WO2020188133A1 - Método de diagnóstico de enfermedad celiaca basado en el nivel de expresión del gen ube2l3 - Google Patents

Método de diagnóstico de enfermedad celiaca basado en el nivel de expresión del gen ube2l3 Download PDF

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WO2020188133A1
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ube2l3
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ube2l3 gene
celiac disease
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José Ramón BILBAO CATALA
Nora FERNÁNDEZ JIMÉNEZ
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Universidad Del País Vasco / Euskal Herriko Unibertsitatea
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to methods and kits for the diagnosis of celiac disease. Therefore, the present invention is encompassed within the technical field of medicine, specifically in the technical field of clinical diagnosis and more specifically in the diagnosis of patients suffering from celiac disease.
  • Celiac disease or celiac disease is an autoimmune disease that appears in genetically predisposed people and is characterized by a chronic inflammation of the proximal part of the small intestine, caused by exposure to gliadin.
  • Gliadin is one of the main components of gluten, so the only treatment today for celiac disease is the strict absence of gluten in the diet.
  • Symptoms of celiac disease include chronic diarrhea, delayed growth and / or development of children, fatigue, skin rashes, weight loss, character changes (irritability, apathy, introversion, sadness), vomiting, bloating, loss of appetite, fatigue, etc.
  • the prevalence of celiac disease in Europeans and their descendants is 1%, being more frequent in women with a 2: 1 ratio.
  • Celiac disease usually manifests itself during childhood, although it has been shown that it can also manifest itself throughout adulthood.
  • the invention refers to an in vitro method for the diagnosis of celiac disease in a subject suspected of suffering from celiac disease, which comprises quantifying in a sample of said subject the content of:
  • a relative content of the mRNA encoding isoform 2 of the UBE2L3 gene with respect to the total mRNA of the UBE2L3 gene elevated with respect to a reference value is indicative that the subject suffers from celiac disease.
  • the invention refers to a kit for the implementation of a method as defined in claims 1 to 10 comprising:
  • components (i) and (ii) constitute at least 1% of the total of the probes present in the kit.
  • the invention relates to a method for the diagnosis and treatment of a subject comprising:
  • step (ii) administering to the subject diagnosed with celiac disease in step (i) an appropriate treatment for said disease.
  • FIG. 1 Genomic location of the isoforms of the UBE2L3 gene on chromosome 22 (arrow indicating variant 2; numbers 4 and 5 indicating the fourth and fifth exon, respectively).
  • the diagram shows the SNP prioritized by mendelian randomization (AM) (rs5754217) and the probes of the lllumina expression microarray performed in CD patients on a gluten-free diet (ILMN_1796830 and ILMN_1677877).
  • AM mendelian randomization
  • Figure 2 A. Expression in intensity units reported by the two lllumina probes located in the UBE2L3 gene in controls (circles) and celiac patients on a gluten-free diet (squares). B: Relative expression between variant 2 and the rest of the isoforms of the UBE2L3 gene calculated from the intensity units reported by the lllumina probes independently.
  • Figure 3 ROC curve with the relative expression score of UBE2L3 as a binary classifier (CE in a gluten-free diet / control).
  • UBE2L3 places it in a privileged position with regard to the development of a peripheral blood diagnostic test that could eliminate gluten provocations in the diagnosis of CD in the absence of gluten from the diet.
  • the invention is related to an in vitro method for the diagnosis of celiac disease in a subject suspected of suffering from celiac disease that comprises quantifying in a sample of said subject the content of:
  • diagnosis refers to both the process of trying to determine and / or identify a possible disease in a subject, that is, the diagnostic procedure, and the opinion reached by this process, that is, the opinion diagnostic. As such, it can also be considered as an attempt to classify an individual's condition into separate and distinct categories that allow medical decisions about treatment and prognosis to be made.
  • Such a diagnosis may not be correct for 100% of the subject to be diagnosed, although it is preferable that it is.
  • the term requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as having a disease or having a predisposition to it.
  • the person skilled in the art can determine if a result is statistically significant using different well-known statistical evaluation tools, for example, by determining the confidence intervals, determining the p-value, the Student test, the Mann-Whitney, etc. (see Dowdy and Wearden, 1983).
  • Preferred confidence intervals are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 95% or at least 99%.
  • the p values are preferably 0.05, 0.025, 0.001 or less.
  • diagnosis method means that the method may consist essentially of the steps mentioned above or may include additional steps.
  • in vitro diagnosis refers to a diagnostic method that does not apply to a human or animal body.
  • celiac disease or “celiac disease” in the present invention refers to an autoimmune pathology characterized by chronic inflammation of the proximal part of the small intestine or jejunum, caused by exposure to gliadin, which is one of the components of the gluten. Celiac disease involves a permanent intolerance to gluten, the characteristic of which is an immune-based inflammatory reaction in the intestinal mucosa that hinders the absorption of nutrients.
  • Gluten is a protein present in cereals such as wheat (Triticum spp), barley (Hordeum vulgare), rye (Secale cereale), triticale (Triticosecale, cereal from the cross between wheat and rye), kamut (Triticum turgidum), spelled ( Triticum spelta) and possibly oats (Avena spp), but absent in rice (Oriza sativa) and corn (Zea mays).
  • Gluten is made up of gliadin and glutenin, with gliadin being a prolamine-type glycoprotein.
  • the ingestion of gliadin causes the enzyme tissue transglutaminase to modify said protein and the immune system originates a cross-reaction against the small intestine, causing an inflammatory reaction that causes atrophy of the villi that line the intestine and interference with nutrient absorption.
  • celiac disease is determined by both environmental (diet) and genetic factors. Thus, celiac disease also implies a genetic predisposition since most celiacs present the human leukocyte antigen (HLA) of the type DQ2 (HLA-DQ2) and DQ8 (HLA-DQ8) (May-Ling J. et al. 2010 Immunogenetics 62: 641-651).
  • HLA human leukocyte antigen
  • subject refers to all animals classified as mammals and includes, but is not restricted to, domestic and farm animals, primates, and humans, eg, humans, non-primates. humans, cows, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats or rodents. Preferably, the subject is a male or female human of any age or race.
  • “comprising” is intended to include, but is not limited to, what follows the term “comprising”. Therefore, the use of the term “comprising” indicates that the above elements are required or required, but that other elements are optional and there is a possibility that they are present or not.
  • “Quantifying”, in relation to a nucleic acid sequence refers to the use of any method for studying the amount of a particular nucleic acid sequence, including, without limitation, methods for determining the number of copies of a nucleic acid sequence. or to determine the change in the number of copies of the nucleic acid sequence over time, or to determine the relative concentration of a sequence when compared to another sequence.
  • any conventional method can be used within the framework of the invention to detect and quantify the levels of mRNA or its corresponding cDNA.
  • the levels of mRNA encoded by said genes can be quantified using conventional methods, for example, methods that comprise the amplification of the mRNA and the quantification of the product of the amplification of said mRNA, such as electrophoresis and staining, or alternatively, by means of Norther blot and use of appropriate probes and use of specific probes of the mRNA of the genes of interest or of their corresponding cDNA, mapping with S1 nuclease, RT-PCR, hybridization, microarrays, etc.
  • the levels of the cDNA corresponding to said mRNA can also be quantified using conventional techniques; in this case, the method of the invention includes a step of synthesis of the corresponding cDNA by reverse transcription (RT) of the corresponding mRNA followed by amplification and quantification of the product of the amplification of said cDNA.
  • RT reverse transcription
  • Conventional methods of quantifying expression levels can be found, for example, in Sambrook et al., 2001 "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol.1-3.
  • the quantification of the expression product of the genes is carried out by determining the level of mRNA derived from their transcription, where the analysis of the level of mRNA can be carried out, by way of illustration and without limiting the scope of the invention.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-LCR reverse transcription in combination with ligase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription in combination with polymerase chain reaction
  • qRT-PCR quantitative polymerase chain reaction
  • DNA microarrays made with oligonucleotides deposited by any mechanism DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or any other mechanism; in situ hybridization using specific probes labeled with any labeling method; using electrophoresis gels; by membrane blotting and hybridization with a specific probe; by NMR or any other diagnostic imaging technique using paramagnetic nanoparticles or any other type of detectable
  • the method of the invention may include performing an extraction step in order to obtain total RNA, which can be performed by conventional techniques (Chomczynski et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532).
  • sample refers to a sample, obtained from the subject under study (unless otherwise indicated), such as a blood or serum sample obtained from said subject.
  • said blood sample comprises peripheral blood.
  • peripheral blood relates to the volume of circulating blood distant from the heart, that is, the blood that circulates through the body of a subject.
  • the blood sample can be obtained by conventional methods known to those skilled in the art.
  • serum refers to the component of the blood resulting after coagulation of the blood and removal of the resulting clot. Methods for obtaining blood samples from a subject are widely covered in the state of the art, as well as methods for obtaining serum from blood samples.
  • RNA messenger RNA
  • mRNA messenger RNA
  • cDNA refers to a nucleotide sequence, complementary to an mRNA sequence.
  • isoform or “variant” refers to all types of RNA transcribed from a given gene that, when collectively processed by alternative splicing or alternative processing, encode isoforms of plural proteins.
  • alternative splicing or “alternative processing” refers to all types of RNA processing that lead to the expression of plural protein isoforms of a single gene.
  • Some genes, usually eukaryotic genes, are first transcribed as long mRNA precursors that are then shortened by a series of processing steps to produce the mature mRNA molecule.
  • Alternative pre-mRNA splicing is a post-transcriptional process that allows the production of different mRNAs from a single gene with the potential to expand protein structure and diversity.
  • Alternative splicing can also introduce or remove regulatory elements to affect translation, localization, or stability of the mRNA. More than 70% of human genes can undergo alternative splicing with many genes capable of producing dozens and even hundreds of different isoforms. One of these steps is RNA splicing, in which intron sequences are removed from the mRNA precursor.
  • a cell can join the primary transcript in different ways, creating different "splice variants" and thus creating different polypeptide chains from the same gene or the same mRNA molecule.
  • Splice variants can include, for example, exon insertions, exon extensions, exon truncations, exon deletions, alternatives in the 5 'untranslated region and alternatives in the 3' untranslated region. Splicing variants are unpredictable, as the cell can join the primary transcript in different ways, creating different polypeptide chains from the same gene or the same mRNA molecule.
  • UBE2L3 refers to the UBE2L3 gene, which is located on chromosome 22 and codes for the ubiquitin conjugating enzyme E3 L3 (Ubiquitin Conjugating Enzyme E2 L3).
  • the UBE2L3 gene is also known as UBCH7, L-UBC, UbcM4, E2-F1 or UBCE7.
  • Alternative processing of the UBE2L3 gene gives rise to 5 mRNA isoforms or variants. Said isoforms can be defined by their corresponding accession number in the NCBI and by the number and specific sequences of exons, as indicated in the following table:
  • isoform 2 of the UBE2L3 gene refers to the sequence identified with the NCBI accession number NR_028436 of February 24, 2019.
  • Said sequence corresponds to an isoform non-coding of the gene and comprises exons 1, 2, 3, 5 and 4 defined respectively by the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEO ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, as specified in table 1.
  • the total mRNA refers to the sum of all the isoforms of the UBE2L3 gene, that is, to the isoforms defined by the NCBI accession numbers NM_003347.3, NR_028436, NM_001256356.1, NM_001256355.1 and NR_046082.1 of 24 February 2019.
  • mRNA levels can be measured and quantified by various methods well known to those of skill in the art, including the use of commercially available kits and reagents.
  • the quantification of the expression levels of the UBE2L3 gene can be carried out from the RNA resulting from the transcription of said genes (mRNA) or, alternatively, from the complementary DNA (cDNA) of said genes. Therefore, in a particular embodiment, the quantification of the expression levels of the UBE2L3 gene comprises the quantification of the messenger RNAs (mRNA) of said genes, or a fragment of said mRNA, the complementary DNA (cDNA) of said genes, or a fragment of said cDNA, or mixtures thereof.
  • mRNA messenger RNAs
  • cDNA complementary DNA
  • the determination of the expression levels of the UBE2L3 gene needs to be compared with the reference values.
  • comparison refers to, but is not limited to, the comparison of the amount of the expression product of the UBE2L3 gene or of any of its isoforms with a reference value.
  • the comparison described in the method of the present invention can be performed manually or computer-aided.
  • the reference value corresponds to the mean value of the expression levels of the UBE2L3 gene or of any of its isoforms, measured in a sample of non-celiac subjects. Once this mean value has been established, the level of this marker expressed in samples from celiac subjects can be compared with this mean value, and thus be assigned to the "low” or "high” expression level. Due to the variability between subjects (for example, aspects related to age, race, etc.) it is very difficult (if not practically impossible) to establish absolute reference values for the expression of the UBE2L3 gene or of any of its isoforms.
  • the reference values for "high” or “reduced” expression of the expression of the UBE2L3 gene or of any of its isoforms are determined by calculating the percentiles by conventional means that involves testing a group of isolated samples from normal subjects (ie, people without celiac disease) for expression levels of UBE2L3 or any of its isoforms.
  • the "reduced" levels of UBE2L3 or any of its isoforms can then preferably be assigned to samples where the expression levels of UBE2L3 or any of its isoforms are equal to or less than the 50th percentile in the normal population, including, for example, expression levels equal to or less than the 60th percentile in the normal population, equal to or less than the 70th percentile in the normal population, equal to or less than the 80th percentile in the normal population, equal to or less than the 90th percentile in the normal population, and equal to or less than the 95th percentile in the normal population.
  • the "elevated" levels of UBE2L3 or any of its isoforms can then be assigned, preferably, to samples where the expression levels of UBE2L3 or any of its isoforms are equal to or exceed the 50th percentile in the normal population, including, for For example, expression levels equal to or in excess of the 60th percentile in the normal population, equal to or in excess of the 70th percentile in the normal population, equal to or in excess of the 80th percentile in the normal population, equal to or in excess of the 90th percentile in the normal population. normal population, and equal to or in excess of the 95th percentile in the normal population.
  • celiac disease can be diagnosed based on the following indicators: a reduced level of the mRNA of isoform 2 of the UBE2L3 gene with respect to a reference value;
  • Relative expression or “relative content”, as used in the context of the method of the invention, is the amount of expressed mRNA of the isoform 2 of the UBE2L3 gene with respect to the amount of the total mRNA of the UBE2L3 gene, both amounts expressed in the same units depending on the method used for the quantification of said mRNA according to the techniques known in the state of the art, or, as already indicated above, of the corresponding cDNA.
  • the reference value in this case is established by the calculation of the relative expression of the isoform 2 of the UBE2L3 gene with respect to the total mRNA of a control group that does not suffer from celiac disease.
  • the reference value is selected from:
  • the relative content of the mRNA that encodes isoform 2 of the UBE2L3 gene with respect to the total mRNA of the UBE2L3 gene is determined by the formula (I):
  • the mRNA levels of isoform 2 of the UBE2L3 gene or of the total mRNA of the UBE2L3 gene are normalized against the level of a constitutively expressing gene.
  • control RNA refers to an RNA whose expression levels do not change or only change in limited amounts in cells from celiac subjects compared to non-celiac subjects.
  • the control RNA is mRNA derived from housekeeping genes and encoding proteins that are constitutively expressed and that carry out essential cellular functions. Examples of housekeeping genes for use in the present invention include b-2-microglobulin, ubiquitin, 18-S ribosomal protein, cyclophilin, GAPDH, and actin.
  • control RNA is GAPDH mRNA.
  • quantification of relative gene expression is calculated according to the comparative Ct method using GAPDH as endogenous control and commercial RNA controls as calibrators. The final results are determined according to formula 2- (DCt of the sample-DCt of the calibrator), where the DCT values of the calibrator and the sample are determined by subtracting the CT value of the target gene from the value of the GAPDH gene.
  • the sample comprises peripheral blood monocuchlear cells (CMSF).
  • CMSF peripheral blood monocuchlear cells
  • Peripheral blood mononuclear cells are characterized by having a single round nucleus. These cells consist of lymphocytes (T cells, B cells, NK cells) and monocytes. In humans, lymphocytes make up the majority of the CMSF population, followed by monocytes, and only a small percentage of dendritic cells.
  • CMSF extraction methods are well known in the state of the art and are part of the usual techniques in research and clinical laboratories.
  • these cells can be extracted by density gradient centrifugation (JW Mannhalter et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 1986 38, 390-397).
  • the mRNA encoding isoform 2 of the UBE2L3 gene is determined by using a probe that specifically hybridizes with a region of exon 4 of the UBE2L3 gene and / or the total mRNA of the UBE2L3 gene is determined by using of a probe that specifically hybridizes with a region of exon 5 of the UBE2L3 gene.
  • a “probe” is defined as a sequence of nitrogenous bases from adenine (A), cytosine (C), guanine (G), thymine (T) or uracil (U), arranged in a linear polymer that is totally or partially complementary ( Watson and Crick type pairings: AT / U or GC) to another present in the sample to be analyzed.
  • probes can be nucleic acids (DNA, RNA), peptide nucleic acid (PNA), or other synthetic nucleic acids capable of hybridizing to other nucleic acids by Watson and Crick type pairings.
  • Said probes can be either a DNA fragment amplified by PCR, or an oligomer of nitrogenous bases (synthetic or obtained by enzymatic digestion or other chemical or physical means of an existing polymer).
  • the probes are synthetic oligonucleotides that carry modifications at one or both ends to facilitate immobilization to solid supports.
  • the probes are designed and constructed in such a way that their base sequence is unique for the variety it represents, and in such a way that the discrepancies (non-complementary nucleotides) between two or more variants are usually in the central regions of the oligonucleotides.
  • the length of the oligonucleotides can vary between 5 or more bases, preferably between 11 and 30 nucleotides being the most appropriate length to discriminate between two very similar but not identical nucleic acid sequences.
  • specific hybridization refers to the formation of hybrids between a polynucleotide probe and a specific target polynucleotide (for example the mRNA of the UBE2L3 gene or any of its isoforms or exons) in which the probe preferentially hybridizes with the target polynucleotide specific and non-hybrid substantially with polynucleotides consisting of sequences that are not substantially identical to the target polynucleotide.
  • a target polynucleotide for example the mRNA of the UBE2L3 gene or any of its isoforms or exons
  • the minimum length of a polynucleotide required for a specific hybridization to a target polynucleotide will depend on several factors, for example: G / C content, positioning of mismatched bases (if any) , the degree of uniqueness of the sequence compared to the population of target polynucleotides, and the chemical nature of the polynucleotide (eg, the methylphosphonate or phosphorothiolate backbone), among others.
  • the probes have an identity of at least 80%, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95%, still much more preferably of at least 98%, and particularly of a 100%, with a fragment of the sequences complementary to the sequences defined by the NCBI accession numbers described in table 1, as well as the exons defined by the sequences SEQ ID NO: 1-7
  • the terms "complementary” and " substantially complementary refer to the hybridization or base pairing between two nucleotides or nucleic acid molecules, such as between the two strands of a double-stranded DNA molecule or between an oligonucleotide primer and a primer binding site into a single stranded nucleic acid to be sequenced or amplified.
  • Complementary nucleotides are generally A and T (or A and U), and C and G.
  • Two single-stranded RNA or DNA molecules are said to be substantially complementary when nucleotides on one strand, optimally aligned and compared to Appropriate nucleotide insertions or leagues match at least about 80% of the nucleotides from the other strand, usually at least about 90% to 95%, and more preferably 98 to 100%.
  • Substantial complementarity exists when a hybrid RNA or DNA strand under selective hybridization conditions with its complement. Typically, selective hybridization will occur when there is at least 65% complementarity over a stretch of at least 14 to 25 nucleotides, preferably at least about 75%, and more preferably at least 90% complementarity. See, for example, M. Kanehisa (1984) Nudeic Acids Res.12: 203.
  • isoform 2 of the UBE2L3 gene is the only isoform of the gene that contains exon 4.
  • Exon 4 refers to the sequence between positions 509 and 617 of the nucleotide sequence defined by the accession number in NCBI NR_028436 of February 24, 2019 and which in the present invention has been named as SEQ ID NO: 4.
  • Said exon 4 is only present in isoform 2 of the UBE2L3 gene of the sequence defined by the accession number in NCBI NR_028436 of February 24, 2019.
  • exon 5 is defined by the sequence SEQ ID NO: 5 and corresponds to the last exon of all the isoforms of the UBE2L3 gene, as shown in Table 1 of the present description.
  • the total mRNA of the UBE2L3 gene is determined by using a probe that specifically hybridizes with a region of exon 3 of the UBE2L3 gene.
  • exon 3 is defined by the sequence SEQ ID NO: 3 as specified in Table 1.
  • the total mRNA of the UBE2L3 gene is determined by any probe that specifically binds to a common region to all isoforms of the UBE2L3 gene.
  • the quantification of the mRNA encoding isoform 2 of the UBE2L3 gene is carried out by quantifying the cDNA whose sequence is defined by the NCBI accession number NR_028436.2 of the version of December 4, 2018.
  • the quantification of the total mRNA of the UBE2L3 gene is carried out by quantifying the sum of the mRNA levels of isoforms 1 to 5 of the UBE2L3 gene with NCBI accession numbers NM_003347.3, NR_028436, NM_001256356.1, NM_001256355.1 and NR_046082.1 of February 24, 2019.
  • mRNA quantification is performed using an expression microarray.
  • a “microarray” is a multiplex technology that typically uses an ordered series of thousands of nucleic acid probes to hybridize, for example to a sample of cDNA or cRNA under stringent hybridization conditions. Hybridization of the probe with the nucleic acid to be identified generates a signal that can be detected and / or quantified.
  • the probes can be labeled with a fluorophore, silver, or chemiluminescence. The signal emitted when hybridizing therefore makes it possible to determine the relative abundance of nucleic acid sequences to be detected.
  • the probes are connected to a solid support by a covalent bond with a chemical matrix (by means of epoxy-silane, amino-silane, lysine, polyacrylamide or others).
  • solid support refers to a wide variety of materials, for example, but not limited to, ion exchange or adsorption resin, glass, plastic, latex, nylon, gel, cellulose esters , paramagnetic spheres, silicon, microscopic beads or a combination of some of them.
  • Various microarrays are commercially available including those manufactured for example by Affymetrix, Inc. and Illumina, Inc.
  • “Stringent hybridization conditions” typically include salt concentrations of at least 1 M, more generally less than about 500 mM, and preferably less than about 200 mM.
  • Hybridization temperatures can be as low as 5 ° C, but are typically greater than 22 ° C, more typically greater than about 30 ° C, and preferably above about 37 ° C. Longer fragments may require higher hybridization temperatures for specific hybridization. How other factors can affect stringency of hybridization, including the composition of the bases and length of complementary strands, the presence of organic solvents and the degree of base mismatch, the combination of parameters is more important than the absolute measurement of any single parameter.
  • the detection of the content of the isoform 2 of the UBE2L3 gene can be carried out using four Any probe capable of hybridizing with a region of the mRNA or cDNA of exon 4 (SEQ ID NO: 4).
  • the detection of the total mRNA content of the UBE2L3 gene is carried out using a probe capable of hybridizing with a region of the mRNA or cDNA of exon 5 (SEQ ID NO: 5), of exon 3 (SEQ ID NO: 3) or any region common to the 5 isoforms of the UBE2L3 gene.
  • the probe used for the recognition and quantification of exon 4 is ILMN_1796830 from lllunin.
  • the ILMN_1677877 probe from Illumina is used for the recognition and quantification of exon 5 of the UBE2L3 gene.
  • the diagnostic method is applied to a subject suspected of suffering from celiac disease who follows a substantially gluten-free diet.
  • a “gluten-free diet (DSG)” refers to the strict elimination from the diet of all products that contain or are cooked with wheat, rye, barley and oats, or any of their varieties and hybrids (spelled, spelled, kamut , triticale %), and derived products, avoiding inadvertent contamination and all kinds of dietary transgressions.
  • Substantially gluten-free refers generally to food products and / or any component thereof that are gluten-free and / or contain an amount of gluten acceptable to an applicable government agency, food regulatory body, or group. from industries, or similar, label them as “gluten-free.”
  • the Food and Drug Administration of the United States of America (FDA) recognizes as "gluten-free" food products those that do not have: (1) an ingredient that is any type of wheat, rye, barley or hybrids of these grains; (2) an ingredient derived from these grains and that has not been processed to remove gluten; and (3) an ingredient derived from these grains that have been processed to remove gluten, if it results in the food product containing 20 ppm or more of gluten.
  • a food product that is substantially gluten-free may have a gluten content less than or equal to 20 parts per million (ppm), including 15 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 3 ppm, 1 ppm, 0.5 ppm, 0 , 1 ppm, 0.05 ppm, 0 ppm, or any value or range between any two of these values (including end points).
  • ppm parts per million
  • Any of the food products, solid compositions, particulate compositions, dry compositions, or the like that are indicated to be gluten-free are recognized by those skilled in the art to be optionally substantially gluten-free.
  • Kit of the Invention in a further aspect, the invention relates to a kit for the implementation of a method as defined in claims 1 to 10 comprising:
  • components (i) and (ii) constitute at least 1% of the total of the probes present in the kit.
  • the kit is based on the predictive power of the diagnostic method of the present invention.
  • the reference value of the expression levels of the UBE2L3 gene or of any of its isoforms can be determined before carrying out the process of the present invention.
  • the expression of the UBE2L3 gene or any of its isoforms can be calculated with respect to the control samples. The control can thus also be included in the kit.
  • the kit of the invention more preferably comprises the necessary means to quantify the expression of the UBE2L3 gene or any of its isoforms and optionally, to compare the amount detected with a reference amount.
  • Said kit can contain all those reagents necessary to analyze the amount of the expression product of the UBE2L3 gene as well as any of its isoforms and any of the exons (defined by the sequences SEQ ID NO: 1 to 7) by means of any of the methods known in the state of the art mentioned above in this document.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, agents to prevent contamination, inhibitors of RNA degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for its start-up and optimization.
  • the kit further comprises Instructions for carrying out the method of the invention.
  • the kit or device of the Invention comprises the primers and probes obtained from the sequences of the invention (Table 1).
  • the kit may contain the probe (s) and primers useful to quantify the expression of said gene, or any of the exons described in table 1, as well as their combinations.
  • the kit is selected from (a) a suitable kit for PCR, (b) a suitable kit for Northern Blotting and (c) a suitable kit for microarray analyzes. Any of two or more can be combined of these embodiments, such that the kit may comprise, for example, both of (a) and
  • kits suitable for PCR this PCR is usually the real-time quantitative PCR (RQ-PCR), a sensitive and reproducible gene expression quantification technique.
  • RQ-PCR real-time quantitative PCR
  • the kit further comprise primers and probes and oligonucleotide (s) of the kit.
  • reagents can optionally be comprised in the kit.
  • a Northern Blot involves the use of electrophoresis to separate RNA samples by size and subsequent detection with an oligonucleotide (s) (hybridization probe) complementary to (part of) the target RNA sequence of interest.
  • s oligonucleotide
  • the kit comprises a microarray.
  • An RNA or DNA microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass slide or a cell made of a thin silicon film) that evaluates large amounts of different RNA or DNA that are detectable by specific probes immobilized on a solid substrate.
  • Each solid support contains a specific nucleic acid sequence, usually a DNA sequence, as probes (or reporters).
  • probes or reporters.
  • said custom microarray comprises fifty or less probes, such as thirty or less probes, including twenty or less probes.
  • the kit can contain lamps and hybridization, enhancement, blocking, washing solutions and any component necessary to carry out the diagnostic method according to common practice.
  • the kit of the invention additionally comprises one or more components selected from the group consisting of
  • the kit of the invention could therefore include any means known in the state of the art for the purification of RNA, such as the isolation of RNA based on extraction with phenol, precipitation through the use of chaotropic salt solutions or adsorption on silica among others, for the conversion of mRNA to cDNA or for the amplification of exons 4 and 5 of the UBE2L3 gene.
  • Method of diagnosis and treatment such as the isolation of RNA based on extraction with phenol, precipitation through the use of chaotropic salt solutions or adsorption on silica among others, for the conversion of mRNA to cDNA or for the amplification of exons 4 and 5 of the UBE2L3 gene.
  • the invention relates to a method for the diagnosis and treatment of a subject comprising:
  • stage (ii) administering to the subject diagnosed with celiac disease in stage (i) an appropriate treatment for said disease
  • Preferred ways of carrying out stage (i) of diagnosis of the present aspect have been described in detail in the context of the diagnostic method of the invention and are equally applicable to the method of diagnosis and treatment.
  • equate treatment in the context of the present invention refers mainly to the following of a gluten-free diet, as previously described. Additionally, enzymatic treatments could be used for the degradation and neutralization of gluten or specific vaccines. Likewise, the use of medications that help maintain the intestinal barrier can be considered. In refractory celiac disease, treatment may involve the use of steroids.
  • the treatment is a gluten-free diet.
  • AM Mendelian Randomization
  • Table 2 Summary of the results obtained from the analysis of AM in celiac GWAS with data from blood eQTLs from GTEx. In addition to the chromosomal location of each SNP and each gene, the effect size of each study used (b), as well as its p value (p), is shown.
  • the resulting AUC values were 0.528-0.699 and 0.452-0.752 for Crohn's and Ulcerative Colitis, respectively.
  • the very high predictive potential of the UBE2L3 relative expression scora places it in a privileged place for the development of a peripheral blood diagnostic test that could eliminate gluten provocations for the diagnosis of CD in the absence of gluten from the diet.

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos para el diagnóstico delaenfermedad celiaca basados en la cuantificación del nivel de expresión del gen UBE2L3 así como de la expresión relativa de la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto a la expresión total del dicho gen. Asimismo, la invención se refiere a kits con los medios necesarios para realizar el diagnóstico según los métodos dela invención.

Description

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDAD CELIACA BASADO EN EL NIVEL
DE EXPRESIÓN DEL GEN UBE2L3
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y kits para el diagnóstico de la enfermedad celíaca. Por lo tanto la presente invención se engloba dentro del campo técnico de la medicina, específicamente en el campo técnico del diagnóstico clínico y más específicamente en el diagnóstico de pacientes que padecen celiaquía.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La celiaquía o enfermedad celíaca es una enfermedad autoinmune que aparece en personas genéticamente predispuestas y que se caracteriza por una Inflamación crónica de la parte proximal del intestino delgado, causada por la exposición a la gliadina. La gliadina es uno de los componentes principales del gluten, por lo que el único tratamiento a día de hoy para la celiaquía es la estricta ausencia de gluten en la dieta.
Los síntomas de la enfermedad celíaca incluyen diarrea crónica, retraso del crecimiento y/o desarrollo infantil, fatiga, erupciones en la piel, pérdida de peso, cambios en el carácter (irritabilidad, apatía, introversión, tristeza), vómitos, distensión abdominal, pérdida de apetito, fatiga, etc. La prevalencia de la enfermedad celíaca en europeos y sus descendientes es del 1%, siendo más frecuente en las mujeres con una proporción 2:1. Habitualmente la celiaquía se manifiesta durante la etapa infantil, aunque se ha demostrado que también puede manifestarse a lo largo de la etapa adulta.
Los pacientes tratados con dietas libres de gluten muestran menores actividades séricas de antígenos frente al gluten. Sin embargo, esa reducida actividad al gluten, tras la introducción de este tipo de dietas, puede ser consecuencia del catabolismo de los anticuerpos ya formados, así como de una disminución de su síntesis por una menor estimulación antigénica al gluten, y no necesariamente por una mejora en la integridad de la mucosa intestinal.
La sensibilidad al gluten auto-diagnosticada y la dieta sin gluten autoimpuesta son fenómenos en auge. No obstante el 10% de la población general y hasta un 12 o 13% en países como Italia o Reino Unido, reporta una sensibilidad al gluten no diagnosticada, a pesar de que la prevalencia de la EC es en principio mucho menor. En este contexto, una herramienta diagnóstica menos invasiva y más eficiente que una provocación con gluten y su consiguiente biopsia constituiría un gran avance clínico. La estrategia actual de diagnóstico para la enfermedad celíaca se basa fundamentalmente en demostrar una enteropatía dependiente del gluten, para lo cual aún se utilizan preferentemente métodos invasivos (biopsias), aunque también se analizan marcadores séricos como los anticuerpos frente a la gliadina. Sin embargo, aún no hay métodos analíticos fiables para el seguimiento de la efectividad del tratamiento propuesto, ya que el análisis histológico de biopsias duodenales no es factible como método de monitorización rutinario para analizar la remisión y eficacia del tratamiento.
Se ha propuesto la determinación de los niveles de anticuerpos frente a otros antígenos alimentarios, así como las medidas de la permeabilidad intestinal como métodos de diagnóstico alternativos de celiaquía. Estos métodos tendrían como ventaja la ausencia de requerimiento de muestras de biopsias.
Los métodos analíticos actuales de la enfermedad celíaca basados en el análisis histológico de biopsias duodenales tampoco permiten evaluar la adherencia a una dieta libre de gluten por parte de los celíacos. Se ha sugerido que el análisis de los cambios cuantitativos y cualitativos en anticuerpos relacionados con la enfermedad celíaca puede ser de utilidad para monitorizar la adherencia al tratamiento con dieta libre de gluten, y de hecho, algunos de los anticuerpos analizados para ello son los anticuerpos frente a la transglutaminasa (anti-tTG) y a la gliadina desaminada (AGA). Sin embargo, estos análisis no reflejan necesariamente el grado real de integridad intestinal, ya que una disminución en esos anticuerpos puede ser consecuencia de un aumento de su catabolismo o una disminución de su síntesis por menor estimulación antigénica al gluten en las dietas libres de gluten.
Se ha descrito que la detección de tetrámeros HLA-DQ-gluten en sangre podría emplearse como método diagnóstico de la EC en ausencia de gluten de la dieta, con sensibilidad del 90% y especificidad del 93% (Sama VK et al., Gastroenterology. 2018;154:886-96)
Por lo tanto, a la vista del estado de la técnica, sigue existiendo la necesidad de desarrollar métodos que permitan tanto el diagnóstico de la enfermedad celíaca cuya fiabilidad sea mayor o al menos aporten más información que la de los métodos descritos hasta la fecha
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto la invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de la enfermedad celiaca en un sujeto sospechoso de padecer enfermedad celiaca que comprende cuantificar en una muestra de dicho sujeto el contenido en:
(i) el mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 y/o
(ii) el mRNA total del gen UBE2L3
en donde:
i) un nivel reducido del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto a un valor de referencia,
ii) un nivel elevado del mRNA total del gen UBE2L3 con respecto a un valor de referencia y/o
iii) un contenido relativo del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto al total de mRNA del gen UBE2L3 elevado con respecto a un valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre enfermedad celiaca.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un kit para la puesta en práctica de un método tal y como se define en las reivindicaciones 1 a 10 que comprende:
(i) Una sonda que híbrida específicamente con el exón 4 del gen UBE2L3,
(ii) Una sonda que híbrida específicamente con el exón 5 del gen UBE2L3 y, opcionalmente
(iii) Una sonda que híbrida de forma específica con un gen de expresión constitutiva
en donde los componentes (i) y (ii) constituyen al menos un 1% del total de las sondas presentes en el kit.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un método para el diagnóstico y tratamiento de un sujeto que comprende:
(i) diagnosticar en dicho sujeto la presencia de enfermedad celiaca mediante el método in vitro de diagnóstico de la invención;
(ii) administrar al sujeto diagnosticado con enfermedad celiaca en la etapa (i) un tratamiento adecuado para dicha enfermedad. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Localización genómica de las isoformas del gen UBE2L3 en el cromosoma 22 (flecha señalando la variante 2; números 4 y 5 señalando el cuarto y quinto exón, respectivamente). En el esquema se muestran el SNP priorizado mediante aleatorización mendeliana (AM) (rs5754217) y las sondas del microarray de expresión de lllumina realizado en pacientes de EC en dieta sin gluten (ILMN_1796830 e ILMN_1677877).
Figura 2: A. Expresión en unidades de intensidad reportada por las dos sondas de lllumina localizadas en el gen UBE2L3 en controles (círculos) y celiacos en dieta sin gluten (cuadros). B: Expresión relativa entre la variante 2 y el resto de isoformas del gen UBE2L3 calculada a partir de las unidades de intensidad reportadas por las sondas de lllumina de forma independiente.
Figura 3: curva ROC con el score de expresión relativa de UBE2L3 como clasificador binario (EC en dieta sin gluten / control). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Como se muestra en los ejemplos de la solicitud, los autores de la presente invención han demostrado que una disminución en la expresión de la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto a un grupo control es indicativo de la enfermedad celiaca, con una gran especificidad y sensibilidad (AUC=0,997). Adicionalmente, un aumento en la expresión del total de las isoformas del gen UBE2L3 con respecto a un grupo control es indicativo de la enfermedad celiaca. Asimismo, una aumento en la expresión relativa de la isoforma 2 del gen UBE2L3 en relación a la expresión de todas las isoformas del gen, con respecto a un grupo control, es también indicador de la enfermedad celiaca. En este caso la especificidad del método de diagnóstico es del 100% (AUC = 1). El altísimo potencial predictivo del score de expresión relativa de
UBE2L3 lo sitúa en un lugar privilegiado de cara al desarrollo de un test diagnóstico en sangre periférica que podría eliminar las provocaciones con gluten del diagnóstico de la EC en ausencia de gluten de la dieta.
Métodos de diagnóstico Así, en base a los hallazgos realizados, en un primer aspecto la invención se relaciona con un método in vitro para el diagnóstico de la enfermedad celiaca en un sujeto sospechoso de padecer enfermedad celiaca que comprende cuantificar en una muestra de dicho sujeto el contenido en:
(i) el mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 y/o (¡i) el mRNA total del gen UBE2L3
en donde:
- un nivel reducido del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto a un valor de referencia,
- un nivel elevado del mRNA total del gen UBE2L3 con respecto a un valor de referencia y/o
- un contenido relativo del mRNA que codifica la isofbrma 2 del gen UBE2L3 con respecto al total de mRNA del gen UBE2L3 elevado con respecto a un valor de referencia
es indicativo de que el sujeto sufre enfermedad celiaca.
El término "diagnóstico" como se usa aquí se refiere tanto al proceso de tratar de determinar y/o identificar una posible enfermedad en un sujeto, es decir, el procedimiento de diagnóstico, y la opinión alcanzada por este proceso, es decir, la opinión de diagnóstico. Como tal, también puede ser considerado como un intento de clasificación de la condición de un individuo en categorías separadas y distintas que permiten decisiones médicas sobre el tratamiento y el pronóstico a realizar.
Como entenderá el experto en la materia, tal diagnóstico puede no ser correcto para el 100% del sujeto a diagnosticar, aunque es preferible que lo sea. Sin embargo, el término requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos pueda ser identificada como que padece una enfermedad o que tiene una predisposición a la misma. El experto en la materia puede determinar si un resultado es estadísticamente significativo usando diferentes herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, mediante la determinación de los intervalos de confianza, la determinación del valor p, la prueba de Student, el Mann-Whitney, etc. (ver Dowdy y Wearden, 1983). Los intervalos de confianza preferidos son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% o al menos 99%. Los valores de p son preferiblemente 0.05, 0.025, 0.001 o menos.
La expresión "método de diagnóstico" a la que se hace referencia de acuerdo con la presente invención significa que el método puede consistir esencialmente en los pasos mencionados anteriormente o puede incluir pasos adicionales. Como se usa en este documento, la expresión "diagnóstico in vitro" se refiere a un método de diagnóstico que no se aplica a un cuerpo humano o animal.
El término“celiaquía” o“enfermedad celíaca” en la presente invención hace referencia a una patología autoinmune caracterizada por una inflamación crónica de la parte próxima del intestino delgado o yeyuno, causada por la exposición a la gliadina, que es uno de los componentes del gluten. La enfermedad celíaca supone una intolerancia permanente al gluten cuya característica es una reacción inflamatoria de base inmune en la mucosa intestinal que dificulta la absorción de los nutrientes.
El gluten es una proteína presente en cereales tales como trigo ( Triticum spp), cebada ( Hordeum vulgare), centeno ( Secale cereale), triticale (Triticosecale, cereal procedente del cruce entre trigo y centeno), kamut ( Triticum turgidum), espelta ( Triticum spelta ) y posiblemente avena (Avena spp), pero ausente en arroz (Oriza sativa) y maíz (Zea mays). El gluten se compone de gliadina y glutenina, siendo la gliadina una glucoproteína de tipo prolamina. En el sujeto que padece la celiaquía o celíaco, la ingestión de gliadina provoca que la enzima transglutaminasa tisular modifique dicha proteína y el sistema inmune origine una reacción cruzada contra el intestino delgado, causando una reacción inflamatoria que causa atrofia de las vellosidades que recubren el intestino e interferencia en la absorción de nutrientes.
El desarrollo de la enfermedad celíaca está determinado tanto por factores ambientales (alimentación) como genéticos. Así, la celiaquía implica también una predisposición genética ya que la mayor parte de celíacos presentan el antígeno de leucocito humano (HLA) de tipo DQ2 (HLA-DQ2) y DQ8 (HLA-DQ8) (May-Ling J. et al. 2010 Immunogenetics 62:641-651).
El término“sujeto”, tal como se usa en la invención, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no está restringido a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o raza.
La expresión "que comprende" pretende incluir, pero sin limitación, lo que sigue a la expresión "que comprende". Por lo tanto, el uso de la expresión "que comprende" indica que los elementos citados son necesarios u obligatorios, pero que son opcionales otros elementos y existe la posibilidad de que estén presentes o no. "Cuantificar", en relación a una secuencia de ácido nucleico, se refiere al uso de cualquier método para estudiar la cantidad de una secuencia de ácido nucleico particular, incluyendo, sin limitación, métodos para determinar el número de copias de una secuencia de ácido nucleico o para determinar el cambio en la cantidad de copias de la secuencia de ácido nucleico a lo largo del tiempo, o determinar la concentración relativa de una secuencia cuando se compara con otra secuencia.
Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm o de su ADNc correspondiente. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de ARNm codificados por dichos genes pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del ARNm y la cuantificación del producto de la amplificación de dicho ARNm, tales como electroforesis y tinción, o alternativamente, mediante Norther blot y empleo de sondas apropiadas y empleo de sondas específicas del ARNm de los genes de interés o de su ADNc correspondiente, mapeo con la nucleasa S1 , RT-PCR, hibridación, microarrays, etc. Análogamente, los niveles del ADNc correspondiente a dichos ARNm también puede ser cuantificado mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del correspondiente ADNc mediante transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho ADNc. Métodos convencionales de cuantificar los niveles de expresión pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook y cois., 2001“Molecular cloning: a Laboratory Manual”, 3 rd ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol.1-3.
En una realización preferida, la cuantificación del producto de la expresión de los genes se realiza determinando el nivel de mRNA derivado de su transcripción, donde el análisis del nivel de mRNA se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qRT-PCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; microarrays de DNA elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectadles funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.
Adicionalmente, el método de la invención puede incluir la realización de una etapa de extracción con el fin de obtener el ARN total, lo que puede realizarse mediante técnicas convencionales (Chomczynski y cois., Anal. Biochem., 1987, 162:156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15:532).
El término“muestra”, tal como se emplea en la presente invención, hace referencia a una muestra, obtenida partir del sujeto bajo estudio (salvo que se indique lo contrario), tal como una muestra de sangre o de suero obtenida a partir de dicho sujeto. En una realización particular, dicha muestra de sangre comprende sangre periférica. El término“sangre periférica” se relaciona con el volumen de sangre circulante distante del corazón, esto es, la sangre que circula por el organismo de un sujeto. La muestra de sangre puede obtenerse por métodos convencionales conocidos por el técnico en la materia. El término“suero”, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al componente de la sangre resultante tras la coagulación de ésta y eliminación del coágulo resultante. Métodos de obtención de muestras de sangre a partir de un sujeto están ampliamente recogidos en el estado de la técnica, así como métodos de obtención de suero a partir de muestras de sangre.
El término "RNA mensajero" o "mRNA" se refiere a un RNA que está sin ¡ntrones y que puede o no traducirse en un polipéptido. El término“cDNA” se refiere a una secuencia de nucleótidos, complementaria de una secuencia de mRNA.
El término“isoforma” o "variante" se refiere a todos los tipos de ARN transcritos de un gen dado que, cuando se procesan colectivamente mediante empalme alternativo o procesamiento alternativo, codifican isoformas de proteínas plurales. El término "empalme alternativo" o“procesamiento alternativo”, se refiere a todos los tipos de procesamiento de ARN que conducen a la expresión de isoformas de proteínas plurales de un solo gen. Algunos genes, generalmente genes eucariotas, se transcriben primero como precursores largos de ARNm que luego se acortan mediante una serie de pasos de procesamiento para producir la molécula de ARNm madura. El empalme alternativo del pre-ARNm es un proceso postranscripcional que permite la producción de distintos ARNm a partir de un solo gen con el potencial de expandir la estructura y diversidad de proteínas. El empalme alternativo también puede introducir o eliminar elementos reguladores para afectar la traducción, la localización o la estabilidad del ARNm. Más del 70% de los genes humanos pueden experimentar un empalme alternativo con muchos genes capaces de producir docenas e incluso cientos de isoformas diferentes. Uno de estos pasos es el empalme de ARN, en el que las secuencias de intrones se eliminan del precursor de ARNm. Una célula puede unir el transcrito primario de diferentes maneras, creando diferentes "variantes de empalme" y, por lo tanto, creando diferentes cadenas polipeptídicas del mismo gen o de la misma molécula de ARNm. Las variantes de empalme pueden incluir, por ejemplo, inserciones de exones, extensiones de exones, truncamientos de exones, delaciones de exones, alternativas en la región no traducida 5 'y alternativas en la región no traducida 3'. Las variantes de empalme son impredecibles, ya que la célula puede unir la transcripción primaria de diferentes maneras, creando diferentes cadenas polipeptídicas del mismo gen o de la misma molécula de ARNm.
EL término UBE2L3 hace referencia al gen UBE2L3, que se encuentra en el cromosoma 22 y codifica para la enzima E3 L3 que conjuga ubiquitina (Ubiquitin Conjugating Enzyme E2 L3). Al gen UBE2L3 se le conoce también por UBCH7, L- UBC, UbcM4, E2-F1 o UBCE7. El procesamiento alternativo del gen UBE2L3 da lugar a 5 isoformas o variantes de mRNA. Dichas isoformas se pueden definir por su correspondiente número de acceso en el NCBI y por el número y secuencias específicas de exones, según se indica en la siguiente tabla:
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Tabla 1. Isoformas del gen UBE2L3, secuencias, número de acceso y exones correspondientes.
Así, el término ¡soforma 2 del gen UBE2L3, según se utiliza en el contexto de la presente invención, se refiere a la secuencia identificada con el número de acceso en el NCBI NR_028436 del 24 de febrero de 2019. Dicha secuencia corresponde a una isoforma no codificante del gen y comprende los exones 1 , 2, 3, 5 y 4 definidos respectivamente por las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEO ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, según se especifica en la tabla 1.
El mRNA total, se refiere a la suma de todas las isoformas del gen UBE2L3, es decir, a las isoformas definidas por los números de acceso del NCBI NM_003347.3, NR_028436, NM_001256356.1 , NM_001256355.1 y NR_046082.1 del 24 de febrero de 2019.
Como ya se ha indicado anteriormente, niveles de mRNA pueden medirse y cuantificarse por diversos métodos bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica, incluyendo el uso de equipos y reactivos comercialmente disponibles. La cuantificación de los niveles de expresión de del gen UBE2L3 puede realizarse a partir del ARN resultante de la transcripción de dichos genes (ARNm) o, alternativamente, a partir del ADN complementario (ADNc) de dichos genes. Por tanto, en una realización particular, la cuantificación de los niveles de expresión de del gen UBE2L3 comprende la cuantificación de los ARN mensajeros (ARNm) de dichos genes, o un fragmento de dicho ARNm, el ADN complementario (ADNc) de dichos genes, o un fragmento de dicho ADNc, o sus mezclas.
La determinación de los niveles de expresión del gen UBE2L3, ya sea mediante la cuantificación del mRNA o del cDNA de la isoforma 2 o mediante la cuantificación del mRNA o cDNA total, necesita ser comparada con los valores de referencia. El término“valor de referencia” o“punto de corte” o“cantidad de referencia”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier valor o rango de valores derivado de la cuantificación del producto de la expresión del gen UBE2L en una muestra biológica, o en una colección de muestras biológicas, procedentes de individuos que no padecen la enfermedad celiaca. La cantidad de referencia se ha de medir de la misma forma, y ser obtenida en el mismo tipo de muestra biológica aislada, que la cantidad medida en el sujeto analizado.
El término“comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad del producto de expresión del gen UBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas con un valor de referencia. La comparación descrita en el método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
En la presente invención el valor de referencia corresponde al valor medio de los niveles de expresión del gen UBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas, medidos en una muestra de sujetos no celiacos. Una vez que se ha establecido este valor medio, se puede comparar el nivel de este marcador expresado en muestras de sujetos celiacos con este valor medio, y de esta manera ser asignado al nivel de expresión "reducido" o“elevado”. Debido a la variabilidad entre sujetos (por ejemplo, aspectos referidos a la edad, raza, etc.) es muy difícil (si no prácticamente imposible) establecer valores de referencia absolutos de expresión del gen UBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas. De esta manera, en una forma de realización particular, los valores de referencia para expresión "elevado" o "reducido" de la expresión del gen UBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas se determinan calculando los percentiles por medios convencionales que implica ensayar un grupo de muestras aisladas de sujetos normales (es decir, gente sin la enfermedad celiaca) para los niveles de expresión de UBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas. Los niveles "reducidos" de UBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas se pueden entonces asignar, preferiblemente, a muestras en donde los niveles de expresión de UBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas son iguales a o inferiores al percentil 50 en la población normal, incluyendo, por ejemplo, niveles de expresión iguales a o inferiores del percentil 60 en la población normal, iguales a o inferiores al percentil 70 en la población normal, iguales a o inferiores al percentil 80 en la población normal, iguales a o inferiores al percentil 90 en la población normal, e iguales a o inferiores al percentil 95 en la población normal. Los niveles "elevados" deUBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas se pueden entonces asignar, preferiblemente, a muestras en donde los niveles de expresión de UBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas son iguales a o superan el percentil 50 en la población normal, incluyendo, por ejemplo, niveles de expresión iguales a o en exceso al percentil 60 en la población normal, iguales a o en exceso al percentil 70 en la población normal, iguales a o en exceso al percentil 80 en la población normal, iguales a o en exceso al percentil 90 en la población normal, e iguales a o en exceso al percentil 95 en la población normal. Así, en según el método de la Invención, se puede diagnosticar la enfermedad celiaca en base a los siguientes indicadores: un nivel reducido del mRNA de la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto a un valor de referencia;
un nivel elevado del mRNA total del gen UBE2L3 con respecto a un valor de referencia; y
un nivel elevado del contenido relativo de mRNA de la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto al total del mRNA del gen UBE2L3 con respecto a un valor de referencia. “Expresión relativa" o“contenido relativo”, como se utiliza en el contexto del método de la invención, es la cantidad de mRNA expresado de la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto a la cantidad del mRNA total del gen UBE2L3, expresadas ambas cantidades en las mismas unidades en función del método utilizado para la cuantificación de dicho mRNA según las técnicas conocidas en el estado de la técnica, o, como ya se ha indicado anteriormente, del cDNA correspondiente. El valor de referencia en este caso se establece mediante el cálculo de la expresión relativa de la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto al mRNA total de un grupo control que no padece enfermedad celiaca.
En una realización particular, el valor de referencia se selecciona de:
(i) el contenido en mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 en un sujeto que no sufre enfermedad celiaca o el valor medio del contenido en mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 en una población de sujetos que no sufren enfermedad celiaca,
(ii) el contenido en mRNA total del gen UBE2L3 en un sujeto que no sufre enfermedad celiaca o el valor medio del contenido en mRNA total del gen UBE2L3 en una población de sujetos que no sufren enfermedad celiaca y/o
(iii) el contenido relativo del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto al total de mRNA del gen UBE2L3 en un sujeto que no sufre enfermedad celiaca o el valor medio del contenido relativo del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto al total de mRNA del gen UBE2L3 en una población de sujetos que no sufren enfermedad celiaca. En otra realización particular, el contenido relativo del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto al total de mRNA del gen UBE2L3 se determina mediante la fórmula (I):
Figure imgf000015_0001
SCORE = 2 (cantidad mRNA isoforma 2 UBE2L3 - cantidad mRNA total UBE2L3)
En una realización preferida los niveles de mRNA de la isoforma 2 del gen UBE2L3 o del mRNA total del gen UBE2L3 se normalizan frente al nivel de un gen de expresión constitutiva.
Para normalizar los valores de expresión el ARNm entre las diferentes muestras, es posible comparar los niveles de expresión del ARNm de interés en las muestras a ensayar con la expresión de un ARN control correspondiente a un gen de expresión constitutiva. Un "ARN control" como se usa aquí, se refiere a un ARN cuyos niveles de expresión no cambian o solo cambian en cantidades limitadas en células de sujetos celiacos en comparación con sujetos no celiacos. Preferiblemente, el ARN control es ARNm derivado de genes de mantenimiento y que codifica proteínas que se expresan de forma constitutiva y que llevan a cabo funciones celulares esenciales. Los ejemplos de genes de mantenimiento para su uso en la presente invención incluyen b-2- microglobulina, ubiquitina, proteína ribosómica de 18-S, ciclofilina, GAPDH y actina. En un forma de realización preferida, el ARN control es el ARNm de GAPDH. En una forma de realización la cuantificación de la expresión génica relativa se calcula según el método comparativo Ct usando GAPDH como control endógeno y controles de ARN comerciales como calibradores. Los resultados finales, se determinan según la fórmula 2-(DCt de la muestra-DCt del calibrador), donde los valores DCT del calibrador y la muestra se determinan sustrayendo el valor CT del gen diana del valor del gen de GAPDH.
En una realización particular, la muestra comprende células monocucleares de sangre periférica (CMSF).
Las células mononucleares de sangre periférica se caracterizan por poseer un único núcleo redondo. Estas células consisten en linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos. En los seres humanos, los linfocitos constituyen la mayoría de la población de CMSF, seguidos de los monocitos, y solo un pequeño porcentaje de células dendríticas.
Métodos de extracción de CMSF son bien conocidos en el estado de la técnica y forman parte de las técnicas habituales de laboratorios de investigación y clínicos. Por ejemplo, estas células se pueden extraer mediante centrifugación de gradientes de densidad (J. W. Mannhalter y otros, Clin. Immunol. Immunopathol. 1986 38, 390 - 397).
En una realización particular el mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 se determina mediante el empleo de una sonda que híbrida de forma específica con una región del exón 4 del gen UBE2L3 y/o el mRNA total del gen UBE2L3 se determina mediante el empleo de una sonda que híbrida de forma específica con una región del exón 5 del gen UBE2L3.
Se define“sonda” como una secuencia de bases nitrogenadas de entre adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) o uracilo (U), dispuestas en un polímero lineal que es total o parcialmente complementaria (apareamientos del tipo Watson y Crick: A-T/U o G-C) a otra presente en la muestra a analizar. Tales sondas pueden ser de ácidos nucleicos (ADN, ARN), ácido nucleico peptídico (PNA), u otros ácidos nucleicos sintéticos capaces de hibridar con otros ácidos nucleicos mediante apareamientos del tipo de Watson y Crick.
Dichas sondas pueden ser o un fragmento de ADN amplificado por PCR, o un oligómero de bases nitrogenadas (sintético u obtenido por digestión enzimática u otro medio químico o físico de un polímero existente).
En una realización particular de la invención las sondas son oligonucleótidos sintéticos que llevan modificaciones en uno o en los dos extremos para facilitar la inmovilización a soportes sólidos.
Las sondas se diseñan y se construyen de tal forma que su secuencia de bases sea única para la variedad que representa, y de tal forma que las discrepancias (nucleótidos no complementarios) entre dos o más variantes suelen estar en las zonas centrales de los oligonucleótidos.
La longitud de los oligonucleótidos puede variar entre 5 o más bases, siendo preferentemente entre 11 y 30 nucleótidos la longitud más apropiada para discriminar entre dos secuencias muy similares pero no idénticas de ácidos nucleicos.
El término "hibridación específica" se refiere a la formación de híbridos entre una sonda de polinucleótido y un polinucleótido diana específico (por ejemplo el mRNA del gen UBE2L3 o cualquiera de sus isoformas o exones) en el que la sonda preferentemente híbrida con el polinucleótido diana específico y no híbrida sustancialmente con polinucleótidos que consisten en secuencias que no son sustancialmente idénticas al polinucleótido diana. Sin embargo, los expertos en la materia reconocerá que la longitud mínima de un polinucleótido requerido para una hibridación específica con un polinucleótido diana dependerá de varios factores, por ejemplo: el contenido G / C, el posicionamiento de bases no coincidentes (si las hay) , el grado de singularidad de la secuencia en comparación con la población de polinucleótidos diana, y la naturaleza química del polinucleótido (por ejemplo, la cadena principal de metilfosfonato o fosforotiolato), entre otros.
En una realización particular las sondas presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a las secuencias definidas por los números de acceso del NCBI descritos en la tabla 1, así como de los exones definidos por las secuencias SEQ ID NO: 1-7 Los términos "complementario" y "sustancialmente complementario" se refieren a la hibridación o emparejamiento de bases entre dos nucleótidos o moléculas de ácido nucleico, como por ejemplo, entre las dos hebras de una molécula de DNA de doble cadena o entre un cebador de oligonucleótido y un sitio de unión a cebador en un ácido nucleico de cadena sencilla a secuenciar o amplificar. Los nucleótidos complementarios son, generalmente, A y T (o A y U), y C y G. Dos moléculas de RNA o de DNA de cadena sencilla se dice que son sustancialmente complementarias cuando los nucleótidos de una hebra, alineadas óptimamente y comparadas con inserciones o deledones de nucleótidos apropiadas, se emparejan con al menos aproximadamente el 80% de los nucleótidos de la otra cadena, normalmente al menos aproximadamente del 90% al 95%, y más preferiblemente del 98 al 100%. La complementariedad sustancial existe cuando una hebra de RNA o DNA híbrida en condiciones de hibridación selectivas con su complementario. Normalmente, la hibridación selectiva se producirá cuando existe al menos un 65% de complementariedad sobre un tramo de al menos 14 a 25 nucleótidos preferiblemente al menos aproximadamente un 75%, y más preferiblemente al menos un 90% de complementariedad. Véase, por ejemplo, M. Kanehisa (1984) Nudeic Acids Res.12:203.
Como se muestra en la tabla 1 anteriormente mencionada, la isoforma 2 del gen UBE2L3 es la única de las isoformas del gen que contiene el exón 4. El exón 4, tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a la secuencia comprendida entre las posiciones 509 y 617 de la secuencia de nucleótidos definida por el número de acceso en el NCBI NR_028436 del 24 de febrero de 2019 y que en la presente invención se ha nombrado como SEQ ID NO: 4.
Figure imgf000018_0001
(SEQ ID NO: 4)
Dicho exón 4 solamente se encuentra presente en la isoforma 2 del gen UBE2L3 de la secuencia definida por el número de acceso en el NCBI NR_028436 del 24 de febrero de 2019.
Tal como se utiliza en la presente invención, exón 5 está definido por la secuencia SEQ ID NO: 5 y corresponde al último exón de todas las isoformas del gen UBE2L3, tal y como se muestra en la tabla 1 de la presente descripción.
En otra realización particular, el mRNA total del gen UBE2L3 se determina mediante el empleo de una sonda que híbrida de forma específica con una región del exón 3 del gen UBE2L3. En este caso, el exón 3 viene definido por la secuencia SEQ ID NO: 3 según se especifica en la tabla 1. En otra realización, el mRNA total del gen UBE2L3 se determina mediante cualquier sonda que se una de manera específica a una región común a todas las isoformas del gen UBE2L3. En una realización preferida, la cuantificatión del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 se lleva a cabo mediante la cuantificatión del cDNA cuya secuencia viene definida mediante el número de acceso del NCBI NR_028436.2 de la versión del 4 de diciembre de 2018.
En otra realización particular, la cuantificación del mRNA total del gen UBE2L3 se lleva a cabo mediante la cuantificatión de la suma de los niveles de los mRNA de las isoformas 1 a 5 del gen UBE2L3 con números de acceso del NCBI NM_003347.3, NR_028436, NM_001256356.1, NM_001256355.1 y NR_046082.1 del 24 de febrero de 2019.
En otra realización preferida, la cuantificatión del ARNm se realiza mediante un microarray de expresión.
Un“microarray” es una tecnología múltiplex que típicamente utiliza una serie ordenada de miles de sondas de ácido nucleico para hibridar, por ejemplo con una muestra de cDNA o cRNA bajo condiciones de hibridación astringentes. La hibridación de la sonda con el ácido nucleico que se quiere identificar genera una señal que se puede detectar y/o cuantificar. A modo de ejemplo, las sondas pueden estar marcadas con un fluoróforo, plata, o quimioluminescencia. La señal emitida al hibridar permite por lo tanto determinar la abundancia relativa de secuencias del ácido nucleico que se quiere detectar. Las sondas se conectan a un soporte sólido por un enlace covalente con una matriz química (mediante epoxi-silano, amino-silano, lisina, poliacrilamida u otras). El término "soporte sólido" tal como se emplea en la presente invención se refiere a una gran variedad de materiales, por ejemplo, pero sin limitarse, intercambio de iones o resina adsorción, vidrio, plástico, látex, nylon, gel, ésteres de celulosa, esferas paramagnéticas, silicio, perlas microscópicas o la combinación de algunos de ellos. Diversos microarrays están comercialmente disponibles incluyendo aquellas fabricadas por ejemplo por Affymetrix, Inc. y lllumina, Inc.
Las "condiciones de hibridación astringentes” incluyen normalmente concentraciones de sal de al menos 1 M, más generalmente menos de alrededor de 500 mM, y preferiblemente menos de aproximadamente 200 mM. Las temperaturas de hibridación pueden ser tan bajas como 5 °C, pero son normalmente mayores de 22 °C, más normalmente mayores e aproximadamente 30 °C, y preferiblemente por encima de aproximadamente 37 °C. Los fragmentos más largos pueden requerir temperaturas más altas de hibridación para la hibridación específica. Como otros factores pueden afectar a la astringencia de la hibridación, incluso la composición de las bases y longitud las cadenas complementarias, la presencia de disolventes orgánicos y el grado de desemparejamiento de bases, la combinación de parámetros es más importante que la medición absoluta de cualquier parámetro solo. En el contexto del método de la presente Invención, la detección del contenido de la isoforma 2 del gen UBE2L3 se puede llevar a cabo empleando cualquier sonda capaz de hibridar con una reglón del mRNA o cDNA del exón 4 (SEQ ID NO: 4). En otra forma preferida de realización, la detección del contenido total en ARNm del gen UBE2L3 se lleva a cabo empleando una sonda capaz de hibridar con una reglón del mRNA o cDNA del exón 5 (SEQ ID NO: 5), del exón 3 (SEQ ID NO: 3) o de cualquier región común a las 5 isoformas del gen UBE2L3. En una realización concreta, la sonda utilizada para el reconocimiento y cuantificación del exón 4 es ILMN_1796830 de lllunina. En otra realización particular, se utiliza la sonda ILMN_1677877 de lllumina para el reconocimiento y cuantificación del exón 5 del gen UBE2L3. En otra forma preferida de realización, el método diagnóstico se aplica sobre un sujeto sospechoso de padecer enfermedad celiaca que sigue una dieta sustancialmente libre de gluten.
Una “dieta sin gluten (DSG)” se refiere a la eliminación de forma estricta de la alimentación todos los productos que contengan o se cocinen con trigo, centeno, cebada y avena, o cualquiera de sus variedades e híbridos (espelta, escanda, kamut, triticale...), y productos derivados, evitando contaminaciones inadvertidas y todo tipo de transgresiones dietéticas.
“Sustancialmente libre de gluten” se refiere en general a productos alimenticios y/o cualquier componente de los mismos que no contienen gluten y/o que contienen una cantidad de gluten aceptable para que una repartición gubernamental aplicable, un ente regulador de alimentos, un grupo de industrias, o similar, los rotule como“libres de gluten”. La Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos de América (FDA) reconoce como productos alimenticios“libres de gluten” a aquellos que no tienen: (1) un ingrediente que es cualquier tipo de trigo, centeno, cebada o híbridos de estos granos; (2) un ingrediente derivado de estos granos y que no se ha procesado para eliminar el gluten; y (3) un ingrediente derivado de estos granos que se han procesado para eliminar el gluten, si deriva en que el producto alimenticio contenga 20 ppm o más de gluten. Otros países tales como, por ejemplo, Nueva Zelanda y Australia, permiten el rótulo de alimento“libre de gluten” en productos alimenticios que tienen menos de 3 ppm de gluten. Un producto alimenticio que es sustancialmente libre de gluten puede tener un contenido de gluten menor o igual a 20 partes por millón (ppm), que incluyen 15 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 3 ppm, 1 ppm, 0,5 ppm, 0,1 ppm, 0,05 ppm, 0 ppm, o cualquier valor o rango entre dos cualquiera de estos valores (que incluyen los puntos extremo). Cualquier de los productos alimenticios, composiciones sólidas, composiciones particuladas, composiciones secas, o similares que se indica que son libres de gluten se reconocen por parte los expertos en el arte como que opcionalmente están sustancialmente libres de gluten.
Kit de la Invención En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit para la puesta en práctica de un método tal y como se define en las reivindicaciones 1 a 10 que comprende:
(i) Una sonda que híbrida específicamente con el exón 4 del gen UBE2L3, (¡i) Una sonda que híbrida específicamente con el exón 5 del gen UBE2L3 y, opcionalmente
(iii) Una sonda que híbrida de forma específica con un gen de expresión constitutiva
en donde los componentes (i) y (¡i) constituyen al menos un 1% del total de las sondas presentes en el kit.
El kit se basa en el poder predictivo del método de diagnóstico de la presente Invención. El valor de referencia de los niveles de expresión del gen UBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas se puede determinar antes de llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. Con la ayuda del kit, se puede calcular la expresión del gen UBE2L3 o de cualquiera de sus isoformas con respecto a las muestras de control. El control puede de esta manera estar comprendido también en el kit.
El kit de la Invención más preferiblemente comprende los medios necesarios para cuantlficar la expresión del gen UBE2L3 o cualquiera de sus isoformas y opcionalmente, para comparar la cantidad detectada con una cantidad de referencia. Dicho kit puede contener todos aquellos reactivos necesarios para analizar la cantidad del producto de expresión del gen UBE2L3 así como cualquiera de sus isoformas y cualquiera de los exones (definidos por las secuencias SEQ ID NO: 1 a 7) por medio de cualquiera de los métodos conocidos en estado de la técnica mencionados anteriormente en este documento. El kit además puede Incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, Inhibidores de la degradación del RNA, etc. Por otro lado el kit puede Incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las Instrucciones para llevar a cabo el método de la invención.
Más preferiblemente, el kit o dispositivo de la Invención comprende los cebadores y sondas obtenidos de las secuencias de la invención (Tabla 1). El kit puede contener la/s sonda/s y cebadores útiles para cuantificar la expresión de dicho gen, o cualquiera de los exones descritos en la tabla 1 , así como las combinaciones de los mismos. En realizaciones particulares, el kit se selecciona entre (a) un kit adecuado para la PCR, (b) un kit adecuado para la Transferencia Northern Blot y (c) un kit adecuado para los análisis de microarray Se pueden combinar cualquiera de dos o más de estas realizaciones, de tal manera que el kit puede comprender, por ejemplo, ambos de (a) y
(c). En el caso de (a) un kit adecuado para la PCR, esta PCR es normalmente la PCR cuantitativa en tiempo real PCR (RQ-PCR), una técnica de cuantificación de la expresión génica sensible y reproducible. En este caso se desea que el kit comprenda adicionalmente cebadores y sondas y oligonucleótido(s) del kit. Estos reactivos pueden estar comprendidos opcionalmente en el kit.
Una Transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar las muestras de ARN por tamaño y la posterior detección con un(os) oligonucleótido(s) (sonda de hibridación) complementaria con (parte de) la secuencia diana del ARN de interés.
Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende un microarray. Un microarray de ARN o DNA es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN o DNA que son detectadles mediante sondas específicas inmovilizadas sobre un sustrato sólido. Cada soporte sólido contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de sondas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que el microarray se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicho microarray personalizado comprende cincuenta sondas o menos, tal como treinta sondas o menos, incluyendo veinte sondas o menos. En kit puede contener lampones y soluciones de hibridación , potenciación , bloqueo, lavado y cualquier componente necesario para llevar a cabo el método de diagnóstico según la práctica común.
En una realización particular, el kit de la invención comprende adicionalmente uno o más componentes seleccionados del grupo formado por
(i) Medios para la purificación de ARN a partir de una muestra de células,
(ii) Medios para la transcripción inversa de una preparación de ARNm y
(iii) Medios para amplificación de los exones 4 y 5 del gen UBE2L3.
El kit de la invención podría por tanto incluir cualquier medio conocido en el estado de la técnica para la purificación del ARN, tales como el aislamiento del ARN basado en la extracción con fenol, precipitación mediante el uso de soluciones de sal caotrópica o la adsorción en sílice entre otros, para la conversión del mRNA a cDNA o para la amplificación de los exones 4 y 5 del gen UBE2L3. Método de diagnóstico v tratamiento
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para el diagnóstico y tratamiento de un sujeto que comprende:
(i) diagnosticar en dicho sujeto la presencia de enfermedad celiaca mediante el método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 10 y
(ii) administrar al sujeto diagnosticado con enfermedad celiaca en la etapa (i) un tratamiento adecuado para dicha enfermedad Formas preferidas de realización de la etapa (i) de diagnóstico del presente aspecto se han descrito en detalle en el contexto del método diagnóstico de la invención y son igualmente aplicables al método de diagnóstico y tratamiento.
La expresión “tratamiento adecuado”, en el contexto de la presente invención se refiere principalmente al seguimiento de una dieta libre de gluten, como se ha descrito previamente. Adicionalmente se podrían emplear tratamientos enzimáticos para la degradación y neutralización del gluten o vacunas específicas. Asimismo, se puede valorar el uso de medicamentos que ayuden a mantener la barrera intestinal. En caso de celiaquía refractaria, el tratamiento puede implicar el uso de esteroides.
En una realización particular, el tratamiento es una dieta libre de gluten.
***
La invención se describirá a continuación por medio de los siguientes ejemplos que tienen carácter meramente ilustrativo y no limitativo del ámbito de la invención. EJEMPLOS
Métodos
Por lo general la utilidad clínica de los estudios de asociación de genoma completo (o GWAS, por sus siglas en inglés - genome-wide association studies ) ha sido muy limitada, por lo que es necesario desarrollar estrategias que permitan identificar la variación verdaderamente importante y traducir esos hallazgos en aplicaciones. Por su parte, la Aleatorización Mendeliana (AM) es un método estadístico por el cual se pueden priorizar genes utilizando Información de cómo estos se relacionan con polimorfismos genéticos o SNPs adyacentes y de cómo los SNPs se asocian a su vez a distintos fenotipos (Zhu Z et al., Nat Genet. 2016;48:481-7). Así, la AM permite identificar genes que median la asociación SNP-enfermedad, dotándola de cierta causalidad y de un mecanismo plausible.
Con el fin de priorizar los genes causales implicados en las asociaciones identificadas en distintos estudios GWAS realizados en enfermedad celiaca (EC), se utilizó el software SMR para aplicar la AM (Zhu Z et al., Nat Genet 2016;48:481-7). Más concretamente, se analizaron los resultados del GWAS más grande llevado a cabo en EC (9451 casos vs 16434 controles) (Dubois PC et al., Nat Genet. 2010;42:295-302) y se cruzaron con datos de expresión de genoma completo en relación con genotipo ( expression quantitative trait loci o eQTLs) de la base de datos GTEx (GTEx Consortium. Genetic effects on gene expression across human tissues. Natura. 2017;550:204-13) (p<1e-5), provenientes de sangre (n=122) y de intestino delgado (n=369). También se aplicó el software SMR a los mismos datos de GWAS con la mediación del ADN como posible mediadora en las asociaciones, utilizando para ello la versión Lite de la base de datos de methylation quantitative trait loci (mQTL) de McRae et al (McRae A et al., Identification of 55,000 Replicated DNA Methylation QTL. bioRxiv 166710) (p<1e-5; n=1 ,366), disponible en la página web de SMR
(https://cnsgenomics.eom/software/smr/#DataResource). Por otro lado, se cruzaron los resultados obtenidos a partir de los dos experimentos independientes (SMR con eQTLs y mQTLs), con el fin de dar con SNPs asociados a enfermedad celiaca por medio de la expresión de genes con cambios en sus niveles de mediación. Después, se replicaron los resultados obtenidos con los datos de expresión en sangre por medio de los eQTLs de la base de datos CAGE (Lloyd-Jones LR et al., Am J Hum Genet 2017; 100:228-237) (p<1e-5; n= 2,765), también disponibles en la web anteriormente mencionada.
Todos los análisis se llevaron a cabo con los parámetros por defecto del software SMR, incluyendo el descarte de señales de asociación derivadas del desequilibrio de ligamiento por medio del algoritmo Heidi (p<0.01) y un valor umbral de p empírico menor de 1e-4 para el test SMR, debido a la potencia limitada del estudio derivada sobre todo del tamaño muestral de los estudios eQTL/mQTL utilizados.
Finalmente, se interrogaron los candidatos seleccionados por medio de la priorización de genes vía AM en dos bases de datos totalmente independientes de expresión de genoma completo en células mononucleares de sangre periférica disponibles en GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/): un análisis en la plataforma I Ilumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip en 17 pacientes de EC en dieta sin gluten y 20 controles sin inflamación intestinal (GSE113469) (Sangineto M et al., PLoS One. 2018;13:e0197915), y un estudio en otro tipo de microarray de expresión-Affymetrix Human Ganóme U133A Array de 42 controles, 59 pacientes de Enfermedad de Crohn y 26 de Colitis Ulcerosa (GSE3365) (Burczynski ME et al., J Mol Diagn. 2006;8:51-61). Las comparaciones se llevaron a cabo mediante la aplicación de tests Mann-Whitney U y se construyeron curvas Característica Operativa del Receptor o Receiver Operating Characteristic (ROC), que utilizaron los niveles de expresión de los genes candidato y sus combinaciones como clasificadores binarios. Concretamente, la expresión relativa de UBE2L3 en EC se calculó a partir de las unidades de intensidad del gen house-keeping GAPDH y de las sondas disponibles en el anray de lllumina antes mencionado para UBE2L3 tal y como se indica a continuación:
2L((UBE2L3.1 - UBE2L3.2)/GAPDH) siendo UBE2L3.1=ILMN_1677877 (exón 5 común a todas las variantes génicas) y UBE2L3.2=ILMN_1796830 (exón 4 exclusivo de la variante no-codificante número 2).
Resultados v discusión
El análisis de AM con los datos de eQTLs de intestino delgado de GTEx no dio ningún resultado significativo, mientas que el mismo análisis con los datos de sangre de la misma base de datos resultó en la priorización de tres SNPs, asociados a EC por medio de la expresión de sus genes adyacentes AHSA2, AC007278.2 y UBE2L3 (Tabla 2).
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Tabla 2: Resumen de los resultados obtenidos a partir del análisis de AM en el GWAS celiaco con datos de eQTLs de sangre de GTEx. Además de la localización cromosómica de cada SNP y cada gen, se muestra el tamaño del efecto de cada estudio utilizado (b), así como su valor de p (p).
Sin embargo, cuando se cruzaron estos resultados con los obtenidos a partir de la AM del GWAS celiaco con mQTLs, solamente se mantuvo el SNP rs5754217 situado en el primer intrón de UBE2L3 en el cromosoma 22 (Figura 1). Además, este binomio SNP- gen volvió a pasar el test SMR cuando se utilizaron los eQTLs de sangre de CAGE en lugar de los de GTEx, de manera que se pudo replicar los resultados en un dataset mayor (b=0.165547, error estándar=0.0340045, p=1.13E-06).
Por otro lado, cuando se comparó la expresión en parientes de EC en dieta sin gluten (n=17) con los controles (n=20) del datasat de expresión de ¡Ilumina en células mononudeares de sangre periférica, las dos sondas mostraron comportamientos opuestos pero muy significativos (p<0.0001) (Figura 2A). Además, la construcción de un scora de expresión relativa (tal y como se determina en Métodos) dio lugar a una diferencia aún más grande entre EC y controles (Figura 2B).
Finalmente, se construyeron curvas ROC para valorar el potencial diagnóstico de la expresión de los diferentes exones de UBE2L3 por separado y de la expresión relativa. Se observó que, si bien la expresión Independiente de los exones es un clasificador eficiente (área bajo la curva o area under the curva - AUC=0.997 por sonda), la expresión relativa de UBE2L3 tiene una sorprendente especificidad y sensibilidad del 100% y por tanto, un valor de AUC=1 (Figura 3). Además, esta capacidad de discriminación parece específica de EC ya que no fue observada en un dataset público e Independiente de expresión en células mononudeares de sangre periférica de enfermedad de Crohn y de Colitis Ulcerosa para ninguna de las sondas localizadas en el candidato UBE2L3. No obstante, los valores de AUC resultantes fueron de 0,528- 0,699 y 0,452-0,752 para Crohn y Colitis Ulcerosa, respectivamente. El altísimo potencial predictivo del scora de expresión relativa de UBE2L3 lo sitúa en un lugar privilegiado de cara al desarrollo de un test diagnóstico en sangre periférica que podría eliminar las provocaciones con gluten del diagnóstico de la EC en ausencia de gluten de la dieta.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método in vitro para el diagnóstico de la enfermedad celiaca en un sujeto sospechoso de padecer enfermedad celiaca que comprende cuantificar en una muestra de dicho sujeto el contenido en:
(i) el mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 y/o (¡i) el mRNA total del gen UBE2L3
en donde:
- un nivel reducido del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto a un valor de referencia,
- un nivel elevado del mRNA total del gen UBE2L3 con respecto a un valor de referencia y/o
- un contenido relativo del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto al total de mRNA del gen UBE2L3 elevado con respecto a un valor de referencia
es indicativo de que el sujeto sufre enfermedad celiaca.
2. Método según la reivindicación 1 en donde el valor de referencia se selecciona de:
(i) el contenido en mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 en un sujeto que no sufre enfermedad celiaca o el valor medio del contenido en mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 en una población de sujetos que no sufren enfermedad celiaca,
(¡i) el contenido en mRNA total del gen UBE2L3 en un sujeto que no sufre enfermedad celiaca o el valor medio del contenido en mRNA total del gen UBE2L3 en una población de sujetos que no sufren enfermedad celiaca y/o
(iii) el contenido relativo del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto al total de mRNA del gen UBE2L3 en un sujeto que no sufre enfermedad celiaca o el valor medio del contenido relativo del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto al total de mRNA del gen UBE2L3 en una población de sujetos que no sufren enfermedad celiaca.
3. Método según la reivindicación 1 en donde el contenido relativo del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 con respecto al total de mRNA del gen UBE2L3 se determina mediante la fórmula (I):
SCORE = 2 (cantidad mRNA isoforma 2 UBE2L3 - cantidad mRNA total UBE2L3)
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde los niveles de mRNA de la isoforma 2 del gen UBE2L3 o del mRNA total del gen UBE2L3 se normalizan frente al nivel de un gen de expresión constitutiva.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra en la que se cuantifica el mRNA comprende células mononucleares de sangre periférica.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 se determina mediante el empleo de una sonda que híbrida de forma específica con una región del exón 4 del gen UBE2L3 y/o en donde el mRNA total del gen UBE2L3 se determina mediante el empleo de una sonda que híbrida de forma específica con una región del exón 5 del gen UBE2L3.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde la cuantificación del mRNA que codifica la isoforma 2 del gen UBE2L3 se lleva a cabo mediante cuantificación del cDNA cuya secuencia viene definida mediante número de acceso del NCBI NR_028436.2 de la versión del 4 de diciembre de 2018.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la cuantificación del mRNA total del gen UBE2L3 se lleva a cabo mediante la cuantificación de la suma de los niveles de los mRNA de las isoformas 1 a 5 del gen UBE2L3 con números de acceso del NCBI NM_003347.3 del 11 de noviembre de 2018, NM_001256, NR_028436 del 4 de diciembre de 2018, NM_001256356.1 del 11 de noviembre de 2018, NM_001253655.4 del 11 de noviembre de 2018 y NR_046082.1 del 4 de diciembre de 2018 respectivamente.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde la cuantificación del ARNm se realiza mediante un microarray de expresión.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde el sujeto sospechoso de padecer enfermedad celiaca sigue una dieta sustancialmente libre de gluten.
11. Kit para la puesta en práctica de un método tal y como se define en las reivindicaciones 1 a 10 que comprende:
(i) Una sonda que híbrida específicamente con el exón 4 del gen UBE2L3,
(ii) Una sonda que híbrida específicamente con el exón 5 del gen UBE2L3 y, opcionalmente
(iii) Una sonda que híbrida de forma específica con un gen de expresión constitutiva
en donde los componentes (i) y (ii) constituyen al menos un 1% del total de las sondas presentes en el kit.
12. Kit de acuerdo a la reivindicación 11 que comprende adicionalmente uno o más componentes seleccionados del grupo formado por
(i) Medios para la purificación de ARN a partir de una muestra de células,
(ii) Medios para la transcripción inversa de una preparación de ARNm y
(iii) Medios para amplificación de los exones 4 y 5 del gen UBE2L3.
13. Método para el diagnóstico y tratamiento de un sujeto que comprende:
(i) diagnosticar en dicho sujeto la presencia de enfermedad celiaca mediante el método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 10 y
(ii) administrar al sujeto diagnosticado con enfermedad celiaca en la etapa (i) un tratamiento adecuado para dicha enfermedad.
14. Método según la reivindicación 13 en donde el tratamiento es una dieta libre de gluten.
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