WO2020188198A1 - Puce microfluidique pour attirer et detruire un element biologique specifique - Google Patents

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reservoir
microfluidic chip
chip
electrode
microchannels
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Benoît CHARLOT
Jean-Marie RAMIREZ
Sébastien MEANCE
Xavier Garric
Coline PINESE
Isabelle GUIRAUD
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Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM
Universite de Montpellier
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Definitions

  • the present application relates to the field of microfluidic devices capable of attracting and destroying a specific biological element. More specifically, the present application relates to a microfluidic chip capable of attracting and destroying in vivo a specific biological element, such as a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • Blood cell tumors also called hematopoietic cancers, are cancers affecting the blood or lymphoid organs, such as leukemia and lymphoma.
  • carcinomas As regards solid tumors, a distinction is made between carcinomas and adenocarcinomas, cancers originating from epithelial tissue. There are also sarcomas which correspond to cancerous cells appearing in a so-called support tissue, which is then referred to as osteosarcoma for the bones, liposarcoma for fat or even myosarcoma for the muscles.
  • Surgery can be used as a single treatment when the tumor is very localized, especially when the tumor is at an early stage, but it is often associated with other treatments such as radiotherapy which is also a local treatment and / or with treatments such as chemotherapy, which is a systemic treatment that potentially acts on all cancer cells in the body.
  • the advantage of local surgery for the treatment of a solid tumor is the ability to remove all of the tumor when possible and to preserve organs and anatomical structures not affected by cancer cells. It also makes it possible to limit the side effects attributed to radiotherapy treatment such as burns, or the generation of radiation-induced cancers, and to chemotherapy such as skin reactions, nausea, vomiting, diarrhea, muscle pain, fatigue, fall hair as well as chemo-induced cancers.
  • the resection area includes an area of healthy tissue around the tumor, which corresponds to the resection margin.
  • the tumor cells of the primary tumor are included in the area of resection and there will be no recurrence.
  • some tumor cells are located beyond the resection area either locally or remotely and then a recurrence is possible either locally or remotely to form metastases, that is to say secondary colonies of cancer cells which spread far from the organ affected by the initial tumor and which are the cause of so-called “metastatic” cancer in an organ other than that in which the solid tumor was located.
  • Chemotherapy can be used after local surgery to remove the tumor, known as “adjuvant chemotherapy” in order to prevent the recurrence and / or the formation of metastatic cancer.
  • adjuvant chemotherapy in order to prevent the recurrence and / or the formation of metastatic cancer.
  • many side effects are caused by this drug treatment.
  • reference can in particular be made to chemo-induced cancers which by definition correspond to new tumors occurring in patients treated with cytotoxic drugs for a first malignant tumor and caused by them, reference can also be made to the risk of generating resistance of cancer cells to chemotherapeutic treatment thus greatly limiting the possibilities of eliminating said cells.
  • the present invention provides a microfluidic chip for attracting and destroying a specific biological element and in particular a eukaryotic cell such as a cancer cell.
  • Said chip being particularly suitable for being implanted in vivo at the resection zone of a solid tumor in order to attract and destroy in vivo the remaining cancer cells.
  • Microfluidic devices have been described in the prior art for their use in the field of cancer treatment. Reference may in particular be made to document WO2018 / 089989 A1 which describes an ex vivo device for the treatment of cancer by subjecting a biological fluid such as blood to electromagnetic radiation specific to the type of cancer cell targeted and capable of destroying it.
  • No prior art document describes or suggests a microfluidic chip for attracting and destroying, preferably in vivo, a cancerous cell after resection of a solid tumor and thus preventing and / or reducing the risks of local recurrence and / or or development of metastatic cancer.
  • microfluidic chip for attracting and preferably destroying in vivo, a specific biological element
  • said microfluidic chip comprising a reservoir consisting of a matrix comprising a chemoattractant compound capable of attracting a biological element, at least one network of microchannels putting the reservoir into communication with the external medium of the chip and at least one electrode capable of generating an electric field to destroy the biological element.
  • the present invention relates to a microfluidic chip for attracting and destroying a specific biological element, said chip comprising:
  • a reservoir (1) consisting of a matrix comprising a chemoattractant compound capable of attracting the biological element
  • At least one electrode (4) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2) or at the same location as the network of microchannels (2), said electrode (4) being able to generate an electric field so in destroying the biological element during its passage to the reservoir (1).
  • Figure 1 is a sectional view of the chip according to the invention.
  • FIG. 2 represents the upper part (6) of the chip seen from above.
  • FIG. 3 represents the lower part (5) of the chip seen from above.
  • FIG. 4 represents an exploded view from below of the chip according to the invention.
  • FIG. 5 represents an exploded view from above of the chip according to the invention.
  • FIG. 6 represents a sectional view of the chip according to the invention on a scale of 5: 0.5 cm.
  • Figure 7 shows a sectional view of the chip on a scale of 5: 1 cm.
  • Fig. 8 is an inverted fluorescence microscope image with x5 objective, at the microchannel level, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) (14) in the absence of gradient.
  • Figure 9 is an inverted fluorescence microscope image with an x5 objective, at the microchannel level, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) (14) attracted into the chip from a gradient of fetal calf serum (FCS) with 1% FCS outside the chip and 10 ⁇ l of pure FCS inside the reservoir.
  • FCS fetal calf serum
  • Figure 10 is an inverted fluorescence microscope image with an x10 objective, at the microchannel level, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) (14) in the absence of gradient.
  • Figure 11 is an inverted fluorescence microscope image with an x5 objective, at the central chip reservoir, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) (14) in the absence of gradient.
  • Figure 12 is an inverted x10 objective fluorescence microscope image, at the microchannel level, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) (14) drawn into the chip from a gradient of fetal calf serum (FCS) with 1% FCS outside the chip and 10 ⁇ l of pure FCS inside the reservoir.
  • MDA-MB-231 breast cancer tumor cells
  • FCS fetal calf serum
  • Figure 13 is an inverted x5 objective fluorescence microscope image at the central chip reservoir, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) (14) drawn into the chip from a gradient of fetal calf serum (FCS) with 1% FCS outside the chip and 10mI of pure FCS inside the reservoir.
  • MDA-MB-231 breast cancer tumor cells
  • FCS fetal calf serum
  • Figure 14 is an inverted 10-fold objective fluorescence microscope image at the microchannel level showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) (14) attracted into the chip from a gradient of SDF-1 chemoattractant (1 ⁇ g of SDF-1 chemoattractant present in the central reservoir of the chip).
  • Figure 15 is an inverted 5x objective fluorescence microscope image at the central chip reservoir, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) (14) drawn into the chip from a gradient of SDF-1 chemoattractant (1 ⁇ g of SDF-1 chemoattractant present in the central reservoir of the chip).
  • FIG. 16 is an image by inverted fluorescence microscope, representing the tumor cells of breast cancer (MDA-MB-231) on a glass slide containing an interdigitated electrode, after 48h of culture in a 5% CO2 incubator and humidity 95%, in the absence of electroporation.
  • Figure 17 is an inverted fluorescence microscope image, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) on a glass slide containing a interdigitated electrode, destroyed by electroporation by application of an electric field by an interdigitated electrode of 5v 100ps 1 hertz at d0 and at d0 + 3 hours.
  • Figure 18 is an inverted fluorescence microscope image, at the microchannel level, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) in the absence of gradient and pulsed electric field.
  • Figure 19 is an inverted fluorescence microscope image, at the microchannel level, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) drawn into the chip from a gradient of SDF-1 (1 pg of SDF-1 chemoattractant present in the central reservoir of the chip) without a pulsed electric field.
  • Figure 20 is an inverted fluorescence microscope image, at the microchannel level, showing breast cancer tumor cells (MDA-MB-231) drawn into the chip from a gradient of SDF-1. (1 pg of SDF-1 chemoattractant present in the central reservoir of the chip) and a pulsed electric field of 5v 100 ms 1 hertz.
  • Fig. 21 is a graph showing the release of BSA-FITC (mimicking SDF-1) from an alginate matrix contained in a microfluidic chip according to the invention over a period of 50 days.
  • Figure 22 is a graph showing the release of SDF-1 from an alginate matrix over a 50 day period.
  • microfluidic chip for attracting and destroying a biological element, such as a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • This microfluidic chip is particularly advantageous for attracting and destroying a cancerous cell in vivo after resection of a solid tumor in order to prevent and / or reduce the risks of local recurrence and / or the development of metastatic cancer.
  • a "microfluidic chip” is a device comprising a network of microchannels, that is to say channels of micrometric size, etched or molded in a material, connected to each other and connecting the inside of the chip to the outside of the chip. chip by inputs and outputs pierced through the chip, to achieve a desired function.
  • the microfluidic chip can be obtained by specific processes such as by deposition and electrodeposition, engraving, bonding, injection molding, embossing, soft lithography, anodic welding, or any other technology. These manufacturing processes are known to those skilled in the art.
  • the desired function of the microfluidic chip is to be able to attract in vivo a specific biological element, preferably a eukaryotic cell such as a cancer cell, and to destroy it in vivo.
  • microchannel network corresponds to a multitude of channels, connected to the outside of the chip by inputs and outputs pierced through the chip.
  • the microchannels can for example be made from a mold, or directly from the material of the microfluidic chip.
  • the number of microchannels varies depending on the diameter of the chip, the width of the microchannels or the spacing between said microchannels. By way of example, for a chip of one centimeter in diameter with channels 10 ⁇ m in width, said microchannels may number around 1500.
  • Each microchannel making up the microchannel network corresponds to a passage whose height can be from a few micrometers to a few hundred micrometers with a length from a few hundred micrometers to a few millimeters.
  • the cross section of a microchannel can in principle have any two-dimensional shape, such as a square, rectangle, circle, or a combination thereof.
  • a microchannel can be straight or curved.
  • the width of a microchannel is the horizontal distance of the two points which are on opposite edges of the cross section and which are furthest from each other.
  • the height of a microchannel is the vertical distance of the points located on the opposite edges of the cross section and furthest from each other.
  • the length of a microchannel is the distance between the two ends of said channel, the length of a microchannel corresponds to the largest dimension.
  • the two shorter dimensions generally define the aforementioned cross section.
  • the term “electrode” refers to any element capable of conducting an electric current and comprising two conductors separated by an air gap at a distance of between 1 ⁇ m to 1 mm.
  • the present application refers to an electrode, in the singular for reasons of clarity, the person skilled in the art understanding that an electrode is composed of two said conductors separated by an air gap so that the current can be conducted.
  • the microfluidic chip is preferably “intended to be implanted in vivo”, that is to say that the microfluidic chip is intended and capable of being implanted within a living being, preferably a mammal and in particular a human being.
  • the chip can be implanted in a living being without interfering with or degrading the tissues with which it is in contact and that said chip is able to function in vivo, that is to say attract and destroy an element specific biological in vivo, preferably a eukaryotic cell such as a cancer cell, and destroy it in vivo.
  • biological element refers to any element comprising genetic information in the form of RNA or DNA and capable of being found within a living organism, that is to say. say in vivo, such as prokaryotic cells, eukaryotic cells and microorganisms.
  • prokaryotic cells such as a bacterium
  • eukaryotic cell such as an animal cell.
  • specific biological element or “target biological element” refers to the biological element of interest in the context of the use of the chip, that is to say the biological element that one wishes to attract. and destroy in vivo.
  • the chemoattractant compound present in the reservoir being chosen to attract the biological element of interest in the context of the use of the microfluidic chip.
  • the term “at the same location as the network of microchannels” refers to the fact that the electrode is arranged at the level of the network of microchannels, more precisely on or under the network of microchannels. Preferably, the electrode is placed on the network of microchannels.
  • the biological element of interest is a prokaryotic or eukaryotic cell, more preferably the biological element of interest is a eukaryotic cell. Even more preferably, the eukaryotic cell is a cancer cell, preferably a metastatic cancer cell.
  • a “cancer cell” is a cell in which one or more major DNA damage has occurred, thus transforming the normal cell into a cancer cell capable of proliferating to form a group of identical transformed cells, that is to say a tumor.
  • the term “cancerous cell” refers to a cell resulting from a solid tumor called initial or original or primary, present at or near the area of resection of the tumor. solid.
  • the term “cancerous cell” also refers to a “metastatic cancer cell”, that is to say a cancerous cell capable of or having migrated through the body via the blood vessels. or lymphatic from the original tumor and capable of or having colonized one or more other tissues near or at a distance from said tumor, thus forming metastases, the origin of “metastatic cancers” or even “metastatic tumors”.
  • the cancer cell is a cell resulting from a so-called secondary or tertiary solid tumor which correspond to metastatic tumors in a second or third tissue or organ other than that of the initial tumor.
  • microfluidic chip according to the present invention is capable of attracting and destroying several of said elements and cells in vivo. It should also be noted that the microfluidic chip according to the present invention is capable of attracting and destroying in vivo several specific biological elements which may be of a different nature, said elements being attracted within the chip by the specific choice of the compound (s). chemoattractants present in the tank.
  • the term “prevent” denotes a reduction in the risk of acquiring a disease or a specified disorder, the reduction or the slowing down of the onset of symptoms of this disease.
  • the term “prevent” may correspond to the reduction of the risk of spreading an infection when the biological element is a prokaryotic cell or to the reduction of the risk of local recurrence of the cancer and / or the risk of the appearance of metastases, more precisely of metastatic cancers when the biological element is a eukaryotic cell of the cancerous type.
  • the term “treating” refers to an improvement or reversal of a specified disease or disorder or of at least one discernible symptom.
  • the term “treating” can also refer to reducing or slowing the progression of the disease or disorder, or the onset of symptoms of such disease or disorder.
  • the term “treat” may correspond to the reduction or slowing down of the progression of an infection when the element biological is a prokaryotic cell or the reduction or slowing down of the appearance of metastases, more precisely of metastatic cancers when the biological element is a eukaryotic cell of the cancerous type.
  • the microfluidic chip is preferably intended to be implanted in vivo in a subject.
  • the subject within the scope of the present invention is a living being, preferably a mammal and more particularly human beings, children, men or women.
  • solid cancer or “solid tumor” we mean an individualized mass of cancer cells in any tissue such as skin, mucous membranes, bones, or any other tissue present in organs, that is i.e. carcinomas from epithelial cells such as skin, mucous membranes, glands and sarcomas from connective and supporting tissue cells such as bone, cartilage.
  • solid cancer or “solid tumor” refers to a carcinoma such as cancer of the breast, lungs, prostate, bladder, salivary glands, cancer. skin, bowel, colon-rectum, thyroid, cervix, endometrium and ovaries, lip-mouth-laryngeal cancer, kidney, liver, brain, testes , pancreas, preferably breast cancer.
  • solid tumors are not limiting.
  • chemoattractant compound refers to any compound capable of attracting by chemotaxis a biological element, preferably a cell expressing specific membrane receptors for this compound at its surface, said biological element moving as a function of the chemoattractant compound concentration gradient.
  • the chemoattractant compound is capable of inducing the displacement of one or more specific biological elements as a function of the concentration gradient of said compound by positive chemotaxis, the biological element moving towards the region where the concentration of chemoattractant compound is the highest.
  • the chemoattractant compound is said to be “capable of attracting” a specific biological element when it allows the displacement of said element inside the microfluidic chip and in particular towards the reservoir of chemoattractant compound in which is the highest concentration of chemoattractant compound.
  • chemoattractant compound is chosen according to the specific biological element of interest.
  • the chemoattractant compound is chosen according to the type of membrane receptors that this cell expresses.
  • the chemoattractant compound can be a cytokine, that is to say a polypeptide or a soluble protein synthesized by a cell and acting at a distance on other cells to regulate the thereof.
  • chemokines colony stimulating factors of granulocytes and macrophages such as M-CSF, G-CSF, CSF-1
  • growth factors and transforming growth factors such as TGF alpha, TGF beta, EGF, betacellulin, amphiregulin, heregulin, HBEGF, FGF, VEGF
  • tumor necrosis factors such as NGF, TNF alpha, TNF beta, interferons such as IFN alpha, IFN beta, IFN gamma, IFN lambda and interleukins such as IL-1 to IL-38.
  • the biological element is a eukaryotic cell such as a cancer cell
  • the chemoattractant compound is chosen from chemokines, growth factors and transformational growth factors.
  • a chemokine is a small protein of 8 to 14 kilo daltons characterized by the presence of four cysteine residues in conserved positions allowing the formation of their three-dimensional structure. Chemokines can be classified into four subfamilies according to the spacing between two of their cysteines in the N-terminal position, one can in particular refer to the CXC or alpha family, i.e. from which the first two cysteines are separated. with any amino acid, the CC or beta family, the CX3C or delta family, the C or gamma family.
  • chemokine in the context of the present invention can for example be chosen from the following chemokines: CXCL12, also called stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25 , CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1.
  • CXCL12 also called stromal cell-derived factor 1 (SDF-1)
  • SDF-1 stromal cell-derived factor 1
  • a growth factor is a protein of low molecular weight (less than 30 kilo daltons) which stimulates cell multiplication and is recognized by specific membrane receptors which are most often tyrosine kinases.
  • the growth factor in the context of the present invention can for example be chosen from TGF alpha or beta (transforming growth factor alpha or beta), FGF (fibroblast growth factor alpha), EGF (epidermal growth factor), betacellulin amphiregulin, heregulin, HBEGF, VEGF (vascular endothelial growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor).
  • the chemoattractant compound can be a peptide carrying a formylated N group such as N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP) or even carbohydrate molecules such as glucose .
  • FMLP N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine
  • the chemoattractant compound is included in a matrix which is composed of a biocompatible material as defined in the present invention.
  • the biocompatible material of the matrix being chosen specifically according to the chemoattractant compound, the desired release profile as well as the context of use of the microfluidic chip.
  • the term “external medium” refers to the tissues located around the microfluidic chip when the latter is implanted in vivo, more precisely to the tissues located directly in contact with the chip, up to 300 mm, preferably up to 150 mm, more preferably up to 100 mm around the chip.
  • resection of a solid tumor is meant the removal, ablation or even resection of a solid tumor, for example by surgery.
  • the present invention relates to a microfluidic chip for attracting and destroying in vivo a specific biological element.
  • a first object of the invention relates to a microfluidic chip for attracting and destroying a specific biological element, said chip comprising:
  • a reservoir (1) consisting of a matrix comprising the chemoattractant compound capable of attracting a biological element at least one network of microchannels (2) arranged between the reservoir (1) and the external medium (3) of the chip and making it possible to allowing the chemoattractant compound to pass to said medium and allowing the biological element present in said medium to pass towards the reservoir (1) at least one electrode (4) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2) or at the same location as the microchannel network (2), said electrode being able to generate an electric field so as to destroy the biological element during its passage to the reservoir (1).
  • the present invention relates to a microfluidic chip intended to be implanted in vivo to attract and destroy a specific biological element, preferably a eukaryotic cell, said chip comprising:
  • a reservoir (1) consisting of a matrix comprising the chemoattractant compound capable of attracting a biological element in vivo at least one network of microchannels (2) arranged between the reservoir (1) and the external medium (3) of the chip and allowing the chemoattractant compound to pass to said medium and to allow the biological element present in said medium to pass towards the reservoir (1) at least one electrode (4) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2 ) or at the same location as the network of microchannels (2), said electrode being able to generate an electric field so as to destroy the biological element in vivo during its passage to the reservoir (1).
  • the present invention relates to a microfluidic chip intended to be implanted in vivo to attract and destroy a eukaryotic cell, preferably a cancer cell, said chip comprising:
  • a reservoir (1) consisting of a matrix comprising the chemoattractant compound capable of attracting said cell in vivo
  • At least one network of microchannels (2) disposed between the reservoir (1) and the external medium (3) of the chip and allowing the chemoattractant compound to pass to said medium and allowing said cell present in said medium to pass towards the reservoir (1) at least one electrode (4) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2) or at the same location as the network of microchannels (2), said electrode (4) being able to generate a field electrical so as to destroy said cell during its passage to the reservoir (1) in vivo.
  • the present invention relates to a microfluidic chip intended to be implanted in vivo to attract and destroy a specific biological element, preferably a eukaryotic cell, more preferably a cancerous cell, said chip comprising: a reservoir (1) consisting of a matrix comprising the chemoattractant compound capable of attracting said cell in vivo
  • At least one network of microchannels (2) disposed between the reservoir (1) and the external medium (3) of the chip and allowing the chemoattractant compound to pass to said medium and allowing said cell present in said medium to pass towards the reservoir (1) at least one electrode (4) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2), said electrode (4) being able to generate an electric field so as to destroy said cell during its passage towards the reservoir (1) in vivo.
  • the present invention relates to a microfluidic chip intended to be implanted in vivo to attract and destroy a specific biological element, preferably a eukaryotic cell, more preferably a cancerous cell, said chip comprising:
  • a reservoir (1) consisting of a matrix comprising the chemoattractant compound capable of attracting said cell in vivo
  • At least one network of microchannels (2) disposed between the reservoir (1) and the external medium (3) of the chip and allowing the chemoattractant compound to pass to said medium and allowing said cell present in said medium to pass towards the reservoir (1) at least one electrode (4) disposed at the same location as the network of microchannels (2), said electrode (4) being able to generate an electric field so as to destroy said cell during its passage to the reservoir ( 1) in vivo.
  • the electrode is placed on or under the network of microchannels, more preferably the electrode is placed on the network of microchannels.
  • the matrix of the reservoir (1) comprising the chemoattractant compound is formed from a biocompatible material.
  • the chemoattractant compound included in the matrix of the reservoir (1) makes it possible to attract in vivo the specific biological element within the chip by positive chemotaxis, the biological element migrating towards the reservoir (1) where the concentration of chemoattractant compound is the highest.
  • the microchannel network (2) for its part allows the passage by diffusion of the chemoattractant compound from the reservoir (1) to the external environment (3) of the chip as well as the passage of the specific biological element from the outside middle (3) of the chip towards the inside of the chip, in the direction of the reservoir (1).
  • the electrode (4) is arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2) so that when the specific biological element enters the chip from the external environment (3) through the network of microchannels (2 ) and in the direction of the reservoir (1), the electric field generated by said electrode (4) destroys the biological element in vivo during its passage in the direction of the reservoir (1).
  • the biological element is preferably a cancer cell and in particular a cancer cell originating from cancer or from a solid tumor.
  • the migration of this cell inside the chip takes place by adhesion to the support on which the electrode (4) is placed, the electric field generated by the electrode then being able to destroy the cell in vivo when it is released. passage towards the reservoir (1).
  • the microchannel network (2) of the microfluidic chip according to the present invention is preferably located on the outer edge of said chip, that is to say in contact with the external medium (3), thus ensuring communication between said medium and the interior space of the chip.
  • the chip according to the present invention can comprise several networks of microchannels (2), for example two networks of microchannels.
  • the microfluidic chip according to the invention comprises a single electrode (4).
  • the microfluidic chip according to the invention comprises several electrodes (4).
  • the electrode can more particularly be arranged:
  • the microfluidic chip according to the first object of the invention comprises a lower part (5) and an upper part (6), the reservoir (1) comprising the matrix of chemoattractant compound, the network of microchannels (2) and the electrode ( 4) which can be included independently of one another in the upper part (6) and / or the lower part (5) of said chip.
  • the upper part (6) of the microfluidic chip is able to be placed on the lower part (5) to form a cover, said parts being fixed together.
  • the microfluidic chip according to the present invention comprises a lower part (5) comprising a part of the reservoir (1), the network of microchannels (2) and the electrode (4), and an upper part (6) comprising a part of the reservoir (1) and suitable for being placed on the lower part (5), said parts being fixed together.
  • the microfluidic chip according to the present invention comprises a lower part (5) comprising a part of the reservoir (1), the electrode (4), and an upper part (6) comprising a part of the reservoir (1). ) and the network of microchannels (2), said upper part being able to be placed on the lower part (5), said parts being fixed together.
  • the term “included in” is understood to mean the fact that the electrode is deposited and / or integrated on the lower and / or upper part of the chip. Preferably, the electrode is integrated on the lower part of the chip.
  • the reservoir (1) included in the lower part (5) and in the upper part (6) corresponds to one and the same reservoir, one part of which is located in the upper part of the chip and the other part is in the bottom of the chip.
  • the term “upper part (6)” is understood to mean “suitable for being placed on the lower part (5) to form a cover” the fact that the shape of the upper part (6) is such that it is adapts to that of the lower part (5) on which it rests without hindering the functionality of each element making up the lower part (5) and makes it possible to form a cover closing the chip.
  • the upper (6) and lower (5) part of the microfluidic chip are rounded so that the chip is implanted in vivo without damaging the tissues.
  • the chip is of rounded shape, with for example the upper and lower part having the shape of a half-oval or of a hemisphere so that when the upper part is arranged on the lower part, the microfluidic chip is respectively of shape oval or spherical.
  • the size of the microfluidic chip according to the first object is suitable for in vivo implantation and is of the order of a few centimeters, preferably between 0.5 and 5 cm, more preferably between 1 and 3 cm, even more preferably. of 1 cm.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the reservoir (1), the network of microchannels (2) and the electrode (4) are of annular shape and in which the reservoir is located at the center of the chip.
  • the ring shape corresponds to a ring shape.
  • This particular configuration makes it possible in particular to ensure a radial diffusion of the chemoattractant compound included in the reservoir (1) towards the external medium (3) and a homogeneous attraction of the biological element from said medium towards the reservoir (1), thanks to the central location of the reservoir (1) and the annular shape of the microchannel network (2).
  • the annular shape of the electrode (4) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2) advantageously makes it possible to ensure effective destruction of each biological element which penetrates the chip and originating from any one. direction.
  • the lower part (5) and the upper part (6) of the microfluidic chip can be attached to each other by any physical or chemical means (12), suitable for use in vivo.
  • any physical or chemical fixing means reference may be made respectively to a screw or to an adhesive suitable for in vivo use of the chip or even to a prominent element coming opposite a hollow element present in the chip. lower and upper part to assemble them.
  • the upper part (6) comprises one or more openings through which one or more screws can be inserted and the lower part (5) comprises one or more nuts suitable for receiving said screw or screws.
  • the upper part (6) of the microfluidic chip according to the invention comprises a central opening through which a screw is able to be inserted and the lower part (5) comprises a central nut adapted to receive said screw.
  • the annular reservoir (1) is arranged around the central opening present on the upper part (6) and the central nut present on the lower part (5) of the chip.
  • the microfluidic chip comprises one or more seals (7) capable of sealing the chip, said seals (7) being arranged between the lower part (5) and the upper part (6) above the microchannel network ( 2).
  • seal capable of making the chip waterproof is understood here to mean the property of the seal of not allowing fluids which may be present in the external environment (3) such as blood, such as blood, to enter within said chip and not to let out. in the external environment, the liquids and materials present inside said chip by a place other than by the network of microchannels (2).
  • the position of said seal (s) (7) above the microchannel network (2) making it possible not to hinder the diffusion of the chemoattractant compound towards the external medium (3) nor the passage of the specific cell present in said medium within the chip, in the direction of the reservoir (1).
  • the seals make it possible to create a bearing zone between the upper and lower part of the chip.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the upper part (6) and / or the lower part (5) comprise an annular cavity i) (8) capable of receiving the matrix comprising the chemoattractant compound, and an annular cavity ii) (10) disposed between the reservoir (1) and the microchannel network (2), capable of receiving a liquid in which the chemoattractant compound is capable of diffusing.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the upper part (6) and / or the lower part (5) comprise an annular cavity i) (8) capable of receiving the matrix comprising the chemoattractant compound via d 'one or more openings (9) communicating with the external environment (3) and opening into said cavity, and an annular cavity ii) (10) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2), capable of receiving a liquid in which the chemoattractant compound is able to diffuse, via one or more openings (11) communicating with the external environment (3) and opening into said cavity.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the upper part (6) and the lower part (5) comprise an annular cavity i) (8) capable of receiving the matrix comprising the chemoattractant compound via one or more openings (9) communicating with the external environment (3) and opening into said cavity, and an annular cavity ii) (10) arranged between the reservoir (1) and the network of microchannels (2), capable of receiving a liquid in which the chemoattractant compound is capable of diffusing, via one or more openings (11) communicating with the external environment (3) and opening into said cavity.
  • the chemoattractant compound is added to the matrix of the reservoir (1) before it is added to the annular cavity i) (8).
  • the chemoattractant compound can be added in the annular cavity i) (8) before or after the addition in this same cavity of the matrix forming the reservoir (1).
  • the matrix comprising the chemoattractant compound and the liquid in which the chemoattractant compound is capable of diffusing are added respectively into the annular cavity i) (8) and into the annular cavity ii) via said openings (9, 11), preferably after the upper part (6) has been placed on the lower part (5).
  • the liquid in which the chemoattractant compound is capable of diffusing is preferably an aqueous solution such as physiological saline or a physiological buffer solution such as an aqueous solution comprising a phosphate buffered saline (PBS).
  • aqueous solution such as physiological saline or a physiological buffer solution
  • PBS phosphate buffered saline
  • each of the cavities after said additions is ensured by sealing the openings by means of gaskets, for example in PDMS or any other suitable material, said gaskets being located at the outlet of these openings (9, 11) and communicating with the external environment (3).
  • the annular cavity i) (8) is included in the upper part (6) and the lower part (5) of the chip, the opening (s) (9) opening into this cavity located in the lower part (5). ) of the chip, and the annular cavity ii) (10) as well as the opening (s) (11) opening into this cavity are included in the upper part (6) of the chip.
  • the chip according to the present invention is made of a biocompatible material.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the upper part (6) and the lower part (5) are made of a biocompatible material.
  • the upper part (6) and the lower part (5) as such as well as the elements which they comprise are made of a biocompatible material. More precisely still, the upper part (6), the lower part (5), the reservoir (1) in particular the matrix comprising the chemoattractant compound, the network of microchannels (2), the electrode (4) and the seals ( 7) are made of a biocompatible material.
  • biocompatible material or “biomaterial” is meant a material having the capacity not to interfere, not to degrade the biological environment in which it is used, even in direct or indirect contact, brief or prolonged with fabrics and fluids internal parts of the body of a human or animal.
  • a biocompatible material which can be used within the framework of the present invention, reference may be made in a non-exhaustive manner to glass, to ceramics such as alumina, zirconia, hydroxyapatite, to metals and metal alloys such as titanium, platinum, polymers of natural origin such as collagen, agarose, chitosan, carrageenan, xanthan and alginate or degradable synthetic such as polyesters and polyanhydrides or non-degradable such as polyurethanes, cellulose and its derivatives, vinyl polymers.
  • the polymers of synthetic origin are PEEK (polyetheretherketone) or PDMS (polydimethylsiloxa ne).
  • the upper part (6), the lower part (5) and the network of microchannels (2) are independently of each other, made of polymers of synthetic origin such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyetheretherketone. (PEEK). More preferably, the upper part (6), the lower part (5) are made of polyetheretherketone (PEEK).
  • the microchannel network (2) is made of polyetheretherketone (PEEK).
  • the electrode (4) is made of titanium and / or of platinum, more preferably of titanium and platinum.
  • the reservoir (1) and in particular the matrix comprising the chemoattractant compound is made of collagen and / or of alginate, more preferably said reservoir, in particular said matrix, is made of alginate.
  • the upper part (6), the lower part (5) and the network of microchannels (2) of the chip according to the invention are made of polyetheretherketone (PEEK), the reservoir (1) of chemoattractant compound is alginate and the electrode (4) is titanium and platinum.
  • PEEK polyetheretherketone
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the matrix comprising the chemoattractant compound is composed of a biocompatible material, preferably a crosslinked polymer.
  • the crosslinked polymer making up the matrix is a polymer of natural origin and in particular collagen and / or alginate, preferably alginate.
  • crosslinking of a polymer corresponds to the formation of one or more three-dimensional networks from linear or branched polymers, by chemical and / or physical means.
  • Those skilled in the art know how to induce crosslinking of polymers according to the polymers considered, by way of example the crosslinking can be carried out by heating and / or by the use of a crosslinking agent.
  • a so-called “crosslinked” polymer is a polymer in which some of its chains are linked together by strong or weak bonds.
  • collagen can be crosslinked by the use of crosslinking agents such as gaseous ammonia, oxidized sugars or aldehydes at room temperature and the alginate can be crosslinked in a bath of calcium chloride at room temperature. ambient temperature.
  • crosslinking agents such as gaseous ammonia, oxidized sugars or aldehydes at room temperature
  • the alginate can be crosslinked in a bath of calcium chloride at room temperature. ambient temperature.
  • the biocompatible material composing the matrix comprising the chemoattractant compound is alginate crosslinked in a calcium chloride bath, preferably at room temperature.
  • the crosslinking of the biocompatible material composing the matrix comprising the chemoattractant compound advantageously allows a sustained release of this compound.
  • sustained release is meant a controlled and continuous release kinetics of the chemoattractant compound over a period of time.
  • the release of the chemoattractant compound takes place between 3 days and 6 months, preferably between 15 days and 3 months.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the percentage by mass of chemoattractant compound / matrix of the reservoir (1) is between 0.1 and 20%, preferably between 0.5 and 10% and more preferably between 0.5 and 5%.
  • the chemoattractant compound included in the reservoir of the microfluidic chip and in particular in the matrix of the reservoir is preferably chosen from chemokines such as CXCL12, also called stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, growth factors and transformative growth factors such as TGF alpha or beta (transforming growth factor alpha or beta), FGF (fibroblast growth factor alpha), EGF (epidermal growth factor alpha), betacellulin, amphiregulin, heregulin, HBEGF, PDGF (factor platelet-derived growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor).
  • CXCL12 also called stromal cell-derived factor 1 (SDF-1)
  • CCL5 CCL5 CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25,
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the chemoattractant compound included in the reservoir (1) of the chip is chosen from at least one of the following compounds: CXCL12, CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, TGF alpha, TGF beta, FGF, PDGF, EGF, VEGF.
  • the chemoattractant compound included in the reservoir (1) of the chip is chosen from at least one of the following compounds: CXCL12, CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, TGF alpha, TGF beta, FGF, PDGF, EGF, VEGF.
  • the chemoattractant included in the reservoir (1) of the microfluidic chip and in particular in the matrix of the reservoir (1) is preferably chosen among the carbohydrate molecules.
  • the chemoattractant compound can be used alone or in combination with one or more other chemoattractant compounds mentioned above and / or with other compounds capable of directly or indirectly improving the ability of said chemoattractant compound to attract a specific biological element, such as a cell.
  • a specific biological element such as a cell.
  • eukaryote and in particular a cancer cell such as for example carbohydrate (glucose) and / or lipid (fatty acids) molecules which provide the necessary energy (energy provided in the form of ATP after degradation of glucose or fatty acids) to the survival of the biological element, in particular of a eukaryotic cell and in particular of a cancer cell.
  • Other molecules such as oxygen can be used in combination with chemoattractants.
  • Oxygen can be transported by hemoglobin or by synthetic hemoglobins. Oxygen is an essential molecule for the survival and proliferation of cells and in particular cancer cells.
  • the chemoattractant compound is used in combination with one or more carbohydrate (glucose) and / or lipid (fatty acids) molecules.
  • chemoattractant compound (s) Those skilled in the art will take care to choose the chemoattractant compound (s) according to the specific biological element targeted.
  • the biological element is a eukaryotic cell
  • an analysis of the membrane receptors expressed by the targeted cell should be carried out upstream in order to ensure the specificity of the chemoattractant compound (s) chosen.
  • the chemoattractant compound chosen is the stromal cell-derived factor 1 (SDF-1).
  • the chosen chemoattractant compound is epidermal growth factor (EGF) or transforming growth factor alpha (TGF alpha).
  • microchannels making up the network of microchannels (2) of the microfluidic chip according to the present invention can be of parallelepipedal, cylindrical, squamous or frustoconical shape or a mixture of its shapes.
  • Each microchannel included in the microchannel network (2) of the microfluidic chip according to the present invention may have a height of between 1 and 500 ⁇ m, preferably between 50 ⁇ m and 150 ⁇ m, a width of between 1 and 500 ⁇ m, preferably between 50 ⁇ m and 150 ⁇ m and a length between 30 ⁇ m and 1 mm, preferably between 30 ⁇ m and 500 ⁇ m.
  • each microchannel included in the microchannel network (2) has a height of between 1 and 40 ⁇ m, a width of between 1 and 40 ⁇ m, a length of between 30 and 250 ⁇ m.
  • each microchannel included in the network of microchannels (2) has a height of between 5 and 20 ⁇ m, a width of between 5 and 20 ⁇ m, and a length of between 100 and 200 ⁇ m, preferably 200 ⁇ m.
  • Each microchannel included in a network of microchannels can have dimensions which are specific to it independently of the dimensions of the other microchannels included in this network of microchannels.
  • each microchannel of the same network as well as each microchannel included in the different networks of microchannels can have dimensions and shapes which are specific to it, independently of one another.
  • all of the microchannels included in a network of microchannels have the same shape and the same dimensions.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the electrode (4) is an interdigitated electrode.
  • the “interdigitated electrode” corresponds to an electrode (4), each conductor of which is multi-toothed.
  • each conductor has a diameter between 200 and 400 miti, preferably about 315 ⁇ m, and each conductor is spaced from the other by an air gap of between 10 and 50 ⁇ m, preferably about 15 ⁇ m.
  • the electrode (4) is a wireless electrode, supplied with energy remotely by an antenna (13).
  • the remote power supply can operate by wireless communication, for example from the ISM (industrial, scientific and medical) frequency band using a frequency range between 13.553-13.567 MHz.
  • ISM industrial, scientific and medical
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the electrode (4) is a wireless electrode, said chip comprising an antenna which can be activated by a second antenna.
  • the second antenna is intended to be placed ex vivo when the microfluidic chip is intended to be implanted in vivo.
  • antenna refers to an electronic component consisting of a winding of a conductive material forming one or more turns. When this antenna is crossed by a current, it produces a magnetic field. This magnetic field can be released by the antenna in the form of electrical energy.
  • the antennas thus allow the transmission of electricity through the tissues by inductance.
  • the antenna is an inductance coil.
  • the antenna (13) allows the remote power supply of the electrode (4).
  • the antenna can also allow remote transmission of information.
  • the second antenna intended to be located ex vivo has a transmitter function and the antenna included in the wireless electrode has a receiver function.
  • the antenna included in the chip as well as the second antenna are made of a biocompatible material, preferably the same as that in which the electrode (4) is made, which is preferably titanium.
  • the diameter of said antennas is sufficient for the transmission of electricity through the tissues by inductance, preferably the diameter of the antennas is of the same order of magnitude as the The thickness of the tissues to be passed through, preferably the diameter of said antennae is between 5 mm and 100 mm, more preferably between 10 and 80 mm.
  • the second antenna is integrated into a patch intended for topical application to the skin, said patch comprising a physiologically acceptable support for topical application, that is to say compatible with the skin, mucous membranes and integuments. .
  • the second antenna can also be in an external box.
  • the present invention relates to a microfluidic chip in which the electric field generated by the electrode (4) is capable of destroying the biological element by irreversible electroporation.
  • said electric field generated by the electrode is a pulsed electric field, which corresponds to a selective non-thermal treatment of short duration, generally from a few microseconds to a few milliseconds.
  • the application of a pulsed electric field to a specific cell causes the accumulation of charges on the membrane surface and the increase of the transmembrane potential of the cell membrane.
  • the attraction between the charges of opposite signs accumulated on either side of the cell membrane causes compression of the latter with an elastic force tending to oppose this electrocompression.
  • the pulsed electric field applied exceeds a critical value, the electrocompressive force becomes greater than the elastic force, and pores appear at the level of the cell membrane.
  • the intensity of the pulsed electric field is great and / or the duration of the treatment is long, there is an intensification of the permeabilization and an irreversible destruction of the cell membrane.
  • the pulsed electric field generated by the electrode on the specific biological element makes it possible to induce the irreversible electroporation of said biological element. More precisely, when the biological element is a prokaryotic or eukaryotic cell, the pulsed electric field generated by the electrode creates pores, in particular nanopores in the cell membrane, inducing deregulation of the cell homeostasis irreversible to the cell. origin of cell death by apoptosis or necrosis.
  • the electric field generated by the electrode (4) is a pulsed electric field between 1000 V / cm and 6500 V / cm in voltage, preferably between 3000 V / cm and 5000 V / cm, 1 Hz in frequency and a duration of between 100 ps and 200 ps.
  • the pulsed electric field for a duration of between 100 ps and 200 ps is generated by the electrode several times a day, preferably at least 3 times, for a period suitable for the context of use of the chip.
  • the microfluidic chip comprises a means of measuring the number of specific biological elements entered into the microfluidic chip and / or the number of biological elements destroyed by the electrode.
  • Electrical impedance is the measure of the opposition of the system to the movement of electrical charges when a potential difference is applied to it. In other words, it is the ratio of the voltage applied to the system and the resulting electric current. In the context of the present invention, this measurement is used to quantify the specific biological elements entered into the microfluidic chip, their adhesion to the support inducing a modification of the electrical impedance as well as to quantify the specific biological elements destroyed by the electrode, which are detached from the electrode and consequently induce a modification of the electrical impedance.
  • the means of measuring the number of biological elements entered into the microfluidic chip and / or biological elements destroyed by the electrode is a means of measurement by electrical impedance.
  • the information can be collected and transmitted by wireless communication technology, for example from the ISM (industrial, scientific and medical) frequency band using a frequency range between 13.553 -13.567 MHz.
  • a second object of the invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention to attract and destroy a specific biological element.
  • the present invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention or to a method for attracting and destroying in vivo a specific biological element, said chip being implanted in vivo.
  • the present invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention or to a method for treating or preventing the proliferation and the dissemination of a specific biological element in a subject, such as a prokaryotic or eukaryotic cell in which the chip is implanted in vivo in a subject.
  • the present invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention or to a method for treating or preventing an infection caused by a prokaryotic cell such as a bacterium in which the chip is implanted in vivo. in a subject.
  • a prokaryotic cell such as a bacterium in which the chip is implanted in vivo. in a subject.
  • the present invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first object of the invention or to a method for treating or preventing the proliferation and dissemination of a eukaryotic cell and in particular of a cancer cell. , preferably after resection of a solid tumor in a subject, wherein the chip is implanted in vivo in a subject.
  • the present invention relates to the use of the microfluidic chip according to the first subject of the invention or to a method for preventing the risks of local recurrence of cancer and / or of development of metastatic cancer in a subject, wherein the chip is implanted in vivo in a subject.
  • the microfluidic chip is implanted at a distance of 0.1 to 20 cm, preferably 1 to 10 cm, more preferably at a distance of 5 cm from the resection area of a solid tumor or focal point of bacterial infection in a subject.
  • the microfluidic chip is preferably implanted at the level of the resection zone as soon as the solid tumor is removed, preferably immediately after the resection of said tumor.
  • the pulsed electric field is preferably generated by the electrode several times a day, preferably at least 3 times a day, more preferably 8 times a day, over a period adapted to the context of use of the chip.
  • the term “context of use of the chip” refers here to the type of specific biological element targeted, that is to say to the type of bacterial infection when said element is a bacterium, or to the type of cancer cell. targeted and in particular to the type of solid tumor removed and the stage at which said tumor is when said element is a cancer cell.
  • the pulsed electric field can be generated over a period of 3 days to 6 months, preferably 2 weeks to 4 months, in the form of a cure that can be repeated in a cycle with or without a rest period.
  • the pulsed electric field is generated by the electrode at least 3 times a day, preferably 8 times a day, over a period of between 8 and 16 weeks.
  • the pulsed electric field is generated by the electrode at least 8 times per day, over a period of 8 to 16 weeks.
  • the microfluidic chip can be used alone or in combination with the simultaneous or sequential administration of other medicinal compounds such as anti-cancer compounds, in particular chemotherapeutic and / or hormone therapy compounds and / or immunotherapy and / or targeted therapy and / or radiotherapy when the specific biological element is a cancer cell.
  • other medicinal compounds such as anti-cancer compounds, in particular chemotherapeutic and / or hormone therapy compounds and / or immunotherapy and / or targeted therapy and / or radiotherapy when the specific biological element is a cancer cell.
  • the present invention also relates to a microfluidic chip according to the first object for its use for attracting and destroying in vivo a specific biological element, said chip being implanted in vivo, in accordance with the above-mentioned implementation conditions.
  • the present invention relates to a microfluidic chip according to the first object for its use for treating or preventing the proliferation and dissemination of a specific biological element in a subject, such as a prokaryotic or eukaryotic cell, in which the chip is implanted in vivo in a subject in accordance with the aforementioned processing conditions.
  • the present invention relates to a microfluidic chip according to the first object for its use for treating or preventing an infection caused by a prokaryotic cell such as a bacterium, in which the chip is implanted in iz / Vo in a subject.
  • the present invention relates to a microfluidic chip according to the first object for its use for treating or preventing the proliferation and dissemination of a eukaryotic cell and in particular of a cancer cell, preferably after the resection of a. solid tumor in a subject, in which the chip is implanted in iz / Vo in a subject in accordance with the above processing conditions.
  • the present invention relates to a microfluidic chip according to the first object for its use for preventing the risks of local recurrence of cancer and / or of development of metastatic cancer in a subject, in which the chip is implanted. in vivo in a subject according to the above processing conditions.
  • the specific biological element is a eukaryotic cell and in particular a cancer cell
  • said cell preferably originates from cancer of the breast, lungs, prostate, bladder, salivary glands, skin, intestine, colon-rectum, thyroid, cervix, endometrium and ovaries, lip-mouth-laryngeal cancer, kidney, liver, brain, testes, pancreas, preferably breast cancer.
  • solid tumors are not limiting.
  • Example 1 Manufacture of the microfluidic chip for the in vitro concept study
  • microfluidic chip containing at its center a reservoir in which a chemoattractant is placed.
  • a glass substrate (dimension 50x50 mm) is prepared in a so-called “piranha” solution (H SO: H 0 2 , 3: 1) in order to clean it and increase its hydrophilic properties, followed by dehumidification for 15 minutes at 150 ° C on a hot plate to promote adhesion of the negative photosensitive resin (AZ® nLOF 2020 from MicroChemicals).
  • H SO H 0 2 , 3: 1
  • the resin is deposited on the substrate by centrifugal coating (3000 rev / min, 30s) in order to obtain a thickness of 2 ⁇ m.
  • the solvents are evaporated by annealing for one minute at 110 ° C. on a hot plate.
  • the sample is subjected to UV exposure (70 mJ / cm 2 ). This activation will modify the local properties of the resin which, after curing, will be soluble or not in a solvent. Since the resin is negative, the part exposed to ultraviolet rays will become solid while the other part will dissolve during development.
  • the plate is then subjected to post exposure bake (PEB) annealing in order to provide the energy necessary to complete the process for 1 min at 110 ° C.
  • PEB post exposure bake
  • a titanium / platinum deposit (20/200 nm) is then carried out by cathodic sputtering followed by a so-called “lift-off” (acetone and NANO TM REMOVER PG from MicroChemicals) to remove the resin residues.
  • lift-off acetone and NANO TM REMOVER PG from MicroChemicals
  • a micro-structuring of silicon nitride is carried out.
  • the lithography process described above is repeated with the addition of an alignment step.
  • the deposit of 200 nm of Si 3 N 4 is obtained in a PECVD frame (plasma-assisted chemical vapor deposition).
  • the areas not protected by the resin are then etched by a reactive ionic etching process (ICP RIE).
  • ICP RIE reactive ionic etching process
  • the device is cleaned with REMOVER PG from MicroChemicals and an air plasma.
  • a silicon wafer (diameter 76.2 mm) is prepared in a “piranha” solution followed by dehumidification for 15 to 150 ° C.
  • the SU-8 resin is deposited on the silicon wafer by centrifugal coating (3000 rpm, 30s) in order to obtain the desired thickness (lOpm or lOOpm depending on the type used SU-8 2010 or SU-8 2100) .
  • the evaporation of the solvents is obtained with very light heating and cooling ramps in order to minimize the mechanical stress in the resin (5 ° C / min).
  • the sample is subjected to a 365 nm UV exposure of 125 mJ / cm2 for a thickness of 10 ⁇ m, and of 250 mJ / cm2 for a thickness of 100 ⁇ m.
  • the plate is then subjected to a post exposure bake (PEB) annealing (4 min at 95 ° C. for a thickness of 10 pm and 30 min at 95 ° C. for a thickness of 100 pm).
  • PEB post exposure bake
  • the development makes it possible to dilute the uncrosslinked parts of the SU-8 resin in a solvent (“SU-8 developer” composed mainly of PGMEA (propylene glycol monomethyl ether acetate)).
  • SU-8 developer composed mainly of PGMEA (propylene glycol monomethyl ether acetate)
  • a silicone polymer polydimethylsiloxane is prepared by mixing it with its curing agent (Sylgard TM 184 silicone elastomer kit from Dow, ratio 1: 10). The bubbles formed during mixing are removed using a desiccator and a vacuum pump. Once the PDMS has been degassed, it is poured onto the SU-8 mold placed in a Petri dish, then placed in an oven at 80 ° C. for at least 2 hours in order to complete the crosslinking process. After cooling, the PDMS is peeled off and then cut using a circular blade in order to obtain the cylindrical shapes of the devices.
  • PDMS silicone polymer polydimethylsiloxane
  • the last step is to glue the PDMS onto a glass substrate to encapsulate the channels. This is obtained by activating the surface to transform the Si-CH 3 function of the PDMS into Si-OH using a 0 plasma generator or air. In contact with glass (Si0 2 ), a permanent Si-O-Si covalent bond will be created. d) Electrical instrumentation
  • the chip is equipped with interdigitated electrodes (distance: 15 ⁇ m) imposing a sufficiently intense field (2000 to 5000 V / cm) to cause irreversible electroporation of specific cells and thus induce apoptosis or necrosis of cells that have entered the system.
  • a square signal (high voltage / frequency / time: 3 to 7.5 V / l Hz / 100 ps) is delivered by a function generator (TG2511A TTi) and visualized by an oscilloscope (TBS1032B Tektronix) during application on the chip.
  • the second channel of the oscilloscope is connected to a high precision shunt resistor (0.1 W, LVR01R1000FE70 from Vishay) thus making it possible to obtain an image of the electric current passing through the electrodes (4) s.
  • the instruments are connected by a USB cable to a computer (Raspberry Pi 3 Model B +, operating system: Linux Raspbian 9 (Stretch)).
  • Virtual instrument software architecture (VISA) communication is provided by the open source PyVISA library and a Python script is run regularly by the crontab program of the operating system. e) Manufacture of the release matrix
  • a 3% (w / v) aqueous alginate solution was placed in a porous mold in the shape of the chip reservoir.
  • the mold is immersed in a crosslinking bath of calcium chloride for 24 hours. After 3 washes with miliQ water, the matrix is frozen at -20 ° C. and then lyophilized.
  • Example 2 Study of the cytokine release profile
  • the chemoattractant compound SDF-1 is usually complexed with BSA (Bovine Serum Albumin) at a rate of 1.51 molecules of BSA per 10 molecules of SDF-1.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • SDF-1 is a small 8 kDA cytokine.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the column used is a column designed to detect proteins such as BSA-FITC.
  • the microfluidic chip has been implemented in vitro to test its ability to attract MDA-MB-231 breast cancer cells which are epithelial cells of mammary tumors.
  • the SDF-1 “stromal cell-derived factor” compound corresponds to the chemoattractant compound capable of attracting MDA-MB-231 cells.
  • the MDA-MB-231 cells stably transfected with the “green fluorescent protein” (GFP) are trypsinized on D0. Then 20,000 cells are seeded in a 35 mm petri dish containing the microfluidic chip in its center. The cells are cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM F12) + Glutamax + 1% fetal calf serum (FCS) + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin).
  • DMEM F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12
  • FCS fetal calf serum
  • antibiotic streptomycin, penicillin
  • the central reservoir of the microfluidic chip is loaded either with 33 ⁇ l of DMEM F12 + Glutamax + 1% FCS + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin) ( Figure 8) or with 33 ⁇ l of DMEM F12 + Glutamax + 10 ⁇ l of FCS pure + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin). ( Figure 9). After 7 days of culture in a 5% CO 2 incubator and a humidity of 95%, photographs are taken from an inverted fluorescence microscope.
  • the MDA-MB-231 cells stably transfected with the “green fluorescent protein” (GFP) are trypsinized on D0. Then 100,000 cells are seeded in a 50 mm diameter petri dish, the microfluidic chip being placed in the center of this petri dish. The cells are cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM F12) + Glutamax + 1% fetal calf serum (FCS) + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin).
  • DMEM F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12
  • FCS fetal calf serum
  • antibiotic streptomycin, penicillin
  • the central reservoir of the microfluidic chip is loaded either with 50 ⁇ l of DMEM F12 + Glutamax + 1% FCS + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin) ( Figures 10 and 11) or with 50 ⁇ l of DMEM F12 + Glutamax + SVF 10 p1 + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin) ( Figures 12 and 13) or with 50 pl of DMEM F12 + Glutamax + 1 pg SDF-1 + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin) ( Figures 14 and 15).
  • MDA-MB-231 cells stably transfected with the “green fluorescent protein” (GFP) are trypsinized on D0. Then 60,000 cells are seeded in a PDMS well fixed on a glass slide inside of which is arranged a circular interdigitated electrode.
  • the culture medium used is: DMEM F12 + Glutamax + FCS 10% + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin).
  • the MDA-MB-231 cells stably transfected with the “green fluorescent protein” (GFP) are trypsinized on D0. Then 50,000 cells are seeded in a 50 mm diameter Petri dish, the microfluidic chip comprising an interdigitated electrode and two microchannel networks being placed in the center of this petri dish. The cells are cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM F12) + Glutamax + 1% fetal calf serum (FCS) + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin).
  • DMEM F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12
  • FCS fetal calf serum
  • antibiotic streptomycin, penicillin
  • the central reservoir of the chip is loaded with 50 ⁇ l DMEM F12 + Glutamax + 1% FCS (fetal calf serum) + 1% antibiotic (streptomycin, penicillin) in the absence of gradient and without pulsed electric field (Figure 18)
  • the cells cross the first network of microchannels and are then electroporated. In any case, the cells are not able to cross the two networks of microchannels.
  • microfluidic chip to attract and destroy a biological element, and in particular that said chip is capable of attracting breast cancer tumor cells (MDA-MB-231), i.e. from a gradient of fetal calf serum is more significantly from a gradient of SDF-1 chemoattractant and that it is possible to destroy these same tumor cells from a pulsed electric field.
  • MDA-MB-231 breast cancer tumor cells
  • SDF-1 chemoattractant i.e. from a gradient of fetal calf serum is more significantly from a gradient of SDF-1 chemoattractant and that it is possible to destroy these same tumor cells from a pulsed electric field.

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Abstract

La présente invention concerne une puce microfluidique pour attirer et détruire un élément biologique spécifique, ladite puce comprenant : - un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique - au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1) - au moins une électrode (4) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) ou au même endroit que le réseau de microcanaux (2), ladite électrode (4) étant apte à générer un champ électrique de façon à détruire l'élément biologique lors de son passage vers le réservoir (1).

Description

Description
Titre de l'invention : Puce microfluidique pour attirer et détruire un élément biologique spécifique
Domaine Technique
La présente demande concerne le domaine des dispositifs microfluidiques aptes à attirer et à détruire un élément biologique spécifique. Plus précisément, la présente demande concerne une puce microfluidique apte à attirer et à détruire in vivo un élément biologique spécifique, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote.
Technique antérieure
Chaque année en France environ 400 000 nouveaux cas de cancers sont identifiés avec environ 150 000 décès.
Il existe différents types de cancers en fonction du tissu dans lequel ils se développent. On peut ainsi distinguer les tumeurs solides qui se caractérisent par un amas localisé de cellules cancéreuses et les tumeurs des cellules sanguines, qui sont diffuses et dont les cellules cancéreuses circulent dans la moelle osseuse ou le sang. Les tumeurs des cellules sanguines aussi appelées cancers hématopoïétiques sont des cancers affectant le sang ou les organes lymphoïdes, tels que les leucémies et les lymphomes.
Pour ce qui est des tumeurs solides on distingue les carcinomes et les adénocarcinomes, cancers issus d'un tissu épithélial. On distingue également les sarcomes qui correspondent à des cellules cancéreuses apparaissant dans un tissu dit de support on parle alors d'ostéosarcome pour les os, de liposarcome pour la graisse ou encore de myosarcome pour les muscles.
Chez les hommes comme chez les femmes, les cancers solides représentent 90 % des cancers, avec les cancers de la prostate, du poumon et du colon-rectum représentant les trois cancers les plus fréquents chez les hommes et les cancers du sein, du colon-rectum et du poumon représentant les trois cancers les plus fréquents chez les femmes. Bien que la mortalité par cancer ait diminué de 1,5 % par an chez les hommes et de 1 % par an chez les femmes entre 1980 et 2012 (taux standardisés), il reste nécessaire de disposer de solutions efficaces pour traiter et prévenir ces tumeurs solides ainsi que leurs complications. A ce jour, la chirurgie est l'un des traitements principaux d'une tumeur solide et correspond à la résection de la totalité de la tumeur lorsque cela est possible et éventuellement des tissus situés autour de la tumeur dite marge de résection. La chirurgie peut être utilisée en traitement unique lorsque la tumeur est très localisée, notamment lorsque la tumeur est à un stade précoce mais elle est souvent associée à d'autres traitements tels que la radiothérapie qui est aussi un traitement local et / ou à des traitements médicaux comme la chimiothérapie qui est un traitement systémique agissant potentiellement sur toutes les cellules cancéreuses du corps.
L'avantage de la chirurgie locale pour le traitement d'une tumeur solide est la possibilité de retirer la totalité de la tumeur lorsque cela est possible et de préserver les organes et les structures anatomiques non atteints par les cellules cancéreuses. Elle permet également de limiter les effets secondaires attribués au traitement par radiothérapie tels que les brûlures, ou la génération de cancers radio-induits, et à la chimiothérapie tels que les réactions cutanées, les nausées, vomissements, diarrhées, douleurs musculaires, fatigue, chute des cheveux ainsi que les cancers chimio-induits.
Afin de diminuer le taux de rechute la zone de résection inclut une zone de tissus sains présents autour de la tumeur, qui correspond à la marge de résection. A ce stade, plusieurs cas de figures doivent être considérés. Dans un premier cas de figure, les cellules tumorales de la tumeur primaire sont inclues dans la zone de résection et il n'y aura pas de récidive. Dans un second cas de figure, certaines cellules tumorales sont localisées au delà de la zone de résection soit au niveau local soit à distance et alors une récidive est envisageable soit localement ou à distance pour former des métastases, c'est-à-dire des colonies secondaires de cellules cancéreuses qui se propagent à distance de l'organe atteint par la tumeur initiale et qui sont à l'origine d'un cancer dit « métastatique» dans un organe autre que celui dans lequel se trouvait la tumeur solide.
Il est donc nécessaire de prévenir au mieux les risques de récidive locale et de cancer métastatique après la résection d'une tumeur solide.
La chimiothérapie peut être utilisée après la chirurgie locale visant la résection de la tumeur, on parle de « chimiothérapie adjuvante » afin de prévenir la récidive et / ou la formation d'un cancer métastatique. Cependant, tel qu'indiqué précédemment, de très nombreux effets secondaires sont engendrés par ce traitement médicamenteux. Parmi les effets secondaires les plus considérables liés à l'utilisation de la chimiothérapie on peut en particulier faire référence aux cancers chimio-induits qui par définition correspondent aux nouvelles tumeurs survenant chez des patients traités par des drogues cytotoxiques pour une première tumeur maligne et causées par celles-ci, on peut également faire référence au risque de générer une résistance des cellules cancéreuses au traitement chimiothérapeutique limitant ainsi fortement les possibilités d'éliminer lesdites cellules.
Ainsi, il n'existe pas à ce jour de solution permettant d'éliminer efficacement les cellules cancéreuses restantes après la résection d'une tumeur solide afin de prévenir et / ou diminuer les risques de récidive locale et / ou de développement de cancer métastatique, qui soit efficace et ne présente pas d'effets secondaires médicamenteux à court et moyen terme.
Pour répondre à ces besoins, la présente invention propose une puce microfluidique pour attirer et détruire un élément biologique spécifique et en particulier une cellule eucaryote telle qu'une cellule cancéreuse. Ladite puce étant particulièrement adaptée à être implantée in vivo au niveau de la zone de résection d'une tumeur solide afin d'attirer et détruire in vivo les cellules cancéreuses restantes.
Des dispositifs microfluidiques ont été décrits dans l'art antérieur pour leur utilisation dans le domaine du traitement du cancer. On peut notamment faire référence au document WO2018/089989 Al qui décrit un dispositif ex vivo pour le traitement du cancer en soumettant un fluide biologique tel que le sang à rayonnement électromagnétique spécifique du type de cellule cancéreuse ciblée et apte à la détruire.
On peut également faire référence au document US2018111124 Al qui décrit un dispositif microfluidique comprenant un ou plusieurs canaux microfluidiques et un ou plusieurs réseaux d'électrodes bipolaires sans fil permettant une capture à haut débit des cellules tumorales circulantes dans une solution ionique conductrice, en appliquant un champ électrique alternatif de 40 kHz à un échantillon biologique. Les cellules ainsi capturées peuvent être utilisées pour diagnostiquer un cancer ou évaluer l'effet d'un traitement anticancéreux.
Aucun document de l'art antérieur ne décrit ou ne suggère une puce microfluidique pour attirer et détruire, de préférence in vivo, une cellule cancéreuse après la résection d'une tumeur solide et ainsi prévenir et / ou diminuer les risques de récidive locale et / ou de développement de cancer métastatique.
De façon plus générale, aucun document de l'art antérieur ne décrit ou ne suggère une puce microfluidique pour attirer et détruire de préférence in vivo, un élément biologique spécifique, ladite puce microfluidique comprenant un réservoir constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer un élément biologique, au moins un réseau de microcanaux mettant en communication le réservoir et le milieu extérieur de la puce et au moins une électrode apte à générer un champ électrique pour détruire l'élément biologique.
Exposé de l'invention
La présente invention concerne une puce microfluidique pour attirer et détruire un élément biologique spécifique, ladite puce comprenant :
- un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique
- au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1)
- au moins une électrode (4) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) ou au même endroit que le réseau de microcanaux (2), ladite électrode (4) étant apte à générer un champ électrique de façon à détruire l'élément biologique lors de son passage vers le réservoir (1).
Brève description des figures
[Fig. 1] La figure 1 est une vue en coupe de la puce selon l'invention.
[Fig. 2] La figure 2 représente la partie supérieure (6) de la puce vue du dessus.
[Fig. 3] La figure 3 représente la partie inférieure (5) de la puce vue du dessus.
[Fig. 4] La figure 4 représente une vue éclatée du dessous de la puce selon l'invention.
[Fig. 5] La figure 5 représente une vue éclatée du dessus de la puce selon l'invention.
[Fig. 6] La figure 6 représente une vue en coupe de la puce selon l'invention à l'échelle 5 :0,5 cm.
[Fig. 7] La figure 7 représente une vue en coupe de la puce à l'échelle 5 : 1 cm.
[Fig. 8] La figure 8 est une image par microscope inversé à fluorescence avec un objectif x5, au niveau des micro-canaux, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA- MB-231) (14) en l'absence de gradient. [Fig. 9] La figure 9 est une image par microscope inversé à fluorescence avec un objectif x5, au niveau des micro-canaux, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA- MB-231) (14) attirées dans la puce à partir d'un gradient de sérum de veaux fœtal (SVF) avec 1% SVF à l'extérieur de la puce et 10 pl de SVF pur à l'intérieur du réservoir.
[Fig. 10] La figure 10 est une image par microscope inversé à fluorescence avec un objectif xlO, au niveau des micro-canaux, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB-231) (14) en l'absence de gradient.
[Fig. 11] La figure 11 est une image par microscope inversé à fluorescence avec un objectif x5, au niveau du réservoir central de la puce, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB-231) (14) en l'absence de gradient.
[Fig. 12] La figure 12 est une image par microscope inversé à fluorescence objectif xlO, au niveau des micro-canaux, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB- 231) (14) attirées dans la puce à partir d'un gradient de sérum de veaux fœtal (SVF) avec 1% SVF à l'extérieur de la puce et 10 pl de SVF pur à l'intérieur du réservoir.
[Fig. 13] La figure 13 est une image par microscope inversé à fluorescence objectif x5, au niveau du réservoir central de la puce, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB-231) (14) attirées dans la puce à partir d'un gradient de sérum de veaux fœtal (SVF) avec 1% SVF à l'extérieur de la puce et 10 mI de SVF pur à l'intérieur du réservoir.
[Fig. 14] La figure 14 est une image par microscope inversé à fluorescence objectif x 10, au niveau des micro-canaux, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB- 231) (14) attirées dans la puce à partir d'un gradient de chimioattractant SDF-1 (1 pg de chimioattractant SDF-1 présent dans le réservoir central de la puce).
[Fig. 15] La figure 15 est une image par microscope inversé à fluorescence objectif x 5, au niveau du réservoir central de la puce, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB-231) (14) attirées dans la puce à partir d'un gradient de chimioattractant SDF-1 (1 pg de chimioattractant SDF-1 présent dans le réservoir central de la puce).
[Fig. 16] La figure 16 est une image par microscope inversé à fluorescence, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB-231) sur une lame de verre contenant une électrode interdigitée, après 48h de culture dans un incubateur C02 5% et humidité 95 %, en l'absence d'électroporation.
[Fig. 17] La figure 17 est une image par microscope inversé à fluorescence, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB-231) sur une lame de verre contenant une électrode interdigitée, détruites par électroporation par application d'un champ électrique par une électrode interdigitée de 5v lOOps 1 hertz à jO et à j0+ 3heures.
[Fig. 18] La figure 18 est une image par microscope inversé à fluorescence, au niveau des micro-canaux, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB-231) en l'absence de gradient et de champ électrique pulsé.
[Fig. 19] La figure 19 est une image par microscope inversé à fluorescence, au niveau des micro-canaux, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB-231) attirées dans la puce à partir d'un gradient de SDF-1 (1 pg de chimioattractant SDF-1 présent dans le réservoir central de la puce) sans champ électrique pulsé.
[Fig. 20] La figure 20 est une image par microscope inversé à fluorescence, au niveau des micro-canaux, représentant les cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB-231) attirées dans la puce à partir d'un gradient de SDF-1 (1 pg de chimioattractant SDF-1 présent dans le réservoir central de la puce) et d'un champ électrique pulsé de 5v 100 ms 1 hertz.
[Fig. 21] La figure 21 est un graphique présentant la libération de BSA-FITC (mimant le SDF-1) à partir d'une matrice d'alginate contenue dans une puce microfluidique selon l'invention sur une période de 50 jours.
[Fig. 22] La figure 22 est un graphique présentant la libération de SDF-1 à partir d'une matrice d'alginate sur une période de 50 jours.
Description détaillée
Les Demandeurs ont mis au point une puce microfluidique pour attirer et détruire un élément biologique, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote. Cette puce microfluidique est particulièrement intéressante pour attirer et détruire une cellule cancéreuse in vivo après la résection d'une tumeur solide afin de prévenir et / ou diminuer les risques de récidive locale et / ou de développement de cancer métastatique.
Définitions
Une « puce microfluidique » est un dispositif comprenant un réseau de microcanaux, c'est-à dire des canaux de taille micrométrique, gravés ou moulés dans un matériau, connectés entre eux et reliant l'intérieur de la puce à l'extérieur de la puce par des entrées et des sorties percées à travers la puce, pour réaliser une fonction voulue. La puce microfluidique peut être obtenue par des procédés spécifiques tels que par déposition et électrodéposition, gravure, collage, moulage par injection, embossage, lithographie douce, soudure anodique, ou toutes autres technologies. Ces procédés de fabrication sont connus de l'Homme du métier. Dans le cadre de la présente invention, la fonction voulue de la puce microfluidique est de pouvoir attirer in vivo un élément biologique spécifique, de préférence une cellule eucaryote telle qu'une cellule cancéreuse, et de le détruire in vivo.
Le « réseau de microcanaux» correspond à une multitude de canaux, reliés à l'extérieur de la puce par des entrées et des sorties percées à travers la puce. Les microcanaux peuvent par exemple être fabriqués à partir d'un moule, ou directement dans le matériau de la puce microfluidique. Le nombre de microcanaux varie en fonction du diamètre de la puce, de la largeur des microcanaux ou encore de l'espacement entre lesdits microcanaux. A titre d'exemple, pour une puce d'un centimètre de diamètre avec des canaux de 10 pm de largeur, lesdits microcanaux peuvent être au nombre de 1500 environ.
Chaque microcanal composant le réseau de microcanaux correspond à un passage dont la hauteur peut être de quelques micromètres à quelques centaines de micromètres avec une longueur de quelques centaines de micromètres jusqu'à quelques millimètres. La section transversale d'un microcanal peut en principe avoir n'importe quelle forme en deux dimensions, telle qu'un carré, un rectangle, un cercle ou une combinaison de ceux-ci. Un microcanal peut être droit ou courbé.
La largeur d'un microcanal correspond à la distance horizontale des deux points qui sont sur les bords opposés de la section transversale et qui sont les plus éloignés l'un de l'autre. La hauteur d'un microcanal correspond à la distance verticale des points situés sur les bords opposés de la section transversale et les plus éloignés les uns des autres. La longueur d'un microcanal est la distance entre les deux extrémités dudit canal, la longueur d'un microcanal correspond à la plus grande dimension. Les deux dimensions les plus courtes définissent généralement la section transversale susmentionnée.
Par « électrode » dans le cadre de la présente invention, on fait référence à tout élément capable de conduire un courant électrique et comprenant deux conducteurs séparés par un entrefer d'une distance comprise entre 1 pm à 1 mm. La présente demande fait référence à une électrode, au singulier pour des raisons de clarté, l'Homme du métier comprenant qu'une électrode est composée des deux dits conducteurs séparés par un entrefer pour que le courant puisse être conduit. La puce microfluidique est de préférence « destinée à être implantée in vivo » c'est à dire que la puce microfluidique est destinée et apte à être implantée au sein d'un être vivant, de préférence un mammifère et en particulier un être humain. Plus particulièrement, cela signifie que la puce peut être implantée dans un être vivant sans interférer, ni dégrader les tissus avec lesquels elle est en contact et que ladite puce est apte à fonctionner in vivo c'est-à-dire attirer et détruire un élément biologique spécifique in vivo, de préférence une cellule eucaryote telle qu'une cellule cancéreuse, et de le détruire in vivo.
Par « élément biologique » au sens de la présente invention on fait référence à tout élément comprenant de l'information génétique sous forme d'ARN ou d'ADN et susceptible de se trouver au sein d'un organisme vivant c'est-à-dire in vivo, tels que les cellules procaryotes, les cellules eucaryotes et les microorganismes. Parmi les éléments biologiques envisageables on peut notamment faire référence à une cellule procaryote telle qu'une bactérie, à une cellule eucaryote telle qu'une cellule animale.
Par « élément biologique spécifique » ou « élément biologique cible » on fait référence à l'élément biologique d'intérêt dans le cadre de l'utilisation de la puce c'est-à-dire l'élément biologique que l'on souhaite attirer et détruire in vivo. Le composé chimioattractant présent dans le réservoir étant choisi pour attirer l'élément biologique d'intérêt dans le cadre de l'utilisation de la puce microfluidique.
Par « au même endroit que le réseau de microcanaux » on fait référence au fait que l'électrode est disposée au niveau du réseau de microcanaux, plus précisément sur ou sous le réseau de microcanaux. De préférence, l'électrode est disposée sur le réseau de microcanaux.
De préférence dans le cadre de l'invention, l'élément biologique d'intérêt est une cellule procaryote ou eucaryote, de préférence encore l'élément biologique d'intérêt est une cellule eucaryote. De façon encore plus préférée, la cellule eucaryote est une cellule cancéreuse, de préférence une cellule cancéreuse métastatique.
Une « cellule cancéreuse » est une cellule dans laquelle une ou plusieurs lésions majeures de l'ADN se sont produites, transformant ainsi la cellule normale en cellule cancéreuse apte à proliférer pour former un groupe de cellules transformées identiques c'est-à-dire une tumeur. On fait notamment référence à une cellule cancéreuse lorsque la cellule considérée présente un certain nombre de caractéristiques telles qu'une indépendance vis-à-vis des signaux de régulation de la croissance cellulaire, une capacité à échapper au processus de mort cellulaire programmée ainsi qu'une capacité à se diviser indéfiniment. Plus particulièrement dans le cadre de la présente invention, on fait référence par « cellule cancéreuse » à une cellule issue d'une tumeur solide dite initiale ou d'origine ou primaire, présente au niveau ou à proximité de la zone de résection de la tumeur solide.
De préférence dans le cadre de la présente invention, on fait également référence par « cellule cancéreuse » à une « cellule cancéreuse métastatique » c'est à dire une cellule cancéreuse, capable de ou ayant migré à travers le corps par la voie des vaisseaux sanguins ou lymphatiques à partir de la tumeur d'origine et capable de ou ayant colonisé un ou plusieurs autres tissus à proximité ou à distance de ladite tumeur formant ainsi des métastases, à l'origine de « cancers métastatiques » ou encore « tumeurs métastatiques ». Dans ce cadre, la cellule cancéreuse est une cellule issue d'une tumeur solide dite secondaire ou tertiaire qui correspondent à des tumeurs métastatiques dans un second ou troisième tissu ou organe autre que celui de la tumeur initiale.
Il est fait référence à « élément biologique spécifique », « une cellule procaryote », « une cellule eucaryote », « une cellule cancéreuse », « une cellule métastatique» au singulier pour des raisons de clarté, étant entendu que la puce microfluidique selon la présente invention est apte à attirer et détruire in vivo plusieurs desdits éléments et cellules. Il est également bon de noter que la puce microfluidique selon la présente invention est apte à attirer et détruire in vivo plusieurs éléments biologiques spécifiques qui peuvent être de nature différente, lesdits éléments étant attirés au sein de la puce par le choix spécifique du ou des composés chimioattractants présents dans le réservoir.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « prévenir » désigne une réduction du risque d'acquisition d'une maladie ou d'un trouble spécifié, la réduction ou le ralentissement de l'apparition des symptômes de cette maladie. Par exemple dans le cadre de la présente invention, le terme « prévenir » peut correspondre à la réduction du risque de propagation d'une infection lorsque l'élément biologique est une cellule procaryote ou à la réduction du risque de récidive locale du cancer et / ou du risque d'apparition de métastases, plus précisément de cancers métastatiques lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote de type cancéreuse.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « traiter » désigne une amélioration ou l'inversion d'une maladie ou d'un trouble spécifié ou d'au moins un symptôme discernable. Le terme « traiter » peut aussi désigner la réduction ou le ralentissement de la progression de la maladie ou du trouble, ou de l'apparition des symptômes de cette maladie ou trouble. Par exemple dans le cadre de la présente invention, le terme « traiter» peut correspondre à la réduction ou au ralentissement de la progression d'une infection lorsque l'élément biologique est une cellule procaryote ou à la réduction ou le ralentissement d'apparition de métastases, plus précisément de cancers métastatiques lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote de type cancéreuse.
Au sens de la présente invention, la puce microfluidique est de préférence destinée à être implantée in vivo chez un sujet.
Le sujet dans le cadre de la présente invention est un être vivant, de préférence un mammifère et plus particulièrement les êtres humains, enfants, hommes ou femmes.
Par « cancer solide », ou « tumeur solide » on fait référence à une masse individualisée de cellules cancéreuses dans n'importe quel tissu tel que la peau, les muqueuses, les os, ou tout autre tissu présent dans les organes, c'est-à-dire aux carcinomes issus de cellules épithéliales comme la peau, les muqueuses, les glandes et aux sarcomes issus de cellules des tissus conjonctifs et de soutien tels que l'os, le cartilage.
De préférence dans le cadre de la présente invention on fait référence par « cancer solide » ou « tumeur solide », à un carcinome tel que le cancer du sein, des poumons, de la prostate, de la vessie, des glandes salivaires, de la peau, de l'intestin, du côlon-rectum, de la thyroïde, du col de l'utérus, de l'endomètre et des ovaires, du cancer lèvre-bouche-larynx, du rein, du foie, du cerveau, des testicules, du pancréas, préférentiellement le cancer du sein. Ces exemples de tumeurs solides n'étant pas limitatifs.
Par « composé chimioattractant » on fait référence à tout composé apte à attirer par chimiotactisme un élément biologique, de préférence une cellule exprimant des récepteurs membranaires spécifiques de ce composé à sa surface, ledit élément biologique se déplaçant en fonction du gradient de concentration en composé chimioattractant. Dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est apte à induire le déplacement d'un ou plusieurs éléments biologiques spécifiques en fonction du gradient de concentration dudit composé par chimiotactisme positif, l'élément biologique se déplaçant vers la région où la concentration en composé chimioattractant est la plus élevée.
En particulier dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est dit « apte à attirer » un élément biologique spécifique lorsqu'il permet le déplacement dudit élément à l'intérieur de la puce microfluidique et en particulier vers le réservoir de composé chimioattractant dans lequel se trouve la concentration la plus élevée en composé chimioattractant. L'Homme du métier saura caractériser l'élément biologique spécifique d'intérêt afin de choisir le composé chimioattractant apte à attirer ledit élément au sein de la puce. Dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est choisi en fonction de l'élément biologique spécifique d'intérêt.
Lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote, le composé chimioattractant est choisi en fonction du type de récepteurs membranaires que cette cellule exprime.
Plus précisément, lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote le composé chimioattractant peut être une cytokine c'est-à-dire un polypeptide ou une protéine soluble synthétisée par une cellule et agissant à distance sur d'autres cellules pour en réguler l'activité et la fonction par l'intermédiaire de récepteurs membranaires, choisie parmi les chimiokines, les facteurs stimulant les colonies de granulocytes et de macrophages tels que M-CSF, G-CSF, CSF-1, les facteurs de croissance et facteurs de croissance transformant tels que TGF alpha, TGF beta, EGF, bétacelluline, amphiréguline, héréguline, HBEGF, FGF, VEGF, les facteurs de nécrose tumorale tels que NGF, TNF alpha, TNF beta, les interférons tels que IFN alpha, IFN beta, IFN gamma, IFN lambda et les interleukines telles que IL-1 à IL-38.
De préférence lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote telle qu'une cellule cancéreuse, le composé chimioattractant est choisi parmi les chimiokines, les facteurs de croissance et les facteurs de croissance de transformation.
Une chimiokine est une petite protéine de 8 à 14 kilo daltons caractérisée par la présence de quatre résidus cystéine en des positions conservées permettant la formation de leur structure tridimensionnelle. Les chimiokines peuvent être classées en quatre sous-familles en fonction de l'espacement entre deux de leurs cystéines en position N-terminale, on peut notamment faire référence à la famille CXC ou alpha c'est à dire dont les deux premières cystéines sont séparées par un acide aminé quelconque, la famille CC ou beta, la famille CX3C ou delta, la famille C ou gamma. La chimiokine dans le cadre de la présente invention peut par exemple être choisie parmi les chimiokines suivantes : CXCL12, appelée également stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1.
Un facteur de croissance est une protéine de faible poids moléculaire (inférieur à 30 kilo daltons) qui stimule la multiplication cellulaire et est reconnu par des récepteurs membranaires spécifiques qui sont le plus souvent des tyrosines kinases. Le facteur de croissance dans le cadre de la présente invention peut par exemple être choisi parmi TGF alpha ou beta (facteur de croissance transformant alpha ou beta), FGF (facteur de croissance du fibroblaste alpha), EGF (facteur de croissance épidermique), la bétacelluline l'amphiréguline, l'héréguline, HBEGF, VEGF (facteur de croissance de l'endothélium vasculaire), PDGF (facteur de croissance plaquette-dérivé).
Lorsque l'élément biologique est une cellule procaryote, telle qu'une bactérie, le composé chimioattractant peut être un peptide portant un groupe N formylé tel que le N- formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (FMLP) ou encore des molécules glucidiques telles que le glucose.
Dans le cadre de la présente invention, le composé chimioattractant est compris dans une matrice qui est composée d'un matériau biocompatible tel que défini dans la présente invention. Le matériau biocompatible de la matrice étant choisi spécifiquement en fonction du composé chimioattractant, du profil de libération souhaité ainsi que du contexte d'utilisation de la puce microfluidique.
Par « milieu extérieur» dans le cadre de la présente invention on fait référence aux tissus situés autour de la puce microfluidique lorsque celle-ci est implantée in vivo, plus précisément aux tissus situés directement au contact de la puce, jusqu'à 300 mm, de préférence jusqu'à 150 mm, de préférence encore jusqu'à 100 mm autour de la puce.
Par « résection d'une tumeur solide » on entend le retrait, l'ablation ou encore l'exérèse d'une tumeur solide par exemple par chirurgie.
Ainsi, la présente invention concerne une puce microfluidique pour attirer et détruire in vivo un élément biologique spécifique.
Les références numériques utilisées dans le cadre de la présente description détaillée de l'invention font référence aux figures de la présente demande ayant pour objectif d'illustrer l'invention sans pour autant s'y limiter.
Un premier objet de l'invention concerne une puce microfluidique pour attirer et détruire un élément biologique spécifique, ladite puce comprenant :
un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant le composé chimioattractant capable d'attirer un élément biologique au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1) au moins une électrode (4) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) ou au même endroit que le réseau de microcanaux (2), ladite électrode étant apte à générer un champ électrique de façon à détruire l'élément biologique lors de son passage vers le réservoir (1).
Plus précisément, la présente invention concerne une puce microfluidique destinée à être implantée in vivo pour attirer et détruire un élément biologique spécifique, de préférence une cellule eucaryote, ladite puce comprenant :
un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant le composé chimioattractant capable d'attirer un élément biologique in vivo au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1) au moins une électrode (4) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) ou au même endroit que le réseau de microcanaux (2), ladite électrode étant apte à générer un champ électrique de façon à détruire l'élément biologique in vivo lors de son passage vers le réservoir (1).
Selon un aspect préféré, la présente invention concerne une puce microfluidique destinée à être implantée in vivo pour attirer et détruire une cellule eucaryote, de préférence une cellule cancéreuse, ladite puce comprenant :
un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant le composé chimioattractant capable d'attirer ladite cellule in vivo
au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer ladite cellule présente dans ledit milieu en direction du réservoir (1) au moins une électrode (4) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) ou au même endroit que le réseau de microcanaux (2), ladite électrode (4) étant apte à générer un champ électrique de façon à détruire ladite cellule lors de son passage vers le réservoir (1) in vivo.
Selon un premier mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique destinée à être implantée in vivo pour attirer et détruire un élément biologique spécifique de préférence une cellule eucaryote, de préférence encore une cellule cancéreuse, ladite puce comprenant: un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant le composé chimioattractant capable d'attirer ladite cellule in vivo
au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer ladite cellule présente dans ledit milieu en direction du réservoir (1) au moins une électrode (4) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), ladite électrode (4) étant apte à générer un champ électrique de façon à détruire ladite cellule lors de son passage vers le réservoir (1) in vivo.
Selon un deuxième mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique destinée à être implantée in vivo pour attirer et détruire un élément biologique spécifique de préférence une cellule eucaryote, de préférence encore une cellule cancéreuse, ladite puce comprenant :
un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant le composé chimioattractant capable d'attirer ladite cellule in vivo
au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer ladite cellule présente dans ledit milieu en direction du réservoir (1) au moins une électrode (4) disposée au même endroit que le réseau de microcanaux (2), ladite électrode (4) étant apte à générer un champ électrique de façon à détruire ladite cellule lors de son passage vers le réservoir (1) in vivo.
De préférence dans ce mode de réalisation, l'électrode est disposée sur ou sous le réseau de microcanaux, de préférence encore l'électrode est disposée sur le réseau de microcanaux.
La matrice du réservoir (1) comprenant le composé chimioattractant est formée d'un matériau biocompatible.
Le composé chimioattractant compris dans la matrice du réservoir (1) permet d'attirer in vivo l'élément biologique spécifique au sein de la puce par chimiotactisme positif, l'élément biologique migrant en direction du réservoir (1) où la concentration en composé chimioattractant est la plus élevée. Le réseau de microcanaux (2) quant à lui, permet le passage par diffusion du composé chimioattractant depuis le réservoir (1) vers le milieu extérieur (3) de la puce ainsi que le passage de l'élément biologique spécifique depuis le milieu extérieur (3) de la puce vers l'intérieur de la puce, en direction du réservoir (1). L'électrode (4), est disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) de sorte que lorsque l'élément biologique spécifique entre dans la puce depuis le milieu extérieur (3) par le réseau de microcanaux (2) et en direction du réservoir (1), le champ électrique généré par ladite électrode (4) détruit in vivo l'élément biologique lors de son passage en direction du réservoir (1).
Dans le cadre de la présente invention, l'élément biologique est de préférence une cellule cancéreuse et en particulier une cellule cancéreuse provenant d'un cancer ou d'une tumeur solide. La migration de cette cellule à l'intérieur de la puce s'effectue par adhérence au support sur lequel l'électrode (4) est disposée, le champ électrique généré par l'électrode étant alors apte à détruire in vivo la cellule lors de son passage en direction du réservoir (1).
Le réseau de microcanaux (2) de la puce microfluidique selon la présente invention se situe de préférence sur la bordure externe de ladite puce c'est-à-dire au contact du milieu extérieur (3), assurant ainsi la communication entre ledit milieu et l'espace intérieur de la puce.
La puce selon la présente invention peut comprendre plusieurs réseaux de microcanaux (2), par exemple deux réseaux de microcanaux. Selon un aspect préféré, la puce microfluidique selon l'invention comprend une seule électrode (4). Selon un autre aspect, la puce microfluidique selon l'invention comprend plusieurs électrodes (4).
Selon certains modes de réalisation particuliers de la présente invention, l'électrode peut plus particulièrement être disposée:
de part et d'autre d'au moins un réseau de microcanaux,
à l'intérieur d'au moins un réseau de microcanaux,
entre au moins deux réseaux de microcanaux ou
de façon adjacente à au moins un réseau de microcanaux.
La puce microfluidique selon le premier objet de l'invention comprend une partie inférieure (5) et une partie supérieure (6), le réservoir (1) comprenant la matrice de composé chimioattractant, le réseau de microcanaux (2) et l'électrode (4) pouvant être compris indépendamment l'un de l'autre dans la partie supérieure (6) et / ou la partie inférieure (5) de ladite puce. La partie supérieure (6) de la puce microfluidique est apte à être disposée sur la partie inférieure (5) pour former un couvercle, lesdites parties étant fixées entre elles.
Selon un aspect particulier, la puce microfluidique selon la présente invention comprend une partie inférieure (5) comprenant une partie du réservoir (1), le réseau de microcanaux (2) et l'électrode (4), et une partie supérieure (6) comprenant une partie du réservoir (1) et apte à être disposée sur la partie inférieure (5), lesdites parties étant fixées entre elles.
Selon un autre aspect particulier, la puce microfluidique selon la présente invention comprend une partie inférieure (5) comprenant une partie du réservoir (1), l'électrode (4), et une partie supérieure (6) comprenant une partie du réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), ladite partie supérieure étant apte à être disposée sur la partie inférieure (5), lesdites parties étant fixées entre elles.
Concernant l'électrode (4), on entend par « comprise dans », le fait que l'électrode soit déposée et / ou intégrée sur la partie inférieure et/ou supérieure de la puce. De préférence, l'électrode est intégrée sur la partie inférieure de la puce.
Le réservoir (1) compris dans la partie inférieure (5) et dans la partie supérieure (6) correspond à un seul et même réservoir dont une partie se trouve dans la partie supérieure de la puce et l'autre partie se trouve dans la partie inférieure de la puce.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par partie supérieure (6) « apte à être disposée sur la partie inférieure (5) pour former un couvercle » le fait que la forme de la partie supérieure (6) est telle qu'elle s'adapte à celle de la partie inférieure (5) sur laquelle elle repose sans entraver la fonctionnalité de chaque élément composant la partie inférieure (5) et permet de former un couvercle fermant la puce.
De façon avantageuse et préférée, la partie supérieure (6) et inférieure (5) de la puce microfluidique sont arrondies de manière à ce que la puce soit implantée in vivo sans endommager les tissus.
De préférence la puce est de forme arrondie, avec par exemple la partie supérieure et inférieure ayant une forme de demi-ovale ou de demi-sphère de sorte que lorsque la partie supérieure est disposée sur la partie inférieure, la puce microfluidique est respectivement de forme ovale ou sphérique. La taille de la puce microfluidique selon le premier objet est adaptée à une implantation in vivo et est de l'ordre de quelques centimètres, de préférence entre 0,5 et 5 cm, de préférence encore entre 1 et 3 cm, de façon encore préférée de 1 cm.
Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle le réservoir (1), le réseau de microcanaux (2) et l'électrode (4) sont de forme annulaire et dans laquelle le réservoir est situé au centre de la puce.
Comme son nom l'indique, la forme annulaire correspond à une forme d'anneau. Cette configuration particulière permet notamment d'assurer une diffusion radiale du composé chimioattractant compris dans le réservoir (1) en direction du milieu extérieur (3) et une attraction homogène de l'élément biologique à partir dudit milieu en direction du réservoir (1), grâce à la situation centrale du réservoir (1) ainsi qu'à la forme annulaire du réseau de microcanaux (2). De même, la forme annulaire de l'électrode (4) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) permet avantageusement d'assurer une destruction efficace de chaque élément biologique qui pénètre la puce et provenant d'une quelconque direction.
La partie inférieure (5) et la partie supérieure (6) de la puce microfluidique peuvent être fixées l'une à l'autre par n'importe quel moyen physique ou chimique (12), adapté à une utilisation in vivo. A titre d'exemple de moyen de fixation physique ou chimique on peut faire référence respectivement à une vis ou à une colle adaptées à une utilisation in vivo de la puce ou encore à un élément proéminent venant au regard d'un élément creux présents dans la partie inférieure et supérieure pour les assembler.
De préférence dans le cadre de la présente invention, la partie supérieure (6) comprend une ou plusieurs ouvertures par lesquelles une ou plusieurs vis peuvent être insérées et la partie inférieure (5) comprend un ou plusieurs écrous aptes à recevoir ladite ou lesdites vis.
De façon encore préférée, la partie supérieure (6) de la puce microfluidique selon l'invention comprend une ouverture centrale par laquelle une vis est apte à être insérée et la partie inférieure (5) comprend un écrou central apte à recevoir ladite vis. Dans ce mode de réalisation préféré, le réservoir (1) annulaire est disposé autour de l'ouverture centrale présente sur la partie supérieure (6) et de l'écrou central présent sur la partie inférieure (5) de la puce. En particulier, la puce microfluidique comprend un ou plusieurs joints (7) aptes à rendre la puce étanche, lesdits joints (7) étant disposés entre la partie inférieure (5) et la partie supérieure (6) au-dessus du réseau de microcanaux (2).
On entend ici par « joint apte à rendre la puce étanche », la propriété du joint à ne pas laisser entrer au sein de ladite puce les fluides pouvant être présents dans le milieu extérieur (3) tel que le sang et à ne pas laisser sortir dans le milieu extérieur les liquides et matériaux présents à l'intérieur de ladite puce par un autre endroit que par le réseau de microcanaux (2). La position du ou desdits joints (7) au-dessus du réseau de microcanaux (2) permettant de ne pas entraver la diffusion du composé chimioattractant vers le milieu extérieur (3) ni le passage de la cellule spécifique présente dans ledit milieu au sein de la puce, en direction du réservoir (1). De façon avantageuse, les joints permettent de créer une zone d'appui entre la partie supérieure et inférieure de la puce.
En particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure (6) et / ou la partie inférieure (5) comprennent une cavité annulaire i) (8) apte à recevoir la matrice comprenant le composé chimioattractant, et une cavité annulaire ii) (10) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), apte à recevoir un liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser.
Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure (6) et / ou la partie inférieure (5) comprennent une cavité annulaire i) (8) apte à recevoir la matrice comprenant le composé chimioattractant par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (9) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité, et une cavité annulaire ii) (10) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), apte à recevoir un liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser, par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (11) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité.
Plus particulièrement encore, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure (6) et la partie inférieure (5) comprennent une cavité annulaire i) (8) apte à recevoir la matrice comprenant le composé chimioattractant par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (9) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité, et une cavité annulaire ii) (10) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2), apte à recevoir un liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser, par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (11) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité. De préférence le composé chimioattractant est ajouté à la matrice du réservoir (1) avant son ajout dans la cavité annulaire i) (8). Alternativement, le composé chimioattractant peut être ajouté dans la cavité annulaire i) (8) avant ou après l'ajout dans cette même cavité de la matrice formant le réservoir (1).
La matrice comprenant le composé chimioattractant et le liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser, sont ajoutés respectivement dans la cavité annulaire i) (8) et dans la cavité annulaire ii) par l'intermédiaire desdites ouvertures (9, 11), de préférence après que la partie supérieure (6) a été disposée sur la partie inférieure (5).
Le liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser est de préférence une solution aqueuse telle que du sérum physiologique ou une solution tampon physiologique telle qu'une solution aqueuse comprenant un tampon phosphate salin (PBS).
L'étanchéité de chacune des cavités après lesdits ajouts est assurée par l'obturation des ouvertures par l'intermédiaire de joints, par exemple en PDMS ou tout autre matériau adapté, lesdits joints étant situés à la sortie de ces ouvertures (9, 11) et communiquant avec le milieu extérieur (3).
De préférence, la cavité annulaire i) (8) est comprise dans la partie supérieure (6) et la partie inférieure (5) de la puce, la ou les ouvertures (9) débouchant dans cette cavité se trouvant dans la partie inférieure (5) de la puce, et la cavité annulaire ii) (10) ainsi que la ou les ouvertures (11) débouchant dans cette cavité sont comprises dans la partie supérieure (6) de la puce.
La puce selon la présente invention est en matériau biocompatible. En particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la partie supérieure (6) et la partie inférieure (5) sont composées d'un matériau biocompatible.
Plus précisément, la partie supérieure (6) et la partie inférieure (5) en tant que telles ainsi que les éléments qu'elles comprennent sont constitués d'un matériau biocompatible. Plus précisément encore, la partie supérieure (6), la partie inférieure (5), le réservoir (1) notamment la matrice comprenant le composé de chimioattractant, le réseau de microcanaux (2), l'électrode (4) et les joints (7) sont constitués d'un matériau biocompatible.
Par « matériau biocompatible » ou « biomatériau » on fait référence à un matériau ayant la capacité de ne pas interférer, de ne pas dégrader le milieu biologique dans lequel il est utilisé et ce, même en contact direct ou indirect, bref ou prolongé avec les tissus et fluides internes du corps d'un être humain ou d'un animal. A titre d'exemple de matériau biocompatible utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut faire référence de façon non exhaustive au verre, aux céramiques telles que l'alumine, la zircone, l'hydroxyapatite, aux métaux et alliages métalliques tels que le titane, la platine, aux polymères d'origine naturelle tels que le collagène, l'agarose, le chitosan, le carraghénane, le xanthane et l'alginate ou synthétique dégradables tels que les polyesters et polyanhydrides ou non dégradables tels que les polyuréthanes, la cellulose et ses dérivés, les polymères vinyliques. De préférence dans le cadre de la présente invention les polymères d'origine synthétiques sont le PEEK (polyétheréthercétone) ou le PDMS ( polyd iméthyl si loxa ne) .
De préférence, la partie supérieure (6), la partie inférieure (5) et le réseau de microcanaux (2) sont indépendamment l'un de l'autre, en polymères d'origine synthétique tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS) ou le polyétheréthercétone (PEEK). De préférence encore, la partie supérieure (6), la partie inférieure (5) sont en polyétheréthercétone (PEEK).
De préférence, le réseau de microcanaux (2) est en polyétheréthercétone (PEEK).
De préférence, l'électrode (4) est en titane et / ou en platine, de préférence encore en titane et platine.
De préférence, le réservoir (1) et en particulier la matrice comprenant le composé chimioattractant est en collagène et / ou en alginate, de préférence encore ledit réservoir, en particulier ladite matrice est en alginate.
De façon particulière et préférée, la partie supérieure (6), la partie inférieure (5) et le réseau de microcanaux (2) de la puce selon l'invention sont en polyétheréthercétone (PEEK), le réservoir (1) de composé chimioattractant est en alginate et l'électrode (4) est en titane et en platine.
Selon un aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle la matrice comprenant le composé chimioattractant est composée d'un matériau biocompatible, de préférence un polymère réticulé. De préférence, le polymère réticulé composant la matrice est un polymère d'origine naturelle et en particulier le collagène et / ou en alginate, de préférence en alginate.
La réticulation d'un polymère correspond à la formation d'un ou de plusieurs réseaux tridimensionnels à partir de polymères linéaires ou ramifiés, par voie chimique et / ou physique. L'Homme du métier sait comment induire une réticulation des polymères selon les polymères considérés, à titre d'exemple la réticulation peut être effectuée par chauffage et/ou par l'utilisation d'agent de réticulation. Un polymère dit « réticulé » est un polymère dont certaines de ses chaînes sont reliées entre elles par des liaisons fortes ou faibles.
A titre d'exemple, le collagène peut être réticulé par l'utilisation d'agents réticulants tels que l'ammoniac gazeux, des sucres oxydés ou des aldéhydes à température ambiante et l'alginate peut être réticulé dans un bain de chlorure de calcium à température ambiante.
De préférence encore, le matériau biocompatible composant la matrice comprenant le composé chimioattractant est en alginate réticulé dans un bain de chlorure de calcium de préférence à température ambiante.
La réticulation du matériau biocompatible composant la matrice comprenant le composé chimioattractant permet avantageusement une libération prolongée de ce composé. Par « libération prolongée » on fait référence à une cinétique de libération du composé chimioattractant contrôlée et continue sur une période de temps. De préférence dans le cadre de la présente invention, la libération du composé chimioattractant s'effectue entre 3 jours et 6 mois, de préférence entre 15 jours et 3 mois.
Selon un aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle le pourcentage massique composé chimioattractant / matrice du réservoir (1) est compris entre 0,1 et 20 %, de préférence entre 0,5 et 10 % et de préférence encore entre 0,5 et 5%.
L'Homme du métier saura déterminer la teneur du réservoir en composé chimioattractant en fonction du contexte de l'utilisation de la puce, de l'élément biologique spécifique d'intérêt, de la durée de libération du composé chimioattractant souhaitée et du biomatériau composant la matrice du réservoir.
Lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule eucaryote, de préférence une cellule cancéreuse, le composé chimioattractant compris dans le réservoir de la puce microfluidique et en particulier dans la matrice du réservoir, est de préférence choisi parmi les chimiokines telles que CXCL12, appelée également stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, les facteurs de croissance et les facteurs de croissance de transformation tels que TGF alpha ou beta (facteur de croissance transformant alpha ou beta), FGF (facteur de croissance du fibroblaste alpha), EGF (facteur de croissance épidermique alpha), la bétacelluline, l'amphiréguline, l'héréguline, HBEGF, PDGF (facteur de croissance plaquette-dérivé), VEGF (facteur de croissance de l'endothélium vasculaire). Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle le composé chimioattractant compris dans le réservoir (1) de la puce, est choisi parmi au moins un des composés suivants : CXCL12, CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, TGF alpha, TGF beta, FGF, PDGF, EGF, VEGF.
Selon un autre aspect, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule procaryote, de préférence une bactérie, le chimioattractant compris dans le réservoir (1) de la puce microfluidique et en particulier dans la matrice du réservoir (1), est de préférence choisi parmi les molécules glucidiques.
Le composé chimioattractant peut être utilisé seul ou en combinaison avec un ou plusieurs autres composés chimioattractants susmentionnés et / ou avec d'autres composés aptes à améliorer directement ou indirectement l'aptitude dudit composé chimioattractant à attirer un élément biologique spécifique, tel qu'une cellule eucaryote et en particulier une cellule cancéreuse comme par exemple des molécules glucidiques (glucose) et / ou lipidiques (acides gras) qui permettent d'apporter l'énergie nécessaire (énergie apportées sous forme d'ATP après dégradation du glucose ou des acides gras) à la survie de l'élément biologique, notamment d'une cellule eucaryote et en particulier d'une cellule cancéreuse. D'autres molécules comme l'oxygène peuvent être utilisées en association avec les chimioattractants. L'oxygène peut être transporté par l'hémoglobine ou par des hémoglobines synthétiques. L'oxygène est une molécule indispensable à la survie et prolifération des cellules et notamment des cellules cancéreuses. De préférence le composé chimioattractant est utilisé en combinaison avec une ou plusieurs molécules glucidiques (glucose) et / ou lipidiques (acides gras).
L'Homme du métier veillera à choisir le ou les composés chimioattractants en fonction de l'élément biologique spécifique ciblé.
A cet effet, lorsque l'élément biologique est une cellule eucaryote une analyse des récepteurs membranaires exprimés par la cellule ciblée devra être réalisée en amont afin de s'assurer de la spécificité du ou des composés chimioattractants choisis.
A titre d'exemple, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule cancéreuse exprimant le récepteur transmembranaire CXCR4 comme par exemple une cellule cancéreuse mammaire notamment humaine, le composé chimioattractant choisi est le stromal cell-derived factor 1 (SDF-1). De même, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule cancéreuse provenant du cancer du poumon, le composé chimioattractant choisi est le facteur de croissance épidermique (EGF) ou le facteur de croissance transformant alpha (TGF alpha).
Les microcanaux composant le réseau de microcanaux (2) de la puce microfluidique selon la présente invention peuvent être de forme parallélépipédique, cylindrique, pavimenteuse, tronconique ou un mélange de ses formes.
Chaque microcanal compris dans le réseau de microcanaux (2) de la puce microfluidique selon la présente invention peut présenter une hauteur comprise entre 1 et 500 pm, de préférence entre 50 pm et 150 pm, une largeur comprise entre 1 et 500 pm, de préférence entre 50 pm et 150 pm et une longueur comprise entre 30 pm et 1 mm, de préférence entre 30 pm et 500 pm.
En particulier dans le cadre de l'invention, chaque microcanal compris dans le réseau de microcanaux (2) présente une hauteur comprise entre 1 et 40 pm, une largeur comprise entre 1 et 40 pm, une longueur comprise entre 30 et 250 pm.
De préférence dans le cadre de la présente invention, chaque microcanal compris dans le réseau de microcanaux (2) présente une hauteur comprise entre 5 et 20 pm, une largeur comprise entre 5 et 20 pm, et une longueur comprise entre 100 et 200 pm, de préférence 200 pm.
Chaque microcanal compris dans un réseau de microcanaux peut présenter des dimensions qui lui sont propres indépendamment des dimensions des autres microcanaux compris dans ce réseau de microcanaux.
De même, lorsque la puce comprend plusieurs réseaux de microcanaux chaque microcanal d'un même réseau ainsi que chaque microcanal compris dans les différents réseaux de microcanaux peut présenter indépendamment l'un de l'autre, des dimensions et des formes qui lui sont propres.
De préférence, dans le cadre de la présente invention l'ensemble des microcanaux compris dans un réseau de microcanaux a la même forme et les mêmes dimensions.
Selon un aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle l'électrode (4) est une électrode interdigitée.
L'« électrode interdigitée » correspond à une électrode (4) dont chaque conducteur est multi denté. De préférence chaque conducteur présente un diamètre compris entre 200 et 400 miti, de préférence de 315 pm environ et chaque conducteur est espacé de l'autre par un entrefer compris entre 10 et 50 pm, de préférence de 15 pm environ.
De préférence encore, l'électrode (4) est une électrode sans fil, alimentée en énergie à distance par une antenne (13).
Par exemple l'alimentation en énergie à distance peut fonctionner par communication sans fil, par exemple à partir de la bande de fréquence ISM (industriel, scientifique et médical) utilisant une plage de fréquence comprise entre 13,553-13,567 MHz.
Plus particulièrement, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle l'électrode (4) est une électrode sans fil, ladite puce comprenant une antenne activable par une deuxième antenne. De préférence la deuxième antenne est destinée à être placée ex vivo lorsque la puce microfluidique est destinée à être implantée in vivo.
Par « antenne » on fait référence à un composant électronique constitué d'un enroulement d'un matériau conducteur formant une ou plusieurs spires. Lorsque cette antenne est traversée par un courant, elle produit un champ magnétique. Ce champ magnétique peut être libéré par l'antenne sous forme d'énergie électrique. Les antennes permettent ainsi la transmission de l'électricité à travers les tissus par inductance. De préférence, dans le cadre de la présente invention, l'antenne est une bobine d'inductance.
L'antenne (13) permet l'alimentation en énergie à distance de l'électrode (4).
L'antenne peut également permettre la transmission d'informations à distance.
La deuxième antenne destinée à être située ex vivo a une fonction d'émetteur et l'antenne comprise dans l'électrode sans fil une fonction de récepteur.
L'Homme du métier veillera à adapter la fréquence de résonance, la distance, et l'alignement entre l'émetteur et le récepteur en fonction de l'efficacité de la puissance sans fil à transmettre.
L'antenne comprise dans la puce ainsi que la deuxième antenne sont composées d'un matériau biocompatible, de préférence le même que celui dans lequel l'électrode (4) est composée, qui est de préférence le titane.
De façon encore plus particulière lorsque la puce est destinée à être implantée in vivo, le diamètre desdites antennes est suffisant pour la transmission de l'électricité à travers les tissus par inductance, de préférence le diamètre des antennes est du même ordre de grandeur que l'épaisseur des tissus à traverser, de préférence le diamètre desdites antennes est compris entre 5 mm et 100 mm, de préférence encore entre 10 et 80 mm. Selon un aspect préféré, la deuxième antenne est intégrée dans un patch destiné à une application topique sur la peau, ledit patch comprenant un support physiologiquement acceptable pour une application topique c'est-à-dire compatible avec la peau, les muqueuses et les phanères.
La deuxième antenne peut également se trouver dans un boîtier externe.
Selon un aspect particulier, la présente invention concerne une puce microfluidique dans laquelle le champ électrique généré par l'électrode (4) est apte à détruire par électroporation irréversible l'élément biologique.
De préférence, ledit champ électrique généré par l'électrode est un champ électrique pulsé, qui correspond à un traitement non-thermique sélectif de courte durée, généralement de quelques microsecondes à quelques millisecondes.
L'application d'un champ électrique pulsé sur une cellule spécifique engendre l'accumulation de charges sur la surface membranaire et l'augmentation du potentiel transmembranaire de la membrane cellulaire. L'attraction entre les charges de signes opposés accumulées de part et d'autre de la membrane cellulaire provoque une compression de cette dernière avec une force élastique tendant à s'opposer à cette électrocompression. Lorsque le champ électrique pulsé appliqué dépasse une valeur critique, la force électrocompressive devient supérieure à la force élastique, on assiste alors à l'apparition de pores au niveau de la membrane cellulaire. Lorsque l'intensité du champ électrique pulsé est grande et / ou que la durée du traitement est longue, on assiste à une intensification de la perméabilisation et une destruction irréversible de la membrane cellulaire.
Dans le contexte de la présente invention, le champ électrique pulsé généré par l'électrode sur l'élément biologique spécifique permet d'induire l'électroporation irréversible dudit élément biologique. Plus précisément, lorsque l'élément biologique est une cellule procaryote ou eucaryote, le champ électrique pulsé généré par l'électrode crée des pores, notamment des nanopores dans la membrane de la cellule, induisant une dérégulation de l'homéostasie cellulaire irréversible à l'origine de la mort de la cellule, par apoptose ou par nécrose.
Plus particulièrement, le champ électrique généré par l'électrode (4) est un champ électrique pulsé compris entre 1000 V/cm et 6500 V/cm de tension, de préférence entre 3000 V/cm et 5000 V/cm, 1 Hz de fréquence et une durée comprise entre 100 ps et 200 ps. De préférence, le champ électrique pulsé d'une durée comprise entre 100 ps et 200 ps est généré par l'électrode plusieurs fois par jour, de préférence au moins 3 fois, pendant une période adaptée au contexte d'utilisation de la puce.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la puce microfluidique comprend un moyen de mesurer le nombre d'éléments biologiques spécifiques entrés dans la puce microfluidique et / ou le nombre d'éléments biologiques détruits par l'électrode.
Parmi les moyens envisageables on peut notamment faire référence à un système de mesure par impédance électrique via l'électrode générant le champ électrique détruisant l'élément biologique ou bien par d'autres électrodes dédiées à ladite mesure et pouvant être comprises dans la partie supérieure et / ou la partie inférieure de la puce microfluidique.
L'impédance électrique correspond à la mesure de l'opposition du système au déplacement de charges électriques lorsqu'une différence de potentiel lui est appliquée. En d'autres termes, cela correspond au rapport de la tension appliquée au système et du courant électrique qui en résulte. Dans le contexte de la présente invention, cette mesure est utilisée pour quantifier les éléments biologiques spécifiques entrés dans la puce microfluidique, leur adhésion au support induisant une modification de l'impédance électrique ainsi que pour quantifier les éléments biologiques spécifiques détruites par l'électrode, qui se détachent de l'électrode et induisent en conséquence une modification de l'impédance électrique.
De préférence, le moyen de mesurer le nombre d'éléments biologiques entrés dans la puce microfluidique et / ou d'éléments biologiques détruits par l'électrode est un moyen de mesure par impédance électrique. Dans ce mode de réalisation particulier de l'invention, les informations peuvent être collectées et transmises par technologie de communication sans fil, par exemple à partir de la bande de fréquence ISM (industriel, scientifique et médical) utilisant une plage de fréquence comprise entre 13,553-13,567 MHz.
Un second objet de l'invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention pour attirer et détruire un élément biologique spécifique.
Plus particulièrement la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour attirer et détruire in vivo un élément biologique spécifique, ladite puce étant implantée in vivo.
Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour traiter ou prévenir la prolifération et la dissémination d'un élément biologique spécifique chez un sujet, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote dans laquelle la puce est implantée in vivo c ez un sujet.
Selon un aspect, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour traiter ou prévenir une infection causée par une cellule procaryote telle qu'une bactérie dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.
Selon un aspect préféré, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour traiter ou pour prévenir la prolifération et la dissémination d'une cellule eucaryote et en particulier d'une cellule cancéreuse, de préférence après la résection d'une tumeur solide chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.
Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation de la puce microfluidique selon le premier objet de l'invention ou une méthode pour prévenir les risques de récidive locale d'un cancer et / ou de développement d'un cancer métastatique chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet.
Dans le cadre de ces utilisations et méthodes, la puce microfluidique est implantée à une distance de 0,1 à 20 cm, de préférence de 1 à 10 cm, de préférence encore à une distance de 5 cm de la zone de résection d'une tumeur solide ou du foyer d'infection bactérienne chez un sujet. La puce microfluidique est de préférence implantée au niveau de la zone de résection dès le retrait de la tumeur solide, de préférence de suite après la résection de ladite tumeur.
Dans le cadre de ces utilisations et méthodes, le champ électrique pulsé est de préférence généré par l'électrode plusieurs fois par jour, de préférence au moins 3 fois par jour, de préférence encore 8 fois par jour, sur une période adaptée au contexte d'utilisation de la puce.
On fait référence ici par « contexte d'utilisation de la puce », au type d'élément biologique spécifique ciblé, c'est-à-dire au type d'infection bactérienne lorsque ledit élément est une bactérie, ou au type de cellule cancéreuse ciblée et en particulier au type de tumeur solide retirée et le stade auquel se trouve ladite tumeur lorsque ledit élément est une cellule cancéreuse. En fonction dudit contexte, le champ électrique pulsé peut être généré sur une période de 3 jours à 6 mois, de préférence de 2 semaines à 4 mois, sous forme de cure pouvant être renouvelée en cycle avec ou sans période de repos.
Par exemple, si la tumeur solide retirée était à un stade avancé, le champ électrique pulsé est généré par l'électrode au moins 3 fois par jour, de préférence 8 fois par jour, sur une période comprise entre 8 et 16 semaines. Par exemple, si la tumeur solide retirée était à un stade avancé, le champ électrique pulsé est généré par l'électrode au moins 8 fois par jour, sur une période comprise entre 8 et 16 semaines.
Dans le contexte des utilisations susmentionnées, la puce microfluidique peut être utilisée seule ou combinée à l'administration simultanée ou séquentielle d'autres composés médicamenteux tels que composés anti-cancéreux, notamment des composés chimiothérapeutiques et/ou d'hormonothérapie et/ou d'immunothérapie et/ou de thérapie ciblées et/ou radiothérapie lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule cancéreuse.
Enfin, la présente invention concerne également une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour attirer et détruire in vivo un élément biologique spécifique, ladite puce étant implantée in vivo, conformément aux conditions de mise en œuvre susmentionnées.
Plus précisément, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour traiter ou prévenir la prolifération et la dissémination d'un élément biologique spécifique chez un sujet, tel qu'une cellule procaryote ou eucaryote, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet conformément aux conditions de mise en œuvre susmentionnées.
Selon un aspect, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour traiter ou prévenir une infection causée par une cellule procaryote telle qu'une bactérie, dans laquelle la puce est implantée in iz/Vo chez un sujet.
Selon un aspect préféré, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour traiter ou prévenir la prolifération et la dissémination d'une cellule eucaryote et en particulier d'une cellule cancéreuse, de préférence après la résection d'une tumeur solide chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in iz/Vo chez un sujet conformément aux conditions de mise en œuvre susmentionnées. De façon encore préférée, la présente invention concerne une puce microfluidique selon le premier objet pour son utilisation pour prévenir les risques de récidive locale d'un cancer et / ou de développement d'un cancer métastatique chez un sujet, dans laquelle la puce est implantée in vivo chez un sujet conformément aux conditions de mise en œuvre susmentionnées.
Dans le cadre de ces utilisations et méthodes, lorsque l'élément biologique spécifique est une cellule eucaryote et en particulier une cellule cancéreuse, ladite cellule provient de préférence d'un cancer du sein, des poumons, de la prostate, de la vessie, des glandes salivaires, de la peau, de l'intestin, du côlon-rectum, de la thyroïde, du col de l'utérus, de l'endomètre et des ovaires, du cancer lèvre-bouche-larynx, du rein, du foie, du cerveau, des testicules, du pancréas, préférentiellement le cancer du sein. Ces exemples de tumeurs solides n'étant pas limitatifs.
L'invention sera davantage illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, ces exemples et ces figures ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de l'invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Fabrication de la puce microfluidique pour l'étude de concept in vitro
Pour réaliser la preuve de concept in vitro, une puce microfluidique contenant en son centre un réservoir dans lequel est placé un chimioattractant. a) Intégration des microélectrodes
Un substrat de verre (dimension 50x50 mm) est préparé dans une solution dite « piranha » (H SO :H 02, 3 : 1) afin de le nettoyer et d'augmenter ses propriétés hydrophiles, suivi d'une déshumidification pendant 15 minutes à 150°C sur plaque chauffante pour favoriser l'adhésion de la résine négative photosensible (AZ® nLOF 2020 de MicroChemicals).
La résine est déposée sur le substrat par enduction centrifuge (3000 tr/min, 30s) afin d'obtenir une épaisseur de 2 pm. Les solvants sont évaporés par un recuit d'une minute à 110°C sur plaque chauffante. Afin d'initier la réticulation dans certaines parties de la résine photosensible, l'échantillon est soumis à une exposition UV (70mJ/cm2). Cette activation modifiera les propriétés locales de la résine qui, après cuisson, sera soluble ou non dans un solvant. La résine étant négative, la partie exposée aux rayons ultraviolets deviendra solide alors que l'autre partie se dissoudra au cours du développement. Pour continuer la réaction de réticulation initiée par l'exposition UV, la plaque est ensuite soumise à un recuit post insolation (« post exposure bake (PEB) ») afin de fournir l'énergie nécessaire pour terminer le processus pendant 1 min à 110°C. Enfin, le développement va permettre de diluer les parties non réticulées de la résine dans un solvant à base de tetramethyl-ammonium- hydroxide (TMAH, AZ ® 726 MIF de MicroChemicals).
Un dépôt titane/platine (20/200 nm) est ensuite réalisé par pulvérisation cathodique suivi d'un décollage dit « lift-off » (acétone et NANO™ REMOVER PG de MicroChemicals) pour enlever les résidus de résine. A la fin de cette étape, les électrodes sont structurées sur la plaque de verre.
Pour assurer l'isolation électrique sur les parties ne devant pas être conductrices, une micro structuration de nitrure de silicium (Si3N ) est effectuée. Pour cela, le procédé de lithographie décrit précédemment est répété avec en plus une étape d'alignement. Le dépôt de 200 nm de Si3N4 est obtenu dans un bâti PECVD (dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma). Les zones non protégées par la résine sont ensuite gravées par un procédé de gravure ionique réactive (ICP RIE). A la fin du procédé, le dispositif est nettoyé avec du REMOVER PG de MicroChemicals et un plasma d'air. b) Fabrication du moule en résine de type époxy photosensible SU-8 de MicroChemicals
Une plaque de silicium (diamètre 76,2 mm) est préparée dans une solution « piranha » suivie d'une déshumidification pendant 15 à 150°C. La résine SU-8 est déposée sur la plaque de silicium par enduction centrifuge (3000 tr/min, 30s) afin d'obtenir l'épaisseur voulue (lOpm ou lOOpm en fonction du type utilisé SU-8 2010 ou SU-8 2100). L'évaporation des solvants est obtenue avec des rampes de chauffage et de refroidissement très légères afin de minimiser le stress mécanique dans la résine (5°C/min). L'échantillon est soumis à une exposition UV 365 nm de 125mJ/cm2 pour une épaisseur de 10pm, et de 250mJ/cm2 pour une épaisseur de 100 pm. La plaque est ensuite soumise à un recuit post insolation (« post exposure bake (PEB) ») (4 min à 95°C pour une épaisseur de lOpm et 30 min à 95°C pour une épaisseur de lOOpm). Enfin, le développement permet de diluer les parties non réticulées de la résine SU-8 dans un solvant (« SU-8 developer » composé principalement de PGMEA (propylene glycol monomethyl ether acetate)). A la fin de cette étape, les motifs permettant la structuration des microcanaux restent sur la plaque de silicium. c) Structuration des microcanaux et assemblage final de la puce Suite à la fabrication du moule, un polymère silicone polydiméthylsiloxane (PDMS) est préparé en le mélangeant avec son agent de durcissement (Sylgard™184 silicone elastomer kit de chez Dow, ratio 1 : 10). Les bulles formées pendant le mélange sont éliminées grâce à un dessiccateur et une pompe à vide. Une fois le PDMS dégazé, il est versé sur le moule SU- 8 posé dans une boîte de Pétri, puis placé dans une étuve à 80°C pendant au moins 2 heures afin de terminer le processus de réticulation. Après refroidissement, le PDMS est décollé puis découpé à l'aide d'une lame circulaire afin d'obtenir les formes cylindriques des dispositifs. Ceux-ci sont alors percés à l'aide d'un emporte-pièce pour former le puit central qui contiendra les chimioattractants. La dernière étape consiste à coller le PDMS sur un substrat de verre pour encapsuler les canaux. Cela est obtenu en activant la surface pour transformer la fonction Si-CH3 du PDMS en Si-OH grâce à un générateur de plasma 0 ou air. Au contact du verre (Si02), une liaison covalente Si-O-Si permanente sera créée. d) Instrumentation électrique
La puce est équipée d'électrodes interdigitées (distance : 15 pm) imposant un champ suffisamment intense (2000 à 5000 V/cm) pour provoquer l'électroporation irréversible des cellules spécifiques et ainsi induire l'apoptose ou la nécrose des cellules ayant pénétré le système. Un signal carré (tension/fréquence/temps haut : 3 à 7,5 V/l Hz/100 ps) est délivré par un générateur de fonction (TG2511A TTi) et visualisé par un oscilloscope (TBS1032B Tektronix) pendant l'application sur la puce. La seconde voie de l'oscilloscope est connectée à une résistance de shunt haute précision (0.1 W, LVR01R1000FE70 de chez Vishay) permettant ainsi d'obtenir une image du courant électrique traversant les électrode (4)s. Afin de pouvoir automatiser l'expérience, les instruments sont reliés par un câble USB à un ordinateur (Raspberry Pi 3 Modèle B+, système d'exploitation : Linux Raspbian 9 (Stretch)). La communication « Virtual instrument software architecture » (VISA) est assurée par la bibliothèque « open source » PyVISA et un script Python est exécuté régulièrement par le programme crontab du système d'exploitation. e) Fabrication de la matrice de libération
Une solution aqueuse d'alginate à 3% (w/v) a été déposée dans un moule poreux ayant la forme du réservoir de la puce. Le moule est immergé dans un bain de réticulation de chlorure de calcium durant 24h. Après 3 lavages à l'eau miliQ, la matrice est congelée à - 20°C puis lyophilisée.
Par la suite, la matrice est déposée délicatement dans la puce. Exemple 2 : Etude du profil de libération de cytokine
(A) Afin de le protéger de la protéolyse enzymatique in vitro et in vivo, le composé chimioattractant SDF-1 est usuellement complexé à de la BSA (Bovine Sérum Albumin) à raison de 1.51 molécules de BSA pour 10 molécules de SDF-1. La BSA est une grosse protéine de sérum de veau de 6 kDA alors que le SDF-1 est une petite cytokine de 8kDA. La libération de SDF-1 à partir de la matrice se faisant par diffusion, c'est la molécule de plus gros rayon hydrodynamique qui impactera le plus la diffusion du complexe : soit la BSA. C'est pourquoi, dans un premier temps, ce modèle a été utilisé pour étudier le profil de libération du composé SDF-1 à partir d'une puce microfluidique fabriquée selon l'exemple 1. Afin de maximiser la détection de concentrations nanométriques, nous avons choisi de détecter la BSA couplée à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) couplée à un détecteur de fluorescence.
Préparation des échantillons :
Dépôts de 3.2 pg de BSA-FITC sur la matrice lyophilisée d'alginate contenue dans la puce
Incubation 30 min à 37°C Début de l'étude :
Immersion de la puce dans 1.5 ml de PBS dans une boîte hermétique
Incubation sous agitation à 37°C durant le temps de l'étude, soit 50 jours.
Prélèvement à différents temps de 750 pl de solution de libération qui seront analysés en HPLC (eau/ acétonitrile).
La colonne utilisée est une colonne prévue pour détecter des protéines telles que la BSA- FITC.
750 pl de nouveau PBS est rajouté dans le milieu de libération pour compenser le précèdent prélèvement.
Résultats :
Cette étude a permis de mettre en évidence une libération prolongée de la BSA-FITC à partir d'une matrice d'alginate comprise dans une puce microfluidique selon l'invention durant 50 jours avec 99% de libération atteinte après 50 jours (Figure 21). (B) Dans un deuxième temps, la libération de SDF-1 à partir d'une matrice d'alginate a été quantifiée sur une période de 50 jours à l'aide d'une méthode de détection par ELISA.
Préparation des échantillons :
- Complexation de SDF-1 à la BSA (0.1%)
- Dépôts de 1 pg de SDF-1 sur la matrice lyophilisée d'alginate
- Incubation 30 min à 37°C
Début de l'étude :
- Immersion de la matrice dans 1.5 ml de PBS dans une boîte hermétique
- Incubation sous agitation à 37°C durant le temps de l'étude, soit 50 jours.
- Prélèvement à différents temps de 750 pl d'échantillons de solution de libération qui seront analysés par un kit ELISA spécifique de la détection de SDF-1, suivant les indications du fournisseur.
- 750 pl de nouveau PBS est rajouté dans le milieu de libération pour compenser le précèdent prélèvement.
Résultats :
Cette étude a permis de mettre en évidence une libération prolongée de SDF-1 à partir de la matrice d'alginate seule durant 23 jours avec 40 % de libération atteinte après 23 jours (Figure 22).
Exemple 3 : Mise en œuvre de la puce microfluidique in vitro
A) Capacité d'attraction des cellules à l'intérieur de la puce
La puce microfluidique a été mise en œuvre in vitro pour tester sa capacité à attirer les cellules du cancer du sein MDA-MB-231 qui sont des cellules épithéliales de tumeurs mammaires. Le composé SDF-1 « stromal cell-derived factor » correspond au composé chimioattractant apte à attirer les cellules MDA-MB-231.
1) Les cellules MDA-MB-231 stablement transfectées avec la « green fluorescent protein » (GFP) sont trypsinisées à J0. Puis 20 000 cellules sont ensemencées dans une boîte de pétri de 35 mm contenant en son centre la puce microfluidique. Les cellules sont cultivées dans le milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM F12) + Glutamax + 1% sérum de veaux fœtal (SVF) + 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline). Le réservoir central de la puce microfluidique est chargé soit avec 33 pl de DMEM F12 + Glutamax + 1% SVF+ 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline) (Figure 8) soit avec 33 pl de DMEM F12 + Glutamax + 10 pl de SVF pur + 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline). (Figure 9). Après 7 jours de culture dans un incubateur C02 5% et une humidité de 95 % on réalise des photographies à partir d'un microscope inversé à fluorescence.
On constate que les cellules se déplacent en direction du et en particulier dans le réservoir dans les deux conditions testées, avec une plus grande quantité de cellules en présence de 10 pl de SVF pur au sein du réservoir.
2) Les cellules MDA-MB-231 stablement transfectées avec la « green fluorescent protein » (GFP) sont trypsinisées à J0. Puis 100 000 cellules sont ensemencées dans une boite de pétri de diamètre 50 mm, la puce microfluidique étant placée au centre de cette boîte de pétri. Les cellules sont cultivées dans le milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM F12) + Glutamax + 1% sérum de veaux fœtal (SVF) + 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline).
Le réservoir central de la puce microfluidique est chargé soit avec 50 pl de DMEM F12 + Glutamax + 1% SVF+ 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline) (Figures 10 et 11) soit avec 50 pl de DMEM F12 + Glutamax + SVF 10 pl + 1% antibiotique (streptomycine, pénicilline) (Figures 12 et 13) soit avec 50 pl de DMEM F12 + Glutamax + 1 pg SDF-1 + 1% antibiotique (streptomycine, pénicilline) (Figures 14 et 15).
Après 8 jours de culture dans un incubateur C02 5% et humidité 95% on réalise des photographies à partir d'un microscope inversé à fluorescence.
On constate que les cellules se déplacent en direction du et en particulier dans le réservoir dans toutes les conditions testées, notamment en présence d'un gradient de sérum de veau fœtal (Figures 12 et 13) et encore plus significativement en présence d'un gradient de composé SDF-1 (Figures 14 et 15).
B) Capacité de destruction des cellules par une électrode interdigitée
1) La capacité d'une électrode interdigitée générant un champ électrique à détruire les cellules MDA-MB-231 a été testée. Pour ce faire, les cellules MDA-MB-231 stablement transfectées avec la « green fluorescent protein » (GFP) sont trypsinisées à J0. Puis 60 000 cellules sont ensemencées dans un puit en PDMS fixé sur une lame de verre à l'intérieur duquel est disposée une électrode interdigitée circulaire. Le milieu de culture utilisé est : DMEM F12 + Glutamax + SVF 10% + 1% antibiotique (streptomycine, pénicilline).
Après 48h de culture dans un incubateur C02 5% et humidité 95% on obtient un tapis cellulaire qui recouvre l'ensemble de la lame de verre contenant l'électrode interdigitée (Figure 16), puis on réalise une électroporation des cellules par application d'un champ électrique de 5v 100ps 1 hertz sur la lame, après 3 heures on réalise des photographies à partir d'un microscope inversé à fluorescence (Figure 17).
On constate qu'environ 70% des cellules sont détruites après 3 heures suivant
l'électroporation.
2) La capacité d'une puce microfluidique selon l'invention à attirer et à détruire les cellules MDA-MB-231 par électroporation a été testée.
Pour ce faire, les cellules MDA-MB-231 stablement transfectées avec la « green fluorescent protein » (GFP) sont trypsinisées à J0. Puis 50 000 cellules sont ensemencées dans une boite de pétri de diamètre 50 mm, la puce microfluidique comprenant une électrode interdigitée et deux réseaux de microcanaux étant placée au centre de cette boîte de pétri. Les cellules sont cultivées dans le milieu Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM F12) + Glutamax + 1% sérum de veaux fœtal (SVF) + 1% d'antibiotique (streptomycine, pénicilline).
Trois conditions sont testées :
- Le réservoir central de la puce est chargé avec 50 pl DMEM F12 + Glutamax + SVF 1% (sérum de veau fœtal) + 1% antibiotique (streptomycine, pénicilline) en l'absence de gradient et sans champ électrique pulsé (Figure 18)
- Le réservoir central de la puce est chargé avec 50 pl de DMEM F12 + Glutamax + SDF-1 1 pg + 1% antibiotique (streptomycine, pénicilline) sans champ électrique pulsé (Figure 19)
- Le réservoir central de la puce est chargé avec 50 mI de DMEM F12 + Glutamax + SDF-1 1 pg + 1% antibiotique (streptomycine, pénicilline) avec champ électrique pulsé (Figure 20)
Après 3 jours de culture des électroporations sont appliquées en condition C toutes les 3 heures (5v 100 ms 1 hertz) durant 7 jours de culture dans un incubateur C02 5% et humidité 95%. On réalise des photographies à partir d'un microscope inversé à fluorescence.
Cette étude a permis de mettre en évidence que les cellules MDA-MB-231 sont attirées vers le réservoir central et restent localisées dans l'espace situé entre les deux réseaux de microcanaux en présence du gradient de chimioattractant SDF-1 et en absence de champ électrique.
En présence du chimioattractant SDF-1 et du champ électrique pulsé appliqué toutes les 3 heures (5v 100ps lhertz), les cellules franchissent le premier réseau de microcanaux puis sont électroporées. Dans tous les cas, les cellules ne sont pas capables de franchir les deux réseaux de microcanaux.
Ces différentes expériences ont permis de mettre en évidence la capacité de la puce microfluidique à attirer et à détruire un élément biologique, et en particulier que ladite puce est capable d'attirer des cellules tumorales du cancer du sein (MDA-MB-231) soit à partir d'un gradient de sérum de veaux fœtal soit de façon plus significative à partir d'un gradient de chimioattractant SDF-1 et qu'il est possible de détruire ces mêmes cellules tumorales à partir d'un champ électrique pulsé.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Puce microfluidique pour attirer et détruire un élément biologique spécifique, ladite puce comprenant :
- un réservoir (1) constitué d'une matrice comprenant un composé chimioattractant capable d'attirer l'élément biologique
- au moins un réseau de microcanaux (2) disposé entre le réservoir (1) et le milieu extérieur (3) de la puce et permettant de laisser passer le composé chimioattractant vers ledit milieu et de laisser passer l'élément biologique présent dans ledit milieu en direction du réservoir (1)
- au moins une électrode (4) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux
(2) ou au même endroit que le réseau de microcanaux (2), ladite électrode étant apte à générer un champ électrique de façon à détruire l'élément biologique lors de son passage vers le réservoir (1).
[Revendication 2] Puce microfluidique selon la revendication 1, comprenant une partie inférieure (5) comprenant une partie du réservoir (1), le réseau de microcanaux (2) et l'électrode (4), et une partie supérieure (6) comprenant une partie du réservoir (1) et apte à être disposée sur la partie inférieure (5), lesdites parties étant fixées entre elles.
[Revendication 3] Puce microfluidique selon l'une des revendications 1 à 2, dans laquelle le réservoir (1), le réseau de microcanaux (2) et l'électrode (4) sont de forme annulaire et dans laquelle le réservoir est situé au centre de la puce.
[Revendication 4] Puce microfluidique selon l'une des revendications 2 à 3, dans laquelle la partie supérieure (6) et / ou la partie inférieure (5) comprennent une cavité annulaire i) (8) apte à recevoir la matrice comprenant le composé chimioattractant par
l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (9) communiquant avec le milieu extérieur
(3) et débouchant dans ladite cavité, et une cavité annulaire ii) (10) disposée entre le réservoir (1) et le réseau de microcanaux (2) apte à recevoir un liquide dans lequel le composé chimioattractant est apte à diffuser, par l'intermédiaire d'une ou plusieurs ouvertures (11) communiquant avec le milieu extérieur (3) et débouchant dans ladite cavité. [Revendication 5] Puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans laquelle la partie supérieure (6) et la partie inférieure
(5) sont composées d'un matériau biocompatible.
[Revendication 6] Puce microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la matrice comprenant le composé chimioattractant est composée d'un matériau biocompatible, de préférence un polymère réticulé.
[Revendication 7] Puce microfluidique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le pourcentage massique composé chimioattractant / matrice du réservoir (1) est compris entre 0,1 et 20 %, de préférence entre 0,5 et 10 % et de préférence encore entre 0,5 et 5%.
[Revendication 8] Puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications
précédentes, dans laquelle le composé chimioattractant compris dans le réservoir (1) est choisi parmi au moins un des composés suivants : CXCL12, CCL5, CCL2, CCL3, CCL7, CCL19, CCL21, CCL22, CCL25, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CX3CL1, TGF alpha, TGF beta, FGF, PDGF, EGF, VEGF.
[Revendication 9] Puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications
précédentes, dans laquelle chaque microcanal compris dans le réseau de microcanaux (2) présente une hauteur comprise entre 1 et 40 pm, une largeur comprise entre 1 et 40 pm, une longueur comprise entre 30 et 250 pm.
[Revendication 10] Puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications
précédentes, dans laquelle l'électrode (4) est une électrode interdigitée.
[Revendication 11] Puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications
précédentes, dans laquelle l'électrode (4) est une électrode sans fil ladite puce comprenant une antenne activable par une deuxième antenne. [Revendication 12] Puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le champ électrique généré par l'électrode (4) est apte à détruire par électroporation irréversible l'élément biologique. [Revendication 13] Puce microfluidique selon l'une quelconque des revendications
précédentes, dans laquelle le champ électrique généré par l'électrode (4) est un champ électrique pulsé compris entre 1000 V/cm et 6500 V/cm de tension, de préférence entre 3000 V/cm et 5000 V/cm, 1 Hz de fréquence et une durée comprise entre 100 ps et 200 MS-
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN115568938A (zh) * 2022-09-28 2023-01-06 上海交通大学 一种分形结构微电极及其制备方法和导管

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090043346A1 (en) * 2000-02-17 2009-02-12 Yoram Palti Treating parasites with electric fields
US20120322685A1 (en) * 2010-01-25 2012-12-20 Condeelis John S Device for collecting and analyzing migratory tumor cells
US20180111124A1 (en) 2016-10-26 2018-04-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. High-throughput selective capture of biological cells by dielectrophoresis at a bipolar electrode array
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Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090043346A1 (en) * 2000-02-17 2009-02-12 Yoram Palti Treating parasites with electric fields
US20120322685A1 (en) * 2010-01-25 2012-12-20 Condeelis John S Device for collecting and analyzing migratory tumor cells
US20180111124A1 (en) 2016-10-26 2018-04-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. High-throughput selective capture of biological cells by dielectrophoresis at a bipolar electrode array
WO2018089989A1 (fr) 2016-11-14 2018-05-17 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Destruction sélective de cellules par résonance électromagnétique

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SANG KYUNG KIM ET AL: "Continuous Low-Voltage dc Electroporation on a Microfluidic Chip with Polyelectrolytic Salt Bridges", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 79, no. 20, 18 September 2007 (2007-09-18), pages 7761 - 7766, XP055112911, ISSN: 0003-2700, DOI: 10.1021/ac071197h *

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