WO2022138928A1 - ヒト樹状細胞が分化するヒトｆｌｔ３ｌトランスジェニックげっ歯類動物 - Google Patents

ヒト樹状細胞が分化するヒトｆｌｔ３ｌトランスジェニックげっ歯類動物 Download PDF

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WO2022138928A1
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human
mouse
rodent animal
gene
flt3l
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亮治 伊藤
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公益財団法人実験動物中央研究所
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a rodent animal capable of reproducing the human immune system.
  • NOG mice are known as very excellent immunodeficient mice (Patent Document 1).
  • Humanized NOG mice have been produced by transplanting human cells and tissues into NOG mice.
  • a mouse in which a human G-CSF gene is knocked in and human hematopoietic stem cells are transplanted in order to reproduce the human innate immune system has been reported (Patent Document 2).
  • DCs Dendritic cells
  • B cells B cells, NK cells, NKT cells and the like, and plays a central role in the immune response.
  • FLT3L Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand acts on hematopoietic progenitor cells including stem cells, and acts as an inducer of dendritic cell proliferation and maturation together with colony-stimulating factors such as G-CSF and GM-CSF.
  • An object of the present invention is to provide a humanized mouse model in which a functional human immune cell system is reconstructed by differentiating human dendritic cells and a method for producing the same.
  • Human dendritic cells could hardly be detected in conventional humanized mice. That is, the human immune cell line was not reconstructed.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a humanized rodent model in which a functional human immune cell system is reconstructed by differentiating human dendritic cells, and to provide the rodent model.
  • Dendritic cells are cells that play a central role in the immune response.
  • Humanized mice in which lymphocytes and neutrophils circulate by transplanting human hematopoietic stem cells into immunodeficient mice have been known, but in conventional humanized mice, the human immune cell system is completely reconstituted. No human dendritic cells could be detected.
  • the present inventor transgenics a human FLT3L gene into an immunodeficient mouse, further knocks out the mouse FLT3 gene, and transplants human hematopoietic stem cells into the mouse, whereby human dendritic cells are proliferated and maintained.
  • a humanized mouse can be produced and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the immunodeficient rodent animal of [1] which is a mouse.
  • [3] Immunodeficient rodents of [2] which are SCID mutant mice, RAG1 knockout mice, RAG2 knockout mice or NOD / SCID mice.
  • the human FLT3L gene is transgenic and rodent, including mating a rodent with a transgenic human FLT3L gene and a rodent animal with a knocked-out FLT3 gene originally present in the rodent.
  • Human dendritic cells differentiate and proliferate, including transplanting human hematopoietic stem cells into immunocompromised rodents in which the human FLT3L gene has been transgenic and the FLT3 gene originally possessed by rodents has been knocked out.
  • the present invention is as follows.
  • [12] A human pathogen infectious disease model rodent animal in which a humanized rodent animal of [5] is infected with a bacterium or a virus.
  • Humans comprising transplanting human hematopoietic stem cells into immunodeficient rodents in which the human FLT3L gene has been transgenic and the FLT3 gene originally possessed by rodents has been knocked out, and further infected with bacteria or viruses.
  • Pathogen infection model How to make rodent animals.
  • the rodent animal of the present invention is transgenic and FLT3 is knocked out, and a human hematopoietic stem cell is transplanted into the rodent animal, blood, Human dendritic cells proliferate and are maintained in the spleen, bone marrow, skin, liver and lungs. Furthermore, antigen-specific IgM antibody and IgG antibody are produced after antigen immunization. That is, it reproduces the human immune system.
  • Such rodents can be used for research on the human immune system and the like.
  • the rodent animal of the present invention is useful for studying the innate defense mechanism against human bacterial and viral infections.
  • the rodent animal of the present invention can be used as a human tumor immune system reconstruction model rodent by engrafting a human tumor cell line or a patient-derived tumor and administering an immune checkpoint inhibitor or the like. can.
  • it can be used as a vaccine evaluation model by immunizing a virus-constituting protein or peptide or a bacterial-constituting protein or peptide to produce T cells or antibodies specific to the virus or bacterium.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the structure of the transgenic vector used for the production of a human FLT3L Tg mouse. It is a figure which shows the human cell chimera rate when the human hematopoietic stem cell is transplanted into the human FLT3L Tg mouse. It is a figure which shows the engraftment of the human CD45 + cell when the human hematopoietic stem cell is transplanted into the human FLT3L Tg mouse. It is a figure which shows the engraftment of the human CD45 + cell when the human hematopoietic stem cell is transplanted into the NOG hFLT3L Tg / mFLT3 KO mouse.
  • the invention is a rodent animal in which the human FLT3L (Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand) gene is transgenic and the FLT3 gene originally possessed by the rodent animal is knocked out.
  • transgenic is a genetic engineering method for inserting a DNA sequence encoding a protein into the chromosome of an organism. Inserting a gene into an animal is said to be transgenic.
  • knockout is a genetic engineering method in which all or a part of a gene is deleted and the function of the gene is lost.
  • the rodents in which the human FLT3L (Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand) gene is transgenic and the rodent animal FLT3 gene is knocked out are the rodents and rodents in which the human FLT3L gene is transgenic. It can be produced by mating a rodent animal in which the FLT3 gene has been knocked out.
  • FLT3L acts on hematopoietic progenitor cells including stem cells, and acts as an inducer of dendritic cell proliferation and maturation together with colony-stimulating factors such as G-CSF and GM-CSF.
  • FLT3 (CD135) is a receptor tyrosine kinase that plays a role in the proliferation and survival of hematopoietic stem cells and the degradation of early B lymphoid progenitor cells.
  • the FLT3L protein binds to the receptor FLT3 protein and activates the proliferation of cells carrying the FLT3 protein.
  • the FLT3 protein is known to be expressed on the cell surface of acute myeloid leukemia and acute lymphocytic leukemia. By knocking out the FLT3 gene, the FLT3 receptor (FLT3 protein) is deleted.
  • the expressed human FLT3L protein binds to the FLT3 protein of rodent myeloid cells, and rodent myeloid cells proliferate to cause myeloid leukemia. It is presented and it is not possible to produce a humanized rodent animal.
  • the FLT3 gene originally possessed by rodents is knocked out, and the FLT3 receptor is disrupted to prevent the development of leukemia symptoms and avoid this problem.
  • rodents are not limited, but mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, nutria and the like can be mentioned, and among these, mice are preferable.
  • the humanized rodent animal in which the human dendritic cells are differentiated used in the present invention is a rodent animal that does not eliminate human dendritic cells by immunity, that is, a rodent animal in which the immune response to humans is inactivated.
  • rodents with reduced or deficient immune function and inactivated immune response to humans include rodents with reduced or deficient immune function and inactivated immune response to humans, and for example, immunodeficient rodents can be used.
  • immunodeficient mice examples include nude mice, NOD / SCID mice, Rag1 knockout mice, Rag2 knockout mice, SCID mice administered with asialo GM1 antibody or TM ⁇ 1, mice irradiated with X-rays, and the like.
  • knockout animals hereinafter referred to as dKO (double knockout) animals
  • dKO mice obtained by multiplying these NOD / SCID mice, Rag1 knockout mice, and Rag2 knockout mice with IL-2R ⁇ knockout
  • dKO mice Rost2 KO, IL-2R null
  • a dKO mouse having a genetic background of Balb / c is referred to as a Balb / c dKO mouse
  • a mouse having a genetic background of NOD is referred to as a NOD dKO mouse
  • the genetic background of mice is not limited to these, and C57BL / 6, C3H, DBA2 and IQI strains also have SCID mutations and IL-2R ⁇ knockouts, Rag1 knockouts and IL-2R ⁇ knockouts, or Rag2 knockouts and IL-2R ⁇ knockout mutations. It may be a system.
  • Jak3 protein which is responsible for signal transduction downstream of the common ⁇ chain of the IL-2 receptor, has the same phenotype as IL2R ⁇ null
  • knockout mice and Rag1 knockout mice obtained by multiplying Rag2 knockout mice with Jak3 knockout mice.
  • Knockout mice obtained by multiplying Jak3 knockout with Jak3 knockout, knockout mice obtained by multiplying SCID mutation and Jak3 knockout, or inbred, non-inbred, and hybrid (F1 hybrid) mice obtained by crossing them may be used.
  • NK cells in order to exclude the influence of immune cells such as NK cells observed in the mouse, it is used in the present invention in addition to the embodiment in which the asialo GM1 antibody is administered to the SCID mouse as described above.
  • a mutation was introduced into the IL-2 receptor ⁇ chain gene, the IL-2 receptor ⁇ chain was deleted, and the SCID mutation of the gene involved in the rearrangement of the antigen receptor gene of T cells and B cells was observed. Genetically modified immunodeficient mice in both allogeneic loci are included.
  • NOG mice NOD / SCID / ⁇ c null (NOD / Shi-scid, IL-2R ⁇ KO mice)) and NSG mice, which are derived from NOD / SCID mice and knocked out the common gamma chain of IL-2 receptors, are such mice.
  • NOD / Scid / IL2R ⁇ null NOD.Cg-Prkdc scid IL2rg tm1Wjl / SzJ
  • NCG mice NOD-Prkdc em26Cd52 IL2rg em26Cd22 / NjuCrl
  • NOG mice These animals can also be referred to as NOG mice (“NOG mouse” is a registered trademark) and used as a host. Since the presence of lymphocytes is not observed in these mice, NOG mice do not show NK activity and lack dendritic cell function.
  • the method for producing NOG mice is described in WO2002 / 043477.
  • the method for producing NSG mice is described in Ishikawa F. et al., Blood 106: 1565-1573, 2005, and the method for producing NCG mice is described in Zhou J. et al. Int J Biochem Cell Biol 46: 49-55, 2014. , NOJ mice are produced by Okada S. et al., Int J Hematol 88: 476-482, 2008.
  • the immunodeficient mice used in the present invention include RAG1 knockout mice and RAG2 knockout mice.
  • Methods for transgenicizing the human FLT3L gene and methods for knocking out the FLT3 gene in rodent animals are not limited, and are not limited, for example. It can be performed by microinjection, homologous recombination, gene editing, etc.
  • the nucleotide sequence of the human FLT3L gene is shown in SEQ ID NO: 1.
  • Knockout of the mouse FLT3 gene can be performed by deleting all or part of the FLT3 gene.
  • all or part of exon 1 of the mouse FLT3 gene may be deleted.
  • As a specific deletion site a deletion of the 35 bp base sequence of exon 1 of the mouse FLT3 gene can be exemplified.
  • the nucleotide sequence of exon 1 of the mouse FLT3 gene is shown in SEQ ID NO: 2, and the nucleotide sequence of exon 1 of the mouse FLT3 gene lacking the 35 bp site is shown in SEQ ID NO: 3.
  • Microinjection is a method of injecting a transgenic vector containing a target gene into a fertilized rodent egg and randomly inserting the target gene into the rodent genome.
  • a transgenic vector is an expression vector in which an arbitrary promoter sequence is placed upstream of a target gene to express the target gene.
  • Homologous recombination is a phenomenon in which two DNA molecules recombined with each other via the same base sequence in the cell, and is a method often used for recombination of organisms having huge genomic DNA.
  • a plasmid (called a targeting vector) in which other DNAs are linked is constructed by dividing the sequence of the target gene site in the center.
  • a human FLT3L gene is isolated, a construct in which the DNA of the gene is sandwiched between the homologous sequences of the upstream part and the downstream part of a specific site of a rodent animal is prepared, and this is inserted into a known vector to obtain a targeting vector.
  • ES cells embryonic stem cells
  • Homologous recombination causes a replacement between the DNA of a particular site of a rodent animal and the same sequence portion on the targeting vector, and other sandwiched DNA is integrated into the rodent genome.
  • ES cells are established, the ES cells are injected into rodent animal embryos or blastocysts, and chimeric embryos are transplanted into the uterus of pseudopregnant rodent animals to prepare chimeric mice.
  • an F1 individual having a human FLT3L gene transgenic in the genome of the rodent animal can be obtained.
  • an immunodeficient rodent animal having a human FLT3L gene transgenic in the genome of the rodent animal can be obtained.
  • a vector for producing a targeting vector a vector that can be expressed and transformed in rodent animal ES cells can be used, and Escherichia coli-derived plasmids, retroviruses, lentiviruses, adeno-associated viruses, etc. can be used. Wakusina virus and the like can be used.
  • a promoter may be ligated upstream of the human FLT3L gene, and for example, a CAG promoter or the like can be used.
  • the targeting vector can be introduced into ES cells by a known electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, lipofection method, microinjection method, particle gun method, or the like.
  • the vector may contain a marker gene for selection, and examples of the marker gene include a hygromycin resistance gene, a neomycin resistance gene, and a puromycin resistance gene.
  • the marker gene may be removed after selection of the homologous recombinant, or can be removed by using a Cre-loxP system or a Flp-frt system.
  • stem cells such as rodent animal iPS cells can also be used.
  • Genome editing is a method of modifying a target gene using a site-specific nuclease.
  • ZFN zinc finger CRISPR
  • TALEN Tine CRISPR
  • CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
  • Cas9 Cas9 (Jinek, Martin) ., Science, Vol 337, 17 August 2012, pp.816-821
  • methods using CRISPR / Cas system such as CRISPR / Cas3, etc. can be mentioned.
  • methods also include methods of modifying nucleases, such as methods using nickase-modified Cas.
  • the method using the CRISPR / Cas9 system is preferable.
  • a guide RNA (crRNA, tracrRNA) containing a sequence complementary to the target sequence of the FLT3 gene of a rodent animal whose function is lost by cleavage is used as a guide RNA (crRNA, tracrRNA) of the immunodeficient rodent gene.
  • crRNA, tracrRNA guide RNA
  • the base length of guideRNA is preferably 20 or more. Genome editing with CRISPR / Cas9 can be performed using a commercially available CRISPR / Cas9 tool.
  • Knockout rodents include complete knockout rodents (conventional knockout rodents) and conditional knockout rodents (conditional knockout rodents). Complete knockout rodents can be made by including homologous recombination and mating.
  • Human FLT3L (Fms-like tyrosine) was obtained by mating a transgenic rodent animal in which the human FLT3L gene thus obtained was transgenic with a knockout rodent animal in which the FLT3 gene of the rodent was knocked out.
  • a rodent animal in which the kinase receptor 3 ligand) gene is transgenic and the FLT3 gene originally possessed by the rodent animal is knocked out can be obtained.
  • Such rodents are called hFLT3L Tg / FLT3 KO rodents.
  • the rodent animal used is a mouse
  • it is called a hFLT3L Tg / mFLT3 KO mouse
  • NOG hFLT3L Tg / mFLT3 KO mouse When the rodent animal used is a mouse, it is called a NOG hFLT3L Tg / mFLT3 KO mouse
  • the NOG mouse is represented by the official strain name NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Sug Flt3 em 35bp Tg (CAG-FLT3L) Jic.
  • hFLT3LTg / FLT3KO By transplanting human hematopoietic stem cells into rodents, human hematopoietic stem cells engraft in rodents, human dendritic cells differentiate, and humans in peripheral blood and in each organ. It is possible to obtain humanized rodents in which dendritic cells are proliferated and maintained.
  • hFLT3L Tg / FLT3KO rodents with radiation before transplantation. At this time, it is preferable to irradiate with radiation of 0.5 to 1.5 Gy, preferably 0.8 to 1.3 Gy, and more preferably 1 Gy.
  • Transplantation of human hematopoietic stem cells is preferably performed via a vein, for example, via the tail vein.
  • the human hematopoietic stem cells to be transplanted depend on the body weight of the rodent animal, but in the case of a mouse, for example, 10 3 to 10 6 cells, preferably 10 4 to 10 5 cells, and more preferably 4 to 5 ⁇ 10 4 cells are transplanted. do it.
  • Humanized rodents with human dendritic cells circulating peripherally can be obtained 2 to 20 weeks, preferably 3 to 16 weeks, more preferably 4 to 12 weeks after transplantation.
  • hFLT3L Tg / FLT3 KO rodents in which human hematopoietic stem cells (HSCs) were transplanted and human dendritic cells proliferated and maintained.
  • HSCs human hematopoietic stem cells
  • the hFLT3L Tg / FLT3 KO rodents produced in the above have the following characteristics.
  • Human FLT3L is constantly produced. It is present in the blood of rodents at a concentration of about 10 to 20 ng / ml. The FLT3 receptor originally possessed by rodents is deficient.
  • Human dendritic cells differentiate, proliferate and exist in the blood.
  • the dendritic cells are human conventional dendritic cells (Total conventional dendritic cells; Total cDC), type 1 conventional dendritic cells (Type1 conventional dendritic cells; cDC1), and type 2 conventional dendritic cells (Type2 conventional dendritic cells; Includes a subset of cDC2) and Plasmacytoid dendritic cells (pDC).
  • the number of human dendritic cells per 1 ml of blood is about 2 to 6 ⁇ 10 4 cells in human conventional dendritic cells (Total cDC).
  • Human dendritic cells are stable for 3 months or longer, preferably 5 months or longer, and more preferably 7 months or longer. This indicates that the functional human blood cell line has been reconstituted.
  • Human dendritic cells proliferate and are maintained throughout the body, especially in the skin, spleen, liver, small intestine and large intestine.
  • the hFLT3L Tg / FLT3 KO rodent animal of the present invention transplanted with human hematopoietic stem cells having the above characteristics can reproduce the human immune system.
  • HSC Human hematopoietic stem cell
  • the present invention is a human infectious disease model in which human hematopoietic stem cells (HSC: hematopoietic stem cells) are transplanted and human dendritic cells are proliferated and maintained. Includes dentate animals.
  • HSC human hematopoietic stem cells
  • Bacteria and viruses include pathogenic Escherichia coli, intestinal hemorrhagic Escherichia coli, Salmonella spp. , Welsche bacteria, Norovirus, hepatitis A virus, hepatitis E virus and the like.
  • HSC Human hematopoietic stem cells
  • HSC Human hematopoietic stem cells
  • Model rodents can be created.
  • the model rodent animal can be used to study the infectious disease defense mechanism in humans, and can be used to search for new therapeutic methods and therapeutic agents.
  • hFLT3LTg / FLT3KO rodents with a human immune system can be administered with proteins or peptides that make up viruses and bacteria, and human antibody production and human immune cell activity can be analyzed. It can also be used for evaluation studies.
  • the immune source examples include human papillomavirus, influenza virus, tuberculosis bacterium, SARS-CoV-2, dengue virus, decavirus, etc., for which vaccine development is underway. Furthermore, a human patient-derived tumor tissue or a human tumor cell line was transplanted into the hFLT3LTg / FLT3KO rodent animal, and a drug having an antitumor effect such as an immune checkpoint antibody was administered to reject the tumor by human immune cells. It will be possible to analyze and create a human tumor immune model rodent animal.
  • Example 1 Preparation and evaluation of NOG human FLT3L Tg (transgenic) mouse (1) Preparation of NOG-human FLT3L Tg mouse Multi-cloning of a plasmid vector having a CAG promoter, which is a systemic expression promoter, of the cloned human FLT3L gene. It was inserted into the site to prepare a transgenic vector (human FLT3L Tg vector). This transgenic vector was linearized by restriction enzyme treatment, injected into a fertilized egg of NOG mouse, and then the fertilized egg was transplanted into the uterus of a foster mother to prepare a human FLT3L Tg mouse.
  • FIG. 1 shows the structure of the transgenic vector.
  • Fig. 3 Similar to the peripheral blood shown in FIG. 2, human CD45 + cells were hardly detected in the bone marrow of hFLT3L Tg mouse. On the other hand, mouse CD45 + cells proliferated remarkably, and most of them were CD11b + Gr1-myeloid leukemia-like cells. That is, the mice presented with myeloid leukemia. This result suggests that the hFLT3L protein crosses the mouse FLT3 protein and enhances the proliferation of myeloid cells. Therefore, we decided to produce mFLT3KO mice.
  • Example 2 Preparation and evaluation of NOG hFLT3L Tg / mFLT3 KO mice
  • NOG mFLT3 KO mice were prepared by genome editing using the CRISPR / CAS9 method.
  • a guide RNA targeting exon 1 of the mFLT3 gene was designed and injected into a fertilized egg of NOG mouse together with CAS9 protein to generate NOG mFLT3 KO mouse.
  • NOG hFLT3L Tg / mFLT3 KO mice were prepared by mating the NOG mFLT3 KO mice and the NOG hFLT3L Tg mice prepared in Example 1.
  • FIG. 5A shows the number of cells in 1 mL of blood.
  • FIG. 5B shows the number of cells in the spleen.
  • NOG hFLT3L Tg / mFLT3 KO mice were humanized by human hematopoietic stem cell transplantation, and human cDC1 in the skin, spleen, liver, small intestine and large intestine was stained immunohistologically 18 weeks later. The results are shown in FIG. In FIG. 6, in the staining of any of the organs, in the NOG hFLT3L Tg / mFLT3 KO mouse, the stained portion is large. As shown in FIG.
  • dendritic cells were significantly enhanced and increased in all organs as compared with non-Tg mice.
  • spleen cells 7 months after transplantation were analyzed by flow cytometry, it was found that all dendritic cells were maintained for a long period of 7 months.
  • NOG hFLT3L Tg / mFLT3KO mice are capable of inducing human dendritic cell differentiation and maintaining human dendritic cells in vivo for a long period of time.
  • OVA-specific IgM antibodies were observed in nonTg mice and NOG hFLT3L Tg / mFLT3 KO Tg mice.
  • OVA-specific IgG antibody was not observed at all in non-Tg mice, but was significantly enhanced in Tg mice after 7 immunizations. Since almost no antigen-specific IgG antibody was produced in human hematopoietic mice transplanted with conventional hematopoietic stem cells, it is possible that human dendritic cells contribute to the induction of IgG antibody production in NOG hFLT3L Tg / mFLT3 KO Tg mice. found.
  • humanized NOG hFLT3L Tg / mFLT3KO mice that produce human FLT3L protein and lack the mouse FLT3 gene have highly differentiated human dendritic cells, promote human hematopoiesis, and are antigen-specific. It was shown to be a new humanized mouse model capable of producing a target human IgG antibody.
  • the rodent animal in which the human FLT3L (Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand) gene of the present invention is transgenic and FLT3 is knocked out is used for research on the human immune system and as a human infectious disease model rodent animal. be able to. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

ヒト樹状細胞が分化することにより、機能的ヒト免疫細胞系が再構成されたヒト化げっ歯類モデルの作製方法及び該げっ歯類モデルの提供を目的とする。　ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされ、げっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされた免疫不全げっ歯類動物。

Description

ヒト樹状細胞が分化するヒトＦＬＴ３Ｌトランスジェニックげっ歯類動物
　本発明は、ヒトの免疫系を再現できるげっ歯類動物に関する。
　非常に優れた免疫不全マウスとして、NOGマウスが知られている（特許文献１）。NOGマウスにヒトの細胞や組織を移植してヒト化NOGマウスが作製されている。例えば、ヒト自然免疫系を再現するために、ヒトG-CSF遺伝子をノックインし、ヒト造血幹細胞を移植したマウスについて報告されている（特許文献２）。
　樹状細胞（Dendritic cell: DC）は生体内の強力な抗原提示細胞であり、Ｔ細胞に抗原を提示することにより免疫応答を誘導することが知られている。また、DCはＴ細胞のみでなくＢ細胞、NK細胞、NKT細胞などとも直接作用し、免疫反応における中枢的役割を担う細胞であることが知られている。
　FLT3L（Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand）は、幹細胞を含む造血前駆細胞に作用し、G-CSFやGM-CSF等のコロニー刺激因子と共に樹状細胞の増殖と成熟の誘導因子として作用する。
国際公報第WO2002/043477号 国際公開第WO2020/196742号
　本発明は、ヒト樹状細胞が分化することにより、機能的ヒト免疫細胞系が再構成されたヒト化マウスモデル及びその作製法の提供を目的とする。
　従来のヒト化マウスでは、ヒト樹状細胞がほとんど検出できなかった。すなわち、ヒト免疫細胞系が再構成されなかった。
　本発明は、ヒト樹状細胞が分化することにより、機能的ヒト免疫細胞系が再構成されたヒト化げっ歯類モデルの作製方法及び該げっ歯類モデルの提供を目的とする。
　樹状細胞は、免疫反応における中枢的役割を担う細胞である。ヒト造血幹細胞を免疫不全マウスに移植することにより、リンパ球や好中球が循環するヒト化マウスが知られていたが、従来のヒト化マウスでは、ヒト免疫細胞系が完全には再構成されず、ヒト樹状細胞は検出できなかった。
　本発明者は、免疫不全マウスにヒトFLT3L遺伝子をトランスジェニックし、さらに、マウスのFLT3遺伝子をノックアウトし、該マウスにヒト造血幹細胞を移植することにより、ヒト樹状細胞が増殖し維持されるヒト化マウスを作製できることを見出し本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされ、げっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされ、ヒトFLT3Lタンパク質を産生しFLT3レセプターが欠損した免疫不全げっ歯類動物。
[２]　マウスである、[１]の免疫不全げっ歯類動物。
[３]　SCID変異マウス、RAG1ノックアウトマウス、RAG2ノックアウトマウス又はNOD/SCIDマウスである[２]の免疫不全げっ歯類動物。
[４］　NOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Tg(CAG-FLT3L)Jicと表される、[２]の免疫不全げっ歯類動物。
[５]　[１]～[４]のいずれかの免疫不全げっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト樹状細胞が分化し増殖し維持されているヒト化げっ歯類動物。
[６]　ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされたげっ歯類動物とげっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされたげっ歯類動物を交配させることを含む、ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされ、げっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされた免疫不全げっ歯類動物の作製方法。
[７]　げっ歯類動物がマウスである、[６]の免疫不全げっ歯類動物の作製方法。
[８]　マウスがNOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugFlt3em 35bp Tg(CAG-FLT3L)Jicと表される、[７]の免疫不全げっ歯類動物の作製方法。
[９]　ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされ、げっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされた免疫不全げっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植することを含む、ヒト樹状細胞が分化し増殖し維持されておりヒトIgM抗体又はヒトIgG抗体を産生し得るヒト化げっ歯類動物の作製方法。
[１０]　げっ歯類動物がマウスである、[９]のヒト化げっ歯類動物の作製方法。
[１１]　マウスがNOGマウスであり、正式系統名がNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugFlt3em 35bp Tg(CAG-FLT3L)Jicと表される、[１０]のヒト化げっ歯類動物の作製方法。
　また、別の一態様において、本発明は、以下の通りである。
[１２]　[５]のヒト化げっ歯類動物に、細菌又はウイルスを感染させた、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物。
[１３]　ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされ、げっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされた免疫不全げっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植し、さらに細菌又はウイルスを感染させることを含む、ヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物の作製方法。
[１４]　げっ歯類動物がマウスである、[１３]のヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物の作製方法。
[１５]　マウスがNOGマウスであり、正式系統名がNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugFlt3em 35bpTg(CAG-FLT3L)Jicと表される、[１４]のヒト病原菌感染症モデルげっ歯類動物の作製方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-215705号の開示内容を包含する。
　本発明の、ヒトFLT3L（Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand）遺伝子がトランスジェニックされ、さらにFLT3がノックアウトされたげっ歯類動物であって、ヒト造血幹細胞を移植したげっ歯類動物において、血液、脾臓、骨髄、皮膚、肝臓及び肺中でヒト樹状細胞が増殖し維持される。さらに、抗原免疫後に抗原特異的なIgM抗体及びIgG抗体が産生される。すなわち、ヒト免疫系を再現している。このようなげっ歯類動物は、ヒトの免疫系の研究等に用いることができる。また、本発明のげっ歯類動物は、ヒトの細菌、ウイルス感染に対する先天的な防御機構の研究に有用である。さらに、病原菌を感染させることにより、ヒト感染症のモデルげっ歯類動物として利用することができる。さらに本発明のげっ歯類動物は、ヒト腫瘍細胞株や患者由来腫瘍を生着させ、免疫チェックポイント阻害薬などを投与することで、ヒト腫瘍免疫系再構築モデルげっ歯類として利用することができる。加えて、ウイルス構成タンパク質若しくはペプチドや細菌構成タンパク質又はペプチドを免疫し、ウイルス又は細菌に特異的なＴ細胞や抗体を産生させることにより、ワクチンの評価モデルとしても利用することができる。
ヒトFLT3L Tgマウスの作製に用いたトランスジェニックベクターの構造を示す図である。 ヒトFLT3L Tgマウスへヒト造血幹細胞を移植した場合のヒト細胞キメラ率を示す図である。 ヒトFLT3L Tgマウスへヒト造血幹細胞を移植した場合のヒトCD45+細胞の生着を示す図である。 NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスへヒト造血幹細胞を移植した場合のヒトCD45+細胞の生着を示す図である。 NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスにおけるヒト樹状細胞の分化をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。 NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスにおけるヒト樹状細胞の分化を免疫組織染色により解析した結果を示す図である。 NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスにおける抗原特異的ヒトIgM抗体およびヒトIgG抗体の産生を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．ヒトFLT3L（Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand）遺伝子が挿入によりトランスジェニックされ、さらにFLT3遺伝子がノックアウトされ、ヒト樹状細胞が分化し増殖し維持されたヒト化遺伝子改変げっ歯類動物の作製
　本発明は、ヒトFLT3L（Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand）遺伝子がトランスジェニックされ、さらにげっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされたげっ歯類動物である。
　ここで、トランスジェニック(transgenic)とは、生物の染色体にタンパク質をコードするDNA配列を挿入する遺伝子工学的手法である。ある遺伝子を動物に挿入することを、該遺伝子がトランスジェニックされる、という。また、ノックアウト（gene knock-out）とは、遺伝子の全部又は一部を欠損させ、その遺伝子の機能を失わせる遺伝子工学的手法である。
　ヒトFLT3L（Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand）遺伝子がトランスジェニックされ、さらにげっ歯類動物FLT3遺伝子がノックアウトされたげっ歯類動物は、ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされたげっ歯類動物とげっ歯類動物FLT3遺伝子がノックアウトされたげっ歯類動物を交配させることにより作製することができる。
　FLT3Lは、幹細胞を含む造血前駆細胞に作用し、G-CSFやGM-CSF等のコロニー刺激因子と共に樹状細胞の増殖と成熟の誘導因子として作用する。FLT3（CD135）は、受容体チロシンキナーゼであり、造血幹細胞の増殖と生存、及び早期Ｂリンパ前駆細胞の分解において役割を果たす。FLT3Lタンパク質は受容体であるFLT3タンパク質に結合し、FLT3タンパク質を有する細胞の増殖を活性化する。FLT3タンパク質は急性骨髄性白血病や急性リンパ球性白血病の細胞表面に発現することが知られている。FLT3遺伝子をノックアウトすることによりFLT3レセプター（FLT3タンパク質）が欠損する。
　ヒトFLT3L遺伝子をトランスジェニックしたげっ歯類動物において、発現したヒトFLT3Lタンパク質がげっ歯類動物の骨髄系細胞のFLT3タンパク質と結合し、げっ歯類動物の骨髄系細胞が増殖し、骨髄性白血病を呈してしまい、ヒト化げっ歯類動物を作製することができない。本発明においては、げっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子をノックアウトし、FLT3レセプターを破壊することにより白血病症状が呈するのを予防し、この問題を回避する。
　本発明において、げっ歯類動物は限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヌートリア等が挙げられ、この中でもマウスが好ましい。
　本発明で用いるヒト樹状細胞が分化するヒト化げっ歯類動物は、ヒト樹状細胞を免疫により排除しないげっ歯類動物、すなわち、ヒトに対する免疫反応が不活化したげっ歯類動物である。そのような動物として、免疫機能が低下又は欠損しており、ヒトに対する免疫反応が不活化したげっ歯類動物が挙げられ、例えば、免疫不全げっ歯類動物を用いることができる。
　免疫不全マウスとして、ヌードマウス、NOD/SCIDマウス、Rag1ノックアウトマウス、Rag2ノックアウトマウス、SCIDマウスにアシアロGM1抗体やTMβ1を投与したマウス、Ｘ線照射マウス等が挙げられる。また、これらのNOD/SCIDマウスやRag1ノックアウトマウス、Rag2ノックアウトマウスにIL-2Rγノックアウトを掛け合わせたノックアウト動物（以下、dKO（ダブルノックアウト）動物）も使用され得る。例えば、dKOマウス（Rag2 KO、IL-2Rnull）を用いることができる。本発明において、遺伝背景をBalb/cとするdKOマウスをBalb/c dKOマウスといい、遺伝背景をNODとするマウスをNOD dKOマウスという。また、マウスの遺伝背景はこれらに限らず、C57BL/6、C3H、DBA2やIQI系統でも、SCID変異とIL-2Rγノックアウト、Rag1ノックアウトとIL-2Rγノックアウト又はRag2ノックアウトとIL-2Rγノックアウト変異を持つ系統でもよい。また、IL-2レセプターの共通γ鎖の下流でシグナル伝達を担うJak3タンパクの欠損もIL2Rγnullと表現型が同様であることから、Rag2ノックアウトマウスにJak3ノックアウトを掛け合わせたノックアウトマウス、Rag1ノックアウトマウスにJak3ノックアウトを掛け合わせたノックアウトマウス、SCID変異とJak3ノックアウトを掛け合わせたノックアウトマウス、あるいはそれらを交配して得た近交系、非近交系、交雑系（F1ハイブリッド）マウスでもよい。
　さらに、該マウス中で認められるNK細胞等の免疫細胞による影響を除外するために、前記のようにSCIDマウスにアシアロGM1抗体が投与されて使用される態様の他に、本発明において使用される別のマウスとして、IL-2レセプターγ鎖遺伝子に変異が導入されて、IL-2レセプターγ鎖が欠損し、かつ、Ｔ細胞及びＢ細胞の抗原レセプター遺伝子の再構成に関わる遺伝子のSCID変異が両対立遺伝子座位にある遺伝子改変免疫不全マウスが挙げられる。このようなマウスとしてNOD/SCIDマウス由来でIL-2レセプターの共通γ鎖をノックアウトしたマウスであるNOGマウス（NOD/SCID/γcnull（NOD/Shi-scid,IL-2RγKOマウス））、NSGマウス（NOD/Scid/IL2Rγnull(NOD.Cｇ－PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ))、NCGマウス（NOD-Prkdcem26Cd52IL2rgem26Cd22/NjuCrl)等が挙げられる。さらにJak3遺伝子に変異が導入されて、Jak3が欠損し、かつ、Ｔ細胞及びＢ細胞の抗原レセプター遺伝子の再構成に関わる遺伝子のSCID変異が両対立遺伝子座位にある遺伝子改変免疫不全マウスNOJマウス（NOD/Scid/Jak3null(NOD.Cg-PrkdcscidJak3tm1card)）も使用できる。以下、scid 変異などによりPrkdc 遺伝子、及びその遺伝子産物の機能が欠損し、IL2Rγ遺伝子の欠損や変異、又はシグナル伝達下流にある遺伝子、及びその産物の機能欠損によりIL2Rγ遺伝子産物の正常な機能が喪失したこれらの動物をNOGマウス（「NOG mouse」は登録商標）と指称し、宿主として使用することもできる。これらのマウスにおいてはリンパ球の存在が認められないため、NOGマウスはNK活性を示さず樹状細胞機能も欠損している。NOGマウスの作出方法は、WO2002/043477に記載されている。NSGマウスの作出方法は、Ishikawa F. et al., Blood 106:1565-1573, 2005に、NCGマウスの作出方法は、Zhou J. et al. Int J Biochem Cell Biol 46:49-55, 2014に、NOJマウスの作出方法は、Okada S. et al.,Int J Hematol 88:476-482, 2008に記載されている。
　さらに本発明に使用される免疫不全マウスとして、RAG1ノックアウトマウス及びRAG2ノックアウトマウスが挙げられる
　ヒトFLT3L遺伝子をトランスジェニックする方法、及びげっ歯類動物のFLT3遺伝子をノックアウトする方法は限定されず、例えば、マイクロインジェクション、相同組換え、ゲノム編集などにより行うことができる。
　ヒトFLT3L遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。
　マウスFLT3遺伝子のノックアウトは、FLT3遺伝子の全部又は一部の欠損により行うことができる。例えば、マウスFLT3遺伝子のエクソン１の全部又は一部を欠損させればよい。具体的な欠損部位として、マウスFLT3遺伝子のエクソン１の35bpの塩基配列の欠損が例示できる。マウスFLT3遺伝子のエクソン１の塩基配列を配列番号２に示し、35bpの部位が欠損したマウスFLT3遺伝子のエクソン１の塩基配列を配列番号３に示す。
　マイクロインジェクションとは、げっ歯類の受精卵に目的の遺伝子を含むトランスジェニックベクターを注入し、げっ歯類のゲノムにランダムに目的遺伝子を挿入する手法である。トランスジェニックベクターは、目的遺伝子の上流に任意のプロモーター配列を配置させ、目的遺伝子を発現させる発現ベクターのことである。相同組換えとは、細胞内で２つのDNA分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象で、巨大なゲノムDNAを持つ生物の組換えにしばしば用いられる方法である。標的とする遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、他のDNAを連結したプラスミド（ターゲティングベクターという）を構築する。すなわち、ヒトFLT3L遺伝子を単離し、該遺伝子のDNAをげっ歯類動物の特定部位の上流部分と下流部分の相同配列で挟んだコンストラクトを作製し、これを公知のベクターに挿入し、ターゲティングベクターを作製する。免疫不全げっ歯類動物のES細胞（胚性幹細胞）に導入する。相同組換えにより、げっ歯類動物の特定部位のDNAとターゲティングベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれた他のDNAがげっ歯類ゲノム中に組み込まれる。このようにしてES細胞を樹立し、該ES細胞をげっ歯類動物胚又は胚盤胞に注入し、キメラ胚を偽妊娠させたげっ歯類動物の子宮に移植しキメラマウスを作製する。得られたキメラマウスを前記の免疫不全げっ歯類動物と交配することにより、げっ歯類動物のゲノム中にトランスジェニックされたヒトFLT3L遺伝子をヘテロに有するF1個体を得ることができる。このヘテロの個体どうしを交配することにより、げっ歯類動物のゲノム中にトランスジェニックされたヒトFLT3L遺伝子をヘテロに有する免疫不全げっ歯類動物を得ることができる。
　この際、ターゲティングベクターを作製するベクターとしては、げっ歯類動物のES細胞において発現可能で、形質転換可能なものを用いることができ、大腸菌由来のプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いることができる。
　ヒトFLT3L遺伝子の上流には、プロモーターを連結させてもよく、例えば、CAGプロモーター等を用いることができる。
　ターゲティングベクターのES細胞への導入は、公知のエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等により行うことができる。
　ベクターは、選別のためのマーカー遺伝子を含んでいてもよく、マーカー遺伝子として、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。マーカー遺伝子は、相同組換え体の選択後に除去してもよく、Cre-loxP系やFlp-frt系を利用することにより除去することができる。
　ES細胞の代わりに、げっ歯類動物のiPS細胞等の幹細胞を用いることもできる。
　ゲノム編集は、部位特異的なヌクレアーゼを利用して標的遺伝子を改変する方法である。ゲノム編集の方法として、用いるヌクレアーゼにより、ZFN(zinc finger nuclease)法（Urnov, Fyodor D. et al., Natur, Vol 435, 2 June 2005, pp.642-651)、TALEN(Tale nuclease)法(Mahfouz, Magdy M et al., PNAS February 8, 2011, 108(6), pp.2623-2628)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9(Crispr Associated protein 9)(Jinek, Martin, et al., Science, Vol 337, 17 August 2012, pp.816-821)、CRISPR/Cas3等のCRISPR/Casシステムによる方法等が挙げられる。これらの方法には、ニッカーゼ改変型Casを用いた方法等のヌクレアーゼを改変した方法も含む。このうち、CRISPR/Cas9システムによる方法が好ましい。CRISPR/Cas9システムにおいては、例えば、切断することにより機能を欠損させたいげっ歯類動物のFLT3遺伝子の標的配列に相補的な配列を含むguide RNA(crRNA、tracrRNA)を免疫不全げっ歯類遺伝子の受精卵に注入する。受精卵内で、げっ歯類動物のFLT3遺伝子が欠損する。guide RNAの塩基長は、20以上が好ましい。CRISPR/Cas9によるゲノム編集は、市販のCRISPR/Cas9ツールを用いて行うことができる。
　ノックアウトげっ歯類動物は、完全ノックアウトげっ歯類動物（コンベンショナルノックアウトげっ歯類動物）も条件付きノックアウトげっ歯類動物（コンディショナルノックアウトげっ歯類動物）も含む。完全ノックアウトげっ歯類動物は相同組換えと交配を含ませて作製することができる。
　このようにして得られたヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされたトランスジェニックげっ歯類動物とげっ歯類のFLT3遺伝子がノックアウトされたノックアウトげっ歯類動物を交配することにより、ヒトFLT3L（Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand）遺伝子がトランスジェニックされ、さらにげっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされたげっ歯類動物を得ることができる。このようなげっ歯類動物をhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物と呼ぶ。用いたげっ歯類動物がマウスである場合、hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスと呼び、NOGマウスである場合、NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスと呼ぶ。該NOGマウスは、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Flt3em 35bpTg(CAG-FLT3L)Jicという正式系統名で表される。
　hFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物に、ヒト造血幹細胞を移植することにより、ヒト造血幹細胞がげっ歯類動物中に生着し、ヒト樹状細胞が分化し、末梢血中及び各臓器にヒト樹状細胞が増殖し維持されたたヒト化げっ歯類動物を得ることができる。
　移植の前にhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物に放射線を照射することが好ましい。この際0.5～1.5Gy、好ましくは0.8～1.3Gy、さらに好ましくは1Gyの放射線を照射することが好ましい。
　ヒト造血幹細胞（CD34+細胞）の移植は、静脈経由で行うことが好ましく、例えば、尾静脈経由で行えばよい。移植するヒト造血幹細胞は、げっ歯類動物の体重によるが、例えばマウスの場合、103～106個、好ましくは104～105個、さらに好ましくは、4～5×104個を移植すればよい。移植後、2～20週、好ましくは3～16週、さらに好ましくは4～12週でヒト樹状細胞が末梢を循環するヒト化げっ歯類動物を得ることができる。
２．ヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）が移植され、ヒト樹状細胞が増殖し維持されたhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物の特性
　１．で作製したhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物は、以下の特性を有する。
　ヒトFLT3Lが恒常的に産生される。げっ歯類動物の血中に、10～20 ng/ml程度の濃度で存在する。
　げっ歯類動物が本来有しているFLT3レセプターが欠損している。
　血中にヒト樹状細胞が分化し増殖し存在する。ここで、樹状細胞は、ヒトコンベンショナル樹状細胞（Total conventional dendritic cells; Total cDC）、タイプ1コンベンショナル樹状細胞（Type1 conventional dendritic cells; cDC1）、タイプ2コンベンショナル樹状細胞（Type2 conventional dendritic cells; cDC2）及び形質細胞様樹状細胞（Plasmacytoid dendritic cells; pDC）のサブセットを含む。血液１ml当たりのヒト樹状細胞数は、ヒトコンベンショナル樹状細胞（Total conventional dendritic cells; Total cDC）で２～６×104細胞程度である。
　ヒト樹状細胞は３ヶ月以上、好ましくは５ヶ月以上、さらに好ましくは７ヶ月以上安定して存在する。これは、機能的なヒト血液細胞系が再構成されたことを示す。
　全身におけるヒト樹状細胞が増殖し、維持され、特に皮膚、脾臓、肝臓、小腸及び大腸において、ヒト樹状細胞が存在する。
　ヒト樹状細胞が増殖し維持されているhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物を抗原で免疫した場合、抗原特異的ヒトIgM抗体だけでなく、抗原特異的ヒトIgG抗体が産生される。抗原特異的ヒトIgG抗体が産生されるのは、樹状細胞が増殖し、ヒト免疫系が活性化するためである。
　上記の特性を有するヒト造血幹細胞を移植した本発明のhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物は、ヒトの免疫系を再現できる。
３．ヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）が移植され、ヒト樹状細胞が増殖し維持されたhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物の利用
　ヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）が移植され、ヒト樹状細胞が増殖し維持されたhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物は、ヒトの免疫系を再現することができ、ヒトの免疫学の研究に利用することができる。
　また、該げっ歯類動物に細菌を感染させることにより、ヒトの細菌感染に対する先天的な防御機構の研究に利用することができる。
　本発明は、ヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）が移植され、ヒト樹状細胞が増殖し維持されたhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物に細菌やウイルスを感染させたヒト感染症モデルげっ歯類動物を包含する。細菌やウイルスとしては、ヒトに対して病原菌として作用する、病原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、サルモネラ属菌、カンンピロバクアー・ジェジェニ／コリ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオ、ボツリヌス菌、セレウス菌、ウエルシェ菌、ノロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス等が挙げられる。これらの病原菌を本発明のヒト造血幹細胞（HSC: hematopoietic stem cell）が移植され、ヒト樹状細胞が増殖し維持されたhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物に感染させることにより、ヒト感染症のモデルげっ歯類動物を作製することができる。該モデルげっ歯類動物を用いてヒトの感染症防御機構を研究することができ、さらに、新しい治療方法や治療薬の探索に用いることができる。また、ヒト免疫系を有するhFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物に、ウイルスや細菌を構成するタンパクまたはペプチドを投与し、ヒト抗体の産生やヒト免疫細胞の活性を解析することができるため、ワクチン評価の研究にも利用することができる。免疫源としては、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、結核菌など、または、ワクチン開発が進められているSARS-CoV-2、デングウイルス、ジカウイルスなどが挙げられる。さらに、該hFLT3L Tg/FLT3 KOげっ歯類動物にヒト患者由来腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞株を移植し、免疫チェックポイント抗体など抗腫瘍効果を有する薬剤を投与し、ヒト免疫細胞による腫瘍の拒絶を解析することが可能となり、ヒト腫瘍免疫モデルげっ歯類動物を作製することができる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
[実施例１]　NOGヒトFLT3L Tg(トランスジェニック）マウスの作製及び評価
（１）　NOG-ヒトFLT3L Tgマウスの作製
　クローニングしたヒトFLT3L遺伝子を全身性発現プロモーターであるCAGプロモーターを有するプラスミドベクターのマルチクローニングサイトに挿入し、トランスジェニックベクター（ヒトFLT3L Tgベクター）を作製した。このトランスジェニックベクターを制限酵素処理によりリニアライズし、NOGマウス受精卵へ注入し、その後受精卵を仮親の子宮へ移植し、ヒトFLT3L Tgマウスを作製した。図１にトランスジェニックベクターの構造を示す。
（２）　ヒトFLT3L TgマウスにおけるhFLT3Lタンパク質の発現
　該マウス血中の、hFLT3Lタンパク質の発現量を、抗hFLTL3抗体を用いたELISA法で測定した。10～20 ng/ml程度のhFLT3LがTgマウス血中にて産生されていた。
（３）　ヒトFLT3L Tgマウスへのヒト造血幹細胞の移植
　作製したhFLT3L Tgマウス又はnonTgマウス（hFLT3L遺伝子をトランスジェニックしていないマウス）へ1.5 GyのX線を照射し、4～5×104個のヒト造血幹細胞を尾静脈より移植した。移植後4、8及び12週後、末梢血を採取し、フローサイトメーターでヒト白血球（CD45）の割合、すなわちヒト細胞キメラ率を測定した。
　結果を図２に示す。図２に示すように、移植後8週以降hFLT3L TgマウスではCD45+細胞がほとんど検出されなかった。
（４）　ヒトFLT3L Tgマウスにおける、ヒトCD45+細胞の生着の確認
　上記のようにヒト造血幹細胞を移植して作製したヒト化hFLT3L TgマウスまたはnonTgマウスを移植後15週時点で解剖し、骨髄細胞を採取してフローサイトメーターでヒトCD45+、CD33+及びCD19+細胞、並びにマウスCD45+、CD11b+及びGr1+細胞の割合を解析した。
　結果を図３に示す。図２に結果を示す末梢血と同様に、hFLT3L Tgマウス骨髄ではヒトCD45+細胞はほとんど検出されなかった。一方で、マウスCD45+細胞は顕著に増殖しており、これらはほとんどがCD11b+Gr1-の骨髄性白血病様細胞であった。すなわち、マウスは骨髄性白血病を呈していた。この結果は、hFLT3Lタンパク質がマウスFLT3タンパク質に交差して、骨髄系細胞の増殖を亢進させていることを示唆している。そこで、mFLT3 KOマウスを作製することとした。
[実施例２]　NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスの作製及び評価
（１）　NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスの作製
　NOG mFLT3 KOマウスは、CRISPR/CAS9法を用いたゲノム編集により作製した。mFLT3遺伝子のエクソン１を標的としたガイドRNAを設計し、CAS9タンパクと共にNOGマウス受精卵に注入し、NOG mFLT3 KOマウスを作製した。さらにNOG mFLT3 KOマウスと実施例１にて作製したNOG hFLT3L Tgマウスを交配することにより、NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスを作製した。
（２）　NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスへのヒト造血幹細胞の移植
　NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスへヒト造血幹細胞を移植し、8週後に採血して血中ヒトCD45+細胞の割合をフローサイトメトリーにて測定した。結果を図４に示す。図４に示すように、ヒトFLT3L Tgマウス（図３）で見られたマウス白血病様症状は回避され、nonTgマウスに遜色なくヒトCD45+細胞の生着が確認された。
（３）　NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスにおけるヒト樹状細胞の分化（フローサイトメトリーによる解析）
　ヒト造血幹細胞を移植したNOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウス末梢血中および脾臓中のヒト樹状細胞をフローサイトメトリーにて解析した。結果を図５に示す。図５Ａは血液１mL中の細胞数を示す。図５Ｂは脾臓中の細胞数を示す。図５Ａ及びＢに示すように、ヒトコンベンショナル樹状細胞（Total conventional dendritic cells; Total cDC）、タイプ1コンベンショナル樹状細胞（Type1 conventional dendritic cells; cDC1）、タイプ2コンベンショナル樹状細胞（Type2 conventional dendritic cells; cDC2）及び形質細胞様樹状細胞（Plasmacytoid dendritic cells; pDC）がnonTgマウスに比べて顕著に分化亢進し、増加していた。
（４）　NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスにおけるヒト樹状細胞の分化（免疫組織染色による解析）
　NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスをヒト造血幹細胞移植によりヒト化して18週後の皮膚、脾臓、肝臓、小腸及び大腸におけるヒトcDC1を免疫組織学的に染色した。結果を図６に示す。図６において、いずれの器官の染色においても、NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスにおいて、染色されている部分が多くなっている。図６に示すように、nonTgマウスに比べていずれの臓器でも樹状細胞が顕著に分化亢進し、増加していた。また、移植後7ヶ月後の脾臓細胞をフローサイトメトリーにて解析したところ、全ての樹状細胞が7ヶ月もの長期間維持されていることがわかった。
　以上の結果から、NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスは、ヒト樹状細胞分化誘導が可能であり、in vivoで長期間ヒト樹状細胞を維持させることができるマウスであることが明らかとなった。
（５）　NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスにおけるヒト免疫反応
　NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスをヒト造血幹細胞移植によりヒト化し、50μgの卵白アルブミン（OVA）抗原をアラムとともに2週間おきに7回腹腔内投与し、血清中のOVA特異的IgMおよびIgG抗体をELISA法にて測定した。結果を図７に示す。図７ＡはIgMの産生量を示し、図７ＢはIgGの産生量を示す。図７に示すように、OVA特異的IgM抗体は、nonTgマウス及びNOG hFLT3L Tg/mFLT3 KO Tgマウスにて観察された。一方、OVA特異的IgG抗体は、nonTgマウスでは全く認められなかったが、7回免疫後のTgマウスでは顕著に亢進していた。従来の造血幹細胞を移植したヒト造血系マウスでは抗原特異的IgG抗体はほとんど産生されなかったため、NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KO Tgマウスでは、ヒト樹状細胞がIgG抗体産生誘導に寄与していることが判明した。
　以上のことから、ヒトFLT3Lタンパク質を産生し、マウスFLT3遺伝子を欠失したヒト化NOG hFLT3L Tg/mFLT3 KOマウスは、ヒト樹状細胞が高度に分化し、ヒト造血系を亢進させ、さらに抗原特異的ヒトIgG抗体の産生が可能な新たなヒト化マウスモデルであることが示された。
　本発明の、ヒトFLT3L（Fms-like tyrosine kinase receptor 3 ligand）遺伝子がトランスジェニックされ、さらにFLT3がノックアウトされたげっ歯類動物はヒト免疫系の研究やヒト感染症モデルげっ歯類動物として利用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (11)

  1. 　ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされ、げっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされ、ヒトFLT3Lタンパク質を産生しFLT3レセプターが欠損した免疫不全げっ歯類動物。
  2. 　マウスである、請求項１記載の免疫不全げっ歯類動物。
  3. 　SCID変異マウス、RAG1ノックアウトマウス、RAG2ノックアウトマウスまたはNOD/SCIDマウスである請求項２に記載の免疫不全げっ歯類動物。
  4. 　NOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugTg(CAG-FLT3L)Jicと表される、請求項３記載の免疫不全げっ歯類動物。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の免疫不全げっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植して得られる、ヒト樹状細胞が分化し増殖し維持されているヒト化げっ歯類動物。
  6. 　ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされたげっ歯類動物とげっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされたげっ歯類動物を交配させることを含む、ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされ、げっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされた免疫不全げっ歯類動物の作製方法。
  7. 　げっ歯類動物がマウスである、請求項６記載の免疫不全げっ歯類動物の作製方法。
  8. 　マウスがNOGマウスであり、正式系統名はNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Flt3em 35bpTg(CAG-FLT3L)Jicと表される、請求項７記載の免疫不全げっ歯類動物の作製方法。
  9. 　ヒトFLT3L遺伝子がトランスジェニックされ、げっ歯類動物が元々有するFLT3遺伝子がノックアウトされた免疫不全げっ歯類動物にヒト造血幹細胞を移植することを含む、ヒト樹状細胞が分化し増殖し維持されており、少なくともヒトIgM抗体又はヒトIgG抗体を産生し得るヒト化げっ歯類動物の作製方法。
  10. 　げっ歯類動物がマウスである、請求項９記載のヒト化げっ歯類動物の作製方法。
  11. 　マウスがNOGマウスであり、正式系統名がNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Flt3em 35bpTg(CAG-FLT3L)Jicと表される、請求項１０記載のヒト化げっ歯類動物の作製方法。
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