WO2020196742A1 - 免疫不全げっ歯類 - Google Patents

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    • A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases

Definitions

  • the present invention relates to rodents capable of reproducing the human innate immune system.
  • NOG mouse is known as a very excellent immunodeficient mouse (Patent Document 1).
  • Humanized NOG mice have been produced by transplanting human cells and tissues into NOG mice.
  • mice in which human granulocytes such as human neutrophils circulate peripherally for a long period of time are required.
  • there are mice transplanted with human hematopoietic stem cells and administered with human G-CSF protein Non-Patent Documents 1 and 2), but engraftment of human neutrophils is transient.
  • the number of mouse neutrophils also increases, the lack of specialization in the human innate immune system has become a major problem.
  • Eosinophils and basophils are natural immune system cells involved in allergic diseases. There are mice in which human eosinophils and human basophils differentiate (Non-Patent Documents 3 and 4). However, in all mice, only a small amount of human eosinophils and human basophils are differentiated, and there are no rodents that can maintain a sufficient amount over a long period of time.
  • An object of the present invention is to provide a humanized mouse capable of reproducing the human innate immune system for a long period of time without activating the mouse innate immune system.
  • human G-CSF cytokine which is known as an inducer of neutrophils
  • the human G-CSF gene is knocked into the mouse G-CSF receptor locus.
  • the function of the mouse G-CSF receptor was deleted.
  • mice in which human G-CSF was present in serum and the human hematopoietic system was reconstituted in immunodeficient mice were produced, and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows.
  • [3] A human G-CSF gene knock-in rodent of [2], which is a NOG mouse and whose official strain name is NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug Csf3r tm1 (CMV-CSF3) / Jic .
  • CMV-CSF3 Csf3r tm1
  • [4] Humanized rodents in which human neutrophils circulate peripherally, obtained by transplanting human hematopoietic stem cells into a human G-CSF gene knock-in rodent animal according to any one of [1] to [3]. Kinds of animals.
  • [5] A human pathogen infectious disease model rodent in which the humanized rodent of [4] is infected with a bacterium or a virus.
  • Human G-CSF is expressed and rodent G-CSF receptor is not expressed, including knocking in the human G-CSF gene at the G-CSF receptor locus of immunodeficient rodents.
  • Method for producing CSF gene knock-in rodent animal [7] The method for producing a human G-CSF gene knock-in rodent according to [6], wherein the rodent is a mouse.
  • the human G-CSF gene knock-in rodent animal of [7] whose official strain name is NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug Csf3r tm1 (CMV-CSF3) / Jic. How to make.
  • [12] Human pathogen infection model rodents including knocking in the human G-CSF gene at the G-CSF receptor locus of rodents, transplanting human hematopoietic stem cells, and further infecting bacteria or viruses. How to make an animal.
  • the mouse is a NOG mouse, and the official strain name is NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug Csf3r tm1 (CMV-CSF3) / Jic ,
  • human pathogen infection model rodent animal Manufacturing method including knocking in the human G-CSF gene at the G-CSF receptor locus of rodents, transplanting human hematopoietic stem cells, and further infecting bacteria or viruses. How to make an animal.
  • a human G-CSF gene that is a rodent animal according to any one of [1] to [3] and further lacks Fcer1g and Fcgr2b, which are constituent molecules of a receptor that binds to the Fc region of an antibody. Rodents that have been knocked into the G-CSF receptor locus of rodents and are further deficient in Fcer1g and Fcgr2b. [16] Created by crossing a rodent animal lacking Fcer1g and Fcgr2b, which are constituent molecules of a receptor that binds the rodent animal of any of [1] to [3] to the Fc region of an antibody.
  • An immunodeficient rodent animal in which a human G-CSF gene is knocked in at any of the G-CSF receptor gene loci of [1] to [3] and lacks the function of the G-CSF receptor is used in NOG mice.
  • the official strain name is NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug Csf3r tm1 (CMV-CSF3) / Jic , which is a mouse and lacks Fcer1g and Fcgr2b, which are constituent molecules of the receptor that binds to the Fc region of the antibody.
  • a human pathogen infectious disease model rodent in which the humanized rodent of [18] is infected with a bacterium or a virus.
  • Rodent animals in which the GM-CSF gene has been inserted and Fcer1g and Fcgr2b are deficient.
  • the rodent animal lost is an FcR KO mouse, and the mouse obtained by mating is a hIL-3 / hGM-CSF Tg, FcR KO mouse, [21] rodent animal.
  • a rodent of [20] which is a NOG mouse and whose official strain name is NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug Csf3r tm1 (CMV-CSF3) / Jic .
  • CMV-CSF3 / Jic .
  • Humanized rodents in which human eosinophils circulate peripherally obtained by transplanting human hematopoietic stem cells into a human G-CSF gene knock-in rodent animal according to any one of [20] to [23].
  • [25] A human pathogen infectious disease model rodent in which a human rodent is infected with a bacterium or a virus.
  • human IL in which Fcer1g and Fcgr2b, which are constituent molecules of the receptor that binds to the Fc region of the antibody, are further deleted.
  • Rodent animals lacking the molecules Fcer1g and Fcgr2b are FcR KO mice, and the mice obtained by mating are hIL-3 / hGM-CSF / hIL-5 Tg, FcR KO mice, [26] Or [27] rodents.
  • a rodent of [28], which is a NOG mouse and its official strain name is NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug Csf3r tm1 (CMV-CSF3) / Jic .
  • the human G-CSF gene of the present invention is a knock-in rodent animal in which the human G-CSF gene is knocked in at the G-CSF receptor gene locus of a rodent animal, and the rodent animal transplanted with human hematopoietic stem cells is a human in the periphery. It is a humanized rodent animal that circulates neutrophils and monocytes and reproduces the human immune system. Such rodents can be used for research on the human immune system and the like.
  • the mouse of the present invention is the first humanized mouse in which human neutrophils circulate in peripheral blood for a long period of time, and is useful for studying the innate defense mechanism against bacterial infection in humans. Furthermore, by infecting a pathogen, it can be used as a model rodent for human infectious diseases.
  • ROS active oxygen
  • the present invention is a knock-in rodent in which the human G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) gene has been knocked in.
  • the human G-CSF gene is knocked in at the G-CSF receptor gene locus originally possessed by the rodent animal, and as a result, the G-CSF receptor originally possessed by the rodent animal is expressed. It is not functioning, or even if it is expressed, it lacks function.
  • the knock-in rodent of the present invention can be produced by knocking in the human G-CSF gene while deleting the G-CSF receptor of the rodent in one step.
  • SEQ ID NO: 1 shows the DNA sequence of the human G-CSF gene
  • SEQ ID NO: 2 shows the DNA sequence of the mouse G-CSF receptor gene.
  • knock-in is a genetic engineering method in which a DNA sequence encoding a protein is inserted into a specific locus on the chromosome of an organism.
  • Human G-CSF can bind to the G-CSF receptor of rodents. Therefore, when the G-CSF receptor is expressed in a rodent animal in which human G-CSF is knocked in, when the human G-CSF gene knocked in in the rodent animal is expressed in the rodent organism, human G -CSF binds to the G-CSF receptor expressed in rodent animal neutrophil progenitor cells and the like, and rodent animal neutrophils can proliferate.
  • the knock-in rodent animal of the present invention since the G-CSF receptor has lost its function, the human G-CSF expressed in the knock-in rodent animal binds to the G-CSF receptor of the rodent animal. There is no such thing.
  • HSC hematopoietic stem cell
  • the human hematopoietic system is reconstituted in the body of the rodent animal.
  • the rodent is a humanized rodent in which the human hematopoietic system is reconstituted in its body.
  • human neutrophils and monocytes circulate peripherally.
  • the present invention includes a method for producing a knock-in rodent animal in which the human G-CSF gene is knocked in, which comprises knocking the human G-CSF gene into the G-CSF receptor locus of the rodent animal.
  • a knock-in rodent in which the human G-CSF gene has been knocked in includes a method for producing a rodent animal in which human HSC is transplanted and human neutrophils are differentiated and circulated in the periphery.
  • the present invention is a knock-in rodent animal in which the human G-CSF gene is knocked in at the G-CSF receptor locus of a rodent animal, and human HSC is transplanted to obtain human neutrophils in the periphery. Includes rodents that have become and circulate.
  • rodents are not limited, but mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, nutria, etc. are mentioned, and among them, mice are preferable.
  • the nucleotide sequence of the human G-CSF gene is shown in SEQ ID NO: 1
  • the nucleotide sequence of the mouse G-CSF receptor gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the humanized rodent animal in which human neutrophils circulate peripherally used in the present invention is a rodent animal that does not eliminate human cells such as human neutrophils by immunity, that is, an immune response to humans is inactivated. It is a dentate animal. Examples of such animals include rodents in which the immune function is reduced or deficient and the immune response to humans is inactivated. For example, immunodeficient rodents can be used.
  • Immunodeficient rodents are animals with reduced or deficient immune function, and are deficient in some or all of T cells, B cells, NK cells, dendritic cells, and macrophages. Immunodeficient rodents can be produced by irradiating the whole body with X-rays, or rodents genetically deficient in immune function can also be used.
  • immunodeficient mice examples include nude mice, NOD / SCID mice, Rag2 knockout mice, SCID mice administered with asialo GM1 antibody or TM ⁇ 1, and X-ray irradiated mice.
  • knockout animals hereinafter, dKO (double knockout) animals
  • dKO mice obtained by multiplying these NOD / SCID mice and Rag2 knockout mice with IL-2R ⁇ knockout
  • dKO mice Rost2 KO, IL-2R null
  • a dKO mouse having a genetic background of Balb / c is referred to as a Balb / c dKO mouse
  • a mouse having a genetic background of NOD is referred to as a NOD dKO mouse.
  • mice are not limited to these, and C57BL / 6, C3H, DBA2 and IQI strains, strains with SCID mutation and IL-2R ⁇ knockout, or strains with Rag2 knockout and IL-2R ⁇ knockout mutation, and IL- Since the phenotype of the Jak3 protein, which is responsible for signal transduction downstream of the common ⁇ chain of the two receptors, is similar to that of IL2R ⁇ null , knockout mice obtained by multiplying Rag2 knockout mice with Jak3 knockout, or SCID mutations and Jak3 knockouts Crossed knockout mice, inbred, non-inbred, and hybrid (F1 hybrid) mice obtained by mating them may also be used.
  • NK cells in order to exclude the influence of immune cells such as NK cells observed in the mouse, it is used in the present invention in addition to the embodiment in which the asialo GM1 antibody is administered to the SCID mouse as described above.
  • a mutation was introduced into the IL-2 receptor ⁇ chain gene, the IL-2 receptor ⁇ chain was deleted, and the SCID mutation of the gene involved in the rearrangement of the antigen receptor gene of T cells and B cells was detected. Genetically modified immunodeficient mice at both allelic loci are included.
  • NOG mice NOD / SCID / ⁇ c null (NOD / Shi-scid, IL-2R ⁇ KO mice)) and NSG mice, which are derived from NOD / SCID mice and knocked out the common ⁇ chain of IL-2 receptors, are such mice.
  • NOD / Scid / IL2R ⁇ null NOD.Cg-Prkdc scid IL2rg tm1Wjl / SzJ
  • NCG mouse NCG mouse
  • a mutation is introduced into the Jak3 gene, and the Jak3 is deficient, and the SCID mutation of the gene involved in the rearrangement of the antigen receptor genes of T cells and B cells is in both allelic immunodeficiency mouse NOJ mice ( NOD / Scid / Jak3 null (NOD.Cg-Prkdc scid Jal3 tm1card ) can also be used.
  • NOD / Scid / Jak3 null NOD.Cg-Prkdc scid Jal3 tm1card
  • the functions of the Prkdc gene and its gene product are deleted due to scid mutation, etc., and the normal function of the IL2R ⁇ gene product is lost due to the deletion or mutation of the IL2R ⁇ gene, or the functional defect of the gene downstream of signal transduction and its product.
  • NOG mice are a registered trademark
  • NOG mice are a registered trademark
  • the method for producing NOG mice is described in WO 2002/043477.
  • the method for producing NSG mice is described in Ishikawa F. et al., Blood 106: 1565-1573, 2005, and the method for producing NCG mice is described in Zhou J. et al. Int J Biochem Cell Biol 46: 49-55, 2014. , NOJ mice are produced by Okada S. et al., Int J Hematol 88: 476-482, 2008.
  • the method of knocking in the human G-CSF gene is not limited, and for example, knock-in can be performed by homologous recombination or genome editing.
  • Homologous recombination is a phenomenon in which two DNA molecules recombined with each other via the same base sequence in a cell, and is a method often used for recombination of organisms having huge genomic DNA.
  • a plasmid (called a targeting vector) in which other DNAs are linked is constructed by dividing the sequence of the target gene site in the center. That is, a human G-CSF gene is isolated, a construct in which the DNA of the gene is sandwiched between the homologous sequences of the upstream and downstream portions of the rodent animal G-CSF receptor is prepared, and this is inserted into a known vector. , Produce a targeting vector. Introduce into ES cells (embryonic stem cells) of immunodeficient rodents.
  • Homologous recombination causes a replacement between the rodent animal G-CSF receptor gene DNA and the same sequence portion on the targeting vector, and the other sandwiched DNA is contained in the target gene G-CSF receptor gene. Once integrated, the gene loses function.
  • ES cells are established, the ES cells are injected into rodent embryos or blastocysts, and chimeric embryos are transplanted into the uterus of pseudopregnant rodent animals to prepare chimeric mice.
  • an F1 individual having a human G-CSF gene knocked in at the G-CSF receptor locus of the rodent animal can be obtained. it can.
  • an immunodeficient rodent animal having a human G-CSF gene knocked in at the G-CSF receptor locus of a rodent animal can be obtained.
  • a vector for producing a targeting vector a vector that can be expressed in ES cells of rodent animals and can be transformed can be used, and an Escherichia coli-derived plasmid, retrovirus, lentivirus, adeno-associated virus, etc. Vaccinia virus and the like can be used.
  • a promoter may be linked upstream of the human G-CSF gene, and for example, a CMV promoter or the like can be used.
  • the targeting vector can be introduced into ES cells by a known electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, lipofection method, microinjection method, particle gun method, or the like.
  • the vector may contain a marker gene for selection, and examples of the marker gene include a hygromycin resistance gene, a neomycin resistance gene, and a puromycin resistance gene.
  • the marker gene may be removed after selection of the homologous recombinant, or can be removed by using a Cre-loxP meter or a Flp-frt system.
  • Stem cells such as rodent iPS cells can be used instead of ES cells.
  • Genome editing is a method of modifying a target gene using a site-specific nuclease.
  • ZFN zinc finger nuclease
  • Cas9 is a guide RNA (crRNA, tracrRNA) and nuclease containing a sequence complementary to the target sequence of the G-CSF receptor gene of rodents whose function is lost by cleavage.
  • a targeting vector containing the human G-CSF gene DNA that knocks in as donor DNA is injected into the fertilized egg of the immunodeficient rodent gene. In the fertilized egg, the rodent G-CSF receptor gene is deficient and the human G-CSF gene is knocked in instead.
  • a target sequence in the gene When disrupting the G-CSF receptor gene of rodents by genome editing, a target sequence in the gene may be selected and a guide RNA sequence containing a sequence complementary to the sequence may be designed.
  • the base length of guideRNA is preferably 20 or more.
  • Genome editing with CRSPR / Cas9 can be performed using a commercially available CRISPR / Cas9 tool.
  • the strain of the knock-in mouse in which the human G-CSF gene is knocked in at the G-CSF receptor locus of the NOG mouse is officially named NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug Csf3r tm1 (CMV-CSF3) / Jic. It is represented and abbreviated as hG-CSF KI.
  • the human hematopoietic stem cells By transplanting human hematopoietic stem cells into a knock-in rodent animal in which the human G-CSF gene thus obtained is knocked in at the G-CSF receptor gene locus of a rodent animal, the human hematopoietic stem cells become rodent. It is possible to obtain a humanized rodent animal that engrafts in an animal and has human neutrophils circulating in the periphery.
  • knock-in rodents with radiation before transplantation. At this time, it is preferable to irradiate with radiation of 0.5 to 1.5 Gy, preferably 0.8 to 1.3 Gy, and more preferably 1 Gy.
  • Transplantation of human hematopoietic stem cells is preferably performed via a vein, for example, via the tail vein.
  • the number of human hematopoietic stem cells to be transplanted depends on the weight of the rodent animal, but in the case of a mouse, for example, 10 3 to 10 6 cells, preferably 10 4 to 10 5 cells, and more preferably 4 to 5 ⁇ 10 4 cells are transplanted. do it.
  • Humanized rodents in which human neutrophils circulate peripherally can be obtained 2 to 20 weeks, preferably 3 to 16 weeks, and more preferably 4 to 12 weeks after transplantation.
  • Human neutrophils differentiated, increased, and circulated in peripheral blood. The proportion of human neutrophils is 4-12% 12 weeks after transplantation. In addition, human neutrophils have the ability to produce active oxygen.
  • Human neutrophils and monocytes differentiated, increased, and circulated in peripheral blood.
  • the proportion of human monocytes is 10-40% 12 weeks after transplantation.
  • cytokines derived from bone marrow cells are present in blood.
  • cytokines include IL-8, IL-6, IL-10, MCP-1, MIP1a, MIP-1b, IFNg and the like.
  • the knock-in rodent of the present invention transplanted with human hematopoietic stem cells having the above characteristics can reproduce the human innate immune system.
  • TLR2 ligand zymosan increases human neutrophils and increases human cytokine concentration.
  • bacteria such as Escherichia coli
  • human neutrophils increase, and emergency granulopoiesis that occurs during human bacterial infection is reproduced.
  • bacterial administration increases human cytokine concentration.
  • HSC human hematopoietic stem cell
  • Bacteria and viruses include pathogenic Escherichia coli, intestinal hemorrhagic Escherichia coli, Salmonella spp. , Welsche bacteria, norovirus, hepatitis A virus, hepatitis E virus and the like.
  • Human infection is caused by the human G-CSF gene of the present invention being knocked into the G-CSF receptor gene locus of rodents and human neutrophils infect peripherally circulating human rodents.
  • a model rodent animal of the disease can be made.
  • the model rodent can be used to study the infectious disease defense mechanism in humans, and can be used to search for new therapeutic methods and therapeutic agents.
  • the present invention deleted Fcer1g and Fcgr2b, which are constituent molecules of the receptor that binds to the Fc region of the antibody and the rodent animal in which the above human G-CSF gene was knocked in. It includes rodents in which the human G-CSF gene obtained by crossing rodents is knocked in at the G-CSF receptor locus of rodents and further lacks Fcer1g and Fcgr2b.
  • human neutrophils differentiate, increase, and circulate peripheral blood.
  • Transplantation of human hematopoietic stem cells may be performed by the above method.
  • rodents examples include rodents in which the immune function is weakened or deficient and the immune response to humans is inactivated.
  • immunodeficient rodents examples include the above-mentioned immunodeficient rodents. Examples include similar animals. Of these, mice, especially NOG mice, are preferable.
  • mice As mice, the above hG-CSFKI mice and FcRKO mice lacking Fcer1g and Fcgr2b, which are constituent molecules of the receptor that binds to the Fc region of the antibody (Inoue Yet al. Journal of immunology 2007; 179: 764- 774.) hG-CSF KI / FcR KO mice obtained by crossing) can be mentioned. It is also possible to generate hG-CSF KI / FcR KO mice by deleting the Fcer1g gene and Fcgr2b gene by genome editing.
  • the human G-CSF gene is knocked in at the G-CSF receptor locus of the NOG mouse, and Fcer1g and Fcgr2b are further deficient.
  • human neutrophils By transplanting human hematopoietic stem cells (CD34 + cells) into the mouse, human neutrophils are differentiated and increased, and peripheral blood is circulated. The proportion of human neutrophils is 15-20% 4 weeks after transplantation. In addition, human neutrophils have the ability to produce active oxygen.
  • CD34 + cells human hematopoietic stem cells
  • the present invention includes a human infectious disease model rodent in which the above-mentioned rodent is infected with a bacterium or a virus. Bacteria and viruses are as described above.
  • human IL-3 and GM-CSF genes are genomes.
  • the human IL-3 and GM-CSF genes obtained by crossing a rodent animal inserted into the rod and a rodent animal lacking Fcer1g and Fcgr2b, which are constituent molecules of a receptor that binds to the Fc region of an antibody, Includes rodents that have been inserted into the genome and are further deficient in Fcer1g and Fcgr2b.
  • human hematopoietic stem cells CD34 + cells
  • immunodeficient rodents examples include the above-mentioned immunodeficient rodents. Of these, mice, especially NOG mice, are preferable.
  • mice In the case of mice, hIL-3 / hGM-CSF Tg obtained by crossing hIL-3 / hGM-CSF Tg mouse (Ito R et al. Journal of immunology 2013; 191: 2890-2899.) And FcR KO mouse. , FcR KO mouse can be mentioned. It is also possible to delete the Fcer1g gene and Fcgr2b gene by genome editing to produce hIL-3 / hGM-CSF Tg and FcR KO mice.
  • human hematopoietic stem cells CD34 + cells
  • human eosinophils differentiate and increase, circulate peripheral blood, and 10 to 15% at 4 weeks after transplantation.
  • the present invention deleted Fcer1g and Fcgr2b, which are constituent molecules of receptors that bind to the Fc region of antibodies and rodent animals in which human IL-3, GM-CSF and IL-5 genes have been inserted into the genome.
  • Human IL-3, GM-CSF and IL-5 genes obtained by mating rodents are inserted into the rodent genome and further include rodents deficient in Fcer1g and Fcgr2b. To do.
  • human hematopoietic stem cells CD34 + cells
  • immunodeficient rodents examples include the above-mentioned immunodeficient rodents. Of these, mice, especially NOG mice, are preferable.
  • Rodent animals with human IL-3, GM-CSF and IL-5 genes inserted into their genomes secrete human IL-3, GM-CSF and IL-5 cytokines and eosinophils after human hematopoietic stem cell transplantation. , Basophils, mast cells and other human cells can differentiate.
  • mice In the case of mice, hIL-3 / obtained by mating hIL-3 / hGM-CSF / hIL-5 Tg mice (Ito R et al. JCI Insight. 2018 Nov 2; 3 (21)) and FcR KO mice. Examples include hGM-CSF / hIL-5 Tg and FcR KO mice. It is also possible to delete the Fcer1g gene and Fcgr2b gene by genome editing to produce hIL-3 / hGM-CSF / hIL-5 Tg, FcR KO mice.
  • human hematopoietic stem cells CD34 + cells
  • human eosinophils are differentiated and increased, and peripheral blood is circulated.
  • the proportion of human eosinophils is 20-30% 4 weeks after transplantation.
  • human basophils are differentiated and increased, and peripheral blood is circulated.
  • the proportion of human basophils is 4-8% 4 weeks after transplantation.
  • the present invention includes a human infectious disease model rodent in which the above-mentioned rodent is infected with a bacterium or a virus. Bacteria and viruses are as described above.
  • FIG. 23 shows the relationship between the mouse strain and the ratio of human granulocytes to human leukocytes.
  • Example 1 Human G-CSF knock-in mouse in which human neutrophils are differentiated 1.
  • KI targeting vector KI targeting in which the human G-CSF gene is placed directly under the cytomegalovirus (CMV) promoter, which is a systemic expression promoter, and sandwiched between the homologous sequences of 3.3 Kb upstream and 6.5 Kb downstream of the mouse G-CSF receptor region.
  • CMV cytomegalovirus
  • FIG. 2 shows the results of gene analysis.
  • the established mouse strain is officially represented by the official strain name NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug Csf3r tm1 (CMV-CSF3) / Jic, and is abbreviated as hG-CSF KI.
  • FIG. 15 summarizes the results of flow cytometric analysis of human CD45-positive leukocytes, monocytes, neutrophils, T cells, and B cells in the experiment described in FIG. Shown.
  • hG-CSF KI mice the proportion of human monocytes decreased and human neutrophils increased after Zymosan administration.
  • Human neutrophils also increased in NOG mice, but the value was as low as about 4%.
  • FIG. 18-1 shows the quantification results of mouse cytokines
  • FIG. 18-2 shows the quantification results of human cytokines. No difference was observed in mouse cytokines between NOG mice and hG-CSF KI mice, and human cytokines produced in IL-6, IL-1b, IL-8, MCP-1, MIP1a and TNFa in G-CSF KI mice. It was significantly enhanced.
  • the G-CSF KI mouse is a humanized mouse capable of analyzing the emergency granulopoiesis after bacterial infection and the innate immune response accompanied by the enhancement of human cytokines, and is useful as a therapeutic drug development model for bacterial infection-induced sepsis. It is conceivable that.
  • hG-CSF KI and FcR KO mice crossed with these FcR KO mice and hG-CSF KI mice were newly established and human hematopoietic stem cells were transplanted the ratio of human neutrophils in human leukocytes in the peripheral blood of the mice It was shown that hG-CSF KI mice increased by about 2 to 5%, whereas hG-CSF KI and FcR KO mice increased by about 4 times to 15 to 20% (Fig. 19).
  • Example 3 Enhancement of human eosinophils by mating with FcR KO mice hIL-3 / hGM-CSF Tg mice already reported by the present inventors (Ito R et al. Journal of immunology 2013; 191: 2890-2899.) And FcR KO mice were mated, and hIL-3 / hGM-CSF Tg and FcR KO mice were newly established.
  • hIL-3 / hGM-CSF / hIL-5 Tg mice Ito R et al. JCI Insight. 2018 Nov 2; 3 (21)
  • FcR KO mice were mated to hIL-3 / hGM-CSF.
  • human hematopoietic stem cells were newly established in / hIL-5Tg and FcRKO mice and transplanted into these mice, the ratio of human eosinophils in human leukocytes in the peripheral blood of the mice was hIL-3 / hGM-CSF Tg mouse.
  • hIL-3 / hGM-CSF / hIL-5 / FcR KO mice increased by about 2 times to 20 to 30%, compared with about 10 to 15% (Fig. 21).
  • Eosinophils differentiate from hematopoietic stem cells in the bone marrow and are increased by cytokines such as IL-5. Severe tissue infiltration is observed during the allergen-mediated inflammatory response locally, such as in lung tissue.
  • Human G-CSF knock-in rodents in which human neutrophils are differentiated, can be used for research on the human immune system and as a model mouse for human infectious diseases. Furthermore, by crossing FcR KO mice, it becomes possible to induce granulocytes more effectively, and it becomes possible to apply it to a highly sensitive infectious disease model and an allergy model. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

本発明は、ヒト造血幹細胞の長期生着を可能とするヒト化マウスの提供を目的とする。本発明はG-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインし、G-CSFレセプターの機能を欠損した免疫不全げっ歯類動物であって、ヒトG-CSFが発現しげっ歯類のG-CSFレセプターを発現しない、ヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト好中球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物である。

Description

免疫不全げっ歯類
　本発明は、ヒトの自然免疫系を再現できるげっ歯類動物に関する。
　非常に優れた免疫不全マウスとして、NOGマウスが知られている（特許文献１）。NOGマウスにヒトの細胞や組織を移植してヒト化NOGマウスが作製されている。ヒト自然免疫系を再現するためには、ヒト好中球等のヒト顆粒球が長期間末梢を循環するマウスが必要である。その目的のために、ヒト造血幹細胞を移植し、ヒトG-CSFタンパクを投与したマウスが存在しているが(非特許文献１、２)、ヒト好中球の生着は一過性であり、またマウスの好中球も増加するため、ヒトの自然免疫系に特化できていないことが大きな問題となっている。
　また好酸球や好塩基球は、アレルギー疾患に関与する自然免疫系細胞である。ヒト好酸球やヒト好塩基球が分化するマウスが存在する（非特許文献３、４）。しかしいずれのマウスにおいても少量のヒト好酸球及びヒト好塩基球が分化するのみであり、長期間に渡って十分な量維持されるげっ歯類は存在しない。
国際公報第WO2002/043477号
Tanaka S. et al., J Immunol. 2012 Jun 15;188(12):6145-55 Coughlan AM et al., Stem Cells Dev. 2016 Apr 1;25(7):530-41 Ito R et al. Journal of immunology 2013;191:2890-2899. Ito R et al. JCI Insight. 2018 Nov 2;3(21)
　本発明は、マウスの自然免疫系が活性化することなく、ヒトの自然免疫系を長期間再現可能とするヒト化マウスの提供を目的とする。
　本発明者らは、ヒト好中球の生着性を亢進させるために、好中球の誘導因子として知られるヒトG-CSFサイトカインを免疫不全マウスにノックインした。この際、ヒトG-CSFがマウスのG-CSFレセプターと交差反応してマウスの自然免疫系が活性化されるのを防ぐために、ヒトG-CSF遺伝子をマウスのG-CSFレセプター遺伝子座にノックインし、マウスG-CSFレセプターの機能を欠損させた。
　この結果、血清中にヒトG-CSFが存在し、免疫不全マウス中でヒト造血系が再構成されたヒト化マウスを作出し、本発明を完成させるに至った。
　さらに、前記の血清中にヒトG-CSFが存在し、免疫不全マウス中でヒト造血系が再構成されたヒト化マウスにおいて、抗体のFc領域に結合するレセプターを欠損させ、ヒト好中球の分化が前記マウスより亢進するヒト化マウスを作出し、他の本発明を完成させた。
また、ヒト好酸球や好塩基球が少量程度分化するhIL-3/hGM-CSF TgマウスおよびhIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tgマウスにおいて、抗体のFc領域に結合するレセプターを欠損させ、好酸球、好塩基球の分化が亢進するヒト化マウス作出し、他のさらに他の本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　G-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインし、G-CSFレセプターの機能を欠損した免疫不全げっ歯類動物であって、ヒトG-CSFが発現しげっ歯類のG-CSFレセプターを発現しない、ヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物。
[２]　マウスである、[１]のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物。
[３]　NOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Csf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、[２]のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物。
[４]　[１]～[３]のいずれかのヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト好中球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物。
[５]　[４]のヒト化げっ歯類動物に、細菌又はウイルスを感染させた、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物。
[６]　免疫不全げっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインすることを含む、ヒトG-CSFが発現しげっ歯類のG-CSFレセプターを発現しない、ヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物の作製方法。
[７]　げっ歯類動物がマウスである、[６]のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物の作製方法。
[８]　マウスがNOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、[７]のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物の作製方法。
[９]　げっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインし、さらにヒト造血幹細胞を移植することを含む、ヒト好中球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物の作製方法。
[１０]　げっ歯類動物がマウスである、[９]のヒト化げっ歯類動物の作製方法。
[１１]　マウスがNOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、[１０]のヒト化げっ歯類動物の作製方法。
[１２]　げっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインし、ヒト造血幹細胞を移植し、さらに細菌又はウイルスを感染させることを含む、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物の作製方法。
[１３]　げっ歯類動物がマウスである、[１２]のヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物の作製方法。
[１４]　マウスがNOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、[１３]のヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物の作製方法。
[１５]　[１]～[３]のいずれかのげっ歯類動物であって、さらに抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失させた、ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
[１６]　[１]～[３]のいずれかのげっ歯類動物を抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物を交配することによる作成された、請求項１５記載のヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
[１７]　[１]～[３]のいずれかのG-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインし、G-CSFレセプターの機能を欠損した免疫不全げっ歯類動物が、NOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表されるマウスであり、抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物がFcR KOマウスである、[１５]又は[１６]のげっ歯類動物。
[１８]　[１５]～[１７]のいずれかのげっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト好中球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物。
[１９]　[１８]のヒト化げっ歯類動物に、細菌又はウイルスを感染させた、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物。
[２０]　ヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子を挿入したげっ歯類動物であって、さらに抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失させ、ヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子が挿入され、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
[２１]　ヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子を挿入したげっ歯類動物と抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物を交配して得た、[２０]のヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子が挿入され、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
[２２]　ヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子を挿入したげっ歯類動物がhIL-3/hGM-CSF Tgマウスであり、抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物がFcR KOマウスであり、交配して得られるマウスがhIL-3/hGM-CSF Tg, FcR KOマウスである、[２１]のげっ歯類動物。
[２３]　NOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Csf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、[２０]のげっ歯類動物。
[２４]　[２０]～[２３]のいずれかのヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト好酸球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物。
[２５]　[２４]のヒト化げっ歯類動物に、細菌又はウイルスを感染させた、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物。
[２６]　ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子を挿入したげっ歯類動物において、さらに抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失させた、ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子がげっ歯類動物に挿入され、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
[２７]　ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子を挿入したげっ歯類動物と抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物を交配して得た、[２６]のヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子がげっ歯類動物に挿入され、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
[２８]　ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子を挿入したげっ歯類動物がhIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tgマウスであり、抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物がFcR KOマウスであり、交配して得られるマウスがhIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tg, FcR KOマウスである、[２６]又は[２７]のげっ歯類動物。
[２９]　NOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Csf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、[２８]のげっ歯類動物。
[３０]　[２６]～[２９]のいずれかのヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト好酸球及び好塩基球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物。
[３１]　[３０]のヒト化げっ歯類動物に、細菌又はウイルスを感染させた、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-062919号の開示内容を包含する。
　本発明の、ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされたノックインげっ歯類動物であって、ヒト造血幹細胞を移植したげっ歯類動物は、末梢において、ヒト好中球や単球が循環しており、ヒト免疫系を再現しているヒト化げっ歯類動物である。このようなげっ歯類動物は、ヒトの免疫系の研究等に用いることができる。また、本発明のマウスは、末梢血中にヒト好中球が長期にわたって循環する最初のヒト化マウスであり、ヒトの細菌感染に対する先天的な防御機構の研究に有用である。さらに、病原菌を感染させることにより、ヒト感染症のモデルげっ歯類動物として利用することができる。
　ヒト好酸球、好塩基球が高度に分化し、長期間維持されるヒト化マウスを用いることで、従来困難であった難治性喘息など重度なヒトアレルギー疾患を再現することが可能となる。
ヒトG-CSFノックインターゲティングベクターの構造を示す図である。 ヒトG-CSFノックインマウスのマウスG-CSFレセプター遺伝子型を示す図である。 ヒトG-CSFノックインマウス血清中のヒトG-CSF濃度（平均値）を示す図である。 ヒトG-CSFノックインマウス顆粒球上のマウスG-CSFレセプター発現欠失を示す図である。 ヒトG-CSFノックインマウス血中のマウス好中球数を示す図である。 ヒトG-CSFノックインマウスの放射線感受性を解析した結果を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化して12週後のヒトG-CSFノックインマウス血中ヒト細胞の割合を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化して4、8及び12週後のヒトG-CSFノックインマウス血中ヒトCD45+細胞の割合と細胞数を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化して4、8及び12週後のヒトG-CSFノックインマウス血中ヒト好中球の割合と細胞数を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化して4、8及び12週後のヒトG-CSFノックインマウス血中ヒト単球の割合と細胞数を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化したヒトG-CSFノックインマウスのヒト好中球の形態をギムザ染色により解析した結果を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化したヒトG-CSFノックインマウスのヒト好中球の活性酸素（ROS）産生能を解析した結果を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化したヒトG-CSFノックインマウスの血清中のヒトサイトカインの産生を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化したヒトG-CSFノックインマウスへzymosan投与4h後のヒト好中球の割合を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化したヒトG-CSFノックインマウスへzymosan投与4h後の各ヒト細胞の割合を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化したヒトG-CSFノックインマウスへzymosan投与4h後、血清中ヒトサイトカイン値を測定した図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化したヒトG-CSFノックインマウスへ大腸菌投与4h後の各ヒト細胞の割合を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化したヒトG-CSFノックインマウスへ大腸菌投与4h後、血清中マウスサイトカイン値を測定した結果を示す図である。 ヒト造血幹細胞によりヒト化したヒトG-CSFノックインマウスへ大腸菌投与4h後、血清中ヒトサイトカイン値を測定した結果を示す図である。 hG-CSF KI, FcR KOマウス末梢血中におけるヒト白血球中のヒト好中球の割合を示す図である。 hIL-3/hGM-CSF Tg, FcR KOマウス末梢血中におけるヒト白血球中のヒト好酸球の割合を示す図である。 hIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tg, FcR KOマウス末梢血中におけるヒト白血球中のヒト好酸球の割合を示す図である。 hIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tg, FcR KOマウス末梢血中におけるヒト白血球中のヒト好塩基球の割合を示す図である。 マウス系統とヒト白血球中に占めるヒト顆粒球の割合との関係を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされたノックインげっ歯類動物、及びヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）が移植されたヒト好中球が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物の作製
　本発明は、ヒトG-CSF（granulocyte-colony stimulating factor：顆粒球コロニー刺激因子）遺伝子がノックインされたノックインげっ歯類動物である。本発明のノックインげっ歯類動物において、ヒトG-CSF遺伝子は、げっ歯類動物が本来有するG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、その結果、げっ歯類動物が本来有するG-CSFレセプターは発現されないか、又は発現されたとしても機能を欠損している。本発明のノックインげっ歯類動物は、１ステップで、げっ歯類動物のG-CSFレセプターを欠損させつつ、ヒトG-CSF遺伝子をノックインして作製することができる。
　配列番号１にヒトG-CSF遺伝子のDNA配列を、配列番号２にマウスG-CSFレセプター遺伝子のDNA配列を示す。
　ここで、ノックイン(gene knock-in)とは、生物の染色体の特定の遺伝子座にタンパク質をコードするDNA配列を挿入する遺伝子工学的手法である。
　ヒトG-CSFはげっ歯類動物のG-CSFレセプターに結合し得る。従って、ヒトG-CSFをノックインしたげっ歯類動物中でG-CSFレセプターが発現している場合、げっ歯類動物にノックインしたヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類生体内で発現すると、ヒトG-CSFがげっ歯類動物の好中球前駆細胞等に発現しているG-CSFレセプターに結合し、げっ歯類動物の好中球が増殖し得る。しかしながら、本発明のノックインげっ歯類動物は、G-CSFレセプターが機能を失っているため、ノックインげっ歯類動物中で発現したヒトG-CSFはげっ歯類動物のG-CSFレセプターに結合することはない。
　ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされたノックインげっ歯類動物の血中には、ヒトG-CSFが存在し、該ノックインげっ歯類動物にヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）を移植した場合、げっ歯類動物体内でヒトG-CSFがヒト造血幹細胞を刺激し、ヒト好中球及び単球が分化し増殖し、末梢血中を循環する。すなわち、ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされたげっ歯類動物にヒトHSCを移植すると、該げっ歯類動物の体内では、ヒト造血系が再構成されている。この意味で、該げっ歯類動物は、その体内でヒト造血系が再構成されているヒト化げっ歯類動物である。該げっ歯類動物においては、ヒト好中球や単球が末梢を循環している。
　本発明は、ヒトG-CSF遺伝子をげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインすることを含む、ヒトG-CSF遺伝子がノックインされたノックインげっ歯類動物の作製法を含む。
　さらに、ヒトG-CSF遺伝子がノックインされたノックインげっ歯類動物にヒトHSCを移植することにより、ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされたノックインげっ歯類動物であって、ヒトHSCが移植され、末梢でヒト好中球が分化し循環しているげっ歯類動物を作製する方法を含む。
　さらに、本発明は、ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされたノックインげっ歯類動物であって、ヒトHSCが移植され、末梢でヒト好中球が分化し循環しているげっ歯類動物を含む。
　本発明において、げっ歯類動物は限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヌートリア等が挙げられ、この中でもマウスが好ましい。
　ヒトG-CSF遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、マウスG-CSFレセプター遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。
　本発明で用いるヒト好中球が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物は、ヒト好中球等のヒト細胞を免疫により排除しないげっ歯類動物、すなわち、ヒトに対する免疫反応が不活化したげっ歯類動物である。そのような動物として、免疫機能が低下又は欠損しており、ヒトに対する免疫反応が不活化したげっ歯類動物が挙げられ、例えば、免疫不全げっ歯類動物を用いることができる。
　免疫不全げっ歯類動物は、免疫機能が低下又は欠損した動物であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、NK細胞、樹状細胞、マクロファージの一部又は全てを欠損している動物である。免疫不全げっ歯類動物は、全身にＸ線を照射することにより作製することができ、又は遺伝的に免疫機能が欠損したげっ歯類動物を用いることもできる。
　免疫不全マウスとして、ヌードマウス、NOD/SCIDマウス、Rag2ノックアウトマウス、SCIDマウスにアシアロGM1抗体やTMβ1を投与したマウス、Ｘ線照射マウス等が挙げられる。また、これらのNOD/SCIDマウスやRag2ノックアウトマウスにIL-2Rγノックアウトを掛け合わせたノックアウト動物（以下、dKO（ダブルノックアウト）動物）も使用され得る。例えば、dKOマウス（Rag2 KO、IL-2Rnull）を用いることができる。本発明において、遺伝背景をBalb/cとするdKOマウスをBalb/c dKOマウスといい、遺伝背景をNODとするマウスをNOD dKOマウスという。また、マウスの遺伝背景はこれらに限らず、C57BL/6、C3H、DBA2やIQI系統でも、SCID変異とIL-2Rγノックアウト、又はRag2ノックアウトとIL-2Rγノックアウト変異を持つ系統でも、また、IL-2レセプターの共通γ鎖の下流でシグナル伝達を担うJak3タンパクの欠損もIL2Rγnullと表現型が同様であることから、Rag2ノックアウトマウスにJak3ノックアウトを掛け合わせたノックアウトマウスや、SCID変異とJak3ノックアウトを掛け合わせたノックアウトマウス、それらを交配して得た近交系、非近交系、交雑系（F1ハイブリッド）マウスでもよい。
　さらに、該マウス中で認められるNK細胞等の免疫細胞による影響を除外するために、前記のようにSCIDマウスにアシアロGM1抗体が投与されて使用される態様の他に、本発明において使用される別のマウスとして、IL-2レセプターγ鎖遺伝子に変異が導入されて、IL-2レセプターγ鎖が欠損し、かつ、Ｔ細胞及びＢ細胞の抗原レセプター遺伝子の再構成に関わる遺伝子のSCID変異が両対立遺伝子座位にある遺伝子改変免疫不全マウスが挙げられる。このようなマウスとしてNOD/SCIDマウス由来でIL-2レセプターの共通γ鎖をノックアウトしたマウスであるNOGマウス（NOD/SCID/γcnull（NOD/Shi-scid,IL-2RγKOマウス））、NSGマウス（NOD/Scid/IL2Rγnull(NOD.Cｇ－PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ))、NCGマウス（NOD-Prkdcem26Cd52IL2rgem26Cd22/NjuCrl)等が挙げられる。さらにJak3遺伝子に変異が導入されて、Jak3が欠損し、かつ、Ｔ細胞及びＢ細胞の抗原レセプター遺伝子の再構成に関わる遺伝子のSCID変異が両対立遺伝子座位にある遺伝子改変免疫不全マウスNOJマウス（NOD/Scid/Jak3null(NOD.Cg-PrkdcscidJal3tm1card)）も使用できる。以下、scid 変異などによりPrkdc 遺伝子、及びその遺伝子産物の機能が欠損し、IL2Rγ遺伝子の欠損や変異、又はシグナル伝達下流にある遺伝子、及びその産物の機能欠損によりIL2Rγ遺伝子産物の正常な機能が喪失したこれらの動物をNOGマウス（「NOG mouse」は登録商標）と指称し、宿主として使用することもできる。これらのマウスにおいてはリンパ球の存在が認められないため、NOGマウスはNK活性を示さず樹上細胞機能も欠損している。NOGマウスの作出方法は、WO2002/043477に記載されている。NSGマウスの作出方法は、Ishikawa F. et al., Blood 106:1565-1573, 2005に、NCGマウスの作出方法は、Zhou J. et al. Int J Biochem Cell Biol 46:49-55, 2014に、NOJマウスの作出方法は、Okada S. et al.,Int J Hematol 88:476-482, 2008に記載されている。
　ヒトG-CSF遺伝子をノックインする方法は限定されず、例えば、相同組換えやゲノム編集によりノックインすることができる。
　相同組換えとは、細胞内で２つのDNA分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象で、巨大なゲノムDNAを持つ生物の組換えにしばしば用いられる方法である。標的とする遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、他のDNAを連結したプラスミド（ターゲティングベクターという）を構築する。すなわち、ヒトG-CSF遺伝子を単離し、該遺伝子のDNAをげっ歯類動物のG-CSFレセプターの上流部分と下流部分の相同配列で挟んだコンストラクトを作製し、これを公知のベクターに挿入し、ターゲティングベクターを作製する。免疫不全げっ歯類動物のES細胞（胚性幹細胞）に導入する。相同組換えにより、げっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子DNAとターゲティングベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれた他のDNAが標的遺伝子であるG-CSFレセプター遺伝子中に組み込まれ、該遺伝子は機能を喪失する。このようにしてES細胞を樹立し、該ES細胞をげっ歯類動物胚又は胚盤胞に注入し、キメラ胚を偽妊娠させたげっ歯類動物の子宮に移植しキメラマウスを作製する。得られたキメラマウスを前記の免疫不全げっ歯類動物と交配することにより、げっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされたヒトG-CSF遺伝子をヘテロに有するF1個体を得ることができる。このヘテロの個体どうしを交配することにより、げっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされたヒトG-CSF遺伝子をヘテロに有する免疫不全げっ歯類動物を得ることができる。
　この際、ターゲティングベクターを作製するベクターとしては、げっ歯類動物のES細胞において発現可能で、形質転換可能なものを用いることができ、大腸菌由来のプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いることができる。
　ヒトG-CSF遺伝子の上流には、プロモータを連結させてもよく、例えば、CMVプロモータ等を用いることができる。
　ターゲティングベクターのES細胞への導入は、公知のエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等により行うことができる。
　ベクターは、選別のためのマーカー遺伝子を含んでいてもよく、マーカー遺伝子として、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。マーカー遺伝子は、相同組換え体の選択後に除去してもよく、Cre-loxP計やFlp-frt系を利用することにより除去することができる。
　ES細胞の代わりに、げっ歯類動物のiPS細胞等の幹細胞を用いることもできる。
　ゲノム編集は、部位特異的なヌクレアーゼを利用して標的遺伝子を改変する方法である。ゲノム編集の方法として、用いるヌクレアーゼにより、ZFN(zinc finger nuclease)法（Urnov, Fyodor D. et al., Natur, Vol 435, 2 June 2005, pp.642-651)、TALEN(Tale nuclease)法(Mahfouz, Magdy M et al., PNAS February 8, 2011, 108(6), pp.2623-2628)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9(Crispr Associated protein 9)(Jinek, Martin, et al., Science, Vol 337, 17 August 2012, pp.816-821)、CRISPR/Cas3等のCRISPR/Casシステムによる方法等が挙げられる。これらの方法には、ニッカーゼ改変型Casを用いた方法等のヌクレアーゼを改変した方法も含む。このうち、CRISPR/Cas9システムによる方法が好ましい。CRSPR/Cas9システムにおいては、例えば、切断することにより機能を欠損させたいげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子の標的配列に相補的な配列を含むguide RNA(crRNA、tracrRNA)及びヌクレアーゼであるCas9、並びにドナーDNAとしてノックインするヒトG-CSF遺伝子DNAを含むターゲティングベクターを免疫不全げっ歯類遺伝子の受精卵に注入する。受精卵内で、げっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子が欠損し、代わりにヒトG-CSF遺伝子がノックインされる。
　ゲノム編集によりげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子を破壊する場合は、遺伝子中の標的配列を選択し、該配列に相補的な配列を含むguide RNAの配列を設計すればよい。guide RNAの塩基長は、20以上が好ましい。CRSPR/Cas9によるゲノム編集は、市販のCRISPR/Cas9ツールを用いて行うことができる。
　ヒトG-CSF遺伝子がNOGマウスのG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされたノックインマウスの系統は公式には、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicという正式系統名で表され、hG-CSF KIと略される。
　このようにして得られたヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされたノックインげっ歯類動物に、ヒト造血幹細胞を移植することにより、ヒト造血幹細胞がげっ歯類動物中に生着し、ヒト好中球が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物を得ることができる。
　移植の前にノックインげっ歯類動物に放射線を照射することが好ましい。この際0.5～1.5Gy、好ましくは0.8～1.3Gy、さらに好ましくは1Gyの放射線を照射することが好ましい。
　ヒト造血幹細胞（CD34+細胞）の移植は、静脈経由で行うことが好ましく、例えば、尾静脈経由で行えばよい。移植するヒト造血幹細胞は、げっ歯類動物の体重によるが、例えばマウスの場合、103～106個、好ましくは104～105個、さらに好ましくは、4～5×104個を移植すればよい。移植後、2～20週、好ましくは3～16週、さらに好ましくは4～12週でヒト好中球が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物を得ることができる。
２．ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、ヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）が移植された、ヒト好中球が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物の特性
　１．で作製したヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、ヒトHSCを移植し、ヒト好中球が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物は、以下の特性を有する。
　血中にヒトG-CSFが存在し、細胞においてげっ歯類動物G-CSFレセプターが欠損している。このため、げっ歯類動物の好中球が減少しているか、又は存在しない。
　ヒト好中球が分化し、増加し、末梢血を循環している。ヒト好中球の割合は、移植後12週では、4～12％である。また、ヒト好中球は活性酸素産生能を有する。
　ヒト好中球及び単球が分化し、増加し、末梢血を循環している。ヒト単球の割合は、移植後12週では、10～40％である。
　骨髄細胞由来のヒトサイトカインが血中に存在する。サイトカインとして、IL-8、IL-6、IL-10、MCP-1、MIP1a、MIP-1b、IFNg等が挙げられる。
　上記の特性を有するヒト造血幹細胞を移植した本発明のノックインげっ歯類動物は、ヒトの自然免疫系を再現できる。
　例えば、TLR2リガンドであるzymosanを投与することによりヒト好中球が増加し、ヒトサイトカイン濃度が増加する。また、大腸菌等の細菌を投与することにより、ヒト好中球が増加し、ヒトの細菌感染時に起こるemergency granulopoiesisが再現される。また、細菌投与によりヒトサイトカイン濃度が増加する。
３．ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、ヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）が移植された、ヒト好中球が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物の利用
　ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、ヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）が移植された、ヒト好中球が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物は、ヒトの自然免疫系を再現することができ、ヒトの免疫学の研究に利用することができる。
　また、該げっ歯類動物に細菌を感染させることにより、ヒトの細菌感染に対する先天的な防御機構の研究に利用することができる。
　本発明は、ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、ヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）が移植された、ヒト好中球が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物に細菌やウイルスを感染させたヒト感染症モデルげっ歯類動物を包含する。細菌やウイルスとしては、ヒトに対して病原菌として作用する、病原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、サルモネラ属菌、カンンピロバクアー・ジェジェニ／コリ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオ、ボツリヌス菌、セレウス菌、ウエルシェ菌、ノロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス等が挙げられる。これらの病原菌を本発明のヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされヒト好中球が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物に感染させることにより、ヒト感染症のモデルげっ歯類動物を作製することができる。該モデルげっ歯類動物を用いてヒトの感染症防御機構を研究することができ、さらに、新しい治療方法や治療薬の探索に用いることができる。
４．hG-CSF KI, FcR KOげっ歯類動物
　本発明は、上記のヒトG-CSF遺伝子をノックインしたげっ歯類動物と抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物を交配して得られる、ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物を包含する。
　該げっ歯類動物にヒト造血幹細胞（CD34+細胞）を移植することにより、ヒト好中球が分化し、増加し、末梢血を循環する。ヒト造血幹細胞（CD34+細胞）の移植は、上記の方法で行えばよい。
　げっ歯類動物としては、免疫機能が低下又は欠損しており、ヒトに対する免疫反応が不活化したげっ歯類動物が挙げられ、このような免疫不全げっ歯類動物としては上記の免疫不全げっ歯類動物が挙げられる。この中でもマウス、特にNOGマウスが好ましい。
　マウスとしては、上記のhG-CSF KIマウス及び抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したFcR KOマウス（Inoue Y et al. Journal of immunology 2007;179:764-774.）を交配して得られるhG-CSF KI/FcR KOマウスが挙げられる。なお、Fcer1g遺伝子、Fcgr2b遺伝子をゲノム編集で欠失させ、hG-CSF KI/FcR KOマウスを作製することも可能である。
　該マウスは、ヒトG-CSF遺伝子がNOGマウスのG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損している。
　該マウスにヒト造血幹細胞（CD34+細胞）を移植することにより、ヒト好中球が分化し、増加し、末梢血を循環している。ヒト好中球の割合は、移植後4週では、15～20％である。また、ヒト好中球は活性酸素産生能を有する。
　本発明は、上記のげっ歯類動物に細菌やウイルスを感染させたヒト感染症モデルげっ歯類動物を包含する。細菌やウイルスは上記のとおりである。
５．hIL-3/hGM-CSF Tg, FcR KOげっ歯類動物及びhIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tg, FcR KOげっ歯類動物
　本発明は、ヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子がゲノムに挿入されたげっ歯類動物と抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物を交配して得られる、ヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子がゲノムに挿入され、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物を包含する。
　該げっ歯類動物にヒト造血幹細胞（CD34+細胞）を移植することにより、ヒト好酸球が分化し、増加し、末梢血を循環する。
　免疫不全げっ歯類動物としては上記の免疫不全げっ歯類動物が挙げられる。この中でもマウス、特にNOGマウスが好ましい。
　マウスの場合は、hIL-3/hGM-CSF Tgマウス（Ito R et al. Journal of immunology 2013;191:2890-2899.）とFcR KOマウスを交配して得られるhIL-3/hGM-CSF Tg, FcR KOマウスが挙げられる。なお、Fcer1g遺伝子、Fcgr2b遺伝子をゲノム編集で欠失させ、hIL-3/hGM-CSF Tg, FcR KOマウスを作製することも可能である。
　該マウスにヒト造血幹細胞（CD34+細胞）を移植することにより、ヒト好酸球が分化し、増加し、末梢血を循環し、移植後4週では、10～15％である。
　さらに、本発明は、ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子がゲノムに挿入されたげっ歯類動物と抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物を交配して得られる、ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子がげっ歯類動物のゲノムに挿入され、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物を包含する。
　該げっ歯類動物にヒト造血幹細胞（CD34+細胞）を移植することにより、ヒト好酸球及びヒト好塩基球が分化し、増加し、末梢血を循環する。
　免疫不全げっ歯類動物としては上記の免疫不全げっ歯類動物が挙げられる。この中でもマウス、特にNOGマウスが好ましい。ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子がゲノムに挿入されたげっ歯類動物は、ヒトIL-3, GM-CSF, IL-5サイトカインを分泌し、ヒト造血幹細胞移植後に好酸球、好塩基球、肥満細胞などのヒト細胞が分化し得る。
　マウスの場合は、hIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tgマウス（Ito R et al. JCI Insight. 2018 Nov 2;3(21)）とFcR KOマウスを交配して得られるhIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tg, FcR KOマウスが挙げられる。なお、Fcer1g遺伝子、Fcgr2b遺伝子をゲノム編集で欠失させ、hIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tg, FcR KOマウスを作製することも可能である。
　該マウスにヒト造血幹細胞（CD34+細胞）を移植することにより、ヒト好酸球が分化し、増加し、末梢血を循環している。ヒト好酸球の割合は、移植後4週では、20～30％である。
　また、該マウスにヒト造血幹細胞（CD34+細胞）を移植することにより、ヒト好塩基球が分化し、増加し、末梢血を循環している。ヒト好塩基球の割合は、移植後4週では、4～8％である。
　本発明は、上記のげっ歯類動物に細菌やウイルスを感染させたヒト感染症モデルげっ歯類動物を包含する。細菌やウイルスは上記のとおりである。
　図２３に、マウス系統とヒト白血球中に占めるヒト顆粒球の割合との関係を示す。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
[実施例１]　ヒト好中球が分化するヒトＧ－ＣＳＦノックインマウス
１．KIターゲティングベクターの作製
　ヒトG-CSF遺伝子を全身性発現プロモータであるサイトメガロウィルス（CMV）プロモータ直下に配置し、マウスG-CSFレセプター領域上流3.3 Kbと下流6.5 Kbの相同配列で挟んだKIターゲティングベクターを作製した。ターゲティングベクターの構造を図１に示す。
２．ヒトG-CSFノックインマウスの作製
　上記のように作製したターゲティングベクターをNOGマウスES細胞へエレクトロポレーションし、相同組換えES細胞を樹立したのちにキメラマウスを作製し、さらにNOGマウスとの交配によりF1マウスを樹立して、PCR法にてG-CSFレセプター遺伝子を解析した。図２に遺伝子解析の結果を示す。樹立したマウスの系統は公式には、NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicという正式系統名で表され、hG-CSF KIと略される。
３．hG-CSF KIマウスの評価
（１）ヒトG-CSFの発現の確認
　6～8週齢のhG-CSF KIマウス（ヘテロ、ホモ）及びNOGマウス血液をヘパリンにより採取して、遠心操作により血漿を分離後、ヒトG-CSFサイトカインレベルをHuman G-CSF Quantikine ELISA Kit (R&D systems)にて測定した。図３に結果を示す。KI/+ヘテロマウス及びKI/KIホモマウスでは、それぞれ1.69μg/ml及び1.87μg/mlとヒトG-CSFサイトカインが高濃度で発現していた。
（２）マウスG-CSFレセプターの発現
　6～8週齢のhG-CSF KIマウス及びNOGマウス血液をヘパリンにより採取し、赤血球を溶血させて白血球を分離し、抗マウスG-CSFレセプター抗体で染色後、発現をフローサイトメーターにて測定した。図４に結果を示す。KI/KIホモマウスの顆粒球はG-CSFRの発現が認められなかったことから、遺伝子破壊により発現が消失したことが示された。
（３）マウス好中球数の確認
　6～8週齢のhG-CSF KIマウス（ヘテロ、ホモ）及びNOGマウス血液をヘパリンにより採取し、赤血球を溶血させて白血球を分離し、抗マウスGr1抗体で染色後にフローサイトメトリーでマウス好中球数を解析した。図５に結果を示す。マウス好中球数は、KI/+で顕著に増加し、KI/KIでは非常に低値であったことから、KI/KIマウスにおいてマウスG-CSFレセプター欠損によるマウス好中球減少が示された。
４．ヒトG-CSFノックインマウスのヒト化
（１）放射線感受性テスト
　6～8週齢のhG-CSF KIマウスへ、1、1.5、2、2.5 Gyの放射線を照射し、1ヶ月以上マウスを観察して死亡率を計測した。図６に放射線感受性テストの結果を示す。hG-CSF KIマウスは、NOGマウスに比べて放射線感受性が高く、2Gyでは約９割程度のマウスが死亡し、1.5 Gyでも2割程度が死亡した。そのため1 Gyを至適な照射条件として採用することとした。
（２）ヒト好中球の確認
　6～8週齢のhG-CSF KIマウスへ1Gyの放射線を照射し、翌日に4～5×104個のヒトCD34+細胞（HSC:造血幹細胞）を尾静脈経由で移植した。移植後12週の末梢血を採取し、フローサイトメーターでヒト好中球、単球などのヒト白血球分画の割合を解析した。図７に結果を示す。ヒト白血球（CD45）中のCD66b+顆粒球及びCD33+単球がG-CSF KIマウスで増加しており、顆粒球の大部分はCD16+の好中球であることが示された。またこれら好中球、単球の分画はNOGマウスでは極めて低値であった。
（３）ヒト細胞のキメラ率の確認
　図７で示したヒトCD45+細胞（ヒト白血球）の割合及び細胞数を移植後4、8及び12週と経時的に解析した。図８に結果を示す。割合、細胞数ともにヒト化後4週でKIマウスにおいて高かったものの、以降は有意差が見られなかった。
（４）ヒト好中球の割合
　図７で示したヒトCD66b+CD16+細胞（ヒト好中球）の割合及び細胞数を移植後4、8及び12週と経時的に解析した。図９に結果を示す。割合、細胞数ともにヒト化後の全期間でKIマウスにおいて有意に高かった。
（５）ヒト単球の割合
　図７で示したヒトCD33+CD14+細胞（ヒト単球）の割合及び細胞数を移植後4、8及び12週と経時的に解析した。図１０に結果を示す。割合、細胞数ともにヒト化後の全期間でKIマウスにおいて有意に高かった。
（６）ヒト好中球の形態の確認
　ヒト化12週後のhG-CSF KIマウスから血液を採取し、ヒト好中球マーカーで染色後にセルソーターにて好中球分画を分離し、ギムザ染色により細胞形態を観察した。図１１に結果を示す。分葉核を有する好中球らしい形態を持った細胞が多数見られた。
（７）ヒト好中球の活性酸素産生能の測定
　ヒト化12週後のhG-CSF KIマウスから血液を採取し、白血球を単離後、in vitroにてLPS（1μg/ml）又はPMA(20 ng/ml)刺激し、ROS産性能をフローサイトメトリーにて解析した。図１２に結果を示す。LPS刺激にて2～3割、PMA刺激にて8～9割程度の好中球がROS陽性であり、これらヒト好中球はROS産生能を有することが示された。
（８）ミエロイド由来ヒトサイトカインの産生
　ヒト化16～20週後のhG-CSF KIマウス及びNOGマウスから血液を採取し、血漿を分離後、Cytokine Beads Array (CBA: BD Bioscience)にて各種ヒトサイトカインを定量した。図１３に結果を示す。IL-8、IL-6、IL-10、MCP-1、MIP1a、MIP-1b及びIFNgの産生がG-CSF KI マウスにおいて有意に亢進していた。
（９）TLR2リガンドであるzymosan投与後のヒト好中球の割合
　ヒト化12週後のhG-CSF KIマウス及びNOGマウスへ1mg/200μLのZymosan溶液を腹腔内投与し、4時間後に血液を採取してヒト好中球のフローサイトメトリー解析を行った。図１４に結果を示す。ヒト好中球はZymosan投与前で4%程度であったが、投与4時間後には20%程度まで増加した。
（１０）zymosan投与後のヒト細胞の割合
　図１４で記した実験におけるヒトCD45陽性白血球、単球、好中球、T細胞、B細胞のフローサイトメトリー解析の結果をまとめた結果を図１５に示す。hG-CSF KIマウスでは、Zymosan投与後にヒト単球の割合が減少し、ヒト好中球が増加した。NOGマウスでもヒト好中球は増加したが、4%程度と低値であった。
（１１）血清中ヒトサイトカインの測定
　図１４で記した実験において血漿を採取し、Cytokine Beads Array (CBA: BD Bioscience)にて血漿中の各種ヒトサイトカインを定量した。図１６に結果を示す。hG-CSF KIマウスでは、Zymosan投与後にヒトIL-10、IL-1b、IL-6、MCP-1、MIP1a、MIP-1b及びTNFa産生が顕著に増加し、ヒト好中球や単球・マクロファージを介した自然免疫応答がNOGマウスに比べて亢進することが示された。
（１２）大腸菌投与後のヒト細胞の割合
　ヒト化14週後のhG-CSF KIマウス及びNOGマウスへ4×108cfuの大腸菌溶液を腹腔内投与し、4時間後に血液を採取してヒト好中球、単球、B細胞のフローサイトメトリー解析を行った。図１７に結果を示す。ヒト好中球は大腸菌投与後顕著に増加し、ヒトの細菌感染時に起こるemergency granulopoiesisが再現された。
（１３）大腸菌投与後のサイトカインの測定
　図１７で記した実験において血漿を採取し、Cytokine Beads Array (CBA: BD Bioscience)にて血漿中の各種マウス及びヒトサイトカインを定量した。図１８－１にマウスサイトカインの定量結果を、図１８－２にヒトサイトカインの定量結果を示す。マウスサイトカインはNOGマウスとhG-CSF KIマウスで差は見られず、ヒトサイトカインは、IL-6、IL-1b、IL-8、MCP-1、MIP1a及びTNFaの産生がG-CSF KIマウスで有意に亢進した。これらのことから、G-CSF KIマウスは細菌感染後のemergency granulopoiesis、ヒトサイトカイン亢進を伴う自然免疫応答を解析できるヒト化マウスであり、細菌感染が誘発する敗血症の治療薬開発モデルとして有用であると考えられる。
[実施例２]　FcR KOマウスとの交配によるヒト好中球の亢進
　抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したFcR KOマウスが既に樹立されている（Inoue Y et al. Journal of immunology 2007;179:764-774.）。このFcR KOマウスとhG-CSF KIマウスを交配したhG-CSF KI, FcR KOマウスを新たに樹立し、ヒト造血幹細胞を移植したところ、マウス末梢血中におけるヒト白血球中のヒト好中球の割合はhG-CSF KIマウスで2～5％程度に対して、hG-CSF KI, FcR KOマウスでは15～20%と4倍程度増加することが示された(図１９)。好中球は骨髄で造血幹細胞からG-CSF依存的に分化し、感染などの刺激に応じて分化が亢進するとともに速やかに刺激の入った局所へ以降し、細菌を排除し得る。
[実施例３]　FcR KOマウスとの交配によるヒト好酸球の亢進
　本発明者らが既に報告しているhIL-3/hGM-CSF Tgマウス（Ito R et al. Journal of immunology 2013;191:2890-2899.）とFcR KOマウスを交配し、hIL-3/hGM-CSF Tg, FcR KOマウスを新たに樹立した。これらへヒト造血幹細胞を移植したところ、末梢血中のヒト好酸球の割合はhIL-3/hGM-CSF Tgマウスで2～5％程度に対して、hIL-3/GM-CSF Tg, FcR KOマウスでは10～15％と3倍程度増加することが示された。(図２０)
　また、同様にhIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tgマウス（Ito R et al. JCI Insight. 2018 Nov 2;3(21)）とFcR KOマウスを交配し、hIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tg, FcR KOマウスを新たに樹立し、これらへヒト造血幹細胞を移植したところ、マウス末梢血中におけるヒト白血球中のヒト好酸球の割合はhIL-3/hGM-CSF Tgマウスで10～15％程度に対して、hIL-3/hGM-CSF/hIL-5/FcR KOマウスでは20～30％と2倍程度増加することが示された(図２１)。好酸球は骨髄で造血幹細胞から分化し、IL-5などのサイトカインによって増加する。肺組織などの局所でアレルゲンを介した炎症応答の際に高度な組織浸潤が認められる。
[実施例４]　FcR KOマウスとの交配によるヒト好塩基球の亢進
　hIL-3/hGM-CSF/hIL-5 TgマウスおよびhIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tg, FcR KOマウスへヒト造血幹細胞を移植し、マウス末梢血中におけるヒト白血球中のヒト好塩基球の割合を測定したところ、hIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tgマウスで1～3％程度に対して、hIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tg, FcR KOマウスでは4～8％と2倍程度増加することが示された(図２２)。好塩基球は骨髄で造血幹細胞から分化し、IL-3などのサイトカインによって増加する。アレルギー炎症時に局所に移動して、炎症を増悪させる。
　ヒト好中球が分化するヒトG-CSFノックインげっ歯類はヒト免疫系の研究やヒト感染症モデルマウスとして利用することができる。さらにFcR KOマウスを掛け合わせることにより、より効果的に顆粒球を誘導することが可能となり、高感度感染症モデルやアレルギーモデルへの応用が可能となる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (31)

  1. 　G-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインし、G-CSFレセプターの機能を欠損した免疫不全げっ歯類動物であって、ヒトG-CSFが発現しげっ歯類のG-CSFレセプターを発現しない、ヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物。
  2. 　マウスである、請求項１記載のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物。
  3. 　NOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、請求項２記載のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト好中球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物。
  5. 　請求項４記載のヒト化げっ歯類動物に、細菌又はウイルスを感染させた、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物。
  6. 　免疫不全げっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインすることを含む、ヒトG-CSFが発現しげっ歯類のG-CSFレセプターを発現しない、ヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物の作製方法。
  7. 　げっ歯類動物がマウスである、請求項６記載のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物の作製方法。
  8. 　マウスがNOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、請求項７記載のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物の作製方法。
  9. 　げっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインし、さらにヒト造血幹細胞を移植することを含む、ヒト好中球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物の作製方法。
  10. 　げっ歯類動物がマウスである、請求項９記載のヒト化げっ歯類動物の作製方法。
  11. 　マウスがNOGマウスであり、正式系統名がNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Csf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、請求項１０記載のヒト化げっ歯類動物の作製方法。
  12. 　げっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインし、ヒト造血幹細胞を移植し、さらに細菌又はウイルスを感染させることを含む、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物の作製方法。
  13. 　げっ歯類動物がマウスである、請求項１２記載のヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物の作製方法。
  14. 　マウスがNOGマウスであり、正式系統名がNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Csf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、請求項１３記載のヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物の作製方法。
  15. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のげっ歯類動物であって、さらに抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失させた、ヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
  16. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のげっ歯類動物を抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物を交配することによる作成された、請求項１５記載のヒトG-CSF遺伝子がげっ歯類動物のG-CSFレセプター遺伝子座にノックインされ、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
  17. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のG-CSFレセプター遺伝子座にヒトG-CSF遺伝子をノックインし、G-CSFレセプターの機能を欠損した免疫不全げっ歯類動物が、NOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表されるマウスであり、抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物がFcR KOマウスである、請求項１５又は請求項１６記載のげっ歯類動物。
  18. 　請求項１５～１７のいずれか１項に記載のげっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト好中球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物。
  19. 　請求項１８記載のヒト化げっ歯類動物に、細菌又はウイルスを感染させた、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物。
  20. 　ヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子を挿入したげっ歯類動物であって、さらに抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失させ、ヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子が挿入され、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
  21. 　ヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子を挿入したげっ歯類動物と抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物を交配して得た、請求項２０記載のヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子が挿入され、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
  22. 　ヒトIL-3及びGM-CSF遺伝子を挿入したげっ歯類動物がhIL-3/hGM-CSF Tgマウスであり、抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物がFcR KOマウスであり、交配して得られるマウスがhIL-3/hGM-CSF Tg, FcR KOマウスである、請求項２１記載のげっ歯類動物。
  23. 　NOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、請求項２０記載のげっ歯類動物。
  24. 　請求項２０～２３のいずれか１項に記載のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト好酸球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物。
  25. 　請求項２４記載のヒト化げっ歯類動物に、細菌又はウイルスを感染させた、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物。
  26. 　ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子を挿入したげっ歯類動物において、さらに抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失させた、ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子がげっ歯類動物に挿入され、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
  27. 　ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子を挿入したげっ歯類動物と抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物を交配して得た、請求項２６記載のヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子がげっ歯類動物に挿入され、さらにFcer1gとFcgr2bが欠損しているげっ歯類動物。
  28. 　ヒトIL-3、GM-CSF及びIL-5遺伝子を挿入したげっ歯類動物がhIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tgマウスであり、抗体のFc領域に結合するレセプターの構成分子であるFcer1gとFcgr2bを欠失したげっ歯類動物がFcR KOマウスであり、交配して得られるマウスがhIL-3/hGM-CSF/hIL-5 Tg, FcR KOマウスである、請求項２６又は２７に記載のげっ歯類動物。
  29. 　NOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugCsf3rtm1(CMV-CSF3)/Jicと表される、請求項２８記載のげっ歯類動物。
  30. 　請求項２６～２９のいずれか１項に記載のヒトG-CSF遺伝子ノックインげっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト好酸球及び好塩基球が末梢を循環しているヒト化げっ歯類動物。
  31. 　請求項３０記載のヒト化げっ歯類動物に、細菌又はウイルスを感染させた、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物。
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