WO2020144145A1

WO2020144145A1 - Probengefäss mit einer kavität zur aufnahme einer probe

Info

Publication number: WO2020144145A1
Application number: PCT/EP2020/050149
Authority: WO
Inventors: Jens Eberhardt; Constantin Nelep; Gerd Bornmann
Original assignee: Als Automated Lab Solutions Gmbh
Priority date: 2019-01-07
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2020-07-16
Also published as: EP3908402A1; DE102019100256A1; JP2022522937A; US20210331157A1; JP7481346B2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Probengefäß (1) mit einer Kavität (2) zur Aufnahme einer Probe (8), einer ersten Öffnung (3) zum Einbringen der Probe (8) und einem der ersten Öffnung (3) gegenüberliegenden Boden (4) sowie mindestens einer zusätzlichen Öffnung (5) der Kavität (2). Erfindungsgemäß mündet die mindestens eine zusätzliche Öffnung (5) auf der dem Boden (4) gegenüberliegenden Seite der Kavität (2) nach außerhalb der Kavität (2). Die Erfindung betrifft ferner eine Trägerplatte (12), eine Evakuierungsnadel sowie ein Verfahren zur Evakuierung einer Probe (8).

Description

Probengefäß mit einer Kavität zur Aufnahme einer Probe

Die Erfindung betrifft ein Probengefäß, insbesondere ein sogenanntes Nanowell, eine Trägerplatte mit erfindungsgemäßen Probengefäßen und eine Evakuierungsnadel. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Evakuierung einer Probe aus einem Probengefäß.

Probengefäße für die Verwendung beispielsweise in der Biochemie, Zellbiologie oder Genetik mit Kavitäten von 0,4 ml und mehr sind beispielsweise aus der DE 30 297 18 A1 bekannt. Die durch ein flüssiges Medium gebildete Probe wird durch einen zusätzlichen Kanal im Bereich des Bodens der Kavität eingesogen und in einem Reservoir der Kavität aufgenommen. Die Entnahme der gespeicherten Probe aus dem Reservoir erfolgt über die erste Öffnung.

Unter Nanowells werden Probengefäße verstanden, die aufgrund ihres Fassungsvolumens und/oder ihrer Abmessungen lediglich eine oder nur wenige biologische Zellen oder Objekte vergleichbarer Größe, nachfolgend verallgemeinernd als Probe bezeichnet, fassen können. Eine Anzahl von Nanowells kann als Nanowell-Array auf einem Träger (Chip) ausgebildet sein. Derartige Nanowell-Arrays sind kommerziell erhältlich.

Beispielhaft sei die unveröffentlichte DE 10 2017 1 13 454 genannt, in der derartige

Nanowells - auch als Kavitäten bezeichnet, beschrieben sind. Die Proben werden durch eine erste Öffnung in die Kavität gebracht und wieder aus dieser heraustransportiert.

Nanowells werden insbesondere eingesetzt, um möglichst jeweils nur ein Objekt, beispielsweise eine Zelle, je Kavität aufzunehmen und bei Bedarf selektiv entnehmen und/oder analysieren zu können. Zur Entnahme von einzelnen Zellen werden als

Werkzeuge beispielsweise hohle Nadeln wie Kapillaren aus Glas oder Kanülen verwendet.

Dabei wird das aus der betreffenden Kavität aufzunehmende Objekt mittels eines

Fluidstroms in die hohle Nadel eingesogen (Aspiration). Dabei soll ein direkter Kontakt mit dem Werkzeug vermieden werden, um das Objekt vor Beschädigungen zu schützen. Die Einsaugöffnung des Werkzeugs muss daher größer als der Durchmesser des

einzusaugenden Objekts sein. Bei sehr kleinen Abmessungen der Nanowells und der Notwendigkeit, dass die Einsaugöffnung des Werkzeugs aus vorgenannten Gründen nicht beliebig verkleinert werden kann, ergeben sich strömungstechnische Schwierigkeiten.

Diese liegen beispielsweise in der nachteiligen Erzeugung eines großen Unterdrucks in der Kavität, ohne dass ein entsprechender Ansaugstrom oder Aspirationsstrom entsteht. Es ist auch möglich, dass zwar ein Aspirationsstrom bewirkt wird, dieser sich aber nicht in der gesamten Kavität ausbreitet und das anzusaugende Objekt nicht oder nicht zuverlässig aus der Kavität in das Werkzeug transportiert wird.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, eine gegenüber dem Stand der Technik verbesserte Möglichkeit zur Aufnahme von Objekten aus Kavitäten von Probengefäßen vorzuschlagen.

Die Aufgabe wird hinsichtlich der Gestaltung eines Probengefäßes durch den Gegenstand des Anspruchs 1 gelöst. In Hinblick auf eine erfindungsgemäße Verfahrensführung wird das Problem durch den Gegenstand des Anspruchs 8 gelöst. Es werden zudem eine erfindungsgemäße Trägerplatte und eine Evakuierungsnadel vorgeschlagen. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Das Probengefäß weist eine Kavität zur Aufnahme einer Probe auf. Eine Probe ist beispielsweise eine biologische Zelle, eine Gruppe von Zellen und/oder von Objekten vergleichbarer Größe. Die Kavität weist eine erste Öffnung zum Einbringen der Probe in die Kavität auf. Durch die erste Öffnung wird die Probe auch wieder aus der Kavität entfernt. Der ersten Öffnung gegenüberliegend befindet sich ein Boden der Kavität.

Erfindungsgemäß ist mindestens eine zusätzliche Öffnung der Kavität vorhanden, die auf der dem Boden gegenüberliegenden Seite der Kavität nach außerhalb der Kavität mündet. Die Mündung der zusätzlichen Öffnung nach außerhalb der Kavität kann dabei im

Wesentlichen in der Ebene der ersten Öffnung liegen. Sie kann in weiteren Ausführungen über die hinausragen oder zwischen halber Tiefe der Kavität und Ebene der ersten Öffnung münden.

Kern der Erfindung ist es, mittels der zusätzlichen Öffnung eine Zuführung eines Mediums in die Kavität zu unterstützen, um auch dann die Ausbildung eines Aspirationsstroms zu erreichen, wenn das Werkzeug, also eine zum Ansaugen der Probe verwendete hohle Nadel, und die erste Öffnung der Kavität gleiche oder nahezu gleiche Abmessungen aufweisen.

Die zusätzliche Öffnung ermöglicht ein Einströmen von Medium aus der Umgebung des Probengefäßes in die Kavität und die Ausbildung eines Aspirationsstroms. Insbesondere auf dem Gebiet der Zellbiologie, Immunologie aber auch der Genetik werden zum Beispiel Zellen vereinzelt und in Kavitäten abgelegt und mit einem Nährmedium überschichtet. Üblicherweise werden Arrays mit einer Vielzahl von Kavitäten verwendet, sodass auch benachbart angeordnete Kavitäten und Proben mit demselben Nährmedium überschichtet sind. Um selektiv Proben aus den einzelnen Kavitäten zu entnehmen, muss die Ausbildung des Aspirationsstroms weitestgehend auf die jeweils ausgewählte Kavität beschränkt werden. Die zusätzliche Öffnung ermöglicht vorteilhaft die Verwendung einer hohlen Nadel mit einer Ansaugöffnung in der gleichen Dimensionierung wie die der ersten Öffnung bei gleichzeitiger Ausbildung eines hinreichend großen Aspirationsstroms. Zugleich sind die Strömungen in dem überschichtendem Medium lokal begrenzt, so dass die Gefahr einer nachteiligen Beeinflussung benachbart angeordneter Proben gering ist.

Das zum Ansaugen der Probe verwendete Werkzeug kann bei einem erfindungsgemäßen Probengefäß vorteilhaft bis auf wenige Mikrometer an die erste Öffnung herangeführt werden oder sogar auf dem Rand der ersten Öffnung aufsetzen.

An die mindestens eine zusätzliche Öffnung kann in einer Ausführungsform des

Probengefäßes ein Kanal anschließen, der in der Kavität mündet. Vorteilhaft ist die

Mündung des Kanals in der Kavität in der Nähe des Bodens ausgebildet, um mittels eines Aspirationsstroms auch dicht am Boden befindliche Proben zu erfassen und in Richtung der ersten Öffnung zu transportieren.

Ein Kanal kann wenigstens über einen Teil seiner Länge gegen die Kavität durch eine Wand abgegrenzt sein. Ein Kanal kann in weiteren Ausführungen auch durch Rippen oder Stege in der Wand der Kavität gebildet sein, die im Wesentlichen von der zusätzlichen Öffnung in Richtung Boden verlaufen.

Die zusätzliche Öffnung kann mit der ersten Öffnung im Wesentlichen in einer Ebene liegen und mit der ersten Öffnung in Verbindung stehen, beispielsweise direkt in diese übergehen. Diese Ausführungsform kann technologisch präzise und kostengünstig gefertigt werden.

Das erfindungsgemäße Probengefäß ist insbesondere bei kleinen Kavitäten von Vorteil, bei denen die erste Öffnung eine lichte Weite von höchstens 0, 5 mm, insbesondere von höchstens 0,3 mm aufweist.

Die zusätzliche Öffnung und/oder ein an diese anschließender Kanal weist vorteilhaft geringere Abmessungen als die erste Öffnung auf, um ein ungewolltes Ausspülen der Probe über die zusätzliche Öffnung zu vermeiden. Je nach Probe können die Abmessung von erster Öffnung und/oder zusätzlicher Öffnung gewählt werden.

Eine Mehrzahl erfindungsgemäßer Probengefäße kann auf einer Trägerplatte ausgebildet sein. Ein derart gebildetes Array von Probengefäßen beziehungsweise Kavitäten erlaubt die zeitnahe oder simultane Auswertung und/oder die effektive Handhabung einer größeren Anzahl von Proben.

Der Erfindungsgedanke kann auch durch ein entsprechend modifiziertes Werkzeug realisiert sein. Das Werkzeug, hier als Evakuierungsnadel bezeichnet, dient zur selektiven Entnahme einer Probe aus einer Kavität eines Probengefäßes. Die Evakuierungsnadel weist einen Hauptkanal auf und ist dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich mindestens ein Nebenkanal vorhanden ist, wobei Hauptkanal und Nebenkanal getrennt voneinander im Bereich der Spitze der Evakuierungsnadel münden. Der Nebenkanal steht dabei vorteilhaft mit der Umgebung der Evakuierungsnadel in Verbindung. Wird durch den Hauptkanal ein Aspirationsstrom beispielsweise in einer Kavität erzeugt, kann Medium aus der Umgebung über den Nebenkanal Zuströmen und die Ausbildung und Stabilität des Aspirationsstroms vorteilhaft unterstützen oder gar erst ermöglichen. Es können vorteilhaft handelsübliche Probengefäße beziehungsweise Arrays verwendet werden.

Die Aufgabe wird ferner mit einem Verfahren zur Evakuierung einer Probe aus einer Kavität eines Probengefäßes gelöst. Dabei wird eine in die Kavität hinein gerichtete und eine aus der Kavität heraus gerichtete Strömung eines Mediums erzeugt, indem

mindestens zwei getrennt in der Kavität mündende Kanäle verwendet werden. Durch das Bewirken von Druckdifferenzen in den Kanälen wird die Strömung erzeugt. Beispielsweise kann an einem der Kanäle ein Unterdrück oder ein Überdruck angelegt werden. An einem anderen der Kanäle wird entsprechend ein Überdruck beziehungsweise ein Unterdrück angelegt. Dabei kann der Überdruck aktiv, beispielsweise mittels einer Pumpvorrichtung, angelegt werden. Gleichwertig ist es, wenn der Überdruck infolge einer Sogwirkung des angelegten Unterdrucks entsteht und zu einem Strom eines Mediums in Richtung des Unterdrucks führt. Eine derart erzeugte Strömung sowie deren Transportvermögen in der Kavität werden so eingestellt, dass die Probe aus der Kavität gespült wird.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines

erfindungsgemäßen Probengefäßes sowie des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 2 eine schematische Darstellung eines Arrays von Probengefäßen gemäß eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes und einer Kapillare;

Fig. 3 eine schematische Darstellung eines Arrays von Probengefäßen gemäß eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes und einer Kapillare;

Fig. 4 eine schematische Darstellung eines Arrays von Probengefäßen gemäß eines dritten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Probengefäßes und einer Kapillare;

Fig. 5 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels von erster Öffnung und zusätzlicher Öffnung eines erfindungsgemäßen Probengefäßes; Fig. 6 eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels von erster Öffnung und zusätzlicher Öffnung eines erfindungsgemäßen Probengefäßes;

Fig. 7 eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels von erster Öffnung und zusätzlicher Öffnung eines erfindungsgemäßen Probengefäßes;

Fig. 8 selektives Entnehmen je einer Probe aus erfindungsgemäßen Probengefäßen, wobei je Spalte ein ausgewähltes Probengefäß vor und nach der Entnahme markiert ist (Originalbilder);

Fig. 9 eine schematische Darstellung des selektiven Entnehmens je einer Probe aus erfindungsgemäßen Probengefäßen, wobei je Spalte ein ausgewähltes Probengefäß vor und nach der Entnahme markiert ist, und

Fig. 10 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer Trägerplatte mit zwei Arrays erfindungsgemäßer Probengefäße.

In der Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßes Probengefäß 1 in einem seitlichen Schnitt dargestellt. Eine Kavität 2 des Probengefäßes 1 weist eine erste Öffnung 3 und

gegenüberliegend einen Boden 4 auf. Seitlich der ersten Öffnung 3 sind zwei zusätzliche Öffnungen 5 vorhanden. An diese schließt jeweils ein Kanal 6 an, der durch eine Wand 7 von der Kavität 2 getrennt ist und im Bereich des Bodens 4 in die Kavität 2 mündet. In der Kavität 2 befindet sich auf dem Boden 4 eine Probe 8, beispielsweise eine biologische Zelle.

Auf die erste Öffnung 3 ist eine Kapillare 9 als ein Werkzeug aufgesetzt, in das die Probe 8 aufgenommen werden soll. In der Kapillare 9 wird ein Unterdrück erzeugt, der sich auch der Kavität 2 mitteilt. Ein Medium 10, mit dem das Probengefäß 1 überschichtet ist, wird infolge des Unterdruckes in der Kavität 2 über die zusätzliche Öffnung 5 und den Kanal 6 in die Kavität 2 hineingesogen. Als Wirkung entsteht in der Kavität 2 eine von dem Boden 4 in Richtung der ersten Öffnung 3 und der Kapillare 9 gerichteter Aspirationsstrom (durch Pfeile veranschaulicht). Durch dessen Transportvermögen wird die Probe 8 aus der Kavität 2 in die Kapillare 9 transportiert.

Fig. 2 zeigt beispielhaft eine Kapillare 9, die einem Probengefäß 1 in einem Array 1 1 von Probengefäßen 1 zugestellt ist. Die erste Öffnung 3 weist eine runde Form auf. An zwei sich gegenüberliegenden Rändern der ersten Öffnung 3 sind je eine zusätzliche Öffnung 5 ausgebildet. Diese befinden sich in der gleichen Ebene wie die erste Öffnung 3 und stehen mit dieser in Verbindung. Die Kapillare 9 überdeckt im Wesentlichen die erste Öffnung 3, während die zusätzlichen Öffnungen 5 mit einem Teil ihrer Ausdehnung über die

Kapillare 9 überstehen. Eine in der Kavität 2 befindliche Probe 8 kann unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens aus der Kavität 2 in die Kapillare 9 transportiert werden.

Eine weitere mögliche Form und Anordnung der zusätzlichen Öffnung 5 ist in Fig. 3 gezeigt. An die runde erste Öffnung 3 schließt eine zusätzliche Öffnung 5 an, die wie zu Fig. 1 erläutert ausgebildet ist.

In Fig. 4 ist ein Array 11 mit Probengefäßen 1 aufweisend eine sechseckige erste

Öffnung 3 gezeigt. Die zusätzliche Öffnung 5 ist als rechteckige Aussparung ausgebildet und steht mit der ersten Öffnung 3 in Verbindung.

Beispiele für erste Öffnungen 3 und zusätzliche Öffnungen 5 sind in den Fig. 5 bis 7 gezeigt. Erste Öffnungen 3 können als Sechsecke ausgebildet sein, die eine lichte Weite A aufweisen und untereinander einen Abstand B oder Pitch B besitzen. Wird auf diese erste Öffnungen 3 eine Kapillare 9 mit runder Öffnung mit einem Außendurchmesser gleich der lichten Weite A aufgesetzt, so können die nicht durch die Kapillare 9 abgedeckten Bereiche der Ecken der ersten Öffnungen 3, die weiter als die lichte Weite A voneinander entfernt sind, als zusätzliche Öffnungen 5 wirken.

Gleiches gilt für die in Fig. 6 dargestellten quadratischen ersten Öffnungen 3 mit der lichten Weite a und einem Abstand B.

Die in der Fig. 7 gezeigten ersten Öffnungen 3 sind rund und weisen jeweils unter einem Winkel von beispielsweise 45° je eine zusätzliche Öffnung 5 auf.

Die in den Fig. 5 bis 7 dargestellten ersten Öffnungen 3 weisen beispielsweise lichte Weiten von 15, 30, 45 oder 200 pm auf. Der Abstand B beträgt beispielsweise 10 gm.

Die Funktionsfähigkeit der erfindungsgemäßen Probengefäße 1 ist in Fig. 8 und Fig. 9 beispielhaft belegt. Für drei unterschiedlich ausgeführte erste Öffnungen 3 und zusätzliche Öffnungen 5 ist jeweils ein Array 11 mit Probengefäßen 1 gezeigt. Jeweils ein

Probengefäß 1 mit einer Probe 8 ist ausgewählt und durch eine Markierung (Kreis) hervorgehoben. In der oberen Zeile sind jeweils die Zustände der Probengefäße 1 vor der Entnahme der Probe 8 und in der unteren Zeile jeweils nach der Entnahme mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gezeigt. In allen Fällen wurde die ausgewählte Probe 8 aus der Kavität 2 entfernt, während die Proben 8 in den benachbarten Kavitäten 2 unbeeinflusst geblieben sind. Um eine effektive Analyse der Vielzahl von Probengefäßen 1 zu ermöglichen, können Arrays 11 auf einer Trägerplatte 12 aufgebracht sein. Fig. 10 zeigt beispielhaft eine Trägerplatte 12 mit zwei Arrays 1 1 und einer Kapillare 9.

Bezuqszeichen

I Probengefäß 2 Kavität

3 erste Öffnung

4 Boden

5 zusätzliche Öffnung

6 Kanal

7 Wand

8 Probe

9 Kapillare

10 Medium

I I Array

12 Trägerplatte

A lichte Weite

B Abstand (Pitch)

Claims

Patentansprüche

1. Probengefäß (1 ) mit einer Kavität (2) zur Aufnahme einer Probe (8),

einer ersten Öffnung (3) zum Einbringen der Probe (8) und

einem der ersten Öffnung (3) gegenüberliegenden Boden (4) sowie

mindestens einer zusätzlichen Öffnung (5) der Kavität (2)

dadurch gekennzeichnet, dass

die mindestens eine zusätzliche Öffnung (5) auf der dem Boden (4) gegenüberliegenden Seite der Kavität (2) nach außerhalb der Kavität (2) mündet.

2. Probengefäß (1 ) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass an die zusätzliche Öffnung (5) ein Kanal anschließt, der in der Kavität (2) mündet.

3. Probengefäß (1 ) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zusätzliche Öffnung (5) mit der ersten Öffnung (3) im Wesentlichen in einer Ebene liegt und mit der ersten Öffnung (3) in Verbindung steht.

4. Probengefäß (1 ) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Öffnung (3) eine lichte Weite (A) von höchstens 0, 5 mm aufweist.

5. Probengefäß (1 ) nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Öffnung (3) eine lichte Weite (A) von höchstens 0, 3 mm aufweist.

6. Trägerplatte (12) mit einer Mehrzahl von Probengefäßen (1 ) nach einem der

Ansprüche 1 bis 5.

7. Evakuierungsnadel zur selektiven Entnahme einer Probe (8) aus einer Kavität (2) eines Probengefäßes (1 ) aufweisend einen Hauptkanal,

dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich mindestens ein Nebenkanal vorhanden ist, wobei Hauptkanal und Nebenkanal getrennt voneinander im Bereich der Spitze der

Evakuierungsnadel münden.

8. Verfahren zur Evakuierung einer Probe (8) aus einer Kavität (2) eines Probengefäßes (1 ),

bei dem eine in die Kavität (2) hinein gerichtete und eine aus der Kavität (2) heraus gerichtete Strömung eines Mediums (10) erzeugt wird, indem

mindestens zwei getrennt in der Kavität (2) mündende Kanäle verwendet werden, durch das Bewirken von Druckdifferenzen in den Kanälen die Strömung erzeugt wird und eine derart erzeugte Strömung sowie deren Transportvermögen in der Kavität (2) so eingestellt wird, dass die Probe (8) aus der Kavität (2) gespült wird.