WO2021002267A1 - Ｏｄｍｒ温度測定方法 - Google Patents

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正澄 藤原
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Definitions

  • the present invention relates to an ODMR (Optically Detected Magnetic Resonance) temperature measuring method and the like.
  • Such techniques include, for example, a technique of measuring temperature based on a wavelength peak change in a fluorescence spectrum using a fluorescent dye or fluorescent polymer nanoparticles, and a technique of measuring temperature based on a wavelength peak change in a fluorescence spectrum using quantum dots.
  • Techniques for measuring the temperature based on the change in the wavelength peak of the light detection electron spin resonance spectrum using inorganic fluorescent particles such as fluorescent nanodiamonds have been reported. Although these techniques have relatively high spatial resolution and temperature sensitivity, they have not been able to measure temperature inside living organisms.
  • Patent Document 1 proposes a technique of measuring four points in the corresponding peak and calculating the peak shift from the obtained measured value, instead of capturing the entire estimated spectral peak. Has been done.
  • the present inventor causes fluctuations in the number of photons measured when performing real-time temperature measurement in a dynamic environment such as at the cellular or individual level, which is the temperature measurement. Found to cause value artifacts. Due to such artifacts, the measured temperature fluctuates greatly even when the actual temperature is constant.
  • an object of the present invention is to provide a technique capable of measuring temperature with higher accuracy based on optical detected magnetic resonance.
  • the present inventor has a difference in photon count responsiveness (error in the number of measured photon-derived pulses) among a plurality of photon count counters used in multipoint measurement, which is described above. It has been found to cause temperature readings artifacts.
  • the present inventor has the following method, that is, a method of measuring the temperature of an object based on the optical detection magnetic resonance of inorganic fluorescent particles, and (a) inorganic.
  • a step of irradiating an object containing fluorescent particles with multiple types of microwaves having different frequencies (b) a step of measuring the fluorescence intensity of the inorganic fluorescent particles during irradiation with various microwaves with separate photon count counters, (c). ) If the method includes a step of correcting the fluorescence intensity based on the error of the pulse measurement number between the photon count counters and (d) a step of calculating the temperature of the object based on the obtained correction value, We have found that the temperature can be measured with higher accuracy. Based on this finding, the present inventor further advanced the research and completed the present invention.
  • the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 A method of measuring the temperature of an object based on the optical detection magnetic resonance of inorganic fluorescent particles.
  • B The process of measuring the fluorescence intensity of inorganic fluorescent particles during various microwave irradiations with separate photon counters.
  • Item 2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the inorganic fluorescent particles are NV center-containing diamonds.
  • Item 3. Item 2.
  • Item 1 or 2 wherein the plurality of types of microwaves are 2 to 10 types.
  • Item 4. Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the plurality of types of microwaves are 6 types.
  • Item 5. Item 6. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the inorganic fluorescent particles are tracked during measurement.
  • Item 6. Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the object is a cell, a microorganism, or an organoid.
  • Item 7. Item 6. The method according to any one of Items 1 to 6, wherein the change in temperature of the object with time is measured.
  • Item 8. Item 6. The method according to any one of Items 1 to 7, wherein the temperature change when a stimulus is applied to the object is measured.
  • step (c) the pre-measured value of the error in the number of pulse measurements between the photon count counters is subtracted from the measured fluorescence intensity of one of the two corresponding fluorescence intensities, or the fluorescence of either one.
  • Item 8. The method according to any one of Items 1 to 8, which comprises a step of adding to the measured value of intensity.
  • Item 10 There are 6 types of the plurality of types of microwaves, and the correction value obtained in the step (c) by the step (d) is expressed by the following formula:
  • ⁇ indicates the temperature dependence of the light emitting center (NV).
  • ⁇ indicates the frequency difference between the 1st and 3rd or the 4th and 6th from the low frequency side of the microwave.
  • I 1 to I 6 indicate the correction values obtained by each of the six types of microwave irradiation.
  • Item 2 The method according to any one of Items 1 to 9, which comprises a step of calculating the temperature change ( ⁇ T NV ) in the light emitting center by substituting into.
  • Item 11 Light detection of inorganic fluorescent particles for the temperature of an object, including (A) microwave irradiation device, (B) photon count counter, (C) calculation unit for correcting fluorescence intensity, and (D) calculation unit for calculating temperature.
  • a temperature measuring device that measures based on magnetic resonance.
  • Item 12 The temperature measuring device according to claim 11, further comprising (E) a particle tracking system.
  • (A) is a graph showing an example of the ODMR spectrum.
  • (B) is a graph showing an example of the temperature dependence of the peak value of the ODMR spectrum. It is a schematic diagram of the ODMR spectrum peak. The optical arrangement and the schematic diagram of the microwave circuit in the apparatus used for the ODMR temperature measurement in the Example are shown.
  • NDF ND filter.
  • LLF Laser line filter.
  • HWP Half-wave plate.
  • L Lens.
  • DBS Dichro beam splitter.
  • LPF Long pass filter.
  • CCD Charge coupling element camera.
  • BS Beam splitter.
  • APD Avalanche photodiode.
  • SPA Spectrum analyzer.
  • MW Microwave source.
  • DAQ Data acquisition board.
  • SpinCore Bit pattern generator.
  • the fluctuation of the optical responsiveness of the counter is shown.
  • A The number of photons of each counter from I1 to I6 as a function of the laser excitation power of ND fluorescence is shown.
  • B Shown as a function of two sets of counters, namely the difference in photon counts between (I1, I6), (I2, I5), and (I3, I4), I1, I2, and I3, respectively.
  • the solid line is a quadratic polynomial approximation to the data.
  • the development and characterization results of a real-time high-speed temperature measurement method are shown.
  • A The time profile of all counter (top) photon counts over 200 seconds with anthropogenic events of fluorescence intensity varies at a sampling rate of 500 ms.
  • FIG. 1 A close-up view of T NV (top) and (T NV -T OBJ ) RMS (bottom) between 38 and 140 minutes is shown. The accuracy is shown by the solid line at 0.3 ° C.
  • a photomicrograph of the ND-labeled nematode worm is shown.
  • FIG. 1 An integrated photograph of the ND of the worm near the internal larva is shown. The yellow arrow indicates the ND used for temperature measurement. The black shadow displayed at the bottom is a copper wire microwave linear antenna.
  • FIG. 1 The number of photons during FCCP stimulation (top) and T NV (bottom) are shown.
  • the blue dashed line is the baseline estimated from the control experiment.
  • the inset shows the T NV minus the baseline.
  • B The bright field and red fluorescence combined photographs taken at a plurality of time points shown in 1-5 in Fig. (A) are shown.
  • the present invention is, in one aspect, a method of measuring the temperature of an object based on the optical detection magnetic resonance of the inorganic fluorescent particles, wherein (a) the object containing the inorganic fluorescent particles has a plurality of different frequencies. Based on the steps of irradiating microwaves, (b) the step of measuring the fluorescence intensity of inorganic fluorescent particles during various microwave irradiations with separate photon count counters, and (c) the error in the number of pulse measurements between the photon count counters.
  • a method including a step of correcting the fluorescence intensity and (d) a step of calculating the temperature of the object based on the obtained correction value in the present specification, may be referred to as "the measuring method of the present invention”. ). This will be described below.
  • the measurement method of the present invention is a method of measuring the temperature of an object based on the optical detected magnetic resonance of inorganic fluorescent particles (hereinafter, also referred to as "ODMR"). ..
  • ODMR optical detected magnetic resonance of inorganic fluorescent particles
  • Inorganic fluorescent particles absorb microwaves of resonance frequency and exhibit electron spin resonance. At the time of electron spin resonance, it has a characteristic that non-radiative energy deactivation increases in the electron excited state. Therefore, when the microwave is irradiated, the amount of fluorescence is reduced as compared with the case where the microwave is not irradiated. For the diamond NV center, when the external magnetic field is zero, electron spin resonance occurs at a frequency F of 2.87 GHz.
  • FIG. 1 (a) is a graph showing an example of the ODMR spectrum.
  • FIG. 1B is a graph showing an example of the temperature dependence of the peak value of the ODMR spectrum.
  • Graph G1 of FIG. 1 (a) it can be seen that the amount of fluorescence is attenuated by about 0.03 when irradiated with microwaves having a frequency F of around 2.87 GHz.
  • the fact that the peak (minimum value) is divided into two is the effect of crystal strain.
  • Each of the first frequency F1 and the second frequency F2 indicates a frequency at which the amount of fluorescence is the minimum value.
  • the second frequency F2 is larger than the first frequency F1.
  • Graph G2 shows the change of the second frequency F2 with respect to the change of the temperature T.
  • Graph G3 shows the change of the first frequency F1 with respect to the change of the temperature T. As shown in graphs G2 and G3, it can be seen that the ODMR spectral peak shifts due to changes in ambient temperature. Therefore, the temperature can be measured based on this peak shift.
  • step (a) an object containing inorganic fluorescent particles is irradiated with a plurality of types of microwaves having different frequencies.
  • the inorganic fluorescent particles are not particularly limited as long as they have electron spin activity.
  • Specific examples thereof include diamond, silicon carbide, zinc oxide, and two-dimensional substances (for example, hexagonal boron nitride, etc.).
  • diamond among others, nano-sized (average particle diameter less than 1000 nm) diamond (nanodiamond) is preferable.
  • Diamond may be either single crystal or polycrystalline.
  • Examples of synthetic diamonds include diamonds synthesized by a CVD method, a high temperature and high pressure method, an explosion method, or the like.
  • Examples of diamonds include type I and type II (type IIa, type Iib, etc.) diamonds.
  • the shape of the diamond is not particularly limited. Examples of the shape include particles, thin films, sheets and the like.
  • the size varies depending on the shape, but in the case of particles, for example, the average particle diameter can be, for example, 1 nm to 500 nm.
  • the average particle size is preferably about 10 to 200 nm, more preferably about 30 to 150 nm.
  • the diamond is preferably a diamond (NV center-containing diamond) containing an NV center (a light emitting center formed by bonding nitrogen atoms contained as impurities and pores lacking carbon atoms in an appropriate positional relationship). is there.
  • the NV center may be naturally contained or artificially introduced.
  • the method of artificially introducing the NV center is not particularly limited, and examples thereof include a method of annealing after injecting a nitrogen atom and a method of introducing a nitrogen atom during chemical vapor deposition (CVD) of diamond.
  • Diamond can also be surface-modified.
  • the method of surface modification is not particularly limited, but for example, the diamond is treated under strong oxidation conditions to convert the carbon on the surface into a carboxy group, or the diamond is reduced to introduce a hydroxy group, or a known method.
  • other functional groups amino group, thiol group, etc.
  • the surface-modifying molecule is not particularly limited, and examples thereof include water-soluble polymers such as polyglycerol and polyethylene glycerol, and various low-molecular-weight compounds such as proteins, peptides, nucleic acids, and pharmaceutical compounds.
  • the inorganic fluorescent particles may be one type alone or a combination of two or more types.
  • the object is the object of temperature measurement and is not particularly limited.
  • the object preferably includes cells, microbes, organoids and the like.
  • the inside of these measurement targets is a dynamic environment. Therefore, when real-time temperature measurement is performed, the number of photons to be measured fluctuates, which causes an artifact of the temperature measurement value. According to the measuring method of the present invention, it is possible to measure the temperature of such an object with higher accuracy.
  • the cells are not particularly limited, and are, for example, vascular endothelial cells, endothelial progenitor cells, stem cells (for example, bone marrow-derived stem cells, adipose tissue-derived stem cells, mesenchymal stem cells, pluripotent stem cells (iPS cells, ES cells, etc.), etc.).
  • stem cells for example, bone marrow-derived stem cells, adipose tissue-derived stem cells, mesenchymal stem cells, pluripotent stem cells (iPS cells, ES cells, etc.), etc.
  • Muscle cells skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myocardial cells
  • muscle progenitor cells for example, myocardial progenitor cells, myoblasts, etc.
  • immune cells T cells, etc.
  • the micro-organism is not particularly limited as long as it is an organism that is invisible to the naked eye or an organism that is visible to the naked eye but whose structure cannot be discriminated, and examples thereof include bacteria, unicellular organisms, plankton, larvae, and nematodes.
  • organoids examples include brain organoids, cerebral organoids, inner ear organoids, thyroid organoids, thoracic organoids, testicular organoids, liver organoids, spleen organoids, intestinal organoids, epithelial organoids, lung organoids, kidney organoids, and embryos.
  • the object containing the inorganic fluorescent particles is preferably the former, because the inorganic fluorescent particles may be present inside the object or adhered to the outside.
  • the former is more affected by the measurement noise due to the environment inside the object, but the measurement method of the present invention can measure the temperature with higher accuracy even in this case.
  • Objects containing inorganic fluorescent particles can be obtained by various methods. For example, when the object is a cell, the inorganic fluorescent particles can be taken up by the cells by bringing the inorganic fluorescent particles into contact with the cells.
  • the amount of inorganic fluorescent particles in the object can be appropriately determined according to the type of the object, the type of the inorganic fluorescent particles, and the like.
  • the amount of inorganic fluorescent particles introduced into one nematode is, for example, 1 to 100 ng.
  • the object containing the inorganic fluorescent particles is arranged so that excitation light irradiation, micro light irradiation, and fluorescence collection can be performed so that the temperature of the present invention can be measured. Specifically, it is arranged on a sample table on an objective lens in a device as shown in FIG. 3, for example.
  • the microwaves to be irradiated are a plurality of types of microwaves having different frequencies from each other.
  • the microwave frequency is usually 9 GHz or less and is selected from a frequency range that shows a linear approximation on both sides of the assumed ODMR spectrum (see Figure 2). It is desirable that the frequency range is determined in advance before measurement according to the types of the inorganic fluorescent particles and the object.
  • the types of microwaves (frequency) are usually even numbers, and are preferably 2 to 10, more preferably 4 to 10, and even more preferably 6 to 8, from the viewpoint of measurement accuracy, measurement efficiency, and the like. There are preferably 6 types.
  • the frequency of each microwave on one side of the ODMR spectral peak is set so that the amount of fluorescence measured is comparable to the amount of fluorescence measured at the frequency of each corresponding microwave on the other side of the peak. It is desirable (see FIG. 2).
  • the frequency f1 is designed so that the measured fluorescence intensity (I1) is comparable to the fluorescence intensity (l6) measured at the corresponding frequency (f6).
  • the frequency difference between each microwave on one side of the ODMR spectral peak is preferably 1-5 MHz.
  • the irradiation time for each microwave of each frequency is not particularly limited, but is, for example, 10 ⁇ s to 1000 ⁇ s, preferably 30 to 300 ⁇ s, and more preferably 50 to 200 ⁇ s from the viewpoint of measurement accuracy, measurement efficiency, and the like.
  • the irradiation time of each microwave is preferably about the same, and for example, the longest irradiation time with respect to the shortest irradiation time is preferably 200% or less, 150% or less, 120% or less, 110% or less, for example.
  • Microwaves of each frequency are usually repeatedly irradiated.
  • frequency f1, frequency f2, frequency f3, frequency f4, frequency f5, frequency f6 are irradiated in this order, and then frequency f1, frequency f2, frequency f3, frequency f4, Microwaves are irradiated in the order of frequency f5 and frequency f6, and this cycle is repeated.
  • a certain period of time for example, 1 minute or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, 20 minutes or more, 30 minutes or more, 60 minutes or more, 2 hours or more, 5 hours or more, 8 hours or more
  • Microwave irradiation is performed using an appropriate microwave source. Repeated irradiation of microwaves at each frequency can be performed, for example, by preparing a plurality of microwave sources at each frequency, connecting them to a switching device, and operating them so that the microwave sources are sequentially switched at a predetermined time. .. Further, the microwave generated from the microwave source is usually amplified through an amplifier and then irradiated to the object.
  • step (a) it is also possible to give a stimulus to an object containing inorganic fluorescent particles.
  • the object is a cell, a micro-organoid, an organoid, or the like, and if a temperature change occurs due to stimulation, the temperature change can be measured.
  • the type of stimulus is not particularly limited, and examples thereof include changes in culture conditions (for example, temperature, pH, light conditions, etc.), addition of a test substance, and the like.
  • the test substance is not particularly limited, and examples thereof include antibodies, proteins, nucleic acids, physiologically active substances, vesicles, bacteria, viruses, polypeptides, haptens, therapeutic agents, metabolites of therapeutic agents, and the like.
  • step (b) the fluorescence intensities of the inorganic fluorescent particles during irradiation with various microwaves are measured with separate photon count counters.
  • the fluorescence intensity of the inorganic fluorescent particles at the time of microwave irradiation is usually determined by irradiating the inorganic fluorescent particles with microwaves in a situation where the inorganic fluorescent particles are continuously irradiated with the excitation light of the particles, and the microwaves (frequency f1, f2 ... ), The fluorescence (fluorescence L1, L2 ”) At the time of irradiation is measured by measuring its intensity (I1, I2 ).
  • the wavelength of the excitation light differs depending on the type of the inorganic fluorescent particles and can be appropriately set. For example, when NV center-containing diamond is used, the wavelength of the excitation light is, for example, 490 to 580 nm, preferably 520 to 560 nm.
  • the wavelength of fluorescence also differs depending on the type of inorganic fluorescent particles.
  • the wavelength of fluorescence is, for example, 637 to 800 nm.
  • Irradiation of excitation light and detection of fluorescence are performed, for example, as follows:
  • a continuous wave laser of typical excitation intensity is used, and a microscope objective lens is used for both excitation and fluorescence acquisition.
  • Fluorescence is extracted (eg, by a splitter such as a dichroic beam splitter or a filter such as a long-pass filter) and, if necessary, the fluorescence is coupled to an optical fiber that functions as a pinhole, or by using a pinhole.
  • Detect with a photodiode such as an avalanche photodiode or other optical detector.
  • the fluorescence intensity of the inorganic fluorescent particles during irradiation with various microwaves is measured by a separate photon counter. That is, for the fluorescence (fluorescence L1, L2 ”) at the time of irradiation of various microwaves (frequency f1, f2 ...), the intensity is determined by different photon count counters (fluorescence L1 intensity is counter 1, fluorescence L2 ). The intensity of is measured by counter 2 ).
  • the photon counter is not particularly limited, and various counters can be used. As the photon count counter, a counter existing only once in one independent measuring instrument may be used, or a plurality of counters existing in each measuring instrument may be used.
  • the fluorescence intensity may be an absolute value or a relative value.
  • the inorganic fluorescent particle to be measured is usually one particle, but it is also possible to measure a plurality of particles in parallel. If the inorganic fluorescent particles move during the measurement, the particles to be measured can be continuously tracked by tracking the inorganic fluorescent particles as appropriate, so that the change over time of the temperature can be measured with higher accuracy. it can.
  • the tracking method is not particularly limited, and particles can be tracked using a known tracking technique.
  • step (c) the fluorescence intensity is corrected based on the error in the number of pulse measurements between the photon counters.
  • the present inventor has a difference in photocount responsiveness (error in the number of photon-derived pulses measured) between a plurality of photon count counters, which enables real-time temperature measurement in a dynamic environment such as at the cellular or individual level. It has been found to cause temperature readings artifacts when done. Therefore, by correcting this error, it becomes possible to measure the temperature with higher accuracy.
  • the measurement of the error is not particularly limited, but can be performed, for example, as follows. Multiple types of microwaves with frequencies used in temperature measurement are irradiated to a single inorganic fluorescent particle with each of multiple laser intensities (for example, 3 to 20, 4 to 15, 6 to 12) that gradually increase, and each micro For the fluorescence (fluorescence L1, L2 ”) at the time of irradiation of the wave (frequency f1, f2 ...), the number of photons (p1, p2 %) is set to a separate photon count counter (fluorescence L1 photon number).
  • the "corresponding two photon counters" are the corresponding frequencies on both sides of the peak of the ODMR spectrum assumed during temperature measurement (see Fig. 2.
  • F1 and f6 correspond, f2 and f5 correspond, and so on. It means two counters (counter 1 and counter 6 correspond, counter 2 and counter 5 correspond, and counter 3 and counter 4 correspond) for measuring about f3 and f4.
  • a graph showing the measured value error as shown in FIG. 4 can be obtained by performing, for example, polynomial fitting or the like based on the measured value.
  • the fluorescence intensity obtained in step (b) is corrected.
  • the correction method is not particularly limited, but for example, one of two corresponding fluorescence intensities (see FIG. I1 and I6 correspond, I2 and I5 correspond, and I3 and I4 correspond).
  • a correction value (correction values c1, c2, ...) Can be obtained by subtracting the error amount from the measured value of the fluorescence intensity or adding the error amount from the measured value of the fluorescence intensity of either one.
  • step (c) specifically, for example, the pre-measured value of the error in the number of pulse measurements between the photon count counters is subtracted from the measured value of the fluorescence intensity of one of the two corresponding fluorescence intensities.
  • it includes a step of adding to the measured value of the fluorescence intensity of either one.
  • step (d) the temperature of the object is calculated based on the obtained correction value.
  • the calculation of the temperature of the object is not particularly limited and can be performed according to or according to a known method.
  • the temperature can be calculated, for example, according to the method described in Patent Document 1.
  • the corresponding two correction values c1-c6, c2-
  • Two combinations c1-c6 and c2-c5 combination, c2-c5 and c3-c4 combination, and c1-c6 and c3-c4 combination) when c5, c3-c4) are combined as one set, respectively.
  • the temperature can be calculated according to the method described in Patent Document 1, and the average value thereof can be used as the final measured value. Specifically, for example, it can be calculated according to the method and formula described in Examples (“1. Temperature Measuring Method”) described later.
  • step (d) when 6 types of microwaves are used, in step (d), specifically, for example, the correction value obtained in step (c) is expressed by the following formula:
  • ⁇ indicates the temperature dependence of the light emitting center (NV).
  • ⁇ indicates the frequency difference between the 1st and 3rd or the 4th and 6th from the low frequency side of the microwave.
  • I 1 to I 6 indicate the correction values obtained by each of the six types of microwave irradiation.
  • ⁇ T NV the temperature change
  • the microwave of each frequency is usually repeatedly irradiated (for example, in the example of FIG. 2, after irradiating the microwave in the order of frequency f1, frequency f2, frequency f3, frequency f4, frequency f5, frequency f6, Subsequently, the frequency f1, frequency f2, frequency f3, frequency f4, frequency f5, and frequency f6 are irradiated with microwaves in this order, and this cycle is repeated.)
  • a certain period of time for example, 0.1 to 180 seconds, 0.3 to 120 seconds.
  • the average temperature for example, adjacent average, moving average, etc.
  • the measuring method of the present invention includes a temperature measuring device (A) a microwave irradiation device, (B) a photon count counter, (C) a calculation unit for correcting fluorescence intensity, and (D) a calculation unit for calculating temperature.
  • A a microwave irradiation device
  • B a photon count counter
  • C a calculation unit for correcting fluorescence intensity
  • D a calculation unit for calculating temperature.
  • the measuring device of the present invention it may be referred to as "the measuring device of the present invention”).
  • the microwave irradiation device and the photon count counter are as described above.
  • the calculation unit for correcting the fluorescence intensity and the calculation unit for calculating the temperature may be one calculation unit or separate calculation units.
  • the calculation unit that corrects the fluorescence intensity acquires information on the fluorescence intensity measured by the photon counter and corrects it based on the error in the pulse measurement number between the photon counters.
  • the calculation unit that calculates the temperature acquires information on the obtained correction value and calculates the temperature.
  • the processing contents in these arithmetic units are as described above, and are executed by a computer program stored in advance.
  • the measuring device of the present invention preferably further includes a particle tracking system.
  • a particle tracking system a system using a known particle tracking technique (for example, a piezostage or the like) can be used.
  • the measuring device of the present invention further includes a sample table for arranging an object containing inorganic fluorescent particles, a microscope objective lens, a fluorescent irradiation device, a display unit for displaying calculated temperature information, and the like. It can also be an all-in-one device that can execute the measurement method.
  • the ODMR temperature measurement method in the examples will be described.
  • a schematic diagram of the device is shown in FIG.
  • NV fluorescence was filtered through a dichroic beam splitter (Semrock, FF560-FDi01) and a long pass filter (using Semrock, BLP01-561R, or BLP01-635R-25) to remove residual green laser scatter.
  • the fluorescence was coupled to an optical fiber (Thorlabs, 1550HP, core diameter about 10 ⁇ m) that functions as a pinhole. Fiber-coupled fluorescence was finally detected by an avalanche photodiode (APD, Perkin Elmer SPCM AQRH-14). Samples were placed on a piezo stage that allowed raster scanning and particle tracking. The APD output was supplied to two data acquisition boards, each with four pulse counters (DAQ-1 BNC, National Instruments) and two pulse counters (DAQ-2 BNC, National Instruments). All photon counting measurements except the 6-point measurement were made by the DAQ board (USB-6343 BNC).
  • a spectrometer (Princeton, LNCCD) equipped with a liquid nitrogen cooled charge coupling element camera was used to measure the fluorescence spectrum.
  • LNCCD Liquin-Chip
  • spectral measurements and particle tracking were performed simultaneously to prevent chromatic aberration due to particle movement.
  • CW-ODMR measurements use an SP6T switch and a bit pattern generator with a gate width of 200 ⁇ s (Spincore, PBESR-PRO-300) to gate APD detection common to both gates on and off microwave irradiation. did. This was followed by a laser cutoff time of 100 ⁇ s, which gave I PL ON and I PL OFF at a repeat rate of 2 kHz. In the examples, no external magnetic field is applied.
  • APD detection was gated for each microwave frequency with a gate width of 100 ⁇ s common to all six gates followed by an interval of 5 ⁇ s. The number of photons at the obtained six frequencies was input to the following equation to calculate the NV center temperature estimate (T NV ).
  • ⁇ is the temperature dependence of the NV center, -74kHz ⁇ °C -1 . ]
  • High-precision quantum temperature measurements are based on the detection of temperature-dependent peak shifts of optically detected magnetic resonance (ODMR) lines at the center of the ND nitrogen vacancy (NV).
  • ODMR optically detected magnetic resonance
  • NV ND nitrogen vacancy
  • the fluorescence intensity at four frequency points out of the six points provides three sets of temperature estimates according to the formula shown in "1. Temperature measurement method" above, and finally the temperature estimates are obtained by averaging them. Can be given.
  • the frequency selector outputs six frequencies in sequence with a pulse width of 100 ⁇ s and an interval of 5 ⁇ s.
  • FIG. 4a shows the counter values of NV fluorescence at six frequencies (I1 to I6) as a function of the excitation laser output. Ideally, I1, I2, and I3 should exhibit the same responsiveness gradient as the corresponding I4, I5, and I6.
  • FIG. 4b shows their differences (I1-I6, I2-I5 and I3-I4) as a function of the number of photons of either I1, I2 or I3, respectively. Therefore, in the following test, counter calibration was performed to correct this deviation (error).
  • the temperature measurement specifications were evaluated by gradually changing the temperature of the microscope objective lens ( TOBJ ) in the range of 20 to 40 ° C (Fig. 5b). .. Initially it started at 44.0 ° C and dropped to 40.2 ° C. Then, in 40.7 minutes, the temperature was raised slightly to 40.9 ° C. Importantly, T NV was able to clearly detect this small temperature change of only 0.7 ° C, as shown in the inset in Figure 5b. This temperature transition occurred with a characteristic time constant of 19 seconds in a practical Boltzmann fitting and was completed in about 1.5 minutes. The time difference between T OBJ and T NV is 1.2 minutes, demonstrating that the nanodiamond thermometer can detect transient temperature changes below 1 ° C in real time.
  • T NV In the low temperature range below 35 ° C, there was a difference between T NV and T OB J. This difference is because there is not enough latency to T OBJ is completely thermalized, not related to the accuracy of the thermometer. Rather, it accurately reflects the actual temperature of the cover glass surface. This is because heat dissipation is proportional to the difference from room temperature according to Fourier's law. It takes more than an hour to reach perfect thermal equilibrium.
  • Heating the objective lens of a microscope causes greater fluctuations and drift of the focal position than lowering the temperature. Therefore, in order to show the robustness of the thermometer, the heater was turned off in 207 minutes and then turned on in 218 minutes to reach 35 ° C. During this rapid thermal event, the system was able to track the ND position while showing the correct temperature estimates.
  • the accuracy of the current temperature measurement was determined to be 0.16 ° C with an integration time of 34 seconds, as it varies gradually in the range of 35-45 ° C, and the accuracy was less than 0.3 ° C at the root mean square (Fig. 5c). ). Therefore, the sensitivity was 1.6 ° C / ⁇ Hz. Such small net accuracy in real time is a hallmark of current nanoscale thermometers, which is an important milestone for biological in vivo applications.
  • Figures 6a-d show DIC (differential interference contrast), green and red confocal fluorescence, and composite images of them, respectively, for labeled worms. Since the ND is distributed over the entire area of the image, it can measure the ODMR signals of different parts of the worm. In living insects, ND moves continuously during temperature observations at a typical rate of about 200 nm / min as measured by time-lapse images. In the following experiments, these NDs were followed while measuring local temperature.
  • FIG. 7a-b show a single ND annexed micrograph and cw-ODMR spectrum indicated by an arrow near the embryo.
  • ODMR contrast is generally weakened by worms due to background fluorescence. Worms typically provide an ODMR contrast of 0.9-0.94 compared to 0.88 on coverslips. From this, it was estimated that the intensity of background fluorescence was 0.6 to 1.0 times that of ND fluorescence.
  • FIG. 7c is a diagram showing the temporal profile of T NV over an hour during the course of temperature change by the microscope-objective heater.
  • thermometry Detection of heat production response by drug stimulation of nematodes
  • FCCP mitochondrial deconjugation agent

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Abstract

光検出磁気共鳴に基づいて、より高い精度で温度を測定できる技術を提供することを課題とし、該課題を、対象物の温度を無機蛍光粒子の光検出磁気共鳴に基づいて測定する方法であって、（a）無機蛍光粒子を含む対象物に互いに異なる周波数の複数種のマイクロ波を照射する工程、（b）各種マイクロ波照射時の無機蛍光粒子の蛍光強度をそれぞれ別々の光子数カウンタで測定する工程、（c）光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差に基づいて蛍光強度を補正する工程、及び（d）得られた補正値に基づいて、対象物の温度を算出する工程を含む方法、により解決する。

Description

ＯＤＭＲ温度測定方法
　本発明は、ODMR（Optically Detected Magnetic Resonance、光検出磁気共鳴）温度測定方法等に関する。
　細胞内部の温度を計測する技術が、蛍光検出をベースに各種開発されている。このような技術としては、例えば蛍光色素や蛍光ポリマーナノ粒子を利用して蛍光スペクトルの波長ピーク変化に基づいて温度を測定する技術、量子ドットを利用して蛍光スペクトルの波長ピーク変化に基づいて温度を測定する技術、蛍光ナノダイヤモンド等の無機蛍光粒子を利用して光検出電子スピン共鳴スペクトルの周波数ピーク変化に基づいて温度を測定する技術等が報告されている。これらの技術は、空間分解能や温度感度が比較的高いものの、これまで、生物体内での温度測定はできなかった。
　一方、マウスin vivo温度測定技術として、蛍光色素や希土類ナノ粒子を利用した測定技術が報告されているが、これは空間分解能及び温度感度が低く、一細胞レベルでの温度測定ができなかった。
国際公開第2014/165505号
　本発明者は光検出電子スピン共鳴スペクトルピークシフトに基づく温度測定法に着目し、これについて研究を進めてきた。該測定法においては、従来、スペクトルピークの全体を捉え、そのピークシフトを算出する方法が報告されていた。しかしながら、この方法では、スペクトルピークの全体を捉えるために時間を要してしまい、リアルタイム温度計測は困難であった。この問題を解決するために、特許文献１では、推定されるスペクトルピーク全体を捉えるのではなく、該当ピーク中の4点を計測し、得られた計測値からピークシフトを算出するという技術が提案されている。
　本発明者は、この多点計測技術についてさらに研究を進める中で、細胞や個体レベルのような動的環境でリアルタイム温度測定を行う場合、測定される光子数の変動等が起こり、これが温度測定値のアーチファクトを引き起こすことを見出した。このようなアーチファクトに起因して、実際の温度が一定の状況下でも、測定温度は大きく変動してしまう。
　そこで、本発明は、光検出磁気共鳴に基づいて、より高い精度で温度を測定できる技術を提供することを課題とする。好ましくは、本発明は、細胞や個体内の温度変化をより高い精度でリアルタイムに測定できる技術を提供することを課題とする。
　本発明者は鋭意研究を進めた結果、多点計測において使用される複数の光子数カウンタ間に、フォトカウント応答性の差（光子由来のパルスの計測数の誤差）が存在し、これが上述した温度測定値のアーチファクトを引き起こすことを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、次の方法、すなわち、対象物の温度を無機蛍光粒子の光検出磁気共鳴に基づいて測定する方法であって、（a）無機蛍光粒子を含む対象物に互いに異なる周波数の複数種のマイクロ波を照射する工程、（b）各種マイクロ波照射時の無機蛍光粒子の蛍光強度をそれぞれ別々の光子数カウンタで測定する工程、（c）光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差に基づいて蛍光強度を補正する工程、及び（d）得られた補正値に基づいて、対象物の温度を算出する工程を含む方法、であれば、より高い精度で温度を測定できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてまたさらに研究を進め、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　対象物の温度を無機蛍光粒子の光検出磁気共鳴に基づいて測定する方法であって、
（a）無機蛍光粒子を含む対象物に互いに異なる周波数の複数種のマイクロ波を照射する工程、
（b）各種マイクロ波照射時の無機蛍光粒子の蛍光強度それぞれ別々の光子数カウンタで測定する工程、
（c）光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差に基づいて蛍光強度を補正する工程、及び
（d）得られた補正値に基づいて、対象物の温度を算出する工程
を含む方法．
　項２．　前記無機蛍光粒子がNVセンター含有ダイヤモンドである、項１に記載の方法．
　項３．　前記複数種のマイクロ波は2～10種である、項１又は２に記載の方法．
　項４．　前記複数種マイクロ波は6種である、項１～３のいずれかに記載の方法．
　項５．　測定中に前記無機蛍光粒子をトラッキングする、項１～４のいずれかに記載の方法．
　項６．　前記対象物が細胞、微小生物、又はオルガノイドである、項１～５のいずれかに記載の方法．
　項７．　前記対象物の温度の経時変化を測定する、項１～６のいずれかに記載の方法．
　項８．　前記対象物に刺激を付与した場合の温度変化を測定する、項１～７のいずれかに記載の方法．
　項９．　前記工程（c）が、光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差の予め測定された値を、2つの対応する蛍光強度のいずれか一方の蛍光強度の測定値から減じる、或いはいずれか一方の蛍光強度の測定値に加える工程を含む、項１～８のいずれかに記載の方法。
　項１０．　前記複数種のマイクロ波は6種であり、且つ
前記工程（d）が、工程（c）で得られた補正値を下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
［式中：αは発光センター（NV）の温度依存性を示す。δωはマイクロ波の低周波数側から1番目と3番目、または、4番目と6番目の間の周波数差を示す。I1～I6は6種のマイクロ波照射それぞれで得られた補正値を示す。］
に代入して発光センターにおける温度変化（δTNV）を算出する工程を含む、項１～９のいずれかに記載の方法。
　項１１．　（A）マイクロ波照射装置、（B）光子数カウンタ、（C）蛍光強度を補正する演算部、及び（D）温度を算出する演算部を備える、対象物の温度を無機蛍光粒子の光検出磁気共鳴に基づいて測定する温度測定装置．
　項１２．　さらに、（E）粒子トラッキングシステムを備える、請求項１１に記載の温度測定装置。
　本発明によれば、光検出磁気共鳴に基づいて、より高い精度で温度を測定できる技術を提供することができる。
（a）はODMRスペクトルの一例を示すグラフである。（b）は、ODMRスペクトルのピーク値の温度依存性の一例を示すグラフである。 ODMRスペクトルピークの模式図である。 実施例におけるODMR温度測定で使用した装置における光学配置とマイクロ波回路の概略図を示す。NDF：NDフィルター。LLF：レーザーラインフィルター。 ＨＷＰ：半波長板。L：レンズ。ＤＢＳ：二色性ビームスプリッタ。LPF：ロングパスフィルター。CCD：電荷結合素子カメラ。BS：ビームスプリッタ。APD：アバランシェフォトダイオード。SPA：スペクトラムアナライザ。MW：マイクロ波源。DAQ：データ収集ボード。SpinCore：ビットパターンジェネレータ。 カウンターの光応答性の変動を示す。（a）ND蛍光のレーザー励起パワーの関数としての、I1からI6までの各カウンターの光子数を示す。（b）2組のカウンタ、すなわち（I1、I6）、（I2、I5）、および（I3、I4）間の光子カウントの差、それぞれI1、I2、およびI3の関数として示す。実線はデータに対する2次多項式近似である。 実時間高速温度測定法の開発とキャラクタリゼーション結果を示す。（a）蛍光強度の人為的事象を伴う200秒にわたる全てのカウンタ（上）の光子カウントの時間プロファイルは、500msのサンプリングレートで変化する。ND-NVセンターの対応する推定温度プロファイルは、カウンターキャリブレーションなし（中央）とあり（下）の両方の場合が示される。灰色：1秒ごとのTNV。赤：34秒の隣接平均。（b）顕微鏡対物加熱器（TOBJ）の温度の段階的変化に対する周囲気温（TAir、上）、検出された総光子数（中央）、およびTNV（下）の時間プロファイルを示す。挿入図は、19秒の時定数で0.7℃の過渡温度上昇のグラフクローズアップの図である。グレー：1秒ごとのTNV、レッド：34秒の隣接平均、ブルー：TOBJ。（c）38から140分の間の、TNV（上）と（TNV-TOBJ）のRMS（下）のクローズアップ図を示す。精度は0.3℃で実線で示される。 ND標識線虫ワームの顕微鏡写真を示す。（a）DIC、（b）緑色（c）赤色共焦点蛍光、および（d）それらの統合画像。 環境温度変化中の線虫の生体内温度測定結果を示す。（a）内部幼虫近くのワームのNDの統合写真を示す。黄色の矢印は、温度測定に使用されたNDを示す。下部に表示されている黒い影は、銅線マイクロ波リニアアンテナである。（b）NDのCW-ODMRスペクトルを示す。（c）環境変化中の光子数とTNVの時間プロファイルを示す。挿入図は、4秒ごとに頻繁に再配置されている光子カウントのクローズアップ図を示す。約1分ごとに、大きな位置補正が見られる。灰色：1秒ごとのTNV、赤：34秒の隣接平均、青：TOBJ。（d）測定後の統合写真を示す。（e）温度変化に対する（TNV-TOBJ）のRMSを示す。精度は0.6℃で実線で示される。 FCCPの生化学的刺激による線虫の温度上昇を示す。（a）FCCP刺激中の光子数（上）およびTNV（下）を示す。青い破線は、対照実験から推定されたベースラインである。挿入図はベースラインを差し引いたTNVを示す。（b）図（a）中の1-5に示される複数の時点で撮影された明視野と赤色蛍光の結合写真を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　本発明は、その一態様において、対象物の温度を無機蛍光粒子の光検出磁気共鳴に基づいて測定する方法であって、（a）無機蛍光粒子を含む対象物に互いに異なる周波数の複数種のマイクロ波を照射する工程、（b）各種マイクロ波照射時の無機蛍光粒子の蛍光強度をそれぞれ別々の光子数カウンタで測定する工程、（c）光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差に基づいて蛍光強度を補正する工程、及び（d）得られた補正値に基づいて、対象物の温度を算出する工程を含む方法（本明細書において、「本発明の測定方法」と示すこともある。）に関する。以下にこれについて説明する。
　1．光検出磁気共鳴に基づいた温度測定
　本発明の測定方法は、対象物の温度を無機蛍光粒子の光検出磁気共鳴（以下、「ODMR」と示すこともある。）に基づいて測定する方法である。ODMRについては以下のとおりである。
　無機蛍光粒子は共鳴周波数のマイクロ波を吸収して電子スピン共鳴を示す。なお、電子スピン共鳴時には、電子励起状態において無輻射のエネルギー失活が増大するという特性を有する。そのため、マイクロ波照射時には、マイクロ波非照射時と比較して蛍光量が減少する。ダイヤモンドのNVセンターについて、外部磁場がゼロ磁場の場合には、電子スピン共鳴は周波数Fが2.87GHzにおいて発生する。
　図１（a）ODMRスペクトルの一例を示すグラフである。図１（b）は、ODMRスペクトルのピーク値の温度依存性の一例を示すグラフである。図１（a）のグラフG1に示すように、周波数Fが2.87GHz近傍のマイクロ波を照射した場合に、蛍光量が0.03程度減衰することが判る。ピーク（極小値）が2つに分かれているのは、結晶歪みによる効果である。第1周波数F1及び第2周波数F2の各々は、蛍光量が極小値となる周波数を示す。第2周波数F2は、第1周波数F1より大きい。図1（b）に示すグラフの横軸は、温度Tを示し、縦軸は、ODMRスペクトルピークの周波数を示す。温度Tは、無機蛍光粒子の周囲温度を示す。グラフG2は、温度Tの変化に対する第2周波数F2の変化を示す。グラフG3は、温度Tの変化に対する第1周波数F1の変化を示す。グラフG2及びG3のとおり、周囲の温度変化によってODMRスペクトルピークがシフトすることが判る。そこで、このピークシフトに基づいて、温度を測定することができる。
　2．工程（a）
　工程（a）では、無機蛍光粒子を含む対象物に互いに異なる周波数の複数種のマイクロ波を照射する。
　無機蛍光粒子は、電子スピン活性を有するものである限り、特に制限されない。具体的には、例えばダイヤモンド、炭化ケイ素、酸化亜鉛、2次元物質（例えば、六方晶系窒化ホウ素等）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはダイヤモンド（中でも、ナノサイズ（平均粒子径が1000nm未満）のダイヤモンド（ナノダイヤモンド））が挙げられる。
　ダイヤモンドは、単結晶又は多結晶のいずれでもよい。合成ダイヤモンドとしては、CVD法、高温高圧法、爆発法等で合成されたダイヤモンドが挙げられる。また、ダイヤモンドとしては、I型、II型（IIa型、Iib型など）等のダイヤモンドが挙げられる。
　ダイヤモンドの形状は、特に限定されない。形状としては、例えば、粒子、薄膜、シート等が挙げられる。サイズは、形状に応じて異なるが、例えば粒子である場合は、平均粒子径は例えば1nm～500nmであることができる。平均粒子径は、好ましくは10～200nm、より好ましくは30～150nm程度である。
　ダイヤモンドは、好ましくはNVセンター（不純物として含まれる窒素原子と、炭素原子が欠落した空孔とを適切な位置関係で結合させることによって形成される発光センター）を含むダイヤモンド（NVセンター含有ダイヤモンド）である。NVセンターは、天然に含まれるものであってもよいし、人工的に導入されたものであってもよい。NVセンターを人工的に導入する方法は、特に制限されず、例えば窒素原子を注入後にアニール処理する方法や、ダイヤモンドの化学気相合成（CVD）時に窒素原子を導入する方法等が挙げられる。
　ダイヤモンドは、表面修飾されたものであることもできる。表面修飾の方法は特に制限されないが、例えば必要に応じてダイヤモンドを強い酸化条件で処理して表面の炭素をカルボキシ基に変換し、或いはダイヤモンドを還元してヒドロキシ基を導入し、或いは公知の方法に従って又は準じて他の官能基（アミノ基、チオール基等）を導入し、これを介して各種分子や物質を連結して表面修飾することができる。表面修飾分子としては、特に制限されず、例えばポリグリセロールやポリエチレングリセロール等の水溶性高分子、タンパク質、ペプチド、核酸、医薬化合物等の各種低分子化合物等が挙げられる。
　無機蛍光粒子は、1種単独であっても、2種以上の組合せであってもよい。
　対象物は、温度測定の対象であり、特に制限されない。対象物としては、好ましくは細胞、微小生物、オルガノイド等が挙げられる。これらの測定対象内部は、動的環境であり、このためリアルタイム温度測定を行う場合、測定される光子数の変動等が起こり、これが温度測定値のアーチファクトを引き起こす。本発明の測定方法によれば、このような対象物であっても、より高い精度で温度測定することが可能である。
　細胞としては、特に制限されず、例えば血管内皮細胞、内皮前駆細胞、幹細胞（例えば、骨髄由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞（iPS細胞、ES細胞等）等）、筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、筋前駆細胞（例えば、心筋前駆細胞、筋芽細胞等）、免疫細胞（T細胞等）、神経細胞等が挙げられる。
　微小生物としては、肉眼では見えない生物、又は肉眼で見えるものの生物体の構造を判別できない生物であれば特に制限されず、例えば細菌、単細胞生物、プランクトン、幼虫、線虫等が挙げられる。
　オルガノイドとしては、脳オルガノイド、小脳オルガノイド、内耳オルガノイド、甲状腺オルガノイド、胸腺オルガノイド、精巣オルガノイド、肝臓オルガノイド、脾臓オルガノイド、腸オルガノイド、上皮オルガノイド、肺オルガノイド、腎臓オルガノイド、胚等が挙げられる。
　無機蛍光粒子を含む対象物は、無機蛍光粒子が対象物内部に存在する場合又は外部に付着している場合があり、好適には前者である。前者の方が、対象物内部の環境による測定ノイズの影響が大きいが、本発明の測定方法であればこの場合でもより高い精度で温度測定することが可能である。無機蛍光粒子を含む対象物は、各種方法で得ることができる。例えば、対象物が細胞である場合は、無機蛍光粒子を細胞に接触させることにより、細胞に無機蛍光粒子を取り込ませることができる。
　対象物における無機蛍光粒子の量は、対象物の種類、無機蛍光粒子の種類等に応じて、適宜決定することができる。例えば体長1mm程度の線虫の場合であれば、線虫1匹に導入する無機蛍光粒子の量は、例えば1～100ngである。
　無機蛍光粒子を含む対象物は、本発明の温度測定が可能な様に、励起光照射、マイクロ光照射、及び蛍光収集が可能な様に配置される。具体的には、例えば図３に示されるような装置における、対物レンズ上の試料台上に配置される。
　本発明の測定方法において、照射するマイクロ波は、互いに異なる周波数の複数種のマイクロ波である。
　マイクロ波の周波数は、通常、9GHz以下であり、想定されるODMRスペクトルのピーク両側の線形近似を示す周波数範囲から選択される（図２参照）。該周波数範囲は、無機蛍光粒子、及び対象物それぞれの種類に応じて、測定前に予め決定しておくことが望ましい。マイクロ波の（周波数）の種類は、通常偶数種であり、測定精度、測定効率等の観点から、好ましくは2～10種、より好ましくは4～10種、さらに好ましくは6～8種、特に好ましくは6種である。ODMRスペクトルピークの片側における各マイクロ波の周波数は、測定される蛍光量が、該ピークの反対側における対応する各マイクロ波の周波数において測定される蛍光量と同程度になるように、設定されることが望ましい（図２参照）。すなわち、図２において、周波数f1は、測定される蛍光強度（I1）が、対応する周波数（f6）において測定される蛍光強度（l6）と同程度になるように、設計されることが望ましい。ODMRスペクトルピークの片側における、各マイクロ波間の周波数の差（例えば図２のX）は、好ましくは1～5MHzである。
　各周波数のマイクロ波それぞれの1回当たりの照射時間は、特に制限されないが、測定精度、測定効率等の観点から、例えば10μs～1000μs、好ましくは30～300μs、より好ましくは50～200μsである。各マイクロ波の照射時間は、同程度であることが好ましく、例えば最も短い照射時間に対する最も長い照射時間は、例えば200％以下、150％以下、120％以下、110％以下であることが好ましい。
　各周波数のマイクロ波は、通常、繰返し照射する。例えば、図２の例であれば、周波数f1、周波数f2、周波数f3、周波数f4、周波数f5、周波数f6の順にマイクロ波を照射した後、続けて周波数f1、周波数f2、周波数f3、周波数f4、周波数f5、周波数f6の順にマイクロ波を照射し、このサイクルを繰り返す。また、この繰返しを一定時間（例えば1分以上、5分以上、10分以上、20分以上、30分以上、60分以上、2時間以上、5時間以上、8時間以上）継続することにより、対象物の温度の経時変化を測定することができる。
　マイクロ波の照射は、適当なマイクロ波源を使用して行われる。各周波数のマイクロ波の繰返し照射は、例えば各周波数の複数のマイクロ波源を用意し、これらを切替装置に連結し、所定時間でマイクロ波源が順次切り替わるように作動させることにより、実行することができる。また、マイクロ波源から発生したマイクロ波は、通常、増幅器を通して増幅されてから、対象物に照射される。
　工程（a）においては、無機蛍光粒子を含む対象物に刺激を付与することもできる。対象物が細胞、微小生物、オルガノイド等である場合、刺激付与により温度変化が生じる場合はその温度変化を測定することが可能である。刺激の種類は特に制限されず、例えば培養条件（例えば温度、pH、光条件等）の変化）、被検物質の添加等が挙げられる。被検物質としては、特に制限されず、例えば抗体、タンパク質、核酸、生理活性物質、ベシクル、細菌、ウイルス、ポリペプチド、ハプテン、治療薬剤、治療薬剤の代謝物等が挙げられる。
　3．工程（b）
　工程（b）では、各種マイクロ波照射時の無機蛍光粒子の蛍光強度それぞれ別々の光子数カウンタで測定する。
　マイクロ波照射時の無機蛍光粒子の蛍光強度は、通常、無機蛍光粒子に該粒子の励起光を照射し続けている状況下でマイクロ波を照射し、該マイクロ波（周波数f1、f2・・・）の照射時点の蛍光（蛍光L1、L2・・・）について、その強度（I1、I2・・・）を測定することにより行われる。励起光の波長は、無機蛍光粒子の種類に応じて異なり、適宜設定することが可能である。例えば、NVセンター含有ダイヤモンドを使用する場合であれば、励起光の波長は、例えば490～580nm、好ましくは520～560nmである。また、蛍光の波長も、無機蛍光粒子の種類に応じて異なる。例えば、NVセンター含有ダイヤモンドを使用する場合であれば、蛍光の波長は、例えば637～800nmである。励起光の照射及び蛍光の検出は、例えば次のようにして行われる：励起には、典型的な励起強度の連続波レーザーを使用し、顕微鏡対物レンズを励起および蛍光収集の両方に使用し、蛍光を（例えばダイクロイックビームスプリッタ等のスプリッタやロングパスフィルタ等のフィルタ等によって）抽出し、必要に応じて、蛍光をピンホールとして機能する光ファイバーに結合して、或いはピンホールを使用して、蛍光をアバランシェフォトダイオード等のフォトダイオード又はその他の光検出器で検出する。
　各種マイクロ波照射時の無機蛍光粒子の蛍光強度はそれぞれ別々の光子数カウンタで測定される。すなわち、各種マイクロ波（周波数f1、f2・・・）の照射時点の蛍光（蛍光L1、L2・・・）について、その強度を、別々の光子数カウンタ（蛍光L1の強度はカウンタ1、蛍光L2の強度はカウンタ2・・・）で測定する。光子数カウンタとしては、特に制限されず、各種カウンタを使用することが可能である。光子数カウンタとしては、1つの独立した測定器内に1つのみ存在するカウンタを利用してもよいし、測定器内に複数存在する各カウンタを利用してもよい。また、複数の測定器を併用して必要数（＝マイクロ波の種類数）のカウンタを準備することもできる。別々の光子数カウンタ（蛍光L1の強度はカウンタ1、蛍光L2の強度はカウンタ2・・・）で測定することによって、各種マイクロ波照射時の無機蛍光粒子の蛍光強度（I1、I2・・・）が得られる。
　蛍光強度は、絶対値であってもよいし、相対値であってもよい。
　測定対象の無機蛍光粒子は、通常は1個の粒子であるが、複数の粒子について平行して測定することも可能である。測定中、無機蛍光粒子が移動する場合は、適宜、無機蛍光粒子をトラッキングすることにより、測定対象の粒子を追跡し続けることができ、これにより温度の経時変化をより高い精度で測定することができる。トラッキングの方法は、特に制限されず、公知のトラッキング技術を利用して粒子をトラッキングすることができる。
　4．工程（c）
　工程（c）では、光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差に基づいて蛍光強度を補正する。
　本発明者は、複数の光子数カウンタ間に、フォトカウント応答性の差（光子由来のパルスの計測数の誤差）が存在し、これが細胞や個体レベルのような動的環境でリアルタイム温度測定を行う場合の温度測定値のアーチファクトを引き起こすことを見出した。よって、この誤差を補正することにより、より高い精度で温度測定を行うことが可能になる。
　光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差は、予め測定しておくことが望ましい。誤差の測定は、特に制限されるものではないが、例えば次のように行うことができる。温度測定で採用する周波数の複数種のマイクロ波を、段階的に増加させる複数（例えば3～20、4～15、6～12）のレーザー強度それぞれで、無機蛍光粒子単体に照射し、各マイクロ波（周波数f1、f2・・・）の照射時点の蛍光（蛍光L1、L2・・・）について、その光子数（p1、p2・・・）を、別々の光子数カウンタ（蛍光L1の光子数はカウンタ1、蛍光L2の光子数はカウンタ2・・・）で測定する。測定値に基づいて、対応する2つの光子数カウンタ間の、測定値の誤差（同条件で計測された光子数の差）を算出する。なお、「対応する2つの光子数カウンタ」とは、温度測定の際に想定されるODMRスペクトルのピーク両側の対応する周波数（図２参照。f1とf6が対応し、f2とf5が対応し、f3とf4が対応する。）について測定する2つのカウンタ（カウンタ1とカウンタ6が対応し、カウンタ2とカウンタ5が対応し、カウンタ3とカウンタ4が対応する。）を意味する。なお、図４に示されるような測定値誤差を示すグラフは、上記測定値に基づいて、例えば多項式フィッティング等を行うことにより、得ることができる。
　上記誤差に基づいて、工程（b）で得られた蛍光強度を補正する。補正の方法は、特に制限されないが、例えば、2つの対応する蛍光強度（図２参照。I1とI6が対応し、I2とI5が対応し、I3とI4が対応する。）のいずれか一方の蛍光強度の測定値から誤差分を減じる、或いはいずれか一方の蛍光強度の測定値から誤差分を加えることにより、補正値（補正値c1、c2・・・）を得ることができる。
　工程（c）は、具体的には、例えば、光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差の予め測定された値を、2つの対応する蛍光強度のいずれか一方の蛍光強度の測定値から減じる、或いはいずれか一方の蛍光強度の測定値に加える工程を含む。
　5．工程（d）
　工程（d）では、得られた補正値に基づいて、対象物の温度を算出する。
　対象物の温度の算出は、特に制限されず、公知の方法に従って又は準じて行うことができる。4種のマイクロ波を使用した場合であれば、例えば特許文献1に記載の方法に従って、温度を算出することができる。また、例えば6種のマイクロ波を使用した場合であれば、6種の各周波数に対応する6種の補正値から、値が同程度である対応する2つの補正値（c1-c6、c2-c5、c3-c4）を一組とした場合の二組の組合せ（c1-c6とc2-c5の組合せ、c2-c5とc3-c4の組合せ、及びc1-c6とc3-c4の組合せ）それぞれについて、例えば特許文献1に記載の方法に従って温度を算出し、その平均値を最終的な測定値とすることができる。具体的には、たとえば後述の実施例（「1．温度測定方法」）に記載の方法及び式に従って、算出することができる。
　6種のマイクロ波を使用した場合、工程（d）は、具体的には、例えば、工程（c）で得られた補正値を下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
［式中：αは発光センター（NV）の温度依存性を示す。δωはマイクロ波の低周波数側から1番目と3番目、または、4番目と6番目の間の周波数差を示す。I1～I6は6種のマイクロ波照射それぞれで得られた補正値を示す。］
に代入して発光センターにおける温度変化（δTNV）を算出する工程を含む。
　また、温度については、一定時間の平均値をとることにより、より高い精度の計測することが可能である。各周波数のマイクロ波は、通常は繰返し照射される（例えば、図２の例であれば、周波数f1、周波数f2、周波数f3、周波数f4、周波数f5、周波数f6の順にマイクロ波を照射した後、続けて周波数f1、周波数f2、周波数f3、周波数f4、周波数f5、周波数f6の順にマイクロ波を照射し、このサイクルを繰り返す。）ところ、例えば、一定時間（例えば0.1～180秒、0.3～120秒、1～100秒、3～100秒、10～80秒、20～50秒）内の各サイクルから算出された温度の平均（例えば隣接平均、移動平均等）を温度測定値とすることができる。
　上記した技術を活用することにより、ナノスケールの熱イベントを高精度にリアルタイムでの計測、個体の代謝測定、脂肪燃焼などの健康食品の効果試験、薬による代謝変化の熱計測等を行うことも可能であり得る。
　本発明の測定方法は、（A）マイクロ波照射装置、（B）光子数カウンタ、（C）蛍光強度を補正する演算部、及び（D）温度を算出する演算部を備える、温度測定装置（本明細書において、「本発明の測定装置」と示すこともある。）を利用して実行することができる。
　マイクロ波照射装置及び光子数カウンタについては、上述の通りである。
　蛍光強度を補正する演算部及び温度を算出する演算部は、1つの演算部であってもよいし、別々の演算部であってもよい。
　蛍光強度を補正する演算部は、光子数カウンタで計測された蛍光強度に関する情報を取得し、光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差に基づいて補正する。温度を算出する演算部は、得られた補正値に関する情報を取得し、温度を算出する。これらの演算部における処理内容については、上述の通りであり、予め記憶されているコンピュータプログラムによって実行される。
　本発明の測定装置は、さらに、粒子トラッキングシステムを備えることが好ましい。該システムとしては、公知の粒子トラッキング技術を利用したもの（例えばピエゾステージ等）を、使用することができる。
　本発明の測定装置は、さらに、無機蛍光粒子を含む対象物を配置する試料台、顕微鏡対物レンズ、蛍光照射装置、算出された温度情報を表示する表示部等を備え、これのみで本発明の測定方法を実行できるオールインワン型装置であることもできる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　1．温度測定方法
　実施例におけるODMR温度測定法について説明する。装置の概略図を図３に示す。励起には、典型的な励起強度ca. 5 kW・cm-2の連続波532nmレーザーを使用した。開口数1.4の油浸顕微鏡対物レンズを励起および蛍光収集の両方に使用した。NV蛍光を、ダイクロイックビームスプリッタ（Semrock、FF560-FDi01）およびロングパスフィルタ（Semrock、BLP01-561R、またはBLP01-635R-25を用いて）によって濾過して、残留緑色レーザ散乱を除去した。次に、蛍光をピンホールとして機能する光ファイバー（Thorlabs、1550HP、コア直径約10μm）に結合した。ファイバ結合蛍光は、アバランシェフォトダイオード（APD、Perkin Elmer SPCM AQRH-14）によって最終的に検出された。試料は、ラスタースキャニングおよび粒子追跡を可能にするピエゾステージ上に載せた。APD出力は、それぞれ4つのパルスカウンタ（DAQ-1 BNC、National Instruments）と2つのパルスカウンタ（DAQ-2 BNC、National Instruments）を持つ2つのデータ収集ボードに供給された。6点測定以外のすべてのフォトンカウンティング測定は、DAQボード（USB-6343 BNC）によって行われた。蛍光スペクトル測定のために、液体窒素冷却電荷結合素子カメラを装備した分光計（Princeton、LNCCD）を使用した。ファイバピッグテールビーム分割システムを光ファイバラインに挿入することによって、スペクトル測定と粒子追跡を同時に実行して、粒子の動きに起因する色収差を防止した。
　CWとマルチポイントの両方のODMR測定を実行するために、250nsのスイッチング時間を有するSP6Tスイッチ（General Microwave、F9160）に1つの独立型マイクロ波源（Rohde＆Schwarz、SMB100A）および5つのUSB駆動マイクロ波源（USG-LF44、Texio）を接続した。次にそれを増幅し（ミニサーキット、ZHL-16W-43 +）、カバースリップ（25μmの細い銅線）の上に置かれたマイクロ波リニアアンテナに送り、中央に穴をあけた細胞培養皿で密封した。一般的なマイクロ波励起電力は、アンテナの入力電力と送信電力、および有限要素法（COMSOL）による電磁界シミュレーションを考慮すると、磁界強度にして5 [A/m]と推定される。CW-ODMR測定では、SP6Tスイッチと、ゲート幅が200μsのビットパターンジェネレータ（Spincore、PBESR-PRO-300）を使用して、両方のゲートに共通のAPD検出をマイクロ波照射のオンとオフにゲートした。その後に100μsのレーザー遮断時間が続き、2 kHzの繰り返しレートでIPL ONとIPL OFFを与えた。なお、実施例では外部磁場は印加されていない。マルチポイントODMR測定では、APD検出は、6つのゲートすべてに共通のゲート幅が100μsで、その後に5μsの間隔が続くそれぞれのマイクロ波周波数に対してゲートされた。得られた6つの周波数での光子数を次の式に入力してNV中心の温度推定値（TNV）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
［式中、αはNV中心の温度依存性、-74kHz・℃-1である。］
　2．6点測定と温度変化によるODMRピークシフト
　ナノダイヤモンド量子サーモメトリーを生体内で実現するために、我々は、高速粒子追跡能力および高精度温度推定プロトコルを備えた共焦点蛍光顕微鏡に基づくリアルタイム生体内温度測定システムを開発した（上記「1．温度測定方法」及び図３参照）。粒子追跡において、システムはxyz方向に沿って蛍光強度を測定し、毎回焦点をそれぞれの蛍光最大値に戻す。再配置は通常2.8秒かかり、4秒ごとに繰り返される。
　高精度量子温度測定は、NDの窒素空孔（NV）中心の光学的に検出された磁気共鳴（ODMR）線の温度依存ピークシフトの検出に基づいている。特に、我々は、ODMRピークに対して対称的に位置する6つの周波数で蛍光強度を測定するマルチポイントODMR測定プロトコルを採用した。6つの点のうちの4つの周波数点における蛍光強度は、上記「1．温度測定方法」で示した式に従う3組の温度推定を提供し、最後にそれらの平均をとることによって温度推定値を与えることができる。実験的には、周波数選択器から100μsのパルス幅と5μsの間隔で6つの周波数が順次出力される。これらのタイミング制御されたマイクロ波パルス列は、細胞培養皿上に作製されたマイクロ波アンテナに送られる。培養皿上にはNDまたはND標識された線虫ワームが配置されている。
　以前に報告（特許文献1）された4点の代わりに6点を選択する利点は、温度精度を向上させることである。同じ光子束で4点を選択するのと比較して、6点分析では4点分析を3重に実行しながら1秒あたり2/3の光子数を使用するため、測定ノイズが減少させることができる（下記式）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　実際には、周波数点の数を増やすと、ODMRのスペクトル形状に関する詳細情報も得られる。これは、温度プロファイルの詳細な分析に役立つ。この研究では移動平均を使用した。しかし、カルマンフィルタリングのようなより高度なデータ推定も効果的である。
　我々は、動的環境でリアルタイムモニタリングを実現するには、各パルスカウンタのフォトンカウント応答性を校正することが重要であることを見出した。各カウンタは、＜5％の非常に小さい光応答性の差を有することが見出された（図４参照）。図４aは、励起レーザー出力の関数としての6つの周波数（I1～I6）におけるNV蛍光のカウンター値を示す。理想的には、I1、I2、およびI3は、対応するI4、I5、およびI6と同じ応答性勾配を示さなければならない。図４bは、それらの差（I1-I6、I2-I5およびI3-I4）をそれぞれI1、I2またはI3のいずれかの光子数の関数として示す。そこで、以下の試験では、このずれ（誤差）を補正するカウンタキャリブレーションを実行した。
　我々は、まず、カバーガラスに貼られたNDについて温度計測した（図３参照）。図５aに示されるように、実際の温度は変化しないにもかかわらず、光子数のステップ変化は、NV中心の温度推定値のアーチファクトを引き起こした。実験に使用される光子計数の全範囲にわたってI1～I6（I2～I5及びI3～I4）を較正することによって、ノイズおよびドリフトを大幅に抑制することができた。これらのカウンターキャリブレーションにより、温度測定は光子数の変動による影響を受けなくなった。
　次に、顕微鏡対物レンズ（TOBJ）の温度を20～40℃の範囲で段階的に変化させることにより、温度測定の仕様（精度、確度、時間分解能、安定性）を評価した（図５b）。最初は44.0℃から始まり、40.2℃に低下させた。その後、40.7分で温度をわずかに40.9℃に上げた。重要なことに、TNVは、図５bの挿入図に示すように、わずか0.7℃というこの小さな温度変化を明確に検出することができた。この温度遷移は、実用的なボルツマンフィッティングにおいて19秒の特性時定数で起こり、約1.5分間で完了した。TOBJとTNVとの間の時間差は1.2分であり、これはナノダイヤモンド温度計がリアルタイムで１℃以下の過渡温度変化を検出できることを実証している。
　35℃以下の低い温度範囲では、TNVとTOBJの間に違いが現れた。この違いは、TOBJが完全に熱化するのに十分な待ち時間がないためで、温度計の精度とは関係無い。むしろ、それはカバーガラスの表面の実際の温度を正確に反映している。なぜなら、熱放散はフーリエの法則に従って室温との差に比例するからである。完全な熱平衡状態に到達するには1時間以上かかる。
　顕微鏡の対物レンズを加熱すると、温度を下げるよりも大幅な変動と焦点位置のドリフトが発生する。そこで、温度計の堅牢性を示すために、207分でヒーターの電源を切った後、218分でヒーターの電源を入れて35℃にした。この急速な熱イベントの間、システムは、正しい温度推定値を示しながらND位置を追跡することができた。35～45℃の範囲で段階的に変化することから、現在の温度測定の精度は34秒の積分時間によって0.16℃と決定され、その精度は二乗平均平方根で0.3度未満であった（図５c）。したがって、感度は1.6℃ / √Hzであった。リアルタイムでのそのような小さい正味精度は、現在のナノスケール温度計の顕著な特徴であり、これは生物学的in vivo用途にとって重要なマイルストーンである。
　3．生きた線虫内の温度測定
　リアルタイムで動作する堅牢で正確な温度測定を確立したので、我々は生きている虫の局所的な温度モニタリングをテストした。線虫を標識するために使用されるNDとして、その表面がポリグリセロールでコーティングされている、高度に水溶性のナノダイヤモンド（粒子径中央値が100nmのナノダイヤモンド（Adams nanotechnology）の表面をポリグリセロールコーティング処理してなるナノダイヤモンド）を使用した。生殖腺へのマイクロインジェクションによってこれらのNDを虫に導入し、NDが細胞に組み込まれるまで待つために一晩培養した。標識された虫は麻酔をかけられ、アンテナ一体型培養皿のマイクロ波アンテナの近くに移された。それらは寒天パッドと緩衝液で満たされたカバーガラスとの間に挟まれた。
　図６a～dはそれぞれ、ラベル付きワームについての、DIC（微分干渉コントラスト）、緑色、赤色共焦点蛍光、及びそれらの合成画像を示す。NDは画像内の全領域に分散しているため、さまざまな部分のワームのODMR信号を測定できる。生きている虫では、NDは、タイムラプス画像によって測定される200 nm / min程度の典型的な速度で、温度観測中に連続的に移動する。以下の実験では、局所温度を測定しながらこれらのNDを追跡し続けた。
　図７a～bは、胚の近くの矢印で示される単一のNDの併合顕微鏡写真およびcw-ODMRスペクトルを示す。ODMRのコントラストは、バックグラウンドの蛍光のために一般的にワームでは弱くなる。通常、カバースリップ上の0.88と比較して、ワームでは0.9～0.94のODMRコントラストが得られる。このことから、バックグラウンド蛍光の強度がND蛍光の0.6～1.0倍であると推定された。図７cは、顕微鏡－対物加熱器による温度変化の経過中の1時間にわたるTNVの時間的プロファイルを示す図である。TOBJは最初は34.0℃に設定された（この時点でRT = 21.5℃）。5分で、ヒーターを切り、そしてTNVをRTに向けて徐々に減少させた。38.7分に、ヒーターをオンにして29.5℃に調整した。TNV（赤）の測定プロファイルは、TOBJ（青）と非常によく一致していた。このin vivo測定の精度と確度は、それぞれ±0.39℃（積分時間34秒）と<0.6℃であった（図７e）。
　4．線虫の薬剤刺激による熱産生応答検出
　本サーモメトリーの生体内発熱研究への適用性を実証するために、ミトコンドリア脱共役剤であるFCCP（シアン化カルボニル-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）によって刺激されたときのワームの内部温度を測定した。図８aは、ワームがFCCPによって刺激されたときのワームの内部温度の時間的プロファイルを示す。測定開始後、TNVは連続的に減少したが、これは実際にはベースラインドリフトであり、これはin vivoで頻繁に観察された。6分後、少量の60μM FCCP溶液を培地に添加した。10分から18分の間に、TNVのベースラインドリフトは、ドロップとリカバリでそれぞれ4秒と12秒という短い遷移時間で急激にシフトダウンした。これは主に、追跡システムが、わずかに異なるODMRピークを持つ近くのNDを誤って捕らえたためであった（図８b参照）。24分（FCCP添加後18分）に温度は徐々に上昇し、40～50分で最大約3℃に達した。25分から35分の間に、実際に温度プロファイルに反映される光子数の強い変動があった。この間、ワームが移動したため、NDの位置は大きく変動していた。確かに、画像の下部に位置する胚はこの期間後に移動した（図８b）。しかしながら、我々のシステムは温度情報でNDを追跡することができた。28分から30分の間の2分間だけ、NDはトラッキングの調整可能範囲を超えて移動し、ND位置を失った。しかし、我々は広視野蛍光イメージングによって同じNDを見つけることができ、焦点に戻してNDを置くことができ、それはTNVの連続的なモニタリングを可能にした。60～65分の間に、発熱反応は終了したように見えた。65分後、TNVのベースラインドリフトは光子数の減少と同期して上昇したようであった。これに関しては、温度上昇に伴って熱による非輻射緩和が促進され、NDの蛍光が減少することが知られている。逆に温度低下によって蛍光量は増大する。この点から、蛍光強度と温度情報は反相関関係にある。しかしながら、蛍光強度は生体試料の透過率や屈折率の時間変化によっても影響を受けるため、必ずしも相関関係が観察されない場合もある。

Claims (12)

  1. 対象物の温度を無機蛍光粒子の光検出磁気共鳴に基づいて測定する方法であって、
    （a）無機蛍光粒子を含む対象物に互いに異なる周波数の複数種のマイクロ波を照射する工程、
    （b）各種マイクロ波照射時の無機蛍光粒子の蛍光強度それぞれ別々の光子数カウンタで測定する工程、
    （c）光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差に基づいて蛍光強度を補正する工程、及び
    （d）得られた補正値に基づいて、対象物の温度を算出する工程
    を含む方法。
  2. 前記無機蛍光粒子がNVセンター含有ダイヤモンドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記複数種のマイクロ波は2～10種である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記複数種のマイクロ波は6種である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 測定中に前記無機蛍光粒子をトラッキングする、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記対象物が細胞、微小生物、又はオルガノイドである、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記対象物の温度の経時変化を測定する、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記対象物に刺激を付与した場合の温度変化を測定する、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記工程（c）が、光子数カウンタ間のパルス計測数の誤差の予め測定された値を、2つの対応する蛍光強度のいずれか一方の蛍光強度の測定値から減じる、或いはいずれか一方の蛍光強度の測定値に加える工程を含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記複数種のマイクロ波は6種であり、且つ
    前記工程（d）が、工程（c）で得られた補正値を下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     ［式中：αは発光センター（NV）の温度依存性を示す。δωはマイクロ波の低周波数側から1番目と3番目、または、4番目と6番目の間の周波数差を示す。I1～I6は6種のマイクロ波照射それぞれで得られた補正値を示す。］
    に代入して発光センターにおける温度変化（δTNV）を算出する工程を含む、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. （A）マイクロ波照射装置、（B）光子数カウンタ、（C）蛍光強度を補正する演算部、及び（D）温度を算出する演算部を備える、対象物の温度を無機蛍光粒子の光検出磁気共鳴に基づいて測定する温度測定装置。
  12. さらに、（E）粒子トラッキングシステムを備える、請求項１１に記載の温度測定装置。
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