WO2020240638A1

WO2020240638A1 - 顕微鏡装置、顕微鏡装置の制御方法、および顕微鏡装置の制御プログラム

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Publication number: WO2020240638A1
Application number: PCT/JP2019/020786
Authority: WO
Inventors: 大和新谷; 啓作浜田; 典夫吉田
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Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2020-12-03
Anticipated expiration: 2021-11-24

Abstract

顕微鏡装置１において、顕微鏡制御部（６１）は、対物レンズ（２６）の光軸方向である試料（ＴＰ）の深さ方向の第１の位置における収差補正部（５１）の補正量に関する情報を、検出部（４１）で検出された光に基づいて算出し、算出した第１の位置における収差補正部（５１）の補正量に関する情報と、試料（ＴＰ）の屈折率に関する情報とに基づいて、第１の位置と異なる第２の位置における収差補正部（５１）の補正量に関する情報を算出する。

Description

顕微鏡装置、顕微鏡装置の制御方法、および顕微鏡装置の制御プログラム

　本発明は、顕微鏡装置、顕微鏡装置の制御方法、および顕微鏡装置の制御プログラムに関する。

　波面変換素子を用いて収差を補正する技術が知られている（例えば、特許文献１を参照）。顕微鏡装置においては、従来から、適切な収差補正が求められている。

特開２００５－２９２５３８号公報

　第１の態様に係る顕微鏡装置は、試料を照明する照明光学系と、前記試料からの光を検出する検出部と、対物レンズを有し、前記試料からの光を前記検出部に導く検出光学系と、前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方の収差を補正する収差補正部と、制御部とを備え、前記制御部は、前記対物レンズの光軸方向である前記試料の深さ方向の第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を、前記検出部で検出された光に基づいて算出し、前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第１の位置と異なる第２の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出する。

　第２の態様に係る顕微鏡装置の制御方法は、試料を照明する照明光学系と、前記試料からの光を検出する検出部と、対物レンズを有し、前記試料からの光を前記検出部に導く検出光学系と、前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方の収差を補正する収差補正部と、制御部とを備える顕微鏡装置の制御方法であって、前記対物レンズの光軸方向である前記試料の深さ方向の第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を、前記検出部で検出された光に基づいて算出し、前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第１の位置と異なる第２の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出する。

　第３の態様に係る顕微鏡装置の制御プログラムは、試料を照明する照明光学系と、前記試料からの光を検出する検出部と、対物レンズを有し、前記試料からの光を前記検出部に導く検出光学系と、前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方の収差を補正する収差補正部と、制御部とを備える顕微鏡装置の制御プログラムであって、コンピュータに、前記対物レンズの光軸方向である前記試料の深さ方向の第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を、前記検出部で検出された光に基づいて算出し、前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第１の位置と異なる第２の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出する処理を実行させる。

　第４の態様に係る顕微鏡装置は、試料からの光を検出する検出部と、対物レンズを有し、前記試料からの光を前記検出部に導く検出光学系と、前記検出光学系の収差を補正する収差補正部と、制御部とを備え、前記制御部は、前記対物レンズの光軸方向である前記試料の深さ方向の第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を、前記検出部で検出された光に基づいて算出し、前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第１の位置と異なる第２の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出する。

顕微鏡装置の構成を示す図である。共焦点顕微鏡における収差補正部の拡大図である。第１実施形態に係る顕微鏡制御部と情報処理装置との間の電気的な接続を示すブロック図である。第１実施形態に係る画像取得方法を示すフローチャートである。（Ａ）は、観察深さと補正環の最適な回転位置との関係を示すグラフであり、（Ｂ）は、観察深さと対物レンズの位置との関係を示すグラフである。第１実施形態に係る設定用データテーブルを示す模式図である。対物レンズの位置の変化に対する観察深さの変化を示す説明図である。（Ａ）は、観察深さ等を設定する際に用いられるＧＵＩの一例を示す模式図であり、（Ｂ）は、観察深さと対物レンズの位置との関係を示す説明図である。試料の屈折率等を入力する際に用いられるＧＵＩの一例を示す図である。（Ａ）は、観察深さと、補正環の最適な回転位置と、対物レンズの位置との関係を示す説明図であり、（Ｂ）は、第１実施形態に係るパラメータリストを示す模式図である。第１実施形態に係る補正環位置決定処理の詳細を示すフローチャートである。第１実施形態に係る補正環位置決定処理における評価値の一例を示すグラフである。第１実施形態の変形例に係る画像取得方法を示すフローチャートである。第２実施形態に係る画像取得方法を示すフローチャートである。第２実施形態に係るパラメータリストを示す模式図である。第２実施形態に係る補正環位置決定処理の詳細を示すフローチャートである。第３実施形態に係る顕微鏡制御部と情報処理装置との間の電気的な接続を示すブロック図である。第３実施形態に係る画像取得方法を示すフローチャートである。（Ａ）は、観察深さと補正環の最適な回転位置との関係を示すグラフであり、（Ｂ）は、観察深さと対物レンズの最適な位置との関係を示すグラフであり、（Ｃ）は、補正環の回転位置が一定の場合における観察深さと対物レンズの位置との関係を示すグラフである。第３実施形態に係る設定用データテーブルを示す模式図である。観察深さと、補正環の最適な回転位置と、対物レンズの最適な位置との関係を示す説明図である。観察深さと、補正環の最適な回転位置と、補正環の回転位置が一定の場合における対物レンズの位置との関係を示す説明図である。第３実施形態に係る補正環位置決定処理の詳細を示すフローチャートである。第３実施形態に係る補正環位置決定処理における評価値の一例を示すグラフである。第３実施形態に係るパラメータリストを示す模式図である。試料の画像表示を切り替えるためのＧＵＩの一例を示す模式図である。第４実施形態に係る画像取得方法を示すフローチャートである。屈折率の探索範囲を入力する際に用いられるＧＵＩの一例を示す図である。相対観察深さと補正環の最適な回転位置との関係を示すグラフである。複数の屈折率に対応する試料の画像の一例を示す模式図である。第５実施形態に係る顕微鏡制御部と情報処理装置との間の電気的な接続を示すブロック図である。第５実施形態に係る画像取得方法を示すフローチャートである。屈折率探索用の評価値の一例を示すグラフである。

［第１実施形態］
　第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１の構成を示す図である。この顕微鏡装置１は、共焦点顕微鏡１０と、情報処理装置９０とを主体に構成される。共焦点顕微鏡１０と情報処理装置９０とは、互いにデータの送受信が可能に構成されている。以降の説明において、共焦点顕微鏡１０の対物レンズ２６の光軸方向に延びる座標軸をｚ軸とする。また、このｚ軸と垂直な面内において互いに直交する方向に延びる座標軸をそれぞれｘ軸およびｙ軸とする。

　共焦点顕微鏡１０は、ステージ１１と、光源ユニット１６と、照明光学系２１と、検出光学系３１と、検出部４１と、収差補正部５１と、顕微鏡制御部６１とを備える。ステージ１１は、図２に示すように、中央に開口部を有する板状に形成される。ステージ１１は、観察対象である試料ＴＰが載置されたカバーガラスＣＧを支持する（図２を参照）。試料ＴＰの例として、例えば、生体試料（図示せず）やビーズ（図示せず）等がある。生体試料は、蛍光染色された細胞等の厚みがある試料である。ビーズは、蛍光標識されたポリスチレン製の（例えば、直径０．２μｍ程度の）微小な球体である。

　図１に示すように、ステージ１１には、ステージ駆動部１２が設けられる。ステージ駆動部１２は、ステージ１１をｚ軸（対物レンズ２６の光軸ＡＸ）と垂直な面内で移動させる。ステージ駆動部１２によりステージ１１をｚ軸と垂直な面内で移動させることで、カバーガラスＣＧを介してステージ１１に支持された、試料ＴＰにおける広範囲の画像を取得することが可能である。なお、ステージ駆動部１２は、ステージ１１をｚ軸（対物レンズ２６の光軸ＡＸ）に沿って移動させてもよい。

　光源ユニット１６は、試料ＴＰに含まれる蛍光物質を励起するための励起光を射出させる。光源ユニット１６は、光源１７と、シャッタ１８と、音響光学素子１９とを有する。光源１７として、例えば、所定の波長域のレーザー光（励起光）を射出させることが可能なレーザー光源等が用いられる。

　照明光学系２１は、光源ユニット１６から射出された励起光で試料ＴＰを照明する。照明光学系２１は、光源ユニット１６側から順に、照明用レンズ２２と、励起フィルタ２３と、ダイクロイックミラー２４と、スキャナ２５と、対物レンズ２６とを有する。照明用レンズ２２は、光源ユニット１６から射出された励起光を平行光にするためのコリメーターレンズである。励起フィルタ２３は、光源ユニット１６からの励起光が透過し、他の波長の光（例、外光、迷光）の少なくとも一部を遮る特性を有する。ダイクロイックミラー２４は、光源ユニット１６から射出された励起光が反射し、ステージ１１上の試料ＴＰで発生した光のうち所定の波長帯の光（例、蛍光）が透過する特性を有する。スキャナ２５は、ｘ方向とｙ方向との２方向において、光源ユニット１６からの励起光で試料ＴＰを走査する。スキャナ２５として、例えば、ガルバノスキャナや、レゾナントスキャナ等が用いられる。

　対物レンズ２６は、ステージ１１の下方近傍に配置される。対物レンズ２６は、ステージ１１の開口部およびカバーガラスＣＧ（図２を参照）を介して、ステージ１１上の試料ＴＰと対向する。対物レンズ２６とカバーガラスＣＧとの間隙部は、浸液ＩＭ（図２を参照）で満たされるようになっている。なお、対物レンズ２６とカバーガラスＣＧとの間隙部は、浸液ＩＭに限らず、空気等の気体で満たされていてもよい。

　検出光学系３１は、試料ＴＰで発生した蛍光を集光する。検出光学系３１は、試料ＴＰ側から順に、対物レンズ２６と、スキャナ２５と、ダイクロイックミラー２４とを含む。さらに、検出光学系３１は、ダイクロイックミラー２４側から順に、蛍光フィルタ３４と、集光レンズ３５とを有する。蛍光フィルタ３４は、試料ＴＰからの光のうち所定の波長帯の光（例、蛍光）が透過する特性を有する。蛍光フィルタ３４は、例えば、試料ＴＰで反射した励起光、外光、迷光などの少なくとも一部を遮断する。集光レンズ３５は、試料ＴＰからの蛍光を集光する。検出部４１は、検出光学系３１を介して、試料ＴＰで発生した蛍光を検出する。検出部４１として、例えば、光電子増倍管が用いられる。

　検出光学系３１と検出部４１との間における検出部４１の近傍に、ピンホール３６が設けられる。ピンホール３６は、対物レンズ２６の試料ＴＰ側の焦点位置と共役な位置に配置される。ピンホール３６は、対物レンズ２６の焦点面（対物レンズ２６の焦点位置を通る対物レンズ２６の光軸ＡＸと垂直な面）または、当該焦点面から所定のずれ許容範囲内で光軸方向にずれた面からの光のみを通過させ、他の光を遮光する。ピンホール３６には、ピンホール駆動部３７が設けられる。ピンホール駆動部３７は、ピンホール３６の大きさを拡大若しくは縮小させる。ピンホール駆動部３７により、ピンホール３６の大きさを拡大若しくは縮小させることで、上述した所定のずれ許容範囲を変えることができる。

　顕微鏡制御部６１は、ステージ駆動部１２、ピンホール駆動部３７、検出部４１等を制御する。また、顕微鏡制御部６１は、試料ＴＰの画像の取得条件として、例えば、光源ユニット１６から射出される励起光の光強度、ピンホール３６の大きさ、試料ＴＰに対する励起光の走査速度等を設定する。

　光源ユニット１６から射出された励起光は、照明光学系２１の照明用レンズ２２を透過して略平行光になる。照明用レンズ２２を透過した励起光は、励起フィルタ２３を通ってダイクロイックミラー２４に入射する。ダイクロイックミラー２４に入射した励起光は、ダイクロイックミラー２４で反射してスキャナ２５に入射する。スキャナ２５は、ｘ方向とｙ方向との２方向において、スキャナ２５に入射した励起光で試料ＴＰを走査する。スキャナ２５に入射した励起光は、スキャナ２５を通って対物レンズ２６を透過し、対物レンズ２６の焦点面に集光される。試料ＴＰにおいて励起光が集光される部分（すなわち、対物レンズ２６の焦点面と重なる部分）は、スキャナ２５によりｘ方向とｙ方向との２方向において２次元的に走査される。

　試料ＴＰにおいて励起光が集光される部分に含まれる蛍光物質から、蛍光が発光する。試料ＴＰで発した蛍光は、検出光学系３１としての対物レンズ２６に入射する。対物レンズ２６に入射した蛍光は、対物レンズ２６を透過し、スキャナ２５を通ってダイクロイックミラー２４に入射する。ダイクロイックミラー２４に入射した蛍光は、励起光と波長が異なるため、ダイクロイックミラー２４を透過して蛍光フィルタ３４に達する。蛍光フィルタ３４に達した蛍光は、蛍光フィルタ３４を通って集光レンズ３５を透過し、対物レンズ２６の焦点位置と共役な位置に集光される。対物レンズ２６の焦点位置と共役な位置に集光された蛍光は、ピンホール３６を通過して検出部４１に入射する。

　検出部４１は、検出部４１に入射した光（蛍光）の光電変換を行い、光の検出信号として、その光の光量（明るさ）に対応するデータを生成する。検出部４１は、生成したデータを顕微鏡制御部６１へ出力する。顕微鏡制御部６１は、検出部４１から入力されたデータを１画素分のデータとして、これをスキャナ２５による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、複数画素分のデータが２次元で（２方向で）並ぶ１つの画像データを生成し、ＲＡＭなどの記憶部６８（図３を参照）に記憶させる。このようにして、顕微鏡制御部６１は、試料ＴＰの画像を取得する。

　図２は、共焦点顕微鏡１０における収差補正部５１の拡大図である。収差補正部５１は、対物レンズ２６先端からカバーガラスＣＧまでの距離、カバーガラスＣＧの厚み、及び試料中の観察深さなどに起因する球面収差を補正する。対物レンズ２６は、レボルバ（図示せず）によりステージ１１の下方近傍で保持される。対物レンズ２６は、収差補正レンズ２７と、補正環２８とを有する。収差補正レンズ２７は、対物レンズ２６の光軸ＡＸに沿って移動することで、対物レンズ２６の球面収差を変化させることが可能である。補正環２８は、対物レンズ２６の鏡筒部に、対物レンズ２６の光軸ＡＸを中心に回転自在に設けられる。補正環２８の回転に応じて、収差補正レンズ２７が対物レンズ２６の光軸ＡＸに沿って移動する。

　収差補正部５１は、対物レンズ２６の収差補正レンズ２７および補正環２８と、検出部４１とを含む。さらに、収差補正部５１は、補正環駆動部５５と、対物レンズ駆動部５６とを有する。補正環駆動部５５は、例えば電動モータ（図示せず）を用いて構成される。補正環駆動部５５は、補正環２８を回転駆動し、補正環２８の回転位置Ｃを変化させ、収差補正レンズ２７を対物レンズ２６の光軸ＡＸに沿って移動させる。補正環駆動部５５は、補正環２８の回転位置■を変化させて、収差補正レンズ２７の光軸上の位置を変化させることにより、対物レンズ２６の球面収差を変化させる。

　対物レンズ駆動部５６は、例えば電動モータ（図示せず）を用いて構成される。対物レンズ駆動部５６は、レボルバ（不図示）とともに対物レンズ２６をｚ方向に上下移動させる。対物レンズ駆動部５６により対物レンズ２６がｚ方向に移動すると、試料ＴＰに対する対物レンズ２６の相対位置が変化し、試料ＴＰに対する対物レンズ２６の焦点位置ＰＦがｚ方向に変化する。対物レンズ駆動部５６により対物レンズ２６の焦点位置ＰＦをｚ方向に変位させることで、ｚ方向（対物レンズ２６の光軸方向）の位置が異なる試料ＴＰの断面（観察面ＴＡ）の画像を取得することが可能である。以降、ｚ方向の位置が異なる複数の試料ＴＰの断面の画像を、試料ＴＰのｚスタック画像と称することがある。

　図３は、第１実施形態に係る共焦点顕微鏡１０の顕微鏡制御部６１と情報処理装置９０との間の電気的な接続を示すブロック図である。共焦点顕微鏡１０の顕微鏡制御部６１は、収差の補正量算出決定部としても機能し、補正環２８の最適な回転位置を求める。顕微鏡制御部６１は、主制御部６２と、画像生成部６３と、評価値算出部６４と、補正環位置決定部６５と、リスト作成部６７と、記憶部６８とを有する。

　主制御部６２は、収差補正部５１を構成する、検出部４１、補正環駆動部５５、および対物レンズ駆動部５６と電気的に接続される。主制御部６２は、情報処理装置９０の入出力制御部９１と電気的に接続される。主制御部６２は、入出力制御部９１から入力されるデータに応じて、検出部４１、補正環駆動部５５、および対物レンズ駆動部５６を制御する。

　画像生成部６３は、検出部４１から入力された光の検出信号に基づいて、試料ＴＰの画像を生成する。画像生成部６３は、生成した試料ＴＰの画像データを、評価値算出部６４および記憶部６８のうち少なくともいずれかへ出力する。例えば、画像生成部６３は、記憶部６８で記憶される試料ＴＰの画像を生成すると、生成した試料ＴＰの画像データを記憶部６８へ出力する。画像生成部６３は、評価値算出部６４による処理で用いられる試料ＴＰの画像を生成すると、生成した試料ＴＰの画像データを評価値算出部６４へ出力する。

　評価値算出部６４は、画像生成部６３から入力された試料ＴＰの画像データに基づいて、詳細は後述する評価値ｖを求める。評価値算出部６４は、求めた評価値ｖのデータを記憶部６８へ出力する。

　補正環位置決定部６５は、記憶部６８に記憶された評価値ｖのデータに基づいて、補正環２８の最適な回転位置を求める。補正環位置決定部６５は、求めた補正環２８の最適な回転位置のデータを、主制御部６２を介して記憶部６８へ出力するとともに、情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。以降、補正環２８の最適な回転位置を最適補正環位置ＣＰと称することがある。

　リスト作成部６７は、記憶部６８に記憶された設定用データテーブルと、情報処理装置９０の入出力制御部９１から入力された入力データに基づいて、共焦点顕微鏡１０の設定に関するパラメータリストを作成する。リスト作成部６７は、作成したパラメータリストを、主制御部６２へ出力する。

　記憶部６８は、ＲＡＭ等のメモリやハードディスク等を用いて構成される。顕微鏡制御部６１の各部から入力される各種データを記憶する。例えば、記憶部６８は、画像生成部６３から入力された試料ＴＰの画像データを記憶する。記憶部６８は、評価値算出部６４から入力された評価値ｖのデータを記憶する。

　また、記憶部６８は、設定用データテーブルを記憶している。第１実施形態に係る設定用データテーブルＤＢ１は、図６に示すように、試料ＴＰの屈折率ｎと、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰと、Ｌ－ｄ変化比ｍ_Ｌとの関係を示すデータテーブルである。

　ここで、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰとは、観察深さｄの変化量と、観察深さｄの変化に伴う補正環２８の最適補正環位置ＣＰの変化量との比である。観察深さｄとは、試料ＴＰの下端部（カバーガラスＣＧと試料ＴＰとの境界部）から観察面までのｚ方向の深さ位置である（図２を参照）。補正環２８の最適補正環位置ＣＰとは、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが観察深さｄの位置にあり、かつ対物レンズ２６先端からカバーガラスＣＧまでの距離、カバーガラスＣＧの厚み、及び観察深さｄなどに起因する球面収差が最小となる、補正環２８の最適な回転位置である。例えば、図５（Ａ）に示すように、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合における観察深さｄと最適補正環位置ＣＰとの関係は直線ｆＣＰ_ｎ１で表すことができる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合における観察深さｄと最適補正環位置ＣＰとの関係は直線ｆＣＰ_ｎ２で表すことができる。このとき、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合におけるＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰは、直線ｆＣＰ_ｎ１の傾きとして求まる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合におけるＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰは、直線ｆＣＰ_ｎ１の傾きとは異なる直線ｆＣＰ_ｎ２の傾きとして求まる。

　Ｌ－ｄ変化比ｍ_Ｌとは、観察深さｄの変化量と、観察深さｄの変化に伴う対物レンズ２６の位置Ｌの変化量との比である。対物レンズ２６の位置Ｌとは、所定の基準位置Ｌ０を原点位置とした、対物レンズ２６のｚ方向の位置である（図２を参照）。対物レンズ２６のｚ方向の位置は、例えば、対物レンズ２６をｚ方向に駆動させるギアの角度の基準位置からの変化量で検出できる。Ｌ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求める理由は、試料ＴＰと浸液ＩＭとの間では屈折率の差があるため、観察深さｄの変化量と対物レンズ２６の位置Ｌの変化量とが異なるからである。例えば図７に示すように、対物レンズ２６の位置がＬ_ｉからＬ_ｉ＋１まで変位した場合の変位量（Ｌ_ｉ＋１－Ｌ_ｉ）は、この変位に対応して対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが観察深さｄ_ｉの位置から観察深さｄ_ｉ＋１の位置まで変位した場合の変位量（ｄ_ｉ＋１－ｄ_ｉ）と異なってしまう。

　例えば、図５（Ｂ）に示すように、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合における観察深さｄと対物レンズ２６の位置Ｌとの関係は直線ｆＬ_ｎ１で表すことができる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合における観察深さｄと対物レンズ２６の位置Ｌとの関係は直線ｆＬ_ｎ２で表すことができる。このとき、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合におけるＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌは、直線ｆＬ_ｎ１の傾きとして求まる。試料ＴＰの屈折率ｎがｎ２の場合におけるＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌは、直線ｆＬ_ｎ１の傾きとは異なる直線ｆＬ_ｎ２の傾きとして求まる。

　予め、光学シミュレーションを行うことにより、複数の試料屈折率についてＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求めることで、設定用データテーブルＤＢ１を作成することが可能である。具体的には、光学シミュレーションを行うことによりＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求める。このときまず、試料屈折率、浸液屈折率、カバーガラスの厚み、試料ＴＰ中の観察深さｄなどを設定し、例えば、ＰＳＦ（点像分布関数）のストレール比を算出することにより、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが観察深さｄの位置にあるときの対物レンズ２６の位置Ｌを求める。次に、複数の観察深さｄについて対物レンズ２６の位置Ｌを求めることで、観察深さｄに対する対物レンズ２６の位置Ｌのプロットを作成する。そして、作成したプロットを例えば直線でフィッティングし、Ｌ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求める。複数の試料屈折率を設定してＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求めることで、試料屈折率毎にＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求める。

　続いて、光学シミュレーションを行うことによりＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰを求める。このときまず、試料屈折率、浸液屈折率、カバーガラスの厚み、試料ＴＰ中の観察深さｄ、および対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが観察深さｄの位置にあるときの対物レンズ２６の位置Ｌなどを設定し、このときの結像状態が最良となる補正環２８の回転位置（最適補正環位置ＣＰ）を求める。なお、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが観察深さｄの位置にあるときの対物レンズ２６の位置Ｌは、Ｌ－ｄ変化比ｍ_Ｌを用いて算出される。また、結像状態を表す指標として、ＰＳＦ（点像分布関数）のストレール比を用いることができる。次に、複数の観察深さｄについて補正環２８の最適補正環位置ＣＰを求めることで、観察深さｄに対する補正環２８の最適補正環位置ＣＰのプロットを作成する。そして、作成したプロットを例えば直線でフィッティングし、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰを求める。複数の試料屈折率を設定してＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰを求めることで、試料屈折率毎にＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰを求める。

　情報処理装置９０は、入出力制御部９１を有する。情報処理装置９０は、入力部９２および表示部９３と電気的に接続される。入力部９２は、ユーザーが操作可能な入力インターフェースである。入力部９２は、例えば、マウス、キーボード、タッチパッド、トラックボール等のうち少なくとも１つを含む。入力部９２は、ユーザーによる操作を検出し、その検出結果をユーザーが入力した入力データとして情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。表示部９３は、例えば、液晶ディスプレイ等である。情報処理装置９０の入出力制御部９１は、共焦点顕微鏡１０の操作に必要なＧＵＩ（グラフィカルユーザーインターフェース）や、共焦点顕微鏡１０の顕微鏡制御部６１から出力された、試料ＴＰの画像、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ等を表示部９３に表示させる。入出力制御部９１は、入力部９２から入力された入力データを共焦点顕微鏡１０の顕微鏡制御部６１へ出力する。

　次に、試料ＴＰの画像を取得するための顕微鏡装置１の制御方法（以降、画像取得方法と称する）について説明する。第１実施形態に係る画像取得方法では、まず、或る一つの観察深さｄの位置に対物レンズ２６の焦点位置ＰＦがあるときの、対物レンズ２６の位置Ｌを求める。次に、当該観察深さｄにおける補正環２８の最適補正環位置ＣＰを実験的に求める。そして、他の観察深さｄにおける補正環２８の最適補正環位置ＣＰを、実験的にではなく、ユーザーの操作により入力される試料ＴＰの屈折率に基づいて求める。なお、第１実施形態に係る画像取得方法では、補正環２８を回転させて対物レンズ２６の球面収差を変化させても、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが変化しない場合について説明する。

　図４は、第１実施形態に係る画像取得方法を示すフローチャートである。なお、顕微鏡制御部６１は、例えばコンピュータシステムを含む。顕微鏡制御部６１は、記憶部６８に記憶されている制御プログラムを読み出し、この制御プログラムに従って各種の処理を実行する。ステップＳＴ１１０において、設定用データテーブルＤＢ１を作成して記憶部６８に記憶させる。前述したように、予め、光学シミュレーションを行うことにより、複数の屈折率についてＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求めることで、設定用データテーブルＤＢ１を作成する。

　ステップＳＴ１２０において、補正環２８の最適補正環位置ＣＰを実験的に求める観察深さｄ_Ｓおよび観察領域ＲＯＩの位置を設定する。図８（Ａ）に示すように、ユーザーは、表示部９３に表示されるＧＵＩを利用して、試料の画像ＴＩを見ながら、対物レンズ２６の位置Ｌを入力する操作を入力部９２に対して行い、観察深さｄ_Ｓを設定する。ユーザーは、表示部９３に表示されるＧＵＩを利用して、試料の画像ＴＩを見ながら、観察領域ＲＯＩ（ステージ１１）のｘ方向位置およびｙ方向位置を入力する操作を入力部９２に対して行い、観察領域ＲＯＩを設定する。ユーザーが、対物レンズ２６の位置Ｌを入力する操作や、観察領域ＲＯＩ（ステージ１１）のｘ方向位置およびｙ方向位置を入力する操作を入力部９２に対して行うと、入力部９２は、これらの操作に対応する入力データを、情報処理装置９０の入出力制御部９１を介して共焦点顕微鏡１０の顕微鏡制御部６１へ出力する。

　図８（Ｂ）は、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが、補正環２８の最適補正環位置ＣＰを実験的に求める観察深さｄ_Ｓの位置にある状態を示す。図８（Ａ）を用いて説明したように、ユーザーは、補正環２８の最適補正環位置ＣＰを実験的に求める観察深さｄ_Ｓが実際にはわからないため、観察深さｄ_Ｓは、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦがこの観察深さｄ_Ｓの位置にあるときの対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｓにより設定される。なお、観察深さｄ_Ｓのときの値を０とする相対的な観察深さを、相対観察深さｄｒと称することがある。補正環２８の最適補正環位置ＣＰを実験的に求める、対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｓおよび、観察領域ＲＯＩ（ステージ１１）のｘ方向位置およびｙ方向位置は、手動に限らず、画像の信号強度（輝度値）やコントラストが高いこと等を条件として自動的に設定されるようにしてもよい。

　ステップＳＴ１３０において、顕微鏡制御部６１は、ステップＳＴ１２０で設定した観察深さｄ_Ｓにおける、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓを求める。ユーザーが、図８（Ａ）に示すＧＵＩ（補正環調整画面）９５の「開始」ボタン９６を選択する操作を入力部９２に対して行うと、入力部９２は、この操作に対応する入力データを、情報処理装置９０の入出力制御部９１を介して共焦点顕微鏡１０の顕微鏡制御部６１へ出力する。そして、ステップＳＴ１２０で設定した観察深さｄ_Ｓ（対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｓ）および観察領域ＲＯＩにおいて、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓを求める補正環位置決定処理が開始される。

　ここで、補正環位置決定処理の詳細について説明する。図１１は、第１実施形態に係る補正環位置決定処理の詳細を示すフローチャートである。ステップＳＴ１３１において、顕微鏡制御部６１の主制御部６２は、補正環駆動部５５へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部５５は、補正環２８を初期状態の回転位置（以降、初期補正環位置ＣＢと称することがある）へ回転移動させる。補正環２８の回転に応じて、収差補正レンズ２７が対物レンズ２６の光軸ＡＸに沿って移動するため、補正環２８の回転位置Ｃは、収差補正レンズ２７の対物レンズ２６における光軸ＡＸ上の位置に対応している。

　ステップＳＴ１３２において、顕微鏡制御部６１は、試料ＴＰの画像を1回または複数回取得する。顕微鏡制御部６１は、光源ユニット１６からレーザー光（励起光）射出させる。また、顕微鏡制御部６１の主制御部６２は、検出部４１へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した検出部４１は、試料ＴＰからの光（蛍光）の検出信号を顕微鏡制御部６１の画像生成部６３へ出力する。画像生成部６３は、検出部４１から入力された光の検出信号（前述の１画素分のデータ）をスキャナ２５による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、試料ＴＰの画像を生成する。画像生成部６３は、生成した試料ＴＰの画像データを評価値算出部６４へ出力する。

　ステップＳＴ１３３において、顕微鏡制御部６１の評価値算出部６４は、ステップＳＴ１３２で生成した試料ＴＰの画像データに基づいて、評価値ｖを求める。評価値算出部６４は、求めた評価値ｖのデータおよび、このときの補正環２８の回転位置Ｃ（初めてこの処理を実行する場合、初期補正環位置ＣＢ）のデータを記憶部６８に記憶させて保持する。評価値ｖとして、例えば、画像のコントラストや、画像の信号強度（輝度）の積算値、画像の信号強度をフーリエ変換して得られる周波数成分の所定の周波数領域における積算値等を用いることができる。また、同じ条件で複数回取得した画像間の相関値を用いてもよい。

　ステップＳＴ１３４において、顕微鏡制御部６１の主制御部６２は、補正環２８の回転位置Ｃを規定回数変えたか否かを判定する。主制御部６２が、補正環２８の回転位置Ｃを規定回数変えていないと判定した場合（ステップＳＴ１３４：Ｎｏ）、ステップＳＴ１３５へ進む。ステップＳＴ１３５において、主制御部６２は、補正環駆動部５５へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部５５は、補正環２８を所定の回転移動量だけ回転移動させ、ステップＳＴ１３２へ戻る。そして、ステップＳＴ１３２からステップＳＴ１３４までの処理を繰り返す。以上の処理により、所定の回転移動量で、補正環２８を初期補正環位置ＣＢから規定回数だけ回転移動させたときの、それぞれの補正環２８の回転位置での評価値ｖを求めることができる。

　図１２は、補正環２８の回転位置Ｃを変えて求まる評価値ｖの一例を示すグラフである。図１２に示すように、補正環２８の回転位置Ｃを変える規定回数を６とした場合、まず、顕微鏡制御部６１は、初期補正環位置ＣＢでの試料の画像ＴＩ（ＣＢ）を取得する。ここで、初期補正環位置ＣＢを回転位置Ｃ_Ｂ０とすると、顕微鏡制御部６１は、回転位置Ｃ_Ｂ０での画像ＴＩ（Ｃ_Ｂ０）を取得することになる。顕微鏡制御部６１は、補正環２８を初期補正環位置ＣＢから第１の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ｂ１での画像ＴＩ（Ｃ_Ｂ１）を取得する。顕微鏡制御部６１は、補正環２８を初期補正環位置ＣＢから第２の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ｂ２での画像ＴＩ（Ｃ_Ｂ２）を取得する。顕微鏡制御部６１は、補正環２８を初期補正環位置ＣＢから第３の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ｂ３での画像ＴＩ（Ｃ_Ｂ３）を取得する。顕微鏡制御部６１は、補正環２８を初期補正環位置ＣＢから第４の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ｂ４での画像ＴＩ（Ｃ_Ｂ４）を取得する。顕微鏡制御部６１は、補正環２８を初期補正環位置ＣＢから第５の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ｂ５での画像ＴＩ（Ｃ_Ｂ５）を取得する。顕微鏡制御部６１は、補正環２８を初期補正環位置ＣＢから第６の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ｂ６での画像ＴＩ（Ｃ_Ｂ６）を取得する。つまり、顕微鏡制御部６１は、補正環２８を初期補正環位置ＣＢから６回回転移動させた各回転位置Ｃ_Ｂ１～Ｃ_Ｂ６で画像ＴＩを取得する。顕微鏡制御部６１の評価値算出部６４は、これらの画像データに基づいて、初期補正環位置ＣＢおよび、補正環２８を初期補正環位置ＣＢから第１～第６の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ｂ１～Ｃ_Ｂ６での評価値ｖを求めることができる。

　なお、上記では、初期補正環位置ＣＢを回転位置Ｃ_Ｂ０とした場合を例に挙げて説明したが、これに限られるものではない。例えば、初期補正環位置ＣＢを回転位置Ｃ_Ｂ３としてもよい。

　ステップＳＴ１３４において、主制御部６２が、補正環２８の回転位置Ｃを規定回数変えたと判定した場合（ステップＳＴ１３４：Ｙｅｓ）、ステップＳＴ１３６へ進む。ステップＳＴ１３６において、顕微鏡制御部６１の補正環位置決定部６５は、記憶部６８に記憶された補正環２８の複数の回転位置での評価値ｖを比較して、評価値ｖが最大となる補正環２８の最適な回転位置を求める。評価値ｖと補正環２８の回転位置Ｃとの関係について補間または関数近似を行った上で、評価値ｖが最大となる補正環２８の最適な回転位置を求めてもよい。補正環位置決定部６５は、求めた補正環２８の最適な回転位置のデータを、主制御部６２へ出力し、ステップＳＴ１３７へ進む。

　ステップＳＴ１３７において、顕微鏡制御部６１の主制御部６２は、ステップＳＴ１３６で求めた補正環２８の最適な回転位置のデータを、実験的に求めた最適補正環位置ＣＰ_Ｓのデータとして、記憶部６８に記憶させて保持する。ステップＳＴ１３８において、主制御部６２は、補正環駆動部５５へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部５５は、補正環２８をステップＳＴ１３６で求めた最適補正環位置ＣＰ_Ｓへ回転移動させる。そして、次の処理（図４のステップＳＴ１４０）に移行する。

　ステップＳＴ１４０において、試料ＴＰの屈折率、画像取得パラメータ、画像取得範囲の入力を行う。図９に示すように、ユーザーは、表示部９３に表示されるＧＵＩ（設定入力画面）を利用して、試料ＴＰの屈折率ｎ_ＳＡとして試料ＴＰの種類を選択入力する操作を入力部９２に対して行う。図９では例えば、「試料の種類」に培養細胞（１．３５）が選択入力されており、この場合、屈折率ｎ_ＳＡは１．３５となる。また、ユーザーは、「手入力」を選択して、屈折率ｎ_ＳＡの値を直接入力する操作を行うことも可能である。図９では例えば、数値「１．３６」が直接入力されており、この場合、屈折率ｎ_ＳＡは１．３６となる。なお、「手入力」が選択されている場合、「試料の種類」の選択入力は無効となる。ユーザーは、表示部９３に表示されるＧＵＩを利用して、画像取得パラメータを入力する操作を入力部９２に対して行う。画像取得パラメータを入力する操作として、レーザーパワー（光源１７のパワー）、スキャンピッチ（スキャナ２５により走査される試料ＴＰにおける走査点の間隔）、スキャン点数(スキャナ２５により走査される試料ＴＰにおける走査点の数)を入力する操作が行われる。ユーザーは、表示部９３に表示されるＧＵＩを利用して、画像取得範囲を入力する操作を入力部９２に対して行う。画像取得範囲を入力する操作として、試料ＴＰのｚスタック画像の取得枚数Ｎ、対物レンズ２６の上端位置Ｌ_ＴＰ、対物レンズ２６の下端位置Ｌ_ＢＭを入力する操作が行われる。

　ユーザーが、試料ＴＰの屈折率を入力する操作や、画像取得パラメータを入力する操作、画像取得範囲を入力する操作を入力部９２に対して行うと、入力部９２は、これらの操作に対応する入力データを、情報処理装置９０の入出力制御部９１を介して共焦点顕微鏡１０の顕微鏡制御部６１へ出力する。なお、ｚスタック画像は、対物レンズ２６の上端位置Ｌ_ＴＰが設定されたときの対物レンズ２６の焦点位置ＰＦから、対物レンズの下端位置Ｌ_ＢＭが設定されたときの対物レンズ２６の焦点位置ＰＦまでの間で取得される。

　ステップＳＴ１５０において、顕微鏡制御部６１のリスト作成部６７は、記憶部６８に記憶された設定用データテーブルＤＢ１（図６を参照）と、ステップＳＴ１４０で入力された屈折率ｎ_ＳＡに基づいて、屈折率ｎ_ＳＡに対応するＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを算出して求める。なお、屈折率ｎ_ＳＡと合致する屈折率の値が、設定用データテーブルＤＢ１にない場合、設定用データテーブルＤＢ１における屈折率ｎ_ＳＡの近傍の屈折率の値に対して補間を行うことで、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求めるようにしてもよい。

　例えば、ステップＳＴ１４０で入力された屈折率ｎ_ＳＡが１．３３６であった場合、設定用データテーブルＤＢ１における屈折率が１．３３５に対応するＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ(n=1.335)およびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌ(n=1.335)を用いてもよい。また、設定用データテーブルＤＢ１における屈折率が１．３３５に対応するＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ(n=1.335)と、屈折率が１．３４０に対応するＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ(n=1.340)とを補間することにより、屈折率ｎ_ＳＡが１．３３６である場合のＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰを求めてもよい。設定用データテーブルＤＢ１における屈折率が１．３３５に対応するＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌ(n=1.335)と、屈折率が１．３４０に対応するＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌ(n=1.340)とを補間することにより、屈折率ｎ_ＳＡが１．３３６である場合のＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求めてもよい。

　ステップＳＴ１６０において、顕微鏡制御部６１のリスト作成部６７は、ステップＳＴ１２０で設定した対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｓと、ステップＳＴ１３０で求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓと、ステップＳＴ１４０で入力された画像取得範囲（試料ＴＰのｚスタック画像の取得枚数Ｎ、対物レンズ２６の上端位置Ｌ_ＴＰ、対物レンズ２６の下端位置Ｌ_ＢＭ）と、ステップＳＴ１５０で求めたＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌに基づいて、共焦点顕微鏡１０の設定に関するパラメータリストを作成する。第１実施形態に係るパラメータリストＬＳ１は、図１０（Ｂ）に示すように、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際の、相対観察深さｄｒと、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ２６の位置Ｌとの関係を示すリストである。リスト作成部６７は、パラメータリストＬＳ１を作成すると、作成したパラメータリストＬＳ１のデータを、主制御部６２へ出力する。

　パラメータリストＬＳ１を作成するには、まず、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際に変位させる対物レンズ２６の位置Ｌ_ｉを求める。ここで、ｉは、１～Ｎ（試料ＴＰのｚスタック画像の取得枚数Ｎ）までの整数である。対物レンズ２６の位置Ｌ_ｉは、下記の式（１）を用いて求められる。

　次に、対物レンズ２６が位置Ｌ_ｉに位置するときの相対観察深さｄｒ_ｉを求める。相対観察深さｄｒ_ｉは、下記の式（２）を用いて求められる。

　次に、各相対観察深さｄｒ_ｉに対応する補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉを求める。補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉは、下記の式（３）を用いて求められる。

　そして、上記の式（１）～（３）を用いて求めた、相対観察深さｄｒ_ｉと、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉと、対物レンズ２６の位置Ｌ_ｉとの関係を示すリストを作成する。これにより、図１０（Ｂ）に示すようなパラメータリストＬＳ１を作成することができる。図１０（Ａ）に、相対観察深さｄｒ_ｉ（ｉ＝１，２，３，…）と、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉ（ｉ＝１，２，３，…）と、対物レンズ２６の位置Ｌ_ｉ（ｉ＝１，２，３，…）との位置関係を模式的に示す。

　ステップＳＴ１７０において、顕微鏡制御部６１は、ステップＳＴ１６０で作成したパラメータリストＬＳ１に従って、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ２６の位置Ｌとを変化させることにより、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する。

　第１実施形態によれば、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際、ｚ方向（対物レンズ２６の光軸方向）の位置が異なる試料ＴＰの断面の画像を取得する毎に、パラメータリストＬＳ１に従って、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ２６の位置Ｌとを変化させることができる。そのため、ｚ方向（対物レンズ２６の光軸方向）の位置が異なる試料ＴＰの断面の画像を取得する毎に、最適な収差補正を行うことができる。

　また、リスト作成部６７は、補正環位置決定部６５等によって或る一つの観察深さｄ_Ｓで実験的に求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓと、入力部９２から入力された試料ＴＰの屈折率ｎ_ＳＡと、設定用データテーブルＤＢ１とに基づいて、パラメータリストＬＳ１を構成する補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉを求める。これにより、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉの全てを実験的に求める必要がなく、パラメータリストＬＳ１を作成する手間を低減させることができる。

　なお例えば、実際に試料ＴＰのｚスタック画像を取得するときのカバーガラスＣＧの厚みは、設定用データテーブルＤＢ１を作成する際に光学シミュレーションで設定したカバーガラスＣＧの厚みと異なっている場合がある。第１実施形態では、光学シミュレーションを行うことにより作成した設定用データテーブルＤＢ１と、或る一つの観察深さｄ_Ｓで実験的に求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓとを用いることにより、他の観察深さ位置での補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉを算出するので、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉを、光学シミュレーションだけを用いて算出する場合よりも精度よく算出することができる。

［第１実施形態の変形例］
　上述の第１実施形態において、試料ＴＰのｚスタック画像を取得した後、異なる観察領域で同様の試料ＴＰのｚスタック画像を取得することが可能である。この場合、例えば、ステップＳＴ１１０～ＳＴ１３０の処理を省略し、ユーザーが観察領域を変える設定を行った後、ステップＳＴ１４０の処理から開始するようにしてもよい。

　また、試料ＴＰのｚスタック画像を取得した後、異なる観察領域で同様の試料ＴＰのｚスタック画像を取得することで、ｘｙ方向の位置が異なる複数の観察領域での試料ＴＰのｚスタック画像を並べるタイリングを行うことが可能である。そこで、第１実施形態に係る画像取得方法の変形例として、タイリングを行うために試料ＴＰのｚスタック画像を取得する場合について説明する。

　図１３は、第１実施形態の変形例に係る画像取得方法を示すフローチャートである。ステップＳＴ１１０～ステップＳＴ１４０の処理は、図４のステップＳＴ１１０～ステップＳＴ１４０の処理と同様であるので、その説明を省略する。ステップＳＴ１４５において、タイリングを行うための設定の入力を行う。このとき、ユーザーは、ｘ方向に並べる観察領域の数Ｍｘと、ｙ方向に並べる観察領域の数Ｍｙを入力する操作を入力部９２に対して行う。

　ステップＳＴ１５０～ステップＳＴ１７０の処理は、図４のステップＳＴ１５０～ステップＳＴ１７０の処理と同様であるので、その説明を省略する。ステップＳＴ１７１において、顕微鏡制御部６１の主制御部６２は、ステップＳＴ１４５で設定した全ての観察領域について試料ＴＰのｚスタック画像を取得したか否かを判定する。主制御部６２が、全ての観察領域について試料ＴＰのｚスタック画像を取得していないと判定した場合（ステップＳＴ１７１：Ｎｏ）、ステップＳＴ１７２へ進む。

　ステップＳＴ１７２において、主制御部６２は、ステージ駆動部１２へ制御信号を送信し、この制御信号を受信したステージ駆動部１２は、ステージ１１を次の観察領域に対応する位置までｘｙ方向に移動させ、ステップＳＴ１７０へ戻る。そして、ステップＳＴ１７０からステップＳＴ１７１までの処理を繰り返す。ステップＳＴ１７１において、主制御部６２が全ての観察領域について試料ＴＰのｚスタック画像を取得したと判定した場合（ステップＳＴ１７１：Ｙｅｓ）、処理を終了する。以上の処理により、Ｍｘ×Ｍｙ個の観察領域での試料ＴＰのｚスタック画像を取得することができる。

［第２実施形態］
　第２実施形態について説明する。第２実施形態に係る顕微鏡装置は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と同様の構成であり、上述の第１実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。第２実施形態において、記憶部６８（図３を参照）は、設定用データテーブルに加え、Ｌ－ＣＰ変化比ｍ_ＬＣのデータを記憶している。

　補正環２８を回転させて対物レンズ２６の球面収差を変化させると、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが光軸方向に変位する場合がある。Ｌ－ＣＰ変化比ｍ_ＬＣとは、補正環２８の回転位置の変化量ΔＣと、対物レンズ２６の補正移動量ΔＬとの比である。対物レンズ２６の補正移動量ΔＬとは、補正環２８の回転に伴って変位した対物レンズ２６の焦点位置ＰＦを観察深さｄの位置まで戻すのに必要な、対物レンズ２６の位置Ｌの変化量である。対物レンズ２６の補正移動量ΔＬは、下記の式（４）を用いて求められる。

　光学シミュレーションを行うことによりＬ－ＣＰ変化比ｍ_ＬＣを求めることが可能である。この場合、まず、試料屈折率、浸液屈折率、カバーガラスの厚み、補正環２８の任意の回転位置Ｃ_Ｔなどを設定し、例えば、ＰＳＦ（点像分布関数）のストレール比を算出することにより、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが任意の観察深さｄ_Ｔの位置にあるときの対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｔ１を求める。次に、補正環２８の回転位置を、任意の回転位置Ｃ_ＴからΔＣだけ変化させた状態で、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが任意の観察深さｄ_Ｔの位置にあるときの対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｔ２を求める。そして、下記の式（５）を用いてＬ－ＣＰ変化比ｍ_ＬＣを求める。

　また、実験的にＬ－ＣＰ変化比ｍ_ＬＣを求めることが可能である。この場合、補正環２８の任意の回転位置Ｃ_Ｔ’と任意の観察深さｄ_Ｔ’における、対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｔ１’を求める。次に、補正環２８の回転位置を、任意の回転位置Ｃ_Ｔ’からΔＣだけ変化させた状態で、補正環２８の回転位置を変化させる前と同じ画像が得られる対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｔ２’を求める。そして、上記の式（５）を用いてＬ－ＣＰ変化比ｍ_ＬＣを求める。

　第２実施形態に係る設定用データテーブルとして、第１実施形態と同様の設定用データテーブルＤＢ１（図６を参照）が用いられる。第２実施形態においても、予め、光学シミュレーションを行うことにより、複数の屈折率についてＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求めることで、設定用データテーブルＤＢ１を作成することが可能である。

　なお、光学シミュレーションを行うことによりＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰを求める際、或る試料ＴＰ中の観察深さｄにおいて、補正環２８の回転位置Ｃと対物レンズ２６の位置Ｌとの２次元のパラメータ空間内で、結像状態が最良となる補正環２８の回転位置および対物レンズ２６の位置を求める。具体的には、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが観察深さｄの位置にあるときの、結像状態が最良となる補正環２８の回転位置（最適補正環位置ＣＰ）および対物レンズ２６の位置を求める。本実施形態では、補正環２８の回転位置が変化すると、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦも変化するため、補正環２８の回転位置Ｃと対物レンズ２６の位置Ｌとの２つのパラメータについて最適値を求める必要がある。結像状態を表す指標として、ＰＳＦ（点像分布関数）のストレール比を用いることができる。次に、複数の観察深さｄについて補正環２８の最適補正環位置ＣＰを求めることで、観察深さｄに対する補正環２８の最適補正環位置ＣＰのプロットを作成する。そして、作成したプロットを例えば直線でフィッティングし、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰを求める。

　次に、第２実施形態に係る画像取得方法について説明する。第２実施形態に係る画像取得方法では、第１実施形態に係る画像取得方法と異なり、補正環２８を回転させて対物レンズ２６の球面収差を変化させると、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが変化する場合について説明する。この場合、前述したように、補正環２８の回転に伴って変位した対物レンズ２６の焦点位置ＰＦを観察深さｄの位置まで戻すのに必要な、対物レンズ２６の補正移動量ΔＬを求める。

　図１４は、第２実施形態に係る画像取得方法を示すフローチャートである。ステップＳＴ２１０において、予め求めておいたＬ－ＣＰ変化比ｍ_ＬＣのデータを記憶部６８に記憶させる。前述したように、予め、光学シミュレーションを行うことにより、もしくは実験的に、Ｌ－ＣＰ変化比ｍ_ＬＣを求めることが可能である。

　ステップＳＴ２２０において、設定用データテーブルＤＢ１を作成して記憶部６８に記憶させる。前述したように、予め、光学シミュレーションを行うことにより、複数の屈折率についてＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求めることで、第１実施形態と同様の設定用データテーブルＤＢ１を作成する。

　ステップＳＴ２３０において、補正環２８の最適補正環位置ＣＰを実験的に求める観察深さｄ_Ｓおよび観察領域ＲＯＩの位置を設定する。ステップＳＴ２３０では、第１実施形態におけるステップＳＴ１２０と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ２４０において、顕微鏡制御部６１は、ステップＳＴ２３０で設定した観察深さｄ_Ｓにおける、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓを求める。ステップＳＴ２４０では、第１実施形態におけるステップＳＴ１３０の場合と同様の操作により、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓを求める補正環位置決定処理が開始される。

　ここで、補正環位置決定処理の詳細について説明する。図１６は、第２実施形態に係る補正環位置決定処理の詳細を示すフローチャートである。ステップＳＴ２４１において、顕微鏡制御部６１の主制御部６２は、補正環駆動部５５へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部５５は、補正環２８を初期状態の回転位置（初期補正環位置ＣＢ）へ回転移動させる。また、主制御部６２は、上記の式（４）を用いて、このときの補正環２８の回転位置の変化量ΔＣに応じた、対物レンズ２６の補正移動量ΔＬを求める。主制御部６２は、対物レンズ駆動部５６へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した対物レンズ駆動部５６は、主制御部６２で求めた補正移動量ΔＬだけ、対物レンズ２６を移動させる。

　ステップＳＴ２４２において、顕微鏡制御部６１は、試料ＴＰの画像を1回または複数回取得する。ステップＳＴ２４２では、第１実施形態におけるステップＳＴ１３２と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ２４３において、顕微鏡制御部６１の評価値算出部６４は、ステップＳＴ２４２で生成した試料ＴＰの画像データに基づいて、評価値ｖを求める。ステップＳＴ２４３では、第１実施形態におけるステップＳＴ１３３と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ２４４において、顕微鏡制御部６１の主制御部６２は、補正環２８の回転位置Ｃを規定回数変えたか否かを判定する。主制御部６２が、補正環２８の回転位置Ｃを規定回数変えていないと判定した場合（ステップＳＴ２４４：Ｎｏ）、ステップＳＴ２４５へ進む。ステップＳＴ２４５において、主制御部６２は、補正環駆動部５５へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部５５は、補正環２８を所定の回転移動量だけ回転移動させる。また、主制御部６２は、対物レンズ駆動部５６へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した対物レンズ駆動部５６は、補正環２８の所定の回転移動量（回転位置の変化量ΔＣ）に応じた補正移動量ΔＬだけ、対物レンズ２６を移動させ、ステップＳＴ２４２へ戻る。そして、ステップＳＴ２４２からステップＳＴ２４４までの処理を繰り返す。以上の処理により、所定の回転移動量で、補正環２８を初期補正環位置ＣＢから規定回数だけ回転移動させたときの、それぞれの補正環２８の回転位置での評価値ｖを求めることができる。

　ステップＳＴ２４４において、主制御部６２が、補正環２８の回転位置Ｃを規定回数変えたと判定した場合（ステップＳＴ２４４：Ｙｅｓ）、ステップＳＴ２４６へ進む。ステップＳＴ２４６において、顕微鏡制御部６１の補正環位置決定部６５は、記憶部６８に記憶された補正環２８の複数の回転位置での評価値ｖを比較して、評価値ｖが最大となる補正環２８の最適な回転位置を求める。補正環位置決定部６５は、求めた補正環２８の最適な回転位置のデータを、主制御部６２へ出力し、ステップＳＴ２４７へ進む。

　ステップＳＴ２４７において、顕微鏡制御部６１の主制御部６２は、ステップＳＴ２４６で求めた補正環２８の最適な回転位置のデータを、実験的に求めた最適補正環位置ＣＰ_Ｓのデータとして、記憶部６８に記憶させて保持する。ステップＳＴ２４８において、主制御部６２は、補正環駆動部５５へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部５５は、補正環２８をステップＳＴ２４６で求めた最適補正環位置ＣＰ_Ｓへ回転移動させる。また、主制御部６２は、上記の式（４）を用いて、このときの補正環２８の回転位置の変化量ΔＣに応じた、対物レンズ２６の補正移動量ΔＬを求める。主制御部６２は、対物レンズ駆動部５６へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した対物レンズ駆動部５６は、主制御部６２で求めた補正移動量ΔＬだけ、対物レンズ２６を移動させる。そして、次の処理（図１４のステップＳＴ２５０）に移行する。

　ステップＳＴ２５０において、試料ＴＰの屈折率、画像取得パラメータ、画像取得範囲の入力を行う。ステップＳＴ２５０では、第１実施形態におけるステップＳＴ１４０と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ２６０において、顕微鏡制御部６１のリスト作成部６７は、記憶部６８に記憶された設定用データテーブルＤＢ１（図６を参照）と、ステップＳＴ２５０で入力された屈折率ｎ_ＳＡに基づいて、屈折率ｎ_ＳＡに対応するＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを算出して求める。なお、屈折率ｎ_ＳＡと合致する屈折率の値が、設定用データテーブルＤＢ１にない場合、設定用データテーブルＤＢ１における屈折率ｎ_ＳＡの近傍の屈折率の値に対して補間を行うことで、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌを求めるようにしてもよい。

　ステップＳＴ２７０において、顕微鏡制御部６１のリスト作成部６７は、ステップＳＴ２３０で設定した対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｓと、ステップＳＴ２４０で求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓと、ステップＳＴ２５０で入力された画像取得範囲（試料ＴＰのｚスタック画像の取得枚数Ｎ、対物レンズ２６の上端位置Ｌ_ＴＰ、対物レンズ２６の下端位置Ｌ_ＢＭ）と、ステップＳＴ２６０で求めたＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬ－ｄ変化比ｍ_Ｌに基づいて、共焦点顕微鏡１０の設定に関するパラメータリストを作成する。第２実施形態に係るパラメータリストＬＳ２は、図１５に示すように、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際の、相対観察深さｄｒと、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、補正環２８の回転に伴う対物レンズ２６の焦点位置ＰＦの変位を補正した対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｃとの関係を示すリストである。リスト作成部６７は、パラメータリストＬＳ２を作成すると、作成したパラメータリストＬＳ２のデータを、主制御部６２へ出力する。

　パラメータリストＬＳ２を作成するには、まず、上記の式（１）を用いて、第１実施形態で述べた対物レンズ２６の位置Ｌ_ｉを求める。次に、上記の式（２）を用いて、対物レンズ２６が位置Ｌ_ｉに位置するときの相対観察深さｄｒ_ｉを求める。次に、上記の式（３）を用いて、各相対観察深さｄｒ_ｉに対応する補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉを求める。

　次に、補正環２８の各最適補正環位置ＣＰ_ｉへの回転に伴う、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦの変位を補正した対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｃｉを求める。補正環２８の回転に伴う焦点位置ＰＦの変位を補正した対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｃｉは、下記の式（６）を用いて求められる。

　そして、上記の式（１）～（３）および式（６）を用いて求めた、相対観察深さｄｒ_ｉと、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉと、補正環２８の回転に伴う焦点位置ＰＦの変位を補正した対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｃｉとの関係を示すリストを作成する。これにより、図１５に示すようなパラメータリストＬＳ２を作成することができる。

　ステップＳＴ２８０において、顕微鏡制御部６１は、ステップＳＴ２７０で作成したパラメータリストＬＳ２に従って、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、補正環２８の回転に伴う焦点位置ＰＦの変位を補正した、対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｃとを変化させることにより、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する。

　第２実施形態によれば、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際、ｚ方向（対物レンズ２６の光軸方向）の位置が異なる試料ＴＰの断面の画像を取得する毎に、パラメータリストＬＳ２に従って、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、補正環２８の回転に伴う焦点位置ＰＦの変位を補正した、対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｃとを変化させることができる。そのため、ｚ方向（対物レンズ２６の光軸方向）の位置が異なる試料ＴＰの断面の画像を取得する毎に、最適な収差補正を行うことができる。

　また、リスト作成部６７は、補正環位置決定部６５等によって或る一つの観察深さｄ_Ｓで実験的に求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓと、入力部９２から入力された試料ＴＰの屈折率ｎ_ＳＡと、設定用データテーブルＤＢ１とに基づいて、パラメータリストＬＳ２を構成する、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉと、補正環２８の回転に伴う焦点位置ＰＦの変位を補正した、対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｃとを求める。これにより、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉや対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｃの全てを実験的に求める必要がなく、パラメータリストＬＳ２を作成する手間を低減させることができる。

　なお例えば、実際に試料ＴＰのｚスタック画像を取得するときのカバーガラスＣＧの厚みは、設定用データテーブルＤＢ１を作成する際に光学シミュレーションで設定したカバーガラスＣＧの厚みと異なっている場合がある。第２実施形態では、光学シミュレーションを行うことにより作成した設定用データテーブルＤＢ１と、或る一つの観察深さｄ_Ｓで実験的に求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓとを用いることにより、他の観察深さ位置での補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉを算出するので、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉを、光学シミュレーションだけを用いて算出する場合よりも精度よく算出することができる。

　上述の第２実施形態において、試料ＴＰのｚスタック画像を取得した後、異なる観察領域で同様の試料ＴＰのｚスタック画像を取得することが可能である。この場合、例えば、ステップＳＴ２１０～ＳＴ２４０の処理を省略し、ユーザーが観察領域を変える設定を行った後、ステップＳＴ２５０の処理から開始するようにしてもよい。また、第１実施形態の変形例で述べた画像取得方法と同様にして、試料ＴＰのｚスタック画像を取得した後、異なる観察領域で同様の試料ＴＰのｚスタック画像を取得することで、ｘｙ方向の位置が異なる複数の観察領域での試料ＴＰのｚスタック画像を並べるタイリングを行うことが可能である。

［第３実施形態］
　第３実施形態について説明する。第３実施形態に係る顕微鏡装置は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と同様の構成であり、上述の第１実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１７は、第３実施形態に係る顕微鏡制御部３６１と情報処理装置９０との間の電気的な接続を示すブロック図である。第３実施形態に係る顕微鏡制御部３６１は、収差の補正量算出決定部としても機能し、補正環２８の最適な回転位置と、対物レンズ２６の最適な位置を求める。顕微鏡制御部３６１は、主制御部６２と、画像生成部６３と、評価値算出部６４と、補正環位置決定部６５と、ｚ位置算出部３６６と、リスト作成部６７と、記憶部６８とを有する。

　画像生成部６３は、検出部４１から入力された光の検出信号に基づいて、試料ＴＰの画像を生成する。画像生成部６３は、生成した試料ＴＰの画像データを、評価値算出部６４、ｚ位置算出部３６６、記憶部６８のうち少なくともいずれかへ出力する。例えば、画像生成部６３は、記憶部６８で記憶される試料ＴＰの画像を生成すると、生成した試料ＴＰの画像データを記憶部６８へ出力する。画像生成部６３は、評価値算出部６４による処理で用いられる試料ＴＰの画像を生成すると、生成した試料ＴＰの画像データを評価値算出部６４へ出力する。画像生成部６３は、ｚ位置算出部３６６による処理で用いられる試料ＴＰの画像を生成すると、生成した試料ＴＰの画像データをｚ位置算出部３６６へ出力する。

　ｚ位置算出部３６６は、画像生成部６３から入力された試料ＴＰの評価用ｚスタック画像データと、記憶部６８に記憶された試料ＴＰの基準画像データに基づいて、対物レンズ２６の最適な位置を求める。ｚ位置算出部３６６は、求めた対物レンズ２６の最適な位置のデータを、主制御部６２を介して記憶部６８へ出力する。以降、対物レンズ２６の最適な位置を最適対物レンズ位置ＬＰと称することがある。

　第３実施形態において、記憶部６８は、設定用データテーブルと、試料ＴＰの基準画像データを記憶する。試料ＴＰの基準画像データは、ｚ位置算出部３６６により対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰを求める際に用いられる。第３実施形態に係る設定用データテーブルＤＢ３は、図２０に示すように、試料ＴＰの屈折率ｎと、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰと、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰと、Ｌ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’との関係を示すデータテーブルである。

　ここで、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰとは、第１実施形態でも述べたように、観察深さｄの変化量と、観察深さｄの変化に伴う補正環２８の最適補正環位置ＣＰの変化量との比である。例えば、図１９（Ａ）に示すように、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合における観察深さｄと最適補正環位置ＣＰとの関係は直線ｆＣＰ_ｎ１で表すことができる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合における観察深さｄと最適補正環位置ＣＰとの関係は直線ｆＣＰ_ｎ２で表すことができる。このとき、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合におけるＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰは、直線ｆＣＰ_ｎ１の傾きとして求まる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合におけるＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰは、直線ｆＣＰ_ｎ１の傾きとは異なる直線ｆＣＰ_ｎ２の傾きとして求まる。

　ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰとは、観察深さｄの変化量と、観察深さｄの変化に伴う対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰの変化量との比である。対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰとは、補正環２８の回転に伴う焦点位置ＰＦの変位を補正した対物レンズ２６の最適な位置である（図２１を参照）。例えば、図１９（Ｂ）に示すように、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合における観察深さｄと対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰとの関係は直線ｆＬＰ_ｎ１で表すことができる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合における観察深さｄと対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰとの関係は直線ｆＬＰ_ｎ２で表すことができる。このとき、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合におけるＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰは、直線ｆＬＰ_ｎ１の傾きとして求まる。試料ＴＰの屈折率ｎがｎ２の場合におけるＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰは、直線ｆＬＰ_ｎ１の傾きとは異なる直線ｆＬＰ_ｎ２の傾きとして求まる。

　Ｌ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’とは、観察深さｄの変化量と、観察深さdの変化に伴う対物レンズ２６の位置Ｌ’の変化量との比である。対物レンズ２６の位置Ｌ’とは、補正環２８の回転位置Ｃが一定であると仮定した場合における、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが観察深さｄの位置にあるときの対物レンズ２６の位置である。例えば、図１９（Ｃ）に示すように、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合における観察深さｄと対物レンズ２６の位置Ｌ’との関係は直線ｆＬ’_ｎ１で表すことができる。試料ＴＰの屈折率がｎ２の場合における観察深さｄと対物レンズ２６の位置Ｌ’との関係は直線ｆＬ’_ｎ２で表すことができる。このとき、試料ＴＰの屈折率がｎ１の場合におけるＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’は、直線ｆＬ’_ｎ１の傾きとして求まる。試料ＴＰの屈折率ｎがｎ２の場合におけるＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’は、直線ｆＬ’_ｎ１の傾きとは異なる直線ｆＬ’_ｎ２の傾きとして求まる。

　なお、図２１に示すように、観察深さがｄ_ｉから観察深さｄ_ｉ＋１まで変位する際、補正環２８の回転位置をＣＰ_ｉからＣＰ_ｉ＋１まで変位させる場合には、対物レンズ２６の位置をＬＰ_ｉからＬＰ_ｉ＋１まで変位させるものとする。図２２に示すように、観察深さがｄ_ｉから観察深さｄ_ｉ＋１まで変位する際、補正環２８の回転位置を一定の位置（Ｃ＝Ｃ_ＣＳＴ）に固定する場合には、対物レンズ２６の位置をＬ’_ｉからＬ’_ｉ＋１まで変位させるものとする。補正環２８の回転位置が変位する場合の対物レンズ２６の変位量（Ｌ_ｉ＋１－Ｌ_ｉ）は、補正環２８の回転位置が一定である場合の対物レンズ２６の変位量（Ｌ’_ｉ＋１－Ｌ’_ｉ）とは異なる。

　予め、光学シミュレーションを行うことにより、複数の屈折率について、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を求めることで、設定用データテーブルＤＢ３を作成することが可能である。具体的は、光学シミュレーションを行うことによりＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰおよびＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰを求める。このときまず、或る試料ＴＰ中の観察深さｄにおいて、補正環２８の回転位置Ｃと対物レンズ２６の位置Ｌとの２次元のパラメータ空間内で、結像状態が最良となる補正環２８の回転位置および対物レンズ２６の位置を求める。具体的には、試料屈折率、浸液屈折率、カバーガラスの厚み、試料ＴＰ中の観察深さｄなどを設定し、結像状態が最良となる補正環２８の回転位置（最適補正環位置ＣＰ）および対物レンズ２６の位置（最適対物レンズ位置ＬＰ）を求める。結像状態を表す指標として、ＰＳＦ（点像分布関数）のストレール比を用いることができる。

　次に、複数の観察深さｄについて補正環２８の最適補正環位置ＣＰを求めることで、観察深さｄに対する補正環２８の最適補正環位置ＣＰのプロットを作成する。そして、作成したプロットを例えば直線でフィッティングし、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰを求める。また、複数の観察深さｄについて対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰを求めることで、観察深さｄに対する対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰのプロットを作成する。そして、作成したプロットを例えば直線でフィッティングし、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰを求める。

　続いて、光学シミュレーションを行うことによりＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を求める。このときまず、試料屈折率、浸液屈折率、カバーガラスの厚み、試料ＴＰ中の観察深さｄなどを設定し、補正環２８を任意の固定回転位置Ｃ_ＣＳＴで固定し、対物レンズ２６の位置Ｌについての１次元のパラメータで、結像状態が最良となる対物レンズ２６の位置Ｌ’を求める。結像状態を表す指標として、ＰＳＦ（点像分布関数）のストレール比を用いることができる。次に、複数の観察深さｄについて対物レンズ２６の位置Ｌ’を求めることで、観察深さｄに対する対物レンズ２６の位置Ｌ’のプロットを作成する。そして、作成したプロットを例えば直線でフィッティングし、Ｌ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を求める。補正環２８の任意の固定回転位置Ｃ_ＣＳＴには、例えば、ユーザーが最も高い頻度で観察を行うと予想される試料ＴＰ中の観察深さｄにおける、補正環２８の最適な回転位置が用いられてもよい。複数の試料屈折率を設定してＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、Ｌ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を求めることで、試料屈折率毎にＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、Ｌ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を求める。

　次に、第３実施形態に係る画像取得方法について説明する。第３実施形態に係る画像取得方法では、まず、或る一つの観察深さｄの位置に対物レンズ２６の焦点位置ＰＦがあるときの、対物レンズ２６の位置Ｌを求める。次に、当該観察深さｄにおける補正環２８の最適補正環位置ＣＰおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰを実験的に求める。そして、他の観察深さｄにおける補正環２８の最適補正環位置ＣＰおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰを、実験的にではなく、ユーザーの操作により入力される試料ＴＰの屈折率に基づいて求める。

　図１８は、第３実施形態に係る画像取得方法を示すフローチャートである。なお、顕微鏡制御部３６１は、例えばコンピュータシステムを含む。顕微鏡制御部３６１は、記憶部６８に記憶されている制御プログラムを読み出し、この制御プログラムに従って各種の処理を実行する。ステップＳＴ３１０において、設定用データテーブルＤＢ３を作成して記憶部６８に記憶させる。前述したように、予め、光学シミュレーションを行うことにより、複数の屈折率について、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を求めることで、設定用データテーブルＤＢ３を作成する。

　ステップＳＴ３２０において、補正環２８の最適補正環位置ＣＰおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰを実験的に求める観察深さｄ_Ｓおよび観察領域ＲＯＩの位置を設定する。ステップＳＴ３２０では、第１実施形態におけるステップＳＴ１２０と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ３３０において、顕微鏡制御部３６１は、ステップＳＴ３２０で設定した観察深さｄ_Ｓにおける、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓと、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓを求める。ステップＳＴ３３０では、第１実施形態におけるステップＳＴ１３０の場合と同様の操作により、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓを求める補正環位置決定処理が開始される。

　ここで、補正環位置決定処理の詳細について説明する。図２３は、第３実施形態に係る補正環位置決定処理の詳細を示すフローチャートである。ステップＳＴ３３１において、顕微鏡制御部３６１は、観察深さｄ_Ｓを設定したときの補正環２８の回転位置および対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｓについての試料ＴＰの画像を取得する。このステップＳＴ３３１で取得する試料ＴＰの画像を、試料ＴＰの基準画像とする。以降、観察深さｄ_Ｓを設定したときの補正環２８の回転位置を基準補正環位置ＣＡと称し、対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｓを基準対物レンズ位置ＬＡと称することがある。顕微鏡制御部３６１は、光源ユニット１６からレーザー光（励起光）射出させる。また、顕微鏡制御部３６１の主制御部６２は、検出部４１へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した検出部４１は、試料ＴＰからの光（蛍光）の検出信号を顕微鏡制御部３６１の画像生成部６３へ出力する。画像生成部６３は、検出部４１から入力された光の検出信号（前述の１画素分のデータ）をスキャナ２５による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、試料ＴＰの基準画像を生成する。画像生成部６３は、生成した試料ＴＰの基準画像データを記憶部６８へ出力する。

　ステップＳＴ３３２において、顕微鏡制御部３６１は、補正環２８を初期状態の回転位置へ回転移動させ、対物レンズ２６を初期状態の位置へｚ方向に移動させる。以降、初期状態の補正環２８の回転位置を初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０と称し、初期状態の対物レンズ２６の位置を初期状態の対物レンズ位置Ｌ_Ａ０と称することがある。その後、顕微鏡制御部３６１は、補正環２８の回転位置を初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０から所定の回転移動量ずつ変化させ、対物レンズ２６の位置を初期状態の対物レンズ位置Ｌ_Ａ０から所定の移動量ずつ変化させた、試料ＴＰの複数種類の評価用画像を取得する。なお、各種類の評価用画像を、１回取得してもよく、複数回取得してもよい。このとき、顕微鏡制御部３６１の主制御部６２は、補正環駆動部５５へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部５５は、補正環２８を初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０から所定の回転移動量ずつ回転移動させる。主制御部６２は、対物レンズ駆動部５６へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した対物レンズ駆動部５６は、対物レンズ２６を初期状態の対物レンズ位置Ｌ_Ａ０から所定の移動量ずつｚ方向に移動させる。それぞれの補正環２８の回転位置および対物レンズ２６の位置において、顕微鏡制御部３６１は、光源ユニット１６からレーザー光（励起光）射出させる。また、顕微鏡制御部３６１の主制御部６２は、検出部４１へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した検出部４１は、試料ＴＰからの光（蛍光）の検出信号を顕微鏡制御部３６１の画像生成部６３へ出力する。画像生成部６３は、検出部４１から入力された光の検出信号（前述の１画素分のデータ）をスキャナ２５による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、試料ＴＰの評価用画像を生成する。画像生成部６３は、生成した試料ＴＰの評価用画像データを評価値算出部６４へ出力する。

　ステップＳＴ３３３において、顕微鏡制御部３６１の評価値算出部６４は、記憶部６８に記憶された試料ＴＰの基準画像データと、ステップＳＴ３３２で生成した試料ＴＰの複数種類の評価用画像データとの相関値をそれぞれ求める。評価値算出部６４は、補正環２８の回転位置が同じで対物レンズ２６の位置が異なる試料ＴＰの評価用画像のうち、相関値が最大となる対物レンズ２６の位置での評価用画像を、補正環２８の各回転位置での評価用画像として選択する。評価値算出部６４は、補正環２８の各回転位置について、選択した試料ＴＰの評価用画像データに基づいて、評価値ｖを求める。評価値算出部６４は、求めた評価値ｖのデータおよび、このときの補正環２８の回転位置Ｃのデータを記憶部６８に記憶させて保持する。評価値ｖとして、第１実施形態と同様のものを用いることができる。

　図２４は、補正環２８の回転位置Ｃを変えて求まる評価値ｖの一例を示すグラフである。図２４に示すように、補正環２８の回転位置Ｃを変える規定回数を初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０から４回とした場合、まず、顕微鏡制御部３６１は、試料ＴＰの基準画像ＴＩ（ＣＡ）を取得する。これに加え、顕微鏡制御部３６１は、補正環２８を基準補正環位置ＣＡから所定の初期回転量だけ回転移動させた初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０において、対物レンズ２６の位置を初期状態の対物レンズ位置Ｌ_Ａ０および４つの位置Ｌ_Ａ１～Ｌ_Ａ４に変位させた試料ＴＰの評価用画像を取得する。評価値算出部６４は、これらの評価用画像のうち、図２４の左側から１番目の△印で示した、相関値が最大となる初期状態の対物レンズ位置Ｌ_Ａ０での評価用画像を、初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０での評価用画像ＴＩ（Ｃ_Ａ０）として選択する。

　顕微鏡制御部３６１は、補正環２８を初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０から第１の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ａ１において、対物レンズ２６の位置を初期状態の対物レンズ位置Ｌ_Ａ０および４つの位置Ｌ_Ａ１～Ｌ_Ａ４に変位させた試料ＴＰの評価用画像を取得する。評価値算出部６４は、これらの評価用画像のうち、図２４の左側から２番目の△印で示した、相関値が最大となる対物レンズ２６の位置Ｌ_Ａ１での評価用画像を、補正環２８の回転位置Ｃ_Ａ１での評価用画像ＴＩ（Ｃ_Ａ１）として選択する。顕微鏡制御部３６１は、補正環２８を初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０から第２の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ａ２において、対物レンズ２６の位置を初期状態の対物レンズ位置Ｌ_Ａ０および４つの位置Ｌ_Ａ１～Ｌ_Ａ４に変位させた試料ＴＰの評価用画像を取得する。評価値算出部６４は、これらの評価用画像のうち、図２４の左側から３番目の△印で示した、相関値が最大となる対物レンズ２６の位置Ｌ_Ａ２での評価用画像を、補正環２８の回転位置Ｃ_Ａ２での評価用画像ＴＩ（Ｃ_Ａ２）として選択する。

　顕微鏡制御部３６１は、補正環２８を初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０から第３の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ａ３において、対物レンズ２６の位置を初期状態の対物レンズ位置Ｌ_Ａ０および４つの位置Ｌ_Ａ１～Ｌ_Ａ４に変位させた試料ＴＰの評価用画像を取得する。評価値算出部６４は、これらの評価用画像のうち、図２４の左側から４番目の△印で示した、相関値が最大となる対物レンズ２６の位置Ｌ_Ａ３での評価用画像を、補正環２８の回転位置Ｃ_Ａ３での評価用画像ＴＩ（Ｃ_Ａ３）として選択する。顕微鏡制御部３６１は、補正環２８を初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０から第４の回転量だけ回転移動させた回転位置Ｃ_Ａ４において、対物レンズ２６の位置を初期状態の対物レンズ位置Ｌ_Ａ０および４つの位置Ｌ_Ａ１～Ｌ_Ａ４に変位させた試料ＴＰの評価用画像を取得する。評価値算出部６４は、これらの評価用画像のうち、図２４の左側から５番目の△印で示した、相関値が最大となる対物レンズ２６の位置Ｌ_Ａ４での評価用画像を、補正環２８の回転位置Ｃ_Ａ４での評価用画像ＴＩ（Ｃ_Ａ４）として選択する。評価値算出部６４は、選択した評価用画像データに基づいて、初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０および、初期状態の補正環位置Ｃ_Ａ０から１～４回だけ移動させた回転位置Ｃ_Ａ１～Ｃ_Ａ４での評価値ｖを求めることができる。

　ステップＳＴ３３４において、顕微鏡制御部３６１の補正環位置決定部６５は、記憶部６８に記憶された補正環２８の複数の回転位置での評価値ｖに基づいて、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓを求める。具体的には、補正環位置決定部６５は、補正環２８の複数の回転位置に対する評価値ｖのプロットを作成する。そして、補正環位置決定部６５は、図２４に示すように、このプロットに対して補間または関数近似を行うことで、評価値ｖが最大となる補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓを求める。補正環位置決定部６５は、求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓのデータを、主制御部６２へ出力する。補間を行う方法として、例えば、補正環２８の複数の回転位置Ｃ_Ａ０～Ｃ_Ａ４に対する評価値ｖのプロットに対しラグランジュ補間やスプライン補間をする方法がある。関数近似を行う方法として、例えば、最小二乗法により、補正環２８の複数の回転位置Ｃ_Ａ０～Ｃ_Ａ４に対する評価値ｖのプロットを二次曲線やガウス関数にフィッティングする方法がある。

　ステップＳＴ３３５において、顕微鏡制御部３６１の主制御部６２は、補正環駆動部５５へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した補正環駆動部５５は、補正環２８をステップＳＴ３３４で求めた最適補正環位置ＣＰ_Ｓへ回転移動させる。

　ステップＳＴ３３６において、顕微鏡制御部３６１は、補正環２８が最適補正環位置ＣＰ_Ｓに回転移動した状態で、対物レンズ２６の位置Ｌを変化させた、試料ＴＰの評価用ｚスタック画像を取得する。このとき、顕微鏡制御部３６１の主制御部６２は、対物レンズ駆動部５６へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した対物レンズ駆動部５６は、対物レンズ２６をｚ方向に移動させる。それぞれの対物レンズ２６の位置において、顕微鏡制御部３６１は、光源ユニット１６からレーザー光（励起光）射出させる。また、顕微鏡制御部３６１の主制御部６２は、検出部４１へ制御信号を送信し、この制御信号を受信した検出部４１は、試料ＴＰからの光（蛍光）の検出信号を顕微鏡制御部３６１の画像生成部６３へ出力する。画像生成部６３は、検出部４１から入力された光の検出信号（前述の１画素分のデータ）をスキャナ２５による２次元的な走査と同期して並べる処理を行うことで、試料ＴＰの評価用ｚスタック画像を生成する。画像生成部６３は、生成した試料ＴＰの評価用ｚスタック画像データをｚ位置算出部３６６へ出力する。

　ステップＳＴ３３７において、顕微鏡制御部３６１のｚ位置算出部３６６は、記憶部６８に記憶された試料ＴＰの基準画像データと、ステップＳＴ３３６で生成した試料ＴＰの評価用ｚスタック画像データとの相関値をそれぞれ求める。ｚ位置算出部３６６は、試料ＴＰの評価用ｚスタック画像のうち、相関値が最大となる画像が得られる対物レンズ２６の位置を、最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓとして求める。なお、ｚ位置算出部３６６は、対物レンズ２６の複数の位置に対する相関値のプロットを作成してもよい。そして、ｚ位置算出部３６６は、このプロットに対して補間または関数近似を行うことで、相関値が最大となる対物レンズ２６の位置を、最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓとして求めるようにしてもよい。

　ｚ位置算出部３６６は、求めた対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓのデータを、主制御部６２へ出力する。主制御部６２は、補正環位置決定部６５から入力された最適補正環位置ＣＰ_Ｓのデータおよび、ｚ位置算出部３６６から入力された最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓのデータを、記憶部６８に記憶させて保持する。そして、次の処理（図１８のステップＳＴ３４０）に移行する。以上の処理により、補正環２８を回転させると、対物レンズ２６の焦点位置ＰＦが変化する場合でも、ステップＳＴ３２０で設定した観察深さｄ_Ｓにおいて、結像状態が最良となる補正環２８の最適補正環位置ＣＰおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰを求めることができる。

　ステップＳＴ３４０において、試料ＴＰの屈折率、画像取得パラメータ、画像取得範囲の入力を行う。ステップＳＴ３４０では、第１実施形態におけるステップＳＴ１４０と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ３５０において、顕微鏡制御部３６１のリスト作成部６７は、記憶部６８に記憶された設定用データテーブルＤＢ３（図２０を参照）と、ステップＳＴ３４０で入力された屈折率ｎ_ＳＡに基づいて、屈折率ｎ_ＳＡに対応する、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を算出して求める。なお、屈折率ｎ_ＳＡと合致する屈折率の値が、設定用データテーブルＤＢ３にない場合、設定用データテーブルＤＢ３における屈折率ｎ_ＳＡの近傍の屈折率の値に対して補間を行うことで、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を求めるようにしてもよい。

　ステップＳＴ３６０において、顕微鏡制御部３６１のリスト作成部６７は、ステップＳＴ３２０で設定した対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｓと、ステップＳＴ３３０で求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓと、ステップＳＴ３４０で入力された画像取得範囲（試料ＴＰのｚスタック画像の取得枚数Ｎ、対物レンズ２６の上端位置Ｌ_ＴＰ、対物レンズ２６の下端位置Ｌ_ＢＭ）と、ステップＳＴ３５０で求めた、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’に基づいて、共焦点顕微鏡１０の設定に関するパラメータリストを作成する。第３実施形態に係るパラメータリストＬＳ３は、図２５に示すように、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際の、相対観察深さｄｒと、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰとの関係を示すリストである。リスト作成部６７は、パラメータリストＬＳ３を作成すると、作成したパラメータリストＬＳ３のデータを、主制御部６２へ出力する。

　パラメータリストＬＳ３を作成するには、まず、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際の、相対観察深さの下端深さｄｒ_ＢＭおよび相対観察深さの上端深さｄｒ_ＴＰを求める。相対観察深さの下端深さｄｒ_ＢＭは、下記の式（７）を用いて求められる。式（７）では、ステップＳＴ３４０で設定した対物レンズ２６の下端位置Ｌ_ＢＭを相対観察深さの下端深さｄｒ_ＢＭへ変換するため、対物レンズ２６の下端位置Ｌ_ＢＭから基準となる相対観察深さ（ｄｒ＝０）での対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓを引いた上で、補正環２８の回転位置が一定の場合のＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’で割る。Ｌ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を用いる理由は、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓおよび対物レンズ２６の下端位置Ｌ_ＢＭがそれぞれ、ステップＳＴ３３０およびステップＳＴ３４０において同じ最適補正環位置ＣＰ_Ｓで設定されたためである。

　相対観察深さの上端深さｄｒ_ＴＰは、上記の式（７）と同様に、下記の式（８）を用いて求められる。

　次に、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際に変化させる相対観察深さｄｒ_ｉを求める。ここで、ｉは、１～Ｎ（試料ＴＰのｚスタック画像の取得枚数Ｎ）までの整数である。相対観察深さｄｒ_ｉ（ｉ番目に取得される画像の相対観察深さ位置）は、下記の式（９）を用いて求められる。式（９）では、ｉ番目の相対観察深さを求めるため、相対観察深さの下端深さｄｒ_ＢＭに、ｚスタック画像の取得ステップ幅と画像取得インデックス（ｉ－１）とを掛けたものを加える。

　次に、各相対観察深さｄｒ_ｉに対応する補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_ｉを求める。補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉは、下記の式（１０）を用いて求められる。式（１０）を用いる理由は、相対観察深さｄｒ_ｉと、その深さでの補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉとの関係が、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰと、基準となる相対観察深さ（ｄｒ＝０）での補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓで決まるためである。

　対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_ｉは、下記の式（１１）を用いて求められる。式（１１）を用いる理由は、相対観察深さｄｒ_ｉと、その深さでの対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_ｉとの関係が、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰと、基準となる相対観察深さ（ｄｒ＝０）での対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓで決まるためである。

　そして、上記の式（７）～（１１）を用いて求めた、相対観察深さｄｒ_ｉと、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉと、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_ｉとの関係を示すリストを作成する。これにより、図２５に示すようなパラメータリストＬＳ３を作成することができる。

　ステップＳＴ３７０において、顕微鏡制御部３６１は、ステップＳＴ３６０で作成したパラメータリストＬＳ３に従って、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰとを変化させることにより、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する。

　ステップＳＴ３８０において、顕微鏡制御部３６１は、ステップＳＴ３７０で取得した試料ＴＰのｚスタック画像データを情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。入出力制御部９１は、顕微鏡制御部３６１から入力されたｚスタック画像データに基づいて、試料ＴＰの３次元的な画像を生成し、表示部９３に表示させる。以降、表示部９３に表示される試料ＴＰの３次元的な画像を、単に３次元画像Ｔ_３Ｄ１～Ｔ_３Ｄ３（図２６を参照）と称することがある。図２６に示すように、入出力制御部９１は、３種類の３次元画像Ｔ_３Ｄ１～Ｔ_３Ｄ３のうちいずれか一つに選択的に切り替えて、表示部９３に表示させることが可能である。

　第１の３次元画像Ｔ_３Ｄ１は、ｚ方向の座標軸を相対観察深さｄｒ_ｉに対応する座標軸とした試料ＴＰの３次元的な画像である。ユーザーが、図２６に示すＧＵＩ（画像選択画面）を利用して、表示ｚスケールとして「観察深さ」を選択する操作を入力部９２に対して行うと、入力部９２は、この操作に対応する入力データを、情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。そして、入出力制御部９１は、第１の３次元画像Ｔ_３Ｄ１を表示部９３に表示させる。

　第２の３次元画像Ｔ_３Ｄ２は、ｚ方向の座標軸を対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_ｉに対応する座標軸とした試料ＴＰの３次元的な画像である。ユーザーが、図２６に示すＧＵＩを利用して、表示ｚスケールとして「対物レンズの位置」を選択する操作を入力部９２に対して行うと、入力部９２は、この操作に対応する入力データを、情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。そして、入出力制御部９１は、第２の３次元画像Ｔ_３Ｄ２を表示部９３に表示させる。

　第３の３次元画像Ｔ_３Ｄ３は、ｚ方向の座標軸を対物レンズ２６の位置Ｌ’_ｉに対応する座標軸とした試料ＴＰの３次元的な画像である。ユーザーが、図２６に示すＧＵＩを利用して、表示ｚスケールとして「補正環固定時の対物レンズの位置」を選択する操作を入力部９２に対して行うと、入力部９２は、この操作に対応する入力データを、情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。そして、入出力制御部９１は、第３の３次元画像Ｔ_３Ｄ３を表示部９３に表示させる。対物レンズ２６の位置Ｌ’_ｉは、例えば、下記の式（１２）を用いて求められる。式（１２）では、相対観察深さｄｒ_ｉを、補正環２８の回転位置が一定の場合の対物レンズ２６の位置Ｌ’_ｉへ変換するため、補正環２８の回転位置が一定の場合のＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’と相対観察深さｄｒ_ｉとを掛けた上で、基準となる相対観察深さ（ｄｒ＝０）での対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓを加える。

　第３実施形態によれば、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する際、ｚ方向（対物レンズ２６の光軸方向）の位置が異なる試料ＴＰの断面の画像を取得する毎に、パラメータリストＬＳ３に従って、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、補正環２８の回転に伴う焦点位置ＰＦの変位を補正した、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰとを変化させることができる。そのため、ｚ方向（対物レンズ２６の光軸方向）の位置が異なる試料ＴＰの断面の画像を取得する毎に、最適な収差補正を行うことができる。

　また、リスト作成部６７は、補正環位置決定部６５等によって或る一つの観察深さｄ_Ｓで実験的に求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓと、入力部９２から入力された試料ＴＰの屈折率ｎ_ＳＡと、設定用データテーブルＤＢ３とに基づいて、パラメータリストＬＳ３を構成する、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉと、補正環２８の回転に伴う焦点位置ＰＦの変位を補正した、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰとを求める。これにより、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉや対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰの全てを実験的に求める必要がなく、パラメータリストＬＳ３を作成する手間を低減させることができる。

　なお例えば、実際に試料ＴＰのｚスタック画像を取得するときのカバーガラスＣＧの厚みは、設定用データテーブルＤＢ３を作成する際に光学シミュレーションで設定したカバーガラスＣＧの厚みと異なっている場合がある。第３実施形態では、光学シミュレーションを行うことにより作成した設定用データテーブルＤＢ３と、或る一つの観察深さｄ_Ｓで実験的に求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓとを用いることにより、他の観察深さ位置での補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉを算出するので、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_ｉを、光学シミュレーションだけを用いて算出する場合よりも精度よく算出することができる。

　上述の第３実施形態において、試料ＴＰのｚスタック画像を取得した後、異なる観察領域で同様の試料ＴＰのｚスタック画像を取得することが可能である。この場合、例えば、ステップＳＴ３１０～ＳＴ３３０の処理を省略し、ユーザーが観察領域を変える設定を行った後、ステップＳＴ３４０の処理から開始するようにしてもよい。また、第１実施形態の変形例で述べた画像取得方法と同様にして、試料ＴＰのｚスタック画像を取得した後、異なる観察領域で同様の試料ＴＰのｚスタック画像を取得することで、ｘｙ方向の位置が異なる複数の観察領域での試料ＴＰのｚスタック画像を並べるタイリングを行うことが可能である。

　上述の第３実施形態において、情報処理装置９０の入出力制御部９１は、３種類の３次元画像Ｔ_３Ｄ１～Ｔ_３Ｄ３のうちいずれか一つに選択的に切り替えて、表示部９３に表示させることが可能であるが、これに限られるものではない。例えば、入出力制御部９１は、第３の３次元画像Ｔ_３Ｄ３を用いずに、２種類の３次元画像Ｔ_３Ｄ１～Ｔ_３Ｄ２のうちいずれか一つに選択的に切り替えて、表示部９３に表示させるようにしてもよい。

　上述の第３実施形態に係る補正環位置決定処理において、顕微鏡制御部３６１の評価値算出部６４は、補正環２８の回転位置が同じで対物レンズ２６の位置が異なる試料ＴＰの評価用画像のうち、相関値が最大となる対物レンズ２６の位置での評価用画像を、補正環２８の各回転位置での評価用画像として選択する。そして、評価値算出部６４は、補正環２８の各回転位置について、選択した試料ＴＰの評価用画像データに基づいて、評価値ｖを求める。第２実施形態に係る補正環位置決定処理においても、上述の第３実施形態と同様にして、補正環２８の複数の回転位置での評価用画像を選択し、選択した評価用画像データに基づいて、評価値ｖを求めることが可能である。

［第４実施形態］
　第４実施形態について説明する。第４実施形態に係る顕微鏡装置は、第３実施形態に係る顕微鏡装置と同様の構成であり、上述の第１実施形態および第３実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。

　第４実施形態に係る画像取得方法について説明する。図２７は、第４実施形態に係る画像取得方法を示すフローチャートである。ステップＳＴ４０１において、設定用データテーブルＤＢ３を作成して記憶部６８に記憶させる。ステップＳＴ４０１では、第３実施形態におけるステップＳＴ３１０と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ４０２において、補正環２８の最適補正環位置ＣＰおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰを実験的に求める観察深さｄ_Ｓおよび観察領域ＲＯＩの位置を設定する。ステップＳＴ４０２では、第３実施形態におけるステップＳＴ３２０、すなわち、第１実施形態におけるステップＳＴ１２０と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ４０３において、顕微鏡制御部３６１は、ステップＳＴ４０２で設定した観察深さｄ_Ｓにおける、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓと、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓを求める。ステップＳＴ４０３では、第３実施形態におけるステップＳＴ３３０の場合と同様の補正環位置決定処理が行われる。

　ステップＳＴ４０４において、試料ＴＰの屈折率の探索範囲、画像取得パラメータ、画像取得範囲の入力を行う。画像取得パラメータおよび画像取得範囲については、第１実施形態におけるステップＳＴ１４０の場合と同様の入力操作が行われる。試料ＴＰの屈折率の探索範囲についても、図２８に示すように、ユーザーは、表示部９３に表示されるＧＵＩ（設定入力画面）を利用して、試料ＴＰの屈折率の探索範囲を入力する操作を入力部９２に対して行う。図２８では例えば、「試料屈折率探索範囲」として、最小値「１．３４」および最大値「１．４０」が直接入力されており、この場合、探索を行う屈折率の最小値は１．３４となり、探索を行う屈折率の最大値は１．４０となる。ユーザーが、試料ＴＰの屈折率の探索範囲を入力する操作や、画像取得パラメータを入力する操作、画像取得範囲を入力する操作を入力部９２に対して行うと、入力部９２は、これらの操作に対応する入力データを、情報処理装置９０の入出力制御部９１を介して共焦点顕微鏡１０の顕微鏡制御部３６１へ出力する。

　ステップＳＴ４０５において、顕微鏡制御部３６１の主制御部６２は、ステップＳＴ４０４で入力された試料ＴＰの屈折率の探索範囲の中から、探索を行う屈折率の値を設定する。探索を行う最初の屈折率の値を、探索範囲における最小の屈折率の値に設定し、探索を行う最後の屈折率の値を、探索範囲における最大の屈折率の値に設定してもよい。探索を行う最初の屈折率の値を、探索範囲における最大の屈折率の値に設定し、探索を行う最後の屈折率の値を、探索範囲における最小の屈折率の値に設定してもよい。

　ステップＳＴ４０６において、顕微鏡制御部３６１のリスト作成部６７は、第３実施形態と同様に、記憶部６８に記憶された設定用データテーブルＤＢ３と、ステップＳＴ４０５で設定した屈折率に基づいて、探索を行う屈折率に対応する、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を算出して求める。

　ステップＳＴ４０７において、顕微鏡制御部３６１のリスト作成部６７は、ステップＳＴ４０２で設定した対物レンズ２６の位置Ｌ_Ｓと、ステップＳＴ４０３で求めた補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓと、ステップＳＴ４０４で入力された画像取得範囲（試料ＴＰのｚスタック画像の取得枚数Ｎ、対物レンズ２６の上端位置Ｌ_ＴＰ、対物レンズ２６の下端位置Ｌ_ＢＭ）と、ステップＳＴ４０６で求めた、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’に基づいて、屈折率探索用のパラメータリストを作成する。屈折率探索用のパラメータリストは、第３実施形態と同様のパラメータリストである。リスト作成部６７は、屈折率探索用のパラメータリストを作成すると、作成した屈折率探索用のパラメータリストのデータを、主制御部６２へ出力する。

　ステップＳＴ４０８において、顕微鏡制御部３６１の主制御部６２は、ステップＳＴ４０７で求めた相対観察深さの下端深さｄｒ_ＢＭおよび相対観察深さの上端深さｄｒ_ＴＰのうち、ステップＳＴ４０２で設定した観察深さｄ_Ｓ（相対観察深さｄｒ＝０）から遠い方を、屈折率探索用の観察深さとして設定する。この理由は、屈折率探索用の観察深さが基準となる相対観察深さ（ｄｒ＝０）から遠いほど、異なる試料屈折率を設定して取得した試料ＴＰの画像間での差異が明確に表れるからである。例えば、実際の試料屈折率が１．３７であったとすると、観察深さｄと最適補正環位置ＣＰとの関係は、図２９の実線で示す直線のようになる。一方、試料屈折率を実際の試料屈折率である１．３７からずれた値に設定すると、観察深さｄと最適補正環位置ＣＰとの関係として、図２９の破線や一点鎖線で示す直線が設定される。相対観察深さの上端深さｄｒ_ＴＰが基準となる相対観察深さ（ｄｒ＝０）から最も遠いとき、実際の試料屈折率に対応する最適補正環位置と、実際の試料屈折率からずれた値に設定された試料屈折率に対応する最適補正環位置との差は、相対観察深さの上端深さｄｒ_ＴＰにおいて最大となる。そのため、設定屈折率を変えたときの画質の変化も相対観察深さの上端深さｄｒ_ＴＰにおいて最大となるので、ユーザーは、最も画質が良いと感じる試料ＴＰの画像をより正確に選択することができる。

　ステップＳＴ４０９において、顕微鏡制御部３６１は、ステップＳＴ４０７で作成した屈折率探索用のパラメータリストに従って、ステップＳＴ４０８で設定した屈折率探索用の観察深さにおける試料ＴＰの画像を取得する。

　ステップＳＴ４１０において、顕微鏡制御部３６１の主制御部６２は、ステップＳＴ４０５で設定される探索範囲内の全ての屈折率について、試料ＴＰの画像を取得したか否かを判定する。主制御部６２が、探索範囲内の全ての屈折率について試料ＴＰの画像を取得していないと判定した場合（ステップＳＴ４１０：Ｎｏ）、ステップＳＴ４０５へ戻る。そして、ステップＳＴ４０５からステップＳＴ４１０までの処理を繰り返す。以上の処理により、探索範囲内の複数の屈折率に対応する試料ＴＰの画像を取得することができる。

　ステップＳＴ４１０において、主制御部６２が、探索範囲内の全ての屈折率について試料ＴＰの画像を取得したと判定した場合（ステップＳＴ４１０：Ｙｅｓ）、ステップＳＴ４１１へ進む。ステップＳＴ４１１において、ステップＳＴ４０９で取得した、探索範囲内の複数の屈折率に対応する試料ＴＰの画像に基づいて、ｚスタック画像を取得する試料ＴＰの屈折率が選択入力される。このとき、顕微鏡制御部３６１は、ステップＳＴ４０９で取得した試料ＴＰの画像データを情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。入出力制御部９１は、顕微鏡制御部３６１から入力された画像データに基づいて、探索範囲内の複数の屈折率に対応する試料ＴＰの画像を生成し、表示部９３に表示させる。図３０に示すように、ユーザーは、表示部９３に表示された複数の屈折率に対応する試料ＴＰの画像を比較する。ユーザーは、最も画質が良いと感じる試料ＴＰの画像が得られる屈折率を、試料ＴＰの屈折率として選択する操作を入力部９２に対して行う。図３０では例えば、試料屈折率「１．３７」に対応する試料ＴＰの画像が選択入力されており、この場合、入力される試料ＴＰの屈折率ｎ_ＳＡは１．３７となる。ユーザーが屈折率を選択する操作を入力部９２に対して行うと、入力部９２は、この操作に対応する入力データを、入出力制御部９１を介して顕微鏡制御部３６１へ出力する。

　ステップＳＴ４１２において、顕微鏡制御部３６１のリスト作成部６７は、第３実施形態におけるステップＳＴ３５０と同様に、記憶部６８に記憶された設定用データテーブルＤＢ３と、ステップＳＴ４１１で入力された屈折率ｎ_ＳＡに基づいて、屈折率ｎ_ＳＡに対応する、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を算出して求める。

　ステップＳＴ４１３において、顕微鏡制御部３６１のリスト作成部６７は、共焦点顕微鏡１０の設定に関するパラメータリストＬＳ３を作成する。ステップＳＴ４１３では、第３実施形態におけるステップＳＴ３６０と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ４１４において、顕微鏡制御部３６１は、ステップＳＴ４１３で作成したパラメータリストＬＳ３に従って、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰとを変化させることにより、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する。

　ステップＳＴ４１５において、顕微鏡制御部３６１は、ステップＳＴ４１４で取得した試料ＴＰのｚスタック画像データを情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。入出力制御部９１は、顕微鏡制御部３６１から入力されたｚスタック画像データに基づいて、試料ＴＰの３次元的な画像を生成し、表示部９３に表示させる。ステップＳＴ４１５では、第３実施形態におけるステップＳＴ３８０と同様の処理が行われる。

　第４実施形態によれば、第３実施形態と同様の効果を得ることができる。また、第４実施形態によれば、試料ＴＰの屈折率が未知の場合であっても、複数の屈折率に対応する試料ＴＰの画像に基づいて、ｚスタック画像を取得する試料ＴＰの屈折率を選択して入力することができる。

　上述の第４実施形態において、試料ＴＰのｚスタック画像を取得した後、異なる観察領域で同様の試料ＴＰのｚスタック画像を取得することが可能である。この場合、例えば、ステップＳＴ４０１～ＳＴ４０３の処理を省略し、ユーザーが観察領域を変える設定を行った後、ステップＳＴ４０４の処理から開始するようにしてもよい。また、第１実施形態の変形例で述べた画像取得方法と同様にして、試料ＴＰのｚスタック画像を取得した後、異なる観察領域で同様の試料ＴＰのｚスタック画像を取得することで、ｘｙ方向の位置が異なる複数の観察領域での試料ＴＰのｚスタック画像を並べるタイリングを行うことが可能である。

　上述の第４実施形態では、屈折率の探索を行う処理を、第３実施形態に組み込んだ例について説明したが、これに限られるものではなく、第１実施形態や第２実施形態に組み込むことが可能である。

［第５実施形態］
　第５実施形態について説明する。第５実施形態に係る顕微鏡装置は、第３実施形態に係る顕微鏡装置と同様の構成であり、上述の第１実施形態および第３実施形態と同様の構成については、適宜、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図３１は、第５実施形態に係る顕微鏡制御部５６１と情報処理装置９０との間の電気的な接続を示すブロック図である。第５実施形態に係る顕微鏡制御部５６１は、第３実施形態に係る顕微鏡制御部３６１と同様に構成される。第５実施形態に係る顕微鏡制御部５６１は、第３実施形態に係る顕微鏡制御部３６１と比較して、屈折率決定部５６９をさらに有する。

　第５実施形態において、評価値算出部６４は、画像生成部６３から入力された屈折率探索用の試料ＴＰのｚスタック画像データに基づいて、屈折率探索用の評価値ｗを求めることが可能である。評価値算出部６４は、求めた評価値ｗのデータを記憶部６８へ出力する。

　屈折率決定部５６９は、記憶部６８に記憶された屈折率探索用の評価値ｗのデータに基づいて、試料ＴＰの屈折率を求める。屈折率決定部５６９は、求めた試料ＴＰの屈折率のデータを、主制御部６２を介して記憶部６８へ出力するとともに、情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。

　第５実施形態に係る画像取得方法について説明する。図３２は、第５実施形態に係る画像取得方法を示すフローチャートである。なお、顕微鏡制御部５６１は、例えばコンピュータシステムを含む。顕微鏡制御部５６１は、記憶部６８に記憶されている制御プログラムを読み出し、この制御プログラムに従って各種の処理を実行する。ステップＳＴ５０１において、設定用データテーブルＤＢ３を作成して記憶部６８に記憶させる。ステップＳＴ５０１では、第３実施形態におけるステップＳＴ３１０と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ５０２において、補正環２８の最適補正環位置ＣＰおよび対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰを実験的に求める観察深さｄ_Ｓおよび観察領域ＲＯＩの位置を設定する。ステップＳＴ５０２では、第３実施形態におけるステップＳＴ３２０、すなわち、第１実施形態におけるステップＳＴ１２０と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ５０３において、顕微鏡制御部５６１は、ステップＳＴ５０２で設定した観察深さｄ_Ｓにおける、補正環２８の最適補正環位置ＣＰ_Ｓと、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰ_Ｓを求める。ステップＳＴ５０３では、第３実施形態におけるステップＳＴ３３０の場合と同様の補正環位置決定処理が行われる。

　ステップＳＴ５０４において、試料ＴＰの屈折率の探索範囲、画像取得パラメータ、画像取得範囲の入力を行う。ステップＳＴ５０４では、第４実施形態におけるステップＳＴ４０４と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ５０５において、顕微鏡制御部５６１の主制御部６２は、ステップＳＴ５０４で入力された試料ＴＰの屈折率の探索範囲の中から、探索を行う屈折率の値を設定する。ステップＳＴ５０５では、第４実施形態におけるステップＳＴ４０５と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ５０６において、顕微鏡制御部５６１のリスト作成部６７は、探索を行う屈折率に対応する、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を算出して求める。ステップＳＴ５０６では、第４実施形態におけるステップＳＴ４０６と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ５０７において、顕微鏡制御部５６１のリスト作成部６７は、屈折率探索用のパラメータリストを作成する。ステップＳＴ５０７では、第４実施形態におけるステップＳＴ４０７と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ５０８において、顕微鏡制御部５６１は、ステップＳＴ５０７で作成した屈折率探索用のパラメータリストに従って、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰとを変化させることにより、屈折率探索用の試料ＴＰのｚスタック画像を取得する。

　ステップＳＴ５０９において、顕微鏡制御部５６１の評価値算出部６４は、ステップＳＴ５０８で取得した屈折率探索用の試料ＴＰのｚスタック画像データに基づいて、屈折率探索用の評価値ｗを求める。評価値算出部６４は、求めた評価値ｗのデータおよび、このときの屈折率のデータを記憶部６８に記憶させて保持する。屈折率探索用の評価値ｗとして、例えば、ｚスタック画像の全体、ｚスタック画像のｘｚ断面、ｚスタック画像のｙｚ断面における、画像のコントラストや、画像の信号強度（輝度）の積算値等を用いることができる。また、図３３の破線で示すように、ｚスタック画像の信号強度が最大となる断面における、画像のコントラストや、画像の信号強度（輝度）の積算値等を用いることができる。

　ステップＳＴ５１０において、顕微鏡制御部５６１の主制御部６２は、ステップＳＴ５０５で設定される探索範囲内の全ての屈折率について、試料ＴＰのｚスタック画像を取得したか否かを判定する。主制御部６２が、探索範囲内の全ての屈折率について試料ＴＰのｚスタック画像を取得していないと判定した場合（ステップＳＴ５１０：Ｎｏ）、ステップＳＴ５０５へ戻る。そして、ステップＳＴ５０５からステップＳＴ５１０までの処理を繰り返す。以上の処理により、探索範囲内の複数の屈折率に対応する試料ＴＰのｚスタック画像を取得することができる。

　図３３は、屈折率を変えて求まる評価値ｗの一例を示すグラフである。図３３に示すように、屈折率の探索範囲をｎ_Ａ１～ｎ_Ａ５に設定した場合、屈折率ｎ_Ａ１に対応する試料ＴＰのｚスタック画像ＴＩ（ｎ_Ａ１）、屈折率ｎ_Ａ２に対応する試料ＴＰのｚスタック画像ＴＩ（ｎ_Ａ２）、屈折率ｎ_Ａ３に対応する試料ＴＰのｚスタック画像ＴＩ（ｎ_Ａ３）、屈折率ｎ_Ａ４に対応する試料ＴＰのｚスタック画像ＴＩ（ｎ_Ａ４）、および屈折率ｎ_Ａ５に対応する試料ＴＰのｚスタック画像ＴＩ（ｎ_Ａ５）を取得することができる。そして、各屈折率ｎ_Ａ１～ｎ_Ａ５に対応する試料ＴＰのｚスタック画像ＴＩ（ｎ_Ａ１）～ＴＩ（ｎ_Ａ５）に基づいて、各屈折率ｎ_Ａ１～ｎ_Ａ５についての評価値ｗを求めることができる。

　ステップＳＴ５１０において、主制御部６２が、探索範囲内の全ての屈折率について試料ＴＰのｚスタック画像を取得したと判定した場合（ステップＳＴ５１０：Ｙｅｓ）、ステップＳＴ５１１へ進む。ステップＳＴ５１１において、顕微鏡制御部５６１の屈折率決定部５６９は、記憶部６８に記憶された複数の屈折率に対応する評価値ｗのデータに基づいて、試料ＴＰの屈折率ｎ_ＳＡを求める。具体的には、複数の屈折率に対応する評価値ｗのプロットを作成する。そして、このプロットに対して図３３に示すように補間または関数近似を行うことで、評価値ｗが最大となる屈折率ｎ_ＳＡを求める。補間を行う方法として、例えば、複数の屈折率ｎ_Ａ１～ｎ_Ａ５に対する評価値ｗのプロットに対しラグランジュ補間やスプライン補間をする方法がある。関数近似を行う方法として、例えば、最小二乗法により、複数の屈折率ｎ_Ａ１～ｎ_Ａ５に対する評価値ｗのプロットを二次曲線やガウス関数にフィッティングする方法がある。

　ステップＳＴ５１２において、顕微鏡制御部５６１の屈折率決定部５６９は、求めた試料ＴＰの屈折率ｎ_ＳＡのデータを、主制御部６２を介して記憶部６８へ出力するとともに、情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。入出力制御部９１は、顕微鏡制御部５６１（屈折率決定部５６９）から入力された試料ＴＰの屈折率ｎ_ＳＡを表示部９３に表示させる。

　ステップＳＴ５１３において、顕微鏡制御部５６１のリスト作成部６７は、第３実施形態におけるステップＳＴ３５０と同様に、記憶部６８に記憶された設定用データテーブルＤＢ３と、ステップＳＴ５１１で求めた屈折率ｎ_ＳＡに基づいて、屈折率ｎ_ＳＡに対応する、ＣＰ－ｄ変化比ｍ_ＣＰ、ＬＰ－ｄ変化比ｍ_ＬＰ、およびＬ’－ｄ変化比ｍ_Ｌ’を算出して求める。

　ステップＳＴ５１４において、顕微鏡制御部５６１のリスト作成部６７は、共焦点顕微鏡１０の設定に関するパラメータリストＬＳ３を作成する。ステップＳＴ５１４では、第３実施形態におけるステップＳＴ３６０と同様の処理が行われる。

　ステップＳＴ５１５において、顕微鏡制御部５６１は、ステップＳＴ５１４で作成したパラメータリストＬＳ３に従って、補正環２８の最適補正環位置ＣＰと、対物レンズ２６の最適対物レンズ位置ＬＰとを変化させることにより、試料ＴＰのｚスタック画像を取得する。

　ステップＳＴ５１６において、顕微鏡制御部３６１は、ステップＳＴ４１４で取得した試料ＴＰのｚスタック画像データを情報処理装置９０の入出力制御部９１へ出力する。入出力制御部９１は、顕微鏡制御部３６１から入力されたｚスタック画像データに基づいて、試料ＴＰの３次元的な画像を生成し、表示部９３に表示させる。ステップＳＴ５１６では、第３実施形態におけるステップＳＴ３８０と同様の処理が行われる。

　第５実施形態によれば、第３実施形態と同様の効果を得ることができる。また、第５実施形態によれば、試料ＴＰの屈折率が未知の場合であっても、ユーザーの操作によって入力部９２から入力される屈折率の探索範囲に基づいて、試料ＴＰの屈折率を求めることができる。

　上述の第５実施形態において、試料ＴＰのｚスタック画像を取得した後、異なる観察領域で同様の試料ＴＰのｚスタック画像を取得することが可能である。この場合、例えば、ステップＳＴ５０１～ＳＴ５０３の処理を省略し、ユーザーが観察領域を変える設定を行った後、ステップＳＴ５０４の処理から開始するようにしてもよい。また、第１実施形態の変形例で述べた画像取得方法と同様にして、試料ＴＰのｚスタック画像を取得した後、異なる観察領域で同様の試料ＴＰのｚスタック画像を取得することで、ｘｙ方向の位置が異なる複数の観察領域での試料ＴＰのｚスタック画像を並べるタイリングを行うことが可能である。

　上述の第５実施形態では、屈折率の探索を行う処理を、第３実施形態に組み込んだ例について説明したが、これに限られるものではなく、第１実施形態や第２実施形態に組み込むことが可能である。

　上述の各実施形態において、１種類の設定用データテーブルを作成しているが、これに限られるものではない。例えば、照明光の波長や温度、対物レンズごとに異なる複数種類の設定用データテーブルを作成し、照明光の波長や温度、対物レンズに応じて使い分けるようにしてもよい。

　上述の各実施形態において、試料ＴＰの屈折率に関するデータ、画像取得パラメータ、および画像取得範囲は、ユーザーの入力操作によって設定されるが、これに限られるものではない。例えば、これらのデータのうち少なくともいずれかは、記憶部６８等に記憶された、以前に試料ＴＰのｚスタック画像を取得したときのデータを参照して、自動的に設定されるようにしてもよい。

　上述の各実施形態において、補正環２８の回転に応じて、収差補正レンズ２７が対物レンズ２６の光軸ＡＸに沿って移動するように構成されている。例えば、カム構造を利用して、収差補正レンズ２７が対物レンズ２６の光軸ＡＸに沿って移動するように構成されてもよい。

　上述の各実施形態において、対物レンズ２６先端からカバーガラスＣＧまでの距離、カバーガラスＣＧの厚み、及び観察深さｄなどに起因する収差を補正する収差補正素子として、収差補正レンズ２７が用いられているが、これに限られるものではない。例えば、収差補正素子として、液体レンズ、デフォーマブルミラーおよび液晶素子等の他の位相変調素子が用いられてもよい。液体レンズは、照明光学系２１または検出光学系３１、または対物レンズ２６内部に配置され、レンズの形状を変化させることにより、収差を補正する。デフォーマブルミラーおよび液晶素子等の位相変調素子は、照明光学系２１または検出光学系３１に配置され、試料ＴＰに対する照明光（励起光）および、試料ＴＰからの検出光（蛍光）のうち、少なくとも一方の位相を変調することにより、収差を補正する。

　位相変調素子には、収差の補正量を変更もしくは調整することが可能な調整部が設けられる。例えば、液体レンズに設けられる調整部は、液体レンズに印加される電圧値を制御することで、レンズの形状を変化させる。これにより、液体レンズによる収差の補正量を変更もしくは調整することができる。デフォーマブルミラーに設けられる調整部は、デフォーマブルミラーに印加される電圧値を制御することで、ミラーの形状を変化させる。これにより、デフォーマブルミラーによる、収差の補正量を変更もしくは調整することができる。液晶素子に設けられる調整部は、液晶素子に印加される電圧値を制御することで、液晶の分布を変化させる。これにより、液晶素子による収差の補正量を変更もしくは調整することができる。

　上述の各実施形態において、入力部９２および表示部９３は、情報処理装置９０と別体に設けられた装置であるが、これに限られるものではない。例えば、入力部９２は、情報処理装置９０と一体的に設けられた装置（例えば、内蔵型のタッチパッド等）であってもよい。入力部９２は、表示部９３と一体的に設けられた装置（例えば、タッチパネル）であってもよい。表示部９３は、情報処理装置９０と一体的に設けられた装置であってもよい。

　上述の各実施形態において、顕微鏡装置１に共焦点顕微鏡１０が設けられているが、これに限られるのではない。例えば、顕微鏡装置に設けられる顕微鏡は、微分干渉顕微鏡、位相差顕微鏡、多光子励起顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、超解像顕微鏡、暗視野顕微鏡、熱レンズ顕微鏡等であってもよい。また、顕微鏡装置に設けられる顕微鏡は、倒立顕微鏡に限らず、正立顕微鏡であってもよい。

　　１　顕微鏡装置
　１０　共焦点顕微鏡
　１１　ステージ　　　　　　　　　　　　　１２　ステージ駆動部
　１６　光源ユニット
　２１　照明光学系
　２６　対物レンズ
　２７　収差補正レンズ　　　　　　　　　　２８　補正環
　３１　検出光学系
　４１　検出部
　５１　収差補正部
　５５　補正環駆動部　　　　　　　　　　　５６　対物レンズ駆動部
　６１　顕微鏡制御部
　６２　主制御部　　　　　　　　　　　　　６３　画像生成部
　６５　補正環位置決定部　　　　　　　　　６７　リスト作成部
　６８　記憶部
　９０　情報処理装置
３６１　顕微鏡制御部（第３実施形態）
５６１　顕微鏡制御部（第５実施形態）
　ＴＰ　試料
ＤＢ１，ＤＢ３　設定用データテーブル
ＬＳ１～ＬＳ３　パラメータリスト

Claims

　試料を照明する照明光学系と、
　前記試料からの光を検出する検出部と、
　対物レンズを有し、前記試料からの光を前記検出部に導く検出光学系と、
　前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方の収差を補正する収差補正部と、
　制御部とを備え、
　前記制御部は、
　前記対物レンズの光軸方向である前記試料の深さ方向の第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を、前記検出部で検出された光に基づいて算出し、
　前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第１の位置と異なる第２の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出する顕微鏡装置。
　前記制御部は、
　前記第１の位置における前記対物レンズの位置に関する情報を、前記検出部で検出された光に基づいて算出し、
　前記算出した前記第１の位置における前記対物レンズの位置に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第２の位置における前記対物レンズの位置に関する情報を算出する請求項１に記載の顕微鏡装置。
　前記制御部は、
　前記試料の屈折率毎に、前記試料の深さ方向の位置の変化量と前記収差補正部の補正量の変化量との比を示す情報を予めシミュレーションにより算出して記憶し、
　前記記憶した情報と、前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第２の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出する請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
　前記制御部は、
　前記試料の屈折率毎に、前記試料の深さ方向の位置の変化量と前記対物レンズの変化量との比を示す情報を予めシミュレーションにより算出して記憶し、
　前記第１の位置における前記対物レンズの位置に関する情報を、前記検出部で検出された光に基づいて算出し、
　前記記憶した情報と、前記算出した前記第１の位置における前記対物レンズの位置に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第２の位置における前記対物レンズの位置に関する情報を算出する請求項１～３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
　前記試料と前記対物レンズとを前記対物レンズの光軸に沿って相対移動させることが可能な駆動部を備え、
　前記制御部は、
　前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記試料の深さ方向の複数の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出し、
　前記算出した補正量に基づいて前記収差補正部を制御し、前記駆動部を制御して、前記試料の深さ方向の複数の位置で、前記検出部で検出された光に基づいて前記試料の画像を生成し、表示部に表示させる請求項１～４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
　前記制御部は、前記試料の深さ方向の複数の位置で生成した画像を用いて前記試料の３次元画像を生成し、前記表示部に表示させる請求項５に記載の顕微鏡装置。
　前記制御部は、前記試料の３次元画像を前記試料の深さ方向の位置に関連付けて前記表示部に表示させる請求項６に記載の顕微鏡装置。
　前記試料と前記対物レンズとを前記対物レンズの光軸に沿って相対移動させることが可能な駆動部を備え、
　前記制御部は、
　前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の第１の屈折率に関する情報とに基づいて、前記試料の第１の屈折率に関する情報に対応する前記試料の深さ方向の複数の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出し、
　前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の第２の屈折率に関する情報とに基づいて、前記試料の第２の屈折率に関する情報に対応する前記試料の深さ方向の複数の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出し、
　前記算出した前記試料の第１の屈折率に関する情報に対応する補正量に基づいて前記収差補正部を制御し、前記駆動部を制御して、前記試料の深さ方向の１以上の位置で前記検出部で検出された光に基づいて前記試料の画像を生成する処理を行い、
　前記算出した前記試料の第２の屈折率に関する情報に対応する補正量に基づいて前記収差補正部を制御し、前記駆動部を制御して、前記試料の深さ方向の１以上の位置で前記検出部で検出された光に基づいて前記試料の画像を生成する処理を行い、
　前記生成した複数の画像に基づいて前記試料の屈折率を算出する請求項１～４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
　前記収差補正部は、補正環を有する請求項１～８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
　前記収差補正部の補正量に関する情報は、前記補正環の最適位置に関する情報である請求項９に記載の顕微鏡装置。
　前記収差補正部は、位相変調素子を有する請求項１～８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
　前記位相変調素子は、液体レンズ、デフォーマブルミラー、および液晶素子の少なくとも１つを有する請求項１１に記載の顕微鏡装置。
　前記収差補正部の補正量に関する情報は、前記位相変調素子に印加される電圧値に関する情報である請求項１１または１２に記載の顕微鏡装置。
　試料を照明する照明光学系と、前記試料からの光を検出する検出部と、対物レンズを有し、前記試料からの光を前記検出部に導く検出光学系と、前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方の収差を補正する収差補正部と、制御部とを備える顕微鏡装置の制御方法であって、
　前記対物レンズの光軸方向である前記試料の深さ方向の第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を、前記検出部で検出された光に基づいて算出し、前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第１の位置と異なる第２の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出する顕微鏡装置の制御方法。
　試料を照明する照明光学系と、前記試料からの光を検出する検出部と、対物レンズを有し、前記試料からの光を前記検出部に導く検出光学系と、前記照明光学系および前記検出光学系の少なくとも一方の収差を補正する収差補正部と、制御部とを備える顕微鏡装置の制御プログラムであって、
　コンピュータに、前記対物レンズの光軸方向である前記試料の深さ方向の第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を、前記検出部で検出された光に基づいて算出し、前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第１の位置と異なる第２の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出する処理を実行させる顕微鏡装置の制御プログラム。
　試料からの光を検出する検出部と、
　対物レンズを有し、前記試料からの光を前記検出部に導く検出光学系と、
　前記検出光学系の収差を補正する収差補正部と、
　制御部とを備え、
　前記制御部は、
　前記対物レンズの光軸方向である前記試料の深さ方向の第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を、前記検出部で検出された光に基づいて算出し、
　前記算出した前記第１の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報と、前記試料の屈折率に関する情報とに基づいて、前記第１の位置と異なる第２の位置における前記収差補正部の補正量に関する情報を算出する顕微鏡装置。