WO2020216978A1 - Biofertilizante líquido que comprende cepas de azospirillum brasilense y pantoea dispersa y método de obtención del mismo - Google Patents

Biofertilizante líquido que comprende cepas de azospirillum brasilense y pantoea dispersa y método de obtención del mismo Download PDF

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WO2020216978A1
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biofertilizer
liquid
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zns0
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PCT/ES2020/070259
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Jorge MALO LÓPEZ-ROMÁN
Carmen María MENGUAL SOTO-NAVARRO
Juan José GARCÍA CARPENA
Arturo Jesús CARRILLO GÓMEZ
Alberto BOTELLA CAYUELAS
Isidro BLANCA PICÓ
José Manuel CASANOVA BELMONTE
Guillermo VÁZQUEZ FERNÁNDEZ
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Probelte S.A.U.
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    • C05F5/00—Fertilisers from distillery wastes, molasses, vinasses, sugar plant or similar wastes or residues, e.g. from waste originating from industrial processing of raw material of agricultural origin or derived products thereof
    • C05F5/006—Waste from chemical processing of material, e.g. diestillation, roasting, cooking
    • C05F5/008—Waste from biochemical processing of material, e.g. fermentation, breweries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
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    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/20—Fertilizers of biological origin, e.g. guano or fertilizers made from animal corpses

Definitions

  • the present invention refers to a product for biological fertilization consisting of a liquid formulation containing two strains of bacteria of the genera Azospir ⁇ llum and Pantoea, with the ability to fix atmospheric nitrogen, solubilize phosphates as well as other mineral nutrients in the soil and produce high amounts of substances that stimulate plant growth.
  • Said microorganisms have been formulated in liquid form, which guarantees easy application and high stability in cell viability and provides sufficient organic and mineral nutrients to facilitate the colonization of plant roots.
  • fertilizers are essential for maintaining high yields in crops.
  • chemical fertilization significant amounts of nitrogen, phosphorus and potassium are added to the soil, as well as other mineral elements, however, their availability is very low, since a fraction remains immobilized in the soil, forming insoluble compounds that cannot be assimilated by the plants and another is washed through a leaching process, which in addition to economic losses, generates a significant environmental pollution problem.
  • a group of microorganisms that is of notable importance in this phenomenon is that which participates in the solubilization of phosphorus from sources that would otherwise be inaccessible to plants.
  • Phosphate solubilizing microorganisms have been isolated in practically all the soils tested, although the number and proportion of these varies according to the type of soil, the climate and other factors such as the historical evolution of the soil. Many microorganisms are capable of assimilating insoluble phosphorus from the soil, releasing a part of it in the form of soluble phosphates that in turn can be used by plants, thus contributing to plant nutrition. In general it is accepted that the solubilization of phosphates in the soil is due to the production of chelating organic acids and oxo acids, from sugars (Seshachala and Tallapragada, 2012). Procedures have been described in which phosphate-solubilizing microorganisms have been used in fertilization (Yu et al., 201 1).
  • the methods used in the isolation of phosphate solubilizing microorganisms are based fundamentally on the use of insoluble inorganic phosphorus salts, such as hydroxyapatite and tricalcium phosphate, in agarized culture media.
  • insoluble inorganic phosphorus salts such as hydroxyapatite and tricalcium phosphate
  • the microorganism produces organic acids that, when diffused in the medium, cause a decrease in pH and consequently the formation of a halo of transparency in the vicinity of the colony.
  • gluconic acid is the main component of organic acids produced by Enterobacter asburiae and that the enzyme glucose dehydrogenase, responsible for the production of gluconic acid, is regulated by phosphate starvation, that is, low concentrations of soluble phosphates stimulate the production of acids in this type of microorganism (Gyaneshwar et al., 1999).
  • Pantoea dispersa is a species with genes that encode the enzyme for the detoxification of albicidin. Said genes and enzyme have been used to obtain transgenic plants resistant to fungal diseases, which demonstrates their ability to protect against fungal plant diseases.
  • point to Pantoea dispersa as a solubilizing species of phosphates (Fernández et al., 2008).
  • microorganisms in the rhizosphere.
  • Numerous microorganisms have been used for this function, among which are bacteria of genera such as Rhizobium, Azotobacter and Azospirillum and fungi of the genera Saccharomyces, Hansenula and Aspergillus, among others.
  • Nitrogen is an abundant element, which makes up almost 80% of the earth's atmosphere and a very scarce nutritional part.
  • atmospheric nitrogen is inert and cannot be used by most organisms, and can only be incorporated into biological synthesis when it has been "fixed” or combined with certain elements such as hydrogen or oxygen.
  • Bacteria are capable of fixing 1.5 x 10 8 metric tons per year, a significant part of which is synthesized using the Haber-Bosch process.
  • the main element involved in the Azospirillum-p ⁇ aa ⁇ a relationship is not only nitrogen, but also phosphorus and potassium play a fundamental role in this relationship.
  • phosphorus and potassium play a fundamental role in this relationship.
  • the bacterium acts with a pattern of cumulative or sequential effects, as a result of mechanisms that occur simultaneously or consecutively (Bashan and De-Bashan 2010).
  • biofertilizer The physical form of a biofertilizer is a determining factor in the practical result that said biofertilizer provides.
  • the viability of the organisms present in a biofertilizer during production, formulation, storage, transport / distribution and application in the field is directly related to the growth potential of the plants. This limits its use due to compatibility, stability and survival problems in different soil conditions. Therefore, an improved shelf life could be the key to a greater generalization of the application of biofertilizers (Brar et al., 2012).
  • the microorganisms In a biological fertilizer, the microorganisms must remain viable, dormant or metabolically active. This factor has two determining aspects, the durability of the product and its ability to colonize the roots of the crops to be stimulated or protected, once applied in the field.
  • the use of cell-free preparations is a common practice in agricultural biotechnology and is very effective when working with microorganisms capable of forming resistance structures, as in the case of bacteria of the Bacillus genus.
  • This problem has another character when it comes to cells that do not have the capacity to form resistance structures, since the crops lose viability over time and also their survival capacity in the soil is very low. Many of the failures that have occurred in the field of Biofertilization and bioprotection are related to this phenomenon.
  • a carrier or a mixture of such carrier materials is selected based on the viability of the microorganisms mixed with them. Similarly, its enrichment with nutrients is the other strategy to improve shelf life by allowing the microorganism to maintain and grow in a non-competitive microenvironment (Yardin et al., 2000).
  • Document ES2234417A1 describes a biological fertilizer comprising bacterial strains of Azospir ⁇ llum brasilense and Pantoea dispersa immobilized on a solid support. Specifically, said document describes the Azospir ⁇ llum brasilense CECT 5802 strain and the Pantoea dispersa strain CECT 5801.
  • Document WO2009027544A1 describes a biological fertilizer that comprises a solid support on which the bacterial strains Azospir ⁇ llum brasilense CECT 5802 and Pantoea dispersa CECT 5801 and, additionally, indole-3-acetic acid or an indole-3-acetic acid promoter have been immobilized. .
  • the change from a biofertilizer that comprises microorganisms immobilized on a solid support to a biofertilizer in liquid form is associated with a significant reduction in the viability of said microorganisms and a decrease in the period in which the product remains viable while maintaining efficacy.
  • the shelf life of a liquid biofertilizer is a major concern (Brar et al., 2012).
  • liquid biofertilizers have advantages over biofertilizers in which the microorganisms contained in them are immobilized on a solid support, such as improvements in the mode of application, being able to apply by irrigation by dripping, spraying or by aerial means. It is not possible to apply biofertilizers immobilized on a solid support by drip irrigation or by liquid spraying.
  • liquid biofertilizers allow their application to other parts of the plants other than the roots, as they can be sprayed on the aerial parts of the plants (stems, leaves, fruits, flowers, etc.).
  • liquid formulations allow to include a sufficient amount of nutrients, cell protectants and inducers of cell formation to guarantee a long shelf life.
  • Tomato concentrates have been used in the production of gibberellins, as a nitrogen source and as a carbon source for growth and the production of metabolites of microbial origin due to their high content of organic carbon.
  • collagen hydrolyzate for use in agriculture is a very suitable and cheap source of organic nitrogen, even for microorganisms incapable of producing proteolytic enzymes.
  • the combination of these two sources offers a universal culture medium, very low cost and therefore very attractive for carrying out large-scale fermentation processes.
  • its natural origin allows a more ecological agriculture that today's society demands.
  • the object of the invention is a product for biological fertilization consisting of a liquid formulation containing two strains of bacteria of the genera Azospir ⁇ llum and Pantoea, with the ability to fix atmospheric nitrogen, solubilize phosphates as well as other mineral nutrients from the soil and produce high amounts of substances that stimulate plant growth. These microorganisms have been formulated in liquid form, which guarantees easy application and high stability in cell viability and provides sufficient organic and mineral nutrients to facilitate the colonization of plant roots.
  • Another object of the invention is a method of stimulating the growth of a plant, which comprises applying the liquid biofertilizer of the invention to said plant, a method of obtaining the liquid biofertilizer of the invention and a liquid biofertilizer obtainable according to said method of obtaining.
  • the present invention refers to a liquid biofertilizer that comprises a strain of Azospir ⁇ llum brasilense deposited in the Spanish Collection of Type Cultures (CECT) with deposit number CECT 5802, a strain of Pantoea dispersed deposited in the CECT with deposit number CECT 5801, at least one inorganic salt and a soluble molasses concentrate.
  • CECT Collection of Type Cultures
  • the present invention differs from the state of the art in that it is a biofertilizer formulated in liquid form, preferably in an aqueous medium suitable to maintain the viability of the biofertilizer strains, maintaining between 60% and 70% cell viability of both the strains after one year of storage at temperatures not greater than 30 and C.
  • Said suitable aqueous medium is responsible for maintaining the viability of the strains in the liquid formulation. Without such a suitable aqueous medium, the strains would lose their viability in a very short time.
  • the present invention provides such an aqueous medium suitable for the maintenance of the strains in the liquid biofertilizer.
  • Said liquid medium must comprise at least one inorganic salt and a soluble molasses concentrate to maintain the viability of the biofertilizer strains for a long time.
  • Said liquid medium may comprise pH regulating agents and one or more antifoaming agents.
  • the application dose is significantly reduced in the liquid biofertilizer of the invention, which comprises the bacterial strains Azospir ⁇ llum brasilense CECT 5802 and Pantoea dispersa CECT 5801, with respect to a biofertilizer comprising the same strains, immobilized on a solid support, because said liquid biofertilizer can make bacteria available to plants faster than in the form of immobilized on a solid support.
  • This reduction in the dose is approximately 20 times, going from an application of biofertilizer immobilized on a solid support of 300 kg / ha to an application of said liquid biofertilizer of 15 L / ha.
  • the bacterial strains present in the liquid biofertilizer of the invention remain viable, in said liquid biofertilizer, for at least one year maintaining their efficacy.
  • the complex technical problem to be solved would therefore consist in providing a biofertilizer comprising bacterial strains, formulated in liquid form, which allows its application in plants with a reduced dose and in which said bacterial strains remain viable for at least one year. maintaining its effectiveness.
  • the present invention defined by the object of the claims, provides a solution to said technical problem.
  • liquid biofertilizer over biofertilizers immobilized on a solid support are based on the liquid formulation form itself.
  • Said liquid biofertilizer as it is a liquid product where the bacteria remain viable for at least one year, favors the mode of application thereof, and can be applied by drip irrigation, spraying or by aerial means. The application by drip irrigation and liquid spray is not possible with biofertilizers immobilized on a solid support.
  • said biofertilizer is an aqueous suspension.
  • said biofertilizer has a pH between 6 and 8.
  • suitable pH regulating agents are used.
  • said biofertilizer further comprises at least one pH regulating agent and at least one antifoam agent.
  • said biofertilizer comprises the pH regulating agents malic acid and KOH.
  • said antifoam agent is polypropylene glycol.
  • said inorganic salt is selected from the group consisting of (NH 4 ) 2 S0 4 , K 2 HP0 4 , ZnS0 4 , MnS0 4 , CuS0 4 , MgSO 4 and CaCl 2 .
  • said biofertilizer comprises the inorganic salts (NH 4 ) 2 S0 4 , K 2 HP0 4 , ZnS0 4 , MnS0 4 , CuS0 4 , MgS0 4 and CaCl 2 .
  • Inorganic salts and soluble molasses concentrate are ingredients used as sources of nutrients in the liquid culture medium in which the strains of the invention grow, necessary to maintain the viability of the microorganisms present in the biofertilizer.
  • said pH regulating agents are malic acid and KOH.
  • said biofertilizer of the invention comprises (NH 4 ) 2 S0 4 , K 2 HP0 4 , ZnS0 4 , MnS0 4 , CuS0 4 , MgS0 4 , CaCl 2 , soluble molasses concentrate, malic acid, KOH and polypropylene glycol .
  • said biofertilizer of the invention comprises (NH 4 ) 2 S0 4 0.5-3.5% (w / w), K 2 HP0 4 0.1 -1% (w / w), ZnS0 4 -7H 2 0 0.005-0.1% (p / p), MnS0 4 -H 2 0 0.005-0.1% (p / p), CuS0 4 -5H 2 0 0.001 -0.01% (p / p), MgS0 4 -7H 2 0 0.001 -0.01% (p / p), CaCl 2 -2H 2 0 0.001 -0.01% (p / p), soluble molasses concentrate 0.05-2% (p / p ), malic acid 0.01 -0.1% (w / w), KOH 0.005-1% (w / w) and polypropylene glycol 0.001 -0.1% (w / w).
  • said biofertilizer of the invention comprises (NH 4 ) 2 S0 4 1, 5-2.5% (w / w), K 2 HP0 4 0.18-0.20% (w / w), ZnS0 4 -7H 2 0 0.01 -0.02% (p / p), MnS0 4 -H 2 0 0.01 -0.02% (p / p), CUS0 4 -5H 2 0 0.001 -0.002% ( w / w), MgSO 4 -7H 2 0 0.003-0.004% (w / w), CaCl 2 -2H 2 0 0.001 - 0.002% (w / w), soluble molasses concentrate 0.25-0.75% ( w / w), malic acid 0.035-0.045% (w / w), KOH 0.02-0.1% (w / w) and polypropylene glycol 0.005-0.01% (w / w).
  • said biofertilizer further comprises KH 2 PO 4 and / or NH 4 CI.
  • said biofertilizer further comprises one or more ingredients selected from the group consisting of tomato paste, collagen hydrolyzate and yeast extract.
  • said biofertilizer comprises tomato paste, collagen hydrolyzate and yeast extract.
  • Tomato paste is a natural product used as a carbon source in the liquid culture medium in which the strains of the invention grow.
  • Collagen hydrolyzate is a natural product used as a nitrogen source in the liquid culture medium in which the strains of the invention grow.
  • Natural yeast extract is a natural product rich in vitamins, especially B complex, amino acids and other growth factors. It is used as a source of nutrients in the liquid culture medium in which the strains of the invention grow.
  • said biofertilizer further comprises KH 2 P0 4 , NH 4 CI, tomato paste, collagen hydrolyzate and yeast extract. More preferably, said biofertilizer comprises KH 2 P0 4 0.05-0.3% (w / w), NH 4 CI 0.01 -2% (w / w), tomato paste 0.5-3% (p / w), collagen hydrolyzate 0.01 -2% (w / w) and yeast extract 0.01 -2% (w / w).
  • the present invention also relates to a method of stimulating the growth of a plant, which comprises applying said liquid biofertilizer to said plant.
  • the application of said liquid biofertilizer is selected from the group consisting of fertigation, spraying and drip irrigation.
  • the application dose of said liquid biofertilizer is between 5 and 30 L / ha. In a more preferred embodiment of said method of stimulating the growth of a plant, said application dose is between 10 and 20 L / ha.
  • said plant is selected from the group consisting of lettuce, broccoli and tomato.
  • the present invention also relates to a method for obtaining a liquid biofertilizer, comprising:
  • said biofertilizer is aqueous, more specifically an aqueous suspension.
  • the first liquid fermentation media comprise at least one of the ingredients selected from the group consisting of tomato paste, collagen hydrolyzate and yeast extract.
  • the first liquid fermentation media comprise tomato paste, collagen hydrolyzate and yeast extract. The addition of these products of natural origin is especially appropriate to use these biofertilizers in organic farming.
  • the first liquid fermentation media also comprise at least one inorganic salt selected from the group consisting of K 2 HP0 4 KH 2 P0 4 and NH 4 CI.
  • the first liquid fermentation media comprise the inorganic salts K 2 HP0 4, KH 2 P0 4 and NH 4 CI.
  • the first liquid fermentation media comprise K 2 HP0 4 , KH 2 P0 4 , NH 4 CI, tomato paste, collagen hydrolyzate and yeast extract. More preferably, the first liquid fermentation media comprise K 2 HP0 4 1 -6% (w / w), KH 2 P0 4 0.01 -0.6% (w / w), NH 4 CI 0.02-4 % (w / w), tomato paste 1 -6% (w / w), collagen hydrolyzate 0.02-4% (w / w) and yeast extract 0.02-4% (w / w).
  • the second liquid fresh medium comprises at least one inorganic salt, a soluble molasses concentrate, at least one pH regulating agent and at least one antifoam agent.
  • said inorganic salt is selected from the group consisting of (NH 4 ) 2 S0 4 , K 2 HP0 4 , ZnS0 4 , MnS0 4 , CuS0 4 , MgS0 4 and CaCI 2 .
  • the second fresh liquid medium comprises the inorganic salts (NH 4 ) 2 S0 4 , K 2 HP0 4 , ZnS0 4 , MnS0 4 , CuS0 4 , MgS0 4 and CaCl 2 .
  • the second fresh liquid medium comprises the pH regulating agents malic acid and KOH.
  • said antifoam agent is polypropylene glycol.
  • the second fresh liquid medium comprises (NH 4 ) 2 S0 4 , K 2 HP0 4 , ZnS0 4 , MnS0 4 , CuS0 4 , MgS0 4 , CaCl 2 , a soluble concentrate of molasses, malic acid, KOH and polypropylene glycol.
  • the second fresh liquid medium comprises (NH 4 ) 2 S0 4 1 -7% (w / w), K 2 HP0 4 0.001 -0.2% (w / w), ZnS0 4 -7H 2 0 0.001 - 0.2% (p / p), MnS0 4 -H 2 0 0.001 -0.2% (p / p), CUS0 4 -5H 2 0 0.001 -0.02% (p / p), MgS0 4 -7H 2 0 0.001 -0.02% (w / w), CaCl 2 -2H 2 0 0.001 -0.02% (w / w), soluble molasses concentrate 0.1 -2% (w / w), malic acid 0.02-0.2% (w / w), KOH 0.01-2% (w / w) and polypropylene glycol 0.001-0.2% (w / w).
  • the second fresh liquid medium comprises (NH 4 ) 2 S0 4 3-5% (w / w), K 2 HP0 4 0.04-0.06% (w / w), ZnS0 4 -7H 2 0 0.02- 0.04% (p / p), MnS0 4 -H 2 0 0.02-0.04% (p / p), CuS0 4 -5H 2 0 0.002-0.004% (p / p), MgSO 4 -7H 2 0 0.006-0.008% (p / p), CaCl 2 -2H 2 0 0.002-0.004% (p / p), soluble molasses concentrate 0.5-1, 5% (p / p), Malic acid 0.07-0.09% (w / w), KOH 0.04-0.2% (w / w) and polypropylene glycol 0.01 -
  • step (a) In another preferred embodiment of said method for obtaining the biofertilizer of the invention, between 20% and 30% (w / w) of the fermentation broths obtained in step (a) are added to said second fresh liquid medium.
  • the cultures of step (a) are carried out for a time between 8 and 20 hours.
  • the stirring speed in step (a) is between 400 and 800 r.p.m.
  • the aeration in step (a) is between 0.5 and 2 L / min.
  • the present invention also relates to a liquid biofertilizer obtainable according to said method of obtaining the invention.
  • Field trials have been carried out under production conditions in the open air and in the greenhouse with said liquid biofertilizer, with very satisfactory results. Such field tests are described in Examples 3-5.
  • viability refers to the fact that the microorganisms in the liquid biofertilizer maintain their ability to reproduce, to colonize the roots and, therefore, maintain their ability to exert their biofertilizer function.
  • This viability means that the biofertilizer is stable and functional during storage under suitable conditions. In particular, both strains of liquid biofertilizer maintained between 60% and 70% cell viability at the end of one year of storage, not temperatures of 30 and C.
  • the terms "viability”, “viable” and the like have , for the purposes of the present specification, the same meaning as the terms “stability", “stable” and the like.
  • aqueous liquid biofertilizer refers to a liquid biofertilizer in which the majority solvent is water.
  • Said aqueous liquid biofertilizer comprises at least one inorganic salt and a soluble molasses concentrate and can comprise acids, hydroxides, polypropylene glycol and other ingredients. Examples of other ingredients are: tomato paste, collagen hydrolyzate, and yeast extract.
  • Said liquid biofertilizer may consist of a buffered formulation.
  • soluble molasses concentrate refers to a product obtained from industrial fermentation processes for the production of yeast, alcohol and organic acids on molasses substrate. Molasses is obtained from sugar crystallization procedures and is a residue of this process from which no more sugar can be obtained by physical methods. Molasses can be obtained from sugar cane.
  • pH regulating agents refers to chemicals that adjust the pH of a solution to a desired value or are capable of maintaining the pH of a solution within a narrow range.
  • regulating agents are carboxylic acids, dicarboxylic acids, malic acid, metal hydroxides, such as KOH, NaOH, etc.
  • anantifoam agent refers to a chemical that prevents foaming in a solution.
  • collagen hydrolyzate refers to a product obtained from biological animal tissues, such as skin, bones, bones, scales, of porcine, beef, chicken, fish, etc. origin.
  • the collagen present in these tissues undergoes a hydrolysis process that separates the polypeptide chains of collagen. These chains are then fragmented into smaller segments, using chemicals (chemical hydrolysis) or proteolytic enzymes (enzymatic hydrolysis). It is a product used in the preparation of culture media for microorganisms as a source of nitrogen.
  • yeast extract refers to a water soluble extract formed by the autolysate of yeast cells. It is a product rich in vitamins, especially the B complex, amino acids and other growth factors. It is used in the preparation of culture media for microorganisms as a source of nutrients.
  • fertigation refers to a fertilizer application technique that allows the simultaneous application of water and fertilizers through the irrigation system.
  • spraying refers to a fertilizer application technique that distributes a particulate liquid.
  • a tomato culture medium was prepared, a culture medium that comprises tomato paste as a carbon source, hydrolyzed collagen from animal skin of fertilizer use as a source of organic nitrogen and whose composition is that described in Table 1 .
  • the tomato paste was a sterile product obtained from whole tomatoes (Solanum Lycopersicum L./Lycopersicum Sculentum "Mili '), crushed, sieved, homogenized, concentrated, pasteurized and aseptically packed (commercial product” Tomato concentrate 28/30 e Brix " of Mensajero Alimenta Terms, SL). This product had 28-30 e Brix, contained dry extract 30-32% (w / w), pH 4, 0-4, 4, acidity (citric acid) 1, 6-2, 2, Bostwick viscosity (20 e C ) 6-1 1 cm / 30 seconds, mesh size 0.6 mm and Howard count less than 60%.
  • the average values per 100 g of this product were: energy value 92 Kcal / 387 Kj, total fat 0.2 g, saturated fatty acids less than 0.1 g, carbohydrates 22 g, sugars 12 g, dietary fiber 7 g , proteins 5 g and salt less than 0.1 g.
  • the collagen hydrolyzate was a powdered product consisting of a powdered mixture of amino acids and peptides obtained by chemical hydrolysis (commercial product "Protifert PN 142 from Sicit 2000 SpA).
  • the product was an ivory-white powder, it contained 95% dry matter (w / w), total nitrogen 14% (w / w), volumetric mass 300 g / L, pH 6.0-7.5 in 10% solution (w / w), thermal stability greater than 200 e C oxidation in static air and greater than 300 e C in an inert atmosphere.
  • the yeast extract used is a powdered product (commercial product "Yeast Extract Powder” from Oxoid Ltd).
  • the product was a pale beige powder.
  • the pH of the tomato culture medium was 7.0.
  • the culture medium was sterilized at 121 tomato and C for 30 minutes.
  • the culture medium is very inexpensive and what is more important, high cell counts of the order of 10 9 -10 10 cells / mL are reached in both cases.
  • the purity of an isolate of the Azospir ⁇ llum brasilense CECT 5802 strain was verified by taking an ampoule of said isolate, seeding a sample of said ampoule in plates of Congo Red medium and incubating at 30 ° C for 72 hours. A portion of the culture was taken from this plate with a loop, inoculated in a 1000 ml_ Erlenmeyer flask, with 100 ml_ of tomato culture medium and incubated with shaking at 30 ° C for 16 hours. At the end of this time, the contents of the flask, which were in the exponential phase, were inoculated into a 3 L Braun Biotech BIOSTAT ® B Kruter with 1.9 L of the tomato culture medium.
  • Fermentation was carried out for 16 hours at a stirring speed of 600 rpm, an aeration of 2 L / min (1 vvm (volume of air per volume of medium per minute)) and a temperature of 30 ° C.
  • the pH was allowed to vary freely and reached a value of 6.8.
  • a concentration of 8.9x10 ® cells / mL was reached.
  • the specific growth rate in exponential phase (m) was 0.25 h 1 .
  • a fresh medium was prepared.
  • the ingredients that make up the fresh medium are described in Table 2.
  • the concentration of the ingredients in this example was the mean value of the range indicated in Table 2.
  • the soluble molasses concentrate was a concentrated liquid product obtained from the industrial fermentation processes for the production of yeast, alcohol and organic acids on molasses substrate and other draft liquors, source of nitrogen and mineral salts (commercial product “Fluido fertilizer nitrogenated organic ”from ED&F Man Liquid Products Italia Srl).
  • the product was a thick liquid black or dark brown, had a viscosity of 200-2000 cp at 20 e C, specific gravity 1.15-1.35, flash point above 200 C and water miscible and higher decomposition temperature 45 e C and pH between 5.5-5.8.5.
  • the polypropylene glycol was a polymer, a liquid product ("VORANOL * 2000 L Polyol” trade product from The Dow Chemical Company).
  • a fermentation reactor with stirring and temperature control was charged with the amount of water necessary to obtain the final volume of product desired. Said amount of water required was approximately 44% w / w.
  • the stirrer was started and the salts were added, following the order in which said salts appear in Table 2, until their complete dissolution.
  • the molasses concentrate, the malic acid and, finally, the polypropylene glycol were added, maintaining stirring. Once a completely homogeneous mixture was obtained, the pH of the medium was adjusted to 7.00, by adding potash (KOH).
  • the fresh medium was allowed to cool.
  • the fermentation broths of the Azospir ⁇ llum brasilense CECT 5802 strains (25% w / w) and Pantoea dispersa CECT 5801 (25% w / w) were added, obtained according to the procedure described in the section Obtaining fermentation broths from the strains ”of this example. Said fermentation broths were added with slow stirring until a homogeneous mixture was obtained.
  • the cell viability of the liquid biofertilizer was periodically checked.
  • the cell viability of the Azospir ⁇ llum brasilense CECT 5802 and Pantoea dispersa CECT 5801 strains was tested in Congo Red medium and MacConkey medium, respectively.
  • the liquid biofertilizer conserved more than 60% of cell viability after one year of conservation, at temperatures not higher than 30 ° C, of both strains.
  • Example 1 the liquid biofertilizer obtained in Example 1 was used.
  • Tables 3 and 4 show the production results obtained in the test.
  • the liquid biofertilizer of the invention obtains superior yields both with respect to the untreated control and the thesis with the recommended fertilizer according to the Integrated production standards of the Region of Murcia (BORM, Order 8024).
  • the liquid biofertilizer of the invention is effective in reducing the need for chemical fertilization since it obtains results similar to or superior to 100% chemical fertilization.
  • the liquid biofertilizer of the invention at 2.5 and 5 L / ha, obtains higher yields with respect to the untreated control.
  • the liquid biofertilizer of the invention is effective in reducing the need for chemical fertilization since it obtains results superior to 100% chemical fertilization.
  • the liquid biofertilizer of the invention at 5 L / ha, obtains an annual production increase in kg / ha of 12% in the thesis applied with the liquid biofertilizer of the invention only without any type of chemical contribution. In the thesis that 50% of chemical fertilization is maintained, the increase reaches 20%.
  • the Azospir ⁇ llum brasilense and Pantoea dispersa strains were deposited on June 9, 2003, according to the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure, with the International Deposit Authority (IDA) Spanish Collection of Type Cultures (CECT), by the depositor Probelte, SA The depositor identified the strains as “Azospir ⁇ llum brasilense M 3 ” and “Pantoea dispersa C 3 ”. After successful completion of the strain viability trials, the IDA accepted the strains, confirmed the above-stated date on which the IDA received the deposit, and assigned the deposit number CECT 5802 and CECT 5801, respectively, to those strains. .
  • the Azospir ⁇ llum brasilense CECT 5802 strain was isolated from the roots of pea plants (Pisum sativum) collected in the region of Murcia. The ability of the Azospir ⁇ llum brasilense CECT 5802 strain to stimulate plant growth was verified by laboratory and greenhouse bioassays. The Azospir ⁇ llum brasilense CECT 5802 strain produced the greatest growth-stimulating effect of the more than 50 isolates of nitrogen-fixing bacteria tested. The production of 3-indole acetic acid and other plant growth promoting substances was verified. The presence of other phytohormones of the cytokinin type was detected.
  • the Pantoea dispersed strain CECT 5801 was isolated from the rhizosphere of Shorgum halepense plants collected in the Murcia region. The characterization of the organic acids produced by the dispersed Pantoea strain CECT 5801 was carried out and it was found that it produces mostly gluconic acid, as well as other organic acids in small quantities. The selection was made through its ability to stimulate plant growth and to produce auxins. Their ability to produce siderophores was determined. Through laboratory and greenhouse bioassays, the ability to stimulate the plant growth. The activity of the enzyme 1-aminocyclopropane 1-carboxylate deaminase present in this strain was also verified, through growth in media with 1-aminocyclopropane 1-carboxylic acid (ACC) as the sole nitrogen source.
  • ACC 1-aminocyclopropane 1-carboxylic acid

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Abstract

Biofertilizante líquido que comprende las cepas Azospirillum brasilense CECT 5802 y Pantoea dispersa CECT 5801. Método de estimulación del crecimiento de una planta, que comprende aplicar a dicha planta dicho biofertilizante líquido. Método de obtención de un biofertilizante líquido, que comprende cultivar dichas cepas en unos primeros medios de cultivo líquido y añadir los caldos de cultivo obtenidos a un segundo medio de cultivo líquido.

Description

DESCRIPCIÓN
BIOFERTILIZANTE LÍQUIDO QUE COMPRENDE CEPAS DE AZOSPIRILLUM BR ASILENSE PANTOEA DISPERSA Y MÉTODO DE OBTENCIÓN DEL MISMO
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se refiere a un producto para la fertilización biológica consistente en una formulación líquida que contiene dos cepas de bacterias de los géneros Azospiríllum y Pantoea, con capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, solubilizar fosfatos así como otros nutrientes minerales del suelo y producir cantidades elevadas de sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal. Dichos microorganismos han sido formulados en forma líquida, lo que garantiza una fácil aplicación y una elevada estabilidad en la viabilidad celular y proporciona nutrientes orgánicos y minerales suficientes para facilitar la colonización de las raíces de las plantas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El uso de fertilizantes resulta imprescindible para el mantenimiento de altos rendimientos en las cosechas. Mediante la fertilización química, son añadidas al suelo cantidades importantes de nitrógeno, fósforo y potasio, así como otros elementos minerales, sin embargo, las disponibilidades de éstos son muy bajas, ya que una fracción queda inmovilizada en el suelo formando compuestos insolubles no asimilables por las plantas y otra es lavada mediante un proceso de lixiviación, lo cual además de pérdidas económicas, genera un importante problema de contaminación ambiental.
En el caso del fósforo, en particular, una parte importante de los fosfatos solubles añadidos es insolubilizada por el hierro y el aluminio en los suelos ácidos y por el calcio en los suelos calcáreos, convirtiéndose progresivamente en formas menos asimilables. Como resultado de los diversos mecanismos de retención, la mayor parte del fósforo aplicado mediante la fertilización no puede ser utilizada por las cosechas y es retenida en el suelo en forma insoluble. Dado este fenómeno y la aplicación cíclica de fertilizantes, la concentración de fósforo en el suelo ha aumentado notablemente, por lo que en muchos suelos podrían establecerse cosechas a largo plazo si estas reservas pudieran ser explotadas económicamente. La adición de fertilizantes inorgánicos en exceso también puede llevar a problemas ambientales como la contaminación de las aguas subterráneas y la eutrofización de las vías navegables. Por lo tanto, es de gran interés investigar estrategias de manejo que sean capaces de mejorar la eficiencia de la fertilización con fósforo, aumentar los rendimientos de los cultivos y reducir la contaminación ambiental causada por la pérdida de fósforo del suelo (Alori y col., 2017).
Es bien conocida la importancia que tienen los microorganismos en el ciclo de los nutrientes en el suelo y su papel en la nutrición de las plantas. Su participación activa en la descomposición y mineralización de la materia orgánica, así como en la fijación y liberación de nutrientes del suelo, es crucial para el mantenimiento de la productividad de las plantas. Las interacciones que se establecen entre los microorganismos del suelo y las raíces de las plantas satisfacen importantes requerimientos nutricionales para ambos. Las raíces están directamente influidas por la composición y densidad de la comunidad microbiana que en ellas se desarrolla, conociéndose esto como “Efecto Rizosfera”, que depende particularmente de la planta y su madurez fisiológica. La práctica de la inoculación de plantas con microorganismos es bien conocida en el estado de la técnica (Vessey 2003).
En la naturaleza son numerosos los microorganismos de la rizosfera capaces de liberar el fósforo del suelo mediante la solubilización y la mineralización (Bhattacharyya y Jha, 2012). Este grupo de microorganismos se conoce como microorganismos solubilizadores de fósforo (PSM). Muchas especies de hongos y bacterias del suelo pueden solubilizar el fósforo in vitro y algunas de ellas aumentan la biodisponibilidad del fósforo insoluble en el suelo para uso por parte de las plantas (Zhu y col., 201 1 ). Solubilizan el fósforo (mineral) inorgánico insoluble y mineralizan el fósforo orgánico insoluble (Sharma y col., 2013).
Un grupo de microorganismos que tiene una notable importancia en este fenómeno es aquel que participa en la solubilización del fósforo de fuentes que de otra forma serían inaccesibles para las plantas.
Los microorganismos solubilizadores de fosfato han sido aislados en prácticamente todos los suelos ensayados, aunque el número y proporción de éstos varía de acuerdo con el tipo de suelo, el clima y otros factores tales como la evolución histórica del suelo. Muchos microorganismos son capaces de asimilar el fósforo insoluble del suelo, liberando una parte de éste en forma de fosfatos solubles que a su vez pueden ser utilizados por las plantas, contribuyendo de esta forma a la nutrición vegetal. En general es aceptado que la solubilización de fosfatos en el suelo es debida a la producción de ácidos orgánicos y oxo ácidos quelantes, a partir de azúcares (Seshachala y Tallapragada, 2012). Se han descrito procedimientos en los que se han empleado microorganismos solubilizadores de fosfatos en la fertilización (Yu y col., 201 1 ).
Los métodos utilizados en el aislamiento de los microorganismos solubilizadores de fosfato se basan fundamentalmente en el empleo de sales inorgánicas insolubles de fósforo, tales como el hidroxiapatito y el fosfato tricálcico, en medios de cultivo agarizados. Para la utilización de dichas sales, el microorganismo produce ácidos orgánicos que, al difundir en el medio, provocan una disminución del pH y como consecuencia la formación de un halo de transparencia en las proximidades de la colonia. Sin embargo, se ha señalado que los medios de cultivo agarizados no siempre detectan a los microorganismos más aptos para la solubilización de fosfatos, se ha planteado como alternativa un esquema y selección de este tipo de microorganismos utilizando cultivos líquidos agitados como alternativa, destacando la importancia de determinados componentes del medio y su concentración en los resultados alcanzados y proponiendo un medio de cultivo para llevar a cabo la selección (Nautiyal 1999). Otros autores, trabajando con medios agarizados, concluyeron que la capacidad amortiguadora de pH del medio de cultivo utilizado en el aislamiento tiene una importancia determinante en la selección de cepas que produzcan cantidades suficientes de ácidos orgánicos para que presenten un interés real en la biofertilización, describieron que el ácido glucónico es el principal componente de los ácidos orgánicos producidos por Enterobacter asburiae y que la enzima glucosa deshidrogenasa, responsable de la producción del ácido glucónico, es regulada por inanición de fosfatos, es decir, que las bajas concentraciones de fosfatos solubles estimulan la producción de ácidos en este tipo de microorganismo (Gyaneshwar y col., 1999).
Los géneros Enterobacter y Pantoea han sido utilizados en la agricultura como solubilizadores de fosfato y para la protección contra enfermedades de las plantas (Beltrán- Pineda, 2014). Pantoea dispersa es una especie con genes que codifican la enzima para la destoxificación de la albicidina. Dichos genes y enzima han sido empleados para la obtención de plantas transgénicas resistentes a las enfermedades producidas por hongos, lo que demuestra su capacidad para proteger contra enfermedades de plantas de origen fúngico. Existen diferentes documentos del estado de la técnica que señalan a Pantoea dispersa como una especie solubilizadora de fosfatos (Fernández y col., 2008).
Otro aspecto que en la práctica ocupa un lugar muy importante es el empleo de los microorganismos de la rizosfera fijadores de nitrógeno atmosférico. Numerosos microorganismos han sido utilizados para esta función entre los que se encuentran bacterias de géneros tales como Rhizobium, Azotobacter y Azospirillum y hongos de los géneros Saccharomyces, Hansenula y Aspergillus, entre otros.
El nitrógeno es un elemento abundante, que compone casi el 80% de la atmósfera terrestre y una parte nutritiva muy escasa. La paradoja se resuelve fácilmente: el nitrógeno atmosférico es inerte y no pueden aprovecharlo la mayoría de los organismos, pudiendo solamente ser incorporado en la síntesis biológica cuando ha sido "fijado" o combinado con ciertos elementos como el hidrógeno o el oxígeno. Las bacterias son capaces de fijar 1 ,5 x 108 toneladas métricas por año, una parte importante de la cual es sintetizada mediante el proceso de Haber-Bosch.
Experimentos realizados en Brasil determinaron la significativa contribución del N2 fijado para las plantas por diferentes microorganismos, encontrándose Azospirillum entre los géneros principales. Estudios posteriores de cuantificación de la fijación biológica del nitrógeno (FBN) en caña de azúcar en este mismo país demostraron que, prácticamente el 65% del total del N2 acumulado fue derivado de la FBN, lo que representa alrededor de 150 kg N2 x ha 1 x año 1 , lo que condujo a la recomendación de reducir al mínimo el uso de los fertilizantes nitrogenados.
Es sabido que diferentes especies de plantas producen diversos efectos sobre la rizosfera, siendo también conocido que las cepas aisladas en un tipo de especie vegetal, tiene un efecto totalmente distinto sobre la rizosfera de la cual fue aislada con respecto a otros cultivos. Sin embargo, Azospirillum brasiiense es capaz de colonizar plantas de diferentes especies adhiriéndose a las raíces. Existen trabajos que han demostrado la ubicuidad del género Azospirillum llevando a cabo su aislamiento en cultivos variados, así como en regiones con climas muy disímiles (Fukami y col., 2016).
Se ha descrito que al inocular diferentes cultivos de plantas con especies del género Azospirillum aparecían cambios en la morfología de las raíces y se ha determinado que, en las primeras tres semanas después de la germinación, el número de pelos radicales y ramas de las raíces aumenta con la inoculación, lo cual produce un aumento de la superficie de absorción de las raíces.
En estudios de inoculación de plantas de trigo con Azospirillum brasiiense, se ha observado que en la superficie de las raíces inoculadas se formaban pequeños agregados celulares, y al hacer cortes, se ha encontrado que algunas bacterias penetraban las células jóvenes de las raíces, pero existían muchas más en los espacios intercelulares, así como en las capas epidémicas de las células. Se ha encontrado, a su vez, que la adsorción de esta bacteria a las raíces es débil y se realiza mediante procesos de metabolismo dependientes de las bacterias, mediados por factores de reconocimiento. También se ha descrito la capacidad de esta especie de trasladarse en el suelo para colonizar las raíces de las plantas y la capacidad de colonizar además de cereales, diferentes cultivos, produciendo sobre las raíces de éstos, cambios morfológicos análogos a los ocurridos en la familia Graminaceae.
El principal elemento involucrado en la relación Azospiríllum-p\aa\a no es únicamente el nitrógeno, también el fósforo y el potasio juegan un papel fundamental en esta relación. Dependiendo de la cepa utilizada, existe un cambio cuantitativo en la toma de los minerales por la planta, aumentado significativamente algunas cosechas. Según la "teoría de los múltiples mecanismos", la bacteria actúa con un patrón de efectos acumulativos o secuenciales, como resultado de los mecanismos que ocurren de manera simultánea o consecutiva (Bashan y De-Bashan 2010).
En la actualidad es muy común el uso de este género en la producción de fertilizantes biológicos.
Hay que destacar que muchos autores coinciden en señalar que los efectos beneficiosos producidos por la inoculación con microorganismos sobre el crecimiento vegetal no son solo debidos a la solubilización de fosfatos o a la fijación biológica del nitrógeno. Existen mecanismos tales como la producción de fitohormonas y sideróforos o la actividad de la enzima 1 -aminociclopropano 1 -carboxilato desaminasa entre otros, que contribuyen notablemente en este efecto (Fukami y col., 2018).
Entre las relaciones microbianas que tienen lugar en la rizosfera se encuentran las llamadas de cooperación que son las que se establecen entre aquellos grupos microbianos que llevan a cabo metabolismos complementarios, puede ser este el caso de algunas bacterias solubilizadoras de fosfatos que excretan al medio ácidos orgánicos los que a su vez constituyen la fuente principal de carbono en algunos géneros de las bacterias nitrofijadoras, permitiendo esto la convivencia de ambos grupos, a la vez de un doble efecto en el mejoramiento de los cultivos y en la protección contra enfermedades.
El desarrollo asociativo de los géneros Azospiríllum y Pantoea ha sido llevado a cabo exitosamente en la fijación biológica de nitrógeno, demostrándose que no existen incompatibilidades entre ambos géneros y que al mostrar diferencias en los mecanismos de regulación metabólica pueden realizar diferentes funciones en un ecosistema dado (Flores y col., 2010; Del Amor y Cuadra, 201 1 ; Schoebitz y col., 2014; Mengual y col., 2014). Los cultivos mixtos de microorganismos del suelo, con diferentes capacidades metabólicas pueden desarrollar relaciones de cooperación entre sí y con las plantas que hacen más eficiente la adsorción de nutrientes por éstas y además pueden producir sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal, aumentando la productividad de las cosechas y protegiéndolas contra los microorganismos patógenos.
La práctica de inocular plantas con microorganismos utilizando cultivos mixtos (llamados también consorcios) que potencien fenómenos tales como el incremento de la eficiencia de la absorción del fósforo por las raíces, la fijación biológica del nitrógeno, la estimulación del crecimiento vegetal por la producción de sustancias reguladoras del crecimiento vegetal, así como sideróforos y la protección contra enfermedades producidas por microorganismos patógenos entre otros se ha revelado como la más efectiva en la biofertilización (Nuti y Giovannetti, 2015).
La forma física de un biofertilizante es un factor determinante en el resultado práctico que proporciona dicho biofertilizante. La viabilidad de los organismos presentes en un biofertilizante durante la producción, formulación, almacenamiento, transporte/distribución y aplicación en el campo está directamente relacionada con el potencial de crecimiento de las plantas. Esto limita su uso debido a problemas de compatibilidad, estabilidad y supervivencia en diferentes condiciones del suelo. Por lo tanto, una vida útil mejorada podría ser la clave para una mayor generalización de la aplicación de biofertilizantes (Brar y col., 2012).
En un fertilizante biológico, los microorganismos deben permanecer viables, en estado latente o metabólicamente activos. Este factor tiene dos aspectos determinantes, la durabilidad del producto y la capacidad de éste para colonizar las raíces de los cultivos que se quiere estimular o proteger, una vez aplicado en el campo. El empleo de preparaciones de células libres es una práctica común en la biotecnología agrícola y resulta muy efectiva cuando se trabaja con microorganismos capaces de formar estructuras de resistencia, como en el caso de bacterias del género Bacillus. Este problema tiene otro carácter cuando se trata de células que no tienen la capacidad de formar estructuras de resistencia, ya que los cultivos van perdiendo viabilidad con el tiempo y además su capacidad de supervivencia en el suelo es muy baja. Muchos de los fracasos que se han producido en el campo de la biofertilización y la bioprotección están relacionados con este fenómeno. La inoculación de suelos con microorganismos capaces de favorecer la productividad de las plantas es un proceso muy complejo en el cual pueden tener un efecto determinante toda una serie de factores. Por esta razón, es imprescindible que el fertilizante biológico sea capaz de preservar la viabilidad celular en condiciones adversas durante largos periodos de tiempo y garantizar en la medida de lo posible la capacidad de colonización de las raíces una vez aplicado en el campo. Uno de los criterios más importante a tener en cuenta para esto es lograr preparados de fertilizantes biológicos que liberen un número apreciable de células viables consistentemente (Pindi y Satyanarayana, 2012).
En la práctica común, para una mejor vida útil de la formulación del biofertilizante, un portador o una mezcla de tales materiales portadores se seleccionan basándose en la viabilidad de los microorganismos mezclados con ellos. De manera similar, su enriquecimiento con nutrientes es la otra estrategia para mejorar la vida útil al permitir que el microorganismo se mantenga y crezca en un microentorno no competitivo (Yardin y col., 2000).
El documento ES2234417A1 describe un fertilizante biológico que comprende cepas bacterianas de Azospiríllum brasilense y Pantoea dispersa inmovilizadas en un soporte sólido. En concreto, dicho documento describe la cepa Azospiríllum brasilense CECT 5802 y la cepa Pantoea dispersa CECT 5801.
El documento W02009027544A1 describe un fertilizante biológico que comprende un soporte sólido en el que se han inmovilizado las cepas bacterianas Azospiríllum brasilense CECT 5802 y Pantoea dispersa CECT 5801 y, adicionalmente, ácido indol-3-acético o un promotor del ácido indol-3-acético.
El cambio de un biofertilizante que comprende microorganismos inmovilizados en un soporte sólido a un biofertilizante en forma líquida está asociado a una reducción significativa en la viabilidad de dichos microorganismos y a una disminución del periodo en el que el producto permanece viable manteniendo la eficacia. La vida útil de un biofertilizante líquido constituye una importante preocupación (Brar y col., 2012).
Sin embargo, los biofertilizantes líquidos tienen ventajas frente a los biofertilizantes en los que los microorganismos contenidos en los mismos están inmovilizados en un soporte sólido, como son las mejoras en el modo de aplicación, pudiéndose aplicar por riego por goteo, pulverización o por medios aéreos. No es posible aplicar biofertilizantes inmovilizados en un soporte sólido por riego por goteo o por pulverización líquida. Es más, los biofertilizantes líquidos permiten su aplicación a otras partes de las plantas distintas de las raíces, al poder pulverizarse sobre las partes aéreas de las plantas (tallos, hojas, frutos, flores, etc.). A diferencia de los biofertilizantes basados en portadores sólidos, las formulaciones líquidas permiten incluir una cantidad suficiente de nutrientes, protectores celulares e inductores de la formación de células para garantizar una vida útil prolongada.
Para que la obtención de un biofertilizante resulte atractiva desde el punto de vista económico, es necesario realizar una selección adecuada del medio en que se va a llevar a cabo su producción. Para esto resulta esencial seleccionar cuidadosamente las materias primas y materiales a utilizar, de manera que se minimicen los costes. Para este fin, es necesario que las materias primas y su concentración en el medio de fermentación permitan obtener una elevada concentración celular o del producto deseado a un coste mínimo. Los productos de origen natural son muy apropiados para este fin, dado su bajo coste y su inocuidad para el medio ambiente. Éstos pueden tener como ventaja adicional, estimular efectos deseados si son incluidos en el preparado final. Los concentrados de tomate han sido utilizados en la producción de giberelinas, como fuente de nitrógeno y como fuente de carbono para el crecimiento y la producción de metabolitos de origen microbiano debido a su elevado contenido en carbono orgánico. Por otra parte, el hidrolizado de colágeno de uso en la agricultura es una fuente de nitrógeno orgánico muy adecuada y barata, incluso para microorganismos incapaces de producir enzimas proteolíticas. La combinación de estas dos fuentes ofrece un medio de cultivo universal, de muy bajo coste y por tanto muy atractivo para la realización de procesos fermentativos a gran escala. Además, su origen natural permite una agricultura más ecológica que la sociedad actual demanda.
De todo lo expuesto anteriormente, se deriva el interés que suscita el desarrollo de un biofertilizante líquido que comprenda cepas bacterianas, en el que dichas cepas bacterianas mantengan su viabilidad durante un tiempo prolongado manteniendo su eficacia, obteniendo así las ventajas, anteriormente mencionadas, que aportan los biofertilizantes líquidos frente a los biofertilizantes inmovilizados en soportes sólidos.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la invención es un producto para la fertilización biológica consistente en una formulación líquida que contiene dos cepas de bacterias de los géneros Azospiríllum y Pantoea, con capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, solubilizar fosfatos así como otros nutrientes minerales del suelo y producir cantidades elevadas de sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal. Dichos microorganismos han sido formulados en forma líquida, lo cual garantiza una fácil aplicación y una elevada estabilidad en la viabilidad celular y proporciona nutrientes orgánicos y minerales suficientes para facilitar la colonización de las raíces de las plantas. También es objeto de invención un método de estimulación del crecimiento de una planta, que comprende aplicar el biofertilizante líquido de la invención a dicha planta, un método de obtención del biofertilizante líquido de la invención y un biofertilizante líquido obtenible según dicho método de obtención.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un biofertilizante líquido que comprende una cepa de Azospiríllum brasilense depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de depósito CECT 5802, una cepa de Pantoea dispersa depositada en la CECT con número de depósito CECT 5801 , al menos una sal inorgánica y un concentrado soluble de melaza.
La presente invención se diferencia del estado de la técnica en que es un biofertilizante formulado en forma líquida, preferiblemente en un medio acuoso adecuado para mantener la viabilidad de las cepas del biofertilizante, manteniendo entre un 60% y un 70% de viabilidad celular de ambas cepas al cabo de un año de conservación, a temperaturas no mayores de 30eC.
Dicho medio acuoso adecuado es responsable del mantenimiento de la viabilidad de las cepas en la formulación líquida. Sin dicho medio acuoso adecuado, las cepas perderían su viabilidad en muy poco tiempo.
La presente invención proporciona dicho medio acuoso adecuado para el mantenimiento de las cepas en el biofertilizante líquido. Dicho medio líquido debe comprender al menos una sal inorgánica y un concentrado soluble de melaza para mantener la viabilidad de las cepas del biofertilizante un tiempo prolongado. Dicho medio líquido puede comprender agentes reguladores del pH y uno o más agentes antiespumantes.
La dosis de aplicación se reduce significativamente en el biofertilizante líquido de la invención, que comprende las cepas bacterianas Azospiríllum brasilense CECT 5802 y Pantoea dispersa CECT 5801 , respecto a un biofertilizante que comprende las mismas cepas, inmovilizadas en un soporte sólido, debido a que dicho biofertilizante líquido puede poner a disposición de las plantas las bacterias de forma más rápida que en forma de inmovilizado en un soporte sólido. Esta reducción en la dosis es de aproximadamente 20 veces, pasando de una aplicación de biofertilizante inmovilizado en un soporte sólido de 300 kg/ha a una aplicación de dicho biofertilizante líquido de 15 L/ha. Adicionalmente, las cepas bacterianas presentes en el biofertilizante líquido de la invención permanecen viables, en dicho biofertilizante líquido, al menos durante un año manteniendo su eficacia.
El problema técnico complejo a resolver consistiría, por tanto, en proporcionar un biofertilizante que comprende cepas bacterianas, formulado en forma líquida, que permita su aplicación en plantas con una dosis reducida y en el que dichas cepas bacterianas permanecen viables al menos durante un año, manteniendo su eficacia.
La presente invención, definida por el objeto de las reivindicaciones, proporciona una solución a dicho problema técnico.
Las ventajas de dicho biofertilizante líquido sobre los biofertilizantes inmovilizados en un soporte sólido se basan en la propia forma de formulación líquida. Dicho biofertilizante líquido, al tratarse de un producto líquido donde las bacterias permanecen viables al menos durante un año, favorece el modo de aplicación del mismo, pudiéndose aplicar por riego por goteo, pulverización o por medios aéreos. La aplicación por riego por goteo y pulverización líquida no es posible con biofertilizantes inmovilizados en un soporte sólido.
En una realización preferida, dicho biofertilizante es una suspensión acuosa.
En otra realización preferida, dicho biofertilizante tiene un pH entre 6 y 8. Para ello se utilizan agentes reguladores de pH adecuados.
En otra realización preferida, dicho biofertilizante comprende además al menos un agente regulador del pH y al menos un agente antiespumante. Aún más preferiblemente, dicho biofertilizante comprende los agentes reguladores del pH ácido málico y KOH. Aún más preferiblemente, dicho agente antiespumante es polipropilenglicol.
En una realización más preferida, dicha sal inorgánica se selecciona del grupo que consiste en (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04 y CaCI2. En una realización aún más preferida, dicho biofertilizante comprende las sales inorgánicas (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04 y CaCI2.
Las sales inorgánicas y el concentrado soluble de melaza son ingredientes utilizados como fuentes de nutrientes en el medio de cultivo líquido en el que crecen las cepas de la invención, necesarios para mantener la viabilidad de los microorganismos presentes en el biofertilizante.
En otra realización preferida, dichos agentes reguladores del pH son ácido málico y KOH.
En otra realización preferida, dicho biofertilizante de la invención comprende (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04, CaCI2, concentrado soluble de melaza, ácido málico, KOH y polipropilenglicol. Más preferiblemente, dicho biofertilizante de la invención comprende (NH4)2S04 0,5-3, 5% (p/p), K2HP04 0,1 -1% (p/p), ZnS04-7H20 0,005-0,1 % (p/p), MnS04-H20 0,005-0,1 % (p/p), CuS04-5H20 0,001 -0,01% (p/p), MgS04-7H20 0,001 -0,01% (p/p), CaCI2-2H20 0,001 -0,01% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,05-2% (p/p), ácido málico 0,01 -0,1 % (p/p), KOH 0,005-1% (p/p) y polipropilenglicol 0,001 -0,1 % (p/p). Aún más preferiblemente, dicho biofertilizante de la invención comprende (NH4)2S04 1 ,5-2,5% (p/p), K2HP04 0,18-0,20% (p/p), ZnS04-7H20 0,01 -0,02% (p/p), MnS04-H20 0,01 -0,02% (p/p), CUS04-5H20 0,001 -0,002% (p/p), MgS04-7H20 0,003-0,004% (p/p), CaCI2-2H20 0,001 - 0,002% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,25-0,75% (p/p), ácido málico 0,035-0,045% (p/p), KOH 0,02-0,1% (p/p) y polipropilenglicol 0,005-0,01% (p/p).
En otra realización preferida, dicho biofertilizante comprende además KH2P04 y/o NH4CI.
En otra realización preferida, dicho biofertilizante comprende además uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. En otra realización aún más preferida, dicho biofertilizante comprende pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura.
La pasta de tomate es un producto natural utilizado como fuente de carbono en el medio de cultivo líquido en el que crecen las cepas de la invención.
El hidrolizado de colágeno es un producto natural utilizado como fuente de nitrógeno en el medio de cultivo líquido en el que crecen las cepas de la invención. El extracto de levadura natural es un producto natural rico en vitaminas especialmente del complejo B, aminoácidos y otros factores de crecimiento. Es utilizado como fuente de nutrientes en el medio de cultivo líquido en el que crecen las cepas de la invención.
En otra realización preferida, dicho biofertilizante además comprende KH2P04, NH4CI, pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. Más preferiblemente, dicho biofertilizante comprende KH2P04 0,05-0,3% (p/p), NH4CI 0,01 -2% (p/p), pasta de tomate 0,5-3% (p/p), hidrolizado de colágeno 0,01 -2% (p/p) y extracto de levadura 0,01 -2% (p/p).
La presente invención se refiere también a un método de estimulación del crecimiento de una planta, que comprende aplicar dicho biofertilizante líquido a dicha planta.
En una realización preferida de dicho método de estimulación del crecimiento de una planta, la aplicación de dicho biofertilizante líquido se selecciona del grupo que consiste en fertirrigación, pulverización y riego por goteo.
En otra realización preferida de dicho método de estimulación del crecimiento de una planta, la dosis de aplicación de dicho biofertilizante líquido es entre 5 y 30 L/ha. En una realización más preferida de dicho método de estimulación del crecimiento de una planta, dicha dosis de aplicación es entre 10 y 20 L/ha.
En otra realización preferida de dicho método de estimulación del crecimiento de una planta, dicha planta se selecciona del grupo que consiste en lechuga, brócoli y tomate.
La presente invención se refiere también a un método de obtención de un biofertilizante líquido, que comprende:
(a) cultivar una cepa de Azospiríllum brasilense depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de depósito CECT 5802 y una cepa de Pantoea dispersa depositada en la CECT con número de depósito CECT 5801 en unos primeros medios líquidos de fermentación separados y apropiados para cada cepa, a una temperatura entre 25eC y 35eC, bajo agitación y aireación y
(b) añadir en frío los caldos de fermentación obtenidos en la etapa anterior a un segundo medio fresco líquido, previamente esterilizado.
En una realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, dicho biofertilizante es acuoso, más en concreto una suspensión acuosa. En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, los primeros medios líquidos de fermentación comprenden al menos uno de los ingredientes seleccionados del grupo que consiste en pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. En otra realización más preferida de dicho método de obtención, los primeros medios líquidos de fermentación comprenden pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. La adición de estos productos de origen natural es especialmente apropiada para utilizar estos biofertilizantes en agricultura ecológica.
En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, los primeros medios líquidos de fermentación además comprenden al menos una sal inorgánica seleccionadas del grupo que consiste en K2HP04 KH2P04 y NH4CI. En otra realización más preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, los primeros medios líquidos de fermentación comprenden las sales inorgánicas K2HP04, KH2P04 y NH4CI.
En otra realización de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, los primeros medios líquidos de fermentación comprenden K2HP04, KH2P04, NH4CI, pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. Más preferiblemente, los primeros medios líquidos de fermentación comprenden K2HP04 1 -6% (p/p), KH2P04 0,01 -0,6% (p/p), NH4CI 0,02-4% (p/p), pasta de tomate 1 -6% (p/p), hidrolizado de colágeno 0,02-4% (p/p) y extracto de levadura 0,02-4% (p/p).
En otra realización de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, el segundo medio fresco líquido comprende al menos una sal inorgánica, un concentrado soluble de melaza, al menos un agente regulador del pH y al menos un agente antiespumante.
En una realización más preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, dicha sal inorgánica se selecciona del grupo que consiste en (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04 y CaCI2. En una realización más preferida del método de obtención del biofertilizante de la invención, el segundo medio fresco líquido comprende las sales inorgánicas (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04 y CaCI2. En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, el segundo medio fresco líquido comprende los agentes reguladores del pH ácido málico y KOH.
En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, dicho agente antiespumante es polipropilenglicol.
En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, el segundo medio fresco líquido comprende (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04, CaCI2, un concentrado soluble de melaza, ácido málico, KOH y polipropilenglicol. Más preferiblemente, el segundo medio fresco líquido comprende (NH4)2S04 1 -7% (p/p), K2HP04 0,001 -0,2% (p/p), ZnS04-7H20 0,001 -0,2% (p/p), MnS04-H20 0,001 -0,2% (p/p), CUS04-5H20 0,001 -0,02% (p/p), MgS04-7H20 0,001 -0,02% (p/p), CaCI2-2H20 0,001 -0,02% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,1 -2% (p/p), ácido málico 0,02-0,2% (p/p), KOH 0,01 - 2% (p/p) y polipropilenglicol 0,001 -0,2% (p/p). Más preferiblemente, el segundo medio fresco líquido comprende (NH4)2S04 3-5% (p/p), K2HP04 0,04-0,06% (p/p), ZnS04-7H20 0,02- 0,04% (p/p), MnS04-H20 0,02-0,04% (p/p), CuS04-5H20 0,002-0,004% (p/p), MgS04-7H20 0,006-0,008% (p/p), CaCI2-2H20 0,002-0,004% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,5- 1 ,5% (p/p), ácido málico 0,07-0,09% (p/p), KOH 0,04-0,2% (p/p) y polipropilenglicol 0,01 -
0,02% (p/p).
En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, se añade entre un 20% y 30% (p/p) de los caldos de fermentación obtenidos en la etapa (a) a dicho segundo medio fresco líquido.
En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, los cultivos de la etapa (a) se llevan a cabo durante un tiempo entre 8 y 20 horas.
En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, la velocidad de agitación en la etapa (a) es entre 400 y 800 r.p.m.
En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, la aireación en la etapa (a) es entre 0,5 y 2 L/min.
La presente invención se refiere también a un biofertilizante líquido obtenible según dicho método de obtención de la invención. Se han llevado a cabo ensayos de campo en condiciones de producción al aire libre y en invernadero con dicho biofertilizante líquido, con resultados muy satisfactorios. Dichos ensayos de campo se describen en los ejemplos 3-5.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos tienen el mismo significado que los comúnmente entendidos por un experto en el campo de la invención. Se pueden usar métodos y materiales similares y equivalentes a los descritos aquí en la práctica de la presente invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, el término "comprende", "que comprende" y sus variantes no son de naturaleza limitativa y, por lo tanto, no pretenden excluir otras características técnicas. El término "comprende", "que comprende" y sus variantes, a lo largo de la descripción y las reivindicaciones, incluye, específicamente, el término "consiste en", "que consiste en" y sus variantes.
Definiciones
En la presente memoria, el término“viabilidad” hace referencia a que los microorganismos del biofertilizante líquido mantienen su capacidad de reproducción, de colonización de las raíces y, por tanto, mantienen su capacidad de ejercer su función biofertilizante. Esta viabilidad significa que el biofertilizante es estable y funcional durante su almacenamiento en condiciones adecuadas. De forma particular, ambas cepas del biofertilizante líquido mantienen entre un 60% y un 70% de viabilidad celular al cabo de un año de conservación, a temperaturas no mayores de 30eC. Los términos“viabilidad”,“viable” y similares tienen, a efectos de la presente memoria, el mismo significado que los términos “estabilidad”, “estable” y similares.
En la presente memoria, el término“biofertilizante líquido acuoso” hace referencia a un biofertilizante líquido en el que el disolvente mayoritario es agua. Dicho biofertilizante líquido acuoso comprende al menos una sal inorgánica y un concentrado soluble de melaza y puede comprender ácidos, hidróxidos, polipropilenglicol y otros ingredientes. Ejemplos de otros ingredientes son: pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. Dicho biofertilizante líquido puede consistir en una formulación tamponada. En la presente memoria, el término“concentrado soluble de melaza” hace referencia a un producto obtenido de los procesos de fermentación industrial para la producción de levadura, alcohol y ácidos orgánicos sobre sustrato de melaza. La melaza se obtiene de los procedimientos de cristalización del azúcar y es un residuo de dicho proceso del cual no se puede obtener más azúcar por métodos físicos. La melaza se puede obtener de la caña de azúcar.
En la presente memoria, el término “agentes reguladores del pH” hace referencia a productos químicos que ajustan el pH de una disolución hasta un valor deseado o que son capaces de mantener el pH de una disolución dentro de un intervalo reducido. Ejemplos de agentes reguladores son los ácidos carboxílicos, ácidos dicarboxílicos, ácido málico, hidróxidos metálicos, tales como KOH, NaOH, etc.
En la presente memoria, el término“agente antiespumante” hace referencia a un producto químico que previene la formación de espuma en una disolución.
En la presente memoria, el término“hidrolizado de colágeno” hace referencia a un producto obtenido a partir de tejidos biológicos animales, como piel, huesos, espinas, escamas, de origen porcino, vacuno, de pollo, de pescado, etc. El colágeno presente en estos tejidos se somete a un proceso de hidrólisis que separa las cadenas polipeptídicas del colágeno. Después, estas cadenas son fragmentadas en segmentos más pequeños, utilizando productos químicos (hidrólisis química) o enzimas proteolíticos (hidrólisis enzimática). Es un producto utilizado en la preparación de medios de cultivo para microorganismos como fuente de nitrógeno.
En la presente memoria, el término“extracto de levadura” hace referencia a un extracto soluble en agua formado por el autolisado de células de levaduras. Es un producto rico en vitaminas especialmente del complejo B, aminoácidos y otros factores de crecimiento. Es utilizado en la preparación de medios de cultivo para microorganismos como fuente de nutrientes.
En la presente memoria, el término “fertirrigación” hace referencia a una técnica de aplicación de fertilizantes que permite la aplicación simultánea de agua y fertilizantes a través del sistema de riego. En la presente memoria, el término “pulverización” hace referencia a una técnica de aplicación de fertilizantes que distribuye un líquido en partículas.
DESCRIPCIÓN DE MODOS DE REALIZACIÓN Ejemplo 1. Obtención del biofertilizante líquido
Obtención de caldos de fermentación de las cepas
Se preparó un medio de cultivo tomate, un medio de cultivo que comprende pasta de tomate como fuente de carbono, hidrolizado de colágeno de piel de origen animal de uso fertilizante como fuente de nitrógeno orgánico y cuya composición es la que se describe en la Tabla 1.
La pasta de tomate era un producto estéril obtenido de tomates ( Solanum Lycopersicum L./Lycopersicum Sculentum “Mili’) enteros, triturados, tamizados, homogeneizados, concentrados, pasteurizados y envasados asépticamente (producto comercial“Concentrado de tomate 28/30 eBrix” de Mensajero Alimentación, S.L.). Este producto tenía 28-30 eBrix, contenía extracto seco 30-32% (p/p), pH 4, 0-4, 4, acidez (ácido cítrico) 1 ,6-2, 2, viscosidad Bostwick (20eC) 6-1 1 cm/30 segundos, luz de malla 0,6 mm y recuento Howard inferior a 60%. Los valores medios por 100 g de este producto eran: valor energético 92 Kcal/387 Kj, grasas totales 0,2 g, ácidos grasos saturados inferior a 0,1 g, hidratos de carbono 22 g, azúcares 12 g, fibra alimentaria 7 g, proteínas 5 g y sal inferior a 0,1 g.
El hidrolizado de colágeno era un producto en polvo constituido por una mezcla en polvo de aminoácidos y péptidos obtenida por hidrólisis química (producto comercial“Protifert P N 142 de Sicit 2000 S.p.A.). El producto era un polvo blanco-marfil, contenía materia seca 95% (p/p), nitrógeno total 14% (p/p), masa volumétrica 300 g/L, pH 6, 0-7, 5 en solución al 10% (p/p), estabilidad térmica superior a 200eC oxidación en aire estático y superior a 300eC en atmósfera inerte.
El extracto de levadura utilizado es un producto en polvo (producto comercial“Polvo del extracto de levadura” de Oxoid Ltd). El producto era un polvo beige pálido.
Tabla 1. Composición del medio de cultivo tomate
Figure imgf000019_0001
El pH del medio de cultivo tomate fue 7,0. El medio de cultivo tomate se esterilizó a 121 eC durante 30 minutos.
Con el medio de cultivo tomate se alcanzaron elevados conteos celulares en 12-14 horas de fermentación para ambas cepas. El medio de cultivo resulta muy económico y lo que es más importante, se alcanzan elevados conteos celulares del orden de 109-1010 células/mL en ambos casos.
Se comprobó la pureza de un aislado de la cepa Azospiríllum brasilense CECT 5802 tomando una ampolla de dicho aislado, sembrando una muestra de dicha ampolla en placas de medio Rojo Congo e incubando a 30°C durante 72 horas. Se tomó una porción del cultivo de esta placa con un asa, se inoculó en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml_, con 100 ml_ del medio de cultivo tomate y se incubó en agitación a 30°C durante 16 horas. Al cabo de este tiempo, se inoculó el contenido del matraz, que se encontraba en fase exponencial, en un termentador Braun Biotech BIOSTAT® B de 3 L con 1 ,9 L del medio de cultivo tomate. Se llevó a cabo la fermentación durante 16 horas a una velocidad de agitación de 600 r.p.m., una aireación de 2 L/min (1 v.v.m. (volumen de aire por volumen de medio por minuto)) y una temperatura de 30°C. Se dejó variar el pH libremente y alcanzó un valor de 6,8. Se alcanzó una concentración de 8,9x10® células/mL. La velocidad específica de crecimiento en fase exponencial (m) fue de 0,25 h 1.
Para la cepa Pantoea dispersa CECT 5801 , se siguió el mismo esquema de fermentación, con pequeñas modificaciones, que se describen a continuación. La pureza del aislado de la cepa se comprobó en medio de cultivo MacConkey, incubando un inoculo de dicha cepa en agitador orbital durante 12 horas. El cultivo en el termentador BIOSTAT® B se llevó a cabo durante 12 horas a una velocidad de agitación de 600 r.p.m., una aireación de 3 L/min (1 ,5 v.v.m.) y una temperatura de 30°C. Se dejó variar el pH libremente y alcanzó un valor de 6,9. Se alcanzó una concentración de 9,5x10® células/mL. La velocidad específica de crecimiento en fase exponencial para esta cepa fue de m = 0,57 h 1.
Figure imgf000020_0001
Se preparó un medio fresco. Los ingredientes que componen el medio fresco se describen en la Tabla 2. La concentración de los ingredientes en este ejemplo era el valor medio del rango indicado en la Tabla 2. El concentrado soluble de melaza era un producto líquido concentrado obtenido de los procesos de fermentación industrial para la producción de levadura, alcohol y ácidos orgánicos sobre sustrato de melaza y otros licores de tiraje, fuente de nitrógeno y sales minerales (producto comercial“Fluido abono nitrogenado orgánico” de ED&F Man Liquid Products Italia Srl). El producto era un líquido espeso de color marrón oscuro o negro, tenía una viscosidad de 200-2000 cp a 20eC, gravedad específica 1.15-1.35, punto de inflamación superior a 200eC, miscible en agua y temperatura de descomposición superior a 45eC y pH entre 5, 5-8, 5.
El polipropilenglicol era un polímero, un producto líquido (producto comercial “VORANOL*2000 L Polyol” de The Dow Chemical Company). El producto era un líquido incoloro, con punto de inflamación de 230eC COC, densidad de vapor (aire = 1 ) superior a 1 , peso específico (agua = 1 ) 1 ,01 , densidad 1 ,0 g/cm3, viscosidad dinámica 305-335 mPa-s a 25eC.
Tabla 2. Componentes del medio fresco
Figure imgf000021_0001
Se cargó un reactor de fermentación con agitación y control de temperatura con la cantidad de agua necesaria para obtener el volumen final de producto deseado. Dicha cantidad de agua necesaria fue aproximadamente 44% p/p. Se puso en marcha el agitador y se añadieron las sales, siguiendo el orden en el que dichas sales aparecen en la Tabla 2, hasta su completa disolución.
A continuación, se incorporaron el concentrado de melaza, el ácido málico y, por último, el polipropilenglicol, manteniéndose la agitación. Una vez obtenida una mezcla totalmente homogénea, se ajustó el pH del medio a 7,00, mediante la adición de potasa (KOH).
Por último, se esterilizó el medio fresco a 121 eC durante 20 minutos.
Obtención del biofertilizante líquido
Se dejó enfriar el medio fresco. Seguidamente, se añadieron los caldos de fermentación de las cepas Azospiríllum brasilense CECT 5802 (25% p/p) y Pantoea dispersa CECT 5801 (25% p/p), obtenidos según el procedimiento descrito en el apartado Obtención de caldos de fermentación de las cepas” de este ejemplo. Se añadieron dichos caldos de fermentación agitando lentamente hasta conseguir una mezcla homogénea.
Ejemplo 2. Evaluación de la viabilidad celular del biofertilizante líquido
Se comprobó periódicamente la viabilidad celular del biofertilizante líquido. Se comprobó la viabilidad celular de las cepas Azospiríllum brasilense CECT 5802 y Pantoea dispersa CECT 5801 en medio Rojo Congo y en medio MacConkey, respectivamente. El biofertilizante líquido conservó más del 60% de viabilidad celular al cabo de un año de conservación, a temperaturas no mayores de 30°C, de ambas cepas.
Ejemplo 3. Ensayo con el biofertilizante líquido en lechuga
Este ensayo se realizó al aire libre entre noviembre de 2018 y febrero de 2018 en Santomera, Murcia.
En algunos tratamientos de este ejemplo y de los ejemplos siguientes se utilizó el biofertilizante líquido obtenido en el Ejemplo 1.
En las Tablas 3 y 4 se muestran los resultados de producción obtenidos en el ensayo.
Tabla 3. Producción de lechuga por Tesis (tratamiento)
Figure imgf000022_0001
Tabla 4. Peso medio de lechugas por Tesis
Figure imgf000023_0001
Como se puede observar en las Tablas 3 y 4, el biofertilizante líquido de la invención, a 2,5 y 5 L/ha, obtiene rendimientos superiores tanto con respecto al testigo sin tratar como a la tesis con el abonado recomendado de acuerdo con las normas de producción integrada de la Región de Murcia (B.O.R.M., Orden 8024).
El biofertilizante líquido de la invención es eficaz para disminuir las necesidades de aporte de fertilización química ya que obtiene resultados similares o superiores a la fertilización química 100%.
Ejemplo 4. Ensayo con el biofertilizante líquido en brócoli
Este ensayo se realizó al aire libre entre noviembre de 2018 y febrero de 2019 en Santomera, Murcia. En las Tablas 5 y 6 se muestran los resultados de producción obtenidos en el ensayo.
Tabla 5. Producción de brócoli por Tesis
Figure imgf000023_0002
Tabla 6. Peso medio de brócolis por Tesis
Figure imgf000023_0003
Biofertilizante líquido 5 L/ha
Figure imgf000024_0001
346,6
Figure imgf000024_0002
15,0 %
Figure imgf000024_0003
Como se puede observar en las Tablas 5 y 6, el biofertilizante líquido de la invención, a 2,5 y 5 L/ha, obtiene rendimientos superiores con respecto al testigo sin tratar.
El biofertilizante líquido de la invención es eficaz para disminuir las necesidades de aporte de fertilización química ya que obtiene resultados superiores a la fertilización química 100%.
Ejemplo 5. Ensayo con el biofertilizante líquido en tomate
Este ensayo se realizó en invernadero entre septiembre de 2017 y mayo de 2018 en Mazarrón, Murcia. En la Tabla 7 se muestran los resultados de producción obtenidos en el ensayo.
Tabla 7. Producción de tomates por Tesis
Figure imgf000024_0004
Tabla 8. Fertilizantes químicos usados por tratamiento
Figure imgf000024_0005
El biofertilizante líquido de la invención, a 5 L/ha, obtiene un aumento de producción anual en kg/ha de un 12% en la tesis aplicada con el biofertilizante líquido de la invención sólo sin ningún tipo de aporte químico. En la tesis que se mantiene un 50% de la fertilización química, el aumento alcanza el 20%.
Para el tratamiento con abono químico convencional, el consumo de productos fertilizantes ha ascendido a 730 kg/ha (Tabla 8), que en la tesis de producto solo, sin aportes químicos, se sustituye totalmente por tan sólo 20 L/ha de biofertilizante líquido. En la tesis en la que se ha mantenido la mitad de la fertilización habitual, el ahorro ha sido de 365 kg/ha de fertilizantes, logrando un notable aumento productivo del 20%, aportando nada más que 10 L/ha de biofertilizante líquido.
REFERENCIA AL MATERIAL BIOLÓGICO DEPOSITADO
Las cepas de Azospiríllum brasilense y de Pantoea dispersa se depositaron el 9 de junio de 2003, según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes, en la Autoridad Internacional de Depósito (IDA) Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), por el depositante Probelte, S.A. El depositante identificó las cepas como“Azospiríllum brasilense M3” y“Pantoea dispersa C3”. Tras completar con éxito los ensayos de viabilidad de las cepas, la IDA aceptó las cepas, confirmó la fecha, anteriormente indicada, en la que la IDA recibió el depósito y asignó el número de depósito CECT 5802 y CECT 5801 , respectivamente, a dichas cepas.
La cepa Azospiríllum brasilense CECT 5802 se aisló de raíces de plantas de guisantes ( Pisum sativum) colectadas en la región de Murcia. Se comprobó, mediante bioensayos en laboratorio e invernadero, la capacidad de la cepa Azospiríllum brasilense CECT 5802 para estimular el crecimiento vegetal. La cepa Azospiríllum brasilense CECT 5802 fue la que mayor efecto estimulador del crecimiento produjo de los más de 50 aislados de bacterias fijadoras de nitrógeno ensayados. Se verificó la producción de ácido-3-indol acético y otras sustancias promotoras del crecimiento vegetal. Se detectó la presencia de otras fitohormonas del tipo citoquininas. En la producción de ácido-3-indol acético, se lograron valores de más del 95% de transformación del triptófano en medio tomate con 150 mg x L 1 de este aminoácido. Se comprobó también la actividad del enzima 1 -aminociclopropano 1 - carboxilato desaminasa presente en esta cepa, a través del crecimiento en medios con ácido 1 -aminociclopropano 1 -carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno.
La cepa Pantoea dispersa CECT 5801 se aisló de la rizosfera de plantas de Shorgum halepense colectadas en la región de Murcia. Se llevó a cabo la caracterización de los ácidos orgánicos producidos por la cepa Pantoea dispersa CECT 5801 y se comprobó que produce ácido glucónico mayoritariamente, así como otros ácidos orgánicos en pequeñas cantidades. La selección se efectuó a través su capacidad para estimular el crecimiento vegetal y de producir auxinas. Se determinó su capacidad para producir sideróforos. Se comprobó, mediante bioensayos en laboratorio e invernadero, la capacidad para estimular el crecimiento vegetal. Se comprobó también la actividad del enzima 1 -aminociclopropano 1 - carboxilato desaminasa presente en esta cepa, a través del crecimiento en medios con ácido 1 -aminociclopropano 1 -carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un biofertilizante líquido que comprende una cepa de Azospiríllum brasilense depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de depósito CECT 5802, una cepa de Pantoea dispersa depositada en la CECT con número de depósito CECT 5801 , al menos una sal inorgánica y un concentrado soluble de melaza.
2. El biofertilizante según la reivindicación 1 , en el que dicho biofertilizante es una suspensión acuosa.
3. El biofertilizante según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho biofertilizante tiene un pH entre 6 y 8.
4. El biofertilizante según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, que además comprende al menos un agente regulador del pH y al menos un agente antiespumante.
5. El biofertilizante según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en el que dicha sal inorgánica se selecciona del grupo que consiste en (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04 y CaCI2.
6. El biofertilizante según la reivindicación 5, que comprende las sales inorgánicas (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04 y CaCI2.
7. El biofertilizante según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, que comprende los agentes reguladores del pH ácido málico y KOH.
8. El biofertilizante según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que dicho agente antiespumante es polipropilenglicol.
9. El biofertilizante según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, que comprende (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04, CaCI2, concentrado soluble de melaza, ácido málico, KOH y polipropilenglicol.
10. El biofertilizante según la reivindicación 9, que comprende (NH4)2S04 0,5-3, 5% (p/p), K2HP04 0,1 -1% (p/p), ZnS04-7H20 0,005-0,1% (p/p), MnS04-H20 0,005-0,1% (p/p), CUS04-5H20 0,001 -0,01% (p/p), MgS04-7H20 0,001 -0,01 % (p/p), CaCI2-2H20 0,001 - 0,01 % (p/p), concentrado soluble de melaza 0,05-2% (p/p), ácido málico 0,01 -0,1% (p/p), KOH 0,005-1% (p/p) y polipropilenglicol 0,001 -0,1% (p/p).
1 1. El biofertilizante según la reivindicación 10, que comprende (NH4)2S04 1 ,5-2, 5% (p/p), K2HP04 0,18-0,20% (p/p), ZnS04-7H20 0,01 -0,02% (p/p), MnS04-H20 0,01 -0,02% (p/p), CUS04-5H20 0,001 -0,002% (p/p), MgS04-7H20 0,003-0,004% (p/p), CaCI2-2H20 0,001 - 0,002% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,25-0,75% (p/p), ácido málico 0,035- 0,045% (p/p), KOH 0,02-0,1 % (p/p) y polipropilenglicol 0,005-0,01% (p/p).
12. El biofertilizante según cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 , que además comprende KH2P04 y/o NH4CI.
13. El biofertilizante según cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, que además comprende uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura.
14. El biofertilizante según cualquiera de las reivindicaciones 1 -13, que además comprende pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura.
15. El biofertilizante según cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, que además comprende KH2P04, NH4CÍ, pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura.
16. El biofertilizante según la reivindicación 15, que comprende KH2P04 0,05-0,3% (p/p), NH4CI 0,01 -2% (p/p), pasta de tomate 0,5-3% (p/p), hidrolizado de colágeno 0,01 -2% (p/p) y extracto de levadura 0,01 -2% (p/p).
17. Un método de estimulación del crecimiento de una planta, que comprende aplicar a dicha planta un biofertilizante líquido según cualquiera de las reivindicaciones 1 -16.
18. El método según la reivindicación 17, en el que la aplicación de dicho biofertilizante líquido se selecciona del grupo que consiste en fertirrigación, pulverización y riego por goteo.
19. El método según la reivindicación 17 ó 18, en el que la dosis de aplicación de dicho biofertilizante líquido es entre 5 y 30 L/ha.
20. El método según la reivindicación 19, en el que dicha dosis de aplicación es entre 10 y 20 L/ha.
21. El método según cualquiera de las reivindicaciones 17-20, en el que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en plantas hortícolas, plantas ornamentales, plantas frutales y cereales.
22. Un método de obtención de un biofertilizante líquido, que comprende:
(a) cultivar una cepa de Azospiríllum brasilense depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de depósito CECT 5802 y una cepa de Pantoea dispersa depositada en la CECT con número de depósito CECT 5801 en unos primeros medios líquidos de fermentación separados y apropiados para cada cepa, a una temperatura entre 25eC y 35eC, bajo agitación y aireación y
(b) añadir en frío los caldos de fermentación obtenidos en la etapa anterior a un segundo medio fresco líquido, previamente esterilizado.
23. El método de obtención según la reivindicación 22, en el que dicho biofertilizante es una suspensión acuosa.
24. El método de obtención según la reivindicación 22 ó 23, en el que los primeros medios líquidos de fermentación comprenden al menos uno de los ingredientes seleccionados del grupo que consiste en pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura.
25. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en el que los primeros medios líquidos de fermentación comprenden pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura.
26. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-25, en el que los primeros medios líquidos de fermentación además comprenden al menos una sal inorgánica seleccionadas del grupo que consiste en K2HP04, KH2P04 y NH4CI.
27. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-26, en el que los primeros medios líquidos de fermentación comprenden las sales inorgánicas K2HP04, KH2P04 y NH4CI.
28. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-27, en el que los primeros medios líquidos de fermentación comprenden K2HP04, KH2P04, NH4CI, pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura.
29. El método de obtención según la reivindicación 28, en el que los primeros medios líquidos de fermentación comprenden K2HP04 1 -6% (p/p), KH2P04 0,01 -0,6% (p/p), NH4CI 0,02-4% (p/p), pasta de tomate 1 -6% (p/p), hidrolizado de colágeno 0,02-4% (p/p) y extracto de levadura 0,02-4% (p/p).
30. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-29, en el que el segundo medio fresco líquido comprende al menos una sal inorgánica, un concentrado soluble de melaza, al menos un agente regulador del pH y al menos un agente antiespumante.
31. El método de obtención según la reivindicación 30, en el que dicha sal inorgánica se selecciona del grupo que consiste en (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04 y CaCI2.
32. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-31 , en el que el segundo medio fresco líquido comprende las sales inorgánicas (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04 y CaCI2.
33. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 30-32, en el que el segundo medio fresco líquido comprende los agentes reguladores del pH ácido málico y KOH.
34. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 30-33, en el que dicho agente antiespumante es polipropilenglicol.
35. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-34, en el que el segundo medio fresco líquido comprende (NH4)2S04, K2HP04, ZnS04, MnS04, CuS04, MgS04, CaCI2, un concentrado soluble de melaza, ácido málico, KOH y polipropilenglicol.
36. El método de obtención según la reivindicación 35, en el que el segundo medio fresco líquido comprende (NH4)2S04 1 -7% (p/p), K2HP04 0,001 -0,2% (p/p), ZnS04-7H20 0,001 - 0,2% (p/p), MnS04-H20 0,001 -0,2% (p/p), CuS04-5H20 0,001 -0,02% (p/p), MgS04-7H20 0,001 -0,02% (p/p), CaCI2-2H20 0,001 -0,02% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,1 - 2% (p/p), ácido málico 0,02-0,2 % (p/p), KOH 0,01 -2% (p/p) y polipropilenglicol 0,001 -
0,2% (p/p).
37. El método de obtención según la reivindicación 36, en el que el segundo medio fresco líquido comprende (NH4)2S04 3-5% (p/p), K2HP04 0,04-0,06% (p/p), ZnS04-7H20 0,02- 0,04% (p/p), MnS04-H20 0,02-0,04% (p/p), CuS04-5H20 0,002-0,004% (p/p), MgS04-7H20 0,006-0,008% (p/p), CaCI2-2H20 0,002-0,004% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,5-1 , 5% (p/p), ácido málico 0,07-0,09% (p/p), KOH 0,04-0,2% (p/p) y polipropilenglicol 0,01 -0,02% (p/p).
38. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-37, en el que se añade entre un 20% y 30% (p/p) de los caldos de fermentación obtenidos en la etapa (a) a dicho segundo medio fresco líquido.
39. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-38, en el que los cultivos de la etapa (a) se llevan a cabo durante un tiempo entre 8 y 20 horas.
40. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-39, en el que la velocidad de agitación en la etapa (a) es entre 400 y 800 r.p.m.
41. El método de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 22-40, en el que la aireación en la etapa (a) es entre 0,5 y 2 L/min.
42. Un biofertilizante líquido obtenible según el método de obtención de las reivindicaciones
22-41 .
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