WO2020222483A1 - 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군 치료용 약학 조성물 - Google Patents

분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군 치료용 약학 조성물 Download PDF

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나광민
한윤미
손준영
하종천
정경희
강영철
이은서
김미진
최용수
황정욱
이민지
김규석
정태녕
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Abstract

본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS) 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분인 미토콘드리아를 활성화된 대식세포와 단핵구에 처리할 경우, 전염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine)인 IL-1β, TNF-α 및 IL-6의 발현을 회복시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물을 패혈증을 유발한 개체에 투여하는 경우, 개체의 생존율을 현저하게 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 패혈증의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군 치료용 약학 조성물
본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS) 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
"전신성 염증 반응 증후군"은 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 상태를 말한다. 체온이 38℃ 이상으로 올라가는 발열 증상 혹은 36℃ 이하로 내려가는 저체온증, 호흡수가 분당 24회 이상으로 증가(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 혹은 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라고 정의한다. 전신성 염증 반응은 외상이나 화상에 의해 유발되기도 하며 감염에 의하여 유발되기도 한다.
패혈증은 미생물(바이러스 포함)에 감염되어 전신에 심각한 염증 반응이 나타내는 질환을 의미한다. 38℃ 이상의 발열 증상, 36℃ 이하의 저체온증, 분당 24회 이상의 호흡수(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈중 백혈구 수의 증가 및 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보인다. 패혈증은 사망률이 30%에 이르는 질환으로, 전세계적으로 매년 3,000 만명의 환자가 발생하고 있다.
패혈증의 치료는 신체검진, 혈액검사 및 영상검사를 통해 패혈증의 원인이 되는 신체의 감염 부위를 찾은 후 적절한 항감염제를 처방하고 있다. 또한, 패혈증의 치료에는 항감염제를 비롯한 체내의 다양한 항상성 유지를 위한 약물치료 및 각 장기 기능부전을 극복하기 위한 지지요법이 병행되고 있다. 하지만, 패혈증의 원인균을 알아내기 위해서는 환자의 혈액을 채취하여 균을 배양하는데 적어도 3일 내지 5일 정도의 시간이 소요되고, 패혈증 발병 후 짧은 시간 내에 사망할 수 있어 치료에 어려움을 겪고 있다. 그러나, 현재까지 패혈증의 근본적인 치료제가 없는 상황이다.
패혈증의 과염증반응을 억제하기 위해 다양한 항염증성 물질 및 면역조절제가 치료제로서 시도된 바 있다. 구체적으로, 코르티코스테로이드(corticosteroids), 항-내독소 항체(anti-endotoxin antibody), TNF 길항제, IL-1 수용체 길항제 등의 면역조절제를 이용하여 패혈증을 치료하고자 시도된 바 있으나, 아직까지는 패혈증의 예후를 호전시킬 만한 결과를 얻지는 못하였다.
항염증성 물질 및 면역조절제를 이용한 패혈증 치료가 어려운 이유는 i) 패혈증 환자의 면역체계에서 전염증 상태(pro-inflammatory state)와 항염증 상태(anti-inflammatory state)가 모두 나타나며, 이는 각각의 패혈증 환자의 면역체계 상태를 고려하여 항염증성 물질 또는 면역조절제를 처방해야 하며, ii) 감염 부위에 따라 감염의 진행 정도가 다르므로 감염 부위의 면역체계 상태가 다르고, iii) 그람음성균과 그람양성균에 의한 감염에 있어서 항염증성 물질 또는 면역조절제의 효과가 다르기 때문이다(The Journal of the Korean Medical Association, 49(7):634, 2006).
한편, 미토콘드리아는 세포 내 에너지 공급원인 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다.
패혈증을 치료하기 위한 연구가 진행된 바 있으나, 개발된 약물은 치료 효과가 미비하거나 부작용이 발생하여 안전하고 효과적인 패혈증 치료제에 대한 개발이 필요한 상황이다. 따라서, 본 발명은 패혈증을 치료하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 또는 SIRS 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물의 유효성분인 미토콘드리아를 활성화된 대식세포에 처리할 경우, 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)인 IL-1β, TNF-α 및 IL-6의 발현을 회복시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물을 패혈증을 인위적으로 유발시킨 개체에 투여하는 경우, 개체의 생존율을 현저하게 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 패혈증의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리한 마우스 유래 Raw 264.7 세포에 미토콘드리아를 농도별로 처리한 후 TNF-α 분비량을 확인한 도면이다.
도 2는 LPS를 처리한 마우스 유래 Raw 264.7 세포에 미토콘드리아를 농도별로 처리한 후 IL-6 분비량을 확인한 도면이다.
도 3은 LPS로 활성화된 인간 유래 THP-1 세포에서 여러 종류의 세포유래 미토콘드리아를 처리한 후 IL-6 mRNA 발현억제능을 관찰한 도면이다.
도 4는 LPS로 활성화된 인간 유래 THP-1 세포에서 여러 종류의 세포유래 미토콘드리아를 처리한 후 IL-6 단백질 발현억제능을 관찰한 도면이다.
도 5는 LPS로 활성화된 마우스 유래 RAW264.7 세포에서 여러 종류의 세포유래 미토콘드리아로 처리한 후 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현억제능을 관찰한 도면이다.
도 6은 LPS 유도 패혈증 마우스모델에서 인간 탯줄 유래 중간엽줄기세포 (UC-MSC)를 배양하여 추출한 미토콘드리아를 처리한 후 생존율증가를 확인한 것이다.
도 7은 CLP(Cecal Ligation and Puncture) 유도 패혈증 래트모델에 생리식염수, 항생제 단독, 미토콘드리아 단독 또는 미토콘드리아와 항생제를 병용 투여한 후, 14일 동안의 실험동물 생존곡선을 비교한 도면이다.
도 8은 패혈증 유발 직후 항생제를 처리한 CLP 유도 패혈증 래트모델에 생리식염수 또는 미토콘드리아와 항생제를 병용 투여한 후, 14일 동안의 실험동물 래트의 생존곡선을 비교한 도면이다.
도 9는 동결 보관된 흰쥐의 골격근 유래 근원 세포주인 L6세포 유래 미토콘드리아와 배양된 L6세포 유래 미토콘드리아의 ATP 활성을 비교한 도면이다.
도 10은 동결 보관된 흰쥐의 골격근 유래 근원 세포주인 L6세포 유래 미토콘드리아와 배양된 L6세포 유래 미토콘드리아의 막전위를 비교한 도면이다.
도 11은 1 ㎍/㎖ 농도의 미토콘드리아를 포함하는 용액 내 미토콘드리아 개수를 파티클 카운터(Multisizer 4e, Beckman Coulter)를 이용하여 측정한 도면이다.
도 12는 2.5 ㎍/㎖ 농도의 미토콘드리아를 포함하는 용액 내 미토콘드리아 개수를 파티클 카운터를 이용하여 측정한 도면이다.
도 13은 5 ㎍/㎖ 농도의 미토콘드리아를 포함하는 용액 내 미토콘드리아 개수를 파티클 카운터를 이용하여 측정한 도면이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 SIRS 치료제
본 발명의 일 측면은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS) 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전신성 염증 반응 증후군"은 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 상태를 말한다. 체온이 38℃ 이상으로 올라가는 발열 증상 혹은 36℃ 이하로 내려가는 저체온증, 호흡수가 분당 24회 이상으로 증가(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 혹은 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라고 정의한다. 전신성 염증 반응은 외상이나 화상에 의해 유발되기도 한다. 특히, 이러한 전신성 염증 반응 증후군이 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “패혈증”이란, 일반적으로 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 질환을 의미한다. 특히, 패혈증은 감염으로 인한 개체의 면역계 이상으로 개체에 심각한 장기 손상을 유발할 수 있다. 구체적으로, 패혈증의 병태생리에 관한 연구에 따르면, 패혈증은 미생물에 의한 감염 이후, 호중구, 대식세포, 단핵구와 같은 면역세포들이 활성화된다. 이러한 면역세포들이 활성화되면, IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α 등과 같은 염증성 사이토카인의 분비가 증가되며, 세포 속에 존재하는 NF-κB라는 전사인자가 활성화됨으로써 전신에 염증반응이 일어난다. 만일 제때 적절한 치료가 이루어지지 않는다면 쇼크상태를 일으키거나 사망하게 된다.
이때, 상기 패혈증은 미생물에 감염되어 유발될 수 있으며, 상기 미생물은 박테리아, 균류 또는 바이러스 일 수 있다. 이때, 패혈증을 유발할 수 있는 미생물에는 그람양성균에 속하는 스타필로코커스 속(Streptococcus species), 엔테로코커스 속(Enterococcus species)의 미생물일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 패혈증을 유발하는 미생물은 스타필로코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 일 수 있다. 또한, 그람음성균에 속하는 클렙시엘라 속(Klebsiella species), 슈도모나스 속(Pseudomonas species), 엔테로박터 속(Enterobacter species) 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 패혈증을 유발하는 미생물은 대장균(Escherichia coli), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 헤모필루스 인플루엔자(Hemophillus influenzae) 일 수 있다. 특히, 상기 패혈증은 미생물에 존재하는 지질다당류에 의해 유발될 수 있다.
또한, 상기 패혈증은 바이러스에 의해 감염되어 유발될 수 있으며, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 싸이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus), 배큘로바이러스(baculovirus), 리오바이러스(Reovirus), 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus), 점액종 바이러스(Myxoma virus), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 파보바이러스(Parvovirus), 코사키 바이러스(Coxsackie virus), 세네카바이러스(Senecavirus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus), 코로나 바이러스(Corona virus) 또는 폭스바이러스(Poxvirus) 중 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 바이러스는 야생형 또는 변이된 형태일 수 있다. 본 발명의 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 전신적 염증 반응을 효과적으로 조절할 수 있으며, 패혈증 뿐만 아니라 패혈증 쇼크에도 효과적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한,　"유효성분"은　단독으로 활성을 나타내거나 또는 그 자체로는 활성이 없는 보조제(담체)와 함께 활성을 나타내는 성분을 지칭한다.
이때, 상기 미토콘드리아는 단리된 미토콘드리아 일 수 있다. 상기 미토콘드리아는 진핵생물로부터 수득된 것일 수 있으며, 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미토콘드리아는 조직, 혈액, 또는 세포로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 혈소판, 체세포, 생식세포 또는 줄기세포로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 미토콘드리아일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 체외에서 배양된 것일 수 있다.
또한, 상기 미토콘드리아는 자가(autologous), 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic)으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 자가 미토콘드리아는 동일 개체의 조직 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 동종 미토콘드리아는 개체와 같은 종에 속하면서 대립유전자에 대해서는 다른 유전자형을 가지는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 이종 미토콘드리아는 개체와 다른 종에 속하는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 상기 미토콘드리아는 온전한 상태의 미토콘드리아를 이용할 수 있다. 뿐만 아니라, 파쇄된 형태의 미토콘드리아도 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 체세포는 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 또는 점막세포일 수 있다. 또한, 상기 생식세포는 감수분열과 체세포 분열을 하는 세포로서 정자 또는 난자일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.
상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 약학 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상청액을 제조하는 단계 및 상기 상청액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.
구체적으로, 상기 제1차 내지 제3차 원심분리는 0℃ 내지 10℃의 온도, 바람직하게는 3℃ 내지 8℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 1분 내지 50분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다.
아울러, 상기 제1차 원심분리는 100×g 내지 1,000×g, 또는 200×g 내지 700×g, 또는 300×g 내지 450×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 1×g 내지 2,000×g, 또는 25×g 내지 1,800×g, 또는 500×g 내지 1,600×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3차 원심분리는 100×g 내지 20,000×g, 또는 500×g 내지 18,000×g, 또는 800×g 내지 15,000×g의 속도로 수행될 수 있다.
상기 분리된 미토콘드리아의 막 단백질을 정량함으로써, 미토콘드리아를 정량할 수 있다. 구체적으로, 상기 분리된 미토콘드리아를 BCA(bicinchoninic acid assay) 분석법을 통해 정량할 수 있다. 이때, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 0.1 ㎍/㎖ 내지 1,000 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 내지 750 ㎍/㎖ 또는 25 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖ 농도로 사용하였다.
또한, 상기 분리된 미토콘드리아를 파티클 카운터(Multisizer 4e, Beckman Coulter)를 통해 개수를 측정할 수 있으며, James D. McCully가 저술한 논문(J Vis Exp. 2014; (91): 51682.)을 참고하면 미토콘드리아의 개수는 하기 표 1과 같을 수 있다.
분리한 미토콘드리아의 양 (㎍) 미토콘드리아 개수 농도 (㎍/㎖)
0.01 2.16×105 ± 0.01×106 0.1
1 2.16×107 ± 0.08×107 10
25 0.54×109 ± 0.02×109 250
50 1.08×109 ± 0.04×109 500
100 2.16×109 ± 0.08×109 1,000
본 발명의 실시예 12에서 나타난 바와 같이, 1 ㎍/㎖, 2.5 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖을 파티클 카운터를 이용해 미토콘드리아의 개수를 측정한 결과, 1.96×106±0.98×106, 5.97×106±0.19×106 및 1.01×107±0.32×107 개로 측정되었다. 상기 표 1과 비교하여 보면, 10 ㎍/㎖ 농도의 미토콘드리아 개수는 2.16×107±0.08×107 개이며, 5 ㎍/㎖ 농도의 미토콘드리아 개수의 2배수를 곱하면 2.02×107±0.64×107 개로 유사한 개수 범위를 갖는 것을 확인하였다. 이때, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 1×105 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 5×109 미토콘드리아 개수/㎖의 함량으로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 1×105 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 5×109 미토콘드리아 개수/㎖, 2×105 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 2×109 미토콘드리아 개수/㎖, 5×105 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 1×109 미토콘드리아 개수/㎖, 1×106 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 5×108 미토콘드리아 개수/㎖, 2×106 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 2×108 미토콘드리아 개수/㎖, 5×106 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 1×108 미토콘드리아 개수/㎖ 또는 1×107 미토콘드리아 개수/㎖ 내지 5×107 미토콘드리아 개수/㎖의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 범위의 농도 및 함량으로 미토콘드리아를 포함함으로써, 투여 시 미토콘드리아 용량 조절이 용이하고, 환자의 패혈증 또는 SIRS 병증 개선 정도가 보다 향상될 수 있다.
특히, 상기 약학 조성물에 포함되는 미토콘드리아의 치료 효과 용량은, 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 3×105 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5×1010 미토콘드리아 개수/㎏일 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아의 치료 효과 용량은, 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 3×105 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5×1010 미토콘드리아 개수/㎏, 6×105 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 6×109 미토콘드리아 개수/㎏, 1.5×106 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 3×109 미토콘드리아 개수/㎏, 3×106 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5×109 미토콘드리아 개수/㎏, 6×106 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 6×108 미토콘드리아 개수/㎏, 1.5×107 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 3×108 미토콘드리아 개수/㎏ 또는 3×107 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5×108 미토콘드리아 개수/㎏일 수 있다. 즉, 상기 미토콘드리아를 포함하는 약학 조성물을 패혈증이 발병된 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 용량으로 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다.
또한, 상기 약학 조성물은 1회 내지 10회, 3회 내지 8회 또는 5회 내지 6회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 5회 투여할 수 있다. 이때, 투여 간격은 1일 내지 7일 또는 2일 내지 5일 간격으로 할 수 있으며, 바람직하게는 3일 간격으로 투여할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 항생제를 추가적으로 더 포함할 수 있다. 상기 항생제는 도리페넴(doripenem), 세페핌(cefepime), 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 세프타지딤(ceftazidime), 세프타롤린 포사밀(ceftaroline fosamil), 세프트리악손(ceftriaxone), 이미페넴(imipenem), 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 세포탁심(cefotaxime), 메트로니다졸(metronidazole), 페니실린(penicillin) 또는 아미노글리코시드(aminoglycoside) 계열 항생제일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 약학 조성물은 항바이러스제를 추가적으로 더 포함할 수 있다. 상기 항바이러스제는 오셀타미비르, 자나미비르, 페라미비르, 아시클로버, 발라시클로비르, 팜시클로비르, 트리플루리딘, 라미부딘, 텔비부딘, 클레부딘, 엔테카비르, 아데포비어, 테노포비르 디소프록실, 테노포비르 알라페나미드, 베시포비르, 리바비린, 다사부비르, 소포스부비르, 다클라타스비르, 아수나프레비르, 지도부딘, 아바카비르, 에파비렌즈, 에트라비린, 네비라핀, 릴피비린, 아타자나비어, 다루나비르, 넬리파비르, 리토나비르, 인디나빌, 돌루테그라비르, 랄테그라빌, 엔푸버타이드, 마라비록 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은, 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 0.1 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏ 양의 항생제 또는 항바이러스제를 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 0.1 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 내지 190 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏ 내지 180 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 내지 170 ㎎/㎏ 20 ㎎/㎏ 내지 160 ㎎/㎏ 또는 40 ㎎/㎏ 내지 150 ㎎/㎏ 양의 항생제를 투여할 수 있다. 즉, 상기 약학 조성물이 패혈증이 발병된 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 함량으로 항생제 또는 항바이러스제가 투여되는 것이 약리학적 측면에서 가장 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 항생제를 150 ㎎/㎏ 양으로 투여하였다.
상기 약학 조성물은 패혈증 또는 SIRS이 의심되거나, 패혈증 또는 SIRS을 앓고 있는 인간 또는 다른 포유동물에 대하여 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 정맥, 근육 또는 피하 투여될 수 있는 주사제일 수 있고, 바람직하게는 주사용 제제일 수 있다.
상기 약학 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 염과 당류가 포함된 완충용액을 사용하여 pH, Redox, 삼투압몰농도(Osmolality)를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다. 상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수를 의미한다.
상기 약학 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 피로설파이트(pyrosulfite), 구연산(citric acid) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 탄산 또는 수산화칼륨일 수 있다.
미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 SIRS 치료용 키트
본 발명의 다른 측면은 미토콘드리아를 유효성분으로 하는 제1조성물 및 항생제 또는 항바이러스제를 유효성분으로 하는 제2조성물을 포함하는 패혈증 또는 SIRS 치료용 키트를 제공한다.
이때, 상기 미토콘드리아는 단리된 미토콘드리아일 수 있다. 상기 미토콘드리아, 항생제 및 항바이러스제는 상술한 바와 같다.
상기 제1조성물에 포함되는 미토콘드리아의 치료 효과 용량은, 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 3×105 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5×1010 미토콘드리아 개수/㎏일 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물 내 미토콘드리아의 치료 효과 용량은, 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 3×105 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5×1010 미토콘드리아 개수/㎏, 6×105 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 6×109 미토콘드리아 개수/㎏, 1.5×106 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 3×109 미토콘드리아 개수/㎏, 3×106 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5×109 미토콘드리아 개수/㎏, 6×106 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 6×108 미토콘드리아 개수/㎏, 1.5×107 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 3×108 미토콘드리아 개수/㎏ 또는 3×107 미토콘드리아 개수/㎏ 내지 1.5×108 미토콘드리아 개수/㎏일 수 있다. 즉, 상기 미토콘드리아를 포함하는 약학 조성물을 패혈증이 발병된 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 용량으로 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다.
또한, 상기 제1조성물은 1회 내지 10회, 3회 내지 8회 또는 5회 내지 6회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 5회 투여할 수 있다. 이때, 투여 간격은 1일 내지 7일 또는 2일 내지 5일 간격으로 할 수 있으며, 바람직하게는 3일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 제2조성물은, 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 0.1 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏ 양의 항생제 또는 항바이러스제를 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 제2조성물은 0.1 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 내지 190 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏ 내지 180 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 내지 170 ㎎/㎏ 20 ㎎/㎏ 내지 160 ㎎/㎏ 또는 40 ㎎/㎏ 내지 150 ㎎/㎏ 양의 항생제 또는 항바이러스제를 투여할 수 있다. 즉, 상기 제2조성물이 패혈증이 발병된 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 함량으로 항생제 또는 항바이러스제가 투여되는 것이 약리학적 측면에서 가장 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 항생제를 150 ㎎/㎏ 양으로 투여하였다.
상기 제1조성물 및 제2조성물은 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제1조성물 및 제2조성물은 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 제1조성물을 먼저 투여한 후 제2조성물을 투여할 수 있다. 나아가, 제2조성물을 먼저 투여한 후 제1조성물을 투여할 수 있다. 또한, 상기 제2조성물을 먼저 투여한 후 제1조성물을 투여하고 다시 제2조성물을 투여할 수 있다.
상기 제1조성물 및 제2조성물은 패혈증 또는 SIRS가 의심되거나, 패혈증 또는 SIRS를 앓고 있는 인간 또는 다른 포유동물에 대하여 투여될 수 있다. 또한, 상기 제1조성물 및 제2조성물은 정맥, 근육 또는 피하 투여될 수 있는 주사제일 수 있고, 바람직하게는 주사용 제제일 수 있다.
상기 제1조성물 및 제2조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 염과 당류가 포함된 완충용액을 사용하여 pH, Redox, 삼투압몰농도(Osmolality)를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "주사제"는 피부내 또는 피부 및 점막을 통하여 체내에 직접 적용하는 의약품의 용액, 현탁액, 유탁액 또는 쓸 때 용제에 녹이거나 현탁하여 쓰는 것으로 무균으로 한 제제를 의미한다. 구체적으로, 주사제, 분말주사제, 수액제, 동결건조주사제, 이식제, 지속성주사제, 복막투석제, 관류제 또는 투석제 등으로 활용될 수 있다. 구체적으로, 상기 주사제는 bolus, 점적, 피하주사, 또는 근육주사로 투여될 수 있다.
구체적으로, 상기 제1조성물 및 제2조성물은 주사용수를 포함할 수 있다. 상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수를 의미한다.
상기 제1조성물 및 제2조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 피로설파이트(pyrosulfite), 구연산 (citric acid) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 탄산 또는 수산화칼륨 일 수 있다.
미토콘드리아를 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 또는 SIRS 치료 방법
본 발명의 다른 측면은 전술한 약학 조성물을 개체의 투여하는 단계를 포함하는 패혈증 또는 SIRS 치료 방법을 제공한다. 여기서 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
이때, 상술한 바와 같이 항생제 또는 항바이러스제를 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 이때 사용한 미토콘드리아의 투여량, 항생제 또는 항바이러스제의 투여량은 상술한 바와 같다.
이때, 투여는 정맥 내(intra-venous), 근육 내(intra-muscular) 또는 피부 내(intra-dermal)에 투여되는 것일 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 약학 조성물은 패혈증 또는 SIRS를 앓고 있는 개체의 정맥에 정상적인 활성을 갖는 외래 미토콘드리아를 공급할 수 있어, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포의 활성을 증가시키거나 미토콘드리아 기능 이상 세포 재생에 유용하며, 패혈증 또는 SIRS의 치료에 이용될 수 있다.
패혈증 또는 SIRS 치료를 위한 미토콘드리아의 용도
본 발명의 다른 측면은 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS) 치료를 위한 미토콘드리아의 용도를 제공한다. 상술한 미토콘드리아, 패혈증 및 SIRS는 상술한 바와 같다.
이때, 상기 용도를 위해 항생제 또는 항바이러스제를 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 이때 사용한 미토콘드리아의 투여량, 항생제 또는 항바이러스제의 투여량은 상술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
I. 미토콘드리아를 포함한 조성물의 제조
제조예 1. 흰쥐의 골격근 유래 근원 세포에서 분리된 미토콘드리아를 포함하는 조성물의 제조
흰쥐의 골격근 유래 근원 세포주인 L6 세포(American Type Culture Collection, ATCC, CRL-1458)를 10% 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Gibco)을 함유하는 DMEM-High glucose(Dulbecco's modified eagle's medium-High glucose, Gibco) 배지에 접종하고 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline, Gibco)를 이용하여 2회 세척하였다. 그 후, 0.25% Trypsin-EDTA(TE)를 처리하여 세포를 수득하였다. 수득한 세포는 미토콘드리아를 추출하기 위하여, 혈구계산기를 이용하여 세포농도가 1×107 cells/㎖가 되도록 세포를 재현탁시켰다.
이후, 상기 세포를 4℃ 온도에서 10분 동안 350×g의 속도로 제1차 원심분리를 수행하였다. 이때 얻어진 펠렛을 회수하여 버퍼 용액에 재현탁시켜 균질화 시켰다. 상기 펠렛을 포함하는 조성물을 4℃ 온도에서 5분 동안 1,500×g의 속도로 제2차 원심분리시켜 상청액을 수득하였다. 이후, 상기 상청액을 4℃ 온도에서 10분 동안 20,000×g의 속도로 제3차 원심분리시켜 세포주로부터 미토콘드리아를 분리하였다. 분리한 미토콘드리아는 각각의 실험에 맞게 BCA(bicinchoninic acid assay) 분석법을 이용해 5 ㎍, 10 ㎍, 25 ㎍, 50 ㎍ 또는 100 ㎍ 등의 필요한 양을 용매와 혼합하여 사용하였다.
제조예 2. 인간 탯줄 유래 중간엽줄기세포에서 분리된 미토콘드리아를 포함하는 조성물의 제조
인간 탯줄 유래 중간엽줄기세포(UC-MSC)를 10% 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Gibco), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 암피실린을 함유하는 Alpha-MEM(Alpha-Minimum essential medium, Gibco) 배지에 접종하고 72시간 동안 배양하였다. 상기 세포의 배양이 종료된 후, DPBS를 이용하여 2회 세척하였다. 그 후, 0.25% Trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 획득하였다. 세포농도가 1Х107 cells/㎖가 되도록 세포를 재현탁 후 4℃에서 10분 동안 350 g의 속도로 제1차 원심분리를 수행하였다.
세척된 세포는 미토콘드리아 분리용액을 이용하여 재부유한 후 1ml 주사기를 이용하여 파쇄하였다. 이후 세포 파쇄액은 1,500xg로 5분간 4℃에서 원심분리하여 불순물을 제거하고 미토콘드리아가 포함되어 있는 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 20,000xg로 5분간 4℃에서 원심분리하여 침전된 미토콘드리아를 회수하였으며, 분리한 미토콘드리아는 트리스버퍼에 부유하여 BCA법으로 단백질 정량 후 실험에 이용하였다.
제조예 3. 인간 골수 유래 중간엽줄기세포에서 분리된 미토콘드리아를 포함하는 조성물의 제조
인간 골수 유래 중간엽줄기세포(BM-MSC)를 10% 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Gibco), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 암피실린을 함유하는 DMEM(Gibco) 배지에 접종하고 72시간 동안 배양하였다.
상기 세포의 배양이 종료된 후 제조예 2에서 기술한 방법과 같이 미토콘드리아를 회수 및 정량한 후 실험에 이용하였다.
제조예 4. 인간 섬유아세포에서 분리된 미토콘드리아를 포함하는 조성물의 제조
인간 섬유아세포(CCD-8LU, ATCC)를 10% 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Gibco), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 암피실린을 함유하는 DMEM(Gibco) 배지에 접종하고 72시간 동안 배양하였다.
상기 세포의 배양이 종료된 후 제조예 2에서 기술한 방법과 같이 미토콘드리아를 회수 및 정량한 후 실험에 이용하였다.
제조예 5. 인간 역분화줄기세포에서 분리된 미토콘드리아를 포함하는 조성물의 제조
인간 역분화 줄기세포(iPSC)는 10ug/ml의 vitronectin (stem cell 07180)으로 코팅한 세포배양용기에서 TeSRTM-E8TM(stem cell 05990) 배지에서 배양하여 사용하였다.
상기 세포의 배양이 종료된 후 제조예 2에서 기술한 방법과 같이 미토콘드리아를 회수 및 정량한 후 실험에 이용하였다.
제조예 6. 혈소판 미토콘드리아의 분리된 미토콘드리아를 포함하는 조성물의 제조
혈소판에서 미토콘드리아를 분리하기 위하여 돼지 전혈을 상온에서 3분간 500xg로 원심 분리한 후, 혈소판이 풍부한 혈장(PRP, Platelet-rich plasma)이 포함된 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액은 1,500xg로 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하여 혈소판이 함유된 침전물을 회수하였다. 농축된 혈소판 침전물은 PBS를 이용하여 재부유한 후 1,500xg로 5분간 원심분리하여 세척하였고, 세척된 혈소판은 미토콘드리아 분리용액을 이용하여 재부유한 후 1ml 주사기를 이용하여 파쇄하였다. 이후 혈소판 파쇄액은 1,500xg로 5분간 4℃에서 원심분리하여 불순물을 제거하고 미토콘드리아가 포함되어 있는 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 20,000xg로 5분간 4℃에서 원심분리하여 침전된 미토콘드리아를 회수하였으며, 분리한 미토콘드리아는 트리스버퍼에 부유하여 단백질 정량 후 실험에 이용하였다.
제조예 7. 흰쥐의 골격근 유래 근원 세포에서 분리된 미토콘드리아를 포함하는 조성물의 제조
흰쥐의 골격근 유래 근원 세포주인 L6 세포(American Type Culture Collection, ATCC, CRL-1458)를 10% 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Gibco)을 함유하는 DMEM-High glucose(Dulbecco's modified eagle's medium-High glucose, Gibco) 배지에 접종하고 72시간 동안 배양하였다.
상기 세포의 배양이 종료된 후 제조예 2에서 기술한 방법과 같이 미토콘드리아를 회수 및 정량한 후 실험에 이용하였다.
II. In vitro에서 미토콘드리아에 의한 항염증 효과 확인
실시예 1. 미토콘드리아 전달에 의한 대식세포의 전-염증인자 사이토카인 분비 억제 효능 확인
실시예 1과 동일한 방법으로, 마우스 유래 Raw 264.7 세포에 2 ㎍/㎖의 LPS를 처리하고 6시간 동안 염증반응을 유도하였다. 그 후, 제조예 2에서 추출한 미토콘드리아를 0.1 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍ 또는 5 ㎍으로 처리한 뒤, 24-웰-플레이트에 접종한 후 24시간 뒤 상등액을 수득하여, 1,500 rpm 조건에서 5분간 원심분리하고, 상등액만 새 튜브로 옮겼다.
대식세포의 전-염증인자(pro-inflammatory) 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 발현 양을 확인하기 위해 각각 TNF-α ELISA kit(Sigma, #RAB0477) 및 IL-6 ELISA kit(Sigma, #RAB0308)를 이용하여 분석하였다. 각 조건 별 상등액 샘플은 ELISA 분석 키트 내에 포함된 희석 용액을 이용하여 1/10의 비율로 희석하여 준비하였다. 준비된 샘플과 표준용액을 각각 항체가 미리 코팅되어 있는 96-웰-플레이트에 넣어주고, 4℃ 온도에서 하룻밤동안 반응시켰다.
그 후, 분석 키트 내에 포함된 세척용액을 이용하여 96-웰-플레이트를 세척하였다. 세척 후, 바이오틴(biotin)이 표지된 항체(detection antibody)를 각 웰에 처리한 후, 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, 세척 용액을 이용하여 세척한 뒤 스트렙타비딘(streptavidine) 용액을 각 웰에 주입한 뒤 45분 동안 상온에서 반응시켰다. 그 후, 세척 용액을 이용하여 세척한 뒤 기질 용액을 추가하고 30분 동안 빛이 차단된 상온 조건의 환경에서 반응시킨 후, 정지 용액을 각 웰에 첨가하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, LPS만 처리한 Raw 264.7 세포의 경우, TNF-α와 IL-6 분비량이 증가하였다. 반면, 미토콘드리아를 처리한 Raw 264.7 세포의 경우, 동일하게 LPS를 처리하였음에도 불구하고 TNF-α와 IL-6 분비량이 정상세포 이하의 수준으로 현저하게 감소하였다(도 1 및 도 2).
실시예 2. 인간 단핵세포(THP-1)에서 여러 종류의 세포유래 미토콘드리아에 의한 항염증 활성 비교
인간 유래 단핵세포인 THP-1 세포를 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지에서 배양하였다. 4x105 개/well의 세포를 24 well 플레이트에 접종을 하고 1% FBS를 포함하는 RPMI 배지에서 15 내지 16시간 동안 배양을 진행하였다.
2 μg/㎖의 농도로 salmonella 유래 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 6시간 동안 처리하여 THP-1 세포주에서 염증반응을 유도하였다. 지질다당류 처리 6시간 후에 제조예 2, 제조예 4, 제조예 5, 제조예 6의 각 세포로부터 얻은 미토콘드리아를 처리하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이 때, 음성 대조군은 지질다당류 및 미토콘드리아 미처리군이며, 양성 대조군은 2 μg/㎖ 농도의 지질다당류를 단독으로 처리한 군이며, 실험군으로는 2 μg/㎖ 농도의 지질다당류를 처리하고, 6시간 후에 탯줄유래 중간엽 줄기세포(UC-MSC), 인간 폐 유래 섬유아세포(CCD-8LU), 인간 역분화줄기세포(IPS) 그리고 돼지 혈소판(Platelet)에서 얻은 미토콘드리아를 각각 40 μg 씩 처리하였다. 반응 후 항염증활성 비교를 위해 세포는 정량적 실시간 중합연쇄반응법에 이용하였고, 배양액은 ELISA법에 이용하였다.
실시예 2.1. 정량적 실시간 중합연쇄반응을 이용한 항염증 활성비교
이 후 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충용액을 첨가하여 2회 세척하고 0.5 ml의 RNA 추출액(Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific)액을 직접 가하였다. 10분간 상온에서 방치한 후 0.1 ml의 클로로포름을 첨가하여 15초간 교반한 뒤 12,000xg로 10분간 원심분리 하였다. 분리된 상층액을 취하여 동일 부피의 이소프로필알콜을 첨가하고 12,000xg로 10분간 원심분리하였다. 그 후, 상등액을 제거한 후 75% 에탄올로 1회 세척을 하고 상온에서 건조하였다.
RNAase가 없는 정제 증류수 50 μl를 가하여 분광광도계를 이용하여 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다. cDNA를 합성하기 위해 정제된 총 RNA 2μg에 oligo dT와 결합 반응을 70℃에서 5분간 진행시킨 후 10X 역전사반응 완충용액, 10 mM dNTP, RNAse 저해제, 및 M-MLV 역전사효소(Enzynomics, Korea)를 가하여 cDNA 합성반응을 42℃에서 60분간 수행하였다. 반응 후 72℃에서 5분간 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 뒤 RNase H를 첨가하여 단일 가닥의 RNA를 제거하여 cDNA를 수득하였다.
전-염증인자들의 사이토카인 발현 변화 여부를 하기 표 2에 나타난 프라이머들을 이용하여 정량적 중합연쇄반응(quantitative RT-PCR)을 수행하였다. 이때 보정을 위한 유전자로서 18S로 정량화하여 발현의 차이를 보정하였다.
primer 염기서열
Human IL-6-S ccacacagacagccactcac (서열번호 1)
Human IL-6-AS tttcaccaggcaagtctcct (서열번호 2)
Human 18S-S ctcccacttggataactgtgg (서열번호 3)
Human 18S-AS gaccgggttggttttgatct (서열번호 4)
도 3의 결과에 나타난 바와 같이, 인간 단핵세포인 THP-1 세포에 지질다당류를 처리하였을 때 IL-6 유전자의 발현이 증가함을 알 수 있었다 또한, 지질다당류에 의해 유도되는 IL-6 유전자의 발현은 탯줄유래 중간엽 줄기세포, 인간 폐 유래 섬유아세포, 인간 역분화줄기세포 및 돼지 혈소판으로부터 얻어진 미토콘드리아를 처리하였을 때 유의한 수준으로 억제됨을 확인하였다. 이를 통하여, 다양한 세포로부터 수득된 미토콘드리아는 현저하게 우수한 항염증 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 3, * P < 0.05).
실시예 2.2. ELISA법을 이용한 항염증 활성비교
수득한 상등액으로 THP-1 세포의 전-염증인자(pro-inflammatory) 사이토카인인 IL-6의 발현 양을 확인하기 위해 Human IL-6(R&D Systems)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 다음과 같이 실험을 수행하였다.
100 ㎕ 코팅용액을 96-웰-플레이트에 넣어 상온에서 하룻밤동안 반응하고 3회 세척 후 시약희석액(reagent diluent)으로 상온에서 1시간 반응하고 3회 세척하였다. 10배 희석 상등액과 표준액은 상온에서 2시간 반응 후 3회 세척한 뒤 표지된 항체(detection antibody)를 각 웰에 처리한 후, 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 3회 세척한 뒤 스트렙트아비틴액(streptavidine-HRP)을 상온에서 20분간 반응시켰다. 그 후, 3회 세척한 뒤 발색용액(Substrate solution)을 암소 상온 조건에서 20분간 반응 후 반응정지액을 첨가하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 4의 결과에 나타난 바와 같이, 인간 단핵세포인 THP-1 세포에 지질다당류를 처리하였을 때 IL-6 단백질이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 지질다당류에 의해 유도되는 IL-6 단백질은 탯줄유래 중간엽 줄기세포, 인간 폐 유래 섬유아세포, 인간 역분화줄기세포 및 돼지 혈소판으로부터 얻어진 미토콘드리아를 처리하였을 때 유의한 수준으로 억제됨을 확인하였고, 이는 유전자 발현결과와 일치하였다. 이를 통하여, 다양한 세포로부터 얻어진 미토콘드리아는 현저하게 우수한 항염증 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 4, * P < 0.05).
실시예 3. RAW264.7 세포에서 여러 종류의 세포유래 미토콘드리아에 의한 정량적 실시간 중합연쇄반응을 이용한 항염증 활성 비교 : In vitro
제조예 2, 제조예 3, 제조예 4 및 제조예 7의 다양한 세포로부터 얻은 미토콘드리아들에 의한 항염증 활성을 비교 분석하기 위하여, 정량적 실시간 중합연쇄반응법을 이용한 세포 기반 분석 실험을 진행하였다.
마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 약 3x105 개/well의 세포를 6 well 플레이트에 접종을 하고 24시간 동안 배양을 한 후에 FBS가 제거된 DMEM 배지에서 약 24시간 동안 결핍 조건을 진행하였다.
24시간 후에, 1 μg/㎖의 농도로 salmonella 유래 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 6시간 동안 처리하여 대식 세포주에서 염증반응을 유도하였다. 지질다당류 처리 6시간 후에 PBS 완충 용액으로 2회 씻어준 뒤 각 세포로부터 얻은 미토콘드리아를 처리하고 18시간 동안 추가로 배양하였다. 이 때, 음성 대조군은 지질다당류 및 미토콘드리아 미처리군이며, 양성 대조군은 1 μg/㎖ 농도의 지질다당류를 단독으로 처리한 군이다. 또한, 실험군으로는 1 μg/㎖ 농도의 지질다당류를 처리하고, 6시간 후에 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC), 탯줄유래 중간엽 줄기세포(UC-MSC), 흰쥐의 골격근 유래 근원 세포주(L6 myoblast), 및 인간 폐 유래 섬유아세포(CCD-8LU)에서 얻은 미토콘드리아를 각각 30 μg 씩 처리하였다.
미토콘드리아 처리 18시간 후에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충 용액을 첨가하여 2회 세척하고, 0.5 ㎖의 RNA 추출액(Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific)액을 직접 첨가한 후, 10분 동안 상온에서 방치하였다. 그 후, 0.1 ㎖의 클로로포름을 첨가하여 15초 동안 교반한 다음, 약 12,000xg로 10분 동안 원심분리 하였다.
분리된 상층액을 수득하고, 동일 부피만큼의 아이소프로필알콜을 첨가한 후에 12,000xg로 10분 동안 원심분리 하였다. 그 후, 액체를 제거하고 75% 에탄올로 1회 세척을 한 후에 상온에서 건조하였다. 건조 후, RNAase-free 정제 증류수를 약 50 ㎕를 첨가하고, 분광 광도계를 이용하여 수득된 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다.
수득된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하기 위해, 정제된 총 RNA 2 ㎍에 oligo dT와 결합 반응을 70℃에서 5분 동안 진행한 후, 10X 역전사반응 완충 용액, 10 mM dNTP, RNAse 저해제 및 M-MLV 역전사효소(Enzynomics, Korea)를 첨가하여, cDNA 합성 반응을 42℃에서 60분 동안 수행하였다.
cDNA 합성 반응이 끝난 후에 72℃에서 5분 동안 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 다음, RNase H를 첨가하여 단일 가닥의 RNA를 제거하여 최종 cDNA를 수득하였다. 염증 반응의 특징 유전자인 TNF-α 유전자, IL-1β 유전자 및 IL-6 유전자의 발현 변화 여부를 정량적 실시간 중합연쇄반응을 통해 관찰하였다. GAPDH 유전자를 함께 정량화 하여 발현의 차이를 보정하였다. 정량적 실시간 중합연쇄반응에 사용된 유전자들의 염기 서열은 하기의 표 3에 기재된 바와 같다.
프라이머 서열
TNF-alpha-S 5'-TCTCATCAGTTCTATGGCCC-3' (서열번호 5)
TNF-alpha-AS 5'-GGGAGTAGACAAGGTACAAC-3' (서열번호 6)
IL-1beta-F 5'-AACCTGCTGGTGTGTGACGTTC-3' (서열번호 7)
IL-1beta-R 5'-CAGCACGAGGCTTTTTTGTTGT-3' (서열번호 8)
IL-6-AS 5'-CTAGGTTTGCCGAGTAGATCT-3' (서열번호 9)
IL-6-S 5'-CCAAACTGGATATAATCAGGAAAT -3' (서열번호 10)
GAPDH-S 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3' (서열번호 11)
GAPDH-AS 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3' (서열번호 12)
실험 결과에 나타난 바와 같이, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 지질다당류를 처리하였을 때 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 유전자의 발현이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 지질다당류에 의해 유도되는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 유전자의 발현은 골수유래 중간엽 줄기세포, 탯줄유래 중간엽 줄기세포, 흰쥐의 골격근 유래 근원 세포, 및 인간 폐 유래 섬유아세포 로부터 얻어진 미토콘드리아를 처리하였을 때 유의한 수준으로 억제됨을 확인하였다.이를 통하여, 본 발명에서 사용된 세포로부터 얻어진 미토콘드리아는 현저하게 우수한 항염증 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
III. In vivo 동물 실험에서 미토콘드리아에 의한 항염증 효과 확인
실시예 4. LPS 유도 패혈증 마우스모델에서 인간 탯줄 유래 중간엽줄기세포 (UC-MSC)로부터 분리한 미토콘드리아의 단회 정맥 내 투여 효능시험
LPS로 유발된 마우스 패혈증 모델을 이용하여 실시예 2에서 제조한 미토콘드리아에 의한 생존율증가 효과를 확인하였다. 실험동물은 9주령의 마우스(male Balb/c)를 사용하였으며, 체중을 측정한 뒤 군간 평균값이 균일하도록 분리하였다. 대조군(n=10)과 실험군(n=7)은 각 개체당 100 ul의 7.5 mg/kg LPS(Lipopolysaccharides from Escherichia coli 011:B4)를 복강(intraperitoneal)에 투여하였다.
LPS 투여 후 6시간 뒤에 대조군은 꼬리정맥(tail vein)에 완충용액을 100 ul씩 주사하였고, 실험군은 꼬리정맥에 탯줄 유래 중간엽줄기세포(UC-MSC)에서 분리한 미토콘드리아를 100 ul(10 ug/mouse)를 주사하였다. 각 개체군은 생존율을 비교함으로써 미토콘드리아의 효능을 확인하였으며, 생존율은 LPS 투여 후 시간 간격으로 측정하였다.
생존율을 측정한 결과 표에서 보는 바와 같이 LPS투여 후 대조군에서는 33시간째 모든 개체가 사망하는 것을 관찰하였다. 대조군에 비해 미토콘드리아를 주입한 시험군에서는 33시간 째에 71%의 높은 생존율을 보였으며, 33시간 이후부터 관찰종료 72시간 까지 57%의 생존율을 계속 유지하는 것을 확인하였다.
이를 통하여, 본 발명에서 사용된 인간탯줄 유래 중간엽줄기세포(UC-MSC)로부터 얻어진 미토콘드리아는 패혈증 마우스모델에서 정맥 내 단회 투여로 우수한 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 하기 표 4에서 LPS 유도 패혈증 마우스모델에서 UC-MSC 유래 미토콘드리아에 의한 생존율을 나타내었고 결과를 도 6에 정리하였다(도 6).
구분 생존율 % (생존 마우스 수/전체 마우스 수)
21 hr 24 hr 30 hr 33 hr 48 hr 51 hr 57 hr 72 hr
대조군(n=10) 50(5/10) 40(4/10) 20(2/10) 0(0/10) 0(0/10) 0(0/10) 0(0/10) 0(0/10)
실험군(n=7, UC-MSC 미토콘드리아) 100(7/7) 100(7/7) 71(5/7) 71(5/7) 57(4/7) 57(4/7) 57(4/7) 57(4/7)
실시예 5. LPS 유도 패혈증 마우스모델에서 혈소판 유래 미토콘드리아의 단회 정맥 내 투여 효능시험
LPS로 유발된 패혈증 마우스모델을 이용하여 제조예 6에서 제조한 미토콘드리아에 의한 생존율증가 효과를 확인하였다. 실험동물은 9주령의 마우스(male Balb/c)를 사용하였으며, 체중을 측정한 뒤 군간 평균값이 균일하도록 분리하였다. 대조군(n=10)과 실험군(n=7)은 각 개체당 100 ul의 7.5 mg/kg LPS(Lipopolysaccharides from Escherichia coli 011:B4)를 복강(intraperitoneal)에 투여하였다.
LPS 투여 후 6시간 뒤에 대조군은 꼬리정맥(tail vein)에 완충용액을 100 ul씩 주사하였고, 실험군은 꼬리정맥에 혈소판에서 분리한 미토콘드리아를 100 ul(10 ug/mouse)를 주사하였다. 각 개체군은 생존율을 비교함으로써 미토콘드리아의 효능을 확인하였으며, 생존율은 LPS 투여 후 72시간까지 일정시간 간격으로 측정하였다.
이를 통하여, 본 발명에서 사용된 혈소판으로부터 얻어진 미토콘드리아도 LPS로 유발된 패혈증 마우스모델에서 실시예 4와 같이 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 미토콘드리아 단독 및 미토콘드리아/항생제 병용투여에 따른 패혈증 치료 효과 비교 I
상기 제조예 1에서 분리한 미토콘드리아 단독 및 미토콘드리아/항생제 병용투여에 따른 패혈증 치료효과를 확인하기 위해, 300 g 내지 350 g 무게의 SD 래트를 가스 흡입 마취 후 동종 동물의 막창자(cecum)에서 짜낸 변을 5% 덱스트로오스 용액에 1:3 비율로 희석시킨 맹장 슬러리(cecal slurry)를 6 ㎖/㎏ 용량으로 실험동물에게 복강내 투여하여 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis)을 유발하였다. 패혈증 유발 직후 체액보충을 위해 실험동물 무게 당 30 ㎖/㎏ 용량으로 생리식염수를 피하주사 하였다.
패혈증 유발 후 1시간 및 7시간 경과 시점에 각각 0.5 ㎖의 생리식염수만을 투여한 그룹을 완전 위약 처리군으로 하였으며, 패혈증 유발 후 1시간 및 7시간 경과 시점에 각각 0.5 ㎖ 생리식염수에 부유된 미토콘드리아 50 ㎍을 꼬리 정맥을 통해 정맥주사를 통해 투여한 그룹을 미토콘드리아 단독 투여군으로 하였다. 또한, 패혈증 유발 후 1시간 및 7시간 경과 시점에 각각 항생제인 세프트리악손(ceftriaxone)을 150 ㎎/㎏ 용량으로 근육주사를 통해 투여한 그룹을 항생제 단독 투여군으로 하였다.
패혈증 유발 후 각각 0.5 ㎖ 생리식염수에 부유된 미토콘드리아 50 ㎍을 정맥주사를 통해 투여하고 150 ㎎/㎏ 용량의 세프트리악손을 근육주사를 통해 투여한 그룹을 병용투여군으로 설정하였다. 각 군(n=4)의 래트의 패혈증 유발일 이후 14일간 생존여부 관찰 후 관찰을 종료하였으며해당 시점을 기준으로 평균 생존기간을 분석하였다.
그 결과, 완전 위약 처리군의 평균 생존기간은 22.95 시간, 미토콘드리아 단독 투여군의 평균 생존기간은 22.99 시간, 항생제 단독 투여군의 평균 생존기간은 110.67 시간 및 미토콘드리아 및 항생제 병용투여군의 평균 생존기간은 290.10 시간으로 분석되었다. 특히, 항생제 단독 투여군과 비교했을 때, 병용투여군의 생존기간은 2배 이상 증가된 것을 확인하였다(도 7).
실시예 7. 미토콘드리아 및 항생제 병용투여에 따른 패혈증 치료 효과 비교 II
상기 제조예 1에서 분리한 미토콘드리아 투여에 따른 패혈증 치료효과를 확인하기 위해, 300 g 내지 350 g 무게의 SD 래트를 가스 흡입 마취 후 동종 동물의 막창자에서 짜낸 변을 5% 덱스트로오스 용액에 1:3 비율로 희석시킨 맹장 슬러리를 6 ㎖/㎏ 용량으로 실험동물에게 복강내 투여하여 다균성 패혈증을 유발하였다. 패혈증 유발 직후 항생제인 세프트리악손을 150 ㎎/㎏ 용량으로 근육주사 하였고, 체액보충을 위해 실험동물 무게 당 30 ㎖/㎏ 용량으로 생리식염수를 피하주사 하였다.
이후 1 시간 및 7 시간 경과 시점에 각각 0.5 ㎖의 생리식염수만을 투여한 그룹을 위약 및 항생제 처리군(n=18)으로 하였다. 또한, 1 시간 및 7 시간 경과 시점에 각각 0.5 ㎖ 생리식염수에 부유된 미토콘드리아 50 ㎍을 정맥주사를 통해 투여한 그룹을 미토콘드리아 및 항생제 병용투여군(n=17)으로 설정하였다. 각 군의 실험동물의 패혈증 유발일 이후 14일간 생존여부 관찰 후 관찰을 종료하였으며, 해당 시점을 기준으로 카플란마이어 생존 분석을 통해 평균 생존기간 추정값의 중위수를 분석하였다.
그 결과, 미토콘드리아 및 항생제 병용투여군의 생존기간 추정값의 중위수는 337.37 시간으로 분석되었으며, 위약 및 항생제 처리군의 생존기간 추정값의 중위수는 48.23 시간으로 분석되었다. 미토콘드리아 및 항생제 병용투여군과 위약 및 항생제 처리군의 로그순위 검정상 p값은 0.032로, 양 군간 유의한 생존기간 차이를 나타내는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 8. 패혈증동물모델에서 미토콘드리아/항생제 병용투여에 따른 치료효과 비교 III
상기 제조예 2에서 분리한 미토콘드리아와 항생제 병용투여에 따른 패혈증 치료효과를 확인하기 위해, 300 g 내지 350 g 무게의 SD 래트를 가스 흡입 마취 후 동종 동물의 막창자(cecum)에서 짜낸 변을 5% 덱스트로오스 용액에 1:3 비율로 희석시킨 맹장 슬러리(cecal slurry)를 6 ㎖/㎏ 용량으로 실험동물에게 복강내 투여하여 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis)을 유발한다. 패혈증 유발 직후 체액보충을 위해 실험동물 무게 당 30 ㎖/㎏ 용량으로 생리식염수를 피하주사 한다.
패혈증 유발 후 1 시간 및 6 시간 경과 시점에 각각 항생제인 프리페넴(이미페넴계열)을 25 ㎎/㎏ 용량으로 근육주사를 통해 투여한 그룹을 항생제 단독 투여군으로 한다. 또한, 패혈증 유발 후 1 시간 및 6 시간 경과 시점에 각각 0.5 ㎖의 미토콘드리아 50 ㎍을 정맥주사를 통해 투여하고 25 ㎎/㎏ 용량의 프리페넴을 근육주사를 통해 투여한 그룹을 병용투여군으로 설정한다.
각 군(n=6)의 래트의 패혈증 유발일 이후 14일간 생존여부 관찰 후 관찰을 종료하였으며 해당 시점을 기준으로 평균 생존기간을 분석한다. 그 결과, 실시예 5 및 실시예 6에서와 같이 미토콘드리아 및 항생제 병용투여군은 항생제 단독군에 비해 생존기간이 증가된 것을 확인할 수 있다.
실시예 9. 패혈증동물모델에서 미토콘드리아/항생제 병용투여에 따른 치료효과 비교 IV
상기 제조예 2에서 분리한 미토콘드리아와 항생제 병용투여에 따른 패혈증 치료효과를 확인하기 위해, 300 g 내지 350 g 무게의 SD 래트를 가스 흡입 마취 후 동종 동물의 막창자(cecum)에서 짜낸 변을 5% 덱스트로오스 용액에 1:3 비율로 희석시킨 맹장 슬러리(cecal slurry)를 6 ㎖/㎏ 용량으로 실험동물에게 복강내 투여하여 다균성 패혈증(polymicrobial sepsis)을 유발한다. 패혈증 유발 직후 체액보충을 위해 실험동물 무게 당 30 ㎖/㎏ 용량으로 생리식염수를 피하주사 한다.
패혈증 유발 후 1 시간 및 6 시간 경과 시점에 각각 항생제인 타박신을 25 ㎎/㎏ 용량으로 근육주사를 통해 투여한 그룹을 항생제 단독 투여군으로 한다. 패혈증 유발 후 1 시간 및 6 시간 경과 시점에 각각 0.5 ㎖의 미토콘드리아 50 ㎍을 정맥주사를 통해 투여하고 25 ㎎/㎏ 용량의 타박신을 근육주사를 통해 투여한 그룹을 병용투여군으로 설정한다. 각 군(n=6)의 래트의 패혈증 유발일 이후 14일간 생존여부 관찰 후 관찰을 종료하며, 해당 시점을 기준으로 평균 생존기간을 분석한다.
그 결과, 실시예 5 및 실시예 6에서와 같이 미토콘드리아 및 항생제 병용투여군은 항생제 단독군에 비해 생존기간이 증가된 것을 확인할 수 있다.
IV. 미토콘드리아를 포함한 조성물의 독성 및 물성 확인 확인
실시예 10. 독성실험
미토콘드리아 투여 시 독성이 나타나는지 확인하기 위해, 미토콘드리아를 ICR 마우스에 단회 정맥 투여한 후, 체중변화 및 부검을 통한 장기 변화 등을 확인하였다. 7 주령의 ICR 마우스 암수 각 12 마리를 하기 표 5과 같이 4개의 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다.
그룹 성별 개체 수 투여물질 투여경로 투여량 (㎍/개체) 투여량 (㎖/개체) 농도 (㎍/㎖)
G1 M/F 3/3 부형제 IV - 0.3 -
G2 M/F 3/3 미토콘드리아 IV 25 0.3 100
G3 M/F 3/3 미토콘드리아 IV 50 0.3 200
G4 M/F 3/3 미토콘드리아 IV 100 0.3 400
상기 표 5에 나타난 바와 같이 G1 그룹은 부형제를 투여하였다. G2 내지 G4 그룹은 각각 25 ㎍, 50 ㎍ 또는 100 ㎍의 미토콘드리아를 투여하였다. 이때, G4 그룹의 경우, 개략적인 치사량(ALD, approximate lethal dose)에 상회하는 양의 미토콘드리아를 투여하였다. 이때, 투여는 투여부위를 70% 알코올 솜으로 소독한 다음, 26 게이지 주사바늘이 장착된 주사기를 이용하여 미정맥을 통해 1 ㎖/분의 속도로 부형제 또는 미토콘드리아를 투여하였다. 먼저, 일반증상은 모든 마우스에 대하여 사육기간 동안 사망을 포함한 일반증상의 종류 및 정도를 1일 1회 이상 관찰하고, 개체별로 기록하였다. 단, 투여 당일에는 투여 후 1 시간 까지는 지속적으로 관찰하고, 그 후부터는 1 시간 간격으로 5 시간 동안 관찰하였다. 빈사동물 및 사망동물은 계획부검 동물에 준하여 처리하였다. 부형제 또는 미토콘드리아 투여 개시일을 1일로 설정하였다.
일반증상 관찰 결과, 전 시험기간 중 모든 군에서 사망동물은 관찰되지 않았고, 미토콘드리아 투여 후 1일째에 관찰된 이상증상은 이후 시험기간 동안 관찰되지 않았기에, 미토콘드리아에 의한 일시적인 변화로 사료된다. 또한, 모든 마우스 개체에 대하여 투여 전, 투여 후 2일, 4일, 8일 및 15일에 체중을 측정하였다. 측정결과를 하기 표 6에 나타내었다.
수컷 체중(g) 암컷 체중(g)
일 그룹 그룹
G1 G2 G3 G4 G1 G2 G3 G4
1 37.48±1.78 37.88±1.11 37.94±1.18 38.02±1.07 29.12±1.36 29.09±1.28 29.18±0.99 29.32±0.93
2 37.62±1.55 38.06±0.55 36.46±1.71 36.59±1.45 29.23±1.48 28.96±0.76 28.93±0.76 28.21±0.96
4 37.50±1.86 37.88±0.66 36.61±2.17 37.46±1.55 28.99±0.96 28.97±0.61 29.54±1.62 28.51±1.09
8 38.49±1.53 38.75±1.65 37.12±3.09 38.96±1.79 29.13±0.71 29.58±0.27 29.90±1.78 28.92±1.79
15 39.21±1.11 39.19±1.17 37.73±2.85 39.98±1.39 30.56±0.52 30.22±0.45 30.82±1.43 29.70±1.39
N 3 3 3 3 3 3 3 3
표 6에 나타난 바와 같이, G1 내지 G4 그룹에서 모두 유의미한 체중변화가 관찰되지 않았다. 또한, 15일에 모든 마우스 개체를 마취시킨 후 개복하여 육안적으로 모든 장기를 검사하였다. 그 결과, G1 내지 G4 그룹에서 모두 장기 변화가 관찰되지 않았다. 상기 결과로 미루어 보아, 본 시험조건하에서 미토콘드리아를 ICR 마우스에 단회 정맥투여하였을 때, 암수 모두 미토콘드리아 농도 100 μg/head 까지 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
실시예 11. 동결 보관된 L6 세포 유래 미토콘드리아와 배양된 L6 세포 유래 미토콘드리아의 특성 비교
흰쥐의 골격근 유래 근원 세포주인 L6 세포(American type culture collection, ATCC, CRL-1458)를 10% 우태혈청을 함유하는 DMEM-High glucose 배지에 접종하고 72 시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, DPBS를 이용하여 2회 세척하였다. 세척된 세포는 0.25% Trypsin-EDTA(TE)를 처리하여 세포를 수득하였다. 수득한 세포는 혈구계산기를 이용하여 세포를 1×107 cells/㎖가 되도록 세포를 재현탁시킨 뒤, 동결 튜브에 넣어 동결 보존 용기로 옮긴 후 -80℃ 온도에서 24 시간 동안 동결하여 액체질소 동결 보존 탱크에 보관하였다.
동결 보관된 L6세포의 미토콘드리아 분리는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 분리하였으며, 제조예 1에서 분리한 배양된 세포 유래 미토콘드리아와 ATP 활성 및 막전위 특성을 비교하였다. 미토콘드리아의 ATP 및 막전위 활성에 대한 정상적인 상태를 확인하기 위해, 산화적 인산화(Oxidative phosphorylation)를 인위적으로 억제하는 CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)를 처리하여 비교군으로 사용하였다.
그 결과, 동결 보존된 L6 세포 유래 미토콘드리아와 배양된 L6 세포 유래 미토콘드리아의 ATP 및 막전위 활성은 유사하였으며, 각 미토콘드리아에 CCCP를 처리할 경우, 동결 보존된 L6 세포 유래 미토콘드리아는 CCCP를 처리하지 않은 미토콘드리아의 ATP 활성 대비 약 65.6%, 막전위는 약 90% 감소하였다. 또한, CCCP를 처리한 배양된 L6 세포 유래 미토콘드리아의 ATP 활성은 약 48.1%, 막전위는 약 93% 감소하였다. 이에, CCCP 처리를 통해 분리된 미토콘드리아가 정상적인 ATP 및 막전위 활성을 나타내고 있음을 확인하였다(도 9 및 도 10).
실시예 12. 파티클 카운터를 이용한 미토콘드리아 개수 측정
제조예 2에서 분리한 인간 탯줄 유래 중간엽줄기세포(UC-MSC)로부터 분리한 미토콘드리아를 1 ㎍/㎖, 2.5 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖ 농도가 되도록 각각의 용액을 제조한 후, 파티클 카운터(Multisizer 4e, Beckman Coulter)를 통해 미토콘드리아의 개수를 측정하였다. 이때, 각 농도 별로 2회 측정하였으며, 측정 결과를 하기 표 7 및 도 11 내지 도 13에 나타내었다.
1 ㎍/㎖ 2.5 ㎍/㎖ 5 ㎍/㎖
미토콘드리아 개수/㎖ 1차 2차 1차 2차 1차 2차
2.66E±06 1.25E±06 6.11E±06 5.83E±06 1.24E±07 7.83E±06
평균 1.96×106 ± 0.98×106 5.97×106 ± 0.19×106 1.01×107 ± 0.32×107

Claims (14)

  1. 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS) 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 세포로부터 분리된 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 세포는 체세포, 생식세포, 줄기세포, 혈액세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 세포는 배양세포 또는 배양 후 보관된 세포인 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 혈소판으로부터 분리된 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 줄기세포가 중간엽줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 중간엽줄기세포가 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 활액, 정소, 골막 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물
  8. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물 내 미토콘드리아는 0.1 ㎍/㎖ 내지 1,000 ㎍/㎖ 농도로 포함되는 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물
  9. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물에 대하여, 상기 미토콘드리아는 1×105 내지 5×109 미토콘드리아 개수/㎖의 함량으로 포함되는 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물
  10. 제1항에 있어서,
    항생제 또는 항바이러스제를 추가적으로 더 포함하는 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항생제는 도리페넴(doripenem), 세페핌(cefepime), 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 세프타지딤(ceftazidime), 세프타롤린 포사밀(ceftaroline fosamil), 세프트리악손(ceftriaxone), 이미페넴(imipenem), 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 세포탁심(cefotaxime), 세프타지딤(ceftazidime), 메트로니다졸(metronidazole), 페니실린(penicillin) 및 아미노글리코시드(aminoglycoside) 계열 항생제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 항바이러스제는 오셀타미비르, 자나미비르, 페라미비르, 아시클로버, 발라시클로비르, 팜시클로비르, 트리플루리딘, 라미부딘, 텔비부딘, 클레부딘, 엔테카비르, 아데포비어, 테노포비르 디소프록실, 테노포비르 알라페나미드, 베시포비르, 리바비린, 다사부비르, 소포스부비르, 다클라타스비르, 아수나프레비르, 지도부딘, 아바카비르, 에파비렌즈, 에트라비린, 네비라핀, 릴피비린, 아타자나비어, 다루나비르, 넬리파비르, 리토나비르, 인디나빌, 돌루테그라비르, 랄테그라빌, 엔푸버타이드, 마라비록 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나인 것인, 패혈증 또는 SIRS 치료용 약학 조성물.
  13. 미토콘드리아를 유효성분으로 하는 제1조성물 및 항생제 또는 항바이러스를 유효성분으로 하는 제2조성물을 포함하는 패혈증 또는 SIRS 치료용 키트.
  14. 패혈증 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS) 치료를 위한 미토콘드리아의 용도.
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