WO2020196737A1 - Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬組成物およびスクリーニング方法 - Google Patents

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亮太 羽場
和毅 嶋根
貴紀 河野
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    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition having anti-hepatitis B virus activity and a method for screening a substance that inhibits the production of hepatitis B virus protein.
  • Hepatitis B virus is a virus belonging to the genus Hepadonavirus, which is a spherical DNA virus having a diameter of about 42 nm.
  • the virus itself is a DNA virus consisting of a core (core) with a diameter of 27 nm, which contains a coat (envelope, envelope), incomplete double-stranded DNA, DNA polymerase, reverse transcriptase, etc., and is called a Dane particle. It has been.
  • HBs antigen hepatitis B surface antigen, HBsAg
  • HBc antigen hepatitis B core antigen, HBcAg
  • genetic DNA Non-Patent Document 1
  • HBs antigens exist as hollow particles, small spherical particles, or rod-shaped particles.
  • the HBV genomic DNA includes four types of transcriptional decoding frames (open reading frame, ORF), a pre-S / S gene region, a P gene region, an X gene region, and a pre-C / C gene region, and three promoters. There are two enhancer (Enhan) regions.
  • the core processor of the X gene region and the precore region of the C gene region are involved in the production of HBe antigen (hepatitis Be develop antigen, HBeAg) constituent proteins, and the point mutation of this region prevents the production of HBe antigen constituent proteins, resulting in the production of HBe antigens. It becomes negative.
  • the two enhancer regions are called enhancer I (Enhancer I, EnhI) and enhancer II (Enhancer II, EnhII), and both of them can increase the promoter activity of all three (Patent Document 1).
  • ccDNA covalent closed double-stranded DNA
  • RNAs is taken up by core particles as pregenomic RNA, minus-strand DNA is synthesized by the action of reverse transcriptase, and then plus-strand DNA is synthesized to become incomplete circular double-stranded DNA. Furthermore, it is wrapped in an envelope formed from HBs antigens to become virus particles (Dane particles) and released into the blood. Hollow particles containing RNA-translated HBsAg, HBc and p22cr antigens (particles without DNA nuclei) and HBe antigens that pass through the hepatocellular membrane are found in large amounts in the blood separately from the Dane particle's blood release route. Released and secreted into.
  • HBe antigen, HBc antigen and p22cr antigen can be measured as HBcr antigen (hepatitis B colle-related antigen, HBcrAg) and are used as markers for virus replication (Non-Patent Document 1).
  • Hepatitis B is one of the viral hepatitis caused by infection with HBV, and the number of infected people is said to be about 240 million worldwide.
  • Dane particles are released into the blood, and a large amount of viral protein is secreted into the blood separately from the release route of the Dane particles.
  • HBs antigens in particular may interfere with the elimination of infected cells by the immune system of the host human (Non-Patent Documents 2 and 3). Therefore, in the treatment of hepatitis B, it is considered important to reduce Dane particles, that is, to suppress the growth of the virus and to reduce viral proteins such as HBs antigen.
  • Nucleic acid analogs such as entecavir and tenohobi are used as first-line drugs for hepatitis B. Nucleic acid analog preparations can reduce the Dane particles in the blood, that is, suppress the growth of viruses, by inhibiting the activity of HBV polymerase protein and the production of incomplete circular double-stranded DNA. However, since nucleic acid analog preparations cannot reduce HBsAg, it is difficult to achieve elimination of infected cells by the host immune system. Therefore, it is desired to develop a drug capable of reducing HBsAg. In recent years, research and development of double-stranded RNA (dsRNA) that binds to and degrades HBV RNA by the principle of RNA interference (RNAi) has been promoted.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • Non-Patent Document 4 It has been reported that these double-stranded RNAs reduce HBs antigens in HBV-infected cells and the like (Non-Patent Document 4). Due to its nature, double-stranded RNA needs to have high sequence identity with HBV RNA in order to bind to HBV RNA and exert its effect. However, since there are eight types of genotypes in HBV and the RNA sequence changes due to gene mutation or the like, there is concern that the effect of double-stranded RNA that binds to HBV RNA cannot be expected.
  • Non-Patent Document 5 it is necessary to develop a drug that can achieve a reduction in HBsAg by a new mechanism of action.
  • HBV does not have the group of molecules needed to transcribe RNA from its own gene, and the group of molecules needed to produce viral proteins from RNA. Therefore, the molecular groups of infected human hepatocytes must be used for HBV proliferation and viral protein production. Therefore, a new approach that targets the human protein used by HBV and inhibits the growth of HBV and the production of viral protein has begun to attract attention. For example, attempts have been made to control transcription from HBV genomic DNA to HBV RNA and regulate HBV replication using a nucleic acid molecule that binds to enhancer I in HBV genomic DNA (Patent Document 2).
  • HBV hepatitis B virus
  • the present invention is completed by finding that a pharmaceutical composition that inhibits a human protein that binds to at least one region of a hepatitis B virus RNA (HBV RNA) sequence corresponding to a sequence has an ability to inhibit the production of HBV protein. It came to.
  • HBV RNA hepatitis B virus RNA
  • the present invention provides the following.
  • a pharmaceutical composition that inhibits the production of hepatitis B virus protein (HBV protein), an HBV RNA sequence corresponding to the enhancer (Enh) I region sequence on the HBV genomic DNA, and an enhancer (Enh) on the HBV genomic DNA.
  • a pharmaceutical composition comprising inhibiting the expression or function of an RNA-binding protein that binds to at least one sequence selected from the HBV RNA sequence corresponding to the II region sequence.
  • the HBV RNA sequence corresponding to the enhancer (Enh) I region sequence on the HBV genomic DNA is a sequence having 80% or more sequence identity with SEQ ID NO: 1 and is included in the enhancer (Enh) II region sequence on the HBV genomic DNA.
  • the HBV RNA sequence corresponding to the enhancer (Enh) I region sequence on the HBV genomic DNA is a sequence having 90% or more sequence identity with SEQ ID NO: 1 and is included in the enhancer (Enh) II region sequence on the HBV genomic DNA.
  • ⁇ 4> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the HBV protein is an HBs antigen protein.
  • RNA-binding protein is at least one protein selected from RBFOX1, ELAVL2, MBNL1, RBMX, SRSF9, SRSF10, SNRPA, ELAVL1, PUM2, YTHDC1, SRSF1, KHDRBS3 and EIF4B.
  • ⁇ 8> A method of screening for substances that inhibit the production of HBV protein. Binding to at least one sequence selected from the HBV RNA sequence corresponding to the enhancer (Enh) I region sequence on the HBV genomic DNA and the HBV RNA sequence corresponding to the enhancer (Enh) II region sequence on the HBV genomic DNA. A screening method comprising identifying a substance that inhibits the expression or function of an RNA-binding protein.
  • the HBV RNA sequence corresponding to the enhancer (Enh) I region sequence on the HBV genomic DNA is a sequence having 80% or more sequence identity with SEQ ID NO: 1 and is included in the enhancer (Enh) II region sequence on the HBV genomic DNA.
  • the screening method according to ⁇ 8>, wherein the corresponding HBV RNA sequence is a sequence having 80% or more sequence identity with SEQ ID NO: 2.
  • ⁇ 11> A method of screening for substances that inhibit the production of hepatitis B virus (HBV) protein.
  • HBV hepatitis B virus
  • the step of identifying the RNA-binding protein that binds (B) A step of contacting a cell infected with HBV or a cell expressing HBV with a test substance that inhibits the function or activity of the identified RNA-binding protein or a test substance that reduces the expression level of the protein. (C) The step of measuring the production ability of HBV protein in cells infected with HBV or cells expressing HBV, and (d) the step of selecting a substance having an activity of inhibiting the production of HBV protein of (c) are included. ,Method. ⁇ 12> The method according to ⁇ 11>, wherein (a) comprises a step of using an RNA-binding protein sequence database.
  • test substance of (b) is an antibody, a peptide, a protein, a non-peptide compound, a synthetic compound, an antisense nucleic acid, a double-stranded RNA, an adeno-associated virus vector or a CRISPR-Cas vector system, according to ⁇ 11>.
  • Method. ⁇ 14> The method according to ⁇ 11>, wherein (c) comprises a step of measuring HBV protein in a culture supernatant of cells infected with HBV or cells expressing HBV.
  • the substance (d) is an antibody, a peptide, a protein, a non-peptide compound, a synthetic compound, an antisense nucleic acid, a double-stranded RNA, an adeno-associated virus vector or a CRISPR-Cas vector system. ..
  • the present invention also provides the following.
  • ⁇ A> A treatment method comprising administering the pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7> to a subject who is infected with HBV or has a disease associated with HBV infection.
  • ⁇ B> The treatment method according to ⁇ a>, wherein the disease associated with HBV infection is hepatitis B, liver cirrhosis caused by them, or liver cancer caused by them.
  • ⁇ C> A kit for treating a disease associated with HBV infection, which comprises the pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>; and an instruction sheet describing a method for treating a disease associated with HBV infection.
  • the method for treating a disease associated with HBV infection comprises administering the pharmaceutical composition to a subject who is infected with HBV or has a disease associated with HBV infection, according to ⁇ c>. Kit for the treatment of diseases associated with HBV infection.
  • HBV RNA sequence corresponding to the enhancer (Enh) I region sequence on HBV genomic DNA for use in treatments that inhibit the production of hepatitis B virus protein (HBV protein), and enhancer (Enh) on HBV genomic DNA.
  • HBV RNA sequence corresponding to the enhancer (Enh) I region sequence on HBV genomic DNA for use in treatments that inhibit the production of hepatitis B virus protein (HBV protein), and enhancer (Enh) on HBV genomic DNA.
  • HBV protein hepatitis B virus protein
  • Enh enhancer
  • Enh Use of a substance that inhibits the expression or function of an RNA-binding protein that binds to at least one sequence selected from the HBV RNA sequence corresponding to the II region sequence.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has excellent anti-HBV activity and is useful as an anti-HBV agent.
  • the screening method of the present invention is useful for screening substances that inhibit the production of HBV protein.
  • FIG. 1 shows the relative luminescence amount (%) of firefly luciferase in a reporter assay using an EnhI / EnhII region-deficient construct derived from genotype C.
  • FIG. 2 shows the relative expression level (%) of firefly luciferase RNA in a reporter assay using an EnhI / EnhII region-deficient construct derived from genotype C.
  • FIG. 3 shows the relative value (%) of each dsRNA-added well to each concentration of negative control dsRNA-added well for HBsAg (HBsAg).
  • FIG. 4 shows the relative value (%) of each dsRNA-added well to each concentration of negative control dsRNA-added well for cell viability.
  • FIG. 1 shows the relative luminescence amount (%) of firefly luciferase in a reporter assay using an EnhI / EnhII region-deficient construct derived from genotype C.
  • FIG. 3 shows the relative value (
  • FIG. 5 shows the relative expression level (%) of firefly luciferase RNA and the relative luminescence level (%) of firefly luciferase in a reporter assay using EnhI / EnhII region-deficient constructs derived from various genotypes.
  • Prevention means inhibition of onset, reduction of onset risk or delay of onset. Treatment means improvement or suppression of progression of the disease or condition of interest. Treatment means prevention or treatment of various diseases.
  • the effective amount means a therapeutically effective amount or a preventive effective amount.
  • a therapeutically effective amount is an amount sufficient to stabilize HBV infection, reduce HBV infection, or eradicate HBV infection in an infected subject.
  • the preventive effective amount is an amount sufficient for preventing HBV infection in a subject at risk of infection.
  • the subject means a mammal including a human.
  • Hepatitis B virus means a virus that has the ability to develop hepatitis B.
  • HBV is currently classified into eight genotypes (genotypes) from type A to type H, depending on the difference in the base sequence derived from the gene mutation.
  • HBV to be prevented or treated in the pharmaceutical composition of the present invention includes all genotypes.
  • hepatitis B is mentioned as a disease associated with HBV infection, and acute hepatitis, chronic hepatitis and fulminant hepatitis are mentioned.
  • liver cancers such as liver cirrhosis, liver fibrosis, and hepatocellular carcinoma are also included as long as the disease is caused by infection of living organisms including humans with HBV.
  • the hepatitis B virus protein is a protein constituting HBV, and examples thereof include HBs antigen, HBc antigen, and HBe antigen.
  • the HBV protein is not particularly limited, but is preferably an HBs antigen.
  • HBV RNA sequence corresponding to EnhI region sequence and EnhII region sequence on HBV genomic DNA It has two enhancer regions (EnhI and EnhII) on HBV genomic DNA, and EnhI and EnhII are known to promote transcription from HBV genomic DNA to HBV RNA.
  • the HBV RNA sequence corresponding to the EnhI region sequence and the EnhII region sequence on the HBV genomic DNA is a 3'untranslated region (hereinafter, also referred to as 3'UTR) of RNA encoding the HBV protein among the HBV RNA sequences.
  • the EnhI region sequence and the HBV RNA sequence corresponding to the EnhII region sequence on the HBV genomic DNA are on the HBV genomic DNA in the 3'UTR of the RNA encoding the HBs antigen among the HBV RNA sequences.
  • the base sequence of the region corresponding to EnhI, or the base sequence of the region corresponding to EnhII on the HBV genomic DNA within the 3'UTR of RNA encoding the HBs antigen is preferable.
  • the HBV RNA sequence corresponding to the EnhI region sequence on the HBV genomic DNA includes a sequence having 80% or more sequence identity with SEQ ID NO: 1, and the HBV corresponding to the EnhII region sequence on the HBV genomic DNA.
  • the RNA sequence include sequences having 80% or more sequence identity with SEQ ID NO: 2.
  • the HBV RNA is an RNA encoding an HBV protein, and is preferably an RNA encoding an HBs antigen.
  • Examples of the HBV RNA sequence include the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the sequence preferably has 80% or more sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, more preferably 85%, even more preferably 90%, even more preferably 95%, 98. % Is even more preferred, and 100% sequence identity is particularly preferred.
  • SEQ ID NO: 1 uuauaugcauguauacaaucuaagcaggcuuucacuuucucgccaacuuacaaggccuuucuguguaaacaauaucugaaccuuuaccccguugcccggcaacggucaggucucugccaaguguuugcugacgacccaacccccacuggauggggcuuggcuaucggccauc
  • RNA-binding proteins bind specifically to specific target RNAs, including post-transcriptional and post-transcriptional RNA splicing, polyadenylation, capping, modification, transport, localization, translation, turnover, etc. It is known to regulate various cell functions in protein expression (Ray et al., Nature, Vol. 499, No. 11, 2013).
  • RNA-binding protein is presumed to control the expression (production) of HBV protein by binding to a specific sequence on HBV RNA.
  • the HBV RNA is preferably RNA encoding an HBs antigen. Specific sequences on the HBV RNA include, for example, the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the sequence preferably has 80% or more sequence identity with respect to the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, more preferably 85%, even more preferably 90%, even more 95%. Preferably, 98% is even more preferred, and 100% sequence identity is particularly preferred.
  • the RNA-binding protein preferably recognizes and binds to 4 to 9 bases on the above sequence, and for example, RBFOX1 (RNA binding protein, fox-1 homolog), ELAVL2 (ELAV like RNA binding protein 2).
  • MBNL1 muscleblind-like Protein 1
  • RBMX RNA-binding motif protein, X chromosome
  • SRSF9 serotonine rich splicing factor 9
  • SRSF10 serotonucleoprotein polypeptide
  • SNRPA small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A
  • ELAVL1 ELAV like RNA binding protein 1
  • PUM2 pumilio homolog 2
  • YTHDC1 YTH domain containing 1
  • SRSF1 seerine and arginine rich splicing factor 1
  • KHDRBS3 KH RNA binding domain containing, signal transduction associated
  • EIF4B eukaryotic translation initiation factor 4B
  • RNA-binding protein of the present invention is preferably at least one protein selected from RBFOX1, ELAVL2, MBNL1, RBMX, SRSF9, SRSF10, SNRPA, ELAVL1, PUM2, YTHDC1, SRSF1, KHDRBS3, and EIF4B.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition containing a "substance”, specifically a "substance that inhibits the production of HBV protein", and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains an HBV RNA sequence corresponding to the enhancer (Enh) I region sequence on the HBV genomic DNA and an enhancer (Enh) II region sequence on the HBV genomic DNA as substances that inhibit the production of the HBV protein.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably has a substance that inhibits the production of HBV protein, and more preferably a substance that inhibits the production of HBs antigen.
  • “substance” examples include antibodies, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, antisense nucleic acids, double-stranded RNAs, adeno-associated virus vectors, CRISPR-Cas vector systems, and the like.
  • an “antisense nucleic acid” is a “sense” nucleic acid encoding a protein, eg, a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of a double-stranded cDNA molecule, mRNA sequence or gene coding sequence.
  • RNAi nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acids that interfere with or inhibit the expression of target genes by short interfering RNA (siRNA), small interfering RNA (SHRNA) or RNA interference (RNAi).
  • RNA interference is a nucleic acid that interferes with or inhibits the expression of a target gene through RNA interference.
  • RNA interference is a post-transcriptional target gene silencing technique that uses double-stranded RNA (dsRNA) to degrade mRNA containing the same sequence as dsRNA (Sharp et al., Science, 287, 2431-2432, 2000). Zamore et al., Cell, Vol. 101, pp.
  • RNAi nucleotide long short interfering RNA
  • Kits for the synthesis of RNAi are commercially available, for example, from New England Biolabs and Ambion.
  • one or more of the above chemistries for use in antisense RNA can be used.
  • antisense nucleic acid or double-stranded RNA is preferable, and double-stranded RNA is more preferable. Moreover, in the case of double-stranded RNA, it is particularly preferable that it is an RNA interfering agent.
  • Adeno-associated virus is a single-stranded DNA virus consisting of about 4700 bases belonging to the family Parvoviridae, which has no envelope and has a capsid with a regular dihedral structure with a diameter of 20 to 30 nm, and also has a cell membrane. It has a wide host range because it recognizes and infects proteoglycan sulfate, which is a universal component. Any gene or nucleic acid can be inserted into the genome of adeno-associated virus. Therefore, since the target gene and nucleic acid can be introduced by infecting the target cell with the genetically modified adeno-associated virus, the adeno-associated virus can be used as a vector for gene transfer.
  • adeno-associated virus vector is non-pathogenic and can be gene-introduced into terminally differentiated non-dividing cells, its application to gene therapy is expected. It is known that adeno-associated viruses have different infection orientations to tissues and cells depending on the serotype (Ozawa et al., Drug Delivery System, Vol. 22, No. 6, pp. 643-650, 2007). As the substance contained in the pharmaceutical composition of the present invention, adeno-associated virus type 5, adeno-associated virus type 7, adeno-associated virus type 8 or adeno-associated virus type 9 is preferable, and adeno-associated virus type 8 is more preferable.
  • CRISPR-Cas system is a system that uses the CRISPR-associated product (CRISPR / Cas) system discovered as acquired immunity of eubacteria and archaea for genome editing. , System, 337, pp. 816-821, 2012).
  • CRISPR / Cas CRISPR-associated product
  • a plurality of cassettes in which fragmented foreign DNA (20 bp) is incorporated are repeated, and different foreign DNAs are incorporated in each cassette.
  • each cassette is generated by fragmenting the DNA of an alien species (for example, a phage) when it is taken up into the cell and incorporating it into the CRISPR region.
  • Each cassette encodes a CRISPR RNA (crRNA).
  • the crRNA has a protospacer sequence and a sequence complementary to the trans-crRNA (tracrRNA) described later.
  • the protospacer sequence is 20 nucleotides in length and has a sequence complementary to the target DNA sequence.
  • the protospacer sequence need not have 100% complementarity with the target sequence, and mismatches are allowed in the region from the 5'end to 6 nucleotides.
  • the crRNA forms a complex with trans-crRNA (tracrRNA), which is transcribed separately via complementary moieties.
  • the complex of crRNA and tracrRNA forms an additional complex with Cas9 endonuclease.
  • the protospacer moiety in the crRNA hybridizes complementarily with the foreign DNA, thereby leading the Cas9 endonuclease to the target sequence of the foreign DNA.
  • the foreign DNA is cleaved by the Cas9 endonuclease at the site of the target sequence and the CRISPR-Cas9 system protects the host from the foreign DNA.
  • the CRISPR-Cas9 system was discovered by the functioning of eubacteria and paleontology as acquired immunity to new foreign DNA.
  • CRISPR-Cas vector system is a vector system containing a crRNA, a tracrRNA sequence, or a guide RNA (gRNA) having the functions of crRNA and tracrRNA, and a Cas gene sequence.
  • gRNA guide RNA
  • the predominantly used system is, but is not limited to, the CRISPR-Cas9 system of the second type, which is derived from Streptococcus pyogenes (S. pyogenes).
  • pharmaceutically acceptable carriers include excipients, diluents, bulking agents, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners, and flavoring agents. Examples include agents, solubilizers or other additives.
  • Pharmaceutical compositions in the form of ears, patches, ointments, injections, liquids, lozenges or elixirs can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration examples include topical solutions containing one or more active substances and prescribed by convention, suppositories for enteric administration, and the like.
  • dose and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected according to the sex, weight, age, severity, symptoms and the like of the patient. In general, for adults, 0.01 to 1000 mg / kg per day should be administered in 1 to several divided doses by oral or parenteral administration (eg, injection, infusion and administration to the rectal site). Just do it.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably further reduces the expression level of HBV DNA.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably further reduces the expression level of complete double-stranded DNA (ccDNA).
  • the pharmaceutical composition of the present invention binds to at least one sequence of the HBV RNA sequence corresponding to the EnhI region sequence on the HBV genomic DNA and the HBV RNA sequence corresponding to the EnhII region sequence on the HBV genomic DNA. It is useful as a drug for inhibiting the expression or function of a protein, or as a drug for suppressing or inhibiting the onset or progression of a disease involving the RNA-binding protein and treating or preventing the disease.
  • the screening method of the present invention is useful as a method for screening a substance that inhibits the production of HBV protein.
  • the screening method of the present invention is a method for screening a substance that inhibits the production of HBV protein, and comprises the HBV RNA sequence corresponding to the enhancer I region sequence on the HBV genomic DNA and the enhancer II region sequence on the HBV genomic DNA. It is useful as a screening method, which comprises identifying a substance that inhibits the expression or function of an RNA-binding protein that binds to at least one sequence selected from the corresponding HBV RNA sequences.
  • the HBV RNA sequence corresponding to the enhancer I region sequence on the hepatitis B virus genomic DNA is a sequence having 80% or more sequence identity with SEQ ID NO: 1, and the hepatitis B virus genomic DNA.
  • the HBV RNA sequence corresponding to the above enhancer II region sequence is a sequence having 80% or more sequence identity with SEQ ID NO: 2.
  • the screening method of the present invention also preferably identifies a substance that inhibits the production of HBs antigen as a hepatitis B virus protein.
  • the screening method of the present invention includes (A) An RNA-binding protein that binds to at least one sequence selected from the HBV RNA sequence corresponding to the EnhI region sequence on the HBV genomic DNA and the HBV RNA sequence corresponding to the EnhII region sequence on the HBV genomic DNA.
  • the process of identifying (B) A step of contacting a cell infected with HBV or a cell expressing HBV with a test substance that inhibits the function or activity of the identified RNA-binding protein or a test substance that reduces the expression level of the protein.
  • (C) A step of measuring the production ability of HBV protein in cells infected with HBV or cells expressing HBV, and (d) a step of selecting a substance having an activity of inhibiting the production of HBV protein in (c).
  • RNA-binding protein that binds to at least one sequence selected from the HBV RNA sequence corresponding to the EnhI region sequence on the HBV genomic DNA and the HBV RNA sequence corresponding to the EnhII region sequence on the HBV genomic DNA. Identification Steps For example, utilizing public RNA-binding protein sequence databases such as RNA-Binding Protein DataBase, RBPDB can be mentioned.
  • the public RNA-binding protein sequence database to be utilized is not particularly limited. By inputting the EnhI region sequence or the HBV RNA sequence corresponding to the EnhII region sequence on the HBV genomic DNA into RBPDB or a database similar thereto, RNA-binding proteins that bind to these region sequences can be extracted.
  • a pull-down assay using a cell extract derived from HepG 2.2.15 cells and RNA having a sequence corresponding to the EnhI region sequence or the EnhII region sequence on the HBV genomic DNA transcribed in vitro is performed.
  • Examples thereof include a method of identifying the obtained bound protein with a mass spectrometer or a method similar thereto.
  • the screening method of the present invention preferably includes (a) a step using an RNA-binding protein sequence database. Further, as another embodiment, it is preferable that (a) is a method including a step of performing a pull-down assay using RNA having a sequence corresponding to the EnhI region sequence or the EnhII region sequence on the HBV genomic DNA.
  • Step B Step of contacting HBV-infected cells or cells expressing HBV with a test substance that inhibits the function or activity of the identified RNA-binding protein or a test substance that reduces the expression level of the protein Infects HBV.
  • the cells were HBV clone C_JPNAT (GenBank: AB246345.1.) Infected human primary cultured hepatitis cells, or HepG2 cells in which sodium taurocholate protein carrying protein (NTCP) was forcibly expressed. : Cells infected with AB246345.1) can be mentioned.
  • the combination of the above HBV clone and cells is not particularly limited.
  • HBV for example, HepG2.2.15 cells or a plasmid containing a 1.24-fold lengthened genomic sequence of HBV clone C_JPNAT (GenBank: AB246345.1) was forcibly expressed.
  • Examples include HepG2 cells, Huh-7 cells, HepaRG cells, or human primary cultured hepatocytes.
  • the above HBV clone is not particularly limited.
  • the length of the sequence derived from the HBV genome inserted into the plasmid containing the genome sequence of the HBV clone is not particularly limited as long as it is 1.24 times or more the length of the genome sequence of the HBV clone.
  • test substance examples include substances selected from antibodies, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, antisense nucleic acids, double-stranded RNAs, adeno-associated virus vectors, CRISPR-Cas vector systems, and the like.
  • antisense nucleic acid or double-stranded RNA is preferable, and double-stranded RNA is more preferable.
  • double-stranded RNA it is particularly preferable that it is an RNA interfering agent.
  • Contact between HBV-infected cells or cells expressing HBV with the test substance can be carried out, for example, by adding the test substance to the culture medium and culturing for a certain period of time.
  • concentration of the test substance to be added varies depending on the type of substance (solubility, toxicity, etc.), but is appropriately selected in the range of, for example, about 0.1 nmol / L to about 100 nmol / L.
  • Examples of the culturing time include about 24 hours to about 120 hours.
  • Step of measuring HBV protein-producing ability in HBV-infected cells or HBV-expressing cells As a step of measuring the HBV protein-producing ability, the steps of culturing HBV-infected cells or HBV-expressing cells A method for measuring HBV protein in the Qing dynasty can be mentioned.
  • the HBV protein can be measured using the collected culture supernatant by a method such as chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA method), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method), or a method similar thereto.
  • CLIA method chemiluminescent enzyme immunoassay
  • ELISA method enzyme-linked immunosorbent assay
  • Step D Step of selecting a substance having an activity of inhibiting the production of the HBV protein of (c) For example, by allowing the test substance to act in (c), the production of HBV protein is increased by 30% as compared with the negative control.
  • a substance that suppresses preferably 50% or more, more preferably 70% or more, and even more preferably 90% or more can be selected.
  • compositions of the present invention are useful in the treatment or prevention of HBV infections.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can inhibit the production of HBV protein, particularly the production of HBs antigen.
  • HBV gene expression HBV DNA production
  • the pharmaceutical compositions of the present invention are useful for the treatment or prevention of HBV infection.
  • the present invention relates to the use of the pharmaceutical compositions of the present invention for inhibiting the production of HBsAg.
  • the present invention relates to the use of the pharmaceutical compositions of the present invention for inhibiting DNA production of HBV.
  • the present invention relates to the use of the pharmaceutical composition of the present invention for inhibiting gene expression of HBV.
  • the present invention relates to the use of the pharmaceutical compositions of the present invention for the treatment or prevention of HBV infection.
  • Diseases associated with HBV infection include advanced liver fibrosis, inflammation and necrosis, which progress to cirrhosis, end-stage liver disease and hepatocellular carcinoma.
  • the region 1086 bp containing the sequence of the 3'untranslated region (hereinafter, also referred to as “3'UTR”) of the gene encoding the HBs antigen is divided into the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • PCR was performed under the condition that 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C.
  • this plasmid is also referred to as "PreS2 / S-Luc-3'UTR".
  • PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype C)
  • Amplification for preparing a plasmid lacking the EnhI region by performing PCR under the condition of repeating 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds 35 times using a combination of primers consisting of 10 nucleotide sequences. Obtained a fragment. These fragments were ligated using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara) to obtain a plasmid lacking the EnhI region in the PreS2 / S-Luc-3'UTR plasmid. Hereinafter, this plasmid is also referred to as "PreS2 / S-Luc-3'UTR dEnhI".
  • Amplification for preparing a plasmid lacking the EnhII region by performing PCR under the condition of repeating 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds 35 times using a combination of primers consisting of 12 nucleotide sequences. Obtained a fragment.
  • HepG 2.2.15 cells which are cells that continuously produce viruses and have the HBV genome introduced into the hepatitis blastoma cell line HepG2 (Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 84, pp. 1005-1009, 1987).
  • DMEM / F-12 GlutaMAX (Invitrogen) + 5 ⁇ g / mL insulin (Wako) + 1% penicillin / streptomycin (Sigma) + 10 mmol / L HEPES (Sigma) + 50 ⁇ mol / L hydrocortisone (Sigma) +10 % FBS (manufactured by Equitech-Bio)
  • HepG 2.2.15 cells were suspended in the above medium, seeded on 96-well microtiter plates to 1 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L per well, and incubated in a 5% CO2 incubator at 37 ° C. for 24 hours.
  • FIG. 1 shows the results of calculating the relative value (%) of the luciferase luminescence amount in each defective plasmid-supplemented well with respect to the luminescence amount of firefly luciferase in the PreS2 / S-Luc-3'UTR plasmid-added well. ..
  • HepG 2.2.15 cells were suspended in the above medium, seeded on a 12-well microtiter plate at 2 ⁇ 10 5 cells / 1000 ⁇ L per well, and incubated in a 5% CO2 incubator at 37 ° C. for 24 hours.
  • the medium was exchanged at 1000 ⁇ L / well of the above-mentioned cell culture medium, and the medium was incubated in a 5% CO2 incubator at 37 ° C. for another 24 hours. Then, the culture supernatant was discarded, the cells were washed with phosphate buffered saline (1000 ⁇ L / well, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and total RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (manufactured by Qiagen). 1 ⁇ g of the extracted total RNA was reverse transcribed using a PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser (manufactured by Takara) to prepare cDNA.
  • RNeasy Mini Kit manufactured by Qiagen
  • the expression level of firefly luciferase RNA was quantified based on the prepared cDNA, and the firefly luciferase RNA in each plasmid-added well with respect to the expression level of firefly luciferase RNA in the wells transfected with the PreS2 / S-Luc-3'UTR plasmid.
  • the result of calculating the relative value (%) of the expression level of is shown in FIG.
  • the relative luminescence amount derived from the firefly luciferase protein decreased by about 70% to 80% (Fig. 1). Therefore, the above phenomenon may be caused by a decrease in transcriptional activity (decrease in firefly luciferase RNA expression level) due to deletion of the EnhI region or EnhII region from the DNA sequence, or a region corresponding to EnhI or EnhII from the RNA sequence. It was considered that this may be due to the functional change of RNA due to the deletion of the region corresponding to.
  • the relative expression level of firefly luciferase RNA was hardly changed due to the deletion of the EnhI region or the EnhII region (Fig. 2). From this, it is clear that the decrease in the relative luminescence amount due to the deletion of the EnhI region or the EnhII region is due to the functional change of RNA due to the deletion of the region corresponding to EnhI or the region corresponding to EnhII from the RNA sequence. became. That is, it was revealed that the region corresponding to EnhI on the HBV genomic DNA or the region corresponding to EnhII on the HBV genomic DNA functions on RNA and controls the expression level of the protein.
  • RNA-binding protein In silico identification of RNA-binding protein, Since the region corresponding to EnhI and the region corresponding to EnhII function on RNA, we attempted to identify RNA-binding proteins that bind to these regions.
  • the putative RNA-binding protein is the EnhI-equivalent region (GenBank: AB246345, base number 1060-) of RNA encoding HBs antigen against a public RNA-binding protein sequence database (RNA-Binding Protein DataBase, RBPDB).
  • RNA sequence corresponding to EnhI region consisting of 1260, SEQ ID NO: 1), or EnhII corresponding region in 3'UTR of RNA encoding HBs antigen (GenBank: AB246345, corresponding to EnhII region consisting of base numbers 1638 to 1771)
  • SEQ ID NO: 2 The RNA sequence to be used, SEQ ID NO: 2) was input, and the protein was identified by executing a binding protein prediction program.
  • RBPDB is a database that stores information on RNA-binding proteins and their binding sequences obtained from in vitro and in vitro experiments using humans, mice, flies, etc., and the sequence can be entered by inputting the base sequence of RNA. It is possible to extract RNA-binding proteins that are presumed to bind to RNA (Nucleic Acids Res, Vol. 39, pp. D301-D308, 2011).
  • RNA-binding proteins would bind to at least one region of the EnhI-equivalent region and the EnhII-equivalent region on the RNA encoding the HBs antigen.
  • HepG 2.2.15 cells which are cells that continuously produce viruses, in which the HBV genome has been introduced into the hepatoblastoma cell line HepG2 (Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 84, pp. 1005-1009, 1987).
  • the anti-HBV effect due to inhibition of each molecule was evaluated by the following procedure. The following was used as a medium for cell culture.
  • SMARTpool ON-TARGETplus RBFOX1 siRNA (L-0133377-01), SMARTpool: ON-TARGETplus ELAVL1 siRNA (L-003773-00), SMARTpool: ON-TARGETplus ELVAL2 MBNL1 siRNA (L-014136-00), SMARTpool: ON-TARGETplus RBMX siRNA (L-011691-01), SMARTpool: ON-TARGETplus PUM2 siRNA (L-014031-02), SMARTpool: ON-TL1LTL 015332-02), SMARTpool: ON-TARGETplus SRSF1 siRNA (L-018672-01), SMARTpool: ON-TARGETplus SRSF9 siRNA (L-019529-01), SMARTpool: ON-TARGETplus SRSF10 SMARTpool: ON-TARGETplus KHDRBS3 siRNA (L-012748-01), SMARTpool:
  • HepG 2.2.15 cells were suspended in the above medium to prepare a 2 ⁇ 10 5 cell / mL HepG 2.2.15 cell suspension.
  • the dsRNA was diluted with Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) (manufactured by Thermo Fisher Scientific) to prepare a dsRNA solution of 2.743 to 2000 nmol / L, a 3-fold dilution series.
  • 1.5 ⁇ L of prepared dsRNA solution and 0.3 ⁇ L of Lipofectamine RNAiMAX (manufactured by Thermo Fisher Scientific) were diluted with 8.2 ⁇ L of serum-free medium (manufactured by Thermo Fisher Scientific) and incubated at room temperature for 5 minutes.
  • the culture supernatant was collected, and the cell viability was measured using CellTiter96 AQueuous One Solution Cell Proflation Assay (manufactured by Promega).
  • the amount of HBsAg in the collected culture supernatant was measured using AlphaLISA Hepatitis B Virus Surface Agent (HBsAg) Kit (manufactured by Perkin Elmer).
  • the collected culture supernatant was treated with a mixture of Buffer AL (manufactured by Qiagen) and Proteinase K (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and the HBV DNA (HBV DNA) in the obtained solution was quantified by a real-time PCR method. did.
  • Buffer AL manufactured by Qiagen
  • Proteinase K manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • Knockdown of RBFOX1, SRSF10, ELAVL1 and PUM2 reduced HBsAg by up to 30%, and knockdown of SRSF9, SNRPA, YTHDC1 and SRSF1 reduced HBsAg by up to 70-90% (FIG. 3).
  • knockdown of PUM2 and SRSF1 reduced HBV DNA by up to 40 to 50%
  • knockdown of YTHDC1 reduced HBV DNA by up to 80%.
  • knockdown of these genes did not affect cell viability (Fig. 4).
  • this plasmid is also referred to as "PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype A)".
  • PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype A) plasmid as a template, the combination of the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7
  • a plasmid lacking the EnhI region was obtained by performing PCR under the condition of repeating 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C.
  • the combination of the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 A plasmid lacking the EnhII region was obtained by performing PCR under the condition that 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were repeated 35 times using a combination of a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18. Amplified fragments for fabrication were obtained.
  • the 3'UTR sequence of the gene encoding the HBs antigen (hereinafter also referred to as "3'UTR (genotype B)) is used.
  • PCR of the containing region 1095 bp under the condition of repeating 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds 35 times using a combination of a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 and a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the combination of the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 and the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 A plasmid lacking the EnhI region was obtained by performing PCR under the condition that 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were repeated 35 times using a combination of a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23. Amplified fragments for fabrication were obtained.
  • PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype B) plasmid were ligated using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara) to obtain a plasmid lacking the EnhI region in the PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype B) plasmid.
  • this plasmid is also referred to as "PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype B) dEnhI”.
  • the combination of the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 and the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 A plasmid lacking the EnhII region was obtained by performing PCR under the condition of repeating 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds 35 times using a combination of a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 and a plasmid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25.
  • the 3'UTR sequence of the gene encoding the HBs antigen (hereinafter also referred to as "3'UTR (genotype D)").
  • 3'UTR gene encoding the HBs antigen
  • This fragment was treated with a combination of XbaI (manufactured by Takara) and SalI (manufactured by Takara) and inserted into the XbaI and SalI sites of PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype C) prepared in Test Example 1. To obtain a ligated plasmid.
  • this plasmid is also referred to as "PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype D)".
  • a combination of a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28, a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 A plasmid lacking the EnhI region was obtained by performing PCR under the condition that 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were repeated 35 times using a combination of a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29. Amplified fragments for fabrication were obtained.
  • PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype D) plasmid were ligated using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara) to obtain a plasmid lacking the EnhI region in the PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype D) plasmid.
  • this plasmid is also referred to as "PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype D) dEnhI”.
  • the combination of the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30 and the primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 A plasmid lacking the EnhII region was obtained by performing PCR under the condition of repeating 98 ° C. for 10 seconds, 58 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds 35 times using a combination of a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 and a plasmid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31.
  • a reporter assay was performed using HepG 2.2.15 cells according to the following procedure. The following was used as a medium for cell culture.
  • HepG 2.2.15 cells were suspended in the above medium, seeded on 96-well microtiter plates to 1 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L per well, and incubated overnight at 37 ° C. in a 5% CO2 incubator.
  • PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype A), PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype B), PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype C), PreS2 / S -
  • the result of calculating the relative value (%) of the luminescence amount of luciferase in each genotype-deficient plasmid-added well to the luminescence amount of firefly luciferase in each plasmid-added well of Luc-3'UTR (genotype D) is calculated. It is shown in FIG.
  • HepG 2.2.15 cells were suspended in the above medium, seeded on a 24-well microtiter plate to 1 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ L per well, and incubated overnight at 37 ° C. in a 5% CO2 incubator.
  • the expression level of firefly luciferase RNA was quantified based on the prepared cDNA, and PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype A), PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype B), PreS2 / S. -In each genotype-deficient plasmid-supplemented well with respect to the expression level of firefly luciferase RNA in each plasmid-supplemented well of Luc-3'UTR (genotype C) and PreS2 / S-Luc-3'UTR (genotype D)
  • the results of calculating the relative value (%) of the luciferase RNA expression level are shown in FIG.
  • deletion of the EnhI region or the EnhII region reduced the relative luminescence amount derived from the firefly luciferase protein by 87% to 90% (Fig. 5).
  • the relative expression level of firefly luciferase RNA decreased by 31 to 49% due to the deletion of the EnhI region or the EnhII region.
  • deletion of the EnhI region or the EnhII region reduced the relative luminescence amount derived from the firefly luciferase protein by 65% to 80%.
  • the relative expression level of firefly luciferase RNA decreased by 39 to 43% due to the deletion of the EnhI region or the EnhII region.
  • deletion of the EnhI region or the EnhII region reduced the relative luminescence amount derived from the firefly luciferase protein by 74% to 84%.
  • the relative expression level of firefly luciferase RNA decreased by 34 to 61% due to the deletion of the EnhI region or the EnhII region.
  • deletion of the EnhI region or the EnhII region reduced the relative luminescence amount derived from the firefly luciferase protein by 86% to 91%.
  • the relative expression level of firefly luciferase RNA decreased by 51 to 52% due to the deletion of the EnhI region or the EnhII region.
  • the pharmaceutical composition of the present invention exhibits excellent anti-HBV activity and is useful as an anti-hepatitis B virus agent.

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Abstract

本発明の課題は、新規な抗Ｂ型肝炎ウイルス剤として有用な医薬組成物、およびスクリーニング方法を提供することである。本発明によれば、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬組成物であって、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列、およびＢ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害することを特徴とする、医薬組成物が提供される。

Description

Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬組成物およびスクリーニング方法
　本発明は、抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を有する医薬組成物およびＢ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。
　Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス属に属するウイルスで、直径約４２ｎｍの球状のＤＮＡウイルスである。ウイルスそのものは、外被（エンベロープ、ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、不完全二重鎖のＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素などを含む、直径２７ｎｍの芯（コア、ｃｏｒｅ）からなるＤＮＡウイルスであり、Ｄａｎｅ粒子と呼ばれている。二重構造を形成し、外側はＨＢｓ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｓＡｇ）、内側はＨＢｃ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｃｏｒｅ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｃＡｇ）と遺伝子ＤＮＡからなっている（非特許文献１）。
　ＨＢｓ抗原は、Ｄａｎｅ粒子以外に、中空粒子、小型球形粒子または桿状粒子として存在する。
　ＨＢＶのゲノムＤＮＡには、ｐｒｅ－Ｓ／Ｓ遺伝子領域、Ｐ遺伝子領域、Ｘ遺伝子領域、ｐｒｅ－Ｃ／Ｃ遺伝子領域の４種類の転写解読枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）、３つのプロモーター、および２つのエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ、Ｅｎｈ）領域がある。Ｘ遺伝子領域のｃｏｒｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｃ遺伝子領域のｐｒｅｃｏｒｅ領域は、ＨＢｅ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｅＡｇ）構成タンパク質の産生に関与し、この領域のｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎによりＨＢｅ抗原構成タンパク質が産生されなくなり、ＨＢｅ抗原陰性となる。
　また、２つのエンハンサー領域はエンハンサーＩ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｉ、ＥｎｈＩ）およびエンハンサーＩＩ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ　ＩＩ、ＥｎｈＩＩ）と呼ばれ、いずれも３つ全てのプロモーター活性を増大させることが可能である（特許文献１）。
　ＨＢＶは肝細胞に侵入すると、不完全環状二本鎖ＤＮＡが肝細胞の核内に取り込まれ、完全閉鎖二本鎖ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｙ　ｃｌｏｓｅｄ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ）に転換される。ＨＢＶの慢性感染状態では、ｃｃｃＤＮＡは肝細胞１個あたり５～５０個、ミニ染色体として存在する。肝細胞核内のｃｃｃＤＮＡからは４種のＲＮＡが転写され、それらより構造タンパク質であるＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原およびＨＢｅ抗原、Ｘタンパク質ならびに逆転写酵素を含むポリメラーゼが翻訳される。ＲＮＡの１つはｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ　ＲＮＡとしてコア粒子に取り込まれ、逆転写酵素の働きによりマイナス鎖ＤＮＡが合成され、次にプラス鎖ＤＮＡが合成され不完全環状二本鎖ＤＮＡとなる。さらに、ＨＢｓ抗原より形成されるエンベロープに包まれてウイルス粒子（Ｄａｎｅ粒子）となり血中に放出される。ＲＮＡにより翻訳されたＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原およびｐ２２ｃｒ抗原を含む中空粒子（ＤＮＡの核が無い粒子）や肝細胞膜を通過するＨＢｅ抗原などは、Ｄａｎｅ粒子の血中放出ルートとは別に多量に血中に放出、分泌される。この作用は、ＨＢＶ感染における宿主免疫機構の攻撃から逃れている作用と考えられる。ＨＢｅ抗原、ＨＢｃ抗原およびｐ２２ｃｒ抗原は、ＨＢｃｒ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｃｏｒｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｃｒＡｇ）として測定可能であり、ウイルス複製のマーカーとして使用されている（非特許文献１）。
　Ｂ型肝炎とは、ＨＢＶに感染することで発症するウイルス性肝炎の一つであり、感染者数は全世界で約２億４０００万人であるとされている。先述のように、ＨＢＶに感染すると、Ｄａｎｅ粒子が血中に放出されるとともに、Ｄａｎｅ粒子の放出ルートとは別にウイルスタンパク質が血中に大量に分泌される。ウイルスタンパク質のうち、とくにＨＢｓ抗原は宿主であるヒトの免疫機構による感染細胞の排除を妨害している可能性が指摘されている（非特許文献２、３）。したがって、Ｂ型肝炎の治療には、Ｄａｎｅ粒子を減らすこと、すなわちウイルスの増殖を抑制するとともに、ＨＢｓ抗原をはじめとするウイルスタンパク質を減らすことが重要であると考えられている。
　Ｂ型肝炎の第一選択薬には、エンテカビルやテノホビなどの核酸アナログが使用されている。核酸アナログ製剤はＨＢＶポリメラーゼタンパクの活性を阻害、不完全環状二本鎖ＤＮＡの生成を阻害することにより、血中のＤａｎｅ粒子を減少、すなわちウイルスの増殖を抑制することが可能である。しかしながら、核酸アナログ製剤はＨＢｓ抗原を減少させることができないため、宿主免疫機構による感染細胞の排除を達成することは困難である。そのため、ＨＢｓ抗原の減少を達成可能な医薬品の開発が望まれている。
　近年、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の原理によりＨＢＶ　ＲＮＡに結合し、これを分解する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の研究開発が進められている。これら二本鎖ＲＮＡは、ＨＢＶ感染細胞などにおいてＨＢｓ抗原を減少させることが報告されている（非特許文献４）。二本鎖ＲＮＡはその性質上、ＨＢＶ　ＲＮＡに結合し効果を発揮するためには、ＨＢＶ　ＲＮＡと高い配列同一性を有する必要がある。しかしながら、ＨＢＶには８種類の遺伝子型が存在すること、遺伝子変異などによりＲＮＡの配列が変化することなどから、ＨＢＶ　ＲＮＡに結合する二本鎖ＲＮＡの効果を期待できない例が懸念されている。実際、Ｂ型肝炎患者から採取したＨＢＶを分析した結果、同一患者において遺伝子配列の異なる複数のクローンが存在すること、ＨＢＶ　ＲＮＡに対する二本鎖ＲＮＡの効果が減弱するクローンが存在することが報告されている（非特許文献５）。したがって、新たな作用メカニズムによりＨＢｓ抗原の減少を達成可能な医薬品の開発が必要である。
　ＨＢＶは自身の遺伝子からＲＮＡを転写するために必要な分子群、およびＲＮＡからウイルスタンパク質を産生するために必要な分子群を有していない。したがって、ＨＢＶの増殖やウイルスタンパク質の産生には、感染したヒト肝細胞がもつ分子群を利用しなければならない。そこで、ＨＢＶが利用するヒトタンパク質を標的とし、ＨＢＶの増殖やウイルスタンパク質の産生を阻害する新たなアプローチが注目され始めた。
　例えば、ＨＢＶゲノムＤＮＡ中のエンハンサーＩに結合する核酸分子を用いて、ＨＢＶゲノムＤＮＡからＨＢＶ　ＲＮＡへの転写を制御し、ＨＢＶの複製を調節する試みがなされている（特許文献２）。また、ＨＢＶゲノムＤＮＡ中のエンハンサー領域に作用する転写因子の発現を制御することにより、ＨＢＶ　ＲＮＡへの転写を制御し、ＨＢＶの増殖を抑制する試みがなされている（特許文献３～５）。
　しかしながら、宿主であるヒトのどの因子がＨＢＶの増殖やウイルスタンパク質の産生に必要なのか、それらを制御することによりどのような抗ＨＢＶ効果につながるのか、十分に明らかにはなっていない。
国際公開第２００５－０５９１３８号パンフレット 米国特許出願公開第２００３／０１４８９８５Ａ１号明細書 特表２０１８－５２６３３２号公報 特表２００７－５２０４６１号公報 特表２００５－５３２０５２号公報
田中ら、モダンメディア、５４巻、１２号、３４７～３５２頁、２００８年 Ｂｒｏｕｗら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２６巻、２８０～２８９頁、２００８年 Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８３巻、１２８１～１２８９頁、２００２年 Ｗｏｏｄｄｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、２１巻、５号、９７３～９８５頁、２０１３年 Ｗｕら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２８巻、７０８～７１６頁、２００５年
　本発明の課題は、宿主因子であるヒトタンパク質を標的とし、抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）活性を有する新規の医薬組成物を提供することである。また、本発明の課題は、ヒトタンパク質を標的とし、ＨＢＶタンパク質の産生を抑制する医薬組成物を提供することである。さらに、本発明の課題は、宿主因子を標的とし、ＨＢＶタンパク質の産生を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題に対し鋭意研究を重ねた結果、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ（ＨＢＶゲノムＤＮＡ）上のエンハンサーＩ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｉ、ＥｎｈＩ）領域配列およびエンハンサーＩＩ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ　ＩＩ、ＥｎｈＩＩ）領域配列に相当する、Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡ（ＨＢＶ　ＲＮＡ）配列の少なくとも１つの領域に結合するヒトタンパク質を阻害する医薬組成物が、ＨＢＶタンパク質の産生阻害能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下を提供する。
＜１＞
　Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する医薬組成物であって、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害することを特徴とする、医薬組成物。
＜２＞
　ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列が、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列である、＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞
　ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列が、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する配列であり、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列が、配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する配列である、＜１＞または＜２＞に記載の医薬組成物。
＜４＞
　ＨＢＶタンパク質が、ＨＢｓ抗原タンパク質である、＜１＞～＜３＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜５＞
　さらに、ＨＢＶゲノムＤＮＡの発現量を低下することを特徴とする、＜１＞～＜４＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜６＞
　さらに、完全二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の発現量を低下することを特徴とする、＜１＞～＜５＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜７＞
　ＲＮＡ結合タンパク質が、ＲＢＦＯＸ１、ＥＬＡＶＬ２、ＭＢＮＬ１、ＲＢＭＸ、ＳＲＳＦ９、ＳＲＳＦ１０、ＳＮＲＰＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２、ＹＴＨＤＣ１、ＳＲＳＦ１、ＫＨＤＲＢＳ３およびＥＩＦ４Ｂより選択される少なくとも１つのタンパク質である、＜１＞～＜６＞のいずれか一つに記載の医薬組成物。
＜８＞
　ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質を同定することを特徴とする、スクリーニング方法。
＜９＞
　ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列が、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列である、＜８＞に記載のスクリーニング方法。
＜１０＞
　ＨＢＶタンパク質が、ＨＢｓ抗原タンパク質である、＜８＞または＜９＞に記載のスクリーニング方法。
＜１１＞
　Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
　（ａ）ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質を同定する工程、
　（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞に対し、同定したＲＮＡ結合タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質、または同タンパク質の発現量を低下させる被験物質を接触させる工程、
　（ｃ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程、および
　（ｄ）（ｃ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
を含む、方法。
＜１２＞
　（ａ）が、ＲＮＡ結合タンパク質配列データベースを用いる工程を含む、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞
　（ｂ）の被験物質が、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系である、＜１１＞に記載の方法。
＜１４＞
　（ｃ）が、ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞の培養上清中のＨＢＶタンパク質を測定する工程を含む、＜１１＞に記載の方法。
＜１５＞
　（ｄ）の物質が、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系である、＜１１＞に記載の方法。
　また、本発明は、以下を提供する。
＜ａ＞
　＜１＞～＜７＞のいずれか一つに記載の医薬組成物を、ＨＢＶに感染しているか、または、ＨＢＶ感染が関連する疾病にかかっている対象に投与することを含む、処置方法。
＜ｂ＞
　ＨＢＶ感染が関連する疾病が、Ｂ型肝炎、それらによる肝硬変、またはそれらによる肝がんである、＜ａ＞に記載の処置方法。
＜ｃ＞
　＜１＞～＜７＞のいずれか一つに記載の医薬組成物；および
　ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置方法が記載されている指示書
を含む、ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置用キット。
＜ｄ＞
　前記ＨＢＶ感染が関連する疾病の処置方法が、前記医薬組成物を、ＨＢＶに感染しているか、または、ＨＢＶ感染が関連する疾病にかかっている対象に投与することを含む、＜ｃ＞に記載のＨＢＶ感染が関連する疾病の処置用キット。
＜ｅ＞
　Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する処置において使用するための、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質。
＜ｆ＞
　Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）の産生を阻害する医薬組成物の製造のための、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質の使用。
　本発明の医薬組成物は、優れた抗ＨＢＶ活性を有し、抗ＨＢＶ剤として有用である。また、本発明のスクリーニング方法は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質のスクリーニングに有用である。
図１は、遺伝子型Ｃ由来のＥｎｈＩ／ＥｎｈＩＩ領域欠損コンストラクトを用いたレポーターアッセイにおける、ホタルルシフェラーゼの相対発光量（％）を示す。 図２は、遺伝子型Ｃ由来のＥｎｈＩ／ＥｎｈＩＩ領域欠損コンストラクトを用いたレポーターアッセイにおける、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量（％）を示す。 図３は、ＨＢｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）について、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対する各ｄｓＲＮＡ添加ウェルの相対値（％）を示す。 図４は、細胞生存率について、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対する各ｄｓＲＮＡ添加ウェルの相対値（％）を示す。 図５は、各種遺伝子型由来のＥｎｈＩ／ＥｎｈＩＩ領域欠損コンストラクトを用いたレポーターアッセイにおける、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量（％）およびホタルルシフェラーゼの相対発光量（％）を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本明細書において、特に断らない限り、各用語は、次の意味を有する。
　予防とは、発症の阻害、発症リスクの低減または発症の遅延などを意味する。
　治療とは、対象となる疾患または状態の改善または進行の抑制などを意味する。
　処置とは、各種疾患に対する予防または治療などを意味する。
　有効量とは、治療有効量または予防有効量などを意味する。
　治療有効量とは、感染した対象におけるＨＢＶ感染の安定化、ＨＢＶ感染の低減またはＨＢＶ感染の根絶に十分な量である。また、予防有効量とは、感染するリスクのある対象におけるＨＢＶ感染の予防に十分な量である。
　対象とは、ヒトを含む哺乳動物を意味する。
＜Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）＞
　Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、Ｂ型肝炎を発症させる能力を有するウイルスを意味する。ＨＢＶは遺伝子変異に由来する塩基配列の違いにより、現在Ａ型～Ｈ型までの８つの遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）に分類されている。本発明の医薬組成物における予防または治療の対象となるＨＢＶとしては、全ての遺伝子型を含む。
　本発明において、ＨＢＶ感染が関連する疾病としては、Ｂ型肝炎が挙げられ、急性肝炎、慢性肝炎および劇症肝炎が挙げられる。また、ヒトを含む生体へのＨＢＶの感染により引き起こされる疾患であれば、肝硬変、肝線維化、肝細胞がんなどの肝がんも含まれる。
＜Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）＞
　Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質（ＨＢＶタンパク質）は、ＨＢＶを構成するタンパク質であり、ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢｅ抗原などが挙げられる。
　本発明において、ＨＢＶタンパク質は、特に限定されないが、ＨＢｓ抗原であることが好ましい。
＜ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列およびＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列＞
　ＨＢＶゲノムＤＮＡ上には２つのエンハンサー領域（ＥｎｈＩおよびＥｎｈＩＩ）を有し、ＥｎｈＩおよびＥｎｈＩＩはＨＢＶゲノムＤＮＡからＨＢＶ　ＲＮＡへの転写を促進することが知られている。
　本発明において、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列およびＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列とは、ＨＢＶ　ＲＮＡ配列のうち、ＨＢＶタンパク質をコードするＲＮＡの３’非翻訳領域（以下３’ＵＴＲともいう）内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域の塩基配列、あるいはＨＢＶタンパク質をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩに相当する領域の塩基配列を意味する。
　本発明において、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列およびＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列とは、ＨＢＶ　ＲＮＡ配列のうち、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域の塩基配列、あるいはＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内にある、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩに相当する領域の塩基配列が好ましい。
　本発明において、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する配列が挙げられ、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列は、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列が挙げられる。
　上記ＨＢＶ　ＲＮＡは、ＨＢＶタンパク質をコードするＲＮＡであり、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡであることが好ましい。
　上記ＨＢＶ　ＲＮＡ配列は、例えば、配列番号１または配列番号２の配列が挙げられる。上記配列は、配列番号１または配列番号２の配列と８０％以上の配列同一性を有していることが好ましく、８５％がより好ましく、９０％がさらに好ましく、９５％がよりさらに好ましく、９８％がよりさらに好ましく、１００％の配列同一性を有していることが特に好ましい。
配列番号１：
uuauaugcauguauacaaucuaagcaggcuuucacuuucucgccaacuuacaaggccuuucuguguaaacaauaucugaaccuuuaccccguugcccggcaacggucaggucucugccaaguguuugcugacgcaacccccacuggauggggcuuggcuaucggccaucgccgcaugcguggaaccuuuguggcuccgcug
配列番号２：
uugcccaaggucuuauauaagaggacucuuggacucucagcgaugucaacgaccgaccuugaggcauacuucaaagacuguuuguuuaaggacugggaggaguugggggaggagauuagguuaaagauuuuugu
＜ＲＮＡ結合タンパク質＞
　ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）は、特定の標的ＲＮＡと配列特異的に結合し、ＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化、キャッピング、修飾、輸送、局在化、翻訳、代謝回転など、転写後および転写後のタンパク質発現において様々な細胞機能を制御することが知られている（Ｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４９９巻、１１号、２０１３年）。
　本発明において、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＨＢＶ　ＲＮＡ上の特定の配列に結合することで、ＨＢＶタンパク質の発現（産生）を制御すると推測される。
　上記ＨＢＶ　ＲＮＡは、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡであることが好ましい。
　上記ＨＢＶ　ＲＮＡ上の特定の配列は、例えば、配列番号１または配列番号２の配列が挙げられる。上記配列は、配列番号１または配列番号２の配列に対して、８０％以上の配列同一性を有していることが好ましく、８５％がより好ましく、９０％がさらに好ましく、９５％がよりさらに好ましく、９８％がよりさらに好ましく、１００％の配列同一性を有していることが特に好ましい。
　本発明において、ＲＮＡ結合タンパク質は、上記配列上の４～９塩基を認識して結合するものが好ましく、例えば、ＲＢＦＯＸ１（RNA binding protein, fox-1 homolog）、ＥＬＡＶＬ２（ELAV like RNA binding protein 2）、ＭＢＮＬ１（muscleblind-like Protein 1）、ＲＢＭＸ（RNA-binding motif protein, X chromosome）、ＳＲＳＦ９（serine and arginine rich splicing factor 9）、ＳＲＳＦ１０（serine and arginine rich splicing factor 10）、ＳＮＲＰＡ（small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A）、ＥＬＡＶＬ１（ELAV like RNA binding protein 1）、ＰＵＭ２（pumilio homolog 2）、ＹＴＨＤＣ１（YTH domain containing 1）、ＳＲＳＦ１（serine and arginine rich splicing factor 1）、ＫＨＤＲＢＳ３（KH RNA binding domain containing, signal transduction associated 3）またはＥＩＦ４Ｂ（eukaryotic translation initiation factor 4B）などが挙げられる。
　本発明のＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＢＦＯＸ１、ＥＬＡＶＬ２、ＭＢＮＬ１、ＲＢＭＸ、ＳＲＳＦ９、ＳＲＳＦ１０、ＳＮＲＰＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２、ＹＴＨＤＣ１、ＳＲＳＦ１、ＫＨＤＲＢＳ３、およびＥＩＦ４Ｂより選択される少なくとも１つのタンパク質であることが好ましい。
＜医薬組成物＞
　本発明の医薬組成物は、「物質」、具体的には「ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質」と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
　本発明の医薬組成物は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質として、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）Ｉ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサー（Ｅｎｈ）ＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質を含む。
　本発明の医薬組成物は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質が好ましく、ＨＢｓ抗原の産生を阻害する物質がより好ましい。
　「物質」としては、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクター、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系などが挙げられる。
　「アンチセンス核酸」は、あるタンパク質をコードする「センス」核酸、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖、ｍＲＮＡ配列または遺伝子のコード鎖の塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的とする塩基配列と特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
　「ＲＮＡｉ核酸」は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸を含むが、それらに限定されない。
　「二本鎖ＲＮＡ」は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸を含むが、それらに限定されない。
　「ＲＮＡ干渉剤」は、ＲＮＡ干渉を介して標的遺伝子の発現を干渉または阻害する核酸である。
　ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いてｄｓＲＮＡと同じ配列を含むｍＲＮＡを分解する、転写後標的遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７巻，２４３１～２４３２頁、２０００年；Ｚａｍｏｒｅら、Ｃｅｌｌ、１０１巻、２５～３３頁、２０００年；Ｔｕｓｃｈｌら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１３巻、３１９１～３１９７、１９９９年）。内因性リボヌクレアーゼが長いｄｓＲＮＡを切断し、より短い２１または２２ヌクレオチド長の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡを生成する場合に生じる。このｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの分解を仲介する。ＲＮＡｉの合成のためのキットは、例えばＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏｌａｂｓおよびＡｍｂｉｏｎから商業的に入手可能である。一つの態様において、アンチセンスＲＮＡに使用するための上記化学の一つ以上が使用できる。
　本発明の医薬組成物に含まれる物質としては、アンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡが好ましく、二本鎖ＲＮＡがより好ましい。
　また、二本鎖ＲＮＡの場合、ＲＮＡ干渉剤であることが特に好ましい。
　「アデノ随伴ウイルス」は、パルボウイルス科に属する約４７００塩基からなる一本鎖ＤＮＡウイルスであり、エンベロープをもたず直径２０～３０ｎｍの正二十面体構造のキャプシドを有しており、細胞膜も普遍的成分であるヘパラン硫酸プロテオグリカンを認識して感染するため、宿主域は広い。
　アデノ随伴ウイルスのゲノム内には、任意の遺伝子、核酸を挿入することができる。したがって、遺伝子改変を行ったアデノ随伴ウイルスを標的となる細胞に感染させることで目的の遺伝子、核酸を導入することができることから、アデノ随伴ウイルスは遺伝子導入のためのベクターとして用いることができる。さらに、「アデノ随伴ウイルスベクター」は、病原性がなく、終末分化した非分裂細胞にも遺伝子導入できるため、遺伝子治療への応用が期待されている。
　アデノ随伴ウイルスは血清型の違いにより、組織および細胞への感染指向性が異なることが知られている（小澤ら、Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ、２２巻、６号、６４３～６５０頁、２００７年）。
　本発明の医薬組成物に含まれる物質としては、アデノ随伴ウイルス５型、アデノ随伴ウイルス７型、アデノ随伴ウイルス８型またはアデノ随伴ウイルス９型が好ましく、アデノ随伴ウイルス８型がより好ましい。
　「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系」は、真性細菌や古細菌が有する獲得免疫として発見されたＣｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムをゲノム編集に転用したシステムである（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７巻、８１６～８２１頁、２０１２年）。具体的には、上記細菌のＣＲＩＳＰＲ領域と呼ばれるゲノム領域には、断片化された外来ＤＮＡ（２０ｂｐ）が取り込まれたカセットが複数リピートしており、各カセットには、異なる外来ＤＮＡが取り込まれている。
　各カセットは、外来生物（例えば、ファージなど）のＤＮＡが細胞内に取り込まれた場合にこれを断片化してＣＲＩＳＰＲ領域に組み込むことで生じると考えられる。
　各カセットは、ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードしている。ｃｒＲＮＡは、プロトスペーサー配列と後述するｔｒａｎｓ－ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と相補的な配列とを有する。プロトスペーサー配列は、２０ヌクレオチド長であり、標的となるＤＮＡ配列と相補的な配列を有する。プロトスペーサー配列は、標的配列と１００％の相補性を有している必要はなく、５’末端から６ヌクレオチドの領域ではミスマッチが許容される。ｃｒＲＮＡは、相補的部分を介して別に転写されるｔｒａｎｓ－ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体を形成する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとさらなる複合体を形成する。ｃｒＲＮＡ中のプロトスペーサー部分は、外来ＤＮＡと相補的にハイブリッド形成を行い、これによりＣａｓ９エンドヌクレアーゼを外来ＤＮＡの標的配列に先導する。外来ＤＮＡは標的配列の部位においてＣａｓ９エンドヌクレアーゼにより切断され、ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムは、外来ＤＮＡから宿主を防御する。
　このようにＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムは、真性細菌や古細菌が新しい外来ＤＮＡに対する獲得免疫として機能することで発見されたものであるが、外来ＤＮＡからなるプロトスペーサーを設計することで、哺乳動物のゲノムを配列依存的に切断できること、およびそれにより、哺乳動物のゲノムを編集することができる。
　「ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓベクター系」とは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの機能を併せ持つガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、およびＣａｓ遺伝子配列を含んでなるベクター系である。現在主に使用されているシステムは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する第２種のＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９システムであるが、これに限定されない。
　また、薬学的に許容され得る担体とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤などが挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、粉体製剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、貼付剤、軟膏剤、注射剤、液剤、トローチ剤あるいはエリキシル剤などの形態の医薬組成物を調製することができる。
　これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、定法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤などが含まれる。
　また、本発明の医薬組成物の投与量および投与回数は、患者の性別、体重、年齢、重症度および症状などに応じて適宜選択することができる。通常、成人に対しては、経口または非経口（例えば、注射、点滴および直腸部位への投与など）投与により、１日当たり０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇを１回から数回に分割して投与すればよい。
　本発明の医薬組成物は、さらにＨＢＶ　ＤＮＡの発現量を低下することが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、さらに完全二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の発現量を低下することが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列の少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害するための医薬品として、または、上記ＲＮＡ結合タンパク質が関与する疾患の発症または進行を抑制、阻害し、上記疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。
＜スクリーニング方法＞
　本発明のスクリーニング方法は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法として有用である。
　本発明のスクリーニング方法は、ＨＢＶタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質を同定することを特徴とする、スクリーニング方法として有用である。
　本発明のスクリーニング方法は、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列が、配列番号1と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列であることが好ましい。
　本発明のスクリーニング方法はまた、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質として、ＨＢｓ抗原の産生を阻害する物質を同定することが好ましい。
　本発明のスクリーニング方法としては、
　（ａ）ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質を同定する工程、
　（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞に対し、同定したＲＮＡ結合タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質、または同タンパク質の発現量を低下させる被験物質を接触させる工程、
　（ｃ）ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程、および
　（ｄ）（ｃ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程、
を含む方法が挙げられる。
（ａ）ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列、およびＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質を同定する工程
　例えば、ＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＤａｔａＢａｓｅ、ＲＢＰＤＢのような公共のＲＮＡ結合タンパク質配列データベースを活用することが挙げられる。活用する公共のＲＮＡ結合タンパク質配列データベースとしては、とくに限定されない。ＲＢＰＤＢまたはこれに準じるデータベースに対し、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列またはＥｎｈＩＩ領域配列に相当するＨＢＶ　ＲＮＡ配列を入力することにより、これら領域配列に結合するＲＮＡ結合タンパクを抽出することができる。
　また、例えば、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞由来の細胞抽出液と、試験管内で転写されたＨＢＶ　ゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列またはＥｎｈＩＩ領域配列に相当する配列を有するＲＮＡを用いたプルダウンアッセイを行い、得られた結合タンパク質を質量分析装置にて特定する方法またはこれらに準じる方法が挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法は、（ａ）が、ＲＮＡ結合タンパク質配列データベースを用いる工程を含む方法であることが好ましい。
　また、別の態様として、（ａ）が、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩ領域配列またはＥｎｈＩＩ領域配列に相当する配列を有するＲＮＡを用いたプルダウンアッセイを行う工程を含む方法であることが好ましい。
（ｂ）ＨＢＶに感染した細胞またはＨＢＶを発現する細胞に対し、同定したＲＮＡ結合タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質、または同タンパク質の発現量を低下させる被験物質を接触させる工程
　ＨＢＶに感染した細胞としては、例えば、ＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）に感染したヒト初代培養肝細胞、あるいはｓｏｄｉｕｍ　ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ　ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＮＴＣＰ）を強制発現させたＨｅｐＧ２細胞であって、ＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）に感染した細胞が挙げられる。上記のＨＢＶクローンと細胞の組み合わせについては、とくに限定されない。
ＨＢＶを発現する細胞としては、例えば、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞、あるいはＨＢＶクローンＣ＿ＪＰＮＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１）のゲノム配列を１．２４倍長化した配列を含んでなるプラスミドを強制発現させたＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ－７細胞、ＨｅｐａＲＧ細胞、あるいはヒト初代培養肝細胞が挙げられる。上記のＨＢＶクローンについては、とくに限定されない。また、上記のＨＢＶクローンのゲノム配列を含んでなるプラスミドに挿入されるＨＢＶゲノム由来の配列の長さについては、ＨＢＶクローンのゲノム配列の１．２４倍長以上であれば、とくに限定されない。
　被験物質としては、例えば、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクター、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系などから選ばれた物質が挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法に用いる被験物質としては、アンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡが好ましく、二本鎖ＲＮＡがより好ましい。
　また、二本鎖ＲＮＡの場合、ＲＮＡ干渉剤であることが特に好ましい。
　ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞と被験物質との接触は、例えば、培養培地に被検物質を添加し、一定期間培養することで実施できる。添加される被験物質の濃度は物質の種類（溶解度、毒性など）により異なるが、例えば、約０．１ｎｍｏｌ／Ｌ～約１００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲で適宜選択される。培養時間としては、例えば、約２４時間～約１２０時間が挙げられる。
（ｃ）ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞におけるＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程
　ＨＢＶタンパク質の産生能を測定する工程としては、ＨＢＶに感染した細胞もしくはＨＢＶを発現する細胞の培養上清中のＨＢＶタンパク質を測定する方法が挙げられる。
　例えば、回収した培養上清を用いて化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、あるいは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）などの方法またはこれらに準じる方法で、ＨＢＶタンパク質を測定することできる。
（ｄ）（ｃ）のＨＢＶタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
　例えば、（ｃ）において被験物質を作用させることにより、陰性対照に比べて、ＨＢＶタンパク質の産生を、３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、よりさらに好ましくは９０％以上抑制する物質を選択することができる。
＜医薬組成物の用途＞
　本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ感染の治療または予防において有用である。
　本発明の医薬組成物は、ＨＢＶタンパク質の産生、特にＨＢｓ抗原の産生を阻害することができる。また、ＨＢＶ遺伝子発現（ＨＢＶのＤＮＡ産生）を阻害することができる。したがって、本発明の医薬組成物は、ＨＢＶ感染の治療または予防のために有用である。
　本発明は、ＨＢｓ抗原の産生の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
　本発明は、ＨＢＶのＤＮＡ産生の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
　本発明は、ＨＢＶの遺伝子発現の阻害のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
　本発明は、ＨＢＶ感染の治療または予防のための、本発明の医薬組成物の使用に関する。
　ＨＢＶ感染に関連する疾病には、進行性肝線維症、炎症および壊死が含まれ、これらは肝硬変、末期肝疾患および肝細胞癌に進行する。
　次に、本発明について試験例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[試験例１] 
（ＥｎｈＩ／ＥｎｈＩＩ領域欠損コンストラクトを用いたレポーターアッセイ）
　ＰＣＲ反応は１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）、０．２μｍｏｌ／Ｌプライマーを含む反応液中で行った。ＨＢＶゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５．１；以下「遺伝子型Ｃ」ともいう）を鋳型にして、ＰｒｅＳ２／Ｓプロモーターを含む領域４１０ｂｐを、配列番号３の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１５秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。同様にして、ＨＢｓ抗原をコードする遺伝子の３’非翻訳領域（以下「３’ＵＴＲ」ともいう）の配列を含む領域１０８６ｂｐを、配列番号５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１５秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＸｂａＩとＳａｌＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。それぞれの断片をＫｐｎＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせ、またはＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせで処理し、ｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＫｐｎI、ＨｉｎｄＩＩＩの部位にまたはＸｂａＩ、ＳａｌＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ」ともいう。なお、後述する試験例４では、遺伝子型の違いを明確にするために、「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミドを鋳型にして、配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号９の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド中のＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ　ｄＥｎｈＩ」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミドを鋳型にして、配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１１の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号１０の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１２の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド中のＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ　ｄＥｎｈＩＩ」ともいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　肝芽細胞腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株ＨｅｐＧ２にＨＢＶゲノムが導入された、持続的にウイルスを産生する細胞であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８４巻　１００５頁～１００９頁　１９８７年）を用いて、以下の手順でレポーターアッセイを実施した。
　細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（Ｗａｋｏ社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）
　ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、１ウェルあたり１×１０４ｃｅｌｌ／１００μＬとなるよう９６穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間インキュベートした。０．０６２μｇのＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ　ｄＥｎｈＩプラスミド、またはＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ　ｄＥｎｈＩＩプラスミドのいずれか、および０．２５ｎｇのｐＲＬ－ＳＶ４０プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、０．２３μＬのＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を、７．８μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で２０分インキュベートした。このプラスミド－ＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ混合液８μＬを前述のＨｅｐＧ２．２．１５を播種したウェルに添加し、２４時間インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地１００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに４８時間インキュベートした。インキュベート後Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にてホタルルシフェラーゼによる発光およびウミシイタケルシフェラーゼによる発光を検出した。各ウェルについてウミシイタケルシフェラーゼの発光量で補正したホタルルシフェラーゼの発光量を算出した結果を、図１に示した。また、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド添加ウェル中のホタルルシフェラーゼの発光量に対する各欠損プラスミド添加ウェル中のルシフェラーゼの発光量の相対値（％）を算出した結果を、図１に示した。
　ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、１ウェルあたり２×１０５ｃｅｌｌ／１０００μＬとなるよう１２穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間インキュベートした。１μｇのＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミド、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ　ｄＥｎｈＩプラスミド、またはＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ　ｄＥｎｈＩＩプラスミドのいずれか、および３μＬのＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を、９７μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で２０分インキュベートした。このプラスミド－ＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ混合液１００μＬを前述のＨｅｐＧ２．２．１５を播種したウェルに添加し、２４時間インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地１０００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに２４時間インキュベートした。そして培養上清を廃棄し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（１０００μＬ／ウェル、富士フイルム和光純薬社製）で洗浄、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎi　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ１μｇを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡをもとにホタルルシフェラーゼＲＮＡの発現量を定量し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲプラスミドをトランスフェクションしたウェル中のホタルルシフェラーゼＲＮＡの発現量に対する各プラスミド添加ウェル中のホタルルシフェラーゼＲＮＡの発現量の相対値（％）を算出した結果を、図２に示した。
　ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が７０％～８０％程度減少した（図１）。したがって、上記現象は、ＤＮＡ配列からＥｎｈＩ領域もしくはＥｎｈＩＩ領域が欠損されたことによる転写活性の減少（ホタルルシフェラーゼＲＮＡ発現量の減少）に起因する可能性、またはＲＮＡ配列からＥｎｈＩに相当する領域もしくはＥｎｈＩＩに相当する領域が欠損されたことによるＲＮＡの機能変化に起因する可能性、が考えられた。そこで、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量を解析した結果、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量はほとんど変化しなかった（図２）。このことから、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損による相対発光量の減少は、ＲＮＡ配列からＥｎｈＩに相当する領域またはＥｎｈＩＩに相当する領域が欠損されたことによるＲＮＡの機能変化に起因することが明らかとなった。すなわち、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域またはＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩＩに相当する領域はＲＮＡ上で機能し、タンパク質の発現量を制御することが明らかとなった。
 [試験例２]
（ＲＮＡ結合タンパク質のｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ同定）
　ＥｎｈＩに相当する領域、ＥｎｈＩＩに相当する領域がＲＮＡ上で機能することから、これらの領域に結合するＲＮＡ結合タンパク質の同定を試みた。推定上のＲＮＡ結合タンパク質は、公共のＲＮＡ結合タンパク質配列データベース（ＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＤａｔａＢａｓｅ、ＲＢＰＤＢ）に対しＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内ＥｎｈＩ相当領域（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５、塩基番号１０６０番～１２６０番からなるＥｎｈＩ領域に相当するＲＮＡ配列、配列番号１）、あるいはＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡの３’ＵＴＲ内ＥｎｈＩＩ相当領域（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４６３４５、塩基番号１６３８番～１７７１番からなるＥｎｈＩＩ領域に相当するＲＮＡ配列、配列番号２）を入力、結合タンパク質予測プログラムを実行することによって同定した。ＲＢＰＤＢは、ヒト、マウス、ハエなどを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ実験から得られたＲＮＡ結合タンパク質とその結合配列に関する情報を蓄積したデータベースであり、ＲＮＡの塩基配列を入力することにより当該配列をもつＲＮＡに結合すると推定されるＲＮＡ結合タンパク質を抽出することが可能である（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、３９巻、Ｄ３０1頁～Ｄ３０８頁、２０１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡ上のＥｎｈＩ相当領域およびＥｎｈＩＩ相当領域の少なくとも１つの領域に対し、複数のＲＮＡ結合タンパク質が結合することが予想された。
［試験例３］
（抗ＨＢＶアッセイ）
　肝芽細胞腫（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞株ＨｅｐＧ２にＨＢＶゲノムが導入された、持続的にウイルスを産生する細胞であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８４巻　１００５頁～１００９頁　１９８７年）を用いて、各分子の阻害による抗ＨＢＶ効果を以下の手順で評価した。
　細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（Ｗａｋｏ社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）
（１）　トランスフェクションに用いたｄｓＲＮＡは、以下のものを使用した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）。ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＲＢＦＯＸ１　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１３３７７－０１）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＥＬＡＶＬ１　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－００３７７３－００）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＥＬＡＶＬ２　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１９８０１－００）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＭＢＮＬ１　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１４１３６－００）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＲＢＭＸ　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１１６９１－０１）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＰＵＭ２　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１４０３１－０２）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＹＴＨＤＣ１　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１５３３２－０２）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＳＲＳＦ１　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１８６７２－０１）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＳＲＳＦ９　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１９５２９－０１）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＳＲＳＦ１０　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－００７２７８－００）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＫＨＤＲＢＳ３　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１２７４８－０１）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＥＩＦ４Ｂ　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０２０１７９－００）、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ：ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ　ＳＮＲＰＡ　ｓｉＲＮＡ（Ｌ－０１９４３５－０２）。また、ｏｎ－ｔａＲｇｅＴｐｌｕｓ　Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｐｏｏｌ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を陰性対照ｄｓＲＮＡとして用いた。
（２）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬのＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液を調製した。ｄｓＲＮＡをＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ（ｎｏｔ　ＤＥＰＣ－Ｔｒｅａｔｅｄ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて希釈し、２．７４３～２０００ｎｍｏｌ／Ｌ、３倍希釈系列のｄｓＲＮＡ溶液を調製した。１．５μＬの調製済みｄｓＲＮＡ溶液および０．３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、８．２μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で５分インキュベートした。このｄｓＲＮＡ－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ混合液１０μＬを細胞培養用培地４０μＬで希釈し、５０μＬとした。これを前述のＨｅｐＧ２．２．１５細胞懸濁液５０μＬと混合し、９６穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で３日間インキュベートした（ｄｓＲＮＡの最終濃度：０．９１～３０ｎｍｏｌ／Ｌ、３倍希釈系列）。次に前述の細胞培養用培地１００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに３日間インキュベートした。そして培養上清を回収するとともに、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６　ＡＱｕｅｏｕｓ　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて細胞生存率を測定した。回収した培養上清中のＨＢｓ抗原量を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　Ｖｉｒｕｓ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｓＡｇ）Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて測定した。また、回収した培養上清をＢｕｆｆｅｒ　ＡＬ（Ｑｉａｇｅｎ社製）およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の混合物で処理し、得られた溶液中のＨＢＶのＤＮＡ（ＨＢＶ　ＤＮＡ）を、リアルタイムＰＣＲ法にて定量した。各マーカーについて、各濃度の陰性対照ｄｓＲＮＡ添加ウェルに対する各ｄｓＲＮＡ添加ウェルの相対値（％）を算出した（図３および図４）。
　ＲＢＦＯＸ１、ＳＲＳＦ１０、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２のノックダウンにより、ＨＢｓ抗原が最大３０％程度減少し、ＳＲＳＦ９、ＳＮＲＰＡ、ＹＴＨＤＣ１、ＳＲＳＦ１のノックダウンにより、ＨＢｓ抗原が最大７０～９０％程度減少した（図３）。また、ＰＵＭ２、ＳＲＳＦ１のノックダウンにより、ＨＢＶ　ＤＮＡが最大４０～５０％程度減少し、ＹＴＨＤＣ１のノックダウンにより、ＨＢＶ　ＤＮＡが最大８０％程度減少した。一方、これら遺伝子のノックダウンは細胞生存率に影響を与えなかった（図４）。以上より、ＨＢｓ抗原をコードするＲＮＡ上のＥｎｈＩ相当領域およびＥｎｈＩＩ相当領域に結合するタンパク質を阻害することによりＨＢＶタンパク質の産生阻害やＨＢＶ　ＤＮＡ発現量の低下などの抗ＨＢＶ効果が得られることが明らかとなった。
[試験例４]
（ＥｎｈＩ／ＥｎｈＩＩ領域欠損コンストラクトを用いたアッセイ、遺伝子型の検討）
　ＰＣＲ反応は１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）、０．２μｍｏｌ／Ｌプライマーを含む反応液中で行った。ＨＢＶゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ４６２０４１．１；以下「遺伝子型Ａ」ともいう）を鋳型にして、ＨＢｓ抗原をコードする遺伝子の３’ＵＴＲの配列（以下「３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）」ともいう）を含む領域１０８６ｂｐを、配列番号１３の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１４の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＸｂａＩとＳａｌＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。この断片をＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせで処理し、試験例１で作製したＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）のＸｂａＩ、ＳａｌＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミドを鋳型にして、配列番号１５の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１６の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミド中のＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩ」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミドを鋳型にして、配列番号１７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１８の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）プラスミド中のＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩＩ」ともいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＨＢＶゲノムＤＮＡ（配列番号１９、以下「遺伝子型Ｂ」ともいう）を鋳型にして、ＨＢｓ抗原をコードする遺伝子の３’ＵＴＲの配列（以下「３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）」ともいう）を含む領域１０９５ｂｐを、配列番号２０の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２１の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＸｂａＩとＳａｌＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。この断片をＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせで処理し、試験例１で作製したＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）のＸｂａＩ、ＳａｌＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）プラスミドを鋳型にして、配列番号２２の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２３の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）プラスミド中のＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩ」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）プラスミドを鋳型にして、配列番号２４の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２５の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）プラスミド中のＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩＩ」ともいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＨＢＶゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ９５５５１．１；以下「遺伝子型Ｄ」ともいう）を鋳型にして、ＨＢｓ抗原をコードする遺伝子の３’ＵＴＲの配列（以下「３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）」ともいう）を含む領域１０８６ｂｐを、配列番号２６の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２７の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃１５秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＸｂａＩとＳａｌＩの制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。この断片をＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ社製）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ社製）の組み合わせで処理し、試験例１で作製したＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）のＸｂａＩ、ＳａｌＩの部位に挿入して連結したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）プラスミドを鋳型にして、配列番号２８の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２９の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）プラスミド中のＥｎｈＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩ」ともいう。ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）プラスミドを鋳型にして、配列番号３０の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０の塩基配列からなるプライマーの組み合わせ、および配列番号７の塩基配列からなるプライマーおよび配列番号３１の塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いて９８℃１０秒、５８℃５秒、７２℃３０秒を３５回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、ＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを作製するための増幅断片を得た。これら断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）プラスミド中のＥｎｈＩＩ領域を欠損したプラスミドを得た。以下、このプラスミドを「ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩＩ」ともいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を用いて、以下の手順でレポーターアッセイを実施した。
　細胞培養用培地として、以下を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）＋５μｇ／ｍＬインスリン（富士フイルム和光純薬社製）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（富士フイルム和光純薬社製）＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（富士フイルム和光純薬社製）＋５０μｍｏｌ／Ｌヒドロコルチゾン（富士フイルム和光純薬社製）＋１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ社製）
　ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、１ウェルあたり１×１０４ｃｅｌｌ／１００μＬとなるよう９６穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩インキュベートした。６４ｎｇの各種プラスミド（ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩＩ）のいずれか、および０．２５ｎｇのｐＲＬ－ＳＶ４０プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、０．２４μＬのＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を、７．８μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で２０分インキュベートした。このプラスミド－ＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ混合液８μＬを前述のＨｅｐＧ２．２．１５を播種したウェルに添加し、さらに１日インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地１００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに２４時間インキュベートした。インキュベート後Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にてホタルルシフェラーゼによる発光およびウミシイタケルシフェラーゼによる発光を検出した。各ウェルについてウミシイタケルシフェラーゼの発光量で補正したホタルルシフェラーゼの発光量を算出した。そして、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）の各プラスミド添加ウェル中のホタルルシフェラーゼの発光量に対する各遺伝子型の欠損プラスミド添加ウェル中のルシフェラーゼの発光量の相対値（％）を算出した結果を、図５に示した。
　ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を上記培地に懸濁し、１ウェルあたり１×１０５ｃｅｌｌ／５００μＬとなるよう２４穴マイクロタイタープレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩インキュベートした。５００ｎｇの各種プラスミド（ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）ｄＥｎｈＩＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩ、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）ｄＥｎｈＩＩ）のいずれか、および１．５μＬのＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を、５０μＬの無血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で希釈し、室温で２０分インキュベートした。このプラスミド－ＴｒａｎｓＩＴ-Ｘ２　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ混合液５２μＬを前述のＨｅｐＧ２．２．１５を播種したウェルに添加し、一晩インキュベートした。次に前述の細胞培養用培地５００μＬ／ウェルにて培地交換し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でさらに１日インキュベートした。そして培養上清を廃棄し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（１０００μＬ／ウェル、富士フイルム和光純薬社製）で洗浄、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎi　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡをもとにホタルルシフェラーゼＲＮＡの発現量を定量し、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ａ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｂ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｃ）、ＰｒｅＳ２／Ｓ－Ｌｕｃ－３’ＵＴＲ（遺伝子型Ｄ）の各プラスミド添加ウェル中のホタルルシフェラーゼＲＮＡの発現量に対する各遺伝子型の欠損プラスミド添加ウェル中のルシフェラーゼＲＮＡ発現量の相対値（％）を算出した結果を、図５に示した。
　遺伝子型Ａにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が８７％～９０％減少した（図５）。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は３１～４９％減少した。
　遺伝子型Ｂにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が６５％～８０％減少した。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は３９～４３％減少した。
　遺伝子型Ｃにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が７４％～８４％減少した。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は３４～６１％減少した。
　遺伝子型Ｄにおいて、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼタンパク質に由来する相対発光量が８６％～９１％減少した。一方、ＥｎｈＩ領域またはＥｎｈＩＩ領域の欠損により、ホタルルシフェラーゼＲＮＡの相対発現量は５１～５２％減少した。
　以上の結果はいずれもＲＮＡからタンパク質に翻訳される過程に対するＥｎｈＩ領域およびＥｎｈＩＩ領域の寄与を示すものである。すなわち、ＨＢＶの複数の遺伝子型に共通して、ＨＢＶゲノムＤＮＡ上のＥｎｈＩに相当する領域またはＥｎｈＩＩに相当する領域はＲＮＡ上で機能し、タンパク質の発現量を制御することが明らかとなった。
　本発明の医薬組成物は、優れた抗ＨＢＶ活性を示し、抗B型肝炎ウイルス剤として有用である。

Claims (15)

  1. 　Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する医薬組成物であって、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列、およびＢ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害することを特徴とする、医薬組成物。
  2. 　Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列が、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、Ｂ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列が、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有する配列であり、Ｂ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列が、配列番号２と９０％以上の配列同一性を有する配列である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 　Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質が、ＨＢｓ抗原タンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 　さらに、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡの発現量を低下することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 　さらに、完全二本鎖ＤＮＡの発現量を低下することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 　ＲＮＡ結合タンパク質が、ＲＢＦＯＸ１、ＥＬＡＶＬ２、ＭＢＮＬ１、ＲＢＭＸ、ＳＲＳＦ９、ＳＲＳＦ１０、ＳＮＲＰＡ、ＥＬＡＶＬ１、ＰＵＭ２、ＹＴＨＤＣ１、ＳＲＳＦ１、ＫＨＤＲＢＳ３およびＥＩＦ４Ｂより選択される少なくとも１つのタンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 　Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列、およびＢ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質の発現または機能を阻害する物質を同定することを特徴とする、スクリーニング方法。
  9. 　Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列が、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する配列であり、Ｂ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列が、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する配列である、請求項８に記載のスクリーニング方法。
  10. 　Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質が、ＨＢｓ抗原タンパク質である、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
  11. 　Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
    　（ａ）Ｂ型肝炎ウイルスゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列、およびＢ型肝炎ウイルゲノムＤＮＡ上のエンハンサーＩＩ領域配列に相当するＢ型肝炎ウイルスＲＮＡ配列より選択される少なくとも１つの配列に対し、結合するＲＮＡ結合タンパク質を同定する工程、
    　（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞またはＢ型肝炎ウイルスを発現する細胞に対し、同定したＲＮＡ結合タンパク質の機能もしくは活性を阻害する被験物質、または同タンパク質の発現量を低下させる被験物質を接触させる工程、
    　（ｃ）Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞またはＢ型肝炎ウイルスを発現する細胞におけるＢ型肝炎ウイルスタンパク質の産生能を測定する工程、および
    　（ｄ）（ｃ）のＢ型肝炎ウイルスタンパク質の産生を阻害する活性を有する物質を選択する工程
    を含む方法。
  12. 　（ａ）が、ＲＮＡ結合タンパク質配列データベースを用いる工程を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 　（ｂ）の被験物質が、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系である、請求項１１に記載の方法。
  14. 　（ｃ）が、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞またはＢ型肝炎ウイルスを発現する細胞の培養上清中のＢ型肝炎ウイルスタンパク質を測定する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
  15. （ｄ）の物質が、抗体、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ、アデノ随伴ウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクター系である、請求項１１に記載の方法。
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