WO2020171573A1 - 혈중 무세포 dna 기반 간암 치료 예후예측 방법 - Google Patents

혈중 무세포 dna 기반 간암 치료 예후예측 방법 Download PDF

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WO2020171573A1
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free dna
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류백렬
박숙련
조은해
이준남
전영주
공선영
김민경
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National Cancer Center Japan
Asan Foundation
National Cancer Center Korea
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
GC Genome Corp
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National Cancer Center Japan
Asan Foundation
National Cancer Center Korea
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Green Cross Genome Corp
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    • G16H50/50—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for simulation or modelling of medical disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the prognosis of liver cancer treatment based on blood cell-free DNA, and more specifically, by extracting cell free DNA (cfDNA) from a biological sample, obtaining sequence information, and then normalizing chromosomal regions.
  • cfDNA cell free DNA
  • liver cancer is the third most common cause of cancer death worldwide and is a cancer whose incidence is gradually increasing (Ferlay J et al., Int J Cancer Vol. 136:E359-86, 2015).
  • liver cancer which is the 6th highest number of all cancers, and the second highest cancer mortality rate.
  • the incidence rate of liver cancer by age was the most in 50s with 27.1%, while those in 60s and 70s accounted for 26.0% and 23.9%, respectively.
  • hepatocellular carcinoma is the main histological subtype accounting for 85-90% of all liver cancers.
  • hepatocellular carcinoma The main cause of the development of hepatocellular carcinoma is infection with hepatitis B and C virus.
  • long-term alcohol consumption and cirrhosis are also known as risk factors for liver cancer.
  • hepatocellular carcinoma was found within 5 years in 8% of patients with alcoholic cirrhosis and 4% of patients with cirrhosis, and it is known that the more severe the cirrhosis and the older the higher the risk of developing liver cancer (Fattovich G et al., Gastroenterology). , Vol. 127:S35-50, 2004).
  • chromosomes of cancer cells are characterized by frequent chromosomal abnormalities such as deletion, duplication, and translocation.
  • chromosomal abnormalities such as deletion, duplication, and translocation.
  • activation of oncogene or inactivation of tumor suppressor gene due to chromosomal abnormalities has a great influence on the occurrence of cancer.
  • duplication of chromosomes 1, 7, 8, 17, 20 and deletion of chromosomes 4, 8, 13, 16, and 17 show a high correlation with the onset of liver cancer (Zhou C, et al., Sci Rep. 2017 Vol. 7(1):10570).
  • somatic copy number alteration (SCNA) in liver cancer patients is p53 signaling (TP53, CDKN2A), Wnt/ ⁇ -catenin pathway (CTNNB1, AXIN1), chromosomal remodeling (ARID1A, ARID1B, ARID2) related genes and TERT related to telomerase maintenance. It appeared frequently in genes (Ng CKY, et al., Front Med (Lausanne). 2018 Vol. 5:78). These genes are genes related to the regulation of cell cycle and cell growth, and studies confirming the association between the genes in the development of liver cancer have been published (Ju-Seog Lee, Clin Mol Hepatol. 2015 Vol. 21(3): 220). -229).
  • cfDNA cell-free DNA
  • cfDNA cell-free DNA
  • plasma necrosis, apoptosis, and secretion.
  • studies are being conducted to detect chromosomal abnormalities.
  • blood cell-free DNA derived from tumor cells contains tumor-specific chromosomal abnormalities and mutations that do not appear in normal cells, and has the advantage of reflecting the current state of the tumor because its half-life is as short as 2 hours.
  • blood cell-free DNA is in the spotlight as a tumor-specific biomarker in various fields related to cancer such as cancer diagnosis, monitoring and prognosis observation.
  • microdeletions identified in the patient's cancer tissue DNA were analyzed from ctDNA obtained before and after surgery (Harris FR et al., Sci Rep. Vol. 6: 29831. 2016). As a result, microdeletion was detected in 8 patients before surgery and 3 recurrence patients out of 8 after surgery. Through this, it was confirmed that the detection of microdeletion of cell-free DNA in blood was clinically significant, and that tumor-specific chromosomal abnormalities were reflected in cell-free DNA in blood.
  • the present inventors made diligent efforts to develop a method for predicting the prognosis of liver cancer based on cell-free DNA in blood. As a result, when performing normalization correction and regression analysis of blood cell-free DNA concentration and chromosomal region, liver cancer patients with high sensitivity It was confirmed that the prognosis of can be predicted, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a method for predicting prognosis of liver cancer based on cell free DNA (cfDNA).
  • Another object of the present invention is to provide an apparatus for predicting the prognosis of liver cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a computer-readable medium including instructions configured to be executed by a processor for predicting a liver cancer prognosis by the above method.
  • Another object of the present invention is to provide a method of providing information for determining the prognosis of liver cancer, including the above method.
  • the present invention comprises the steps of: a) obtaining sequence information of a cell-free DNA isolated from a biological sample; b) aligning the sequence information (reads) with a reference genome database of a reference group; c) checking the quality of the aligned sequence information (reads), and selecting only sequence information having a cut-off value or more; d) dividing the standard chromosome into a predetermined section (bin), and confirming and normalizing the amount of each section with respect to the selected sequence information (reads); e) calculating the mean and standard deviation of the reads matched in each normalized bin of the reference group, and then calculating a Z score between the values normalized in step d); f) calculating an I score by classifying chromosomes using the Z score; And g) when the cut-off value of the I score is exceeded, the prognosis of liver cancer based on cell free DNA (cfDNA) comprising determining that the liver cancer prognosis is bad Provides a prediction
  • the present invention also includes a decoding unit for decoding the sequence information of the cell-free DNA isolated from the biological sample; An alignment unit for aligning the translated sequence to a reference group's standard chromosomal sequence database; A quality control unit that selects only sequence information of samples having a cut-off value or more for the aligned sequence information (reads); And for the selected sequence information (reads), a Z score is calculated by comparing it with a reference group sample, and then an I score is derived based on this, so that the I score is a cut-off value. value), a cfDNA-based liver cancer prognosis prediction apparatus including a determination unit that determines that the liver cancer prognosis is bad.
  • the present invention further includes, as a computer-readable medium, an instruction configured to be executed by a processor for predicting a prognosis of liver cancer, comprising: a) obtaining sequence information of a cell-free DNA isolated from a biological sample; b) aligning the sequence information (reads) with a reference genome database of a reference group; c) checking the quality of the aligned sequence information (reads), and selecting only sequence information having a cut-off value or more; d) dividing the standard chromosome into a predetermined section (bin), and confirming and normalizing the amount of each section with respect to the selected sequence information (reads); e) calculating the mean and standard deviation of the reads matched in each normalized bin of the reference group, and then calculating a Z score between the values normalized in step d); f) calculating an I score by classifying chromosomes using the Z score; And g) if the cut-off value of the I-score is exceeded, determining that the prognosis of liver
  • the present invention also provides a method of providing information for determining the prognosis of liver cancer, including the above method.
  • FIG. 1 is an overall flowchart for predicting prognosis of liver cancer based on cfDNA of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the correction result of the number of sequencing reads before and after GC calibration by the LOESS algorithm during the QC (quality control) process of read data.
  • 3 is a result of confirming the difference in blood cell-free DNA concentration between a normal person and a liver cancer patient.
  • the sequence analysis data obtained from a liver cancer patient sample is normalized, organized based on a reference value, and then divided into predetermined bins to normalize the read amount for each bin, and then compared with the reference group sample.
  • Calculate the Z score divide the chromosomes based on the derived Z score again (segmentation), and calculate the I score based on this, I-score It was confirmed that if) exceeded 1637, it could be judged as having a bad prognosis, and if it was less than 1637, it could be judged as having a good prognosis.
  • it can be identified by classifying the risk group for death or progression due to liver cancer according to the range of the I score.
  • the I score is 1638 to 3012, it is classified as a moderate risk group, if the I score is 3013 to 7448 and if it is 7449 to 13672, it is classified as a high risk group, and if the I score is 13673 to 28520, it is classified as an ultra-high risk group. Can be classified.
  • chromosomes are divided into predetermined bins to match each section.
  • the average and standard deviation of the reads that match each bin in the normal sample are calculated, and then the Z score with the normalized value is calculated and based on this
  • the I score is calculated using this, and if the I score exceeds 1637, the liver cancer patient's A method of determining that the prognosis is bad was developed (Fig. 1)
  • sequence information refers to one nucleic acid fragment obtained by analyzing sequence information using various methods known in the art. Therefore, in the present specification, the terms “sequence information” and “lead” have the same meaning in that they are a result of obtaining sequence information through a sequencing process.
  • prognosis is used in the same meaning as “prognosis”, and refers to an act of predicting the course and outcome of a disease in advance. More specifically, prognosis prediction is interpreted to mean any action that predicts the course of the disease after treatment by comprehensively considering the patient's physiological or environmental condition, and the course of the disease after treatment may vary depending on the patient's physiological or environmental condition. Can be.
  • the prognosis prediction may be interpreted as an act of predicting the progression of the disease after treatment of liver cancer and predicting the risk of cancer progression, recurrence of cancer, and/or metastasis of cancer.
  • the term "good prognosis” means that the risk of progression of cancer, recurrence of cancer and/or metastasis of cancer of a patient after liver cancer treatment represents a value lower than 1, so that the liver cancer patient is more likely to survive, In another sense, it is also expressed as "positive prognosis".
  • bad prognosis means that the risk of progression of cancer, recurrence of cancer, and/or metastasis of the patient after liver cancer treatment is higher than 1, and thus the probability of death of the liver cancer patient is high, and in other words, “ It is also expressed as "negative prognosis”.
  • the term "risk” refers to an odds ratio, a risk ratio, etc. to the probability that a patient will develop cancer progression, recurrence, and/or metastasis of cancer after treatment of liver cancer.
  • cfDNA Cell free DNA
  • (a-iv) It may be characterized in that it is performed by a method including the step of obtaining sequence information (reads) of the nucleic acid in the next-generation gene sequence tester.
  • the nucleic acid purified in the (ai) step is subjected to enzymatic digestion, pulverization, or random fragmentation by a hydroshear method to single-ended It can be performed by a method further comprising the step of preparing a sequencing or pair-end sequencing library.
  • the step of obtaining the sequence information of step a) may be characterized in that the separated cell-free DNA is obtained through full-length genome sequencing at a depth of 1 million to 100 million reads.
  • the term “reference group” is a reference group that can be compared like a standard sequence database, and refers to a group of people who do not currently have a specific disease or condition.
  • the standard nucleotide sequence in the reference group's standard chromosome sequence database may be a reference chromosome registered in a public health institution such as NCBI.
  • the next-generation sequencer is not limited thereto, but the Illumina Company's Hiseq system, the Illumina Company's Miseq system, and the Illumina Company's genome It could be an analyzer (GA) system, the Roche Company's 454 FLX, the Applied Biosystems Company's SOLiD system, and the Life Technologies Company's Ion Torrent system.
  • G analyzer
  • Roche Company's 454 FLX the Roche Company's 454 FLX
  • the Applied Biosystems Company's SOLiD system the Life Technologies Company's Ion Torrent system.
  • the alignment step is not limited thereto, but may be performed using the BWA algorithm and the Hg19 sequence.
  • the BWA algorithm may include BWA-ALN, BWA-SW or Bowtie2, but is not limited thereto.
  • checking the quality of the aligned sequence information in step c) means checking how much the actual sequencing read matches the reference chromosome sequence by using an alignment matching score (Mapping Quality Score) index. do.
  • (c-ii) selecting a sequence that satisfies a reference value of a mapping quality score and a GC ratio within the region; It may be characterized in that it is performed, including.
  • the region of the nucleic acid sequence in step (c-i) is not limited thereto, but may be 20 kb to 1 MB.
  • the reference value in the step (c-ii), may vary according to a desired criterion, but specifically 15 to 70, more specifically 30 to 65, Most specifically, it may be 60.
  • the GC ratio may vary according to a desired criterion, but it may be specifically 20 to 70%, more specifically 30 to 60%.
  • step c) may be characterized in that it is performed excluding data on the central body or the terminal body of the chromosome.
  • central body may be characterized in that it is about 1 Mb from the starting point of each chromosome q arm, but is not limited thereto.
  • terminal group may be characterized in that it is within 1 Mb from the start point of each chromosome p arm or within 1 Mb from the end point of the long arm (q arm), but is not limited thereto.
  • (d-iv) It may be characterized in that it is performed, including the step of normalizing the number of reads using the regression coefficient.
  • the predetermined interval (bin) in (d-i) may be, specifically, 100 kb to 2000 kb.
  • a predetermined interval (bin) is not limited thereto, but is 100 kb to 2 MB, specifically 500 kb to 1500 kb, more specifically 600 kb to It may be 1600 kb, more specifically 800 kb to 1200 kb, and most specifically 900 kb to 1100 kb.
  • the regression analysis in step (iii) may be used as long as it is a regression analysis method capable of calculating a regression coefficient, but may be specifically characterized in that it is a LOESS analysis, but is not limited thereto.
  • the step of calculating the Z score in step e) may be characterized by standardizing the sequencing read value for each specific area (bin), and specifically, calculated by Equation 1 below. It can be characterized.
  • step (f) is
  • the reference value of the average absolute value of the Z score is 1-2, and more specifically, it may be characterized in that it is 2.
  • the CBS algorithm refers to a method of detecting a point at which a change in the Z score calculated in the above step occurs.
  • i is the random point where the change of the Z score of the chromosome starts
  • j is the ending point
  • the total length of the region is N
  • r is the bin value of each nucleic acid sequence (specific bin section)
  • s is the standard of bin values
  • ( i c , j c ) means the location where the Z score change actually occurred, max means the maximum value, and arg means the declination angle.
  • the reference value of the I score may be characterized in that 1637.
  • the method may further include the step of determining that the concentration of the cell-free DNA is a poor prognosis when the concentration of the cell-free DNA exceeds a reference value by measuring the concentration of the isolated cell-free DNA.
  • the reference value of the isolated cell-free DNA concentration may be characterized in that 0.71 ng/ ⁇ l.
  • the method further comprises the step of classifying as a moderate risk group if the I score is 1638 to 3012, classifying it as a high risk group if it is 3013 to 13672, and classifying it as an ultra-high risk group if it is 13673 to 28520. It may be characterized by including.
  • a decoding unit for decoding the sequence information of the cell-free DNA isolated from the biological sample;
  • An alignment unit for aligning the translated sequence to a reference group's standard chromosomal sequence database;
  • a quality control unit that selects only sequence information of samples having a cut-off value or more for the aligned sequence information (reads); And, for the selected sequence information (reads), the Z score is calculated by comparing it with the reference group sample, and then I-score is derived based on this, when the I score exceeds the reference value.
  • It relates to a cfDNA-based liver cancer prognosis prediction apparatus including a determining unit to determine a bad prognosis.
  • the reference value of the I score may be characterized in that 1637.
  • the device may further include a concentration-based prognosis determining unit that measures the concentration of the isolated cell-free DNA and determines that the concentration of the cell-free DNA exceeds a reference value, which determines that the prognosis is bad. .
  • the reference value of the isolated cell-free DNA concentration may be characterized in that 0.71 ng/ ⁇ l.
  • the present invention includes an instruction configured to be executed by a processor for predicting a liver cancer prognosis, a) obtaining sequence information of a cell-free DNA isolated from a biological sample; b) aligning the sequence information (reads) with a reference genome database of a reference group; c) checking the quality of the aligned sequence information (reads), and selecting only sequence information having a cut-off value or more; d) dividing the standard chromosome into a predetermined section (bin), and confirming and normalizing the amount of each section with respect to the selected sequence information (reads); e) calculating the mean and standard deviation of the reads matched in each normalized bin of the reference group, and then calculating a Z score between the values normalized in step d); f) calculating an I score by classifying chromosomes using the Z score; And g) if it exceeds the reference value of the I-score, it relates to a computer-readable medium comprising instructions configured to be executed by a processor comprising instructions configured
  • the reference value of the I score may be characterized in that 1637.
  • the processor may further include the step of determining that the concentration of the isolated cell-free DNA is a bad prognosis when the concentration of the isolated cell-free DNA exceeds a reference value.
  • the reference value of the isolated cell-free DNA concentration may be characterized in that 0.71 ng/ ⁇ l.
  • the present invention relates to a method for providing information for determining the prognosis of liver cancer, including the method.
  • the liver cancer is not limited as long as it is any type of cancer that occurs in the liver, and more specifically, hepatocellular carcinoma (hepatocellular carcinoma with or without fibrous lamella), cholangiocarcinoma (intrahepatic gallbladder duct carcinoma), and mixed hepatocyte Including, but not limited to, cholangiocarcinoma.
  • hepatocellular carcinoma hepatocellular carcinoma with or without fibrous lamella
  • cholangiocarcinoma intrahepatic gallbladder duct carcinoma
  • mixed hepatocyte Including, but not limited to, cholangiocarcinoma.
  • the term "prognosis" of the present invention means the prediction of the progression of cancer, recurrence of cancer and/or the possibility of metastasis of cancer.
  • the prediction method of the present invention can be used to clinically make treatment decisions by selecting the most appropriate treatment modality for any particular patient.
  • the prediction method of the present invention is a valuable tool to assist in diagnosis and/or diagnosis in determining whether a patient's cancer progression, cancer recurrence, and/or cancer metastasis are likely to occur.
  • Cell-free DNA was extracted from plasma samples from 151 liver cancer patients and from 14 normal human plasma samples, and a library for full-length chromosomes was prepared.
  • Cell-free DNA was extracted in the following order. 1) Separation of supernatant (plasma) by sequential centrifugation at 1600g for 10 minutes and 3000g for 10 minutes within 4 hours after blood collection in EDTA Tube; 2) Cell-free DNA extraction with QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit using 1.5 ml of the separated plasma; 3) The final extracted cell-free DNA was reacted with Qubit 2.0 Fluorometer and the concentration (ng/ul) was measured; The library was prepared based on Illumina's Truseq nano kit, and a total of 5 ng of cell-free DNA was used for the reaction. Table 1 shows the information of 151 liver cancer patients who participated in the study.
  • the completed library was subjected to sequencing in NextSeq equipment, and an average of 10 million reads (1 million reads-100 million reads) of sequence information data per sample was produced.
  • the fastq file was aligned with the reference chromosome Hg19 sequence based on the BWA-mem algorithm. It was confirmed that the mapping quality score satisfies 60.
  • the process of segmenting the chromosome with the CBS algorithm was preceded by using the calculated Z score for each bin as data.
  • the sum of these values was used to calculate the I-score of each sample. It was judged as a sample with an increase in the amount of cellular DNA and a poor prognosis for Sorafenib treatment.
  • the I-score was calculated by Equation 2 below, and the I-score values according to the percentile are shown in Table 2.
  • the distribution of cell-free DNA concentration values extracted from plasma of a total of 151 liver cancer patients was 0.13 ng/ul to maximum 15.00 ng/ul, and the median value was 0.71 ng/ul.
  • the distribution of cell-free DNA concentration values in 14 normal subjects was from 0.28 ng/ul to 0.54 ng/ul, and the median was 0.34 ng/ul.
  • the test for the difference between the two groups was conducted by the Mann-Whitney Test, and as a result, it was confirmed that there is a significant difference (p ⁇ 0.0001) (Fig. 3).
  • the blood cell-free DNA concentration also affected the prognosis (survival and asymptomatic period; Overall Survival and Time To Progression) of 151 liver cancer patients.
  • the risk of survival (Overall Survival) and Time To Progression (Time To Progression) was evaluated based on the median value of 0.71 ng/ul of the blood cell-free DNA concentration of 151 people. All 151 liver cancer patients took 400mg of sorafenib twice a day, and the evaluation of the chemotherapy response was conducted every 6-8 weeks according to the RECIST guideline Version 1.1.
  • the I-score of a total of 151 liver cancer patients ranged from 256 to 28,520 with a median value of 1637. In 14 normal subjects, no Somatic CNA was found, so all I-score values were 0. Was evaluated based on the median I-score of 1637. All 151 liver cancer patients took 400mg of sorafenib twice a day, and the evaluation of the chemotherapy response was conducted every 6-8 weeks according to the RECIST guideline Version 1.1.
  • 95% CI, 2.19-11.41; p 0.0001)
  • 8th quartile ( 13673 ⁇ 28520 ) was 7.72 (95% CI, 3.31-18.02; p ⁇ 0.0001) showed a tendency to gradually increase (Fig. 6).
  • the liver cancer prognosis prediction method uses Next Generation Sequencing (NGS) to improve the prognostic accuracy of liver cancer patients, as well as the accuracy of prognostic prediction based on a very low concentration of cell-free DNA that was difficult to detect It can increase commercial utilization by increasing the value. Therefore, the method of the present invention is useful for determining the prognosis of patients with liver cancer.
  • NGS Next Generation Sequencing

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Abstract

본 발명은 본 발명은 혈중 무세포 DNA 기반의 간암 치료 예후예측 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 간암 예후예측 방법은 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용하여 간암 환자의 예후예측 정확도를 높일 뿐만 아니라 검출하기 어려웠던 매우 낮은 농도의 무세포 DNA에 기반의 예후예측 정확도를 높여서 상업적 활용도를 높일 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 간암 환자의 예후 판단에 유용하다.

Description

혈중 무세포 DNA 기반 간암 치료 예후예측 방법
본 발명은 혈중 무세포 DNA 기반의 간암 치료 예후예측 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생체시료에서 무세포 DNA(cell free DNA, cfDNA)를 추출하여, 서열정보를 획득한 다음, 염색체 영역의 정규화 교정 및 회귀분석을 이용한 무세포 DNA 기반의 간암 치료 예후예측 방법에 관한 것이다.
원발성 간암은 전 세계적으로 세 번째로 흔한 암 사망 원인이며 그 발생빈도가 점차 증가하고 있는 암이다(Ferlay J et al., Int J Cancer Vol. 136:E359-86, 2015). 2015년 우리나라에서 발생한 214,701건의 암 중 7.3%에 해당하는 15,757건이 간암이었고 이는 전체 암 중 6번째로 많은 수 이며 암 사망률 또한 2위의 높은 순위를 보였다. 연령별 간암의 발생 비율은 50대가 27.1%로 가장 많았고 60대, 70대가 각각 26.0%, 23.9%를 차지하였다. 원발성 간암 중 간세포암은 전체 간암의 85~90%를 차지하는 주된 조직학적 아형이다. 간세포암 발병의 주된 원인으로는 B형과 C형 간염바이러스의 감염을 들 수 있다. 또한 간염바이러스 외에도 장기간의 음주와 간경변증 역시 간암의 위험요인으로 알려져 있다. 알코올성 간경변증 환자의 8%, 간경병증 환자의 4%에서 5년 내에 간세포암이 발견되었다는 연구결과가 있으며 간경변증이 심할수록, 연령이 높을수록 간암 발생위험이 높다고 알려져 있다(Fattovich G et al., Gastroenterology, Vol. 127:S35-50, 2004).
암은 세포의 유전자 돌연변이가 누적되면서 세포분열이 정상적으로 조절되지 않아 발생한다. 때문에 암세포의 염색체는 결실이나 중복, 전좌와 같은 염색체이상(chromosomal abnormality)이 빈번하게 나타나는 특징이 있다. 특히 염색체이상으로 인한 종양유전자(Oncogene)의 활성화 또는 종양억제유전자(Tumor suppressor gene)의 비활성화가 암의 발생에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 간암의 경우 1, 7, 8, 17, 20번 염색체의 중복과 4, 8, 13, 16, 17번 염색체의 결실이 간암의 발병과 높은 연관성을 보이는 것으로 알려져 있다(Zhou C, et al., Sci Rep. 2017 Vol. 7(1):10570). 특히 간암 환자의 somatic copy number alteration(SCNA)는 p53 signaling(TP53, CDKN2A), Wnt/β-catenin pathway(CTNNB1, AXIN1), chromosomal remodeling(ARID1A, ARID1B, ARID2) 관련 유전자들 및 telomerase maintenance와 관련된 TERT유전자에서 빈번하게 나타났다(Ng CKY, et al., Front Med (Lausanne). 2018 Vol. 5:78). 해당 유전자들은 세포 주기와 세포성장 조절과 관련된 유전자들이며 간암의 발생에 있어 해당 유전자들 간에 연관성을 확인한 연구들이 발표된 바 있다(Ju-Seog Lee, Clin Mol Hepatol. 2015 Vol. 21(3): 220-229). 염색체 이상으로 인한 암의 발생 기작에 관한 연구들이 이루어지면서 암의 진단 및 예후관측의 지표로 활용하려는 노력이 계속되고 있다(Parker BC and Zhang W, Chin J Cancer. Vol. 11:594-603. 2013).
더 나아가 최근에는 액체생검(Liquid biopsy) 기술을 이용하여 세포의 괴사(necrosis), 세포자살(apoptosis), 분비(secretion)에 의해 혈장 내에 존재하는 무세포 DNA(cfDNA; cell-free DNA)를 이용하여 염색체이상을 검출하려는 연구들이 진행되고 있다. 특히 종양세포에서 유래된 혈중 무세포 DNA는 정상세포에서 나타나지 않는 종양 특이적인 염색체이상 및 돌연변이를 포함하고 있으며, 반감기가 2시간 정도로 짧아서 종양의 현재상태를 반영한다는 장점이 있다. 또한 비침습적이고 반복적으로 채취가 가능하기 때문에 혈중 무세포 DNA는 암의 진단, 모니터링 및 예후 관측 등 암과 관련된 다양한 분야에서 종양 특이적인 생체 표지자로써 각광받고 있다. 최근 분자진단기술이 발전하면서 Digital Karyotyping, PARE 분석 등을 통해 암 환자의 혈중 무세포 DNA에서 종양 특이적인 염색체이상을 검출이 가능하다는 연구와 함께 이를 임상적으로 확인한 연구결과들이 발표된 바 있다(Leary RJ et al., Sci Transl Med. Vol. 4, Issue 162. 2012).
난소암 환자 10명을 대상으로 한 Faye R. Harris의 연구에 따르면, 환자의 암 조직 DNA에서 확인한 미세결실을 수술 전후에 얻은 ctDNA에서 분석한 바 있다(Harris FR et al., Sci Rep. Vol. 6: 29831. 2016). 그 결과, 수술 전 8명의 환자, 수술 후 8명 중 3명의 재발환자 모두에게서 미세결실을 검출 하였다. 이를 통해 혈중 무세포 DNA의 미세결실 검출이 임상적으로 유의미하며, 종양 특이적인 염색체 이상이 혈중 무세포 DNA에 반영되는 것을 확인하였다.
이외에도 Daniel G. Stover는 전이성 TNBC(Triple-Negative Breast Cancer)환자 164명을 대상으로 cfDNA를 통해 조직특이적 CNA를 분석한 바 있다(Stover DG. et al., J Clin Oncol. Vol. 36(6):543-553). 그 결과, NOTCH2, AKT2, AKT3와 같은 특정 유전자의 copy number gain이 전이성 TNBC에서 원발성 TNBC에 비해 높게 나타났으며, 18q11과 19p13 염색체의 중복을 가진 전이성 TNBC 환자의 생존율이 통계적으로 유의하게 낮은 것을 확인한 바 있다.
이러한 기술배경하에, 본 발명자들은 혈중 무세포 DNA 기반의 간암 예후예측 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 혈중 무세포 DNA 농도와 염색체 영역의 정규화 교정 및 회귀분석을 수행할 경우, 높은 민감도로 간암 환자의 예후를 예측할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 무세포 DNA(Cell Free DNA, cfDNA) 기반의 간암 예후예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 간암 예후를 예측하는 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 간암 예후를 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 포함하는 간암의 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계; b) 상기 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계; d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화하는 단계; e) 참조집단의 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수를 계산하는 단계; f) 상기 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수를 계산하는 단계; 및 g) 상기 I 점수(I-score)의 기준값(cut-off value)을 초과할 경우, 간암 예후가 나쁜 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 무세포 DNA(cell free DNA, cfDNA) 기반의 간암 예후예측 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 기준값(cut-off value) 이상인 샘플의 서열정보만 선별하는 품질관리부; 및 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 참조집단 샘플과 비교하여 Z 점수(Z score)를 계산한 다음, 이를 바탕으로 I 점수(I-score)를 도출하여, I 점수가 기준값(cut-off value)을 초과할 경우, 간암 예후가 나쁜 것으로 판정하는 결정부를 포함하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 컴퓨터 판독 가능한 매체로서, 간암 예후를 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계; b) 상기 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계; d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화하는 단계; e) 참조집단의 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수를 계산하는 단계; f) 상기 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수를 계산하는 단계; 및 g) 상기 I 점수(I-score)의 기준값(cut-off value)을 초과할 경우, 간암 예후가 나쁜 것으로 판정하는 단계를 포함하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법을 포함하는 간암의 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 cfDNA 기반 간암 예후예측을 위한 전체 흐름도이다.
도 2는 read data의 QC(퀄리티 관리, quality control) 과정 중, LOESS 알고리즘에 의한 GC 교정 전과 후의 시퀀싱 리드 수의 보정결과를 도식화 한 것이다.
도 3은 정상인과 간암 환자의 혈중 무세포 DNA 농도 차이를 확인한 결과이다.
도 4는 혈중 무세포 DNA 농도에 따른 간암의 진행 및 생존 여부에 대한 평가 결과이다.
도 5는 본 발명의 방법에 따른 간암의 진행 및 생존 여부에 대한 예후 예측 결과이다.
도 6은 본 발명의 I 점수를 세분화한 그룹별 간암 환자의 생존 여부에 대한 예후 예측 결과이다.
도 7은 본 발명의 I 점수를 세분화한 그룹별 간암의 진행에 대한 예후 예측 결과이다.
도 8은 본 발명의 I 점수와 혈중 무세포 DNA 농도의 상관관계를 확인한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 간암 환자 샘플에서 획득한 서열 분석 데이터를 정규화하고, 기준값을 바탕으로 정리한 뒤, 일정 구간(bin)으로 나누어 각 구간(bin) 별 리드 양을 정규화 한 다음, 참조집단 샘플과의 Z 점수(Z score)를 계산하고, 도출된 Z 점수(Z score)를 기반으로 염색체를 다시 나눈 뒤(segmentation), 이를 바탕으로 I 점수(I-score)를 계산하여, I 점수(I-score)가 1637을 초과하면, 나쁜 예후를 나타내고 1637 이하이면 좋은 예후를 나타내는 것으로 판단할 수 있다는 것을 확인하였다. 구체적으로, I 점수의 범위에 따라 간암에 의한 사망 또는 진행에 대한 위험군을 분류하여 확인할 수 있다. 보다 구체적으로, I 점수가 1638 내지 3012인 경우, 중등도 위험군으로 분류되고, I 점수가 3013 내지 7448인 경우 및 7449 내지 13672인 경우 고도 위험군으로 분류되고, I 점수가 13673 내지 28520인 경우 초고도 위험군으로 분류될 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 정상인 14명과 간암 환자 151명의 혈액에서 추출한 DNA를 시퀀싱 한 뒤, LOESS 알고리즘을 이용하여 품질을 관리하고, 염색체를 일정 구간(bin)으로 구분하여 각 구간 별 매칭되는 리드 양을 GC 비율로 정규화한 다음, 정상인 샘플에서 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한다음, 상기 정규화한 값과의 Z 점수(Z score)를 계산하고 이를 기반으로 Z 점수(Z score)가 급변하는 염색체 영역을 다시 나눈 뒤(segmentation), 이를 이용하여 I 점수(I-score)를 계산하여, I 점수(I-score)가 1637을 초과할 경우, 간암 환자의 예후가 나쁘다고 판정하는 방법을 개발하였다(도 1)
본 발명에서 용어 "리드(reads)"는, 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 서열정보를 분석한 하나의 핵산 단편을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “서열정보” 및 “리드”는 시퀀싱 과정을 통해 서열정보를 수득한 결과물이라는 점에서 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서 용어 "예후예측"이란, "예후"와 동일한 의미로 사용되는데, 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후예측이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 예후예측은 간암의 치료 후, 질환의 경과를 미리 예상하여 암의 진행, 암의 재발 및/또는 암의 전이의 위험도를 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, 용어 "좋은 예후"는 간암 치료 후 환자의 암의 진행, 암의 재발 및/또는 암의 전이의 위험도가 1보다 낮은 값을 나타내어, 간암 환자가 생존할 가능성이 높다는 것을 의미하고, 다른 의미로 "긍정적 예후"로도 표현된다. 용어 "나쁜 예후"는 간암 치료 후 환자의 암의 진행, 암의 재발 및/또는 암의 전이의 위험도가 1보다 높은 값을 나타내어, 간암 환자가 사망할 가능성이 높다는 것을 의미하고, 다른 의미로 "부정적 예후"로도 표현된다.
본 발명에서 용어 "위험도"란, 간암의 치료 후, 환자가 암의 진행, 재발 및/또는 암의 전이 등이 나타날 확률에 대한 오즈비, 위험비 등을 의미한다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서,
a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계;
b) 상기 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계;
d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화하는 단계;
e) 참조집단의 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수를 계산하는 단계;
f) 상기 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수를 계산하는 단계; 및
g) 상기 I 점수(I-score)의 기준값(cut-off value)을 초과할 경우, 간암 예후가 나쁜 것으로 판정하는 단계를 포함하는 무세포 DNA(cell free DNA, cfDNA) 기반의 간암 예후예측 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서,
상기 a) 단계는
(a-i) 채취된 무세포 DNA에서 염석 방법(salting-out method), 컬럼크로마토그래피 방법(column chromatography method), 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
(a-i) 상기 정제된 핵산에 대하여, 싱글-엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어-엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
(a-iii) 상기 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
(a-iv) 상기 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 (a-i) 및 상기 (a-ii) 단계 사이에, 상기 (a-i) 단계에서 정제된 핵산을, 효소적 절단, 분쇄 또는 하이드로쉐어방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)하여 싱글-엔드 시퀀싱 또는 페어-엔드 시퀀싱 라이브러리를 제작하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 서열정보를 획득하는 단계는 분리된 무세포 DNA를 1백만 내지 1억 리드 깊이로 전장 유전체 시퀀싱을 통해 획득하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어 ”참조집단”은 표준 염기서열 데이터베이스와 같이 비교할 수 있는 기준(reference) 집단으로, 현재 특정 질환 또는 병증이 없는 사람의 집단을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에서 표준 염기서열은 NCBI 등의 공공보건기관에 등록되어 있는 참조 염색체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 차세대 유전자서열 검사기(next-generation sequencer)는 이에 제한되지는 않으나, 일루미나 컴파니의 하이섹(Hiseq) 시스템, 일루미나 컴파니의 마이섹(Miseq) 시스템, 일루미나 컴파니의 게놈 분석기(GA) 시스템, 로슈 컴파니(Roche Company)의 454 FLX, 어플라이드 바이오시스템즈 컴파니의 SOLiD 시스템, 라이프 테크놀러지 컴파니의 이온토렌트 시스템일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 정렬단계는 이에 제한되지는 않으나, BWA 알고리즘 및 Hg19 서열을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 BWA 알고리즘은 BWA-ALN, BWA-SW 또는 Bowtie2 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계에서 상기 정렬된 서열정보에 대하여 퀄리티를 확인하는 것은, 정렬 일치도 점수(Mapping Quality Score) 지표를 이용하여 실제 시퀀싱 리드가 참조 염색체 서열과 얼마나 일치하는지를 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계는
(c-i) 각 정렬된 핵산서열의 영역을 특정하는 단계; 및
(c-ii) 상기 영역 내에서 정렬 일치도 점수(mapping quality score)와 GC 비율의 기준값을 만족하는 서열을 선별하는 단계; 를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c-i) 단계의 핵산서열의 영역을 특정하는 단계에서, 핵산서열의 영역은 이에 제한되는 않으나, 20kb~1MB일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c-ii) 단계에서, 상기 기준값은 상기 정렬 일치도 점수(mapping quality score)는 원하는 기준에 따라 달라질 수 있으나, 구체적으로는 15 내지 70, 보다 구체적으로는 30 내지 65, 가장 구체적으로는 60일 수 있다. 상기 (c-ii) 단계에서, 상기 GC 비율이 원하는 기준에 따라 비율이 달라질 수 있으나, 구체적으로는 20 내지 70%, 보다 구체적으로는 30 내지 60% 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단계는 염색체의 중심체 또는 말단체의 데이터를 제외하고 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어 “중심체”는 각 염색체 장완(q arm)의 시작점으로부터 1Mb 내외인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 “말단체”는 각 염색체 단완(p arm)의 시작점으로부터 1 Mb 내외 이내 또는 장완(q arm)의 종료점으로부터 1 Mb 이내인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 d) 단계는
(d-i) 표준 염색체를 일정구간(bin)으로 나누는 단계;
(d-ii) 상기 구간별 정렬된 리드 개수 및 리드들의 GC양을 산출하는 단계;
(d-iii) 상기 리드 개수 및 GC양을 바탕으로 회귀분석을 실시하여 회귀계수를 산출하는 단계; 및
(d-iv) 상기 회귀계수를 이용하여 리드 개수를 정규화하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, (d-i)에서의 일정구간(bin)은, 구체적으로는 100 kb 내지 2000 kb 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d-i) 단계의 핵산서열의 영역을 특정하는 단계에서, 일정구간(bin)은 이에 제한되는 않으나, 100 kb 내지 2MB, 구체적으로 500kb 내지 1500 kb, 보다 구체적으로는 600kb 내지 1600 kb, 보다 더 구체적으로 800kb 내지 1200 kb, 가장 구체적으로 900 kb 내지 1100 kb 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (iii) 단계의 회귀분석은 회귀계수를 산출할 수 있는 회귀분석 방법이면 모두 이용가능하나, 구체적으로는 LOESS 분석인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 e) 단계의 Z 점수(Z score)를 계산하는 단계는 특정 영역(bin)별 시퀀싱 리드 값을 표준화하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로는 하기의 수식 1로 계산하는 것을 특징으로 할 수 있다.
Figure PCTKR2020002359-appb-I000001
본 발명에 있어서, 상기 (f) 단계는
(f-i) 각 구간별 Z 점수(Z score)를 기반으로 CBS 방법(Circular Binary segmentation method)으로 염색체 영역을 구분하는 단계;
(f-ii) 상기 구분된 구역의 Z 점수(Z score)의 평균 절대값이 기준값 이상인 지역의 염색체 길이(size)를 구하는 단계; 및
(f-iii) 하기 수식 2로 I 점수(I-score)를 계산하는 단계:
Figure PCTKR2020002359-appb-I000002
본 발명에 있어서, 상기 Z 점수(Z score)의 평균 절대값의 기준값은 1-2이고, 보다 구체적으로는 2인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 CBS 알고리즘은 상기 단계에서 계산된 Z 점수의 변화가 발생하는 지점을 검출하는 방법을 의미한다.
즉, 염색체의 Z 점수의 변화가 시작되는 임의의 지점을 i, 끝나는 임의의 지점을 j, 전체 영역 길이를 N, r을 각 핵산 서열(특정 bin 구간)의 bin 값, s를 bin 값들의 표준 편차라고 가정하면 1<=i<j<=N의 조건 하에서, 아래의 식을 만족한다.
Figure PCTKR2020002359-appb-I000003
여기서 (i c, j c)는 Z 점수 변화가 실제 일어난 위치를 의미하며, max는 최대값, arg는 편각을 의미한다.
본 발명에 있어서 상기 I 점수의 기준값은 1637인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 분리된 무세포 DNA의 농도를 측정하여, 무세포 DNA의 농도가 기준값을 초과하면 나쁜 예후인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분리된 무세포 DNA 농도의 기준값은 0.71ng/μl인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 I 점수가 1638 내지 3012인 경우, 중등도 위험군으로 분류하고, 3013 내지 13672인 경우, 고도 위험군으로 분류하고, 13673 내지 28520인 경우 초고도 위험군으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 해독하는 해독부; 해독된 서열을 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부; 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 기준값(cut-off value) 이상인 샘플의 서열정보만 선별하는 품질관리부; 및 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 참조집단 샘플과 비교하여 Z 점수(Z score)를 계산한 다음, 이를 바탕으로 I 점수(I-score)를 도출하여, I 점수가 기준값을 초과할 경우, 나쁜 예후로 판정하는 결정부를 포함하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 장치에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 I 점수의 기준값은 1637인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 장치는 분리된 무세포 DNA의 농도를 측정하여, 무세포 DNA의 농도가 기준값을 초과하면 나쁜 예후인 것으로 판단하는 농도 기반 예후 결정부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분리된 무세포 DNA 농도의 기준값은 0.71ng/μl인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 간암 예후를 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되, a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계; b) 상기 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계; c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계; d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화하는 단계; e) 참조집단의 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수를 계산하는 단계; f) 상기 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수를 계산하는 단계; 및 g) 상기 I 점수(I-score)의 기준값을 초과할 경우, 나쁜 예후인 것으로 판정하는 단계를 포함하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 I 점수의 기준값은 1637인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로세서는 분리된 무세포 DNA의 농도를 측정하여, 분리된 무세포 DNA의 농도가 기준값을 초과하면 나쁜 예후인 것으로 판단하하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분리된 무세포 DNA 농도의 기준값은 0.71ng/μl인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 방법을 포함하는 간암의 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 간암은 간에서 발생하는 모든 종류의 암이면 제한없으며, 보다 구체적으로는 간세포 암종 (섬유층판성 변형이 있거나 없는 간 세포 암종), 담관암종 (간내 쓸개관 암종) 및 혼합 간세포 담관암종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 “예후(prognosis)”는 암의 진행, 암의 재발 및/또는 암의 전이 가능성의 예측을 의미한다. 본 발명의 상기 예측 방법은 임의의 특정환자에 대한 가장 적절한 치료 양식을 선택하는 것으로 임상적으로 치료 결정을 내리기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 예측 방법은 환자의 암의 진행, 암의 재발 및/또는 암의 전이가 발생할 가능성이 높은지를 판단하는 것에 대한 진단 및/또는 진단을 보조하는 가치있는 도구이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 간암 환자 및 정상인에서 I-score 계산
151명 간암 환자의 혈장검체와 14명의 정상인 혈장검체에서 무세포 DNA를 추출하고 전장 염색체에 대한 라이브러리를 제조하였다. 무세포 DNA의 추출은 다음과 같은 순서로 진행하였다. 1) EDTA Tube채혈 후 4시간 이내에 1600g에서 10분, 3000g에서 10분 순차적으로 원심분리하여 상층액(혈장)을 분리; 2) 분리한 혈장 중 1.5ml을 사용하여 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit로 무세포 DNA 추출; 3) 최종 추출된 무세포DNA를 Qubit 2.0 Fluorometer에 반응시키고 농도(ng/ul) 측정; 라이브러리의 제조는 일루미나의 Truseq nano kit를 기반으로 진행하였으며 총 5ng의 무세포 DNA를 반응에 사용하였다. 연구에 참여한 151명 간암환자의 정보는 표 1과 같다.
Figure PCTKR2020002359-appb-T000001
Figure PCTKR2020002359-appb-I000004
완성된 라이브러리는 NextSeq 장비에서 염기서열 분석을 수행하였으며, 샘플당 평균 10 million read(1 million read - 100 million read)의 서열정보 데이터를 생산하였다.
차세대염기서열분석(NGS) 장비에서 Bcl 파일(염기서열정보 포함)을 fastq 형식으로 변환한 다음, fastq 파일을 BWA-mem 알고리즘을 사용하여 참조염색체 Hg19서열 기준으로 라이브러리 서열을 정렬하였다. 정렬 일치도 점수(Mapping quality score)가 60을 만족하는 것을 확인하였다.
GC양에 따라 각 염색체 좌위 구간(bin)의 시퀀싱 리드 수의 분포가 편향되는 것을 확인했고(도 2), 회귀분석을 사용하여 염색체별 GC 비율에 따라 정렬된 라이브러리 서열의 숫자를 교정하였다.
이후 하기 수식 1로 Z 점수(Z score)를 계산하였다:
Figure PCTKR2020002359-appb-I000005
I-score를 계산하기 위해, 계산된 bin별 Z score를 데이터로 사용해, CBS 알고즘으로, 염색체를 분할(Segmentation)하는 과정이 선행되었다.
평균 Z score 값이 절대값 2 이상인 분할 지역의 평균 Z score 와 염색체 길이를 곱한 뒤, 이 값들의 합으로 각 샘플의 I-score를 구하였고 I-score 값이 1637을 넘어가는 샘플은 혈액 내 무세포 DNA의 양이 증가하고 Sorafenib 치료에 대한 예후가 좋지 않은 샘플로 판단하였다. I-score는 하기의 수식 2로 계산하였으며, 백분위에 따른 I-score의 값은 표 2와 같다.
Figure PCTKR2020002359-appb-I000006
Figure PCTKR2020002359-appb-T000002
실시예 2. 혈중 무세포 DNA 농도(ng/μl)가 간암의 진행 및 생존에 미치는 영향 확인
총 151명 간암 환자의 혈장에서 추출한 무세포 DNA 농도 값 분포는 최소 0.13 ng/ul에서 최대 15.00 ng/ul 였으며, 중간값(Median)은 0.71 ng/ul였다. 정상인 14명의 무세포 DNA 농도 값 분포는 최소 0.28 ng/ul에서 최대 0.54 ng/ul 였으며, 중간값(Median)은 0.34 ng/ul였다. 두 군의 차이에 대한 검정은 Mann-Whitney Test로 진행하였으며, 그 결과 유의미하게 차이가 있는 것(p<0.0001)을 확인하였다(도 3).
혈중 무세포 DNA 농도는 간암 환자 151명의 예후(생존 여부와 무증악기간; Overall Survival and Time To Progression)에도 영향을 주었다. 151명의 혈중 무세포 DNA 농도의 중간값인 0.71 ng/ul을 기준으로 하여 해당 값을 초과하였을 때의 생존 여부(Overall Survival)와 무증악기간(Time To Progression)에 대한 위험도를 평가하였다. 151 명의 간암 환자는 모두 400mg의 sorafenib을 1일당 2회씩 복용하였으며, 항암치료 반응에 대한 평가는 RECIST 가이드라인 Version 1.1에 의거하여 6-8주 단위로 진행하였다.
분석 결과, 무세포 DNA 농도가 0.71 ng/ul을 초과하였을 때 무증악기간에 대한 위험비(Hazard Ratio, HR)가 1.71(95% CI, 1.20-2.44; log-rank p=0.002)이었으며, 생존 여부에 대한 위험비(Hazard Ratio, HR)가 3.50(95% CI, 2.36-5.20; log-rank p<0.0001)이었다. 이를 근거로 무세포 DNA의 혈중 농도 증가가 암의 진행 및 사망의 위험을 증가시키는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 3. I-score가 간암의 진행 및 생존에 미치는 영향 확인
총 151명 간암 환자의 I-score는 최소 256에서 최대 28520로 분포하였으며, 중간값은 1637이었다. 정상인 14명은 Somatic CNA가 발견되지 않아서 I-score의 값이 모두 0에 해당하였다. I-score의 중간값인 1637을 기준으로 하여 을 평가하였다. 151 명의 간암 환자는 모두 400mg의 sorafenib을 1일당 2회씩 복용하였으며, 항암치료 반응에 대한 평가는 RECIST 가이드라인 Version 1.1에 의거하여 6-8주 단위로 진행하였다.
분석 결과, I-score가 1637을 초과하였을 때 질병의 무증악기간에 대한 위험비(Hazard Ratio, HR)가 2.09(95% CI, 1.46-3.00; log-rank p<0.0001)이었으며, 생존 여부에 대한 위험비(Hazard Ratio, HR)가 3.35(95% CI, 2.24-5.01; log-rank p<0.0001)이었다 (도 5).
I-score를 8분위수로 세분화 하였을 때 생존 여부에 대한 위험비는 5분위수(1638~3012)가 2.97(95% CI, 1.28-6.90; p=0.01), 6분위수(3013~7448)가 4.99(95% CI, 2.19-11.41; p=0.0001), 7분위수(7449~13672)가 4.52(95% CI, 2.01-10.18; p=0.0003), 8분위수(13673~28520)가 7.72(95% CI, 3.31-18.02; p<0.0001)로 점차적으로 증가하는 경향을 나타냈다 (도 6).
이와 같은 경향은 무증악기간에 대한 위험비에서도 유사하게 나타나는데, 5분위수가 2.43(95% CI, 1.21-4.86; p=0.01), 6분위수가 2.73(95% CI, 1.36-5.48; p=0.0047), 7분위수가 2.26(95% CI, 1.09-4.70; p=0.0294), 8분위수가 3.08(95% CI, 1.50-6.35; p=0.0022)로 I-score가 증가할수록 암의 진행에 대한 위험이 증가하였다 (도 7).
이를 근거로 I-score의 증가가 암의 진행 및 사망의 위험을 증가시키는 것을 확인하였다.
실시예 4. 무세포 DNA 농도와 I-score간 상관관계 확인
혈중 무세포 DNA 농도와 I-score 모두 간암의 진행 및 생존에 영향을 주는 것으로 분석되어 두 변수간 상관관계를 파악하기 위하여 Spearman Correlation Analysis를 실시하였다.
그 결과, R2 = 0.24, p<0.0001로 분석되어 정비례의 상관관계가 있는 것을확인할 수 있었다(도 8).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 간암 예후예측 방법은 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용하여 간암 환자의 예후예측 정확도를 높일 뿐만 아니라 검출하기 어려웠던 매우 낮은 농도의 무세포 DNA에 기반의 예후예측 정확도를 높여서 상업적 활용도를 높일 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 간암 환자의 예후 판단에 유용하다.

Claims (21)

  1. 다음의 단계를 포함하는 무세포 DNA(cell free DNA, cfDNA) 기반의 간암 예후예측 방법:
    a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계;
    b) 상기 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계;
    d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화하는 단계;
    e) 참조집단의 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수를 계산하는 단계;
    f) 상기 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수를 계산하는 단계; 및
    g) 상기 I 점수(I-score)의 기준값(cut-off value)을 초과할 경우, 간암 예후가 나쁜 것으로 판정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법:
    (a-i) 채취된 무세포 DNA에서 염석 방법(salting-out method), 컬럼크로마토그래피 방법(column chromatography method), 또는 비드 방법(beads method)을 사용하여 단백질, 지방, 및 기타 잔여물을 제거하고 정제된 핵산을 수득하는 단계;
    (a-ii) 상기 정제된 핵산에 대하여, 싱글-엔드 시퀀싱(single-end sequencing) 또는 페어-엔드 시퀀싱(pair-end sequencing) 라이브러리(library)를 제작하는 단계;
    (a-iii) 상기 제작된 라이브러리를 차세대 유전자서열검사기(next-generation sequencer)에 반응시키는 단계; 및
    (a-iv) 상기 차세대 유전자서열검사기에서 핵산의 서열정보(reads)를 획득하는 단계.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 (a-i) 및 상기 (a-ii) 단계 사이에, 상기 (a-i) 단계에서 정제된 핵산을, 효소적 절단, 분쇄 또는 하이드로쉐어방법(hydroshear method)으로 무작위 단편화(random fragmentation)하여 싱글-엔드 시퀀싱 또는 페어-엔드 시퀀싱 라이브러리를 제작하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 서열정보를 획득하는 단계는 분리된 무세포 DNA를 1백만 내지 1억 리드 깊이로 전장 유전체 시퀀싱을 통해 획득하는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법:
    (c-i) 각 정렬된 핵산서열의 영역을 특정하는 단계; 및
    (c-ii) 상기 영역 내에서 정렬 일치도 점수(mapping quality score)와 GC 비율의 기준값을 만족하는 서열을 선별하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 기준값은, 상기 정렬 일치도 점수(mapping quality score)가 15 내지 70이고, GC 비율은 30 내지 60%인 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법.
  7. 제5항에 있어서, c) 단계는, 염색체의 중심체 또는 말단체의 데이터를 제외하고 수행되는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법:
    (d-i) 표준 염색체를 일정구간(bin)으로 나누는 단계;
    (d-ii) 상기 구간별 정렬된 리드 개수 및 리드들의 GC양을 산출하는 단계;
    (d-iii) 상기 리드 개수 및 GC양을 바탕으로 회귀분석을 실시하여 회귀계수를 산출하는 단계; 및
    (d-iv) 상기 회귀계수를 이용하여 리드 개수를 정규화하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, (d-i)에서의 일정구간(bin)은 100 kb 내지 2 Mb인 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 e) 단계는, 하기의 수식 1로 계산하는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법:
    Figure PCTKR2020002359-appb-I000007
  11. 제1항에 있어서, 상기 (f) 단계는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법:
    (f-i) 각 구간별 Z 점수를 기반으로 CBS(Circular Binary Segmentation) 방법으로 염색체 영역을 구분하는 단계;
    (f-ii) 상기 구분된 구역의 Z 점수의 평균 절대값이 기준값 이상인 지역의 염색체길이(size)를 구하는 단계; 및
    (f-iii) 하기 수식 2로 I 점수를 계산하는 단계
    Figure PCTKR2020002359-appb-I000008
  12. 제11항에 있어서, 상기 Z 점수의 평균 절대값의 기준값은 1-2인 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 I 점수의 기준값은 1637인 것을 특징으로 하는 순환 종양 DNA 검출 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    분리된 무세포 DNA의 농도를 측정하여, 무세포 DNA의 농도가 기준값을 초과하면 나쁜 예후인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    분리된 무세포 DNA 농도의 기준값은 0.71ng/μl인 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 I 점수가 1638 내지 3012인 경우, 중등도 위험군으로 분류하고, 3013 내지 13672인 경우, 고도 위험군으로 분류하고, 13673 내지 28520인 경우 초고도 위험군으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법으로 간암 예후를 예측하는 단계를 포함하는 간암의 예후 판단을 위한 정보의 제공 방법.
  18. 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 해독하는 해독부;
    해독된 서열을 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스에 정렬하는 정렬부;
    정렬된 서열정보(reads)에 대하여 기준값(cut-off value) 이상인 샘플의 서열정보만 선별하는 품질관리부; 및
    선별된 서열정보(reads)에 대하여, 참조집단 샘플과 비교하여 Z 점수(Z score)를 계산한 다음, 이를 바탕으로 I 점수(I-score)를 도출하여, I 점수가 기준값(cut-off value)을 초과할 경우, 간암 예후가 나쁜 것으로 판정하는 결정부를 포함하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 장치.
  19. 제18항에 있어서, 분리된 무세포 DNA의 농도를 측정하여, 농도가 기준값을 초과하면 나쁜 예후인 것으로 판단하는 농도 기반 예후 결정부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 cfDNA 기반의 간암 예후예측 장치.
  20. 컴퓨터 판독 가능한 매체로서, 간암 예후를 예측하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하되,
    a) 생체시료에서 분리된 무세포 DNA의 서열정보를 획득하는 단계;
    b) 상기 서열정보(reads)를 참조집단의 표준 염색체 서열 데이터베이스(reference genome database)에 정렬(alignment)하는 단계;
    c) 상기 정렬된 서열정보(reads)에 대하여 퀄리티를 확인하여, 기준값(cut-off value) 이상인 서열정보만 선별하는 단계;
    d) 상기 표준 염색체를 일정 구간(bin)으로 나누고, 상기 선별된 서열정보(reads)에 대하여, 각 구간의 양을 확인하고 정규화하는 단계;
    e) 참조집단의 정규화된 각 구간(bin)에 매치되는 리드의 평균과 표준편차를 구한 다음, 상기 d) 단계에서 정규화한 값 사이의 Z 점수를 계산하는 단계;
    f) 상기 Z 점수(Z score)를 이용하여 염색체를 구분하여, I 점수를 계산하는 단계; 및
    g) 상기 I 점수(I-score)의 기준값(cut-off value)을 초과할 경우, 간암 예후가 나쁜 것으로 판정하는 단계.
    를 포함하는 프로세서에 의해 실행되도록 구성되는 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체.
  21. 제20항에 있어서, 분리된 무세포 DNA의 농도를 측정하여,
    무세포 DNA의 농도가 기준값을 초과하면 나쁜 예후인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 컴퓨터 판독 가능한 매체.
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