WO2020179405A1 - 遺伝子型解析装置及び方法 - Google Patents

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genotyping
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満 藤岡
恵佳 奥野
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    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR

Definitions

  • the present invention relates to a genotyping apparatus and method using electrophoresis.
  • DNA analysis by analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) polymorphism is currently widely used for the purpose of criminal investigation and determination of blood-related relationships.
  • DNAs of organisms of the same species have almost similar base sequences, but in some places have different base sequences.
  • Such diversity of nucleotide sequences on DNA between individuals is called DNA polymorphism and is involved in the formation of individual differences at the gene level.
  • STR Short Tandem Repeat
  • microsatellite microsatellite.
  • STR is a characteristic sequence pattern in which a short sequence having a length of about 2 to 7 bases is repeated several to several tens of times, and it is known that the number of repetitions differs depending on an individual. Analyzing the combination of the repeat numbers of STR at the locus of a specific gene is called STR analysis.
  • STR analysis In DNA testing for the purpose of criminal investigation, STR analysis is used, which utilizes the property that the combination of the number of repetitions of STR differs between individuals.
  • the FBI Federal Bureau of Investigation
  • the International criminal police Organization define 10 to 10 STR locus (locus) used for DNA testing as DNA markers, and analyze the pattern of the number of repetitions of these STR sequences. Since the difference in the number of STR repeats appears due to the difference in alleles (Allele), hereinafter, the number of STR repeats in each DNA marker is referred to as an allele.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • a fixed amount of target DNA sample is obtained by repeatedly amplifying only the DNA fragment sandwiched between the primer sequences by designating a fixed base sequence called a primer sequence at both ends of the target DNA. It is a technology to acquire.
  • Electrophoresis is performed to measure the fragment length of the target DNA fragment obtained by this PCR. Electrophoresis is a method for separating a DNA fragment by utilizing the fact that the migration rate in a charged migration path differs depending on the length of the DNA fragment, and the longer the migration path, the lower the migration rate. As a method of electrophoresis, capillary electrophoresis using a capillary as a migration path has been widely used in recent years.
  • capillary electrophoresis a thin tube called a capillary is filled with an electrophoresis medium such as gel, and a sample DNA fragment is electrophoresed in this capillary. Then, the length of the DNA fragment is examined by measuring the time required for the sample to migrate a certain distance, usually from end to end of the capillary.
  • Each sample i.e. each DNA fragment, is labeled with a fluorescent dye and an optical detector located at the end of the capillary detects the fluorescent signal of the electrophoresed sample.
  • the migration speed of DNA fragments varies depending on the environment such as migration medium, reagent performance, device temperature and migration voltage value. If the migration rate changes, the measured DNA fragment size will differ, making it impossible to accurately identify the allele. Therefore, a standard reagent called an allelic ladder is generally used for the purpose of accurately identifying the allele with respect to the fluctuation of the migration speed. As will be described later, the allele ladder is an artificial sample containing many alleles that may be generally contained in DNA markers, absorbs fluctuations in migration rate, and corresponds to the allele and DNA fragment length. You can fine-tune the relationship.
  • this allelic ladder is provided by a reagent manufacturer as a reagent kit for DNA evaluation. Since the migration speed fluctuations due to environmental changes accumulate over time, STR analysis recommends that allelic ladders be used at a certain frequency.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and provides a genotype analysis apparatus and method capable of reducing the frequency of using an allelic ladder and reducing the analysis cost of STR analysis. Is.
  • an electrophoresis device that obtains a spectrum by electrophoresis and a data analysis device that obtains the base length of DNA based on the spectrum and analyzes the genotype with reference to the standard base length.
  • the data analysis device provides a genotype analysis device having a configuration including a mobility model management unit that predicts a correspondence between a standard base length and an actually measured base length based on environmental information in electrophoresis.
  • the present invention is a genotype analysis method using a data analysis device, and the data analysis device obtains a standard base length and an electrophoresis based on environmental information in electrophoresis.
  • a genotype analysis method for predicting the correspondence with the actually measured base length of DNA obtained based on the obtained spectrum is provided.
  • the usage frequency of the allelic ladder can be reduced, STR analysis can be realized at low cost.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a genotype analysis device according to Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of an electrophoretic device according to Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing a processing flow of the genotype analysis apparatus according to Example 1.
  • 5 is a diagram showing a flow of electrophoresis processing according to Example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the example of the fluorescence intensity waveform of a real sample. It is a figure for explaining the outline of Gaussian fitting.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining an overview of Size Calling according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram showing a schematic configuration of a STR analysis unit according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing a processing flow of Allele Calling according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing a correspondence relationship table (Look Up Table: LUT) according to the first embodiment. It is a figure which shows the example of the fluorescence intensity waveform of an allelic ladder.
  • FIG. 7 is a diagram showing a first example of LUT update according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the concept of a prediction model according to the first embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram for explaining the concept of a decision tree according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the concept of allele base length correction according to Example 1.
  • FIG. 8 is a diagram showing a second example of LUT update according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining the concept of allele identification according to the first embodiment.
  • FIG. 9 is a diagram showing a schematic configuration of a STR analysis unit according to a second embodiment.
  • FIG. 8 is a diagram showing a processing flow of the genotype analysis apparatus according to Example 2.
  • FIG. 9 is a diagram showing a processing flow of prediction model learning according to the second embodiment.
  • FIG. 8 is a diagram showing the concept of a learning data set according to the second embodiment. It is a figure which shows the processing flow of AlleleCalling by Example 3.
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of positive control information according to the third embodiment.
  • Example 1 includes an electrophoresis device that obtains a spectrum by electrophoresis and a data analysis device that obtains the base length of DNA based on the spectrum and analyzes the genotype with reference to the standard base length.
  • a genotype analysis device including a mobility model management unit that predicts the correspondence between a standard base length and an actually measured base length based on environmental information in electrophoresis.
  • the present example is a genotype analysis method using a data analysis device, and the data analysis device determined based on the standard base length and the spectrum obtained by electrophoresis based on environmental information in electrophoresis. It is an example of a genotype analysis method for predicting a correspondence with an actually measured base length of DNA.
  • FIG. 1 shows the configuration of the genotype analyzer of Example 1.
  • the genotype analysis device 101 is composed of a data analysis device 112 and an electrophoresis device 105.
  • the data analysis device 112 uses a central control unit 102 that controls electrophoresis and data processing, and a display unit to present and input information to the user, such as a list of applicable prediction models that will be described later.
  • a user interface unit 103 for inputting information from a user using the unit and a storage unit 104 for storing data and device setting information. Further, when the data analysis device 112 is connected to the external server 111 via the network, it becomes possible to send and receive various data such as prediction model data between the two.
  • the central control unit 102 includes a sample information setting unit 106, an electrophoresis device control unit 108, a fluorescence intensity calculation unit 110, a peak detection unit 107, and a STR analysis unit 109.
  • FIG. 8 shows a block configuration in the STR analysis unit 109.
  • the STR analysis unit 109 includes a SizeCall unit 121, a mobility model management unit 122, and an AlleleCall unit 123.
  • the mobility model management unit 122 includes an environmental information receiving unit 124, a prediction model storage unit 125, and a mobility prediction unit 126. Each function will be described later.
  • FIG. 2 is a schematic view of the electrophoresis apparatus 105.
  • the configuration of the electrophoresis apparatus 105 will be described with reference to FIG.
  • the electrophoresis apparatus 105 includes a detection unit 216 for optically detecting a sample, a constant temperature bath 218 for keeping the capillary at a constant temperature, a conveyor 225 for transporting various containers to the cathode end of the capillary, and a high voltage on the capillary.
  • High-voltage power supply 204 for adding, first ammeter 205 for detecting the current emitted from the high-voltage power supply, second ammeter 212 for detecting the current flowing through the anode side electrode 211, one or more capillarys 202 And a pump mechanism 203 for injecting a polymer into the capillaries.
  • the capillary array 217 is a replacement member including a plurality of (for example, eight) capillaries, and includes a load header 229, a detection unit 216, and a capillary head 233.
  • the capillaries are damaged or their quality is deteriorated, the capillaries are replaced with new ones.
  • Capillaries are composed of glass tubes with an inner diameter of several tens to several hundreds of microns and an outer diameter of several hundreds of microns, and the surface is coated with polyimide to improve strength.
  • the light irradiation portion irradiated with the laser light has a structure in which the polyimide coating is removed so that the light emission inside is easily leaked to the outside.
  • the inside of the capillary 202 is filled with a separation medium for giving a migration speed difference during electrophoresis. Although the separation medium has both fluidity and non-fluidity, a fluid polymer is used in this embodiment.
  • the detection unit 216 is a member that acquires information depending on the sample.
  • the detection unit 216 When the detection unit 216 is irradiated with the excitation light from the light source 214, the sample emits fluorescence having a wavelength depending on the sample, which is information light, and is emitted to the outside. This information light is dispersed in the wavelength direction by the diffraction grating 232, and the dispersed information light is detected by the optical detector 215 to analyze the sample.
  • the end 227 of the capillary cathode is fixed through a hollow metal electrode 226, and the tip of the capillary is projected about 0.5 mm from the hollow electrode 226. Further, all hollow electrodes provided for each capillary are integrally attached to the load header 229. Further, all the hollow electrodes 226 are electrically connected to the high-voltage power source 204 mounted on the main body of the apparatus, and act as a cathode electrode when it is necessary to apply a voltage such as electrophoresis or sample introduction.
  • the capillary end (the other end) opposite to the capillary cathode end side 227 is bundled into one by the capillary head 233.
  • the capillary head 233 can be connected to the block 207 with a pressure-proof confidentiality.
  • the high voltage generated by the high voltage power supply 204 is applied between the load header 229 and the capillary head 233.
  • the syringe 206 fills the capillary with the new polymer from the other end.
  • the refilling of the polymer in the capillaries is performed for each measurement to improve the performance of the measurement.
  • the pump mechanism 203 includes a syringe 206 and a mechanism system for pressurizing the syringe. Further, the block 207 is a connecting portion for connecting the syringe 206, the capillary array 217, the anode buffer container 210, and the polymer container 209, respectively.
  • the optical detection unit that detects the information light from the sample is composed of a light source 214 for irradiating the detection unit 216 described above, an optical detector 215 for detecting light emission in the detection unit 216, and a diffraction grating 232. There is.
  • the light source 214 irradiates the detection unit 216 of the capillary, the light emitted from the detection unit 216 is separated by the diffraction grating 232, and detected by the optical detector 215.
  • the constant temperature bath 218 is covered with a heat insulating material in order to keep the inside of the constant temperature bath at a constant temperature, and the temperature is controlled by the heating / cooling mechanism 220.
  • the fan 219 circulates and agitates the air in the constant temperature bath to keep the temperature of the capillary array 217 positionally uniform and constant.
  • the carrier 225 is equipped with three electric motors and a linear actuator, and can move in three axes in the vertical, horizontal, and depth directions. Further, at least one container can be placed on the moving stage 230 of the carrier 225. Further, the moving stage 230 is provided with an electric grip 231 so that each container can be grasped and released. Therefore, the buffer container 221, the cleaning container 222, the waste liquid container 223, and the sample container 224 can be transported to the capillary cathode end 227, if necessary. Unnecessary containers are stored in a predetermined housing in the device.
  • the electrophoretic device 105 is used while being connected to the data analysis device 112 with a communication cable.
  • the data analysis device 112 enables the operator to control the functions of the device and exchange the data detected by the detector in the device.
  • the electrophoretic device 105 may have a sensor for acquiring environmental information that may affect electrophoresis.
  • a sensor for acquiring environmental information As an example, an in-apparatus sensor 240, a polymer sensor section 241, and a buffer solution sensor 242 are shown in FIG.
  • the in-device sensor unit 240 is a sensor group for acquiring environmental information in the device, and examples thereof include temperature, humidity, and atmospheric pressure in the device.
  • the polymer sensor unit 241 is a sensor group for acquiring information regarding the quality of the polymer, and examples thereof include a PH sensor and an electric conductivity sensor.
  • the polymer sensor unit 241 is shown in FIG. 2 as an example installed in the polymer container 209, but is not limited to this position.
  • the buffer solution sensor unit 242 is a sensor group for acquiring information on the quality of the buffer solution, and a temperature sensor is an example. Although the buffer solution sensor unit 242 is shown in FIG. 2 as an example installed in the anode buffer container 210, the buffer solution sensor unit 242 is not limited to this position. It may also be set in the buffer container 221.
  • an actual sample to be analyzed is subjected to electrophoresis (step, hereinafter S301).
  • S302 the fluorescence intensity of each fluorescent dye is calculated from the spectral waveform data obtained by electrophoresis.
  • S303 the peak is detected from the waveform of the fluorescence intensity.
  • S304 the correspondence between the time and the DNA fragment length is obtained by mapping the obtained peak time with the information on the known DNA fragment length of the size standard. This process is called Size Calling.
  • S305 an allele is identified from the length of each obtained DNA fragment. This process is called Allele Calling.
  • FIG. 4 shows a flow of the electrophoresis process of the actual sample in S301.
  • the basic procedure of electrophoresis can be roughly divided into sample preparation (S401), analysis start event (S402), electrophoresis medium filling (S403), preliminary electrophoresis (S404), sample introduction (S405), and electrophoresis analysis (S406). ..
  • the operator of this device sets samples and reagents in this device as sample preparation (S401) before the start of analysis. More specifically, first, the buffer container 221 and the anode buffer container 210 are filled with a buffer solution that forms a part of the energization path.
  • the buffer solution is, for example, an electrolyte solution commercially available for electrophoresis from various companies.
  • the sample to be analyzed is dispensed into the wells of the sample plate 224.
  • the sample is, for example, a DNA PCR product.
  • a cleaning solution for cleaning the capillary cathode end 227 is dispensed into the cleaning container 222.
  • the cleaning solution is pure water, for example.
  • an electrophoretic medium for electrophoresing the sample is injected into the syringe 206.
  • the electrophoretic medium is, for example, a polyacrylamide-based separation gel or a polymer commercially available for electrophoresis from various companies. Further, when deterioration of the capillaries 202 is expected or when the length of the capillaries 202 is changed, the capillary array 217 is replaced.
  • the samples set on the sample plate 224 include the actual sample of DNA to be analyzed, the positive control, the negative control, and the allelic ladder, which are electrophoresed in different capillaries.
  • the positive control is, for example, a PCR product containing a known DNA, and is a sample for a control experiment for confirming that the DNA is correctly amplified by PCR.
  • the negative control is a PCR product that does not contain DNA, and is a sample for a control experiment for confirming that contamination such as operator DNA and dust does not occur in the amplified product of PCR.
  • Allelic ladder is an artificial sample containing many alleles that may be commonly contained in DNA markers, and is usually provided by reagent manufacturers as a reagent kit for DNA testing.
  • the allelic ladder is used for the purpose of finely adjusting the correspondence between the DNA fragment length of each DNA marker and the allele. Allelic ladder will be described later.
  • a known DNA fragment labeled with a specific fluorescent dye called a size standard is mixed with all of the above-mentioned actual samples, positive control, negative control, and allelic ladder samples.
  • the type of fluorescent dye assigned to the size standard differs depending on the reagent kit used. For example, in the size standard reagent illustrated in (a) of FIG. 7, it is assumed that a known DNA fragment having a length between 80 bp and 480 bp is labeled with the fluorescent dye LIZ.
  • the size standard is mixed in all capillary samples for the purpose of obtaining the correspondence between the scan time and the DNA fragment length in Size Calling described later.
  • the operator specifies the type of allelic ladder, the type of size standard, the type of fluorescent reagent, the type of sample set in the well on the sample plate 224 corresponding to each capillary, and the like. In the present embodiment, any one of actual sample, positive control, negative control, and allelic ladder is designated as the sample type.
  • the setting of these pieces of information is set in the sample information setting unit 106 on the data analysis device 112 via the user interface unit 103.
  • the operator operates the user interface unit 103 on the data analysis device 112 to instruct the start of analysis.
  • This analysis start instruction is passed to the electrophoresis apparatus control unit 108.
  • the electrophoresis apparatus control unit 108 sends an analysis start signal to the electrophoresis apparatus 105, and the analysis is started (S402).
  • filling of the electrophoretic medium (S403) is started. This step may be performed automatically after the analysis is started, or may be performed by sequentially transmitting a control signal from the electrophoresis device control unit 108.
  • Filling the migration medium is a procedure for filling the capillary 202 with a new migration medium to form migration channels.
  • the waste liquid container 223 is carried directly under the load header 229 by the conveyor 225, the solenoid valve 213 is closed, and the used migration medium discharged from the capillary cathode end 227 is transferred. Make it acceptable. Then, the syringe 203 is driven to fill the capillary 202 with a new migration medium, and the used migration medium is discarded. Finally, the capillary cathode end 227 is immersed in the cleaning solution in the cleaning container 222, and the capillary cathode end 227 contaminated with the electrophoresis medium is washed.
  • preliminary migration (S404) is performed. This step may be performed automatically, or may be performed by sequentially transmitting a control signal from the electrophoresis apparatus control unit 108.
  • the pre-electrophoresis is a procedure of applying a predetermined voltage to the electrophoretic medium to bring the electrophoretic medium into a state suitable for electrophoresis.
  • the carrier cathode 225 is immersed in the buffer solution in the buffer container 221 with the capillary cathode end 227 to form an energization path.
  • the high-voltage power supply 204 applies a voltage of several to several tens of kilovolts to the migration medium for several to several tens of minutes to bring the migration medium into a state suitable for electrophoresis.
  • the capillary cathode end 227 is immersed in the cleaning solution in the cleaning container 222, and the capillary cathode end 227 contaminated with the buffer solution is washed.
  • sample introduction is performed. This step may be performed automatically or may be performed by sequentially transmitting a control signal from the electrophoresis device control unit 108.
  • sample introduction sample components are introduced into the migration path.
  • the capillary cathode end 227 is immersed in the sample held in the well of the sample plate 224 by the conveyor 225, and then the solenoid valve 213 is opened. As a result, an energization path is formed and the sample component is introduced into the migration path. Then, a pulse voltage is applied to the energization path by the high-voltage power supply 204, and the sample component is introduced into the migration path.
  • the capillary cathode end 227 is dipped in the cleaning solution in the cleaning container 222 to clean the capillary cathode end 227 contaminated with the sample.
  • electrophoresis analysis (S406) is performed. This step may be performed automatically, or may be performed by sequentially transmitting a control signal from the electrophoresis apparatus control unit 108.
  • each sample component contained in the sample is separated and analyzed by electrophoresis.
  • the carrier cathode 225 is used to immerse the capillary cathode end 227 in the buffer solution in the buffer container 221 to form a current path.
  • a high voltage of about 15 kV is applied to the energization path by the high voltage power supply 204 to generate an electric field in the migration path.
  • each sample component in the migration path moves to the detection unit 216 at a speed depending on the property of each sample component. That is, the sample components are separated by the difference in their moving speeds. Then, the sample components reaching the detection unit 216 are sequentially detected. For example, when the sample contains a large number of DNAs having different base lengths, a difference in moving speed occurs depending on the base lengths, and the DNAs having shorter base lengths reach the detection unit 216 in order. A fluorescent dye depending on the terminal base sequence is attached to each DNA.
  • the detection unit 216 is irradiated with excitation light from the light source 214, information light, that is, fluorescence having a wavelength dependent on the sample is generated from the sample and emitted to the outside.
  • This information light is detected by the optical detector 215.
  • the optical detector 215 detects this information light at regular time intervals and transmits the image data to the data analysis device 112.
  • the luminance of only a part of the image data may be transmitted instead of the image data.
  • a brightness value sampled only at wavelength positions at regular intervals may be transmitted.
  • This brightness value data represents the spectral waveform of each capillary. This spectrum waveform is stored in the storage unit 104.
  • the intensity of each fluorescent dye is calculated (S302) from the image data obtained by the electrophoretic processing (S301) of FIG. 3 described above.
  • This fluorescence intensity calculation process is performed by the fluorescence intensity calculation unit 110 in FIG.
  • the fluorescence intensity calculation process (S302) assuming that the spectral waveform data stored in the storage unit 104 in S301 is sampled at ⁇ (0) to ⁇ (19), that is, at the 20 wavelength position, the fluorescence intensity of each dye is different. It is calculated by multiplying the intensity ratio of each fluorescent dye at the wavelength and adding them together. If this is expressed in a matrix, it becomes as shown in (Equation 1).
  • the vector c is a fluorescence intensity vector, and its elements c F , c V , c N , c P , and c L represent the fluorescence intensities of 6FAM, VIC, NED, PET, and LIZ, respectively. ing.
  • the vector f is a measured spectrum vector, and its elements f 0 to f 19 represent signal intensities (luminance values) at wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19), respectively.
  • the elements f 0 to f 19 may be arithmetic averages of signal intensities in the vicinity of the wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19), respectively.
  • the measurement signals of individual wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19) detected by the optical detector 215 are based on Raman scattered light from the polymer filled in the capillary in addition to the signal by the fluorescent dye. It is included as a line signal. Therefore, it is necessary to remove this baseline signal in advance when calculating the vector f.
  • the baseline signal is removed by applying a high-pass filter that removes low-frequency components to the measurement signals of each wavelength from ⁇ (0) to ⁇ (19). You may. Alternatively, the minimum value in the vicinity of each time may be used as the baseline signal value at that time.
  • Matrix M is a matrix that converts the measurement spectrum f into a fluorescence intensity vector, and its elements correspond to the intensity ratio of each fluorescent dye at each wavelength. The higher the value of this intensity ratio, the higher the contribution of the fluorescent dye to the intensity at that wavelength.
  • Matrix M is originally determined centrally by the type of fluorescent dye and the conditions of the migration path, but in reality it can fluctuate depending on the positional relationship between the capillary and the detector, so when replacing the capillary, etc. Need to calculate.
  • Spectral calibration is a series of processes for obtaining this matrix M. Spectral calibration is generally performed by subjecting a sample called a matrix standard to electrophoresis.
  • a matrix standard is a reagent for performing electrophoresis for the purpose of obtaining a fluorescence spectrum and obtaining the above-mentioned matrix.
  • the matrix may be calculated based on the electrophoretic data of the actual sample to be measured without using the above matrix standard.
  • the present embodiment is not limited to spectral calibration, but it is assumed that the above matrix is obtained in advance.
  • Fig. 5 shows an example of the fluorescence intensity waveform of the actual sample obtained in S302 after electrophoresis (S301).
  • the time at which the peak of each fluorescence intensity stands corresponds to the length of the DNA fragment labeled with each fluorescent dye, and this difference in length corresponds to the difference in alleles.
  • one or two peaks are included for each DNA marker. When there is one peak, the fluorescence intensity of that peak is higher than that of the marker with two peaks. You can see that it is getting higher.
  • One peak means homozygous (father-derived allele and mother-derived allele are the same), and two peaks mean heterozygotes (father-derived allele and mother-derived allele are different). There is.
  • FIG. 5 shows an example in which one person contributes to the DNA of the sample, and if the sample is a mixed sample in which DNAs of a plurality of people are mixed, one DNA marker is added according to the contribution rate of the plurality of people. However, there may be three or more peaks.
  • peak detection is performed on the above fluorescence intensity waveform obtained by the fluorescence intensity calculation process (S302) in FIG.
  • peak detection the center position of the peak (peak time), the height of the peak, and the width of the peak are important.
  • the central position of the peak corresponds to the DNA fragment length and is the most important for the discrimination of alleles.
  • the height of the peak is used for identifying homozygous/heterozygous and for quality evaluation of the DNA concentration in the sample.
  • the width of the peak is also important in assessing the quality of the sample and electrophoresis results.
  • Gaussian fitting which is a known technique, can be used as one of the methods for estimating the peak parameter of such actual data.
  • Figure 6 shows the concept of Gaussian fitting.
  • Gaussian fitting calculates parameters (mean value ⁇ , standard deviation ⁇ , and maximum amplitude value A) so that the Gaussian function g best approximates the actual data for a certain interval. It is a process to do.
  • the least square error between the actual data and the Gaussian function value is often used as an index indicating the degree of approximation of the actual data.
  • parameters can be optimized by using a conventional method such as the Gauss-Newton method.
  • a method for improving accuracy such as a case where two or more peak waveforms are mixed or a case where data around a peak is asymmetrical, as disclosed in Patent Document 2, is applied. Good. Then, if the variance ⁇ of the Gaussian function g is determined, its full width at half maximum (FWHM: Full Width at Maximum) can be obtained by the formula shown in FIG. This value can be used as the peak width.
  • FWHM Full Width at Maximum
  • peak parameters are calculated for the fluorescent intensity waveforms of all fluorescent dyes. At this time, if the peak width and the peak height do not satisfy the predetermined threshold condition, they may be excluded from the peak.
  • Size Calling is a process of associating the time required for a DNA fragment to be detected by electrophoresis with the base length of the DNA fragment (hereinafter referred to as DNA base length), and in this embodiment, data analysis is performed. This is performed by the Size Call unit 121 in the STR analysis unit 109 shown in FIG. 8 in the apparatus 112. Specifically, as described above, electrophoresis is performed on a reagent containing a DNA fragment of a known length, which is called a size standard, and which is labeled with a specific fluorescent dye. For example, in the size standard reagent illustrated in FIG.
  • known DNA fragments with lengths between 80 bp and 480 bp are labeled with the fluorescent dye LIZ.
  • a known DNA fragment length is associated with the center position of the peak obtained by the above-described peak detection (S303), that is, the peak time.
  • S303 peak detection
  • a known dynamic programming method or the like is used for this association. From the combination of these peak times and the known DNA base length, the correspondence equation between the electrophoresis time and the DNA base length can be obtained.
  • a quadratic expression, a cubic expression, or the like may be used as f(t), and an approximation that minimizes the squared error may be performed.
  • the user may specify to the STR analysis unit 109 via the user interface unit 103 what kind of approximate expression should be used.
  • Allele Calling is a process of identifying an allele from the DNA base length of each peak obtained by the Size Calling process, and in this embodiment, the STR analysis unit 109 shown in FIG. 8 in the data analysis device 112. It is performed by the mobility model management unit 122 and the Allele Call unit 123 in the inside.
  • FIG. 9 is a flowchart showing the processing flow of Allele Calling processing (S305).
  • the Allele Calling process in this embodiment is characterized in that environmental information acquisition (S901) and correction length prediction (S902) are performed before LUT update (S903) as in the conventional case.
  • the LUT 113 shown in FIG. 10 corresponds to the locus name (Locus) labeled by each fluorescent dye (Dye), the allele name (Allele) contained in the locus, and the allele as basic information of the allele ladder. It has information on the DNA base length (Length) to be used and the allowable base length width (Min / Max) from the center position of each allele.
  • the DNA marker (Locus) D10S1248 is labeled with 6FAM and includes 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 as its alleles, which are standard.
  • the DNA base length (unit: bp) is 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 109, 113, 117, respectively. It shows that all alleles have a tolerance of plus 0.5 bp and minus 0.5 bp. As described above, it is premised that the AlleleCall unit 123 has a LUT of each individual allele and its standard DNA base length in advance.
  • the standard DNA base length contained in this LUT113 is only a standard one, and is generally different from the base length of the allele obtained by actually electrophoresis and measuring the sample. Therefore, usually, the length of each allele measured by electrophoresis of an allelic ladder reagent is measured.
  • Fig. 11 shows an example of the fluorescence intensity waveform obtained by electrophoresis of an allelic ladder.
  • this waveform each allele of the DNA marker in each fluorescent dye appears as a peak.
  • the base length of each allele obtained in this way is matched with the standard base length of LUT113 in FIG. 10, and the correction length with respect to the standard base length is stored inside in addition to the above LUT.
  • An example of the LUT to which this correction length is added is shown in FIG.
  • the standard base lengths of alleles 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, and 18 are 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, and 109, respectively.
  • 113, 117, and the base length is actually measured by adding the correction lengths of 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1.1, 1.1, 1.1, 1.1, 1.2, and 1.2 (Offset column in the figure), respectively. It is shown that the base length of the allele is.
  • the above-mentioned matching may be performed using a known dynamic programming method as in the case of Size Calling described above.
  • a case where a noise peak is included in the detected peak or a peak detection failure may occur.
  • a matching algorithm that considers such peak insertion and omission may be used.
  • the distance between the standard base length and the base length of each peak, the peak interval, etc. are used to associate each peak with each allele of the allele ladder. You can go.
  • Fig. 15 shows the concept of correcting the base length of an allele.
  • the base length of the allele (corrected base) actually measured by adding the obtained correction length d (i) to the standard base length p (i) of each allele. Long) q(i) is obtained.
  • environmental information acquisition (step 901) is performed. This process is performed by the environmental information acquisition unit 124.
  • the environmental information acquisition unit 124 receives the environmental information regarding the electrophoretic conditions from the electrophoretic device 105.
  • the environmental information is various information related to electrophoresis that can be observed by the apparatus.
  • Specific examples of environmental information include the temperature, humidity, and pressure inside the device acquired by the sensor section 420 in the device, the temperature of the buffer solution measured by the buffer solution sensor 422, and the electrical conductivity of the polyma measured by the ammeter sensor section 421.
  • the voltage of the high voltage source 204 the current value measured by the first ammeter 205 and the second ammeter 212, the frequency of use of the polymer and buffer, the number of days elapsed, the lot number, the number of times the capillary is used, etc. Information about the consumables in.
  • these environmental information are information related to the characteristics of electrophoresis. It is desirable to experimentally observe that the environmental information contributes to the improvement of the prediction accuracy of the base correction length, which will be described later, and then it is desirable to select it. However, there is a possibility that the characteristics of the device may change and the environmental information useful for prediction may change. Therefore, as the data to be stored in the device, it is desirable to acquire and store as much environmental information as possible that is estimated to be related to electrophoresis. Among them, it is desirable that what kind of environment information is used for prediction can be changed when the prediction model is generated, as described later.
  • environmental information it is assumed that the environmental temperature and the time series data of the current measured by the second ammeter 212 are used.
  • the disclosed technology according to the present invention is not necessarily limited to such environmental information, and can be applied to any environmental information available from the device.
  • environmental information may be stored in the data file and stored in the storage unit 104 together with the data of the spectral waveform obtained by electrophoresis.
  • the mobility prediction unit 126 of the mobility model management unit 122 in this embodiment performs the correction length prediction (S902).
  • the correction length prediction is a process of predicting the correction length with respect to the standard base length of each allele in the allelic ladder, as described above.
  • the correction length of each allele is predicted based on the environment information described above.
  • the mobility prediction unit 126 performs the above prediction using the prediction model stored in the prediction model storage unit 125.
  • FIG. 13 shows the concept of the correction length prediction based on the prediction model in the mobility prediction unit 126.
  • the prediction model is a model in which a set of a vector v of environmental information values and an arbitrary base length p is input and a corrected length d at the base length p is output. It is known that in electrophoresis, generally, the higher the temperature and the higher the current value, the faster the migration speed. It is also known that the characteristics of change in migration velocity are different depending on whether the base length is short or long.
  • a prediction model that reflects such a tendency is created in advance based on measurement of actual data and stored in the prediction model storage unit 125. It is assumed that this predictive model is measured in advance by the device manufacturer before shipment of the genotype analysis device, or measured by service engineers when the device is installed and stored in the device. In addition, the prediction model information may be added from the outside in response to addition of reagents or version upgrade. Further, as described in Example 2, it is preferable that this prediction model is created after learning based on the DNA fragment length of each allele obtained by actually performing electrophoresis on the allelic ladder.
  • ⁇ Parametric model> A simple example as a parametric model is a linear regression model as shown in Equation 2.
  • Equation 2 the model is expressed by the parameter ⁇ , where the environmental temperature at a certain base length x is t and the current value is c as the environmental information v.
  • Expression 2 is expressed as follows.
  • Equation 3 defining the basis function ⁇ k (x) appropriately, and defining it as in Equation 4.
  • Expressions 2 to 4 use the input vector x and the parameter ⁇ as three-dimensional inputs. However, when the number of elements of environment information is increased in order to improve the accuracy of prediction, the input vector x and the parameter ⁇ It is possible to increase the dimension.
  • Nonparametric model can also be used when suitable prediction cannot be performed with the above parametric model.
  • Examples of non-parametric models include known decision trees. That is, the prediction value for the input vector is determined using the tree-structured inference rule.
  • FIG. 14 shows a conceptual diagram of prediction by a decision tree. As shown in the figure, in the decision tree, the input data, base length p, environmental temperature t, and current c, starts from the root node and is finalized by a combination of rules whether or not the conditions in each node are satisfied. Determine a predictive value d.
  • ⁇ may be modeled using a known machine learning algorithm such as a random forest that combines the above decision trees, a related vector machine (RVM), or a neural network.
  • a known machine learning algorithm such as a random forest that combines the above decision trees, a related vector machine (RVM), or a neural network.
  • the above prediction model is not unique, and a plurality of prediction models may be created, and the mobility prediction unit 126 may appropriately select the prediction model according to the conditions.
  • the items for which it is preferable to use multiple prediction models are listed below. It is desirable that the prediction model is created for each fluorescent dye. This is because the characteristics of DNA mobility are different for each fluorescent dye. It is desirable that the prediction model is created for each type of genetic analysis panel. This is because the type of locus of allelic ladder and the characteristics of DNA mobility differ depending on the reagent. It is desirable that the prediction model is created for each type of polymer. This is because the mobility characteristics of DNA differ depending on the type of polymer.
  • a prediction model may be created for each condition according to the environmental conditions. Examples are listed below. Predictive models that are divided into different temperature conditions, such as a predictive model applied when the environmental temperature is low and a predictive model applied when the environmental temperature is high, may be prepared. A prediction model for high voltage, a prediction model for low voltage, and the like may be prepared according to the voltage. A prediction model when the number of times of use is large, a prediction model when the number of times of use is small, and the like may be prepared according to the frequency of use of the buffer solution and the number of times of use. A prediction model may be prepared according to the number of times of use of consumables such as capillaries and the number of elapsed days.
  • an appropriate prediction model may be selected from a plurality of prediction models as described above according to the application conditions of the prediction model.
  • the operator may be presented with a list of applicable prediction models via the user interface 103 so that the operator can set the priority of the prediction model to be applied.
  • the operator may be presented with a list of applicable prediction models via the user interface 103, from which the operator can set the priority of the applied prediction models.
  • a list of applicable prediction models may be presented to the operator via the user interface 103 so that the operator can select the model to be applied from the list.
  • LUT update processing (S903) is performed (FIG. 9).
  • the correction length of the base lengths of all alleles in the LUT obtained in S902 is stored in the LUT.
  • the existing correction length (Offset column in the figure) may be overwritten.
  • the correction length may be newly added and updated while leaving the existing correction length.
  • the LUT is updated based on the correction length obtained by actually measuring the allele ladder, whereas in this embodiment, the LUT is updated based on the environmental information and the base length of each allele.
  • the predicted length is used to predict the corrected length for the base length of each allele, and the LUT is updated based on this prediction result. This makes it possible to obtain LUT information close to the actual sample measurement without using the allelic ladder.
  • an allele identification process (S904) is performed.
  • the allele identification process the allele corresponding to each peak is identified from the DNA base length of the measured peak of the actual sample with reference to the LUT whose correction length is determined as described above. That is, it corresponds to identifying which of the alleles contained in the allele ladder shown in FIG. 11 each peak of the fluorescence intensity waveform of the actual sample to be analyzed shown in FIG. 5 corresponds to.
  • FIG. 12 An example of allele identification processing is shown with reference to FIG.
  • the figure shows an example of identifying the allele of the locus “D10S1248” labeled with the fluorescent dye 6FAM.
  • the base lengths of alleles 8 to 18 contained in the same locus in the LUT are shown. This base length is the base length after the above-mentioned correction is performed, and in the figure, a numerical value based on the correction length shown in FIG. 12 is shown as an example.
  • the AlleleCall section 123 determines which of the allele base lengths in the LUT corresponds to the above base length and identifies the corresponding allele. In the figure, alleles are identified as 8 and 14, respectively.
  • the AlleleCall unit 123 identifies the allele of each locus by performing the process as shown in the figure for all locus of all fluorescent dyes. This allele combination pattern provides genotype information for personal identification.
  • the LUT in FIG. 12 stores the permissible range of the base length of each allele (plus 0.5 bp, minus 0.5 bp in the figure), and the corresponding allele is allowed to allow an error within this range. Identify.
  • a plurality of candidate models and their priorities may be automatically determined, or the operator can set the priorities of the respective models via the user interface unit 103. You can
  • the correction value calculated by the latest allele ladder may be applied, or the correction value when the most recent allele identification process was successful is applied. May be.
  • the standard base length of the allele is input, and the correction length to be added to the standard base length of the allele is defined as the output.
  • the correction length is added to the standard base length in the LUT to associate with the measured allele base length.
  • the essential purpose of the prediction model described in the present embodiment is to obtain the correspondence between the standard base length of the allele and the measured base length of each allele. Therefore, the output of the prediction model for obtaining this correspondence is not limited to the correction length added to the standard base length in the LUT.
  • the output of the prediction model may be a direct value of the actually measured base length instead of the above-mentioned corrected length.
  • a model that inputs the actually measured base length and outputs a correction length for estimating the standard base length in the LUT may be used, or not a correction value, It may be a model that directly outputs the standard base length in the LUT. It is easy for the above identification process to obtain a correspondence between the standard base length and the actually measured base length according to the content of the output of the prediction model as described above.
  • the correction length of the standard base length contained in the allelic ladder is predicted based on the environmental information when the device is used, and the base length of each aller is slightly corrected.
  • the base length of each allele can be finely modified at the same time as the electrophoresis of the actual sample without performing electrophoresis using the allelic ladder. Therefore, the analysis can be performed by reducing the frequency of use of the allelic ladder. The cost can be reduced.
  • the mobility model management unit uses the electrophoresis results of a sample containing DNA with a known standard base length as a data set, and learns from the data set to create a genotype analysis device to be used for prediction. Etc. are examples.
  • a prediction model suitable for the conditions of the analysis environment was selected from the prediction models stored in advance in the prediction model storage unit 125, and the base length of each allele was corrected. ..
  • this prediction model is measured by the device manufacturer in advance before the genotype analyzer is shipped, or is measured by service engineers at the time of installing the device and stored in the device. Was there.
  • the pre-stored prediction model can follow such changes in the environment. It is conceivable that the correction length prediction of the allele does not go well with high accuracy.
  • Example 2 the electrophoresis results when the allelic ladder is measured are stored, and these are used as training data to update the prediction model.
  • FIG. 18 shows the configuration of the genotype analyzer according to Example 2.
  • a prediction model learning unit 127 is added to the configuration of the first embodiment shown in FIG.
  • the other configuration of FIG. 18 is the same as that of the first embodiment.
  • FIG. 19 is a diagram showing a processing flow of processing for learning a prediction model in the second embodiment.
  • the allelic ladder is electrophoresed (S1901).
  • the only difference from the electrophoresis process (S301) in FIG. 3 is the difference in the sample to be measured, and the process is the same, so a description thereof will be omitted.
  • the allelic ladder electrophoresis treatment (S1901) and the actual sample electrophoresis treatment (S301) shown in FIG. 3 may be performed simultaneously by using different capillaries.
  • fluorescence intensity calculation S1902
  • peak detection S1903
  • Size Calling S1904
  • step 1905 make a correspondence with the allelic ladder.
  • the sequence of base lengths of each peak obtained in Size Calling (1904) and the sequence of standard base lengths of the allelic ladder are associated. Similar to Size Calling described above, it can be performed using a known dynamic programming method or the like. Since a detected peak may include a noise peak or failure of peak detection may occur, a matching algorithm that considers such peak insertion or omission may be used.
  • the distance between the standard base length and the base length of each peak, the peak interval, etc. are used to associate each peak with each allele of the allele ladder. You may go. In this way, each peak is associated with each allele of the allele ladder.
  • FIG. 20 shows a processing flow of prediction model learning.
  • the prediction model learning in this embodiment will be described with reference to the figure.
  • S2001 Acquisition of environmental information (S2001) is the same as S901 in Fig. 9. It is various information related to the electrophoretic performance that can be observed by the device when the allelic ladder is electrophoresed. These are used as input data for the subsequent prediction model.
  • FIG. 21 shows the concept of the Alleric Ladder dataset 118 stored.
  • the data set 118 is stored in the storage unit 104, and data is added each time the allelic ladder is electrophoresed. However, old data may be deleted depending on the capacity of the storage unit 104.
  • the dataset 118 contains at least the measurement date and time information, the standard base length (Length) of each allele, the correction length (Offset) obtained from the measurement result of each allele, and the environmental information used for inputting the prediction. ..
  • environmental temperature (Temp.) and current value (Current) are recorded as an example of environmental information. From these datasets, the dataset to be used for training the prediction model is determined.
  • various selection conditions can be considered based on the conditions under which the prediction model is to be created. As an example, the selection conditions of the plurality of models described above are shown.
  • Data sets may be divided according to temperature conditions, such as a data set in which the environmental temperature is low and a data set in which the environmental temperature is high.
  • the data sets may be divided according to voltage conditions, such as a data set for high voltage and a data set for low voltage.
  • the data sets may be divided according to the frequency of use of the buffer solution, the number of times of use, and the like. Data sets may be divided according to the number of times consumables such as capillaries have been used and the number of days elapsed.
  • the training data of the prediction model and the test data used to evaluate the prediction accuracy are divided.
  • the prediction model update process is performed (S2003). Updating the predictive model optimizes the parameters of the predictive model using the training data set described above.
  • the prediction model update process differs depending on what kind of prediction model is used. For example, as an example of a parametric model, a known least squares method or parameter estimation by ridge regression can be applied to a linear regression model as shown in Equation 4.
  • a known CART (Classification And Regression Trees) algorithm is widely used as an algorithm for learning the tree structure of a decision tree as shown in FIG.
  • known machine learning algorithms such as random forests, related vector machines, and neural networks can be applied to optimize predictive model parameters.
  • correction length prediction is performed using the prediction model obtained in S2003 (S2004).
  • This correction length prediction is performed on the test data set determined in S2002. That is, the correction value is predicted by using the input vector (standard base length, temperature, current value in the example of FIG. 21) in the test data set as an input. Since the method of the prediction process is the same as the correction length prediction (S902) described in FIG. 9 of the first embodiment, the description will be omitted.
  • the predicted value obtained in S2004 is evaluated (S2005).
  • the difference from the actually measured correction value (Offset column in FIG. 21) in the test data set is compared.
  • a mean square error or the like is generally used as an index of this difference.
  • the maximum value, the minimum value, the median value, the variance, etc. of the difference may be added as an index.
  • the learning parameter in S2003 is changed and learning is performed on the same data set.
  • the learning parameters are parameters related to the learning operation of S2003, such as the learning coefficient when performing convergence calculation, the constraint condition imposed on the parameter, the learning end condition, and the definition of the loss function at the time of learning evaluation.
  • a learning parameter having the best evaluation index and a prediction model parameter may be selected from a predetermined learning parameter set.
  • S2007 it is determined whether or not to change the data set and relearn. If the evaluation index satisfies a predetermined acceptance level, it is adopted as a prediction model. If the acceptance level is not satisfied, the process may return to S2002, and the training data set and the test data set may be divided and retrained. Further, the data of the specific condition may be deleted from the data set determined in S2002. In addition, data of new conditions may be added to the data set from the data set 118.
  • the new prediction model obtained as described above can be stored in the prediction model storage unit 125 and used for Allele Calling (S305) for an actual sample as described in Example 1.
  • FIG. 19 shows an example in which the latest electrophoretic characteristics are reflected by learning a prediction model when a new allelic ladder is electrophoresed.
  • the timing of learning the prediction model does not necessarily have to be the time of performing electrophoresis of the allelic ladder.
  • the prediction model can be re-learned at an arbitrary timing by some event. As an example of such an event, in the Allele Calling process of the first embodiment, if the allele cannot be identified even if the existing prediction model is used, the prediction model may be automatically recreated. Alternatively, the operator may perform an operation via the user interface unit 103 so as to create a prediction model based on a new condition.
  • Allele Calling (S1907) is performed using the prediction model obtained in this way. Since this processing is the same as Allele Calling (S305) of the first embodiment, description thereof will be omitted.
  • the prediction model for predicting the base correction length of the allele can be appropriately learned by using the electrophoresis result of the allele ladder. ..
  • the prediction accuracy of the base length of the allele can be maintained and improved, and the frequency of subsequent use of the allele ladder can be reduced and analyzed. It is possible to reduce the cost.
  • the mobility model management unit evaluates the accuracy of prediction by referring to the base length obtained by electrophoresis of an actual sample that always contains DNA with a known standard base length when predicting the correspondence. This is an example of a genotype analyzer or the like.
  • the corrected length of the base length of each allele is corrected during the electrophoresis of the actual sample by using the prediction model created by using the migration result of the allelic ladder.
  • the prediction model created by using the migration result of the allelic ladder. was predicted, and the base length of the allele was finely adjusted. If the allele identification fails, another prediction model can be used or a prediction model can be generated under new conditions.
  • the third embodiment is characterized in that the accuracy of the prediction model is evaluated by referring to a marker having a known base length included in the actual sample.
  • the structure of the genotyping apparatus according to the third embodiment is similar to that shown in FIG.
  • the structure of the STR analysis unit 109 is the same as that shown in either FIG. 8 or FIG.
  • Example 3 when a marker having a known base length is included at the time of actual sample measurement, the prediction accuracy is evaluated by referring to the base length of this known marker.
  • a positive control is mentioned as such a known marker.
  • a positive control is a PCR product containing DNA of known base length and is a sample for a control experiment to confirm that PCR is being performed correctly. Therefore, it is possible to evaluate whether or not the correction length is correctly predicted by confirming whether or not the base length of the known DNA marker of this positive control can be measured correctly.
  • Example 3 it is assumed that the base length information of the positive control used for the prediction evaluation of the correction length is stored in the mobility prediction unit 126 in advance before electrophoresis. An example of this positive control information is shown in FIG.
  • the positive control information includes at least a fluorescent dye (Dye) and a standard base length (Length) as shown in FIG. 23 (a). Further, the allowable range of error may be included (Min/Max). These pieces of information may be input by the operator through the user interface unit 103, or may be passed to the STR analysis unit 109 as a setting file according to a defined format. Further, the positive control information once set may be named and stored in the storage unit 104 as the setting information. When the operator uses the positive control, the operator may specify and call the setting information stored in the storage unit 104.
  • FIG. 22 is a flow chart of the processing of Allele Calling (S305) on the electrophoresis result performed on the actual sample in Example 3.
  • the acquisition of environmental information (S2201) is the same as the acquisition of environmental information (S901) in the first embodiment, and a description thereof will be omitted.
  • the correction length prediction (S2202) is performed during electrophoresis from the preset positive control information as shown in the positive control information 116 of FIG. 23 (a).
  • the corrected length of the standard base length of the known marker is predicted.
  • the processing of this correction length prediction is the same as that of S2202 and S902.
  • the correction length of each known marker obtained is retained for each marker of the positive control information as shown in the positive control information 117 of FIG. 23 (b) (Offset of the positive control information 117).
  • the base length correction of the known marker of the positive control is corrected. It also predicts the length.
  • the base length of each marker actually measured by electrophoresis of the positive control is associated with the corrected base length of the known marker obtained in S2202, and the difference between them is calculated.
  • the base lengths closest to each other may be used, or a known matching technique such as dynamic programming may be used.
  • S2204 if any one of all the known markers has the difference above the preset allowable range, it is determined that there is a problem in prediction accuracy, and the process proceeds to S2207.
  • the prediction model may be changed as described in the first embodiment, or the prediction model may be created under new conditions as described in the second embodiment. After S2207, start over from the correction length prediction (S2202).
  • the prediction accuracy of the correction amount of the base length can be improved by referring to the DNA marker whose base length is known, which is measured simultaneously with the actual sample. Can be evaluated. This makes it possible to evaluate the prediction accuracy of the base length when measuring an actual sample without using the allelic ladder, so that it is possible to reduce the risk of misidentification of alleles when the frequency of use of the allelic ladder is reduced.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and appropriate modifications are allowed within the scope of the spirit of the present invention.
  • a microchip-type electrophoresis device in which a sample channel is formed may be used.
  • the capillary in this specification may be read as a flow path.
  • the present invention can be similarly applied to an electrophoresis device using a slab gel.
  • the present invention can also be realized by a program code of software that realizes the functions of the embodiments.
  • a storage medium in which the program code is recorded is provided to the system or device, and the computer (or CPU or MPU) of the system or device reads out the program code stored in the storage medium.
  • the program code itself read from the storage medium realizes the functions of the above-described embodiment, and the program code itself and the storage medium storing the program code itself constitute the present invention.
  • a storage medium for supplying such a program code for example, a flexible disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a hard disk, an optical disk, a magneto-optical disk, a CD-R, a magnetic tape, a non-volatile memory card, a ROM. Etc. are used.
  • the OS operating system
  • the CPU of the computer or the like performs a part or all of the actual processing based on the instruction of the program code, and the processing is performed. May realize the functions of the above-described embodiment.
  • the program code is stored in a storage means such as a hard disk or a memory of a system or a device, or a storage medium such as a CD-RW or a CD-R.
  • the computer (or CPU or MPU) of the system or device may read and execute the program code stored in the storage means or the storage medium at the time of use.

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Abstract

遺伝子解析のコスト低減をはかるため、アレリックラダーの使用頻度を低減する。　電気泳動装置105とデータ解析装置で構成される遺伝子型解析装置であって、データ解析装置のSTR解析部109内に、環境情報受信部124と、予測モデル格納部125と、移動度予測部126を含む移動度モデル管理部122を設け、環境情報受信部124が受け取った電気泳動時の環境条件と、アレリックラダーの電気泳動結果に基づき、移動度予測部126において、アレルの標準塩基長の補正量を予測するための予測モデルを生成する。そして、この予測モデルを用いて、アレリックラダーを使用せずに、環境条件からアレルの塩基長を補正する。

Description

遺伝子型解析装置及び方法
　本発明は、電気泳動を用いた遺伝子型解析装置及びその方法に関する。
　デオキシリボ核酸(DNA)多型の解析によるDNA鑑定が現在、犯罪捜査や血縁関係の判定などの目的で広く行われている。同じ種の生物のDNAはほぼ似通った塩基配列を有するが、一部の箇所では異なった塩基配列を有している。このように個体間でDNA上の塩基配列に多様性が見られることをDNA多型とよび、遺伝子レベルでの個体差の形成に関わる。
　DNA多型の形態の一つとしてShort Tandem Repeat(STR)、もしくはマイクロサテライトがある。STRとは、2塩基から7塩基長程度の短い配列が数回から数十回反復されるような特徴的な配列パターンのことであり、この反復回数が個体によって異なることが知られている。特定の遺伝子の座位におけるSTRの反復回数の組み合わせを解析することをSTR解析と呼ぶ。
　犯罪捜査などを目的としたDNA鑑定においては、STRの反復回数の組み合わせが個体間で異なる性質を利用したSTR解析が用いられている。FBI（米国連邦捜査局）や国際刑事警察機構では、DNA鑑定に用いるSTRの座位（ローカス）をDNAマーカとして10～10数個定義し、これらのSTRの配列の反復回数のパターンを解析する。このSTRの反復回数の違いはアレル（対立遺伝子、Allele）の違いによって出現するものであるため、以降、個々のDNAマーカにおけるSTRの反復回数をアレルと記す。
　DNAマーカとして用いられるSTRの箇所のDNAを一定量抽出するために、PCR(Polymerase Chain Reaction)が行われる。PCRは、ターゲットのDNAの両端において、プライマ配列と呼ばれる一定の塩基配列を指定することで、プライマ配列の間にはさまれるDNA断片のみを繰り返し増幅することにより、一定量のターゲットDNAのサンプルを取得する技術である。
　このPCRにより得られたターゲットDNA断片の断片長を計測するために電気泳動が行われる。電気泳動とは、DNA断片の長さによって、荷電された泳動路における泳動速度が異なり、長いDNA断片ほど泳動速度が小さくなることを利用したDNA断片の分離方法である。電気泳動の手法としては、泳動路としてキャピラリを用いたキャピラリ電気泳動が近年多く用いられている。
　キャピラリ電気泳動では、キャピラリと呼ばれる細い管にゲル等の泳動媒体を充填し、このキャピラリ内でサンプルのDNA断片を泳動させる。そしてサンプルが一定距離、通常はキャピラリの端から端まで泳動し終えるまでに要した時間を計測することで、DNA断片長を調べる。各サンプル、すなわち各DNA断片は蛍光色素で標識されており、キャピラリ終端部に置かれた光学検出器により、泳動されたサンプルの蛍光シグナルを検出する。
　DNA断片の泳動速度は、泳動媒体や試薬性能、装置温度や泳動電圧値等の環境によって変動することが知られている。泳動速度が変化すると、計測されるDNA断片サイズが異なってしまい、正確にアレルを同定することができない。そこで泳動速度の変動に対し、正確にアレルを同定する目的で、アレリックラダーと呼ばれる標準試薬が一般的に用いられる。アレリックラダーとは、後述するように、DNAマーカに一般的に含まれる可能性のあるアレルを多く含む人工的なサンプルであり、泳動速度の変動を吸収し、アレルとDNA断片長との対応関係を微調整することができる。
　通常、このアレリックラダーはDNA鑑定用の試薬キットとして試薬メーカから提供される。時間が経つほど環境変化による泳動速度の変動が蓄積するため、STR解析では、アレリックラダーを一定の頻度で使用することが推奨されている。
特許第6087128号 US2009/0228245A1
　しかし泳動速度の変動が、従来の推奨される頻度で想定される変動よりも大きい場合は、泳動速度の変動を吸収できず、正しくDNA断片サイズが計測できないという課題がある。
　逆に、推奨頻度の期間を過ぎていたとしても、泳動速度の変動が小さい場合は、不要にアレリックラダーを消費し、ランコストを増加させてしまうという課題もある。特に、キャピラリが1本しかない遺伝子検査装置では、計測対象サンプルとアレリックラダーとを、異なるキャピラリで同時に電気泳動することができない。このような装置でアレリックラダーを用いるには、２回の電気泳動を行う必要があるため、解析が煩雑となる。
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、アレリックラダーを使用する頻度を低減し、STR解析の解析コスト低減を図ることが可能な遺伝子型解析装置及び方法を提供するものである。
　上記課題を達成するため、本発明においては、電気泳動によりスペクトルを得る電気泳動装置と、スペクトルを基にDNAの塩基長を求め、標準塩基長を参照して遺伝子型を解析するデータ解析装置と、を備え、データ解析装置は、電気泳動における環境情報をもとに、標準塩基長と実測塩基長との対応を予測する移動度モデル管理部を含む構成の遺伝子型解析装置を提供する。
　また、上記課題を達成するため、本発明においては、データ解析装置による遺伝子型解析方法であって、データ解析装置は、電気泳動における環境情報をもとに、標準塩基長と、電気泳動により得られるスペクトルを基に求めたDNAの実測塩基長との対応を予測する遺伝子型解析方法を提供する。
　本発明によれば、アレリックラダーの使用頻度を低減できるため、低コストでSTR解析を実現することができる。
実施例１による遺伝子型解析装置の概略構成を示す図である。 実施例１による電気泳動装置の概略構成を示す図である。 実施例１による遺伝子型解析装置の処理フローを示す図である。 実施例１による電気泳動処理フローを示す図である。 実サンプルの蛍光強度波形の例を示す図である。 ガウシアンフィッティングの概要を説明するための図である。 実施例１によるSize Callingの概要を説明するための図である。 実施例１によるSTR解析部の概略構成を示す図である。 実施例１によるAllele Callingの処理フローを示す図である。 実施例１による対応関係表（Look Up Table：LUT)を示す図である。 アレリックラダーの蛍光強度波形の例を示す図である。 実施例1によるLUT更新の第一の例を示す図である。 実施例１による予測モデルの概念を説明するための図である。 実施例１による決定木の概念を説明するための図である。 実施例１によるアレル塩基長補正の概念を説明するための図である。 実施例１によるLUT更新の第二の例を示す図である。 実施例１によるアレル同定の概念を説明するための図である。 実施例２によるSTR解析部の概略構成を示す図である。 実施例２による遺伝子型解析装置の処理フローを示す図である。 実施例２による予測モデル学習の処理フローを示す図である。 実施例２による学習データセットの概念を示す図である。 実施例３によるAllele Callingの処理フローを示す図である。 実施例３によるポジティブコントロール情報の例を示す図である。
　以下、添付図面を参照して、環境情報を元に実サンプルの電気泳動時に、DNAの塩基長の補正量を予測する遺伝子型解析装置及び方法の種々の実施例について順次説明する。ただし、各実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
　実施例１は、電気泳動によりスペクトルを得る電気泳動装置と、スペクトルを基にDNAの塩基長を求め、標準塩基長を参照して遺伝子型を解析するデータ解析装置とを備え、データ解析装置は、電気泳動における環境情報をもとに、標準塩基長と実測塩基長との対応を予測する移動度モデル管理部を含む遺伝子型解析装置の実施例である。また、本実施例は、データ解析装置による遺伝子型解析方法であって、データ解析装置は、電気泳動における環境情報をもとに、標準塩基長と、電気泳動により得られるスペクトルを基に求めたDNAの実測塩基長との対応を予測する遺伝子型解析方法の実施例である。
　図１に実施例１の遺伝子型解析装置の構成を示す。遺伝子型解析装置101は、データ解析装置112と電気泳動装置105から構成される。データ解析装置112は、電気泳動の制御やデータ処理等を行う中央制御部102と、表示部を使って、後で説明する適用が可能な予測モデルの一覧などのユーザへの情報提示や、入力部を使ってユーザからの情報入力を行うユーザインタフェース部103と、データや装置の設定情報を格納する記憶部104とから構成される。また、データ解析装置112はネットワークを介して外部サーバ111に接続されると、予測モデルデータなどの各種のデータを両者間で送受信することが可能になる。
　中央制御部102は、サンプル情報設定部106と、電気泳動装置制御部108と、蛍光強度計算部110と、ピーク検出部107と、STR解析部109とから構成される。STR解析部109内のブロック構成を図８に示す。STR解析部109は、Size Call部121と、移動度モデル管理部122と、Allele Call部123とから構成される。さらに移動度モデル管理部122は、環境情報受信部124と、予測モデル格納部125と、移動度予測部126とから構成される。各々の機能については後述する。
　図２は電気泳動装置105の概略図である。図２を参照して電気泳動装置105の構成について説明する。
  電気泳動装置105は、サンプルを光学的に検出するための検出部216、キャピラリを恒温に保つための恒温槽218、キャピラリ陰極端に様々な容器を搬送するための搬送機225、キャピラリに高電圧を加えるための高圧電源204、高圧電源から発せられる電流を検出するための第１電流計205、陽極側電極211に流れる電流を検出するための第２電流計212、単数もしくは複数本のキャピラリ202により構成されるキャピラリアレイ217、キャピラリにポリマを注入するためのポンプ機構203により構成される。
　キャピラリアレイ217は、複数本（例えば8本）のキャピラリを含む交換部材であり、ロードヘッダ229、検出部216、及びキャピラリヘッド233を含む。また、キャピラリに破損や品質の劣化が見られたとき、新品のキャピラリアレイに交換する。
　キャピラリは、内径数十～数百ミクロン、外形数百ミクロンのガラス管で構成され、強度を向上させるために表面をポリイミドでコーティングしている。ただし、レーザ光が照射される光照射部は、内部の発光が外部に漏れやすいように、ポリイミド被膜が除去された構造になっている。キャピラリ202の内部は、電気泳動時に泳動速度差を与えるための分離媒体が充填される。分離媒体は流動性と、非流動性の双方が存在するが、本実施例では流動性のポリマを用いる。
　検出部216は、サンプルに依存した情報を取得する部材である。検出部216に光源214から励起光が照射されると、サンプルから情報光である、サンプルに依存した波長を有する蛍光が生じ、外部に放出される。この情報光は回折格子232によって波長方向に分光され、分光された情報光を光学検出器215により検出して、サンプルを分析する。
　キャピラリ陰極側端227は、それぞれ金属製の中空電極226を通して固定されており、キャピラリ先端が中空電極226から0.5mm 程度突き出た状態になっている。また、キャピラリ毎に装備された中空電極はすべてが一体となってロードヘッダ229に装着される。さらに、すべての中空電極226は装置本体に搭載されている高圧電源204と導通しており、電気泳動やサンプル導入など電圧を印加する必要がある際に陰極電極として動作する。
　キャピラリ陰極端側227と反対側のキャピラリ端部（他端部）は、キャピラリヘッド233により一つに束ねられている。キャピラリヘッド233は、ブロック207に耐圧機密で接続できる。高電圧電源204による高電圧はロードヘッダ229とキャピラリヘッド233の間にかけられる。そして、シリンジ206により、他端部からキャピラリ内に新規ポリマが充填される。キャピラリ中のポリマ詰め替えは、測定の性能を向上するために測定ごとに実施される。
　ポンプ機構203は、シリンジ206とこのシリンジを加圧するための機構系で構成される。
また、ブロック207はシリンジ206、キャピラリアレイ217、陽極バッファ容器210、およびポリマ容器209をそれぞれ連通させるための接続部である。
　サンプルからの情報光を検出する光学検出部は、上述した検出部216を照射するための光源214と、検出部216内の発光を検出するための光学検出器215、回折格子232で構成されている。電気泳動により分離されたキャピラリ中のサンプルを検出するときは、光源214でキャピラリの検出部216を照射し、検出部216からの発光を回折格子232で分光し、光学検出器215で検出する。
　恒温槽218は、恒温槽内を一定の温度に保つために、断熱材で覆われ、加熱冷却機構220により温度が制御される。また、ファン219が恒温槽内の空気を循環及び攪拌させ、キャピラリアレイ217の温度を位置的に均一かつ一定に保つ。
　搬送機225は、３つの電動モータとリニアアクチュエータを備えており、上下、左右、および奥行き方向の３軸に移動可能である。また、搬送機225の移動ステージ230には少なくとも１つ以上の容器を載せることができる。さらに移動ステージ230には電動のグリップ231が備えられており、各容器を掴むことや放すことができる。このため、バッファ容器221、洗浄容器222、廃液容器223及びサンプル容器224を必要に応じて、キャピラリ陰極端227まで搬送できる。尚、不必要な容器は、装置内の所定収容所に保管されている。
　電気泳動装置105は、データ解析装置112と通信ケーブルで接続された状態で使用される。オペレータは、データ解析装置112により、装置の保有する機能を制御し、装置内の検出器で検出されるデータを授受できる。
　また電気泳動装置105には、電気泳動に影響し得る環境情報を取得するためのセンサが存在してもよい。例としては、装置内センサ240、ポリマセンサ部241、緩衝液センサ242を図2内に示している。装置内センサ部240は、装置内の環境情報を取得するためのセンサ群であり、例としては装置内の温度、湿度、気圧などである。ポリマセンサ部241は、ポリマの品質に関する情報を取得するためのセンサ群であり、例としてはPHセンサや電気伝導率センサ等である。ポリマセンサ部241は、図2ではポリマ容器209内に設置した例を示しているが、この位置に限定されるものではない。緩衝液センサ部242は、緩衝液の品質に関する情報を取得するためのセンサ群であり、例としては温度センサがある。緩衝液センサ部242は、図2では陽極バッファ容器210内に設置した例を示しているが、この位置に限定されるものではない。またバッファ容器221内に設定されていてもよい。
　図３を用いて、本実施例の遺伝子型解析装置及び方法の処理フローの概要を説明する。
まず、解析対象の実サンプルの電気泳動処理を行う（ステップ、以下S301）。次にS302において、電気泳動で得られたスペクトル波形データから各蛍光色素の蛍光強度を計算する。そしてS303において、蛍光強度の波形からピークを検出する。次にS304において、得られたピーク時刻とサイズスタンダードの既知のDNA断片長の情報とのマッピングをとることで、時刻とDNA断片長との対応関係を得る。この処理をSize Callingと呼ぶ。その後S305にて、得られた個々のDNA断片長からアレルを同定する。この処理をAllele Callingと呼ぶ。
　以下、図面を参照して、上記の各々のステップにおける処理の詳細を述べる。
  図４は、S301における実サンプルの電気泳動処理のフローを示している。電気泳動の基本的手順は、サンプル準備(S401)、分析開始イベント(S402)、泳動媒体充填(S403)、予備泳動(S404)、サンプル導入(S405)、及び泳動分析(S406)に大別できる。
　本装置のオペレータは、分析開始前のサンプル準備（S401）として、サンプルや試薬を本装置にセットする。より具体的には、まず、バッファ容器221と陽極バッファ容器210に、通電路の一部を形成する緩衝液を満たす。緩衝液は、例えば、各社から電気泳動用として市販されている電解質液である。また、サンプルプレート224のウェル内に、分析対象であるサンプルを分注する。サンプルは、例えば、DNAのPCR産物である。また、洗浄容器222に、キャピラリ陰極端227を洗浄する為の洗浄溶液を分注する。洗浄溶液は、例えば、純水である。また、シリンジ206内に、サンプルを電気泳動する為の泳動媒体を注入する。泳動媒体は、例えば各社から電気泳動用として市販されているポリアクリルアミド系分離ゲルやポリマなどである。さらに、キャピラリ202の劣化が予想される場合や、キャピラリ202の長さを変更する場合、キャピラリアレイ217を交換する。
　このときに、サンプルプレート224にセットされるサンプルとしては、解析の対象であるDNAの実サンプルの他、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、アレリックラダーとがあり、それぞれ異なるキャピラリにおいて電気泳動される。ポジティブコントロールは、例えば既知のDNAを含むPCR産物であり、PCRによってDNAが正しく増幅されていることを確認するための対照実験用のサンプルである。ネガティブコントロールとは、DNAを含まないPCR産物であり、PCRの増幅物にオペレータのDNAや塵などのコンタミネーションが生じていないことを確認するための対照実験用のサンプルである。
　アレリックラダーとは、DNAマーカに一般的に含まれる可能性のあるアレルを多く含む人工的なサンプルであり、通常、DNA鑑定用の試薬キットとして試薬メーカから提供される。アレリックラダーは、個々のDNAマーカのDNA断片長とアレルとの対応関係を微調整する目的で使用される。アレリックラダーについては後述する。
　また上記の実サンプル、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、及びアレリックラダー、のサンプル全てに対して、サイズスタンダードと呼ばれる、特定の蛍光色素で標識された既知のDNA断片が混ぜられる。使用する試薬キットによってサイズスタンダードに割り当てられる蛍光色素の種類は異なる。例えば図７の(a)に例示するサイズスタンダード試薬では、長さが80bpから480bpの間の既知のDNA断片が、蛍光色素LIZで標識されているものとする。サイズスタンダードは、後述するSize Callingにおいて、スキャン時刻とDNA断片長との対応関係を得る目的で、全てのキャピラリのサンプルに対して混合される。
　オペレータは、アレリックラダーの種類やサイズスタンダードの種類、蛍光試薬の種類、それぞれのキャピラリに対応するサンプルプレート224上のウェルにセットされたサンプルの種類などを指定する。本実施例ではサンプルの種類として、実サンプル、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、及びアレリックラダーのいずれかの種類が指定される。これらの情報の設定は、データ解析装置112上にて、ユーザインタフェース部103を介し、サンプル情報設定部106に設定される。
　そして、上記のようなサンプル準備（S401）が完了した後、オペレータはデータ解析装置112上にて、ユーザインタフェース部103を操作して、分析開始を指示する。この分析開始の指示は電気泳動装置制御部108に渡される。電気泳動装置制御部108が、分析開始の信号を電気泳動装置105に送信することで、分析が開始される（S402）。
　次に電気泳動装置105では、泳動媒体充填（S403）が開始される。このステップは、分析開始後に自動的に行われてもよいし、逐次、電気泳動装置制御部108から制御信号が送信されることによって行われてもよい。泳動媒体充填とは、キャピラリ202内に新しい泳動媒体を充填し、泳動路を形成する手順である。
　本実施例における泳動媒体充填（S403）では、まず、搬送機225により廃液容器223をロードヘッダ229の直下に運び、電磁弁213を閉じ、キャピラリ陰極端227から排出される使用済の泳動媒体を受け止められるようにする。そして、シリンジ203を駆動して、キャピラリ202に新しい泳動媒体を充填し、使用済の泳動媒体を廃棄する。最後に、洗浄容器222内の洗浄溶液にキャピラリ陰極端227を浸し、泳動媒体により汚れたキャピラリ陰極端227を洗浄する。
　次に予備泳動（S404）が行われる。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、電気泳動装置制御部108から制御信号が送信されることによって行われてもよい。予備泳動とは、泳動媒体に所定の電圧を印加し、泳動媒体を電気泳動に適した状態にする手順である。本実施例における予備泳動（S404）では、まず、搬送機225により、バッファ容器221内の緩衝液にキャピラリ陰極端227を浸し、通電路を形成する。そして、高圧電源204により、泳動媒体に数～数十キロボルト程度の電圧を数～数十分間加え、泳動媒体を電気泳動に適した状態とする。最後に、洗浄容器222内の洗浄溶液にキャピラリ陰極端227を浸し、緩衝液により汚れたキャピラリ陰極端227を洗浄する。
　次にサンプル導入（S405）が行われる。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、電気泳動装置制御部108から制御信号が送信されることによって行われてもよい。
サンプル導入（S405）では、サンプル成分が泳動路に導入される。本実施例におけるサンプル導入（S405）では、まず、搬送機225により、サンプルプレート224のウェル内に保持されたサンプルにキャピラリ陰極端227を浸し、その後電磁弁213を開く。これにより、通電路が形成され、泳動路にサンプル成分を導入することが状態となる。そして、高圧電源204によりパルス電圧を通電路に印加し、泳動路にサンプル成分を導入する。最後に、洗浄容器222内の洗浄溶液にキャピラリ陰極端227を浸し、サンプルにより汚れたキャピラリ陰極端227を洗浄する。
　次に泳動分析（S406）が行われる。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、電気泳動装置制御部108から制御信号が送信されることによって行われてもよい。泳動分析（S406）では、電気泳動により、サンプル中に含まれる各サンプル成分が分離分析される。本実施例における泳動分析（S406）では、まず、搬送機225により、バッファ容器221内の緩衝液にキャピラリ陰極端227を浸し、通電路を形成する。次に、高圧電源204により、通電路に１５ｋＶ前後の高電圧を印加し、泳動路に電界を発生させる。発生した電界により、泳動路内の各サンプル成分は、各サンプル成分の性質に依存した速度で検出部216へ移動する。つまり、サンプル成分は、その移動速度の差により分離される。そして、検出部216に到達したサンプル成分から順番に検出される。例えば、サンプルが、塩基長の異なるDNAを多数含む場合は、その塩基長により移動速度に差が生じ、塩基長の短いDNAから順に検出部216に到達する。各DNAには、その末端塩基配列に依存した蛍光色素が取り付けられている。検出部216に光源214から励起光が照射されると、サンプルから情報光、すなわちサンプルに依存した波長を有する蛍光が生じ、外部に放出される。この情報光を光学検出器215により検出する。泳動分析中は、光学検出器215では、一定の時間間隔でこの情報光を検出し、画像データをデータ解析装置112へ送信する。もしくは送信する情報量を減らすため、画像データではなく、画像データ中の一部の領域のみの輝度を送信してもよい。例えば、キャピラリ毎に、一定間隔の波長位置のみサンプリングされた輝度値を送信してもよい。この輝度値データは各キャピラリのスペクトル波形を表している。このスペクトル波形が記憶部104へ格納される。
　最後に、予定していた画像データを取得し終えたら電圧印加を停止し、泳動分析を終了する（S407）。以上が、図３における電気泳動処理（S301）の処理の一例である。
　次に、上述した図３の電気泳動処理（S301）で得られた画像データから、各蛍光色素の強度が計算される（S302）。この蛍光強度計算処理は、図１中の蛍光強度計算部110において行われる。蛍光強度計算処理（S302）においては、S301において記憶部104に格納されたスペクトル波形データをλ(0)～λ(19)、すなわち20波長位置でサンプリングとすると、各色素の蛍光強度はそれぞれの波長における、各蛍光色素の強度比率を掛けて足し合わせることで計算される。これを行列で表現すると（式１）のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
  （式１）において、ベクトルcは蛍光強度ベクトルであり、その要素cF、cV、cN、cP、及びcLはそれぞれ、6FAM、VIC、NED、PET、及びLIZの蛍光強度を表している。
　ベクトルfは、計測されたスペクトルベクトルであり、その要素f0からf19はそれぞれ、波長λ(0)からλ(19)における信号強度（輝度値）を表している。もしくは要素f0からf19はそれぞれ、波長λ(0)からλ(19)の近傍の信号強度の加算平均などであってもよい。なお、光学検出器215で検出される、個々の波長λ(0)からλ(19)の計測信号には、蛍光色素による信号に加え、キャピラリ内に充填されるポリマからのラマン散乱光がベースライン信号として含まれている。このため、ベクトルfの算出の際には、このベースライン信号を予め除去しておく必要がある。
　このベースライン信号の除去方法の一例としては、λ(0)からλ(19)の各々の波長の計測信号に対し、低周波成分を除去するようなハイパスフィルタをかけることでベースライン信号を除去してもよい。もしくは各時刻の近傍の最小値を、その時刻におけるベースライン信号値としてもよい。
　マトリクスMは、計測スペクトルfを、蛍光強度ベクトルに変換するマトリクスであり、その要素は各々の波長における各々の蛍光色素の強度比率に相当する。この強度比率の値が高いほど、その波長においてその蛍光色素の強度への寄与が高いことを意味する。
　マトリクスMは、本来は、蛍光色素の種類と泳動路の条件によって一元的に定められるものであるが、実際にはキャピラリと検出器の位置関係によって変動し得るため、キャピラリの交換等の際に計算する必要がある。このマトリクスMを求める一連の処理が、スペクトラルキャリブレーションである。スペクトラルキャリブレーションは、一般的には、マトリクススタンダードと呼ばれるサンプルを電気泳動にかけることで行われる。マトリクススタンダードとは、蛍光スペクトルを取得し、前述のマトリクスを得る目的で電気泳動を行うための試薬である。
　その他、特許文献１のように、上記のマトリクススタンダードを用いずに、計測対象の実サンプルの泳動データを元にマトリクスを算出してもよい。本実施例では、スペクトラルキャリブレーションに限定されるものではないが、予め上記のマトリクスが得られているものと仮定する。
　このマトリクスMの初期値を用いて、（式１）により計測スペクトルから各蛍光色素の蛍光強度を計算する。この処理を各時刻の各キャピラリのスペクトルに対して行うことで、各キャピラリの蛍光強度の時系列データを得ることができる。以降、この蛍光強度の時系列データを蛍光強度波形と記す。
　図５に、電気泳動（S301）後、S302で得られた実サンプルの蛍光強度波形の例を示している。各々の蛍光強度のピークが立っている時刻が、各々の蛍光色素で標識されたDNA断片の長さに相当し、この長さの違いがアレルの違いに相当する。図５の蛍光強度波形では、個々のDNAマーカに対して１つか、もしくは２つのピークが含まれており、ピークが一つの場合、そのピークの蛍光強度はピークが２つのマーカの蛍光強度に比べて高くなっていることがわかる。ピークが１つの場合はホモ接合（父親由来のアレルと母親由来のアレルとが同一）、ピークが２つの場合はヘテロ接合（父親由来のアレルと母親由来のアレルとが異なる）ことを意味している。なお、図５ではサンプルのDNAに対して一人が寄与する例であり、もしも複数人のDNAが混合するような混合サンプルである場合には、その複数人の寄与率に応じ、一つのDNAマーカに対してピークが３つ以上存在する場合がある。
　次に、図３における蛍光強度計算処理（S302）によって得られた、上記の蛍光強度波形に対して、ピーク検出（S303）を行う。ピーク検出では主に、ピークの中心位置（ピーク時刻）、ピークの高さ、及びピークの幅が重要である。ピークの中心位置はDNA断片長に対応し、アレルの識別のために最も重要である。またピークの高さはホモ接合・ヘテロ接合の識別や、サンプル中のDNA濃度の大小等の品質評価に用いられる。ピークの幅も、サンプルや電気泳動結果の品質を評価する上で重要である。このような実データのピークパラメータを推定する手法の一つとして、既知技術であるガウシアンフィッティングを用いることができる。
　図６にガウシアンフィッティングの概念を示す。同図で示すようにガウシアンフィッティングとは、一定区間の実データに対し、ガウス関数gが最もよく実データを近似するようなパラメータ（平均値μ、標準偏差σ、及び最大振幅値A）を計算する処理である。実データの近似の程度を表す指標としては、実データとガウス関数値との最小二乗誤差が多く用いられる。この最小二乗誤差を最小するような数値計算手法として、ガウスニュートン法などの従来手法を用いてパラメータを最適化することができる。その他にも、特許文献2に開示されるような、２つ以上のピーク波形が混合している場合や、ピーク周辺のデータが非対称である場合などの精度を向上させるような手法を適用してもよい。そしてガウス関数gの分散σが定まれば、その半値全幅(FWHM：Full Width at Half Maximum)は、図６中に示す式で得られる。この値をピーク幅とすることができる。
　このようにして全ての蛍光色素の蛍光強度波形に対してピークパラメータを求める。この際、ピーク幅やピークの高さが予め定められた閾値条件を満たさない場合には、ピークから除外してもよい。
　次に、図３におけるSize Calling処理（S304）を行う。Size Callingとは、DNA断片が電気泳動によって検出されるまでに要した時間とDNA断片の塩基長（以降、DNA塩基長と記す）との対応付けを行う処理であり、本実施例ではデータ解析装置112中の図８に示すSTR解析部109内のSize Call部121にて行われる。具体的には前述のように、サイズスタンダードと呼ばれる、既知の長さのDNA断片を含み、かつそれらが特定の蛍光色素で標識された試薬に対して電気泳動を行う。例えば図７の(a)で例示するサイズスタンダード試薬では、長さが80bpから480bpの間の既知のDNA断片に対して、蛍光色素LIZで標識されている。前述のピーク検出（S303）によって得られたピークの中心位置、すなわちピーク時刻に対し、既知のDNA断片長が対応づけられる。この対応づけには、公知の動的計画法などが用いられる。これらのピーク時刻と既知のDNA塩基長との組み合わせから、電気泳動時間とDNA塩基長の対応式を得ることができる。
　図７の(b)はこのDNA泳動時間(t)とDNA塩基長(y)の関係式「y=f(t)」を求める様子を示した図である。サイズスタンダードの既知のDNA塩基長と、それに対応するピーク時刻とをプロットし、このプロットを最もよく近似するような関係式y=f(t)を求める。f(t)としては二次式、もしくは三次式等を用いて、その二乗誤差を最小にするような近似を行ってもよい。またどのような近似式を用いるかをユーザが、ユーザインタフェース部103を介してSTR解析部109に指定してもよい。このようにして得られる、DNA泳動時間(t)とDNA塩基長(y)との関係式「y=f(t)」を、全てのキャピラリに対して求め、保持しておく。この関係式を用いて、各キャピラリで計測される蛍光強度波形のピーク時刻から、そのときのDNA塩基長を求めることができる。
　次に、図３におけるAllele Calling処理（S305）を行う。前述のように、Allele Callingとは、Size Calling処理によって得られた各ピークのDNA塩基長からアレルを同定する処理であり、本実施例ではデータ解析装置112中の図８に示すSTR解析部109内の移動度モデル管理部122とAllele Call部123にて行われる。
　図９はAllele Calling処理（S305）の処理フローを示すフローチャートである。本実施例におけるAllele Calling処理は、従来と同様のLUT更新(S903)の前に、環境情報取得(S901)、補正長予測(S902)を行うことを特徴としている。
　＜従来のアレリックラダーによるLUT更新＞
  本実施例のAllele Calling処理の特徴を示すため、上記S901とS902の処理を行わない、従来のLUT更新処理(S903)について先に説明する。従来のLUT更新処理は、アレリックラダーの電気泳動結果に基づいて行われる。
　図１０に一例を示したLUT113は、アレリックラダーの基本情報として、各蛍光色素（Dye）が標識するローカス名(Locus)と、そのローカスに含まれるアレル名(Allele)と、そのアレルに対応するDNA塩基長(Length)、及び各アレルの中心位置からの許容塩基長幅（Min/Max）の情報を有している。例えば同図ではDNAマーカ（ローカス）D10S1248は6FAMで標識されており、そのアレルとして8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18が含まれ、その標準的なDNA塩基長(単位はbp)はそれぞれ77、81、85、89、93、97、101、109、113、117である。全てのアレルはプラス0.5bp、マイナス0.5bpの許容幅を持つことを示している。このように、Allele Call部123は、個々の各アレルとその標準的なDNA塩基長のLUTを予め内部に持っていることを前提とする。
　しかし、このLUT113に含まれる標準的なDNA塩基長は、あくまで標準的なものであり、実際にサンプルを電気泳動して計測して得られるアレルの塩基長とは一般的には異なる。
このため、通常は、アレリックラダー試薬を電気泳動して計測される個々のアレル長を計測する。
　図１１にアレリックラダーの電気泳動により得られる蛍光強度波形の例を示す。この波形には、各蛍光色素におけるDNAマーカの各アレルがピークとして現れている。このピークに対して前述のピーク検出、Size Calling処理を行うことで、個々のアレルの塩基長を得ることができる。
　このようにして得られた各アレルの塩基長と、図１０のLUT113の標準塩基長とのマッチングを行い、標準塩基長に対する補正長として、上記LUTに加えて内部に持っておく。この補正長を追加したLUTの例を図１２に示す。同図のLUT114では、アレル8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18の標準的塩基長がそれぞれ77、81、85、89、93、97、101、109、113、117であり、それぞれ1、1、1、１、1.1、1.1、1.1、1.1、1.1、1.2、1.2の補正長(同図Offset列)を加算した塩基長が実際に計測される個々のアレルの塩基長であることを示している。
　なお上記のマッチングには、前述のSize Callingと同様、公知の動的計画法などを用いて行ってもよい。また上記の検出されたピークにはノイズピークが含まれている場合や、ピーク検出の失敗などが起こり得る。こうしたピークの挿入や欠落を考慮したマッチングアルゴリズムを用いてもよい。また最適なマッチングを得るための評価関数としては、標準塩基長と個々のピークの塩基長との距離や、ピーク間隔などを用いて、各ピークとアレリックラダーとの各アレルとの対応づけを行ってもよい。
　このように、アレリックラダー試薬を電気泳動することで、図１０の標準的塩基長に対し、図１２のLUT114ように実際の計測時に補正する長さを得ることができる。
　図１５に、アレルの塩基長の補正の概念を示す。同図に示すように、個々のアレルの標準塩基長p(i)に対し、得られた補正長d(i)を加算することで、実際に計測されるアレルの塩基長（補正後の塩基長）q(i)が得られる。
　以上が、従来のアレリックラダーを用いたアレル塩基長の補正方法である。それに対し、本実施例におけるAllele Calling処理では、アレリックラダーの使用頻度を減らすことで、遺伝子型解析のためのランニングコスト低減を図るため、アレリックラダーを用いることなく、サンプル計測時における各アレルの塩基長の補正長を予測することを特徴とする。以下、図９を参照して本実施例におけるAllele Calling処理を説明する。
　＜環境情報＞
  本実施形態におけるAllele Calling処理(ステップ305)では、環境情報取得(ステップ901)を行う。この処理は、環境情報取得部124にて行われる。環境情報取得部124は、電気泳動装置105から、泳動条件に関する環境情報を受信する。ここで環境情報とは、装置で観測が可能な、電気泳動に関連する様々な情報である。環境情報の具体例としては、装置内センサ部420で取得される装置内温度や湿度、圧力、緩衝液センサ422で計測される緩衝液の温度、ポリマセンサ部421で計測されるポリマの電気伝導率やPH、高電圧源204の電圧、第1電流計205や第2電流計212で計測される電流値などの他、ポリマや緩衝液の使用頻度や経過日数、ロット番号、キャピラリの使用回数等の消耗品に関する情報などが挙げられる。
　これらの環境情報は、電気泳動の特性に関連する情報であることが望ましい。環境情報は、後述する塩基補正長の予測精度の向上に寄与するものであることを、実験的に観測した上で選択することが望ましい。ただし、装置の特性が変動し、予測に有効な環境情報が変化する可能性もある。このため装置に保存するデータとしては、電気泳動に関連すると推測される、可能な限りの環境情報を取得し、保存しておくことが望ましい。その中で、どのような環境情報を予測に用いるかは、後述するように、予測モデルの生成時に変更できることが望ましい。
　以下の説明では、環境情報の例として環境温度と第2電流計212で計測される電流の時系列データとする。ただし本発明による開示技術は、必ずしもこれらの環境情報に限定されるものではなく、装置から入手可能なあらゆる環境情報においても適用可能である。またこうした環境情報は、電気泳動で得られたスペクトル波形のデータとともに、データファイル内に格納され、記憶部104へ格納されていてもよい。
　＜補正長予測処理＞
  次に本実施例における移動度モデル管理部122の移動度予測部126が補正長予測(S902)を行う。補正長予測とは、前述のように、アレリックラダーにおける各アレルの標準の塩基長に対する補正長を予測する処理である。本実施例の補正長予測処理では、従来技術とは異なり、前述の環境情報を元に各アレルの補正長を予測する。移動度予測部126は、予測モデル格納部125に格納された予測モデルを用いて上記の予測を行う。
　図１３に、移動度予測部126における予測モデルに基づく補正長予測の概念を示す。予測モデルは、環境情報の値のベクトルvと、任意の塩基長pとの組を入力として、塩基長pにおける補正長dを出力するようなモデルである。電気泳動は一般的に温度が高くなるほど、また電流値が高いほど泳動速度は速くなる傾向が知られている。また塩基長が短い場合と長い場合とで、泳動速度の変化の特性が異なることが知られている。
　本実施例では、こうした傾向を反映するような予測モデルを、実データの計測に基づいて予め作成し、予測モデル格納部125に格納しておくことを前提としている。この予測モデルは、遺伝子型解析装置の出荷前に予め装置メーカによって計測されているか、もしくは装置の設置時にサービスエンジニアらによって計測され、装置内に記憶されているものとする。また、試薬の追加やバージョンアップなどに対応して、予測モデル情報を外部から追加してもよい。またこの予測モデルは、実施例２で述べるように、アレリックラダーを実際に電気泳動して得られた各アレルのDNA断片長に基づいて学習した上で作成されていることが望ましい。
　この予測モデルは、d=f(p,v)とあらわしたときにfを特定の関数の形状であらわすことができるようなパラメトリックモデルでもよいし、関数の形状で表現することができないような非パラメトリックモデルであってもよい。
　＜パラメトリックモデル＞
  パラメトリックモデルとしての簡易な例としては、式２に示すような線形回帰モデルが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
式２では、環境情報vとして、ある塩基長xにおける環境温度をt、電流値をcとし、パラメータθによりモデルが表現されている。上記の入力値の組(p,t,c)をまとめて入力ベクトルxとすると、式２は以下のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
また、式３を一般化し、基底関数φk(x)を適切に定義し、式４のように定義することで予測モデルの表現力を高めても良い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
式２乃至式４は入力ベクトルxとパラメータθとを３次元とした入力としているが、予測の精度を上げるために環境情報の要素数を増やす場合には、上記の入力ベクトルxとパラメータθの次元を増やすことも可能である。
　＜非パラメトリックモデル＞
  上記のようなパラメトリックモデルでは適した予測が行えない場合には、非パラメトリックモデルを用いることも可能である。非パラメトリックモデルの例としては、公知の決定木が挙げられる。すなわち、木構造の推論規則を用いて、入力ベクトルに対する予測値を決定する。図１４に決定木による予測の概念図を示す。同図に示すように、決定木では、入力データである塩基長p、環境温度t、電流cに対し、根ノードから出発し、各ノードにある条件を満たすか否かのルールの組み合わせによって最終的な予測値dを決定する。
　この他、上記の決定木を組み合わせたランダムフォレストや、関連ベクターマシン(RVM)、ニューラルネットワーク等、既知の機械学習アルゴリズムを用いてモデル化されてもよい。
　＜複数の予測モデルの選択＞
  なお、上記の予測モデルは唯一ではなく、また予測モデルは複数作成され、移動度予測部126が、条件に応じて予測モデルを適宜選択してもよい。以下、複数の予測モデルを用いるほうが望ましい項目を列挙する。
予測モデルは、蛍光色素毎に作成されていることが望ましい。これは、蛍光色素毎にDNAの移動度の特性が異なるためである。
予測モデルは、遺伝子解析のパネルの種類毎に作成されていることが望ましい。これは試薬によってアレリックラダーのローカスの種類や、DNAの移動度の特性が異なるためである。
予測モデルはポリマの種類毎に作成されていることが望ましい。ポリマの種類によってDNAの移動度の特性が異なるためである。
その他、予測モデルの精度を向上させるため、環境条件に応じて、条件別に予測モデルを作成してもよい。例を以下に列挙する。
環境温度が低温のときに適用する予測モデルや、高温のときに適用する予測モデルなど、温度条件を分けた予測モデルが用意されていてもよい。
電圧に応じて高電圧用の予測モデル、低電圧用の予測モデル等が用意されていてもよい。
緩衝液の使用頻度に応じて、使用回数に応じて、使用回数の多いときの予測モデル、使用回数が少ないときの予測モデル等が用意されていてもよい。
キャピラリ等の消耗品の使用回数や経過日数などに応じた予測モデルが用意されていてもよい。
　移動度予測部126では、上記のように複数の予測モデルから、その予測モデルの適用条件に応じて、適切な予測モデルを選択すればよい。
　またはオペレータに対して、ユーザインタフェース103を介して、適用が可能な予測モデルの一覧を提示し、オペレータがこの中から適用される予測モデルの優先順位を設定できるようにしても良い。またはオペレータに対して、ユーザインタフェース103を介して、適用が可能な予測モデルの一覧を提示し、オペレータがこの中から、適用される予測モデルの優先順位を設定できるようにしてもよい。
またはオペレータに対して、ユーザインタフェース103を介して、適用が可能な予測モデルの一覧を提示し、オペレータがこの中から適用するモデルを選択できるようにしてもよい。
　＜LUT更新＞
  次にLUT更新処理(S903)を行う（図９）。LUT更新処理は、S902で得られた、LUT内の全アレルの塩基長の補正長を、LUT内に格納する。LUTのデータ構造としては、図１２に示すように、既存の補正長(同図中、Offset列)を上書きしてもよい。もしくは図１６のLUT115に示すように、既存の補正長を上書きするのではなく、既存の補正長を残しつつ、新たに補正長を追加更新してもよい。
　前述のように、従来のLUT更新処理ではアレリックラダーを実測して得られた補正長に基づいてLUTを更新するのに対し、本実施例では、環境情報と各アレルの塩基長を元に、予測モデルを用いて各アレルの塩基長に対する補正長を予測し、この予測結果に基づいてLUTを更新している。これにより、アレリックラダーを用いずに、実サンプル計測時に近いLUTの情報を得ることが可能となる。
　＜アレル同定処理＞
  次にアレル同定処理(S904)を行う。アレル同定処理は、上記のように補正長が決定されたLUTを参照して、計測された実サンプルのピークのDNA塩基長から、各ピークに対応するアレルを同定する。すなわち、図５に示す、解析対象の実サンプルの蛍光強度波形の個々のピークが、図１１に示すアレリックラダーに含まれるアレルのうち、どのアレルに相当するかを同定することに相当する。
　図１７を参照してアレル同定処理の例を示す。同図では蛍光色素6FAMで標識されるローカス「D10S1248」のアレルを同定する例を示している。同図の上には、LUT内の同ローカスに含まれるアレル8～18の塩基長を示している。この塩基長は前述の補正が行われた後の塩基長であり、同図では図１２に示した補正長に基づいた数値が例として記載されている。
　同図の下には、解析対象である実サンプルにおいて、D10S1248の範囲に観測された２つのアレルピークを記している。２つのアレルピークはそれぞれ、前述のSizing Call処理により、塩基長がそれぞれ85.7[bp]、102.3[bp]と算出されている。
　Allele Call部123では、上記の塩基長がLUT内の各アレル塩基長のうちのどれに対応するかを判別し、対応するアレルを同定する。同図ではアレルがそれぞれ8、14と同定されている。Allele Call部123は、同図のような処理を全ての蛍光色素の全てのローカスに対して行うことで、各ローカスのアレルを同定する。このアレルの組み合わせパターンが、個人識別のための遺伝子型の情報となる。
　なお前述のように、図１２のLUTには各アレルの塩基長の許容範囲が格納されており（同図ではプラス0.5bp、マイナス0.5bp）、この範囲内の誤差を許容して対応するアレルを同定する。
　＜アレル同定が失敗したときの補正値予測の再実行＞
  S905において、アレル同定処理が問題ないかどうかの判定を行う。もしも全てのアレルが上記の許容誤差範囲内で検出されていれば、問題がないと判断し、Allele Calling処理を終了する。もしも上記の誤差を許容しても対応するアレルが存在しないDNAマーカがある場合、原因の一つとして、前述のS902で得られた補正長の予測値が適切でない可能性が挙げられる。このような場合、複数の予測モデルが存在する場合には、別の予測モデルを用いて補正値予測(S902)からやり直してもよい。
　このようにアレル同定に失敗した場合に対し、候補となる複数のモデルとその優先順位を自動的に定めてもよいし、ユーザインタフェース部103を介し、オペレータが各モデルの優先順位を設定できるようにしてもよい。
　もしも、全ての候補の予測モデルで予測が失敗した場合は、直近のアレリックラダーで算出された補正値を適用してもよいし、直近でアレル同定処理が成功したときの補正値を適用してもよい。
なお、本実施形態の説明で述べた予測モデルでは、アレルの標準塩基長を入力とし、そのアレルの標準塩基長に加算する補正長を出力として定義している。このため上記のアレル同定処理では、LUT内の標準塩基長に補正長を加算して実測したアレル塩基長との対応付けを行っている。ただし、実測されたアレルの塩基長から、本補正長を減算することで、LUT内の標準塩基長と対応づけを行ってもよい。すなわち本発明における補正長とは、本質的には、標準塩基長と実測される塩基長との差分であるため、この差分を用いた補正方法は、前者であっても後者であっても変わりは無い。
　さらに、本実施形態で述べた予測モデルの本質的な目的は、アレルの標準塩基長と、実測される各アレルの塩基長との対応を得ることである。よってこの対応を得るための予測モデルの出力は、上記のLUT内の標準塩基長に加算される補正長に限定されるものではない。例えば、予測モデルの出力は、上記の補正長ではなく、実測される塩基長の直接の値であってもよい。また他の予測モデルの例としては、実測される塩基長を入力とし、LUT内の標準塩基長を推測するための補正長を出力するようなモデルであってもよいし、補正値ではなく、LUT内の標準塩基長を直接出力するようなモデルであってもよい。上記の同定処理が、上記のような予測モデルの出力の内容に応じて、標準塩基長と実測塩基長との対応を得ることは容易である。
　以上に述べたように、実施例１では、装置使用時の環境情報を元にアレリックラダーに含まれる標準塩基長の補正長を予測して、各アレルの塩基長を微修正し、このような方法により、アレリックラダーを用いて電気泳動を行うことなく、実サンプルの電気泳動と同時に各アレルの塩基長を微修正することができるので、アレリックラダーの使用頻度を減らすことで、解析コストを軽減することが可能となる。
　実施例２による遺伝子型解析装置について説明する。本実施例は、移動度モデル管理部は、標準塩基長が既知のDNAを含むサンプルの電気泳動結果をデータセットとし、当該データセットから学習して予測に用いる予測モデルを作成する遺伝子型解析装置等の実施例である。
　実施例１による遺伝子型解析装置では、予測モデル格納部125に予め格納された予測モデルの中から、解析環境の条件に適した予測モデルを選択し、各アレルの塩基長の補正を行っていた。実施例１では、この予測モデルは、遺伝子型解析装置の出荷前に予め装置メーカによって計測されているか、もしくは装置の設置時にサービスエンジニアらによって計測され、装置内に記憶されている形態を想定していた。
　しかし、装置の電気泳動特性が想定以上に変動してしまった場合や、新たな試薬が追加されるなど解析環境が変わる場合などには、予め格納された予測モデルではそうした環境の変化に追従できずに、精度よくアレルの補正長予測がうまくいかないことが考えられる。
　このような場合には、実施例１にて述べたように、アレリックラダーを用いた従来のLUT更新を行う必要があるが、アレリックラダーの使用頻度が多くなってしまうという課題がある。
　そこで実施例２では、アレリックラダーを計測したときの電気泳動結果を格納しておき、これらを訓練データとして予測モデルを更新する。以下に、本発明の実施例２について図面を参照して詳細を説明する。
　図１８に実施例２による遺伝子型解析装置の構成を示す。図１８では、図１に示される実施例１の構成に加え、予測モデル学習部127が加えられている。図１８のその他の構成は、実施例１と同様である。
　図１９は実施例２における、予測モデルを学習する処理の処理フローを示す図である。
予測モデルの学習では、アレリックラダーの電気泳動処理を行う（S1901）。図３の電気泳動処理（S301）との違いは、計測対象とするサンプルの違いのみであり、処理は同様であるので説明は省略する。なお、アレリックラダーの電気泳動処理(S1901)と、図３で示す実サンプルの電気泳動処理（S301）とは、異なるキャピラリを用いることで同時に実行してもよい。
　その後、蛍光強度計算(S1902)、ピーク検出(S1903)、Size Calling(S1904)を行う。これらの処理、図３における蛍光強度計算(S302)、ピーク検出(S303)、Size Calling(S304)とそれぞれ同様であるので説明は省略する。
　次に、アレリックラダーとの対応づけ(ステップ1905)を行う。この対応づけ処理は、Size Calling(1904)で得られた各ピークの塩基長の数列と、アレリックラダーの標準塩基長の数列との間の対応づけを行う。前述のSize Callingと同様、公知の動的計画法などを用いて行うことができる。検出されたピークにはノイズピークが含まれている場合や、ピーク検出の失敗などが起こり得るため、こうしたピークの挿入や欠落を考慮したマッチングアルゴリズムを用いてもよい。また最適なマッチングを得るための評価関数としては、標準塩基長と各ピークの塩基長との間の距離や、ピーク間隔などを用いて、各ピークとアレリックラダーとの各アレルとの対応づけを行ってもよい。こうして各ピークとアレリックラダーとの各アレルとの対応づけを行う。
　このようにして、アレリックラダーの蛍光波形から、全アレルの塩基長の実計測値が得られる。次に、予測モデル学習(S1906)を行う。図２０に予測モデル学習の処理フローを示す。以降、同図を参照して本実施例における予測モデル学習を説明する。
　環境情報取得(S2001)は、図9のS901と同様である。アレリックラダーを電気泳動したときの装置で観測が可能な、電気泳動性能に関連する様々な情報である。これらは以降の予測モデルの入力データとして使用される。
　次に、学習に用いるデータセットを決定する(S2002)。学習には、アレリックラダーの電気泳動結果を用いる。本実施例では、記憶部104に、過去のアレリックラダーの電気泳動で得られたデータが、環境情報とセットで格納されているものとする。図２１に格納されたアレリックラダーのデータセット118の概念を示す。データセット118は記憶部104に格納され、アレリックラダーの電気泳動を行う都度、データが追加されていく。ただし記憶部104の容量に応じて古いデータは削除されてもよい。
　データセット118には少なくとも、計測日時の情報と、各アレルの標準塩基長(Length)、各アレルの計測結果から得られた補正長(Offset)、予測の入力に用いられる環境情報とが含まれる。同図では環境情報の例として環境温度(Temp.)と、電流値(Current)が記録されている。これらのデータセットの中から、予測モデルの学習に用いるデータセットを決定する。
　学習のデータセットの決定においては、どのような条件に適用する予測モデルを作成するか、かに基づいて様々な選択条件が考えられる。例として、前述した複数モデルの選択条件を示す。
　＜予測モデル学習のためのデータセットの選択条件＞
蛍光色素毎にデータセットを分けることが望ましい。蛍光色素毎にDNAの移動度の特性が異なるためである。
遺伝子解析のパネルの種類毎にデータセットを分けることが望ましい。試薬によってアレリックラダーのローカスの種類や、DNAの移動度の特性が異なるためである。
ポリマの種類毎にデータセットを分けることが望ましい。ポリマの種類によってDNAの移動度の特性が異なるためである。
環境温度が低温であるデータセットや、高温のときのデータセット等、温度条件によってデータセットを分けてもよい。
高電圧用時のデータセットや、低電圧用のデータセット等、電圧条件によってデータセットを分けてもよい。
緩衝液の使用頻度や、使用回数等に応じて、データセットを分けても良い。
キャピラリ等の消耗品の使用回数や経過日数に応じてデータセットを分けてもよい。
　上記のようにして選択されたデータセットそれぞれに対し、予測モデルの訓練データと、予測精度の評価に用いるテストデータとに分割する。
　次に、予測モデル更新処理を行う（S2003）。予測モデルの更新は、上記の訓練データセットを用いて予測モデルのパラメータを最適化する。
　予測モデル更新処理は、どのような予測モデルを用いるかにより異なる。例えば、パラメトリックモデルの例として、式４に示したような線形回帰モデルに対しては、既知の最小二乗法や、リッジ回帰によるパラメータ推定を適用できる。
　また、非パラメトリックモデルとしては、図１４で示したような決定木の木構造を学習するアルゴリズムとしては、既知のCART(Classification And Regression Trees)アルゴリズムが広く用いられている。その他、ランダムフォレストや関連ベクトルマシン、ニューラルネット等の既知の機械学習アルゴリズムを適用し、予測モデルパラメータの最適化を行うことができる。
　次に、S2003で得られた予測モデルを用いて補正長予測を行う(S2004)。この補正長予測では、S2002において決められたテストデータセットに対して行う。すなわち、テストデータセットにおける入力ベクトル（図２１の例では標準塩基長、温度、電流値）を入力として補正値を予測する。予測処理の方法は実施例１の図９で述べた補正長予測(S902)と同様であるため、説明は省略する。
　次に、S2004で得られた予測値の評価を行う(S2005)。予測値の評価には、テストデータセットにおける実測された補正値(図２１のOffset列)との差を比較する。この差の指標としては平均二乗誤差などが一般的に用いられる。その他、差分の最大値や最小値、中央値、分散などを指標として追加してもよい。
　次に、S2006において、予測モデル更新を行うか否かの判定を行う。S2005で得られた評価指標を元に、予め定められた判定条件を満たさない場合に、S2003における学習パラメータを変えて、同一のデータセットに対して学習を行う。学習パラメータとしては、収束計算を行うときの学習係数や、パラメータに課する制約条件、学習の終了条件、学習評価の際の損失関数の定義など、S2003の学習の動作に関するパラメータである。予め定めた学習パラメータセットの中から、評価指標が最も良い学習パラメータと、予測モデルパラメータを選択してもよい。
　次に、S2007において、データセットを変更して学習をしなおすか否かの判定を行う。
評価指標が予め定めた合格水準を満たしていれば、予測モデルとして採用する。もしも合格水準を満たしていなければ、S2002に戻り、訓練データセットとテストデータセットの分割をしなおして再度学習しなおしてもよい。また、S2002で決定したデータセットから特定の条件のデータを削除してもよい。またデータセットに新たな条件のデータをデータセット118から追加してもよい。
　以上のようにして得られた新たな予測モデルを、予測モデル格納部125に格納し、実施例１で述べたように、実サンプルに対するAllele Calling(S305)に利用することができる。
　なお、本実施例では図１９において、新たにアレリックラダーを電気泳動するときに予測モデルの学習を行うことで、最新の電気泳動の特性を反映する例について示した。ただし予測モデルの学習を行うタイミングは、必ずしもアレリックラダーの電気泳動を行うときである必要はない。記憶部104に、予測モデルの学習に十分な量のデータセットが存在する場合には、何らかのイベントによって任意のタイミングで予測モデルの学習のし直しを実行できる。このようなイベントの一例として、実施例１のAllele Calling処理で、既存の予測モデルを用いてもアレル同定が行えない場合に自動的に予測モデルを作り直す、という処理を行っても良い。もしくはオペレータがユーザインタフェース部103を介して、新たな条件に基づく予測モデルを作成するように操作を行っても良い。
　このようにして得られた予測モデルを用いてAllele Calling(S1907)を行う。本処理は実施例１のAllele Calling(S305)と同様のため説明は省略する。
　以上に述べたように、本発明の実施例２による遺伝型解析装置では、アレリックラダーの電気泳動結果を用いて、アレルの塩基補正長を予測するための予測モデルを適宜学習することができる。これにより、新たなアレリックラダーの泳動特性を反映して予測モデルを更新することで、アレルの塩基長の予測精度を維持向上させることで、その後のアレリックラダーの使用頻度を軽減し、解析コストの低減を図ることが可能となる。
　実施例３による遺伝子型解析装置について図２２、図２３を用いて説明する。本実施例は、移動度モデル管理部は、対応を予測する際に、標準塩基長が既知のDNAを常に含む実サンプルの電気泳動により得られる塩基長を参照することにより、予測の精度を評価する遺伝子型解析装置等の実施例である。
　実施例１、及び実施例２による遺伝子型解析装置では、アレリックラダーの泳動結果を用いて作成された予測モデルを用いて、実サンプルの電気泳動の際に、各アレルの塩基長の補正長を予測し、アレルの塩基長の微調整を行った。そしてアレル同定が失敗した場合には、別の予測モデルを使用することや、新たな条件で予測モデルを生成することができる。
　しかし実施例１と実施例２では、アレル同定の失敗が検出できない場合には、予測の失敗が検出できず、上記の予測モデルの変更や新規追加などを行えない。予測モデルが著しく不適切であると、偽のアレルを同定してしまい、アレル同定の失敗が検出できない可能性がある。そこで実施例３では、実サンプルに含まれる既知の塩基長のマーカを参照し、予測モデルの精度を評価することを特徴とする。
　以下、図面を参照して実施例３による遺伝子型解析装置の詳細を説明する。実施例３による遺伝子型解析装置の構成は、図１に示される構成と同様である。またSTR解析部109の構成は図８もしくは図１８のいずれかと同様である。
　実施例３では、既知の塩基長のマーカが実サンプル計測時に含まれている場合に、この既知マーカの塩基長を参照することで予測精度を評価する。このような既知マーカとしてはポジティブコントロールが挙げられる。前述のように、実サンプルの解析の際には、解析の対象であるDNAサンプルの他、ポジティブコントロールを、異なるキャピラリにおいて電気泳動することが多い。ポジティブコントロールは、既知の塩基長のDNAを含むPCR産物であり、正しくPCRが行われていることを確認するための対照実験用のサンプルである。従って、このポジティブコントロールの既知のDNAマーカの塩基長が正しく計測できているかどうかを確認することで、補正長の予測が正しく行われているかどうかを評価することができる。
　実施例３では、予め補正長の予測評価に用いるポジティブコントロールの塩基長情報が、電気泳動前に移動度予測部126に格納されているものとする。このポジティブコントロールの情報の例を図２３に示す。
　ポジティブコントロールの情報としては、図２３の(a)に示すように少なくとも蛍光色素(Dye)、標準塩基長(Length)とが含まれる。さらに誤差の許容範囲を含んでいてもよい(Min/Max)。これらの情報は、ユーザインタフェース部103を通じてオペレータが入力してもよいし、定められたフォーマットに従った設定ファイルとしてSTR解析部109に渡されてもよい。また一度設定されたポジティブコントロール情報は、設定情報として名前をつけて記憶部104に格納されてもよい。そしてオペレータが、そのポジティブコントロールを利用する際に、記憶部104に格納された設定情報を指定し、呼び出すことができるようにしてもよい。
　図２２は、実施例３における、実サンプルに対して行われる電気泳動結果に対するAllele Calling(S305)の処理のフロー図である。環境情報取得(S2201)は実施例１における環境情報取得(S901)と同様であるため説明は省略する。
　補正長予測(S2202)は、実施例１における補正長予測(S902)に加え、図２３の(a)のポジティブコントロール情報116に示すように、予め設定されたポジティブコントロールの情報から、電気泳動時の環境情報と、各既知マーカの標準塩基長とを入力とし、既知マーカの標準塩基長の補正長を予測する。この補正長予測の処理はS2202やS902と同様である。
得られた各既知マーカの補正長は、図２３の(b)のポジティブコントロール情報117に示すように、ポジティブコントロール情報の各マーカに対して保持しておく（ポジティブコントロール情報117のOffset)。すなわち実施例３における補正長予測(S2202)では、実施例１で述べたLUTに格納された全アレルの塩基長の補正長の予測(S902)に加え、ポジティブコントロールの既知マーカの塩基長の補正長の予測も行う。
　次に予測精度評価(S2203)を行う。この処理では、ポジティブコントロールの電気泳動により実測された各マーカの塩基長と、S2202で得られた補正後の既知マーカの塩基長との対応づけを行い、それらの差分を計算する。上記の対応付けには、互いに最も近い塩基長同士としてもよいし、公知の動的計画法等のマッチング技術を用いてもよい。
　S2204において、全ての既知マーカに対する上記の差分が、予め設定された許容範囲以下であれば、予測の精度には問題がないと判断し、後段のLUT更新(S2205)、アレル同定(S2206)に進む。LUT更新(S2204)、アレル同定(S2205)は、実施例１における図９で示した処理と同様のため、説明を省略する。
　S2204において、全ての既知マーカのうちいずれか一つでも上記の差分が、予め設定された許容範囲以上のものがあれば、予測の精度には問題があると判断し、S2207に進む。S2207では、実施例１で述べたように予測モデルを変更してもよいし、実施例２で述べたように新たな条件で予測モデルを作成してもよい。S2207の後、補正長予測(S2202)からやり直す。
　以上に述べたように、本発明の実施例３による遺伝型解析装置では、実サンプルと同時に計測される、塩基長が既知のDNAマーカを参照することで、塩基長の補正量の予測精度を評価することができる。これにより、アレリックラダーを用いずとも、実サンプルの計測時に塩基長の予測精度を評価できるため、アレリックラダーの使用頻度を減らしたときのアレル誤判定のリスクを低減することができる。
　以上、本発明を実施するための最良の形態について説明したが、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容されるものである。例えば、サンプルの流路が内部に形成されたマイクロチップ式の電気泳動装置を用いてもよい。この場合には本明細書におけるキャピラリを流路と読み替えればよい。また、スラブゲルを用いた電気泳動装置にも同様に本発明を適用できる。
　また、本発明は、実施例の機能を実現するソフトウェアのプログラムコードによっても実現できる。この場合、プログラムコードを記録した記憶媒体をシステム或は装置に提供し、そのシステム或は装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が記憶媒体に格納されたプログラムコードを読み出す。この場合、記憶媒体から読み出されたプログラムコード自体が前述した実施例の機能を実現することになり、そのプログラムコード自体、及びそれを記憶した記憶媒体は本発明を構成することになる。このようなプログラムコードを供給するための記憶媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－Ｒ、磁気テープ、不揮発性のメモリカード、ＲＯＭなどが用いられる。
　また、プログラムコードの指示に基づき、コンピュータ上で稼動しているＯＳ（オペレーティングシステム）などが実際の処理の一部又は全部を行い、その処理によって前述した実施の形態の機能が実現されるようにしてもよい。さらに、記憶媒体から読み出されたプログラムコードが、コンピュータ上のメモリに書きこまれた後、そのプログラムコードの指示に基づき、コンピュータのＣＰＵなどが実際の処理の一部又は全部を行い、その処理によって前述した実施の形態の機能が実現されるようにしてもよい。
　また、実施の形態の機能を実現するソフトウェアのプログラムコードを、ネットワークを介して配信することにより、それをシステム又は装置のハードディスクやメモリ等の記憶手段又はＣＤ－ＲＷ、ＣＤ－Ｒ等の記憶媒体に格納し、使用時にそのシステム又は装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が当該記憶手段や当該記憶媒体に格納されたプログラムコードを読み出して実行するようにしても良い。
101　遺伝子型解析装置
102　中央制御部
103　ユーザインタフェース部
104　記憶部
105　電気泳動装置
106　サンプル情報設定部
107　ピーク検出部
108　電気泳動装置制御部
109　STR解析部
110　蛍光強度計算部
111　外部サーバ
112　データ解析装置
113、114、115　LUT
116、117　ポジティブコントロール情報
118　データセット
121　Size Calling部
122　移動度モデル管理部
123　Allele Call部
124　環境情報受信部
125　予測モデル格納部
126　移動度予測部
127　予測モデル学習部

Claims (15)

  1. 遺伝子型解析装置であって、
    電気泳動によりスペクトルを得る電気泳動装置と、
    前記スペクトルを基にDNAの塩基長を求め、標準塩基長を参照して遺伝子型を解析するデータ解析装置と、を備え、
    前記データ解析装置は、前記電気泳動における環境情報をもとに、前記標準塩基長とその実測塩基長との対応を予測する移動度モデル管理部を含む、
    ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
  2. 請求項１に記載の遺伝子型解析装置であって、
    前記移動度モデル管理部は、
    前記予測に用いる予測モデルを複数格納し、
    前記対応を予測する際に、前記環境情報に基づく環境条件に応じて前記予測モデルを選択する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
  3. 請求項１に記載の遺伝子型解析装置であって、
    前記移動度モデル管理部は、
    前記予測に用いる予測モデルを複数格納し、
    前記対応を予測する際に、予め定められた優先順に前記予測モデルを適用する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
  4. 請求項２または３に記載の遺伝子型解析装置であって、
    前記データ解析装置は、ユーザインタフェース部を含み、
    前記ユーザインタフェース部に、適用が可能な前記予測モデルの一覧を表示する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
  5. 請求項１に記載の遺伝子型解析装置であって、
    前記移動度モデル管理部は、
    前記標準塩基長が既知のDNAを含むサンプルの電気泳動結果をデータセットとし、当該データセットから学習して前記予測に用いる予測モデルを作成する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
  6. 請求項５に記載の遺伝子型解析装置であって、
    前記移動度モデル管理部は、
    前記環境情報に基づく環境条件に応じて前記データセットを選択し、選択した前記データセットから学習して前記予測モデルを作成する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
  7. 請求項２乃至６のいずれか１項記載の遺伝子型解析装置であって、
    前記移動度モデル管理部は、
    前記対応を予測する際に、前記標準塩基長が既知のDNAを常に含む実サンプルの電気泳動により得られる塩基長を参照することにより、前記予測の精度を評価する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
  8. 請求項７記載の遺伝子型解析装置であって、
    前記移動度モデル管理部は、
    前記予測の精度の評価結果に応じて、前記予測モデルを変更する、または予測モデルを新たに学習する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
  9. データ解析装置による遺伝子型解析方法であって、
    前記データ解析装置は、
    電気泳動における環境情報をもとに、標準塩基長と、前記電気泳動により得られるスペクトルを基に求めたDNAの実測塩基長との対応を予測する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
  10. 請求項９に記載の遺伝子型解析方法であって、
    前記データ解析装置は、
    前記対応を予測する際に、前記環境情報に基づく環境条件に応じて、前記予測に用いる予測モデルを選択する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
  11. 請求項９に記載の遺伝子型解析方法であって、
    前記データ解析装置は、
    前記対応を予測する際に、予め定められた優先順に前記予測に用いる予測モデルを適用する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
  12. 請求項９に記載の遺伝子型解析方法であって、
    前記データ解析装置は、
    前記標準塩基長が既知のDNAを含むサンプルの電気泳動結果をデータセットとし、当該データセットから学習して前記予測に用いる予測モデルを作成する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
  13. 請求項１２に記載の遺伝子型解析方法であって、
    前記データ解析装置は、
    前記環境情報に基づく環境条件に応じて前記データセットを選択し、選択した前記データセットから学習して前記予測モデルを作成する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
  14. 請求項１０乃至１３のいずれか１項記載の遺伝子型解析方法であって、
    前記データ解析装置は、
    前記対応を予測する際に、前記標準塩基長が既知のDNAを常に含む実サンプルの電気泳動により得られる塩基長を参照することにより、前記予測の精度を評価する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
  15. 請求項１４記載の遺伝子型解析方法であって、
    前記データ解析装置は、
    前記予測の精度の評価結果に応じて、前記予測モデルを変更する、または予測モデルを新たに学習する、
    ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
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