherent light toward a sample of the sample unit, and detecting transmitted light passing through the sample unit to obtain a sample image in time series.
  • the image sensor and the sample image after a preset time are analyzed to determine the concentration level of colonies in the sample, and when the determined concentration level is a high concentration that is equal to or greater than a preset reference value, spatial correlation of the interference pattern of the sample image correlation) and a control unit for determining the concentration information of the colony in the sample based on a change over time in the spatial correlation of the interference pattern.
  • the controller may determine a high concentration when the number of colonies detected per unit area of the sample image is greater than or equal to a preset reference value, and determine a low concentration when it is less than the reference value.
  • control unit may determine a high concentration when a degree of overlapping of single colonies detected in the sample image is greater than or equal to a preset reference value, and determine a low concentration when it is less than the reference value.
  • the controller when the determined concentration level is a low concentration that is less than a preset reference value, the controller detects images of single colonies in the entire area of the sample image and counts the number of colonies in the sample. I can.
  • first and second are not used in a limiting meaning, but are used for the purpose of distinguishing one component from another component.
  • a part such as a unit, a region, or a component
  • another part not only is it directly above the other part, but also another unit, region, component, etc. is interposed therebetween. Includes cases.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram schematically showing a microbial colony detection system according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a diagram showing another embodiment of the microbial colony detection system of FIG. 1.
  • the microbial colony detection system 100, 100' according to embodiments of the present invention includes a light source 110, a sample unit 120, an image sensor 130, and a control unit 140.
  • the microbial colony detection system 100 of FIG. 1 includes the minimum configuration of the present invention, and the microbial colony detection system 100 ′ of FIG. 2 is a modified embodiment based on the microbial colony detection system 100 of FIG. 1. As shown, redundant description of the same configuration will be omitted.
  • the microbial colony detection system 100 and 100' is characterized in detecting a measurement object that changes in time series using light.
  • the microbial colony detection system 100, 100' may be a system that detects a measurement object that grows over time, such as a microorganism.
  • the present invention is not necessarily limited to detecting microorganisms, and it is of course possible to detect any object to be measured whose shape, concentration, and size change over time.
  • it will be described focusing on the detection of microbial colonies.
  • the microbial colony detection system 100, 100' irradiates light to the sample unit 120 for culturing microorganisms and detects the emitted light with the image sensor 130 to detect colonies in the sample unit 120 or count colonies. It is a technical idea to do.
  • the light source 110 may irradiate light having coherence toward the sample.
  • the light source 110 may be applied to any type of source device capable of generating light, and may be a laser capable of irradiating light of a specific wavelength band.
  • the light source 110 may be a laser that outputs light in a 532 nm wavelength band.
  • a laser having good coherence may be used as the light source 110 in order to form a speckle on the sample.
  • the measurement accuracy may increase. That is, as the coherence length increases, the measurement accuracy may increase.
  • laser light having a spectral bandwidth of the light source 110 less than a predefined reference bandwidth may be used as the light source 110, and measurement accuracy may increase as the spectral bandwidth of the light source 110 is shorter than the reference bandwidth.
  • the spectral bandwidth of the wave source may be set so that the condition of Equation 1 below is maintained.
  • the spectral bandwidth of the light source 110 may be kept less than 5 nm when light is irradiated into the sample at every reference time.
  • the microbial colony detection system 100' improves optical characteristics to increase analysis accuracy when irradiating the light generated from the light source 110 to the sample unit 120 Need to be made.
  • the microbial colony detection system 100 ′ may include one or more optical means between the light source 110 and the sample unit 120.
  • the optical means may include a filter 101, one or more optical lenses 102 and 103, a pinhole member 104, a mirror 107, a diaphragm 105, and the like.
  • the microbial colony detection system 100 ′ may control an irradiation area of light irradiated to the sample unit 120 using the optical means described above.
  • the microbial colony detection system 100 ′ may control the irradiation area of light to irradiate light to an area larger than the size of a single colony using the optical means described above. A detailed description of this will be described in FIG. 4.
  • the filter 101 may perform a function of controlling the irradiation intensity of light or removing noise, and for example, an ND filter (Neutral Density Filter) may be used.
  • One or more optical lenses 102 and 103 may perform a function of guiding a path of light.
  • the first optical lens 102 is disposed between the pinhole member 104 and the filter 101 to guide the path of light to the opening of the pinhole member 104, and the second optical lens
  • the lens 103 may be disposed between the pinhole member 104 and the sample unit 120 to perform a function of collimating with parallel rays by adjusting the size of light.
  • the pinhole member 104 functions as a spatial filter and can uniformly adjust the wavefront of light.
  • the diaphragm 105 may perform a function of guiding only a part of the parallel ray extended from the second optical lens 103 as a collimator into the sample unit 120.
  • the sample unit 120 may accommodate a sample to be measured.
  • the sample unit 120 may be applied in any container form capable of accommodating a sample, and may be, for example, an agar plate containing a culture solution for culturing microorganisms.
  • the sample may be accommodated in the sample unit 120 by various methods, and as an example, may be accommodated in the sample unit 120 by a pore method.
  • the microbial colony detection systems 100 and 100' may measure a sample in a transparent state, but may measure a sample having a turbidity or an opaque state such as meat or ham.
  • the sample unit 120 may include a culture material for culturing microorganisms.
  • the culture material corresponds to the type of microorganism to be counted, and may include a material capable of effectively culturing the microorganism.
  • the medium containing the culture material used for cultivation must adequately meet the requirements of the specific microorganism.
  • Various microbial culture media are described, for example, in “Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981. These media contain various carbon sources, nitrogen sources and trace element components.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose, lactose, sucrose, fructose, maltose, starch and fiber; Fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil and coconut oil; Fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid; Alcohol such as glycerol and ethanol and organic acids such as acetic acid may be included, and these carbon sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • carbohydrates such as glucose, lactose, sucrose, fructose, maltose, starch and fiber
  • Fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil and coconut oil
  • Fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid
  • Alcohol such as glycerol and ethanol and organic acids such as acetic acid may be included, and these carbon sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • Nitrogen sources include organic nitrogen sources and urea such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor (CSL) and bean flour, Inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate may be included, and these nitrogen sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • the medium may additionally contain potassium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate and corresponding sodium-containing salts as a phosphoric acid source, but is not limited thereto. . Further, the medium may contain a metal such as magnesium sulfate or iron sulfate, and amino acids, vitamins, and suitable precursors may be added.
  • oxygen or a gas containing oxygen may be injected into the culture solution.
  • the temperature of the culture may be generally 20-45°C, specifically 25-40°C.
  • the sample unit 120 may be connected to a heating means.
  • the sample unit 120 may include a lid member (not shown).
  • a heating means is provided in the lid member (not shown) to perform a function of evaporating moisture in the sample unit 120.
  • the image sensor 130 may measure a sample image, which is an optical image that is disposed on a path of light emitted from the sample unit 120 and emitted.
  • the image sensor 130 may detect the transmitted light K2 passing through the sample unit 120 to obtain a sample image in time series.
  • the image sensor 130 may be a CCD camera.
  • the microbial colony detection systems 100 and 100' may detect not only low concentration microorganisms but also high concentration microorganisms in the same configuration.
  • the image sensor 130 may measure the optical image emitted from the sample unit 120 and transmit it to the control unit 140, at this time, acquiring both a sample image for a low concentration sample and a sample image for a high concentration sample.
  • the image sensor 130 must be disposed to be spaced apart from the sample unit 120 by a predetermined distance. This will be described later.
  • the microbial colony detection system 100' includes a polarizer 190 between the paths of the transmitted light K2 emitted from the sample unit 120 and incident on the image sensor 130, so that unnecessary external reflected light is provided. The back can be removed.
  • the controller 140 may analyze the sample image acquired from the image sensor 130 to count the number of colonies in the sample or determine concentration information.
  • a method of counting the number of colonies in a sample or determining concentration information by the controller 140 will be described in detail with reference to the drawings.
  • the microbial colony detection system 100 irradiates light K1 to the sample unit 120 for culturing the microorganism and detects the emitted light K2 with the image sensor 130, and the sample unit ( 120) colonies can be detected or colonies can be counted.
  • the colony performs a diffuser function for the incident light K1. That is, before the colonies grow, the light K1 incident on the sample unit 120 does not have a diffusion medium and is emitted as it is, but when the colonies grow, the light incident on the sample unit 120 is scattered due to the colonies. Scattering may form an interference pattern or a diffraction pattern.
  • the microbial colony detection system 100 uses the image sensor 130 to capture an interference pattern or diffraction pattern formed by colonies, and analyzes the pattern shown in the captured optical image to detect colonies or count the number of colonies. I can.
  • the microbial colony detection system 100 may detect colonies or count the number of colonies regardless of the concentration of microorganisms in the initial sample.
  • the present invention is to solve such a problem, and has the advantage of being able to measure using a single device regardless of any concentration of the initial sample through the method described later.
  • microorganism as used in the present invention means a prokaryotic or eukaryotic microorganism having the ability to produce a useful target substance such as L-amino acid.
  • microorganisms with an increased intracellular ATP concentration are Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., and Providencia sp. ), Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Leptospira, Salmonellar sp., Brevibacteria sp., Hypomononas genus sp.), Chromobacterium sp., Nocardia, or fungi or yeast.
  • the microorganism may be a microorganism of the genus Escherichia.
  • microorganisms are Staphylococcus, coagulase negative, Staph. aureus, Streptococcus spp., Streptococcus virion dance group Streptococcus viridans group), Enterococcus spp., Corynebacterium spp., Aerococcus spp., Micrococcus spp., Peptococcus spp. , Lactococcus spp., Leukonostoc spp., Tothia spp., Gemella spp., Alcaligenes spp., Alternaria spp.
  • Flavobacterium spp. Bacillus spp., Achromobacter spp., Acinetobacter spp., Actinobacillus spp., Alcaligenes spp., Campylobacter spp., Edwardsiella spp.; Ehrlichia spp., Enterobacter spp., Ewingera spp. (Ewingella spp.), Flavobacteria, Hafnia spp., Klebsiella spp., Kluyvera spp., Legionella spp.
  • spp. Morxella spp., Morganella spp., Neisseria ( Neisseria spp.), Pasteurella spp., Prevotella spp., Proteus spp., Providencia spp., Pseudomonas spp.
  • non-tuberculous antioxidant It may include bacteria selected from the group consisting of non-Tuberculosis mycobacteria (NTB), Mycobacterium tuberculosis, and Mycobacterium avium. More specifically, the microorganism may be E. coli. However, the technical idea of the present invention is not limited thereto, and it goes without saying that other microorganisms may be further included.
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating a method of detecting a microbial colony according to an embodiment of the present invention in order
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a method of irradiating light to the sample unit 120.
  • the method for detecting microbial colonies includes first irradiating coherent light to the sample unit 120 using the light source 110. Do (S10).
  • the microbial colony detection system 100 may control the irradiation area of the incident light K1 irradiated from the light source 110 and provide it to the sample unit 120.
  • the microbial colony detection system 100 uses optical means so that the irradiation area of light is greater than the size of at least one single colony (C), or includes at least a portion of one single colony (C) and a portion of the surrounding area.
  • the irradiation area of light can be adjusted.
  • the peripheral region may be a region in which another single colony is formed based on one single colony (C) or a region in which a single colony is not formed.
  • the microbial colony detection system 100 is provided to the sample unit 120 by increasing the irradiation area of light so that the light generated from the light source 110 can cover the entire area of the sample unit 120 using optical means. can do.
  • the microbial colony detection system 100 may irradiate light to the sample unit 120 by varying the irradiation area of light as necessary. For example, the microbial colony detection system 100 initially controls the irradiation area of light to cover the entire area of the sample unit 120 in the step of roughly determining the concentration level of the colony in the sample, and then, the colony In the step of determining the concentration information of, the irradiation area of light may be controlled to a size sufficient to cover one single colony (C) and the surrounding area.
  • C single colony
  • the image sensor 130 detects the transmitted light K2 passing through the sample unit 120 to obtain a sample image in time series (S20).
  • the image sensor 130 may measure an optical image emitted from the sample unit 120 and transmit it to the controller 140.
  • the image sensor 130 should be disposed apart from the sample unit 120 by a predetermined distance in order to acquire both an optical image for a low concentration sample and an optical image for a high concentration sample.
  • the preset distance is a first condition that the distance must be close so that the image sensor 130 can sufficiently distinguish a single colony from a low concentration sample, and a distance must be long such that the speckle size is larger than the pixel size in a high concentration sample. It may have a range that satisfies all of the second conditions.
  • 5 is a conceptual diagram for explaining a first condition.
  • the first condition may be derived from Equation 2 below when Rayleigh criterion for lateral resolution is applied.
  • r is the smallest distinguishable distance
  • ⁇ is the laser wavelength (eg, 532 nm)
  • ⁇ is the light arriving at the image sensor with respect to the vertical axis. This represents the maximum value of the tilt angle.
  • NA is as follows.
  • a distance range between the image sensor 130 and the sample unit 120, specifically, the image sensor 130 and the sample according to the first condition is set as follows.
  • the range of distances satisfying the second condition is as follows.
  • the pixel size of the image sensor 130 may be a value determined by the image sensor 130.
  • the image sensor 130 may use a commercially available lumenera camera, and the lumenera camera may have a pixel size of 4.54 ⁇ m (based on a spec sheet).
  • the speckle size (d) is determined by NA and wavelength, and can be expressed as Equation 6 below.
  • Equation 6 is substituted into Equation 5, the following result can be obtained.
  • the image sensor 130 may be disposed apart from the sample unit 120 by a predetermined distance range derived through the above-described process.
  • the preset distance range is as follows.
  • the microbial colony detection method may determine the concentration level of the colony in the sample by analyzing the sample image by the control unit 140 after a preset time (S30).
  • a predetermined time to grow into a single colony is required.
  • the preset time may vary depending on the type of microorganism to be measured.
  • the controller 140 may determine the concentration level of the colony in the sample using the sample image captured through the image sensor 130.
  • the controller 140 may determine a high concentration, and when less than the reference value, determine a low concentration.
  • the low concentration means a concentration at which single colonies do not overlap each other and can be distinguished
  • the high concentration may mean a concentration at which single colonies overlap without being distinguished due to a large number of microorganisms.
  • the control unit 140 does not accurately count the number of colonies or analyze the concentration, but only performs an analysis to determine whether the sample is at a low concentration or a high concentration.
  • the controller 140 analyzes how much microbial colonies optically visible in the sample image are herpes per unit area, and determines the concentration level of the microbial colonies. In this case, the controller 140 may perform analysis on the entire area of the sample image, but in another embodiment, the concentration level may be determined by using the unit area image sampled within the sample image.
  • the controller 140 may use an image analysis method well known in the art to detect microbial colonies in the sample image.
  • the image analysis method may be a method of identifying microbial colonies in a sample image based on one or more criteria including object size, visibility, color, surface quality, and shape. For example, the controller 140 may detect a microbial colony by using the degree of shadowing of each pixel of the sample image.
  • the controller 140 may determine a high concentration when the degree of overlapping of single colonies detected in a sample image is greater than or equal to a preset reference value, and determine a low concentration when it is less than the reference value.
  • the controller 140 may detect the edge of a single colony using the image analysis method described above. Here, when the edges of a single colony do not overlap each other, the controller 140 may determine that the concentration is low.
  • the controller 140 may determine a high concentration when the overlapping degree is more than a certain degree. In this case, the controller 140 may determine the concentration level by averaging the overlapping degree of single colonies included in the unit area, not one single colony.
  • control unit 140 may change a method of analyzing a sample image according to whether the concentration level is a low concentration or a high concentration.
  • the controller 140 may count the number of colonies in the sample by detecting images of single colonies in the entire area of the sample image.
  • low-concentration samples such as 10 3 cfu/ml, 10 4 cfu/ml, and 10 5 cfu/ml shown in FIG. 9, the colonies grow so that they are non-overlapping enough to be distinguishable, so the controller 140 is as described above, You can count the number of colonies directly from the visual image.
  • the controller 140 roughly determines whether the concentration is a low concentration or a high concentration using a sample image that is a visual image, and when it is determined as a low concentration, the sample image that is a visual image is again Is used to count the total number of colonies.
  • the controller 140 may use an image analysis method and, unlike the previous step, may count the number of microbial colonies for the entire area.
  • the control unit 140 acquires spatial correlation of the interference pattern of the sample image, and obtains information on the density of colonies in the sample based on the change over time in the spatial correlation of the interference pattern. I can judge.
  • the method for detecting microbial colonies according to the present invention can obtain concentration information on the colonies of a high concentration through the following method.
  • FIG. 6 to 8 are diagrams for explaining the principle of the microbial colony detection system 100 according to an embodiment of the present invention to determine the concentration information of a high concentration sample
  • FIG. 9 is a degree of colony growth in samples by concentration This is an image taken.
  • the controller 140 may receive an optical image measured in a time series from the image sensor 130 and determine the concentration information of a colony in the sample from the optical image.
  • the colony may perform a diffuser function for incident light. That is, as shown in the left figure of FIG. 6, before the colony grows, the light incident on the sample unit 120 is emitted as it is because there is no medium to diffuse it. However, when the colony grows, the light incident on the sample unit 120 is They can be scattered by colonies to form interference patterns.
  • the controller 140 may obtain a spatial correlation of the interference pattern.
  • the spatial correlation given by the following equation can be expressed as a number of a certain range of how similar a pixel and a pixel separated by a distance r from the pixel have similar brightness in the image measured at time t (Fig. 7 (B) of).
  • the certain range may be in the range of -1 to 1. That is, the spatial correlation indicates the degree of correlation between an arbitrary pixel and another pixel, and 1 indicates a positive correlation, -1 indicates a negative correlation, and 0 indicates no relationship. Specifically, since brightness is evenly emitted before the interference pattern is formed, the spatial correlation of the sample image shows a positive correlation close to 1, but after the interference pattern is formed, the correlation value decreases in the direction close to 0. I can.
  • C 0 ( t ) was used to adjust the range of Equation 7 to -1 to 1. If the brightness I(r',t) measured at time t in an arbitrary pixel and the brightness I(r'+r,t) of a pixel separated by a distance r are the same, the spatial correlation is 1, and if not, 1 Will have a smaller value.
  • the present invention may represent the above spatial correlation only as a function of time.
  • the control unit 140 may obtain an average of the spatial correlation for pixels having the same size r from an arbitrary pixel as shown in Equation 8 below (see FIG. 7B).
  • control unit 140 may substitute a preset distance into Equation 8 and represent the time as a function, and the degree to which the interference pattern is formed is determined between 0 and 1, which is a certain range. It can be confirmed by the value of (see Fig. 7(d)).
  • the control unit 140 may distinguish between foreign substances and microbial colonies in the sample through a pattern change of the sample image over time.
  • the image does not change over time, but in the case of microbial colonies, since the image such as the shape and size changes over time, the microbial colony detection system 100 can distinguish between the foreign matter and the microbial colony.
  • control unit 140 may determine the concentration information of the microbial colony by using the spatial correlation as follows. Spatial correlation is achieved by creating two identical images that are superimposed using one image, shifting one of the images by a preset distance in one direction, and then moving two adjacent images between the shifted and unshifted images. It can be obtained by analyzing how similar the pixels are.
  • the spatial correlation is a measure of how uniform the image is. If an interference pattern is formed due to a colony, the similarity of two adjacent pixels decreases due to a small interference pattern, so the value of the spatial correlation also decreases. .
  • the control unit 140 may obtain the spatial correlation by shifting the image by a predetermined distance or more.
  • the predetermined distance r set in advance depends on the speckle size, and the controller 140 may obtain a spatial correlation by shifting the image by a pixel larger than the speckle size when expressed in pixel units.
  • the preset predetermined distance may be at least 3 pixels or more.
  • the controller 140 may acquire not only the spatial correlation as described above, but also a temporal correlation of the interference pattern of the measured sample image, and detect the microorganism based on the acquired temporal correlation.
  • the control unit 140 may calculate a temporal correlation coefficient between images using image information of the interference pattern measured in time series, and detect microbial colonies in the sample based on the time correlation coefficient. have.
  • the controller 140 may detect the microbial colony through an analysis in which the calculated time correlation coefficient falls below a preset reference value.
  • the microbial colony detection system 100 may estimate the presence or concentration of microorganisms even when no colonies are formed in the sample through time correlation analysis of the interference pattern formed by microscopic movements of microorganisms.
  • the microbial colony detection system 100 is a multi-scatter amplification for amplifying the number of times that light incident on the sample unit 120 is multiple scattered in the sample. It may further include a member.
  • a multiple scattering amplifying member (not shown) is provided on a path of light between the light source 110 and the sample unit 120 or between the sample unit 120 and the image sensor 130, and the number of multiple scattering of light Can be amplified.
  • the multiple scattering amplifying member (not shown) is formed in a structure that can be mounted or detached from the system, and may be used as needed.
  • the controller 140 may analyze microorganisms in a sample by performing a spatial correlation with respect to images of an interference pattern formed as a colony as well as a temporal correlation of an interference pattern measured in a time series.
  • the microbial colony detection system can detect colonies in a sample within a short time. Since the degree of interference pattern formation is only affected by colony formation, the microbial colony detection system may not be sensitive to vibration or external noise. In addition, the microbial colony detection system has the advantage of enabling fast and accurate measurement because there is no effect even when the culture material of the sample unit is unstable. In addition, since the microbial colony detection system analyzes by reflecting the area occupied by the colonies on the surface, even a small number of colonies can be observed after a certain period of time, and a single colony can be measured within a short time.
  • FIG. 10 is a view for explaining the principle of performing an antibiotic susceptibility test (antimicrobial susceptibility test) using the microbial colony detection system according to embodiments of the present invention.
  • the microbial colony detection system 100 may be used for antibiotic susceptibility evaluation.
  • Antimicrobial susceptibility test generally uses a colony counting method and a disk diffusion method.
  • the colony counting technique is a method of measuring the antimicrobial activity of the specimen through the count of the grown microbial community by spreading the microbial solution reacted with the specimen for a certain period of time on a nutrient agar, and then growing the microorganism for a certain period of time.
  • the method of counting microbial colonies described above or determining concentration information may be used.
  • the antibiotic susceptibility evaluation method shown in FIG. 10 shows the use of a disk diffusion method.
  • the general disk diffusion method is a method of measuring the size of the microbial growth inhibition zone around the specimen by placing the specimen on a nutrient agar medium coated with a certain amount of microorganisms and then growing the microorganism for a certain period of time As a result, the qualitative antibacterial activity of the specimen can be obtained. Conventionally, since the size of the microbial growth inhibition zone was directly measured by a human hand, there was a problem that the accuracy was low.
  • the microbial colony detection system may evaluate antibiotic sensitivity from a sample image obtained by irradiating light onto a culture plate on which an antibiotic disk is disposed, and detecting transmitted light, similar to the method described above.
  • the first antibiotic disk (d1) to the third antibiotic disk (d3) containing different antibiotics may be disposed on the culture plate.
  • the microbial growth inhibition zones of the second antibiotic disk d2 hardly grow, whereas the microbial growth inhibition zones A1 and A3 of the first antibiotic disk d1 and the third antibiotic disk d3 are You can see that the size has grown.
  • the first microbial growth inhibition zone A1 and the third microbial growth inhibition zone A3 may have different sizes.
  • the microbial colony detection system can scan light from the center to the edge of the microbial growth inhibition zone based on each antibiotic disk. Since the light incident on the microbial growth inhibition zone is evenly emitted because there are no microorganisms, there will be little change in the emitted light while scanning within the microbial growth inhibition zone. On the contrary, when light is incident on the edge of the microbial growth inhibition zone, light may be irradiated to both an area where the microorganism is present and an area that does not exist. In this case, an interference pattern may be formed due to different optical characteristics in a region in which microorganisms exist and a region in which no microorganisms exist.
  • the microbial colony detection system can quickly and accurately calculate the size of the microbial growth inhibition zone by detecting changes in the interference pattern while scanning around the antibiotic disk.
  • a system for detecting microbial colonies is provided.
  • the embodiments of the present invention can be applied to an apparatus for detecting impurities or microorganisms used in the industry.

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Abstract

본 발명의 일 실시예는, 샘플이 수용된 샘플 유닛으로 간섭성을 갖는 광을 조사하는 단계, 영상 센서에 의해, 상기 샘플 유닛을 투과하는 투과광을 감지하여 샘플 이미지를 시계열적으로 획득하는 단계, 사전에 설정된 시간 이후, 제어부에 의해 상기 샘플 이미지를 분석하여 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단하는 단계 및 상기 제어부에 의해 상기 판단된 농도 수준이 사전에 설정된 기준값 이상인 고농도인 경우, 상기 샘플 이미지의 간섭 패턴의 공간상관관계(spatial correlation)를 획득하고, 상기 간섭 패턴의 공간상관관계의 시간에 따른 변화를 기초로 상기 샘플 내 콜로니의 농도 정보를 판단하는 단계를 포함하는 미생물 콜로니 검출 방법을 제공한다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 04.08.2020]　미생물 콜로니 검출 시스템
본 발명의 실시예들은 미생물 콜로니 검출 시스템에 관한 것이다.
식품 또는 의료분야에서는, 의도치 않은 미생물이 발생되어 문제가 되는 경우가 빈번하다. 이러한 미생물의 증식 여부를 확인하기 위해 종래에는 미생물 검출 시스템으로, 배지를 사용한 배양형의 계수 방법이 이용되었다. 예를 들면, 미생물 계수 방법으로서, 한천 배지를 사용하여 증식된 미생물의 콜로니수를 계측하는 방법이 사용되고 있다. 한편, 한천 배지 등에 생성된 콜로니수를 시각적으로 계수하는 방법 대신, 최근 CCD 카메라 등을 이용하여 촬영한 계수 대상 배지의 영상 데이터를 데이터 처리해 콜로니수를 계수하는 방법도 제안되고 있다.
그러나, 상기한 계수 방법들은 미생물의 개체수를 직접적으로 계수하지 못하고, 육안으로 확인 가능한 콜로니 상태로 배양시켜 계수할 수 밖에 없어 계수를 위하여 적어도 하루 이상의 시간이 소요되는 문제점이 있었다.
본 발명은 샘플 이미지로부터 빠르게 미생물 콜로니를 검출하는 시스템을 제공하는 데에 목적이 있다.
본 발명의 일 실시예는, 샘플이 수용된 샘플 유닛으로 간섭성을 갖는 광을 조사하는 단계, 영상 센서에 의해, 상기 샘플 유닛을 투과하는 투과광을 감지하여 샘플 이미지를 시계열적으로 획득하는 단계, 사전에 설정된 시간 이후, 제어부에 의해 상기 샘플 이미지를 분석하여 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단하는 단계 및 상기 제어부에 의해 상기 판단된 농도 수준이 사전에 설정된 기준값 이상인 고농도인 경우, 상기 샘플 이미지의 간섭 패턴의 공간상관관계(spatial correlation)를 획득하고, 상기 간섭 패턴의 공간상관관계의 시간에 따른 변화를 기초로 상기 샘플 내 콜로니의 농도 정보를 판단하는 단계를 포함하는 미생물 콜로니 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예들에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템은 빠른 시간 내에 샘플 내의 콜로니를 검출할 수 있다. 간섭 패턴의 형성정도는 오직 콜로니 형성여부에만 영향을 받기 때문에, 미생물 콜로니 검출 시스템은 진동이나 외부 노이즈에 민감하지 않을 수 있다. 또한, 미생물 콜로니 검출 시스템은 샘플 유닛의 배양물질이 불안정한 경우에도 영향이 없어 빠르고 정확한 계측이 가능하다는 장점을 갖는다. 또한, 미생물 콜로니 검출 시스템은 콜로니가 표면 상에서 차지하는 면적을 반영하여 분석하므로, 적은 수의 콜로니로도 일정 시간 후에는 관찰이 가능하게 되고, 빠른 시간 내에 단일 콜로니(single colony)를 측정할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템을 개략적으로 도시한 개념도이다.
도 2는 도 1의 미생물 콜로니 검출 시스템의 다른 실시형태를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 콜로니 검출 방법을 순서대로 도시한 순서도이다.
도 4는 샘플 유닛에 광을 조사하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 제1 조건을 설명하기 위한 개념도이다.
도 6 내지 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템이 고농도의 샘플의 농도 정보를 판단하는 원리를 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 농도별 샘플에서의 콜로니 성장 정도를 촬영한 이미지이다.
도 10은 본 발명의 실시예들에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템을 이용하여 항생제 감수성 평가(antimicrobial susceptibility test)를 수행하는 원리를 설명하기 위한 도면이다.
본 발명의 일 실시예는, 샘플이 수용된 샘플 유닛으로 간섭성을 갖는 광을 조사하는 단계, 영상 센서에 의해, 상기 샘플 유닛을 투과하는 투과광을 감지하여 샘플 이미지를 시계열적으로 획득하는 단계, 사전에 설정된 시간 이후, 제어부에 의해 상기 샘플 이미지를 분석하여 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단하는 단계 및 상기 제어부에 의해 상기 판단된 농도 수준이 사전에 설정된 기준값 이상인 고농도인 경우, 상기 샘플 이미지의 간섭 패턴의 공간상관관계(spatial correlation)를 획득하고, 상기 간섭 패턴의 공간상관관계의 시간에 따른 변화를 기초로 상기 샘플 내 콜로니의 농도 정보를 판단하는 단계를 포함하는 미생물 콜로니 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단하는 단계는, 상기 샘플 이미지의 단위 면적당 검출되는 콜로니의 수가 사전에 설정된 기준값 이상인 경우 고농도로 판단하고, 상기 기준값 미만인 경우 저농도로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단하는 단계는, 상기 샘플 이미지에서 검출되는 단일 콜로니들이 중첩되는 정도가 사전에 설정된 기준값 이상인 경우 고농도로 판단하고, 상기 기준값 미만인 경우 저농도로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 샘플 내 콜로니의 농도 정보를 판단하는 단계는, 상기 제어부에 의해 상기 판단된 농도 수준이 사전에 설정된 기준값 미만인 저농도인 경우, 상기 샘플 이미지의 전체 면적에서 단일 콜로니들의 이미지를 검출하여 상기 샘플 내 콜로니의 수를 계수할 수 있다.
본 발명의 일 실시예는, 샘플을 수용하는 샘플 유닛, 상기 샘플 유닛의 샘플을 향하여 간섭성을 갖는 광을 조사하는 광원, 상기 샘플 유닛을 투과하는 투과광을 감지하여 샘플 이미지를 시계열적으로 획득하는 영상 센서 및 사전에 설정된 시간 이후 상기 샘플 이미지를 분석하여 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단하고, 상기 판단된 농도 수준이 사전에 설정된 기준값 이상인 고농도인 경우 상기 샘플 이미지의 간섭 패턴의 공간상관관계(spatial correlation)를 획득하고, 상기 간섭 패턴의 공간상관관계의 시간에 따른 변화를 기초로 상기 샘플 내 콜로니의 농도 정보를 판단하는 제어부를 포함하는, 미생물 콜로니 검출 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제어부는 상기 샘플 이미지의 단위 면적당 검출되는 콜로니의 수가 사전에 설정된 기준값 이상인 경우 고농도로 판단하고, 상기 기준값 미만인 경우 저농도로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제어부는 상기 샘플 이미지에서 검출되는 단일 콜로니들이 중첩되는 정도가 사전에 설정된 기준값 이상인 경우 고농도로 판단하고, 상기 기준값 미만인 경우 저농도로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제어부는 상기 판단된 농도 수준이 사전에 설정된 기준값 미만인 저농도인 경우, 상기 샘플 이미지의 전체 면적에서 단일 콜로니들의 이미지를 검출하여 상기 샘플 내 콜로니의 수를 계수할 수 있다.
전술한 것 외의 다른 측면, 특징, 이점이 이하의 도면, 특허청구범위 및 발명의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 이하의 실시예들을 상세히 설명하기로 하며, 도면을 참조하여 설명할 때 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 도면부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 실시예들은 다양한 변환을 가할 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 본 실시예들의 효과 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 내용들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 실시예들은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다.
이하의 실시예에서 제1, 제2 등의 용어는 한정적인 의미가 아니라 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하는 목적으로 사용되었다.
이하의 실시예에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
이하의 실시예에서 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 또는 구성요소가 존재함을 의미하는 것이고, 하나 이상의 다른 특징들 또는 구성요소가 부가될 가능성을 미리 배제하는 것은 아니다.
이하의 실시예에서 유닛, 영역, 구성 요소 등의 부분이 다른 부분 위에 또는 상에 있다고 할 때, 다른 부분의 바로 위에 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 유닛, 영역, 구성 요소 등이 개재되어 있는 경우도 포함한다.
이하의 실시예에서 연결하다 또는 결합하다 등의 용어는 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 반드시 두 부재의 직접적 및/또는 고정적 연결 또는 결합을 의미하는 것은 아니며, 두 부재 사이에 다른 부재가 개재된 것을 배제하는 것이 아니다.
명세서상에 기재된 특징, 또는 구성요소가 존재함을 의미하는 것이고, 하나 이상의 다른 특징들 또는 구성요소가 부가될 가능성을 미리 배제하는 것은 아니다.
도면에서는 설명의 편의를 위하여 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다. 예컨대, 도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 임의로 나타내었으므로, 이하의 실시예는 반드시 도시된 바에 한정되지 않는다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템을 개략적으로 도시한 개념도이고, 도 2는 도 1의 미생물 콜로니 검출 시스템의 다른 실시형태를 도시한 도면이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 실시예들에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템(100, 100')은 광원(110), 샘플 유닛(120), 영상 센서(130) 및 제어부(140)를 포함할 수 있다. 도 1의 미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 본 발명의 최소 구성을 포함하며, 도 2의 미생물 콜로니 검출 시스템(100')은 도 1의 미생물 콜로니 검출 시스템(100)을 기초로 하는 변형실시형태를 나타내는 바, 동일한 구성에 대해서 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 실시예들에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템(100, 100')은 시계열적으로 변하는 측정대상체를 광을 이용하여 검출하는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 미생물 콜로니 검출 시스템(100, 100')은 미생물과 같이 시간이 지남에 따라 성장하는 측정대상체를 검출하는 시스템일 수 있다. 그러나, 본 발명은 반드시 미생물을 검출하는 것에 한정되는 것은 아니며, 시계열적으로 형상이나 농도, 크기가 변하는 어떠한 측정대상체도 검출가능함은 물론이다. 이하에서는 설명의 편의를 위하여 미생물 콜로니를 검출하는 것을 중심으로 설명하기로 한다.
미생물 콜로니 검출 시스템(100, 100')은 미생물을 배양하는 샘플 유닛(120)에 광을 조사하고 출사되는 광을 영상 센서(130)로 검출하여 샘플 유닛(120) 내의 콜로니를 검출하거나 콜로니를 계수하는 것을 기술적인 사상으로 한다.
광원(110)은 샘플을 향하여 간섭성(coherence)을 갖는 광을 조사할 수 있다. 여기서, 광원(110)은 광을 생성할 수 있는 모든 종류의 소스 장치를 적용할 수 있으며, 특정 파장 대역의 광을 조사할 수 있는 레이저(laser)일 수 있다. 예를 들면, 광원(110)은 532 nm 파장대역의 광을 출력하는 레이저일 수 있다.
예를 들어, 샘플에 스펙클(speckle)을 형성하기 위해서 간섭성(coherence)이 좋은 레이저를 광원(110)으로 이용할 수 있다. 이때, 레이저 광원의 간섭성을 결정하는 광원의 스펙트럴 대역폭(spectral bandwidth)이 짧을수록 측정 정확도가 증가할 수 있다. 즉, 간섭 길이(coherence length)가 길수록 측정 정확도가 증가할 수 있다. 이에 따라, 광원(110)의 스펙트럴 대역폭이 기정의된 기준 대역폭 미만인 레이저광이 광원(110)으로 이용될 수 있으며, 기준 대역폭보다 짧을수록 측정정확도는 증가할 수 있다. 예컨대, 아래의 수학식 1의 조건이 유지되도록 파동원의 스펙트럴 대역폭이 설정될 수 있다.
Figure PCTKR2020008756-appb-M000001
수학식 1에 따르면, 레이저 스펙클의 패턴 변화를 측정하기 위해, 기준 시간마다 샘플 내에 광을 조사 시에 광원(110)의 스펙트럴 대역폭은 5nm 미만을 유지할 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 다른 실시예에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템(100')은 광원(110)으로부터 생성된 광을 샘플 유닛(120)으로 조사함에 있어, 분석정확도를 높이기 위해 광 특성을 향상시킬 필요가 있다. 이를 위해, 미생물 콜로니 검출 시스템(100')은 광원(110)과 샘플 유닛(120) 사이에 하나 이상의 광학 수단을 구비할 수 있다. 예를 들면, 광학수단은 필터(101), 하나 이상의 광학렌즈(102, 103), 핀홀(pinhole) 부재(104), 미러(107), 조리개(105) 등을 포함할 수 있다. 미생물 콜로니 검출 시스템(100')은 상기한 광학수단들을 이용하여 샘플 유닛(120)에 조사되는 광의 조사면적을 제어할 수 있다. 예를 들면, 미생물 콜로니 검출 시스템(100')은 상기한 광학수단들을 이용하여 단일 콜로니의 크기보다 넓은 면적으로 광을 조사하도록 광의 조사면적을 제어할 수 있다. 이에 대한 구체적인 설명은 도 4에서 설명하기로 한다.
필터(101)는 광의 조사 강도를 제어하거나 노이즈를 제거하기 위한 기능을 수행할 수 있으며, 예를 들면, ND 필터(Neutral Density Filter)를 사용할 수 있다. 하나 이상의 광학 렌즈(102, 103)는 광의 경로를 안내하는 기능을 수행할 수 있다. 도면에 도시된 바와 같이, 제1 광학렌즈(102)는 핀홀 부재(104)와 필터(101) 사이에 배치되어 핀홀 부재(104)의 개구로 광의 경로를 안내하는 기능을 수행하며, 제2 광학렌즈(103)는 핀홀 부재(104)와 샘플 유닛(120) 사이에 배치되어 광의 크기를 조절하여 평행광선으로 시준하는 기능을 수행할 수 있다. 핀홀 부재(104)는 공간 주파수 필터(spatial filter) 기능을 수행하며, 광의 파면을 균일하게 조정할 수 있다. 또한, 조리개(105)는 시준기인 제2 광학렌즈(103)로부터 확장된 평행광선의 일부만을 샘플 유닛(120) 내로 안내하는 기능을 수행할 수 있다.
샘플 유닛(120)은 측정하고자 하는 샘플을 수용할 수 있다. 샘플 유닛(120)은 샘플을 수용할 수 있는 어떠한 용기 형태든 적용될 수 있으며, 예를 들면, 미생물을 배양하는 배양액을 포함하는 아가 플레이트(agar plate)일 수 있다. 샘플은 다양한 방법에 의해 샘플 유닛(120)에 수용될 수 있으며, 일 실시예로서, 포어링(pouring)법에 의해 샘플 유닛(120)에 수용될 수 있다. 미생물 콜로니 검출 시스템(100, 100')은 투명한(transparent) 상태의 샘플을 측정할 수 있으나, 탁도를 갖거나, 고기 또는 햄과 같이 불투명한 상태의 샘플을 측정할 수도 있다. 샘플 유닛(120)은 미생물 배양을 위한 배양물질을 포함할 수 있다. 배양물질은 계수하고자 하는 미생물 종류에 대응되어, 해당 미생물을 효과적으로 배양시킬 수 있는 물질을 포함할 수 있다.
배양에 사용되는 배양물질을 포함하는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물 배양 배지들은 예를 들어 문헌 ("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.)에 기재되어 있다. 이들 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분들을 포함한다. 탄소원은 포도당, 유당, 자당, 과당, 맥아당, 전분 및 섬유소와 같은 탄수화물; 대두유, 해바라기 오일, 피마자유(castor oil) 및 코코넛 오일(coconut oil)과 같은 지방; 팔미트산, 스테아르산(stearic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)과 같은 지방산; 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올과 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 탄소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 질소원으로는 펩톤(peptone), 효모추출액(yeast extract), 육즙(gravy), 맥아추출액(malt extract), 옥수수침출액(corn steep liquor (CSL)) 및 콩가루(bean flour)와 같은 유기 질소원 및 요소, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카보네이트 및 암모늄 니트레이트와 같은 무기 질소원을 포함할 수 있으며, 이들 질소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 배지에는 인산원으로서 추가적으로 포타슘 디히드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 포타슘 디히드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate) 및 상응하는 소듐 포함 염(sodium-containing salts)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 배지는 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate) 또는 황산철(iron sulfate)와 같은 금속을 포함할 수 있고, 아미노산, 비타민 및 적합한 전구체 등이 첨가될 수 있다.
또한, 배양액의 호기성 조건을 유지하기 위해서, 배양액 내로 산소 또는 산소를 포함한 가스(예, 공기)가 배양액에 주입될 수 있다. 배양물의 온도는 일반적으로 20-45℃일 수 있으며, 구체적으로는 25-40℃일 수 있다. 배양물의 온도를 제어하기 위해, 샘플 유닛(120)은 히팅수단과 연결될 수 있다.
다른 실시예로서, 샘플 유닛(120)은 뚜껑부재(미도시)를 구비할 수 있다. 이때, 뚜껑부재(미도시)에 가열수단이 구비되어 샘플 유닛(120) 내의 수분을 증발시키는 기능을 수행할 수 있다.
영상 센서(130)는 샘플 유닛(120)에서 출사되는 광의 경로 상에 배치되어 출사되는 광학적 이미지인, 샘플 이미지를 측정할 수 있다. 영상 센서(130)는 샘플 유닛(120)을 투과하는 투과광(K2)을 감지하여 샘플 이미지를 시계열적으로 획득할 수 있다. 예를 들면, 영상 센서(130)는 CCD 카메라일 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템(100, 100')은 저농도의 미생물뿐만 아니라 고농도의 미생물을 동일한 구성으로 검출할 수 있다. 다시 말해, 영상 센서(130)는 샘플 유닛(120)으로부터 출사되는 광학적 이미지를 측정하여 제어부(140)로 전달할 수 있으며, 이때, 저농도 시료에 대한 샘플 이미지 및 고농도 시료에 대한 샘플 이미지를 모두 획득하기 위해서, 영상 센서(130)는 샘플 유닛(120)과 사전에 설정된 거리만큼 이격되어 배치되어야 한다. 이에 대해서는 후술하기로 한다.
한편, 미생물 콜로니 검출 시스템(100')은 샘플 유닛(120)으로부터 출사되어 영상 센서(130)로 입사되는 투과광(K2)의 경로 사이에 편광판(polarizer, 190)을 구비하여, 불피요한 외부의 반사광 등을 제거할 수 있다.
제어부(140)는 영상 센서(130)로부터 획득된 샘플 이미지를 분석하여 샘플 내 콜로니의 수를 계수하거나 농도 정보를 판단할 수 있다. 이하에서는 도면을 참조하여 제어부(140)에서 샘플 내 콜로니의 수를 계수하거나 농도 정보를 판단하는 방법을 구체적으로 설명하기로 한다.
상기한 구성을 갖는, 미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 미생물을 배양하는 샘플 유닛(120)에 광(K1)을 조사하고 출사되는 광(K2)을 영상 센서(130)로 검출하여, 샘플 유닛(120) 내의 콜로니를 검출하거나 콜로니를 계수할 수 있다. 이때, 콜로니는 입사되는 광(K1)에 대해 디퓨져(diffuser) 기능을 수행하게 된다. 즉, 콜로니가 성장하기 전에는 샘플 유닛(120)으로 입사되는 광(K1)은 확산시키는 매개체가 없어 그대로 출사하게 되나, 콜로니가 성장하게 되면 샘플 유닛(120)으로 입사되는 광은 콜로니들로 인해 산란되어(scattering) 간섭 패턴 또는 회절 패턴이 형성될 수 있다.
미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 영상 센서(130)를 이용하여 콜로니들로 인해 형성된 간섭 패턴 또는 회절 패턴을 촬상하고, 촬상된 광학적 이미지에 나타난 패턴을 분석하여 콜로니를 검출하거나 콜로니의 수를 계수할 수 있다. 미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 최초 샘플의 미생물 농도에 관계없이 콜로니를 검출하거나 콜로니의 수를 계수할 수 있다.
종래에는 배지 테스트에서 균을 측정할 때, 약 30 내지 300 개 정도를 계수하는 것이 가장 신뢰도가 있다고 하여, 최초 농도에 따라 희석을 한 후, 배지테스트를 진행하는 것이 일반적이었다. 이러한 경우, 미생물의 최초 농도를 알지 못하면 다양한 희석 시료를 가지고 실험을 해야하기 때문에, 시간적, 비용적 손실이 발생하는 문제점이 있었다. 본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 후술하는 방법을 통해 최초 샘플이 어떠한 농도이든 상관없이, 하나의 장비를 이용하여 측정할 수 있다는 장점을 갖게 된다.
한편, 본 발명에서 사용된 용어, "미생물"은 L-아미노산과 같은 유용한 목적 물질의 생산능을 갖는 원핵 미생물 또는 진핵 미생물을 의미한다. 예를 들어, 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 미생물은 에스케리시아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라 속(Leptospira), 살모넬라 속(Salmonellar sp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.), 하이포모나스 속(Hypomononas sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium sp.), 노카디아 속(Norcardia) 또는 곰팡이(fungi) 또는 효모(yeast)에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물은 에스케리시아속 미생물일 수 있다.
또는, 미생물은 포도상구균속(Staphylococcus), 응고효소 음성 포도상구균속(staph Coagulase negative), 스타필로코커스 아우레우스(Staph. aureus), 연쇄구균종(Streptococcus spp.), 스트렙토코커스 비리 댄스군(Streptococcus viridans group), 장구균종(Enterococcus spp.), 코리네박테륨 균종(Corynebacterium spp.), 에어로 코카스 균종(Aerococcus spp.), 마이크로 코카스 균종(Micrococcus spp.), 펩토스트렙토코커스 균종(Peptostreptococcus spp.), 유산구균종(Lactococcus spp.), 류코노스톡 균종(Leuconostoc spp.), Tothia spp., 쌍둥이 균종(Gemella spp.), 알칼리게네스 균종(Alcaligenes spp.), 알테르나리아 균종(Alternaria spp.), 플라보박테리움 균종(Flavobacterium spp.), 바실러스 균종(Bacillus spp.), 아크로모박터 균종(Achromobacter spp.), 아시네토박터 균종(Acinetobacter spp.), 악티노바실러스 균종(Actinobacillus spp.), 알칼리게네스 균종(Alcaligenes spp.), 캄필로박터 균종(Campylobacter spp.), 에드워드 시에라 균종(Edwardsiella spp.);에를리히아 균종(Ehrlichia spp.), 엔테로박터 균종(Enterobacter spp.), 에윈게라 균종(Ewingella spp.), 후라보바크테리아속(Flavobacteria), 하프니아 균종(Hafnia spp.), 클렙시엘라(klebsiella) 균종(Klebsiella spp.), 크루이베라 균종(Kluyvera spp.), 레지오넬라균종(Legionella spp.), 모락셀라 균종(Morxella spp.), 모르가넬라 균종(Morganella spp.), 나이세리아 균종(Neisseria spp.), 파스튜렐라 균종(Pasteurella spp.), 프레보테라 균종(Prevotella spp.), 프로테우스 균종(Proteus spp.), 프로비덴시아 균종(Providencia spp.), 슈도모나스 균종(Pseudomonas spp.), 라네라 균종(Rahnella spp.), 살모넬라균종(Salmonella spp.), 세라티아(serratia) 균종(Serratia spp.), 적리균종(Shigella spp.), 스핑고 박테리움 균종(Sphingobacterium spp.), 비브리오 균종(Vibrio spp.), 여시니아(yersinia) 균종(Yersinia spp.), 나이세리아 균종(Neisseria spp.), 킨게라 균종(Kingella spp.), 카르지오바크테리움속(Cardiobacterium), 비결핵성 항산균(NTB:non-Tuberculosis mycobacteria), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 및 새형 결핵균(Mycobacterium avium)으로 구성되는 군에서 선택되는 세균을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 미생물은 대장균일 수 있다. 그러나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 제한되지 않으며, 이와 다른 미생물을 더 포함할 수 있음은 물론이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 콜로니 검출 방법을 순서대로 도시한 순서도이고, 도 4는 샘플 유닛(120)에 광을 조사하는 방법을 설명하기 위한 도면이다.
다시 도 1, 도 3 및 도 4를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 콜로니 검출 방법은 먼저 광원(110)을 이용하여 샘플 유닛(120)으로 코히런트한 광을 조사하는 단계를 포함한다(S10). 이때, 미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 광원(110)으로부터 조사되는 입사광(K1)의 조사면적을 제어하여 샘플 유닛(120)으로 제공할 수 있다.
미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 광학수단들을 이용하여 광의 조사 면적이 적어도 하나의 단일 콜로니(C)의 크기보다 크거나, 또는 하나의 단일 콜로니(C)의 적어도 일부와 주변 영역의 일부를 포함하도록 광의 조사면적을 조절할 수 있다. 여기서, 주변 영역이란 하나의 단일 콜로니(C)를 기준으로 다른 단일 콜로니가 형성된 영역이거나 단일 콜로니가 형성되지 않은 영역일 수 있다. 또한, 미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 광학수단들을 이용하여 광원(110)으로부터 생성된 광이 샘플 유닛(120)의 전체 영역을 커버할 수 있도록 광의 조사면적을 크게 하여 샘플 유닛(120)으로 제공할 수 있다.
미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 필요에 따라 광의 조사면적을 달리하여 샘플 유닛(120)으로 광을 조사할 수 있다. 예를 들면, 미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 초기에 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 개략적으로 판단하는 단계에서 샘플 유닛(120)의 전체 영역을 커버할 수 있도록 광의 조사면적을 제어하고, 이후, 콜로니의 농도 정보를 판단하는 단계에서 하나의 단일 콜로니(C)와 주변 영역을 커버할 정도의 크기로 광의 조사면적을 제어할 수 있다.
다음, 미생물 콜로니 검출 방법은 영상 센서(130)에 의해, 샘플 유닛(120)을 투과하는 투과광(K2)을 감지하여 샘플 이미지를 시계열적으로 획득할 수 있다(S20). 영상 센서(130)는 샘플 유닛(120)으로부터 출사되는 광학적 이미지를 측정하여 제어부(140)로 전달할 수 있다. 이때, 영상 센서(130)는 저농도 시료에 대한 광학적 이미지 및 고농도 시료에 대한 광학적 이미지를 모두 획득하기 위해서, 샘플 유닛(120)과 사전에 설정된 거리만큼 떨어져 배치되어야 한다.
구체적으로, 사전에 설정된 거리는 영상 센서(130)가 저농도 시료에서 단일 콜로니를 충분히 구별할 수 있도록 거리가 가까워야 하는 제1 조건과, 고농도 시료에서 스펙클 사이즈가 픽셀 사이즈보다 크도록 거리가 멀어야 하는 제2 조건을 모두 만족하는 범위를 가질 수 있다.
도 5는 제1 조건을 설명하기 위한 개념도이다.
다시 도 1, 도 3 및 도 5를 참조하면, 제1 조건은 가로 해상도에 대한 레일레이((Rayleigh criterion for lateral resolution)을 적용하면 다음과 같은 수학식 2로부터 도출될 수 있다.
Figure PCTKR2020008756-appb-M000002
여기서, r은 구분가능한 최소 거리이고, n은 굴절률(공기로 가정, n=1)이며, λ는 레이저 파장(예를 들면, 532 nm)이고, θ는 수직축을 기준으로 이미지 센서에 도착하는 빛이 기울어진 각도 최대값을 나타낸다.
만약, 샘플 위치에서 두 콜로니가 거리 a 만큼 떨어져 있다면, 수학식 3과 같이 Rayleigh criterion < a의 조건을 만족해야 두 콜로니를 구분하는 것이 가능하다.
Figure PCTKR2020008756-appb-M000003
이때, 약 100 cfu를 1 cm2의 면적에 식종(seeding) 하였다고 가정하면 (105 cfu/ml를 5 μl 만큼 식종할 때), 콜로니 간의 평균 거리는 다음과 같다.
Figure PCTKR2020008756-appb-I000001
또한, 영상 센서(130)와 샘플 간의 거리를 L이라고 하고, 미생물을 뿌린 면적을 1 cm2(가로세로 D =1 cm)이라 하면 NA는 다음과 같다.
Figure PCTKR2020008756-appb-M000004
여기서, aavg와 sinθ를 수학식 3에 대입하면, 다음과 같이 제1 조건에 의한 영상 센서(130)와 샘플 유닛(120), 구체적으로 영상 센서(130)와 샘플 간의 거리 범위가 설정된다.
Figure PCTKR2020008756-appb-I000002
한편, 제2 조건을 만족하는 거리범위는 다음과 같다.
Figure PCTKR2020008756-appb-M000005
영상 센서(130)의 픽셀 사이즈(pixel size)는 영상 센서(130)에 의해 결정되는 값일 수 있다. 예를 들면, 영상 센서(130)는 시판되고 있는 루메네라 카메라(lumenera camera)를 이용할 수 있는데, 루메네라 카메라의 경우 4.54μm의 픽셀 사이즈(스펙시트 기준)를 가질 수 있다.
스펙클 사이즈(speckle size, d)는 NA와 파장에 의해 결정되는데, 다음의 수학식 6과 같이 나타낼 수 있다.
Figure PCTKR2020008756-appb-M000006
마찬가지로, 상기 수학식 6을 수학식 5에 대입하면 다음의 결과를 얻을 수 있다.
Figure PCTKR2020008756-appb-I000003
Figure PCTKR2020008756-appb-I000004
Figure PCTKR2020008756-appb-I000005
영상 센서(130)는 전술한 과정으로 도출된 사전에 설정된 거리범위만큼 샘플 유닛(120)으로부터 떨어져 배치될 수 있다. 사전에 설정된 거리범위는 하기와 같다.
4.3 cm < L < 15.4 m
다만, 상기한 과정에 의해 도출된 값들은 하나의 실시예에 해당하며, 본 발명이 상기한 결과값들에 의해 한정되는 것은 아니다.
다음, 미생물 콜로니 검출 방법은 사전에 설정된 시간 이후, 제어부(140)에 의해 샘플 이미지를 분석하여 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단할 수 있다(S30).
앞서 설명한 바와 같이, 미생물이 단일 콜로니로 성장해야 디퓨저(diffuser)의 기능을 수행할 수 있기 때문에, 단일 콜로니로 성장할 수 있는 사전에 설정된 시간이 필요하다. 사전에 설정된 시간은 측정하고자 하는 미생물의 종류에 따라 다를 수 있다.
제어부(140)는 사전에 설정된 시간 이후, 영상 센서(130)를 통해 촬영된 샘플 이미지를 이용하여 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단할 수 있다. 일 실시예로서, 제어부(140)는 광학적으로 보여지는 샘플 이미지의 단위 면적 당 검출되는 콜로니의 수가 사전에 설정된 기준값 이상인 경우, 고농도로 판단하고, 상기 기준값 미만인 경우 저농도로 판단할 수 있다. 여기서, 저농도는 단일 콜로니가 서로 중첩되지 않고 구분이 가능한 정도의 농도를 의미하며, 고농도는 미생물 수가 많아 단일 콜로니가 구분되지 않고 중첩되는 정도의 농도를 의미할 수 있다. 제어부(140)는 이 단계에서, 콜로니의 수를 정확히 계수하거나 농도를 분석하는 것은 아니며, 샘플 내 개략적으로 저농도인지 고농도인지를 판단하는 분석만을 수행하게 된다.
제어부(140)는 샘플 이미지 내에서 광학적으로 보여지는 미생물 콜로니들이 단위 면적 당 얼마나 포진되어 있는지를 분석하고, 미생물 콜로니의 농도 수준을 판단하게 된다. 이때, 제어부(140)는 샘플 이미지 전체 면적에 대하여 분석을 수행할 수도 있으나, 다른 실시예로서, 샘플 이미지 내에서 샘플링된 단위 면적 이미지를 이용하여 농도 수준을 판단할 수 있다.
제어부(140)는 샘플 이미지 내에서 미생물 콜로니를 검출하기 위해서, 당업계에 주지된 이미지 분석 방법을 이용할 수 있다. 이미지 분석 방법은 대상 크기, 가시성, 색상, 표면 품질, 및 형상을 비롯한 하나 이상의 기준에 기초하여 샘플 이미지 내의 미생물 콜로니를 식별하는 방법일 수 있다. 예를 들면, 제어부(140)는 샘플 이미지의 각 픽셀들의 음영 정도를 이용하여 미생물 콜로니를 검출할 수 있다.
다른 실시예로서, 제어부(140)는 샘플 이미지에서 검출되는 단일 콜로니들이 중첩되는 정도가 사전에 설정된 기준값 이상인 경우 고농도로 판단하고, 상기 기준값 미만인 경우 저농도로 판단할 수 있다. 제어부(140)는 상기한 이미지 분석 방법을 이용하여 단일 콜로니의 에지를 검출할 수 있다. 여기서, 단일 콜로니의 에지가 서로 중첩되지 않는 경우 제어부(140)는 저농도로 판단할 수 있다. 단일 콜로니의 에지가 중첩되는 경우, 제어부(140)는 중첩되는 정도가 일정 정도 이상인 경우, 고농도로 판단할 수 있다. 이때, 제어부(140)는 하나의 단일 콜로니가 아닌 단위 면적 내에 포함된 단일 콜로니들의 중첩 정도를 평균내어, 농도 수준을 판단할 수 있다.
다음, 본 발명에 따른 제어부(140)는 농도 수준이 저농도인지 고농도인지에 따라 샘플 이미지를 분석하는 방법을 달리할 수 있다.
저농도인 경우(S41), 제어부(140)는 샘플 이미지의 전체 면적에서 단일 콜로니들의 이미지를 검출하여 샘플 내 콜로니의 수를 계수할 수 있다. 도 9에 도시된 103 cfu/ml, 104 cfu/ml, 105 cfu/ml와 같은 저농도 샘플의 경우, 콜로니들이 구분가능할 정도로 비중첩되어 성장하므로, 제어부(140)는 앞서 설명한 바와 같이, 시각적 이미지로부터 직접 콜로니의 수를 계수할 수 있다. 다시 말해, 제어부(140)는 농도 수준을 판단하는 단계에서 시각적(visual) 이미지인 샘플 이미지를 이용하여, 저농도인지 고농도인지를 개략적으로 판단한 후, 저농도로 판단된 경우, 시각적 이미지인 샘플 이미지를 다시 이용하여 전체 콜로니의 수를 계수하게 된다. 마찬가지로 제어부(140)는 이미지 분석 방법을 이용할 수 있으며, 앞선 단계와 달리 전체 면적에 대하여 미생물 콜로니의 개수를 계수할 수 있다.
고농도인 경우(S42), 제어부(140)는 샘플 이미지의 간섭 패턴의 공간상관관계(spatial correlation)를 획득하고, 간섭 패턴의 공간상관관계의 시간에 따른 변화를 기초로 샘플 내 콜로니의 농도 정보를 판단할 수 있다. 고농도인 경우, 시각적으로 미생물 콜로니의 수를 계수하는 것은 불가능하기 때문에, 본 발명에 따른 미생물 콜로니 검출 방법은 하기와 같은 방법을 통해 고농도의 콜로니에 대한 농도 정보를 획득할 수 있다.
도 6 내지 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템(100)이 고농도의 샘플의 농도 정보를 판단하는 원리를 설명하기 위한 도면이고, 도 9는 농도별 샘플에서의 콜로니 성장 정도를 촬영한 이미지이다.
도 6 내지 도 9를 참조하면, 제어부(140)는 영상 센서(130)로부터 시계열적으로 측정된 광학 이미지를 제공받고, 광학 이미지로부터 샘플 내 콜로니의 농도 정보를 판단할 수 있다. 콜로니는 입사되는 광에 대해 디퓨져(diffuser) 기능을 수행할 수 있다. 즉, 도 6의 좌측 그림과 같이, 콜로니가 성장하기 전에는 샘플 유닛(120)으로 입사되는 광은 확산시키는 매개체가 없어 그대로 출사하게 되나, 콜로니가 성장하게 되면 샘플 유닛(120)으로 입사되는 광은 콜로니들로 인해 산란 (scattering)되어 간섭 패턴을 형성할 수 있다.
제어부(140)는 상기한 간섭 패턴의 공간상관관계(spatial correlation)를 획득할 수 있다. 여기서, 하기의 식으로 주어지는 공간상관관계는 시간 t에 측정된 이미지 상에서, 임의의 픽셀과 그 픽셀로부터 거리 r만큼 떨어져 있는 픽셀이 얼마나 비슷한 밝기를 가지는지를 일정 범위의 숫자로 나타낼 수 있다(도 7의 (b) 참고). 일정 범위는 -1 내지 1의 범위일 수 있다. 즉, 공간상관관계는 임의의 픽셀과 다른 픽셀 사이의 상관관계가 어느 정도인지를 나타내는 것으로서, 1이면 양의 상관관계, -1이면 음의 상관관계, 0이면 관계성이 없는 것을 나타낸다. 구체적으로, 간섭 패턴이 형성되기 전에는 밝기가 고르게 출사되므로, 샘플 이미지의 공간상관관계는 1에 가까운 양의 상관관계를 나타내나, 간섭패턴이 형성되고 나면 0에 가까운 방향으로 상관관계의 값이 떨어질 수 있다.
영상 센서(130)에서 r'=(x,y) 위치에 있는 픽셀에서 시간 t 에 측정된 밝기를 I(r',t)로 정의하고, r 만큼 떨어진 픽셀의 밝기는 I(r'+r, t)로 정의할 수 있다. 이를 이용하여 공간상관관계를 정의하면 다음 수학식 7로 나타낼 수 있다.
Figure PCTKR2020008756-appb-M000007
C 0(t)는 수학식 7의 범위를 -1 내지 1로 맞추기 위해 사용되었다. 임의의 픽셀에서 시간 t에 측정된 밝기 I(r',t)와 거리 r만큼 떨어진 픽셀의 밝기 I(r'+r,t)가 동일하다면 공간상관관계는 1이 도출되고, 동일하지 않다면 1보다 작은 값을 갖게 된다.
일 실시예로서, 본 발명은 상기한 공간상관관계를 시간에 대한 함수로만 나타낼 수도 있다. 이를 위해, 제어부(140)는 임의의 픽셀로부터 같은 크기의 r 을 갖는 픽셀에 대해 공간상관관계의 평균을 하기의 수학식 8과 같이 구할 수 있다(도 7의 (b) 참조).
Figure PCTKR2020008756-appb-M000008
일 실시예로서, 제어부(140)는 사전에 설정된 거리를 상기 수학식 8에 대입하여 시간에 대한 함수로 나타낼 수 있으며, 이 함수를 이용하여 간섭 패턴이 형성되는 정도를 일정 범위인 0 내지 1 사이의 값으로 확인할 수 있다(도 7의(d) 참조).
제어부(140)는 시간에 따른 샘플 이미지의 패턴 변화를 통해 샘플 내 이물질과 미생물 콜로니를 구분할 수도 있다. 이물질의 경우, 시간이 지나도 이미지 상의 변화가 없으나, 미생물 콜로니의 경우 시간에 따라 형상, 크기 등 이미지가 변화하기 때문에, 미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 이물질과 미생물 콜로니를 구분할 수 있게 된다.
한편, 제어부(140)는 다음과 같이 공간상관관계를 이용하여 미생물 콜로니의 농도 정보를 판단할 수도 있다. 공간상관관계는 하나의 이미지를 이용해 중첩된 2개의 동일한 이미지를 생성하고, 둘 중 하나의 이미지를 일방향으로 사전에 설정된 거리만큼 시프트(shift)시킨 후 시프트된 이미지와 시프트되지 않은 이미지 사이에서 인접한 두 픽셀이 얼마나 유사한가를 분석하는 것에 의해 획득될 수 있다. 여기서, 공간상관관계는 이미지가 얼마나 균일한지를 나타내는 척도가 되는데, 만약, 콜로니로 인해 간섭 패턴이 형성되는 경우, 자잘한 간섭 패턴으로 인해 인접한 두 픽셀들의 유사도가 떨어지므로 공간상관관계의 값 또한 떨어지게 된다.
이러한 공간상관관계 계수(spatial correlation coefficient)는 시프트되는 거리(r)에 따라 달라지게 되는데(도 8의 (b) 참조), 일정 거리범위 내에서는 시프트시키는 거리인 r이 증가할수록 그 값이 떨어지고, 일정 거리범위를 초과하는 경우에는 거의 일정한 값을 갖게 된다. 따라서, 좀 더 유의미한 공간상관관계를 획득하기 위해서, 제어부(140)는 사전에 설정된 일정 거리 이상으로 이미지를 시프트시켜 공간상관관계를 획득할 수 있다. 이때, 사전에 설정된 일정 거리 r은 스펙클 사이즈에 의존하게 되며, 제어부(140)는 픽셀 단위로 나타낼 때 스펙클 사이즈보다 큰 픽셀만큼 이미지를 시프트시켜 공간상관관계를 획득할 수 있다. 예를 들면, 상기 사전에 설정된 일정 거리는 최소 3픽셀 이상의 거리일 수 있다.
한편, 제어부(140)는 상기와 같은 공간상관관계뿐만 아니라, 측정된 샘플 이미지의 간섭 패턴의 시간상관관계(temporal correlation)를 획득하고, 획득된 시간상관관계에 기초하여 미생물을 검출할 수도 있다. 제어부(140)는 시계열적으로 측정된 간섭 패턴의 이미지 정보를 이용하여 이미지들 간의 시간상관관계 계수(temporal correlation coefficient)를 계산할 수 있으며, 시간상관관계 계수에 기초하여 샘플 내 미생물 콜로니를 검출할 수 있다.
제어부(140)는 계산된 시간상관관계 계수가 사전에 설정된 기준값 이하로 떨어지는 분석을 통해 미생물 콜로니를 검출할 수 있다. 미생물의 미소한 움직임에 의해서 형성되는 간섭 패턴의 시간 상관관계 분석을 통해 미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 샘플 내 콜로니가 형성되지 않은 상태에서도 미생물의 존재 여부 또는 농도를 추정할 수도 있다.
상기한 분석을 위해서, 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 샘플 유닛(120)에 입사된 광이 샘플 내에서 다중 산란(multiple scattering)되는 횟수를 증폭시키기 위한 다중산란증폭부재를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 다중산란증폭부재(미도시)는 광원(110)과 샘플 유닛(120) 사이 또는 샘플 유닛(120)과 영상 센서(130) 사이의 광의 이동경로 상에 구비되어, 광의 다중산란횟수를 증폭시킬 수 있다. 다중산란증폭부재(미도시)는 시스템에 장착 또는 탈착이 가능한 구조로 형성되어, 필요에 따라 사용할 수도 있다.
즉, 제어부(140)는 콜로니로 형성되는 간섭 패턴의 이미지들에 대한 공간상관관계뿐만 아니라 시계열적으로 측정되는 간섭 패턴의 시간상관관계를 병행하여 샘플 내 미생물을 분석할 수 있다.
전술한 구성을 통해 본 발명의 실시예들에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템은 빠른 시간 내에 샘플 내의 콜로니를 검출할 수 있다. 간섭 패턴의 형성정도는 오직 콜로니 형성여부에만 영향을 받기 때문에, 미생물 콜로니 검출 시스템은 진동이나 외부 노이즈에 민감하지 않을 수 있다. 또한, 미생물 콜로니 검출 시스템은 샘플 유닛의 배양물질이 불안정한 경우에도 영향이 없어 빠르고 정확한 계측이 가능하다는 장점을 갖는다. 또한, 미생물 콜로니 검출 시스템은 콜로니가 표면 상에서 차지하는 면적을 반영하여 분석하므로, 적은 수의 콜로니로도 일정 시간 후에는 관찰이 가능하게 되고, 빠른 시간 내에 단일 콜로니(single colony)를 측정할 수 있다.
도 10은 본 발명의 실시예들에 따른 미생물 콜로니 검출 시스템을 이용하여 항생제 감수성 평가(antimicrobial susceptibility test)를 수행하는 원리를 설명하기 위한 도면이다.
도 10을 참조하면, 미생물 콜로니 검출 시스템(100)은 항생제 감수성 평가에 활용될 수 있다. 항생제 감수성 평가(antimicrobial susceptibility test)는 일반적으로 콜로니 계수 방법(colony counting method)과 디스크 확산법(disk diffusion method)가 이용된다. 콜로니 계수 기법은 일정 시간 동안 시편과 반응한 미생물 용액을 영양한천배지(nutrient agar)에 도말한 후, 일정 시간 동안 미생물을 성장시켜, 성장된 미생물 군집 계수를 통해 시편의 항균력을 측정하는 방법으로, 앞서 설명한 미생물 콜로니를 계수하거나 농도 정보를 판단하는 방법을 이용할 수 있다.
도 10에 도시된 항생제 감수성 평가 방법은 디스크 확산법을 이용하는 것을 나타낸 것이다. 일반적인 디스크 확산법은 일정량의 미생물이 도말되어 있는 영양한천배지에 시편을 올려놓은 후, 일정시간 동안 미생물을 성장시켜 시편의 영향으로 시편 주위에 생기는 미생물 성장 억제 지대(inhibition zone)의 크기를 측정하는 방법으로, 시편의 정성적인 항균력을 얻을 수 있다. 종래에는 미생물 성장 억제 지대의 크기를 사람의 손으로 직접 측정하였기 때문에, 정확도가 낮다는 문제점이 있었다.
본 발명의 실시예들에 미생물 콜로니 검출 시스템은 전술한 방법과 유사하게, 항생제 디스크가 배치된 배양 플레이트에 광을 조사하고, 투과되는 광을 검출하여 획득된 샘플 이미지로부터 항생제 감수성을 평가할 수 있다. 구체적으로, 서로 다른 항생제를 포함하는 제1 항생제 디스크(d1) 내지 제3 항생제 디스크(d3)는 배양 플레이트에 배치될 수 있다.
도시된 바와 같이, 제2 항생제 디스크(d2)의 미생물 성장 억제 지대는 거의 성장하지 못한 반면, 제1 항생제 디스크(d1) 및 제3 항생제 디스크(d3)의 미생물 성장 억제 지대(A1, A3)는 크기가 성장한 것을 확인할 수 있다. 이때, 제1 미생물 성장 억제 지대(A1)와 제3 미생물 성장 억제 지대(A3)는 크기가 다를 수 있다.
미생물 콜로니 검출 시스템은 각각의 항생제 디스크를 기준으로 중심으로부터 미생물 성장 억제 지대의 가장자리를 향하여 광을 스캐닝시킬 수 있다. 미생물 성장 억제 지대로 입사되는 광은 미생물이 존재하지 않기 때문에 밝기가 고르게 출사되므로, 미생물 성장 억제 지대 내에서 스캐닝되는 동안에는 출사되는 광의 변화는 거의 없을 것이다. 이와 달리, 미생물 성장 억제 지대의 가장자리로 광이 입사되는 경우, 미생물이 존재하는 영역과 존재하지 않는 영역 모두에 광이 조사될 수 있다. 이 경우, 미생물이 존재하는 영역과 존재하지 않는 영역에서의 광 특성이 달라져 간섭 패턴이 형성될 수 있다.
미생물 콜로니 검출 시스템은 항생제 디스크를 중심으로 스캐닝하는 동안 간섭 패턴의 변화를 감지하여 미생물 성장 억제 지대의 크기를 빠르고 정확하게 계산할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 본 발명을 구현할 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로 상기 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 미생물 콜로니 검출 시스템을 제공한다. 또한, 산업상 이용하는 불순물 또는 미생물 검출 장치 등에 본 발명의 실시예들을 적용할 수 있다.

Claims (8)

  1. 샘플이 수용된 샘플 유닛으로 간섭성을 갖는 광을 조사하는 단계;
    영상 센서에 의해, 상기 샘플 유닛을 투과하는 투과광을 감지하여 샘플 이미지를 시계열적으로 획득하는 단계;
    사전에 설정된 시간 이후, 제어부에 의해 상기 샘플 이미지를 분석하여 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단하는 단계; 및
    상기 제어부에 의해 상기 판단된 농도 수준이 사전에 설정된 기준값 이상인 고농도인 경우, 상기 샘플 이미지의 간섭 패턴의 공간상관관계(spatial correlation)를 획득하고, 상기 간섭 패턴의 공간상관관계의 시간에 따른 변화를 기초로 상기 샘플 내 콜로니의 농도 정보를 판단하는 단계;를 포함하는, 미생물 콜로니 검출 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단하는 단계는,
    상기 샘플 이미지의 단위 면적당 검출되는 콜로니의 수가 사전에 설정된 기준값 이상인 경우 고농도로 판단하고, 상기 기준값 미만인 경우 저농도로 판단하는, 미생물 콜로니 검출 방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단하는 단계는,
    상기 샘플 이미지에서 검출되는 단일 콜로니들이 중첩되는 정도가 사전에 설정된 기준값 이상인 경우 고농도로 판단하고, 상기 기준값 미만인 경우 저농도로 판단하는, 미생물 콜로니 검출 방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 샘플 내 콜로니의 농도 정보를 판단하는 단계는,
    상기 제어부에 의해 상기 판단된 농도 수준이 사전에 설정된 기준값 미만인 저농도인 경우, 상기 샘플 이미지의 전체 면적에서 단일 콜로니들의 이미지를 검출하여 상기 샘플 내 콜로니의 수를 계수하는, 미생물 콜로니 검출 방법.
  5. 샘플을 수용하는 샘플 유닛;
    상기 샘플 유닛의 샘플을 향하여 간섭성을 갖는 광을 조사하는 광원;
    상기 샘플 유닛을 투과하는 투과광을 감지하여 샘플 이미지를 시계열적으로 획득하는 영상 센서; 및
    사전에 설정된 시간 이후 상기 샘플 이미지를 분석하여 샘플 내 콜로니의 농도 수준을 판단하고, 상기 판단된 농도 수준이 사전에 설정된 기준값 이상인 고농도인 경우 상기 샘플 이미지의 간섭 패턴의 공간상관관계(spatial correlation)를 획득하고, 상기 간섭 패턴의 공간상관관계의 시간에 따른 변화를 기초로 상기 샘플 내 콜로니의 농도 정보를 판단하는 제어부;를 포함하는, 미생물 콜로니 검출 시스템.
  6. 제5 항에 있어서,
    상기 제어부는 상기 샘플 이미지의 단위 면적당 검출되는 콜로니의 수가 사전에 설정된 기준값 이상인 경우 고농도로 판단하고, 상기 기준값 미만인 경우 저농도로 판단하는, 미생물 콜로니 검출 시스템.
  7. 제5 항에 있어서,
    상기 제어부는 상기 샘플 이미지에서 검출되는 단일 콜로니들이 중첩되는 정도가 사전에 설정된 기준값 이상인 경우 고농도로 판단하고, 상기 기준값 미만인 경우 저농도로 판단하는, 미생물 콜로니 검출 시스템.
  8. 제5 항에 있어서,
    상기 제어부는 상기 판단된 농도 수준이 사전에 설정된 기준값 미만인 저농도인 경우, 상기 샘플 이미지의 전체 면적에서 단일 콜로니들의 이미지를 검출하여 상기 샘플 내 콜로니의 수를 계수하는, 미생물 콜로니 검출 시스템.
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