WO2020138907A2 - 다양한 표면공정을 통한 3차원 신경세포체 형성 및 신경 돌기 생성이 가능한 구조체 제작 - Google Patents

다양한 표면공정을 통한 3차원 신경세포체 형성 및 신경 돌기 생성이 가능한 구조체 제작 Download PDF

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김동휘
이건희
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고려대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a platform for three-dimensional formation of neuronal structures and neurites.
  • Organs and tissues in the human body are composed of cells with an extracellular matrix.
  • the importance of 3D cell culture technology has emerged as research results have recently been published showing that cells cultured in 3D are similar to biological responses in vivo.
  • neurites are formed to connect with each other.
  • the formation of neurites has a direct effect on the formation of nerve bundles and the development of nerve cells. It is known that neurites are formed by extracellular matrix and cell-cell interaction.
  • the interaction force between cell-structures When the interaction force between cell-structures is greater than the interaction force between cell-cells, nerve cells can form neurites, but are not formed into spherical three-dimensional cell aggregates having a constant shape.
  • the cell-structure interaction force is smaller than the cell-cell interaction force, the neurons can form a spherical three-dimensional cell aggregate having a constant shape, but cannot form a neurites.
  • the present invention provides a micro-platform capable of forming a three-dimensional neuronal cell body having a uniform shape while optimizing the interaction force between cell-structures and generating neurites.
  • the present invention provides a three-dimensional neuron culture platform comprising a substrate made of a concave microwell surface-treated with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES).
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • the concave microwell may refer to a recessed structure in which neurons are fixed and cultured on a flat substrate.
  • the concave microwells can be used without limitation in size and shape to provide sufficient space for culture to form a single neuronal cell body.
  • the concave microwell was prepared by using a substrate having a hemispherical concave microwell having a diameter of 100 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • a hemispherical shape was selected as a structure in which even interaction between the cells and the culture platform can be achieved.
  • the size of the neuron body formed is small, meaningless of 3D culture, and the neuron body formed using a diameter of 1000um or more exceeds 300um in size.
  • apoptosis may occur due to lack of oxygen and nutrients inside the neuronal cell body. Therefore, in the present invention, a hemispherical platform having a diameter of 100 to 1000 ⁇ m was used.
  • the substrate may be made of polydimethylsiloxane (PDMS) having excellent biocompatibility.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the present inventors confirmed the formation of a uniform spherical neuron cell body by culturing neurons on a substrate on which a concave microwell having a surface treatment of APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) was formed, and at the same time, the formation of neurites was also promoted.
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • Neurons are composed of nerve cell bodies and neurites, and through neurites, networks can be formed between different nerve cells to rapidly transmit and receive signals.
  • the present invention is one of carbon nanotubes (CNT), laminin and poly-L-lysin (PLL) on the substrate on which the 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is surface-treated.
  • CNT carbon nanotubes
  • PLA poly-L-lysin
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • CNT carbon nanotubes
  • PLA poly-L-lysin
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • a plurality of concave microwells may be formed on the substrate in various patterns.
  • One concave microwell may be cultured with one neuron, and the concave microwells may be adjacent to each other.
  • the microwells may be open. Through the open space, neurites formed from nerve cells cultured in one concave microwell can be connected to neuronal cell bodies of neurons cultured in adjacent concave microwells to form one neural network in vitro. Through this, by simulating a three-dimensional environment similar to the neural network network environment in vitro in vitro, it can be used for research on signaling mechanisms between neurons and drug screening for neurological diseases.
  • the present invention provides a three-dimensional neuron culture method comprising the step of culturing neurons on the above-described three-dimensional neuron culture platform.
  • the present invention provides a method for screening for a neuropathic disease drug comprising the following steps:
  • the candidate substance may be any one selected from the group consisting of peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts or animal tissue extracts, but is not limited thereto.
  • the candidate substance can be a single compound, a mixture of compounds (eg, natural extracts or cell or tissue cultures), antibodies or peptides, or can be obtained from a library of synthetic or natural compounds. Methods for obtaining libraries of such compounds are known in the art. Synthetic compound libraries are commercially available from Maybridge Chemical Co. (UK), Comgenex (USA), Brandon Associates (USA), Microsource (USA) and SigmaAldrich (USA), and libraries of natural compounds are available from Pan Laboratories (USA) and Commercially available from MycoSearch (USA).
  • the nerve injury or neurological disease may be any one of brain injury, brain disease, spinal cord injury, peripheral nerve injury, peripheral nerve disease, or amyotrophic lateral sclerosis, and the brain injury or brain disease Silver dementia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, epilepsy, stroke, stroke, ischemic brain disease, or degenerative brain disease Can.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a surface treatment process of concave microwells capable of forming neurites and forming neuronal cells.
  • Figure 2 shows the different chemical properties of the five surfaces subjected to a surface process using Fourier transform infrared spectroscopy.
  • Figure 6 shows neurocell body formation in concave microwells through five surface processes: a) Optical micrographs by day. b) The date required for the formation of neuronal cell bodies. c) the size of the neuronal cell body. Scale bar: 100 ⁇ m
  • Figure 8 shows the formation of neural cell bodies and neurites produced in concave microwells produced through five surface processes: a) Electron microscopic image of neuronal cell bodies, b) Fluorescence staining images of neuronal cell bodies and neurites , c) Number of neurites formed in each concave microwell, d) Length of neurites formed in each concave microwell, e) Relationship between contact angle and cell adhesion, neuron formation, f) Adhesion and nerve of each surface and nerve cell Schematic diagram of the process of forming projections. Scale bar: 200 ⁇ m
  • FIG. 10 shows a model for reducing neurites by amyloid beta administration for drug screening model verification: a) neuronal cell bodies in concave microwells treated with APTES, b) whether amyloid beta accumulates, c) treated with amyloid beta Neuronal cell body, d) increased amyloid beta accumulation, e) amyloid beta accumulation comparison, f) nerve protrusion count comparison, g) nerve protrusion length comparison.
  • polydimethylsiloxane extracts nerve cells extracted from prenatal rats.
  • the cells were cultured in a concave microwell made of polydimethylsiloxane (PDMS) (FIG. 1).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the surface of the concave microwell was processed using the aminosilane functional group of APTES and carbon nanotubes, poly-L-lysine, and laminin.
  • the concave microwells are surface treated with oxygen plasma (100W, 30s), then 10% (water and volume) APTES solution or 0.01% (water and buffy) carbon nanotubes or 20 ⁇ g/ml laminin or
  • the surface process was performed by adding 20 ⁇ g/ml of poly-L-lysine for about 1 hour.
  • neuronal cell bodies were formed one day after seeding.
  • neuronal cell bodies were formed 5 days after cell injection, and in the concave microwell treated with laminin and poly-L-lysine, neuronal cell bodies were not formed even after 10 days.
  • it was confirmed that there was no size difference between the generated neuron cells (FIG. 6).
  • Neurons were cultured for 10 days in concave microwells of five different surface conditions, and then fluorescently stained with ⁇ -III tubulin and observed with an electron microscope to confirm the presence or absence of neural cell bodies and the formation of neurites.
  • the neuronal cell body was formed in a concave microwell treated with polydimethylsiloxane and carbon nanotubes and APTES.
  • the neurites were formed most frequently in the concave microwells treated with poly-L-lysine and the longest in the concave microwells treated with APTES. I concluded that this is the best.
  • polydimethylsiloxane concave microwells, carbon nanotubes, and APTES and laminin and poly-L-lysine-treated concave microwells decrease the repulsive force between the cell-structure, decrease the contact angle, and decrease hydrophobicity.
  • affinity between structures was increased, the surface wettability was increased, the cell structure formation time was increased, and the number of neurites formed was increased (FIG. 8).
  • neural projections between neuronal cell bodies are formed and connected through a network between concave microwells treated with APTES (FIG. 9).
  • Amyloid beta known as a representative substance inducing Alzheimer's desease disease, to confirm that the formation of neuronal cell bodies and the formation of neurites are optimal in concave microwells treated with APTES, and can be used for drug screening purposes.

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Abstract

본 발명은 신경세포 구조체 형성을 위한 플랫폼 제작에 관한 것이며, 보다 상세하게는 마이크로플랫폼을 이용하여 3차원 신경세포체를 형성하고 신경세포체와 마이크로플랫폼 사이에 신경 돌기가 형성되어 신경세포의 필수기능인 신호전달이 가능하여 시험관 3차원 신경세포체 형성과 동시에 신경 돌기 생성이 가능한 구조체 제작에 관한 것이다.

Description

다양한 표면공정을 통한 3차원 신경세포체 형성 및 신경 돌기 생성이 가능한 구조체 제작
본 발명은 신경세포 구조체 및 신경돌기의 3차원 형성을 위한 플랫폼에 관한 것이다.
인체 내 장기 및 조직들은 세포외기질(extracellular matrix)과 함께 세포를 기본으로 하여 구성되어 있다. 최근 3차원으로 배양된 세포들이 생체내의 생물학적 반응과 비슷하다는 연구결과들이 발표됨에 따라 3차원 세포 배양기술에 관한 중요도성이 대두되고 있다.
한편 신경세포의 발달과정의 경우 줄기세포에서 분화되어 신경세포가 되고 최종적으로 신경 돌기가형성되어 서로를 연결하는 모양을 보인다. 신경 돌기의 형성은 신경 다발 형성과 신경세포의 발달에 직접적인 영향을 끼친다. 신경 돌기는 세포외기질과 세포-세포 상호작용에 의해 그 형성 여부가 결정된다는 사실이 알려져 있다.
신경 돌기 형성을 위한 기존 연구는 라미닌이나 폴리-L-라이신 혹은 폴리-D-라이신을 이용하여 신경 돌기 형성을 유도하는 경우가 있다. 예를 들어 나노섬유에 라미닌이나 폴리-L-라이신을 도포하여 세포와 바닥과의 접착력을 향상시켜 신경세포의 생존력과 신경 돌기의 생장을 도운 연구들이 있다. 하지만 이런 연구는 모두 2차원적인 세포배양으로 실제 3차원에서 일어나는 현상과 거리가 있다. 한편 3차원으로 배양이 가능하도록 플랫폼에서 신경세포를 배양한 경우에는 신경세포체의 형상의 균일성이 없거나 신경 돌기가 자라지 않는 한계를 보이고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
한국특허공개공보 제10-2017-0029237호
세포-구조체 사이의 상호작용력이 세포-세포 사이의 상호작용력보다 큰 경우 신경 세포는 신경 돌기 형성이 가능하지만 모양이 일정한 구형 3차원 세포집합체로 형성이 되지 않는다. 반면 세포-구조체 사이의 상호작용력이 세포-세포 사이의 상호작용력보다 작은 경우 신경 세포는 모양이 일정한 구형 3차원 세포집합체 형성이 가능하지만 신경 돌기 형성이 불가능하다. 시험관 수준에서 약물 스크리닝 용도 혹은 생체내의 신경세포체를 모사하여 생물학적 유사성의 연구를 위해서는 3차원으로 신경세포체를 형성함과 동시에 신경 동기도 형성이 되어야 한다. 이에 본 발명에서는 세포-구조체 사이의 상호작용력을 최적화하여 신경 돌기가 생성됨과 동시에 모양이 일정한 3차원 신경세포체를 형성할 수 있는 마이크로 플랫폼의 개발이 필요한 실정이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포-구조체 사이의 상호작용력을 최적화하여 신경 돌기가 생성됨과 동시에 모양이 일정한 3차원 신경세포체를 형성할 수 있는 마이크로 플랫폼을 제공한다.
구체적으로 본 발명은 APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)로 표면 처리된 오목 마이크로웰로 이루어진 기판을 포함하는 3차원 신경세포 배양 플랫폼을 제공한다.
상기 오목 마이크로웰은 편평한 기판 상에 신경세포가 고정되어 배양될 수 있는 움푹 패인 구조를 지칭할 수 있다. 상기 오목 마이크로웰은 배양되어 하나의 신경세포체를 형성하기에 충분한 공간을 제공할 수 있는 크기 및 형태에 제한없이 이용될 수 있다. 구체적인 일 실시예에서, 상기 오목 마이크로웰은 직경이 100μm 내지 1000μm 범위의 반구형의 오목 마이크로웰이 형성된 기판을 제조하여 사용하였다. 일정한 크기의 구형의 신경세포체를 형성시키기 위하여, 세포 및 배양 플랫폼 간의 고른 상호 작용이 이루어질 수 있는 구조로써 반구형을 선택하였다.
3차원 신경세포를 배양하기 위하여 사용하는 플랫폼의 직경이 100um 이하의 경우 형성되는 신경세포체의 크기가 작아서 3차원 배양의 의미가 없게 되고 1000um 이상의 직경을 사용하여 형성되는 신경세포체는 크기가 300um를 넘어가면서 신경세포체 내부에 산소 및 영양분 부족으로 인해 세포사멸(네크로시스)이 일어날 수 있다 이에 본 발명에서는 100~1000μm 직경의 반구형 플랫폼을 사용하였다.
상기 기판은 생체 적합성이 우수한 폴리디메틸실록세인 (polydimethylsiloxane, PDMS)으로 제조된 것일 수 있다.
본 발명자들은 APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)이 표면 처리된 오목 마이크로웰이 형성된 기판에 신경세포를 배양함으로써 균일한 구형의 신경세포체 형성을 확인하였으며, 동시에 신경돌기의 형성도 촉진됨을 확인하였다.
신경세포는 신경세포체와 신경돌기로 이루어지며, 신경돌기를 통하여 다른 신경세포간에 네트워크를 형성하여 신속하게 신호를 전달하고 전달 받을 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 본 발명은 상기 APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)이 표면 처리된 기판에 탄소나노튜브(CNT), 라미닌(Laminin) 및 폴리-L-라이신(Poly-L-lysin, PLL) 중 하나 이상이 추가로 표면 처리될 수 있다.
APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)이 표면 처리된 기판에 탄소나노튜브(CNT), 라미닌(Laminin) 및 폴리-L-라이신(Poly-L-lysin, PLL) 중 하나로 표면 처리된 상기 3차원 신경세포 배양 플랫폼에서 신경세포를 배양한 결과, 탄소나노튜브가 추가로 표면 처리되는 경우, 신경세포체의 형성에 차이가 없음을 확인하였고, 라미닌 또는 폴리-L-라이신이 추가로 표면 처리되는 경우 신경 돌기 형성이 촉진됨을 확인하였다. 상기 물질의 추가 처리를 통하여 신경세포 및 플랫폼 간의 상호 작용력을 조절함으로써 신경세포체 및 신경돌기의 형성을 인위적으로 조절할 수 있음을 확인하였다..
구체적인 다른 일 실시예에서, 상기 기판에는 복수의 오목 마이크로웰이 다양한 패턴으로 형성될 수 있다, 상기 하나의 오목 마이크로웰은 하나의 신경세포가 배양될 수 있고, 상기 복수의 오목 마이크로웰은 인접하는 마이크로웰 사이가 개방되어 있을 수 있다. 상기 개방된 공간을 통하여 하나의 오목 마이크로웰에서 배양되는 신경세포에서 형성된 신경돌기가 인접한 오목 마이크로웰에서 배양되는 신경세포의 신경세포체와 연결되어 생체 외에서 하나의 신경 네트워크망을 형성시킬 수 있다. 이를 통하여, 생체 외에서 생체 내 신경 네트워크 망 환경과 유사한 3차원 환경을 모사함으로써 신경 세포간의 신호전달 기작 연구 및 신경 질환 약물 스크리닝에 이용될 수 있다.
본 발명은 상술한 3차원 신경세포 배양 플랫폼에 신경세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원 신경세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 신경 손상 질환 약물 스크리닝 방법을 제공한다:
본 발명의 3차원 신경세포 배양 플랫폼에 신경세포를 배양하는 단계;
상기 배양된 신경세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
후보 물질이 처리된 상기 신경세포에 신경 손상 질환을 유발하는 물질을 처리하는 단계; 및
후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 신경세포에서의 신경돌기 및 신경세포체 형성 정도를 비교하는 단계.
상기 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액 또는 동물 조직 추출액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 후보 물질은 단일 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 항체 또는 펩티드 이거나, 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 SigmaAldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다.
본 발명에서, 신경 손상 또는 신경질환은 뇌손상, 뇌질환, 척수손상, 말초신경손상, 말초신경질환, 또는 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 중 어느 하나일 수 있으며, 상기 뇌손상 또는 뇌질환은 치매(dementia), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(alzheimer's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 뇌전증(epilepsy), 뇌졸중(stroke), 중풍, 허혈성 뇌질환 또는 퇴행성 뇌질환 중 어느 하나일 수 있다.
상기 신경세포 배양 플랫폼과 관련하여 상술한 내용과 중복되는 내용에 대한 설명은 생략한다.
첫째, 마이크로 플랫폼을 이용하여 모양이 일정한 3차원 신경세포체 배양이 가능하다. 둘째, 세포와 구조체간의 상호작용력을 조절하여 물리적, 화학적, 구조적으로 다른 성질을 갖도록 하는 표면 공정이 가능하다.
셋째, 신경세포체의 배열이 가능하다. 오목한 웰에 네트워크를 디자인함에 따라 표면공정을 통해 생성된 신경세포체의 신경 돌기들이 상호 연결되어 원하는 대로의 신경세포체의 배열이 가능하다.
넷째, 효과적으로 생체 내의 신경세포를 모사함으로서 약물 스크린 용도로 활용 가능하다.
도 1은 신경 돌기 형성 및 신경세포체 형성이 가능한 오목 마이크로웰의 표면 처리과정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 푸리에 변환 적외선 분광학을 이용한 표면 공정을 진행한 다섯 가지 표면의 다른 화학적 성질을 도시한 것이다.
도 3은 원자힘 현미경을 이용한 다섯 가지 표면 공정을 통한 오목 마이크로웰의 표면 성질을 나타낸 것이다. 스케일바 : 500nm
도 4는 접촉각 측정을 통한 다섯 가지 표면 공정을 통한 오목 마이크로웰의 다른 물리적 성질을 나타낸 것이다.
도 5는 다섯 가지 표면 공정을 통한 오목 마이크로웰의 다른 세포 부착력을 나타낸 것이다.
도 6은 다섯 가지 표면 공정을 통한 오목 마이크로웰에서의 신경세포체 형성을 나타낸 것이다: a) 일자별 광학 현미경 사진. b) 신경세포체 형성에 소요되는 일자. c) 신경세포체의 크기. 스케일바: 100μm
도 7은 칼슘 인디케이터 (Fluo-4 AM)을 이용한 다섯 가지 표면에서 배양된 신경세포체의 칼슘 전달 이미지를 나타낸 것이다. 스케일바: 50μm
도 8은 다섯 가지 표면 공정을 통해 제작된 오목 마이크로웰에서 배양된 신경세포체의 형성 유무와 신경 돌기 생성을 나타낸 것이다: a) 신경세포체의 전자현미경 이미지, b) 신경세포체와 신경 돌기의 형광 염색 이미지, c) 각 오목 마이크로웰에서 형성된 신경 돌기 개수, d) 각 오목 마이크로웰에서 형성된 신경 돌기 길이, e) 접촉각과 세포 부착력, 신경세포 형성과의 관계, f) 각 표면과 신경세포의 부착력 및 신경 돌기 형성 관계에 대한 모식도. 스케일바: 200μm
도 9는 표면 공정 및 네트워크 구조를 일정한 간격으로 배양된 신경세포체와 연결된 신경 돌기를 보여주는 현미경 사진이다. 스케일바: 500μm
도 10은 약물 스크리닝 모델 검증을 위한 아밀로이드 베타 투여에 의한 신경 돌기 감소 모델을 나타낸 것이다: a) APTES를 처리한 오목 마이크로웰에서의 신경세포체, b) 아밀로이드 베타 축적 여부, c) 아밀로이드 베타를 처리한 신경세포체, d) 증가된 아밀로이드 베타 축적, e) 아밀로이드 베타 축적 비교, f) 신경 돌기 개수 비교, g) 신경 돌기 길이 비교.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
신경 돌기 구조를 생성함과 동시에 일정한 모양과 간격으로 신경세포체를 형성할 수 있도록 표면 공정을 통해 세포-구조체 사이의 상호 작용력을 최적화하였고 여기에 태아 쥐(Prenatal rat)로부터 추출한 신경 세포를 폴리디메틸실록세인 (polydimethylsiloxane, PDMS)으로 제작한 오목 마이크로웰 (concave microwell) 에 배양하였다 (도 1).
[실시예 1] 표면 공정
APTES의 아미노실레인 작용기와 탄소 나노 튜브, 폴리-L-라이신, 라미닌을 이용하여 오목 마이크로웰을 표면을 공정하였다. 먼저 오목 마이크로웰을 산소 플라즈마 (100W, 30s)를 이용하여 표면 처리를 한 뒤 10% (물과 부피비) APTES 용액 혹은 0.01% (물과 부비피)의 탄소 나노 튜브 혹은 20 μg/ml의 라미닌 혹은 20 μg/ml의 폴리-L-라이신을 약 1시간 동안 추가 하여 표면 공정을 진행하였다.
[실시예 2] 표면의 화학적, 표면적, 물리적 성질 확인
여러 개의 물질로 코팅된 오목 마이크로웰의 표면의 화학적 차이를 보기 위해 푸리에 변환 적외선 분광학 (Fourier transform infrared, FTIR)을 이용하여 다섯 가지의 오목 마이크로웰이 각기 다른 화학적 성질을 보이는 것을 확인하였다 (도 2). 그리고 원자힘현미경 (Automic force microscope, AFM)을 이용하여 표면에 붙어있는 물질이 각기 다른 것을 확인하였다 (도 3). 또한 접촉각 측정 (contact angle)을 이용하여 폴리디메틸실록세인 자체 표면에서 가장 접촉각이 크며 폴리-L-라이신 처리한 표면에서 접촉각이 가장 작은 것을 확인하였다 (도 4).
[실시예 3] 신경 세포 부착 실험
세포-구조체 사이의 상호작용력을 측정하기 위하여 표면 공정을 통해 제작된 다섯 가지 다른 성질의 표면에 신경 세포 부착 실험을 진행하였다. 각 표면 조건에 2*105개의 신경세포를 주입 (seeding)하고 3시간 동안 배양 후 세 번 배양액을 교체하여 부착되지 않은 세포들을 제거하였다. 남아있는 세포의 양을 측정하기 위해 세포 측정 키트 (cell counting kit-8, Dojindo, USA)를 이용하여 정량화하였다. 그 결과 폴리디메틸실록세인 자체 표면에서 가장 세포 부착이 적었으며 폴리-L-라이신 처리한 표면에서 세포 부착이 많은 것을 확인하였다 (도 5)
[실시예 4] 신경세포체 형성
각 다른 표면 조건에서 신경세포체의 형성기간을 확인하였는데 폴리디메틸실록세인 오목 마이크로웰과 탄소나노튜브를 표면처리한 오목 마이크로웰에서는 세포 주입 (seeding) 후 1일 만에 신경세포체가 형성되었다. APTES를 처리한 오목 마이크로웰에서는 세포 주입 후 5일 이후 신경세포체가 형성되었으며 라미닌과 폴리-L-라이신을 처리한 오목 마이크로웰에서는 10일이 지나도 신경세포체가 형성이 되지 않는 것을 보였다. 한편 생성된 신경세포체들 사이에는 크기차이는 없는 것을 확인하였다 (도 6).
[실시예 5] 신경을 통한 신호 전달 확인
포타슘에 의해 활성화되는 신경 전달을 확인하기 위하여 세포내 칼슘 인디케이터인 Fluo-4 AM을 이용하여 형광이미지로 측정하였다. Fluo-4를 미리 주입한 신경세포체에 고농도의 포타슘으로 자극을 하여 칼슘의 전달을 확인하였으며 이를 통해 다섯 가지 조건의 표면에서 자란 신경세포들이 표면 공정에 의해 신경 세포의 이상이 유도되지 않는 다는 것을 증명하였다 (도 7)
[실시예 6] 신경 돌기 형성 및 신경세포체 형성 확인
신경 세포들을 다섯 가지 표면 조건의 오목 마이크로웰에서 10일 동안 배양한뒤 신경세포체의 형성 유무와 신경 돌기의 형성 유무를 확인하기 위하여 β-III tubulin을 형광염색하고 전자 현미경으로 관측하였다. 그 결과 신경세포체는 폴리디메틸실록세인 오목 마이크로웰과 탄소나노튜브 및 APTES로 처리한 오목 마이크로웰에서 형성이 되었다. 신경 돌기는 폴리-L-라이신을 처리한 오목 마이크로웰에서 가장 많이 형성되었으며 APTES로 처리한 오목 마이크로웰에서 가장 길게 형성되는 것을 확인함으로써 APTES로 처리한 오목 마이크로웰에서 신경 돌기의 형성 및 신경세포체 형성이 가장 적합한 것으로 결론내었다. 이를 바탕으로 폴리디메틸실록세인 오목 마이크로웰, 탄소 나노 튜브 및 APTES 및 라미닌 및 폴리-L-라이신을 처리한 오목 마이크로웰 순서로 갈수록 세포-구조체 사이의 반발력 감소, 접촉각 감소, 소수성이 감소하며, 세포-구조체 사이의 친화력 증가, 표면 습윤성 증가, 세포 구조체 형성 시간 증가, 신경 돌기 형성 개수 증가를 확인하였다 (도 8). 또한 APTES를 처리한 오목 마이크로웰 사이의 네크워크를 통해 신경세포체 사이의 신경 돌기들이 형성되어 연결되는 것을 확인하였다 (도 9)
[실시예 7] 약물 스크리닝을 위한 아밀로이드 베타 (amyloid-beta) 투여 실험
신경세포체의 형성과 신경 돌기 형성이 APTES를 처리한 오목 마이크로웰에서 최적임을 확인하여 이를 이용하여 약물 스크리닝 용도로 사용이 가능함을 확인하기 위하여 알츠하이머 (Alzheimer's desease) 질병을 유발하는 대표 물질로 알려진 아밀로이드 베타를 투여하였다. 신경세포체로의 아밀로이드 베타 축척을 확인하기 위하여 thioflavin-S를 이용하여 형광이미지를 얻었다. 그 결과 아밀로이드 베타를 처리한 신경세포체의 신경 돌기의 개수와 길이가 급격하게 감소한 것을 확인하였고 이를 통해 본 발명에서 제시한 방법을 통해 약물 스크리닝 용도로 사용이 가능함을 증명하였다 (도 10).

Claims (8)

  1. APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)로 표면 처리된 오목 마이크로웰로 이루어진 기판을 포함하는 3차원 신경세포 배양 플랫폼.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 오목 마이크로웰은 100μm~1000μm 직경의 반구형인 것인, 3차원 신경세포 배양 플랫폼.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 3차원 신경세포 배양 플랫폼은 신경세포체 및 신경돌기의 형성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 3차원 신경세포 배양 플랫폼.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 기판은 복수의 오목 마이크로웰로 이루어지고, 서로 인접하는 오목 마이크로웰 사이가 개방되어 있는 것을 특징으로 하는 3차원 신경세포 배양 플랫폼.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 기판에 탄소나노튜브(CNT), 라미닌(Laminin) 및 폴리-L-라이신(Poly-L-lysin, PLL) 중 하나 이상이 추가로 표면 처리된 것을 특징으로 하는 3차원 신경세포 배양 플랫폼.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 오목 마이크로웰로 이루어진 기판은 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS)으로 제조된 것인 3차원 신경세포 배양 플랫폼.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 3차원 신경세포 배양 플랫폼에 신경세포를 배양하는 단계를 포함하는 생체 외 3차원 신경세포 배양 방법.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 3차원 신경세포 배양 플랫폼에 신경세포를 배양하는 단계;
    상기 배양된 신경세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
    후보 물질이 처리된 상기 신경세포에 신경 질환을 유발하는 물질을 처리하는 단계; 및
    후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 신경세포에서의 신경돌기 및 신경세포체 형성 정도를 비교하는 단계를 포함하는 신경 손상 또는 신경 질환 치료용 약물 스크리닝 방법.
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