WO2020138478A1 - Ｒｎａ修飾を利用したがんの転移／原発性に関連する状態の分析・診断法 - Google Patents

Ｒｎａ修飾を利用したがんの転移／原発性に関連する状態の分析・診断法 Download PDF

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WO2020138478A1
WO2020138478A1 PCT/JP2019/051560 JP2019051560W WO2020138478A1 WO 2020138478 A1 WO2020138478 A1 WO 2020138478A1 JP 2019051560 W JP2019051560 W JP 2019051560W WO 2020138478 A1 WO2020138478 A1 WO 2020138478A1
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WO
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rna
cancer
mir
modification
metastasis
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/051560
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English (en)
French (fr)
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雅允 今野
秀始 石井
準 小関
歩 浅井
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国立大学法人大阪大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present disclosure relates to characterization and classification of biological objects. More particularly, the disclosure relates to techniques for analyzing cancer metastasis associated conditions in biological subjects based on modification information on RNA.
  • RNA Ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • the present disclosure provides a new method for analyzing a cancer metastasis-related condition in a subject based on the finding that the cancer metastasis condition is reflected in RNA modification information.
  • the present disclosure provides: (Item 1) Obtaining modification information on at least one type of RNA in the subject, Analyzing the condition associated with cancer metastasis/primarity in the subject based on the modification information. (Item 2) The method of item 1, wherein the RNA comprises microRNA. (Item 3) Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the RNA comprises lncRNA. (Item 4) The method of any one of paragraphs 1-3, wherein the modification comprises m 6 A or m 5 C. (Item 5) The method of any one of paragraphs 1-4, wherein the condition associated with metastasis/primaryness of the cancer is whether the subject has a metastatic tumor. (Item 6) 6.
  • the metastasis/primary cancer related condition is whether the cancer in the subject is primary.
  • the at least one type of RNA is RNA obtained from the blood of the subject.
  • the at least one type of RNA is RNA obtained from the tumor of the subject.
  • the condition associated with metastasis/primary nature of cancer is a condition associated with metastasis from pancreas.
  • (Item A1) A modification information acquisition unit that acquires modification information on at least one type of RNA in the target; A system or an apparatus for analyzing the condition of a subject, comprising: an analysis unit for analyzing a condition associated with metastasis/primary nature of cancer in the subject based on the modification information.
  • (Item A2) The system or apparatus of item A1 wherein the RNA comprises microRNA.
  • (Item A3) The system or apparatus according to item A1 or A2, wherein the RNA comprises lncRNA.
  • (Item A4) The system or apparatus of any one of paragraphs A1-A3 wherein the modification comprises m 6 A or m 5 C.
  • RNA obtained from a liquid biopsy containing blood, urine, saliva or the like of the subject, or a solid biopsy obtained by surgically excising or biopsying The system or apparatus according to paragraph 1.
  • RNA obtained from the tumor of the subject.
  • metastasis/primary cancer-related condition is a condition related to metastasis from the pancreas.
  • IItem B1 Obtaining modification information on at least one type of RNA in the subject, Analyzing the metastasis/primary cancer-related condition in the subject based on the modification information, the program including instructions for causing a computer to execute the method for analyzing the condition of the subject.
  • the program of item B1 wherein the RNA comprises microRNA.
  • (Item B3) The program according to item B1 or B2, wherein the RNA comprises lncRNA.
  • (Item B4) The program of any one of items B1-B3, wherein the modification comprises m 6 A or m 5 C.
  • (Item B5) The program according to any one of items B1 to B4, wherein the condition associated with metastasis/primaryness of cancer is whether the subject has a metastatic tumor.
  • (Item B6) The program according to any one of items B1 to B5, wherein the condition associated with metastasis/primaryness of the cancer is whether or not the cancer in the subject is primary.
  • RNA obtained from a liquid biopsy containing blood, urine, saliva or the like of the subject, or a solid biopsy obtained by surgically excising or biopsying The program according to item 1.
  • the program according to any one of items B1 to B8, wherein the condition related to metastasis/primaryity of cancer is a condition related to metastasis from intractable cancer including pancreas.
  • a computer-readable recording medium recording the program according to any one of items B1 to B9.
  • RNA modification information e.g, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary. It can be analyzed and predicted by a method different from conventional methods, and its accuracy is considered to be dramatically higher.
  • the upper row is a photograph of the tumor, and the lower row is a hematoxylin-eosin stain of the tissue section. It is a figure comparing the appearance of dissecting EL1 mouse (left) and WTg mouse (right) at the age of 22 weeks. Tumors were observed only in the pancreas in EL1 mice, and the pancreas was more enlarged in WTg mice, and cancer metastasis was observed in various organs. It is the figure which compared the liver extracted at the time of 29-week-old of EL1 mouse (left) and WTg mouse (right). No tumor was observed in the liver of the EL1 mouse, cancer metastasis to the liver was observed in the WTg mouse, and the liver was enlarged.
  • the Metascape analysis result about the gene by which methylation was detected in WTg mouse is shown.
  • Each bar shows the biological pathways shown in Table 18-2 in order, and the horizontal axis shows the enrichment rate (Log 10 P) of each biological pathway.
  • ⁇ indicates a biological pathway related to extracellular matrix, and ⁇ indicates a biological pathway related to immunity.
  • the results of analyzing RNA-seq data on tumors of EL1 mice and WTg mice by Cibrsort (https://cibersort.stanford.edu/) are shown.
  • the composition of immune system cells in the tumors developed in each mouse is shown.
  • the upper row shows data of PDL1 gene extracted from the results of RNA-seq and RIP-seq for tumors of EL1 and WTg mice.
  • the number 3 in EL1 and the number 8 in WTg indicate the number of reads of RNA-seq.
  • the 3'UTR region was methylated in the tumors of both mice, with increased methylation, especially in WTg mice.
  • the lower row shows the results of Western blot of PDL1 protein for EL1 and WTg mice. Expression of PDL1 protein was improved in WTg mice.
  • 8 shows the state of tumors in WTg mice treated with anti-PDL1 antibody or Vehicle.
  • the photographs on the right show the excised primary pancreatic tumor and metastatic liver tumor.
  • the vertical axis represents the methylation rate of let-7a-5p (adenine at position 19) measured by mass spectrometry.
  • MiR-21 in the sample before resection of the primary tumor from a human colorectal cancer patient (Before) in which metastasis was found between 1 and 2 years after resection of the primary tumor and in the sample (After) obtained when metastasis was found A comparison of the methylation rates of -5p, miR-17-5p, let7a-5p, and miR-200c-5p is shown. The Before and After samples of the same patient were connected by a line.
  • the vertical axis represents the methylation rate of the target miRNA measured by mass spectrometry.
  • FIG. 6 shows the intensity of MS signals showing methylated miR-21-5p (top) and let-7a-5p (bottom) for normal and tumor tissues.
  • the m/z at the position of the arrow is the signal of the fragment derived from methylated RNA.
  • the vertical axis represents the signal intensity measured by the mass spectrometer.
  • FIG. 9 shows the MS signal intensities for methylated miR-200c-3p (top) and miR-200c-5p (bottom) for normal and tumor tissues.
  • the m/z at the position of the arrow is the signal of the fragment derived from methylated RNA.
  • the vertical axis represents the signal intensity measured by the mass spectrometer.
  • FIG. 6 shows the MS signal intensity indicating methylated miR-17c-5p for normal tissue and tumor tissue.
  • the m/z at the position of the arrow is the signal of the fragment derived from methylated RNA.
  • the vertical axis represents the signal intensity measured by the mass spectrometer.
  • the percentage (%) of methylated RNA in the RNA of the sequence of interest between normal and tumor tissues It is the figure which compared the upper level and RNA expression level (lower).
  • N. S. Indicates that there was no significant difference.
  • FIG. 6 shows the MS signal indicating the presence of methylated miR-200c-5p. Ammonia treatment is performed to confirm the internal arrangement.
  • FIG. 3 is a diagram comparing the ratio (%) of methylated RNA in RNA of a sequence of interest between normal tissue and tumor tissue for miR-200c-3p and miR-let7a-5p. It is a schematic diagram of a system configuration.
  • RNA ribonucleic acid
  • RNA means a molecule containing at least one ribonucleotide residue.
  • ribonucleotide is meant a nucleotide having a hydroxyl group at the 2'position of the ⁇ -D-ribo-furanose moiety.
  • RNA includes, for example, mRNA, tRNA, rRNA, lncRNA, and miRNA.
  • mRNA messenger RNA
  • mRNA refers to RNA that is produced by using a DNA template and is associated with a transcript that encodes a peptide or polypeptide.
  • the mRNA comprises a 5'-UTR, a protein coding region, and a 3'-UTR.
  • Specific information (sequence etc.) of mRNA can be used by referring to NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), for example.
  • human mature microRNAs include those in the table below.
  • microRNA refers to a functional nucleic acid that is encoded on the genome and finally becomes a minute RNA having a length of 20 to 25 bases through a multistep generation process.
  • Specific information (sequence etc.) of miRNA can be used by referring to, for example, mirbase (http://mirbase.org).
  • mirbase http://mirbase.org
  • human mature microRNAs include those in the table below.
  • long non-coding RNA refers to RNA of 200 nt or more that functions without being translated into a protein. Specific information (sequences, etc.) of lncRNA can be used by referring to, for example, RNAcentral (http://rnacentral.org/).
  • ribosomal RNA refers to RNA that constitutes ribosome. Specific information (sequence, etc.) of rRNA can be used by referring to NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), for example.
  • transfer RNA refers to a tRNA that is known to be aminoacylated by an aminoacyl tRNA synthetase. Specific information (sequence etc.) of tRNA can be used by referring to NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), for example.
  • RNA Modification used in the context of nucleic acids refers to a state in which a part or all of the constituent units of the nucleic acid or its terminals are replaced with other atomic groups, or functional groups are added. Refers to.
  • the set of RNA modifications is sometimes referred to as “RNA Modomics”, “RNA” Mod, etc., and these are also called epitranscriptomes because RNA is a transcript, and are synonymous in this specification. used.
  • RNA modification examples include, but are not limited to, those shown in the following table, and any modification can be used as long as it corresponds to the modification.
  • methylation refers to methylation at any position of any type of nucleotide, but typically methylation of adenine (eg, position 6; m6A, 1-position; m1A), methylation of cytosine (eg 5-position; m5C, 3-position; m3C).
  • the detected modification site can be specified using a method known in the art.
  • m1A and m6A and m3C and m5C can be determined by chemical modification.
  • RNA modifications found in tRNA, rRNA, mRNA, etc. a considerable degree can be identified as a difference in mass number.
  • chemical modifications can create mass number differences that can theoretically be distinguished.
  • those having the same mass number can be identified by using other methods known in the art.
  • measurement is used in the ordinary meaning used in the relevant field, and means to measure and obtain the amount of a certain object.
  • detection is used in the ordinary meaning used in the art, and means to find out by inspecting a substance or component
  • identity refers to an existing object related to a certain object. It refers to the act of searching for the attribution of it from the classification of, and when used in the chemical field, it means determining the identity of a target substance as a chemical substance (for example, determining the chemical structure), “Quantitative” refers to determining the amount of the substance in question.
  • the “amount” of an analyte in a sample generally refers to the absolute value that reflects the detectable mass of the analyte in the volume of the sample. However, the amount also contemplates a relative amount as compared to another analyte amount. For example, the amount of analyte in the sample can be above the control or normal level of analyte normally present in the sample.
  • the “subject” refers to a subject (for example, an organism such as a human or cells taken out from the organism, blood, urine, serum, etc.) to be subjected to analysis, diagnosis, or detection of the present disclosure.
  • organ that can be used in the present specification is also referred to as "organ”, and is a unit that constitutes the body of a multicellular organism such as an animal or a plant, and is morphologically distinguished from the surroundings. It refers to the one that has the function of cohesion.
  • organs typically, the liver, spleen, and lymph nodes are exemplified, and in addition, other organs such as kidney, lung, adrenal gland, pancreas, heart, and the like can be exemplified, but not limited thereto.
  • the term “primary” with respect to a tumor or cancer is used in the ordinary meaning used in the art, and the tumor or cancer is a physicochemical stimulus such as a chemical substance or radiation. It means that it occurs spontaneously in any factor, or that it occurs as a result of intentionally transplanting cancer cells imitating such a tumor or cancer that naturally occurs.
  • metastatic lesions is used in the ordinary meaning used in the art, and means that tumor cells reach a location different from the primary lesion and proliferate there. Metastasis is a complex biological event involving various factors such as cell localization, cell migration, cell adhesion, extracellular matrix, immune system and angiogenesis. In metastases, the nature of the cells originally present at the primary site may be found ectopically. Therefore, for the treatment of metastatic lesions, the treatment that is originally effective at the site where the metastatic lesions exist may not be appropriate. For example, when a tumor is present in the liver, there is a possibility of primary liver cancer and cancer that has metastasized to the liver from a primary lesion at another site.
  • liver cancer If it is a primary liver cancer, it is effective to treat it as liver cancer, but if it is a cancer that has metastasized to the liver from a primary lesion of another site, the treatment strategy (depending on the type of primary lesion) Since it is necessary to determine the type of anticancer drug), it is of great medical significance to distinguish whether the cancer is primary or metastatic.
  • condition associated with cancer metastasis/primary tumor refers to the current status of one or both of a primary tumor and a metastatic tumor (eg, grade, size, site of existence, progress from the onset). Time), future development, treatability, resistance (eg, resistance to drugs and/or treatments) availability, and possible post-curative course of any condition associated with cancer metastasis. Meaning, for example, the degree of cancer invasion, whether cancer has metastasized, where the cancer has metastasized, whether the tumor is a primary tumor, where the primary tumor occurred, or tumor Responsiveness to drugs or treatments (primary and/or metastatic tumors) and their potential.
  • biomarker is an index for evaluating the condition or action of a certain subject. Unless otherwise specified herein, a “biomarker” may be referred to as a “marker”.
  • the detecting agent or detecting means of the present disclosure may be a complex or a complex molecule in which another substance (eg, label) is bound to a detectable moiety (eg, antibody).
  • a detectable moiety eg, antibody
  • complex or “complex molecule” means any construct that comprises two or more moieties.
  • one part is a polypeptide
  • the other part may be a polypeptide and is a substance other than that (for example, a base material, sugar, lipid, nucleic acid, other hydrocarbon, etc.). May be.
  • two or more parts constituting the complex may be bonded by a covalent bond, or may be bonded by another bond (eg, hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic interaction, van der Waals force, etc.). It may have been done.
  • two or more parts are polypeptides, they may be referred to as chimeric polypeptides. Therefore, the “complex” in the present specification includes a molecule formed by linking a plurality of kinds of molecules such as a polypeptide, a polynucleotide, a lipid, a sugar, and a small molecule.
  • “detection” or “quantification” of polynucleotide expression refers to detection or quantification of modification information on RNA using the technique described herein, and other indicators such as marker detection.
  • Amounts of PCR products can be measured in the present disclosure, although this can be accomplished using any suitable method, including mRNA measurement and immunoassay methods that involve binding or interaction with an agent.
  • the molecular biological measurement method include Northern blotting, dot blotting, PCR and the like.
  • Examples of the immunological measurement method include ELISA method using a microtiter plate, RIA method, fluorescent antibody method, luminescent immunoassay (LIA), immunoprecipitation method (IP), immunodiffusion method (SRID), and immunoassay.
  • a turbidimetric method (TIA), a Western blotting method, an immunohistological staining method and the like are exemplified. Moreover, an ELISA method, a RIA method, etc. are illustrated as a quantification method. It can also be performed by a gene analysis method using an array (eg, DNA array, protein array).
  • the DNA array is widely described in "Cell Engineering Supplement, "DNA Microarray and Latest PCR Method", edited by Shujunsha Co., Ltd.). For protein arrays, see Nat Genet. 2002 Dec;32 Suppl:526-32.
  • Examples of the gene expression analysis method include, but are not limited to, RT-PCR, RACE method, SSCP method, immunoprecipitation method, two-hybrid system, and in vitro translation, in addition to the above.
  • Such further analysis methods are described in, for example, the Genome Analysis Experimental Method-Yusuke Nakamura Lab Manual, edited by Yusuke Nakamura Yodosha (2002), and all the descriptions thereof are incorporated herein by reference. To be done.
  • “means” means any tool that can achieve a certain purpose (for example, detection, diagnosis, treatment), and in particular, in the present specification, “means for selectively recognizing (detecting)” "Means a means capable of recognizing (detecting) an object differently from other objects.
  • MS mass spectrometry
  • MS refers to an analytical method for identifying a compound by its mass, such as particles such as atoms, molecules, and clusters. Is made into a gaseous ion by some method (ionization), and is moved in a vacuum to use electromagnetic force or the like, or a technique of separating and detecting the ions according to the mass-to-charge ratio by the time difference of flight or the like.
  • MS refers to a method of filtering, detecting, and measuring ions based on their mass-to-charge ratio, or "m/z”.
  • MS techniques generally include (1) ionizing a compound to form a charged compound: and (2) detecting the molecular weight of the charged compound and calculating a mass-to-charge ratio.
  • the compound may be ionized and detected by any suitable means.
  • a "mass spectrometer” generally includes an ionizer, a mass analyzer and an ion detector.
  • one or more molecules of interest are ionized and the ions are then introduced into a mass spectrometric instrument where the ions, due to the combination of magnetic and electric fields, have a mass (“m”) and a charge (“m”).
  • m mass
  • m charge
  • z charge
  • Examples of the mass spectrometer include a magnetic field type, an electric field type, a quadrupole type, and a time-of-flight type.
  • Ion detection in quantification is performed by selective ion monitoring, which selectively detects only target ions, or by selecting one of the ion species purified by the first mass spectrometric unit as a precursor ion and then selecting the second ion.
  • Selective reaction monitoring SRM
  • SRM improves the signal/noise ratio by increasing selectivity and reducing noise.
  • FWHM Resolution
  • m/ ⁇ m 50% the term “resolution” or “resolution (FWHM)” refers to the width of the mass peak at 50% of maximum height. Refers to the observed mass-to-charge ratio divided by (Full Width at Half Maximum, “FWHM”). Higher resolution may be better qualitative and quantitative.
  • the “label” means an entity (for example, substance, energy, electromagnetic wave, etc.) for distinguishing a target molecule or substance from others.
  • labeling method include RI (radioisotope) method, stable isotope labeling method, fluorescence method, biotin method, optical method utilizing Raman scattering, and chemiluminescence method.
  • labeling is performed by substances having different Raman scatterings.
  • a label can be utilized to modify the intended subject so that it can be detected by the detection means used.
  • modifications are known in the art, and those skilled in the art can appropriately carry out such a method depending on the label and the intended subject.
  • diagnosis means identifying various parameters related to a condition (eg, disease, disorder) in a subject, and determining the present or future of such condition.
  • conditions within the body can be investigated, and such information can be used to determine the metastasis/primary cancer-related condition in a subject (eg, subject metastases).
  • Various parameters can be selected, such as whether or not the patient has a sex cancer, whether the cancer is primary), the formulation or method for treatment or prophylaxis to be administered.
  • diagnosis in a narrow sense refers to diagnosis of the current state, but broadly includes “early diagnosis”, “predictive diagnosis”, “pre-diagnosis” and the like.
  • the diagnostic method of the present disclosure is industrially useful because, in principle, the diagnostic method that comes out of the body can be used and the diagnostic method can be performed without the hands of a medical staff such as a doctor.
  • a medical staff such as a doctor
  • "predictive diagnosis, pre-diagnosis or diagnosis” may be referred to as "support”.
  • the technique of the present disclosure can be applied to such a diagnostic technique.
  • treatment refers to a certain condition (for example, a disease or disorder), when such a condition is caused, prevention of deterioration of such condition, preferably maintenance of the current state, more preferably, Reducing, and more preferably abolishing, including being able to exert a symptom improving effect or a preventive effect on a patient's condition or one or more symptoms associated with the condition.
  • Preliminary diagnosis and appropriate treatment are called “companion treatments”, and diagnostic agents therefor are sometimes called “companion diagnostic agents”.
  • the ability to identify RNA modifications using the techniques of this disclosure will allow for conditions associated with metastasis/primaryness of a particular cancer (eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary). Or not) and may be useful in such companion treatment or companion diagnostics.
  • prognosis means predicting the possibility of death or progression due to a disease or disorder such as cancer.
  • Prognostic factors are variables relating to the natural course of a disease or disorder, and these affect the recurrence rate of patients who once developed the disease or disorder.
  • Clinical indicators associated with worse prognosis include, for example, any of the cellular indicators used in the present disclosure.
  • Prognostic factors are often used to classify patients into subgroups with different pathologies. The ability to identify RNA modifications using the techniques of this disclosure will allow for conditions associated with metastasis/primaryness of a particular cancer (eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary). It can be useful as a technique for providing a prognostic factor because it can be associated with
  • detection device means, in a broad sense, any device capable of detecting or inspecting a target object.
  • diagnosis agent refers, in a broad sense, to any agent capable of diagnosing a target condition (eg, cancer, classification, aging, etc.).
  • the “kit” is usually a unit in which two or more compartments are provided and parts to be provided (for example, test agents, diagnostic agents, therapeutic agents, reagents, labels, instructions, etc.) are provided.
  • This kit form is preferable when it is intended to provide a composition that should not be provided as a mixture for stability or the like, and is preferably used as a mixture immediately before use.
  • Such kits preferably include instructions that describe how to use the provided parts (eg, test agents, diagnostic agents, therapeutic agents, reagents, labels, etc.) or how to treat them.
  • the kit when the kit is used as a reagent kit, the kit describes how to use test agents, diagnostic agents, therapeutic agents, reagents, labels, etc. It includes instructions, etc.
  • the “kit” can be provided as a “system”.
  • an “instruction” describes a doctor or other user how to use the present disclosure.
  • the instructions describe the detection method of the present disclosure, the usage of the diagnostic agent, or the words instructing to administer the drug or the like.
  • the instruction sheet may describe, as an administration site, a word for instructing oral administration or administration to the esophagus (eg, by injection).
  • This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the regulatory agency of the country in which the present disclosure is implemented (for example, Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan, Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc.), and approved by the regulatory agency. The fact that you have received is specified.
  • the instructions are so-called package inserts and are usually provided in a paper medium, but are not limited thereto, and are in a form such as an electronic medium (for example, a website provided on the Internet, an electronic mail). But it can be offered.
  • program is used in the ordinary meaning used in the field, describes the processing to be performed by a computer in order, and is legally treated as "a thing”. All computers work according to the program. In modern computers, programs are represented as data and stored in recording media or storage devices.
  • the “recording medium” is a recording medium that stores a program for executing the present disclosure
  • the recording medium may be any medium as long as the program can be recorded.
  • it may be an external storage device such as a ROM, an HDD, a magnetic disk, a flash memory such as a USB memory, which can be stored inside, but is not limited thereto.
  • system refers to a configuration for executing the method or program of the present disclosure, and originally means a system or organization for performing the purpose, and a plurality of elements are systematically configured. , Which affect each other, and in the field of computers, refer to the overall configuration of hardware, software, OS, network, etc.
  • RNA modification provides conditions related to metastasis/primary cancer in a subject based on modification information on RNA (eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary). Provide a way to analyze.
  • modification information on RNA eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary.
  • the modification information comprises modification information on the microRNA.
  • the modification information comprises modification information on the lncRNA.
  • the modification information comprises methylation information.
  • the modification information comprises methylation information on the microRNA.
  • the modification information comprises methylation information on the lncRNA.
  • the disclosure provides for measuring modifications on RNA using a mass spectrometer to determine a condition associated with cancer metastasis/primaryness (eg, whether the subject has metastatic cancer, Whether the cancer is primary) and this method (A) purifying the target RNA using beads to which a nucleic acid complementary to the target RNA is covalently linked (B) a step of ionizing the purified RNA by MALDI and measuring with a mass spectrometer to obtain information on the modification state on the RNA of interest; (C) analyzing a condition associated with cancer metastasis/primaryness in the subject based on the information regarding the modified state.
  • a condition associated with cancer metastasis/primaryness eg, whether the subject has metastatic cancer, Whether the cancer is primary
  • a feature of the present disclosure is that the internal sequence and the position of the modified base can be observed by using the alkaline hydrolysis with ammonia in combination.
  • a denaturant is added to a starting material (homogenate, cell lysate, serum, etc.) and direct hybridization is performed to purify miRNA having a specific sequence
  • a technique for directly binding a capture nucleic acid to beads is used.
  • the disclosure provides for measuring modifications on RNA using a mass spectrometer to determine a condition associated with cancer metastasis/primaryness (eg, whether the subject has metastatic cancer, Whether the cancer is primary) and this method (A-1) purifying exosomes by a cell fractionation method, (A-2) purifying exosomes using an anti-CD63 antibody, (B) purifying the target RNA using a nucleic acid complementary to the target RNA, (C) a step of ionizing the purified RNA by an ionization method (for example, MALDI) and measuring with a mass spectrometer to obtain information about a modification state on the RNA of interest, (D) analyzing a condition associated with cancer metastasis/primaryness in the subject based on the information regarding the modified state.
  • A-1 purifying exosomes by a cell fractionation method
  • A-2) purifying exosomes using an anti-CD63 antibody
  • B purifying the target RNA using a nucleic acid complementary
  • the intensity of mass spectrometry eg, MALDI-MS
  • the intensity of mass spectrometry is significantly improved by performing the step of purifying exosomes in advance.
  • combining steps (A) and (B), or combining steps (A) and (C) may improve purification or improve mass. It has been found that the intensity of analytical (eg MALDI-MS) measurements is greatly improved. In addition, when both (A-1) and (A-2) were carried out, there was an effect that the intensity of the MALDI-MS signal became about 2.5 times, which is an effect that could not be predicted in the past. It can be said that there is.
  • analytical eg MALDI-MS
  • sample The method of the present disclosure can be carried out using any sample containing RNA, but clinically available ones are preferable.
  • the sample is from a subject, where the subject is a mammal (eg, human, chimpanzee, monkey, mouse, rat, rabbit, dog, horse, pig, cat, etc.) Examples include but are not limited to pets.
  • the sample is from a subject that has, or may have, a particular condition for cancer.
  • a disease for example, an infection caused by a carcinogenic virus such as human papilloma virus
  • an age for example, a sex, a race
  • a history of cancer in a family for example, a medical history (for example, , Cancer disease history), treatment history (for example, history of anti-cancer treatment), smoking status, drinking status, occupation, living environment information, etc., but are not limited thereto.
  • the sample is an organ, tissue, cell (eg, circulating tumor cells (CTC), etc.), blood (eg, plasma, serum, etc.), mucosal epidermis (eg, oral cavity, nasal cavity, etc.) obtained from the subject.
  • CTC circulating tumor cells
  • mucosal epidermis eg, oral cavity, nasal cavity, etc.
  • the sample is a surgically excised or biopsied solid biopsy or portion thereof.
  • the present inventor has found that it is possible to analyze a condition related to cancer metastasis/primaryness by measuring a modification on microRNA. Since it can be collected from a sample that can be easily collected such as a test (eg, blood, urine, saliva), it can be analyzed with a minimum load on the subject, such as a liquid biopsy.
  • the method of using the sample can be a preferred embodiment of the present disclosure.
  • the RNA may or may not be purified prior to analysis for RNA modification.
  • the term “purified” substance or biological factor for example, RNA or protein such as a gene marker
  • the term “purified” as used herein preferably comprises at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight, It means that the same type of biological factor exists.
  • RNA as used herein may be isolated.
  • RNAs of all types may be purified from other components without discrimination.
  • poly A may be used to purify RNA from other components.
  • all microRNA may be purified from other components.
  • RNA having the sequence of interest may be purified from other components.
  • RNA having multiple types of sequences of interest may be purified separately for each sequence.
  • RNA with modifications may be purified from other components.
  • RNA with methylation modifications may be purified from other components.
  • RNA having the sequence of interest (single type or multiple types) and modification (single type or multiple types) may be purified from other components.
  • the RNA of interest is SEQ ID NO: 1-4.
  • CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG SEQ ID NO: 1
  • UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA SEQ ID NO: 2
  • CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG SEQ ID NO: 3
  • UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU SEQ ID NO: 4
  • RNA-specific molecules may be used to purify total RNA.
  • the target RNA may be purified by purifying the nucleic acid molecule after the action of the DNA degrading enzyme. Plural types of RNA may be purified separately, in parallel, or in a mixed state.
  • 1, 2, 3, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500 or 3000 RNAs may be purified in parallel (eg, using a carrier-bound sequence-specific RNA capture molecule).
  • nucleic acid molecules that are at least partially complementary to the sequence of interest eg, DNA and RNA
  • the complementary Nucleic acid molecules may include any portion for purification.
  • a carrier such as beads (which may be magnetic if necessary), a pair of mutually binding pair molecules such as biotin and streptavidin, which are bound to each other
  • a moiety for binding a pair molecule eg, an alkyne moiety in click chemistry
  • an antibody recognition moiety e.g., an antibody binding moiety for binding a pair molecule
  • specific binding molecules eg, antibodies
  • a binding molecule eg, antibody
  • RNA modification eg, methylation
  • a binding molecule eg, antibody
  • a binding molecule eg, an antibody
  • a binding molecule specific for a particular sequence
  • the RNA of interest may be purified using binding molecules (eg, antibodies) specific for particular modifications and particular sequences.
  • RNA is purified using DNA containing at least a portion of a sequence selected from the group consisting of:
  • RNA of interest may be purified by purifying intracellular organelles (eg, exosomes).
  • intracellular organelles eg, exosomes
  • the RNA of interest may be purified by centrifugation.
  • the RNA of interest may be purified by using a molecule (eg, an antibody) that binds to a molecule present in an organelle (eg, an anti-CD63 antibody is used to purify exosomes).
  • a molecule eg, an antibody
  • an anti-CD63 antibody is used to purify exosomes.
  • RNA having a target sequence may be directly purified from a sample, or total RNA may be purified from a sample and then RNA having a target sequence may be purified. ..
  • RNA of interest when purifying a plurality of types of RNA of interest, at least two types of the RNA of interest may be purified in a mixed state, or each of the RNAs of interest may be purified separately.
  • the sample in the case of separately purifying RNA having a plurality of target sequences, the sample may be divided into a plurality of samples, and the target nucleic acids having different sequences may be purified from the respective divided samples.
  • the target nucleic acid may be purified by applying the sample to a carrier in which nucleic acid molecules complementary to are arranged at a plurality of distant positions.
  • RNA sequencing after chemical treatment such as bisulfite sequencing (combined with PCR if necessary), nanopore sequencing (eg from Oxford Nanopore Technologies), tunnel current sequencing (Scientific Reports) 2,doi: 10.1038/srep00501(2012)).
  • the detection and identification of modifications on RNA may be performed in parallel with the identification of RNA sequence information.
  • any RNA modification information can be identified.
  • the type of modification on the RNA of interest including the type of modification with the same type of functional group introduced at different positions on one nucleotide
  • the amount and percentage of modified RNA of interest At least one of the amount and rate of modification on the RNA of interest and the position of the modification on the RNA of interest is identified, optionally together with the amount of the RNA.
  • the modification state on the RNA of interest can include the confidence level of the modification state (eg, true positive probability).
  • methylation on RNA is identified.
  • methylation on nucleosides is identified.
  • nucleobase methylation of RNA is identified. In one embodiment, methylation on nucleosides is identified. In one embodiment, the RNA m 6 A is identified. In one embodiment, the RNA modification state (based on at least one of the recognition motif information of the enzyme that adds the modification, the recognition motif information of the enzyme that removes the modification, and the recognition motif information of the protein that binds to the modification ( For example, the position of modification, reliability of modification state, etc.) are identified.
  • CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG Methylation of the 13th A of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 10) UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA Methylation of the 9th C in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 11) CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG Methylation of the 13th C in SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 12) UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU Methylation of A at position 19 of SEQ ID NO: 5 (SEQ ID NO: 13) Modifications are identified, including modifications selected from the group consisting of:
  • miR-434-3p miR-127-5p, miR-145a-5p, miR-143-5p, miR-300-3p, miR-495-3p, miR-3102-3p, miR-. 339-3p, miR-376b-5p, miR-382-3p, miR-204-5p, miR-679-5p, miR-547-3p, miR-431-3p, miR-370-5p, miR-1843a- 3p, miR-431-5p, miR-409-5p, miR-668-3p, miR-341-3p, miR-329-5p, miR-465a-5p, miR-450b-5p, miR-380-5p, miR-466c-5p, miR-743b-5p, miR-26a-1-3p, miR-743a-5p, miR-34b-3p, miR-883a-3p, and miR-152-5p, miR-23a-5p , MiR-19a-3p, miR-96
  • a modification (eg, methylation) on at least one lncRNA selected from the group consisting of G530011O06Rik, Tmem51os1, Gm17300, 4930412M03Rik, Gm16046, Gm15298, and Gm16091 is identified and associated with metastasis/primarity of the cancer of interest.
  • the condition eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary
  • modifications on RNA can be detected and identified by radiation emitted from radioactive atoms contained in the moieties that make up the modifications (eg, the methyl moieties).
  • the modifications on the RNA include detection of binding (eg, detection of fluorescence) of a molecule that specifically binds to the modification (eg, modification-specific antibody), or a molecule that specifically reacts to the modification. It can be specified by detection of a reaction product generated by the reaction (for example, detection of light which is a reaction product, detection of a biotin derivative generated by the reaction by streptavidin, etc.).
  • modifications on RNA can be identified in nucleic acid sequencing methods such as bisulfite sequencing, sequencing RNA enriched with modification-specific antibodies (RIP sequencing). Any suitable sequencing method can be used in accordance with the present disclosure.
  • Next-generation sequencing (NGS) technology is preferred.
  • NGS Next-generation sequencing
  • the term "next generation sequencing” or “NGS” refers to the entire nucleic acid template by dividing the entire nucleic acid into smaller pieces as opposed to the "conventional” sequencing method known as Sanger chemistry. Means all novel high-throughput sequencing techniques that randomly read in parallel along.
  • NGS technology also referred to as Massively Parallel Sequencing Technology
  • NGS technology provides nucleic acid sequence information of whole genome, exome, transcriptome (all transcribed sequences of genome) or methylome (all methylated sequences of genome) for a very short period of time. For example, it can be delivered within 1-2 weeks, preferably within 1-7 days, or most preferably within 24 hours, allowing in principle a single cell sequencing approach. Any NGS platform that is commercially available or mentioned in the literature can be used to practice the present disclosure.
  • nucleic acids amplified by PCR can be sequenced to identify modifications on RNA.
  • RNA is identified as modified RNA based on being purified by a modification-specific binding molecule (eg, an antibody such as an anti-m6A antibody).
  • a modification-specific binding molecule eg, an antibody such as an anti-m6A antibody.
  • the data obtained by sequencing can be processed by any analysis method and converted into RNA modification information.
  • analysis methods include, but are not limited to, MetPeak (see Cui et al., Bioinformatics (2016) 32(12):i378-i385).
  • RNA modifications on RNA can be identified by mass spectrometry.
  • Mass spectrometers that can be used in the present disclosure include magnetic field type, electric field type, quadrupole type, time of flight (TOF), and the like.
  • TOF time of flight
  • a single-stranded RNA may be measured by a mass spectrometer, or a double-stranded RNA with DNA or RNA may be measured.
  • Mass spectrometry can be combined with any ionization method.
  • Ionization methods that can be used in the present disclosure include, for example, electron ionization method (EI), chemical ionization method (CI), fast atom bombardment method (FAB), matrix assisted laser desorption ionization method (MALDI), electrospray ionization. Law (ESI), but is not limited thereto.
  • EI electron ionization method
  • CI chemical ionization method
  • FAB fast atom bombardment method
  • MALDI matrix assisted laser desorption ionization method
  • ESI electrospray ionization. Law
  • ESI electrospray ionization. Law
  • ESI electrospray ionization. Law
  • ESI electrospray ionization. Law
  • ESI electrospray ionization. Law
  • ESI electrospray ionization. Law
  • ESI electrospray ionization. Law
  • RNA placed in one spot (anchor position) on the target plate may include RNA having multiple sequences, but preferably RNA placed in one spot on the target plate. Is a group of RNAs that share the same sequence. As the number of RNA sequences present on one anchor position increases, confirmation of the sequence and/or the position of modification can become difficult.
  • RNA modification status (eg, presence or absence of modification, modification position, modification) based on measurements of unfragmented ions (parent ions) and/or fragmented ions (daughter ions). , The reliability of modification, etc.) can be identified.
  • the modification status of RNA eg, stable isotope-labeled nucleic acid, unmodified nucleic acid, the other nucleic acid of a pair that had formed a complementary duplex, etc.
  • a control molecule such as For example, the amount of modification, etc.
  • the modification state of RNA can be identified based on reference information (for example, measurement results of standard samples, known modification information, etc.).
  • Mass spectrometric data can be processed by any software to convert it to an RNA modified state.
  • examples of such software include, but are not limited to, the DNA methylation analysis system MassARRAY® EpiTYPER (Sequenom).
  • the sample containing the RNA of interest, whose modification can be measured to analyze a condition associated with cancer metastasis/primaryity is physically, chemically or biologically prior to measurement. May be pre-processed.
  • pretreatment for example, the sensitivity, accuracy and/or precision in the measurement of the RNA of interest can be improved, the different types of modifications can be distinguished, the quantitativeness in the comparison between samples can be improved, and the separation in the measuring instrument can be improved. The effect can be obtained.
  • pretreatment examples include dimethyl sulfate treatment, halogen compound treatment, alkali hydrolysis treatment, stable isotope label introduction treatment, and detection enhancer (for example, a fluorescent dye or the like, which includes a portion having good laser absorption in MALDI). Compound) treatment, but is not limited thereto.
  • pretreatment can be performed on RNA-loaded substrates such as beads.
  • the pretreatment agent can be designed to introduce a group at the amine moiety, the terminal phosphate group or the hydroxyl group on the base of RNA.
  • Dimethyl sulfate treatment can selectively methylate the nitrogen atom at position 1 of the purine ring of adenine of RNA to give a mass of +14 Da, but the nitrogen atom at position 1 of the purine ring is already methylated. In this case, this reaction does not proceed and it is possible to distinguish between 1-mA and N6-mA.
  • methyl trifluoromethanesulfonate may be used.
  • a halogen compound for example, a halogenated acetaldehyde can be used, and a new 5-membered ring is formed by bridging the nitrogen atom at the 3-position and the amino group at the 4-position of cytosine of RNA.
  • halogenated acetaldehyde examples include bromoacetaldehyde and chloroacetaldehyde, and since these compounds have a boiling point of about 60° C., they can be removed by vacuum drying without degrading RNA. Alkaline hydrolysis, for example, treats RNA with ammonia to fragment the RNA.
  • RNA modification information obtained can be used to analyze metastasis/primary associated states of various cancers.
  • Conditions related to cancer metastasis/primaryness include the degree of cancer invasion, whether cancer has metastasized, where the cancer has metastasized, and whether the tumor is a primary tumor. , The site of origin of the primary tumor, the responsiveness of the tumor (primary tumor and/or metastatic tumor) to a drug or treatment and their potential.
  • Cancers that analyze metastasis-related conditions can be any cancer, including pancreatic cancer (eg, early pancreatic cancer), liver cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, gastric cancer, and large intestine. Cancer, bladder cancer, kidney cancer, breast cancer, lung cancer, brain tumor, skin cancer and the like.
  • the cancer for which a condition associated with metastasis is analyzed is a refractory cancer, including pancreatic cancer. It would be of great medical benefit to be able to perform a detailed analysis of cancer metastasis/primary associated conditions.
  • a refractory cancer including pancreatic cancer.
  • pancreatic cancer a refractory cancer
  • metastatic lesions the nature of cells originally present at the primary site is found ectopically, and the nature of primary tumors and metastatic tumors are different, so appropriate treatment may differ between the two. It was not easy to distinguish between the two methods.
  • the methods of the present disclosure can be very beneficial because primary tumors and metastatic tumors can be easily distinguished (eg, using blood samples).
  • the present disclosure also provides agents of the organism of interest (or anti-cancer agents, molecularly targeted agents, antibody drugs, biologics (eg, (Nucleic acid, protein) etc.) or responsiveness to treatment can be analyzed.
  • agents of the organism of interest or anti-cancer agents, molecularly targeted agents, antibody drugs, biologics (eg, (Nucleic acid, protein) etc.
  • responsiveness to treatment can be analyzed.
  • drug resistance and the like can be analyzed, and for example, it can be applied to analysis of responsiveness to anticancer agents, selection of appropriate therapeutic agents, and the like.
  • the analysis of the present disclosure can also be used for analysis of the course and prognosis of surgery or radiation treatment such as treatment with heavy ion beam (for example, Carbon/HIMAC) or X-ray.
  • various drugs such as LONSURF (TAS102), gemcitabine, CDDP, 5-FU, cetuximab, nucleic acid drugs or histone demethylase inhibitors are given for cancer metastasis/primarity related conditions.
  • impacts can be analyzed and can be used as basic information for treatment strategies.
  • the present disclosure such as the selection of a drug and/or additional treatment for said subject to treat a condition associated with cancer metastasis/primaryness in the subject based on its responsiveness to such treatment as the drug. It can be performed.
  • a drug for treating the condition can be indicated from among the plurality of drugs.
  • the analysis can be based on comparison of modification information (eg, methylation) of the RNA of the present disclosure in the subject before and after administration of the drug or the treatment.
  • a subject to analyze a condition associated with cancer metastasis/primaryness eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary.
  • the analysis can be performed by further considering at least one information selected from the group consisting of living environment information, cancer marker information, nucleic acid information, metabolite information, protein information, and any combination thereof.
  • nucleic acid information examples include genomic information, epigenome information, transcriptome expression level information, RIP sequencing information, microRNA expression level information, and any combination thereof. it can.
  • RNA to be analyzed by the present disclosure can be increased or decreased according to the purpose of analysis, and for example, at least 5, at least 10, at least 20, at least 30, at least 50, at least 100, Modification information on at least 200 types, at least 300 types, at least 500 types, at least 1000 types, at least 1500 types, at least 2000 types of RNA can be analyzed.
  • at least one kind of RNA is RNA that can analyze the state related to cancer metastasis/primaryness by measuring the modification of the RNA.
  • microRNAs when microRNAs are targeted, all microRNAs shown in Table 1 may be targeted.
  • lncRNA all lncRNAs shown in Table 2 may be targets.
  • RNA is not particularly limited, but mRNA, tRNA, rRNA, lncRNA, miRNA and the like may be used alone or in combination of a plurality of types.
  • multiple modification information on RNA containing the same sequence can be analyzed.
  • a condition associated with metastasis/primaryness of the cancer in the subject eg, whether the subject has metastatic cancer, the cancer is primary, etc.
  • RNA structural information eg. whether the subject has metastatic cancer, the cancer is primary, etc.
  • a family having a YTH domain such as a methylating enzyme (eg, Mettl3, Mettl14, Wtap), a demethylating enzyme (eg, FTO, AlkBH5) and a methylating recognition enzyme (eg, YTHDF1, YTHDFF2, YTHDF3).
  • a methylating enzyme eg, Mettl3, Mettl14, Wtap
  • a demethylating enzyme eg, FTO, AlkBH5
  • a methylating recognition enzyme eg, YTHDF1, YTHDFF2, YTHDF3
  • a methylating enzyme eg, Mettl3, Mettl14, Wtap
  • a demethylating enzyme eg, FTO, AlkBH5
  • methylation recognition for example, a family molecule having a YTH domain such as YTHDF1, YTHDF2, and YTHDF3
  • a condition related to the metastasis/primarity of the cancer of the subject for example, Of having a metastatic cancer, whether the cancer is primary.
  • a step of calculating the probability of a state may be performed based on a plurality of pieces of modification information.
  • any statistical method can be performed, and for example, principal component analysis can be performed.
  • the efficacy of anticancer drugs eg, Lonsurf (TAS102), gemcitabine, CDDP, 5-FU, cetuximab, nucleic acid drugs or histone demethylase inhibitors
  • TAS102 Lonsurf
  • gemcitabine gemcitabine
  • CDDP 5-FU
  • cetuximab nucleic acid drugs or histone demethylase inhibitors
  • microRNAs can be analyzed by the techniques of the present disclosure to further elucidate the mechanism of action of cancer metastasis/primaryness-related conditions. That is, the method of the present disclosure can be used to analyze a microRNA that fluctuates depending on a condition related to cancer metastasis/primaryness, which is specific to a drug such as an anticancer drug, and can be used for companion diagnosis. Can design medicine. In one embodiment, companion diagnostics can be performed using miRNA in peripheral blood obtained with a minimally invasive liquid biopsy.
  • the present disclosure can perform analysis on cancer stem cells or Cancer Initiating Cells (CIC).
  • CIC Cancer Initiating Cells
  • the analysis of the present disclosure can also be applied when the modified RNA itself is a target molecule of a drug for treating a condition associated with cancer metastasis/primaryness. That is, the analytical technique of the present disclosure can be used to screen for novel agents by detecting modified or unmodified RNA.
  • modification eg, methylation
  • the present disclosure may provide a drug with a new mechanism of action. It is a thing.
  • the analysis of the present disclosure can be applied even when the modified RNA itself is a component molecule of a drug for treating a condition associated with cancer metastasis/primaryness.
  • the analytical technique of the present disclosure to detect modified or unmodified RNA, to analyze whether or not an external factor such as an RNA modified product of interest or an enzyme responsible for the modification can be used as a drug.
  • an external factor such as an RNA modified product of interest or an enzyme responsible for the modification
  • RNA modification In addition to RNA modification, the present disclosure also combines information on nucleic acids other than RNA modification, for example, information on base substitution and/or modification of nucleic acid (DNA, RNA, etc.) to improve cancer metastasis/primarity. It is understood that an analysis of the relevant conditions can be performed.
  • omics other than RNA modification epidermal modification
  • omics other than RNA modification such as Sijia Huang et al., Front Genet.2017;8:84, Yehudit Hasin et al.,Genome Biol.2017;18:83 Can be combined with multi-omics analysis techniques.
  • Information on other nucleic acids can be analyzed by, for example, mass spectrometry.
  • RIP-seq is applied to RNA
  • DIP-seq is applied to DNA
  • BrdU is used for FDNA. It can be analyzed by performing FDIP-seq.
  • the analytical technique of the present disclosure can elucidate the mechanism of a new cancer metastasis/primary-associated state mechanism based on clinical evidence.
  • the present disclosure can be utilized in drug discovery for tumor diversity.
  • RNA mod of the present disclosure for example, methylation information of microRNA
  • single molecule measurement of modified DNA incorporating ChIP-seq or FTD and further CAF (Cancer Associated Fibroblasts) or lymph of the stroma of tumor tissue.
  • CAF Cancer Associated Fibroblasts
  • lymph of the stroma of tumor tissue it can be applied in combination with single cell analysis (C1) of a sphere. It is possible to distinguish and understand the response between the metastatic tumor and the primary tumor when the patient is given the drug. If we can classify inhibitors using RNA mod information, we can create innovative medicines that can differentiate between metastatic tumors and primary tumors.
  • the disclosure provides, for certain agents, (1) extending the indication disease to a cancer metastasis/primary-related condition, and (2) treating a cancer metastasis/primary-related condition. (3) Elucidation of a new mechanism of action of cancer metastasis/primary-related state and therapeutic drug, showing non-inferiority with respect to other preceding drugs and tracing back before 2nd line treatment It can be applied to verify the possibility.
  • the expression information of serum exosome miRNAs is maintained as a liquid biopsy of a patient, such as a cancer patient having a condition associated with metastasis, to analyze serum exosome miRNAs of the patient after treatment to be analyzed.
  • a patient such as a cancer patient having a condition associated with metastasis
  • Expression information and modification information of the present disclosure can be analyzed.
  • RNA information of the present disclosure indicates that the target is a transcription factor, that is, it regulates (often positively) the expression of the target gene. It can also be an important point to be a key inducer of In this case, the number can be narrowed down by carefully selecting independent transcription factors. It is understood that if there is an oncogene, the limited independence of transcription factors will be lost, and various actions will occur in cell context dependent, so it will not be possible to determine the minimum number clearly.
  • miRNA is used, which is characterized by being many-to-many correspondence. That is, it can be said that one micro R acts in a plurality of ways and shares a common target among micro RNAs as different molecules, which is also an important point.
  • Such a "many-to-many correspondence" control system a condition associated with cancer metastasis/primaryness (eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary) It is not surprising that there is an important set of genes that induces, because it is not a single molecule. Rather, it can be said that it is a characteristic of the analysis provided by the present disclosure that it is a limited set or can be expressed with a weight value that can represent the hierarchy in the set.
  • the acquired RNA modification information can be used to search for new biomarkers.
  • RNA obtained in a subject having a condition associated with metastasis/primaryness of cancer eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary
  • Comparing the modification information with RNA modification information obtained in a subject that is not in that state RNA (or RNA) for which a difference (eg, statistically significant difference) in RNA modification state (eg, amount, modification position, etc.) was observed
  • the group can be a biomarker for predicting its condition.
  • RNA modification information obtained in a subject having a condition associated with metastasis/primaryness of a drug and/or treated cancer is compared to similar conditions without the drug and/or treatment.
  • the RNA or group of RNAs in which a difference (for example, a statistically significant difference) in RNA modification state (for example, amount, modification position, etc.) is observed compared to the RNA modification information obtained in the subject It can be a biomarker for predicting responsiveness and/or resistance to treatment.
  • the RNA modification information obtained can be used to evaluate new drugs that treat cancer metastasis/primary associated conditions.
  • RNA modification information obtained in a subject having a metastasis/primary associated condition of cancer treated with one drug is obtained in a subject having a similar condition treated with another drug. By comparing with RNA modification information, classification can be performed among drugs based on RNA that fluctuates in the treatment of each drug.
  • RNA modification for example, methylation
  • DNA and RNA information on a continuous base sequence is lost (fragmented short) as it decomposes, but methylation expresses its quality, and as long as there is a target site, methylation will occur. It is unique in that it can be monitored as "a predisposing factor that has diminished over time and remains that way" because it is expressed as a rate of change. Protein is not only in the middle of the two, but its target is not fixed, so there is a limit as a tracking tool and tracer. Therefore, RNA modification (for example, methylation) is different from DNA, RNA, and protein. It can be said that a particularly excellent effect is achieved.
  • RNA modification information obtained from the subject in addition to RNA modification information obtained from the subject, other information, such as RNA modification information obtained from the subject at another time point (eg, before and after treatment), information about the subject, related to modification Information on proteins to be processed, information on RNA modification obtained from other targets, information on complexes between RNA-binding substances (proteins, lipids, etc.) and RNA (states related to RNA modification state, if necessary) ) Etc. can be used to analyze a condition associated with metastasis/primary cancer of the subject (eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary) ..
  • Information about the subject includes, for example, the subject's age, sex, race, history of cancer in the family, history of cancer (eg, history of cancer), treatment history (eg, anti-cancer). Treatment history), smoking status, drinking status, occupation information, living environment information, disease marker information, nucleic acid information, metabolite information, protein information and the like.
  • nucleic acid information include genome information, genome modification information, transcriptome information (including expression level and sequence information), RIP sequencing information, microRNA information (including expression level and sequence information).
  • Modification-related protein motif information that can be additionally used includes recognition motif information of the enzyme that adds the modification, recognition motif information of the enzyme that removes the modification, and recognition motif information of the protein that binds to the modification.
  • recognition motif information of the enzyme that adds the modification
  • recognition motif information of the enzyme that removes the modification and recognition motif information of the protein that binds to the modification.
  • a family having a YTH domain such as a methylating enzyme (eg, Mettl3, Mettl14, Wtap), a demethylating enzyme (eg, FTO, AlkBH5) and a methylating recognition enzyme (eg, YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3). Molecules) and other motif information.
  • RNA modification information in a subject having a condition associated with metastasis/primaryness of a cancer genetic manipulation for expression of a protein associated with the modification, and the like.
  • Modification information in a living organism RNA modification information in a subject having a condition associated with drug metastasis/or cancer metastasis/primaryness, a substance that binds to RNA (protein, lipid, etc.) and RNA, Information about the complex of (in addition to the state related to the RNA modification state, if necessary), but is not limited thereto.
  • the disclosure provides obtaining modification (eg, methylation) information on at least one type of RNA (eg, microRNA) in a subject, and determining the status of the subject based on the modification information.
  • a step of analyzing a metastatic/primary associated condition of the cancer in the subject including, for example, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary.
  • the methods of analyzing cancer metastasis/primary associated conditions of the present disclosure may, for example, distinguish between primary tumors and metastatic tumors for which appropriate treatments may differ, thus selecting appropriate treatments and It can be very beneficial, such as in the cure of a subject's cancer.
  • the modification information can be acquired by measuring a sample derived from the subject.
  • the method of analyzing a metastasis/primary-related state of cancer is performed using a sample such as a liquid biopsy (eg, blood, urine, saliva) that has a small load on a subject even when obtained. It is possible to In one embodiment, the analysis is performed within a short period of time (eg, within 1 day, within 10 hours, within 5 hours, within 2 hours, within 1 hour, within 30 minutes, within 15 minutes, etc.) after obtaining the sample. Is an on-site analysis. In one embodiment, the analysis result of the on-site analysis is performed within a short period of time from the acquisition of the sample (eg, within 1 day, within 10 hours, within 5 hours, within 2 hours, within 1 hour, within 30 minutes, within 15 minutes). Output).
  • a sample such as a liquid biopsy (eg, blood, urine, saliva) that has a small load on a subject even when obtained. It is possible to In one embodiment, the analysis is performed within a short period of time (eg, within 1 day, within 10 hours, within 5
  • the sample is delivered to the location of the meter and/or analyzer where the analysis is performed.
  • the subject itself may acquire the sample.
  • the obtained sample is frozen and delivered.
  • the analysis result may be transmitted to the delivery source or may be available by accessing a site on the Internet.
  • a sample eg, blood, excision, etc.
  • a subject eg, a subject at risk of a condition related to cancer metastasis/primaryness
  • the sample is processed to purify the RNA of interest (eg, microRNA) and the modification information of the RNA of interest is identified.
  • a condition related to metastasis/primary cancer of the target cancer eg, whether the target cancer has metastatic cancer, whether the cancer is primary
  • the RNA modification information may be used to analyze cancer metastasis/primary cancer-related conditions in other subjects, or it may be relevant to cancer metastasis/primary cancer at another time point in the same subject. It may be used for the analysis of the state to be stored or may be stored in a database.
  • RNA for example, microRNA
  • the modification information of the RNA identified in this manner is used to confirm the metastasis/primary cancer-related condition of the same subject confirmed by other analysis (for example, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer Information can be stored in association with (whether it is sex or not). Based on the RNA modification information thus obtained, a drug that can be appropriately applied to the target cancer metastasis/primary-related state can be determined.
  • the disclosure provides a condition associated with metastasis/primary cancer of a subject based on RNA modification information (eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary).
  • RNA modification information eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary.
  • the method implemented by this program is: (a) comparing modification information on at least one kind of RNA in the target with reference modification information of the RNA; and (b) based on an output result of the comparing step. Determining the state of the subject.
  • the reference modification information comprises modification information on the RNA in a subject different from the subject.
  • the reference modification information includes modification information on the RNA in the subject obtained at a time different from the modification information.
  • the disclosure provides a condition associated with metastasis/primary cancer of a subject based on RNA modification information (eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary).
  • RNA modification information eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary.
  • the method executed by the program stored in this recording medium is as follows: (a) comparing modification information on at least one kind of RNA in the target with reference modification information of the RNA; and (b) output of the comparing step. Determining the state of the subject based on the result.
  • the reference modification information comprises modification information on the RNA in a subject different from the subject.
  • the reference modification information includes modification information on the RNA in the subject obtained at a time different from the modification information.
  • the disclosure provides a condition associated with metastasis/primary cancer of a subject based on RNA modification information (eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary).
  • the system includes: (a) a measuring unit for measuring RNA; (b) a calculating unit for calculating the modification state on RNA based on the result of the measurement; and (c) analyzing the condition of the target based on the modification state. And an analysis unit that does.
  • the system further comprises a sample processor that processes the sample to purify the RNA of interest.
  • a sample processing unit for concentrating RNA from a sample such as a liquid biopsy (for example, blood, urine, saliva) in which RNA of interest is contained at a low concentration can be preferably included.
  • the system (which may be an apparatus) of the present disclosure includes a modification information acquisition unit that acquires modification information on at least one type of RNA in a subject, and cancer metastasis/primary cancer in the subject based on the modification information. It may be a form including an analysis unit that analyzes a state related to.
  • the modification information on RNA can be obtained by various measuring devices (measuring units).
  • the present disclosure provides a step of obtaining modification information on at least one kind of RNA in a subject, and analyzing a condition associated with cancer metastasis/primarity in the subject based on the modification information.
  • a computer-readable recording medium having such a program recorded therein, the program including instructions for causing a computer to execute a method for analyzing a state of a subject.
  • the recording medium may be, for example, a floppy disk (FD), HDD (hard disk drive), SSD, CD-ROM, CD-R, MO, DVD, USB memory, flash memory, etc. Good.
  • the measurement unit may have any configuration as long as it has a function and arrangement for providing RNA modification information.
  • the calculation unit and the analysis unit may be provided as the same or different structures.
  • the measurement unit is a mass spectrometer (eg MALDI-MS).
  • the measurement unit is a sequencing device.
  • the calculation unit identifies the modification state (eg modification position, modification amount, etc.) on RNA based on the measurement data.
  • the analysis unit determines the metastasis/primary cancer-related condition of the target (for example, whether the target has metastatic cancer, whether the cancer is primary). Please analyze). In one embodiment, the analysis may also be performed with reference to the additional information above.
  • a system 1000 of the present disclosure includes a CPU 1001 incorporated in a computer system, an external storage device 1005 such as a RAM 1003, a ROM, an SSD, a HDD, a magnetic disk, a flash memory such as a USB memory, and an input/output interface (I) via a system bus 1020. /F) 1025 is connected.
  • An input device 1009 such as a keyboard and a mouse, an output device 1007 such as a display, and a communication device 1011 such as a modem are connected to the input/output I/F 1025.
  • the external storage device 1005 includes an information database storage unit 1030 and a program storage unit 1040. Both are fixed storage areas secured in the external storage device 1005.
  • RNA modification data when RNA modification data is obtained by measuring an RNA sample (eg, mass spectrometry and/or sequencing), RNA modification data obtained by performing this measurement or information equivalent thereto (for example, the data obtained by performing the simulation) is input via the input device 1009, the communication I/F, the communication device 1011 or the like, or is stored in the database storage unit 1030. It may be one.
  • the step of performing measurement (for example, mass spectrometry and/or sequencing) of the RNA sample to obtain RNA modification data and analyzing the RNA modification data is performed by a program stored in the program storage unit 1040 or an input device.
  • software for performing such an analysis those exemplified in the examples may be used, but the software is not limited to this, and any software known in the art can be used.
  • the analyzed data may be output through the output device 1007 or stored in the external storage device 1005 such as the information database storage unit 1030.
  • these data, calculation results, or information acquired via the communication device 1011 or the like is written and updated at any time.
  • the information belonging to the sample to be accumulated is determined by the ID defined in each master table. It becomes possible to manage.
  • the database storage unit 1030 may store the above calculation results in association with various kinds of information such as different nucleic acid information obtained from the same sample and known information regarding a state related to cancer metastasis/primaryness. .. Such association may be made by using data available through a network (Internet, intranet, etc.) as it is or as a link of the network.
  • a network Internet, intranet, etc.
  • the computer program stored in the program storage unit 1040 may be a computer as a processing system described above, for example, a system that performs data provision, analysis of a modified state, comparison with reference data, classification, clustering, and other processing. It is what constitutes.
  • Each of these functions is an independent computer program, its module, routine, etc., and is executed by the CPU 1001 to configure the computer as each system or device.
  • the present disclosure provides conditions related to metastasis/primary cancer of a subject based on RNA modification information (eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary).
  • a composition for the purification of RNA associated with the condition comprising capturing means for capturing at least one RNA in the subject.
  • at least one kind of RNA contains at least one kind of RNA which can analyze the state related to cancer metastasis/primaryness by measuring the modification of the RNA.
  • the means for capturing comprises a nucleic acid that is at least partially complementary to the RNA of interest.
  • the means for capturing comprises a means for capturing modified RNA (eg, a modification-specific antibody, etc.).
  • the means for capturing comprises a molecule specific for the modified RNA of interest.
  • the means for capturing comprises a moiety for purification (eg, an optionally magnetic carrier, one of the mutually bindable pairs (eg, biotin and streptavidin)).
  • the means for capturing comprises a linker linked to the moiety for purification.
  • the present disclosure is based on the modification information of at least one RNA to determine whether a condition associated with metastasis/primaryness of cancer in a subject (eg, whether the subject has metastatic cancer).
  • Plate or chip for determining whether the cancer is primary or not) and a means for capturing the RNA is arranged on the surface of the plate or chip.
  • at least one kind of RNA contains at least one kind of RNA which can analyze the state related to cancer metastasis/primaryness by measuring the modification of the RNA.
  • the plate or chip is for MALDI measurements.
  • the plate or chip has a plurality of spots, and each spot is provided with means for capturing RNA having a different sequence.
  • each spot can be, for example, 10 ⁇ m to 100 ⁇ m in diameter. In one embodiment, 1, 2, 3, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, on one plate or chip, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500 or 3000 spots may be formed. In one embodiment, each spot may be equipped with 10 7 or more capture means. In one embodiment, the means for capturing is a nucleic acid that is at least partially complementary to the RNA of interest.
  • the base material of the plate or chip is not limited, but examples thereof include glass and plastic (polyethylene) having conductivity.
  • the spots on the plate or chip can be arranged to reduce or minimize the effects of interference between signals.
  • the effect of interference between signals is that of the value of m/z caused by the fragmentation of each RNA located in each spot (may be based on empirical results or theoretical). It is evaluated based on the overlap and/or the difference between.
  • the m/z value generated by the fragmentation of each RNA may or may not take into account the increase or decrease in the mass number due to the presence of the modification.
  • the spots on the plate or chip are placed based on mathematical and statistical techniques such as Monte Carlo.
  • kits provide a condition associated with metastasis/primary cancer of a subject cancer based on RNA modification information (eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary).
  • RNA modification information eg, whether the subject has metastatic cancer, whether the cancer is primary
  • a kit for determining whether or not the composition is for purifying RNA of interest a plate or chip on which a means for capturing RNA of interest is arranged, and a sample for obtaining a sample from the subject.
  • a kit is provided that includes at least one of the devices and instructions for using the kit.
  • the kit comprises means for purifying RNA from the sample.
  • the kit includes a device (eg, blood collection syringe) for obtaining a liquid biopsy (eg, blood, urine, saliva) from a subject.
  • the kit is for processing the sample to accommodate MALDI measurements.
  • the kit further comprises an application agent (eg, including 3-hydroxypicolinic acid) for use in the MALDI measurement.
  • an application agent eg, including 3-hydroxypicolinic acid
  • the kit is for obtaining a sample from a subject.
  • a kit that includes a device for obtaining a sample from a subject includes instructions that describe the destination of the sample.
  • the kit comprises means for cryopreserving the collected sample.
  • the kit comprises blood, mucosal epidermis (eg, in the oral cavity, nasal cavity, ear cavity, vagina, etc.), skin epidermis, biological secretions (eg, saliva, runny nose, sweat, tears, urine) from the subject.
  • a device for example, a blood sampling syringe for obtaining bile or the like is included.
  • RNA methylation was performed using the following methylation on microRNA as an example (in the table, underline indicates methylation). Those skilled in the art understand that similar analyzes can be performed for induction of RNAs other than this.
  • RNA extraction RNA extraction
  • TRIzol Invitrogen
  • Oligo DNA complementary to each RNA was used for purification of specific RNA.
  • oligo DNAs each complementary to the human miRNAs in the table below were designed.
  • Direct binding beads were made as follows. A 6-aminohexyl group was introduced into the phosphate moiety at the 5'end of the capture oligo DNA. Magnetic beads (Dynabeads M270 Amine, Thermo Fisher Scientific, Tokyo, Japan) with amino groups covalently bound to the surface of each modified capture oligo DNA by a divalent amino crosslinker (BS3, bis(sulfosuccinimidyl) suberate) ).
  • BS3 divalent amino crosslinker
  • Biotin-conjugated beads Another type of bead was also made. Biotin was introduced into the phosphate moiety at the 5'end of the capture oligo DNA. Magnetic beads (Dynabeads M270 Streptoavidin, Thermo Fisher Scientific) to which streptavidin is covalently bound to the surface are mixed with the above-mentioned biotinylated capture oligo DNA to generate avidin-biotin bond, and capture oligo DNA is obtained. Fixed on magnetic beads.
  • a protocol was also used in which the biotinylated capture oligo DNA was hybridized with the RNA of interest and then purified with magnetic beads.
  • the sample was divided and one type of capture oligo DNA was used for each divided sample.
  • the supernatant was removed using a magnetic stand, and the beads were mixed with 1 mL of BW Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2.0 M NaCl) 4 times, and Volatile Rinse Buffer (10 mM ammonium acetate, pH 7.0). It was washed twice with 1 mL. 5. After completely removing the washing solution, 100 ⁇ L of RNase free SDW was added to the beads and the beads were heated at 70° C. for 3 minutes and then rapidly cooled on ice to collect the supernatant. 6. When the concentration was low, the supernatant was freeze-dried.
  • BW Buffer 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2.0 M NaCl
  • Volatile Rinse Buffer 10 mM ammonium acetate, pH 7.0
  • the non-adsorbed fraction (supernatant) was discarded on a magnetic stand. 5.
  • the beads were washed 3 times on a magnetic stand with 10 mM phosphate buffer pH 7.0, 50 mM KCl. 6.
  • the beads were washed 3 times on a magnetic stand with 10 mM ammonium acetate (pH 7.0) and then eluted with RNase free water. 7. When the concentration was low, the supernatant was freeze-dried.
  • RNA samples were optionally purified using Zip Tip C18 (Millipore).
  • the MALDI device settings were as follows: positive-mode (positive ion detection mode) reflector-mode (reflection mode) Laser Power Max (maximum configurable output) (Analysis of measurement results by mass spectrometer) The analysis of the measurement results obtained by MALDI was performed as follows.
  • RIP sequencing measurement was performed according to the following protocol.
  • RNA can be recovered using 2 ml of Trizol (Invitrogen) per ml of serum. Used reagents, etc.
  • RNA 750 ng/18 ⁇ L 1. Adjust RNA to 750 ng/18 ⁇ L. 2. A total of 20 ⁇ L of RNA 750 ng/18 ⁇ L+10X Fragmentation Buffer 2 ⁇ L was divided into each well of an 8-strip tube. 3. Incubated at 90°C for 2 minutes. 4. 2 ⁇ L of EDTA (0.5 M) was quickly added to 20 ⁇ L of the reaction solution to stop the reaction. 5. The reaction solution was collected for each sample and ethanol precipitation was performed.
  • step (D) Immunoprecipitation with magnetic beads 1. 50 ⁇ L of Dynabeads Protein G (Thermo Fisher Scientific) was used for each sample, and washed twice with 1 ml of 1 ⁇ IP Buffer. 2. 1 x IP Buffer 1 ml + RVC 10 ⁇ L + RNAse inhibitor 1 ⁇ L + BSA (10 mg/ml) 50 ⁇ L were added to the magnetically separated beads, and the mixture was incubated at 4°C for 2 hours while rotating (inhibition of nonspecific binding of beads). 3. The beads were washed twice with 1 ml of 1X IP Buffer+10 ⁇ L of RVC+1 ⁇ L of RNAse inhibitor. 4. The reaction solution of step (C) was added to the beads separated magnetically and separated magnetically, and incubated at 4° C. for 2 hours (or overnight) while rotating.
  • step (E) Elution 1.
  • the beads in step (D) were washed three times with a washing buffer (1X IP Buffer 10 ml+RVC 10 ⁇ L+RNAse inhibitor 5 ⁇ L).
  • INPUT1, INPUT2, INPUT3 corresponding INPUTs
  • ⁇ Grandes files are linked to form a list, and each element of the list is named.
  • the sequence was acquired with the ChIPpeakAnno package.
  • Example 1 Methylation analysis of microRNA
  • methylation analysis of microRNA was performed. Specifically, it is as follows.
  • MicroRNA200-c-5p human sequence, SEQ ID NO: 9 synthesized to contain methylated adenine and methylated cytosine was dissolved in RNase Free ultrapure water, the concentration was confirmed by measuring absorbance, and adjusted to 1 pmol/ ⁇ L .. Using 1 ⁇ L of this microRNA aqueous solution, mass spectrometry was performed with a MALDI mass spectrometer according to the above protocol. RNA degradation (5' ⁇ 3') was performed by ammonia treatment to confirm the internal sequence. In addition, we performed in-source decay (in-source decomposition, ISD) on the observed precursor ions (Fig. 1).
  • ISD in-source decomposition
  • RNA modification can be analyzed by combining appropriate mass spectrometry and RNA purification.
  • Example 2 Knockdown analysis of gene using RNA modification
  • RNA modification was used to analyze whether gene knockdown analysis can be performed.
  • Example 2-1 Effect of Mettl3 knockdown on RNA modification
  • Human pancreatic adenocarcinoma cell line MIA PaCa-2 cells were treated by a standard method using shRNA and siRNA to produce a Mettlel3 knockdown cell line (Kosuke Taketo et al., Int J Oncol. 2018 Feb;52(2 ):621-629). Then, RIP sequencing was performed.
  • Example 2-2 Preparation of metastasis model mouse The inventors have found that the WTg mouse shown below is useful for evaluation of metastasis.
  • WT1 mice were created by crossing EL1 mice with METTL3Tg mice.
  • EL1 mouse is a pancreatic cancer spontaneous carcinogenesis model mouse, and FVB/N-Tg (Cela1-Luc, Cela1-Tag) 116Xen mouse was purchased from Taconic.
  • the METTL3Tg mouse was produced as follows. The mettl3 gene of the mouse was incorporated into a CAG expression vector, and this was injected into a fertilized egg of a BL6 mouse and transplanted into the uterus of a foster mother to prepare a mouse overexpressing the mettl3 gene.
  • a double transgenic (WTg) mouse was prepared by mating the Mettlel3 gene overexpressing mouse thus prepared with an EL1 mouse by a usual method.
  • mice 16 mice each were bred in a normal animal laboratory, 4 mice per cage in an SPF environment, and used for the test. At the time of dissection, isoflurane was aspirated, and the abdomen was incised under anesthesia and observed.
  • FIG. 3 shows the pancreas excised from each mouse at the age of 20 weeks (left: EL1 mouse, right: WTg mouse). WTg mice had faster tumor growth and less viability.
  • RNA modification is an RNA methylating enzyme, and these results indicate that 1) RNA modification (epitranscriptome) plays an important role in the onset and progression of cancer, and 2) that it contributes significantly to cancer. It was revealed that the change in RNA modification has a greater effect on cancer than the change in genes (P53, RB) that had been considered in the past.
  • Example 3 Changes in RNA due to transfer The expression and methylation of total RNA were analyzed in EL1 mice and WTg mice.
  • RNA-seq total RNA was extracted using Isogen (Nippon Gene, Tokyo).
  • Isogen Nippon Gene, Tokyo
  • RIP-Seq after immunoprecipitation with the m6A antibody (MBL International, Massachusetts, USA), RNA was extracted using Isogen (Nippon Gene).
  • An RNA library for sequences was created with TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero kit (Illumina, USA, California). Sequencing was performed using HiSeq 2500 platform (Illumina). Then, the sequence was analyzed using the software of FATX-toolkit, TopHat2 (https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml).
  • RNA-seq data of EL1 mouse and WTg mouse were analyzed by Cibrsort (https://cibersort.stanford.edu/) (FIG. 7). As a result, it was found that the immune system was suppressed in WTg mice.
  • Example 4 Relationship between metastasis and PDL1 Results of PDL1 were extracted from RNA-seq data and RIP-seq data of EL1 mice and WTg mice (FIG. 8, upper row). It was found that the 3'UTR region of the PDL1 gene of WTg mouse was highly methylated.
  • proteins were extracted from pancreatic cancer tissues of EL1 and WTg mice, and PDL1 protein was detected by Western blot with Mini-PROTEAN TGX Precast Gels Bio Rad (Bio-Rad, California, USA).
  • the anti-PDL1 antibody (ab80276) (Abcam, USA) was used as the primary antibody. Expression of PDL1 protein was also improved in WTg mice.
  • mice produced at Unitech were brought into a breeding room dedicated to animal experiments at about 7 weeks of age, and the general condition was observed and the weight was measured to confirm the health condition. Males were weighed at about 8 to about 20 weeks of age and females at about 8 to about 22 weeks according to the study schedule.
  • PDL1 antibody InvivoMAb anti-mouse PD-L1 (B7-H1) (Bio X Cell, Boston)) or physiological saline (Otsuka raw injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo) was administered for about 10 to about 17 weeks according to the test schedule.
  • the PDL1 antibody (treatment group) was administered in an amount of 200 ⁇ L/animal, and the physiological saline (Vehicle group) was administered in an amount of 10 ml/kg. Three mice in each group were used in the experiment.
  • mice in the treatment group and the vehicle group were dissected, and the pancreatic tumor as the primary tumor and the metastatic liver tumor found in the vehicle group were excised. As a result, a remarkable suppressive effect on the primary tumor and metastatic tumor by the anti-PDL1 antibody was observed (FIG. 9).
  • methylating enzyme METTL3 that causes the enhancement of 3′UTR methylation of PDL1 mRNA.
  • This enzyme is a methylating enzyme of miR-21-5p, miR-17-5p, let7a-5p, miR-200c-5p. Increase the rate of conversion.
  • the mRNA of PDL1 was detected by the same enzyme. It is also predicted that the methylation of 3'UTR of E. In this way, the expression level of PDL1 can be predicted by confirming the increase of miRNA methylation, and the therapeutic effect can also be predicted. (Example 5) Modification of translocation-related miRNA Using the mouse model of transposition, the modification state of miRNA was examined.
  • Example 2 Specifically, the following experiment was conducted on the EL1 mouse and the WTg mouse shown in Example 2. Approximately 1 mL of blood was collected from the inferior vena cava immediately before tumor and metastatic lesions were excised from each of 3 mice at around 20 weeks of age. Serum was obtained by centrifuging this blood at 10,000 G for 10 minutes at 4°C. MiRNA was concentrated from this serum according to the common protocol and RIP sequencing was performed using RNA-Seq and anti-m6A antibody.
  • methylation was detected only in WTg mice, and no methylation was detected in EL1 mice.
  • the miRNAs shown in the table below have a ratio of the methylation rate of WTg mice to EL1 mice [(WTg mouse methylation rate/WTg mouse expression level)/(EL1 mouse methylation rate/EL1 mouse expression level)] of 2 or more. Met.
  • the miRNAs shown in the table below have a ratio of the methylation rate of WTg mice to EL1 mice [(WTg mouse methylation rate/WTg mouse expression level)/(EL1 mouse methylation rate/EL1 mouse expression level)] of 1. It was 5 or more.
  • cancer metastasis was not observed in the EL1 mouse (primary tumor only), while cancer metastasis was observed in the WTg mouse (primary tumor + metastatic lesion).
  • the miRNA whose destabilization was detected or whose methylation was improved in the WTg mouse can be an indicator of the primary of cancer.
  • low or undetectable methylation of these miRNAs in a cancer can be an indicator that the cancer is metastatic.
  • the miRNA binds to the target mRNA and promotes the degradation of the mRNA.
  • methylated miRNA loses its ability to bind to a target and cannot control mRNA. Therefore, it is considered that the microRNA whose methylation is promoted by the transposition cannot suppress the target mRNA having the function of promoting the metastasis and promote the metastasis.
  • Example 5A It was tested whether the candidate microRNAs found in the above RIP sequencing could be used to determine the metastatic status.
  • the level of methylation was analyzed by mass spectrometry as follows.
  • the methylation rate of miR-21-5p, miR-17-5p, let7a-5p, miR-200c-5p decreased despite the presence of metastatic lesions.
  • elevated methylation of these miRNAs can be an indicator that the tumor is primary and/or that the patient has a primary tumor.
  • low or undetectable methylation of these miRNAs in a cancer can be an indicator that the cancer is metastatic.
  • Example 7 colorectal cancer
  • Tissue specimens of colorectal cancer (3 persons) with only primary tumors of stages 2 to 4 were collected at the time of surgery from human patients who obtained informed consent in advance.
  • a tissue sample was collected as a healthy tissue from a region 5 cm or more away from the malignant tumor region.
  • qRT-PCR was performed as follows. TaqMan microRNA reverse transcription kit and TaqMan microRNA assays (Applied Biosystem) were used according to the product protocol. THUNDERBIRD SYBR (registered trademark) qPCR Mix (Toyobo) was used as a PCR master mix. The LightCycler® system (Roche) was used as a device for qRT-PCR.
  • the expression levels of the above miRNAs were compared between normal tissue and tumor tissue by qRT-PCR. For each miRNA, the results of the above methylation rate (MS) and expression level were compared (FIG. 14).
  • RNA can be a useful marker from the expression level (RT-PCR).
  • RNA degradation (5' ⁇ 3') was performed by ammonia treatment to confirm the internal sequence, and mass spectrometry was performed (Fig. 15). As shown in FIG. 15, it was confirmed by mass spectrometry that the modification at a specific position of a specific RNA can be accurately determined.
  • Example 8 Early pancreatic cancer
  • the RNA modification state was investigated using serum samples collected from 17 human pancreatic cancer patients. These pancreatic cancers were early pancreatic cancers diagnosed as stages I to II (4 in stage IA, 5 in stage IIA, and 7 in stage IIB). As a normal sample, a serum sample of a healthy person was used.
  • Methylation of miR-17-5p was detected in serum samples of all pancreatic cancers, but this methylation was not detected in normal samples or the degree of methylation was low.
  • the degree of methylation of miR-17 can be a more accurate index in the detection of pancreatic cancer, as compared with the determination results by the existing pancreatic cancer markers CA19-9 and CEA. ..
  • RNA modification information is considered to reflect the state thereof.
  • Example 6 it has been confirmed that the miRNAs investigated here have enhanced methylation only in the primary focus. That is, when there is cancer in the pancreas, it can be determined that it is a primary lesion if methylation of these miRNAs is enhanced, and if it is not, it is a cancer of a metastatic lesion.
  • the results of this Example can predict whether the pancreatic cancer is in the metastatic state or the primary state based on miR-21-5p, miR-17-5p, let7a-5p, miR-200c-5p. It can be said that it supports
  • Example 9 Other cancer samples
  • another cancer sample was analyzed.
  • RNA of Example 8 was analyzed in the range of RNA of Example 8 for various cancer samples.
  • Tissue specimens of gastric cancer (4 persons) were collected at the time of surgery from human patients who obtained informed consent in advance.
  • a tissue sample was collected as a healthy tissue from a region separated by 5 cm or more from the malignant tumor region.
  • Example 10 The result in gastric cancer is shown (FIG. 16). It can be said that the results of this example support that miR-21-5p, miR-17-5p, let7a-5p, miR-200c-5p can predict the metastatic (primary) state of gastric cancer.
  • Example 10 Transposition-related lncRNA modification Using the mouse model for transposition of Example 2, the modification state of lncRNA was examined in the same manner as in Example 5.
  • the lncRNAs shown in the table below have a ratio of the methylation rate of WTg mice to EL1 mice [(WTg mouse methylation rate/WTg mouse expression level)/(EL1 mouse methylation rate/EL1 mouse expression level)] of 2 or more. Met.
  • Example 2 As shown in Example 2, no cancer metastasis was observed in the EL1 mouse (primary tumor only), while cancer metastasis was observed in the WTg mouse (primary tumor + metastatic tumor). Therefore, methylation was observed in the WTg mouse.
  • the improved lncRNA can be used as an indicator of the primary nature of cancer. In addition, low or undetectable methylation of these lncRNAs in a certain cancer can be an indicator that the cancer is metastatic.
  • Example 11 Drug Screening by RNA Modification This example demonstrates that drug screening by RNA modification is possible.
  • Treat resistant strains with any compound library. Analyze RNA modifications in these cells. When these compounds are classified based on RNA modification information, some of the compounds form a cluster and can be analyzed. Since resistant strains have the property of easy metastasis, it is possible to grasp the methylation state of cancer cells that are likely to metastasize by comparison with the parent strain.
  • Example 12-1 Analysis of Various Modifications on RNA This example demonstrates analysis of conditions associated with metastasis/primarity using other RNA modifications.
  • Mass spectrometric data that analyze metastasis/primary associated states can be re-analyzed to analyze modifications other than methylation on microRNAs, and this information can be used to identify various modifications on RNA. It can be used for analysis of metastasis/primary associated conditions.
  • RNAs other than microRNAs can be linked to data that correlate states associated with metastasis/primarity. For example, there are many peaks in mass spectrometry, and each peak can be applied manually or can be machine-learned. For these, the specifications of Maldi of Burka can be referred to.
  • Example 13 Analysis Combining RNA Modification Information With Other Data This example demonstrates the analysis of metastasis/primaricity related conditions combining RNA modification information with other data.
  • RNA for example, Pagliarini DJ , Cell Metab. 2016 Jul 12;24(1):13-4. doi: 10.1016/j.cmet.2016.06.018.
  • Methylome methylated binding protein; eg Shabalin AA., Bioinformatics. 2018 Feb 12. doi: 10.1093/bioinformatics/bty069.
  • transcriptome RNAseq; eg Jeong H, Front Neurosci. 2018 Feb 2;12:31.
  • RNA modification information of the present disclosure can be combined to further improve the accuracy of analysis of the state related to metastasis/primaricity, or to improve the accuracy of analysis as such.
  • the present disclosure can be used in analysis in almost any field in which organisms are involved, and its application in the medical field is immeasurable.
  • miR-17-5p CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG (SEQ ID NO: 1) miR-21-5p UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (SEQ ID NO: 2) miR-200c-5p CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG (SEQ ID NO: 3) miR-let7a-5p UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU (SEQ ID NO: 4)
  • Capture 17-5p CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG SEQ ID NO: 5
  • Capture 21-5p TCAACATCAGTCTGATAAGCTA (SEQ ID NO:6)
  • Capture 200c-5p CCAAACACTGCTGGGTAAGACG (SEQ ID NO: 7) Capture let7a-5p AACTATACAACCTACTACCTCA (SEQ ID NO:8) Synthetic miR-200c-5p CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG (#7,mA;#13,mC) (SEQ ID NO:8) Synthetic miR-200c

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Abstract

本開示は、対象のがんの転移／原発性に関連する状態を分析するための新たな方法を提供する。本開示は、がんの転移の状態がＲＮＡの修飾情報に反映されることを見出したことに基づき、対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析するための新たな方法を提供する。本開示は、がんの転移を含む種々の生物学的状態を分析することができ、治療すべきがんを決定することおよび適切な治療法を選択することなどができる。

Description

ＲＮＡ修飾を利用したがんの転移／原発性に関連する状態の分析・診断法
　本開示は生物学的対象の特徴分析法および分類に関する。より特定すると、本開示はＲＮＡ上の修飾情報に基づく生物学的対象におけるがんの転移に関連する状態を分析手法に関する。
　リボ核酸（ＲＮＡ）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と同様に生物が有する情報を担う分子である。ＤＮＡはメチル化などの修飾を受けてその機能が制御されることが知られているが、近年、ＲＮＡ上にも修飾が起こる例が報告されている。
　疾患を含む種々の生物学的状態を分析するために、ＤＮＡの変異、ｍＲＮＡ発現量、タンパク質発現量などの情報を生物学的状態と関連付けることが試みられているが、これらの情報を使用しても、早期のがんなど十分に予測することができない状態も多い。また、ある部位のがんを処置した場合であっても、がんの転移が発生しているためにがんの完全な治療が達成できない場合があり、標的とするがんが原発性であるかどうか、およびがんの転移が発生しているかどうかを判定することは非常に重要である。
Pagliarini　DJ,　Cell　Metab.　2016　Jul　12;24(1):13-4.　doi:　10.1016/j.cmet.2016.06.018.
　本開示は、がんの転移の状態がＲＮＡの修飾情報に反映されることを見出したことに基づき、対象におけるがんの転移に関連する状態を分析するための新たな方法を提供する。
　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を取得するステップと、
　該修飾情報に基づいて該対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態を分析するステップと
を含む、対象の状態を分析する方法。
（項目２）
　前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
　前記ＲＮＡがｌｎｃＲＮＡを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
　前記修飾がｍ６Ａまたはｍ５Ｃを含む、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、前記対象が転移性腫瘍を有するかどうかである、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、前記対象におけるがんが原発性であるかどうかである、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
　前記少なくとも１種類のＲＮＡが前記対象の血液から取得されたＲＮＡである、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
　前記少なくとも１種類のＲＮＡが前記対象の腫瘍から取得されたＲＮＡである、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、膵臓からの転移に関連する状態である、項目１～８のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ａ１）
　対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を取得する修飾情報取得部と、
　該修飾情報に基づいて該対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態を分析する分析部と
を含む、対象の状態を分析するシステムまたは装置。
（項目Ａ２）
　前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡを含む、項目Ａ１に記載のシステムまたは装置。
（項目Ａ３）
　前記ＲＮＡがｌｎｃＲＮＡを含む、項目Ａ１またはＡ２に記載のシステムまたは装置。
（項目Ａ４）
　前記修飾がｍ６Ａまたはｍ５Ｃを含む、項目Ａ１～Ａ３のいずれか１項に記載のシステムまたは装置。
（項目Ａ５）
　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、前記対象が転移性腫瘍を有するかどうかである、項目Ａ１～Ａ４のいずれか１項に記載のシステムまたは装置。
（項目Ａ６）
　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、前記対象におけるがんが原発性であるかどうかである、項目Ａ１～Ａ５のいずれか１項に記載のシステムまたは装置。
（項目Ａ７）
　前記少なくとも１種類のＲＮＡが前記対象の血液または尿または唾液等を含むリキッドバイオプシー、または手術的に切除または生検して得られたソリッドバイオプシーから取得されたＲＮＡである、項目Ａ１～Ａ６のいずれか１項に記載のシステムまたは装置。
（項目Ａ８）
　前記少なくとも１種類のＲＮＡが前記対象の腫瘍から取得されたＲＮＡである、項目Ａ１～Ａ６のいずれか１項に記載のシステムまたは装置。
（項目Ａ９）
　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、膵臓からの転移に関連する状態である、項目Ａ１～Ａ８のいずれか１項に記載のシステムまたは装置。
（項目Ｂ１）
　対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を取得するステップと、
　該修飾情報に基づいて該対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態を分析するステップと
を含む、対象の状態を分析する方法をコンピュータに実行させる指示を含むプログラム。
（項目Ｂ２）
　前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡを含む、項目Ｂ１に記載のプログラム。
（項目Ｂ３）
　前記ＲＮＡがｌｎｃＲＮＡを含む、項目Ｂ１またはＢ２に記載のプログラム。
（項目Ｂ４）
　前記修飾がｍ６Ａまたはｍ５Ｃを含む、項目Ｂ１～Ｂ３のいずれか１項に記載のプログラム。
（項目Ｂ５）
　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、前記対象が転移性腫瘍を有するかどうかである、項目Ｂ１～Ｂ４のいずれか１項に記載のプログラム。
（項目Ｂ６）
　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、前記対象におけるがんが原発性であるかどうかである、項目Ｂ１～Ｂ５のいずれか１項に記載のプログラム。
（項目Ｂ７）
　前記少なくとも１種類のＲＮＡが前記対象の血液または尿または唾液等を含むリキッドバイオプシー、または手術的に切除または生検して得られたソリッドバイオプシーから取得されたＲＮＡである、項目Ｂ１～Ｂ６のいずれか１項に記載のプログラム。
（項目Ｂ８）
　前記少なくとも１種類のＲＮＡが前記対象の腫瘍から取得されたＲＮＡである、項目Ｂ１～Ｂ６のいずれか１項に記載のプログラム。
（項目Ｂ９）
　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、膵臓を含む難治性のがんからの転移に関連する状態である、項目Ｂ１～Ｂ８のいずれか１項に記載のプログラム。
（項目Ｃ）
　項目Ｂ１～Ｂ９のいずれか１項に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
　本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　本開示により、ＲＮＡの修飾情報に基づき、対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を従来とは異なる方法で分析し、予測することができ、その精度も飛躍的に高いと考えられる。
合成マイクロＲＮＡ２００－ｃ－５ｐのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ測定の結果を示す図である。３’末端フラグメントおよび５’末端フラグメントの両方のシリーズが観察された。 膵臓でがんが自然発生するＥＬ１マウス（点線）と、このマウスおよびＭｅｔｔｌ３遺伝子の過剰発現マウスから作製したダブルトランスジェニック（ＷＴｇ）マウス（実線）との間で生存率を比較した図である。縦軸に生存率を示し、横軸に週齢を示す。 ＥＬ１マウス（左）およびＷＴｇマウス（右）の２０週齢時点で摘出した腫瘍を比較した図である。上段は腫瘍の写真であり、下段は組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色である。 ＥＬ１マウス（左）およびＷＴｇマウス（右）を２２週齢時点で解剖した様子を比較した図である。ＥＬ１マウスでは膵臓にのみ腫瘍が観察され、ＷＴｇマウスでは膵臓がより肥大しており、様々な臓器にがんの転移が観察された。 ＥＬ１マウス（左）およびＷＴｇマウス（右）の２９週齢時点で摘出した肝臓を比較した図である。ＥＬ１マウスでは肝臓に腫瘍は観察されず、ＷＴｇマウスでは肝臓へのがん転移が見られ、肝臓は肥大していた。 ＷＴｇマウスにおいてメチル化が検出された遺伝子についてのMetascape解析結果を示す。各バーは表１８－２に示す生物学的経路を順序通りに示し、横軸はそれぞれの生物学的経路の濃縮率（Ｌｏｇ１０Ｐ）を示す。●は細胞外マトリクスに関連する生物学的経路を示し、〇は免疫に関連する生物学的経路を示す。 ＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスの腫瘍に関するＲＮＡ－ｓｅｑデータをCibrsort(https://cibersort.stanford.edu/)で解析した結果を示す。それぞれのマウスに発生した腫瘍における免疫系細胞の構成が示される。 上段は、ＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスの腫瘍に関するＲＮＡ－ｓｅｑおよびＲＩＰ－ｓｅｑの結果からＰＤＬ１遺伝子のデータを抽出したものである。ＥＬ１における３、およびＷＴｇにおける８の数字は、ＲＮＡ－ｓｅｑのリード数を示す。両方のマウスの腫瘍において３’ＵＴＲ領域がメチル化されており、特にＷＴｇマウスにおいてメチル化が亢進していた。下段は、ＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスについてのＰＤＬ１タンパク質のウエスタンブロットの結果を示す。ＷＴｇマウスにおいて、ＰＤＬ１タンパク質の発現が向上していた。 抗ＰＤＬ１抗体処置またはＶｅｈｉｃｌｅ処置を行ったＷＴｇマウスにおける腫瘍の状態を示す。左のグラフは、摘出した原発性の膵臓腫瘍の重量を示す（ｎ＝３）。右の写真は、摘出した原発性の膵臓腫瘍および転移性の肝臓腫瘍を示す。 転移ありの試料および転移なしの試料（それぞれ、ｎ＝６）についてｌｅｔ－７ａ－５ｐのメチル化率の比較を示す。縦軸は、質量分析によって測定したｌｅｔ－７ａ－５ｐ（１９位のアデニン）のメチル化率を示す。 原発腫瘍切除後１から２年後までの間で転移が見つかったヒト大腸がん患者由来の原発腫瘍切除前のサンプル（Before）および転移が見つかった際に取得したサンプル（After）におけるｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｌｅｔ７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐのメチル化率の比較を示す。同じ患者のBeforeおよびAfterのサンプルを線で結んだ。縦軸は、質量分析によって測定した対象ｍｉＲＮＡのメチル化率を示す。 メチル化されたｍｉＲ－２１－５ｐ（上）およびｌｅｔ－７ａ－５ｐ（下）を示すＭＳシグナルの強度を正常組織および腫瘍組織について示す図である。矢印の位置のｍ／ｚがメチル化ＲＮＡ由来のフラグメントのシグナルである。縦軸は質量分析計で測定されたシグナル強度を示す。 メチル化されたｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ（上）およびｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ（下）を示すＭＳシグナルの強度を正常組織および腫瘍組織について示す図である。矢印の位置のｍ／ｚがメチル化ＲＮＡ由来のフラグメントのシグナルである。縦軸は質量分析計で測定されたシグナル強度を示す。 メチル化されたｍｉＲ－１７ｃ－５ｐを示すＭＳシグナルの強度を正常組織および腫瘍組織について示す図である。矢印の位置のｍ／ｚがメチル化ＲＮＡ由来のフラグメントのシグナルである。縦軸は質量分析計で測定されたシグナル強度を示す。 ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－ｌｅｔ７ａ－５ｐおよびｍｉＲ－１７－５ｐについて、正常組織と腫瘍組織との間で対象の配列のＲＮＡ中のメチル化ＲＮＡの割合（％）（上）およびＲＮＡ発現量（下）を比較した図である。Ｎ．Ｓ．は有意差がなかったことを示す。 メチル化されたｍｉＲ－２００ｃ－５ｐの存在を示すＭＳシグナルを示す図である。内部配列確認のためアンモニア処理を行っている。両矢印で示される幅が対応するヌクレオチドの質量差として検出されたことを示す。 ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐおよびｍｉＲ－ｌｅｔ７ａ－５ｐについて、正常組織と腫瘍組織との間で対象の配列のＲＮＡ中のメチル化ＲＮＡの割合（％）を比較した図である。 システムの構成の概略図である。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　（定義等）
　本明細書において、「リボ核酸（ＲＮＡ）」少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β－Ｄ－リボ－フラノース部分の２’位においてヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。ＲＮＡには、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡが含まれる。
　本明細書において、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、ＤＮＡ鋳型を使用することによって作製され、ペプチドまたはポリペプチドをコードしている転写物に関連するＲＮＡを指す。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、および３’－ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡの具体的な情報（配列など）は、例えば、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照することで利用可能である。例えば、ヒトにおける成熟マイクロＲＮＡは以下の表のものが挙げられる。
　本明細書において、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」とは、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に２０から２５塩基長の微小ＲＮＡとなる機能性核酸を指す。ｍｉＲＮＡの具体的な情報（配列など）は、例えば、ｍｉｒｂａｓｅ（http://mirbase.org）を参照することで利用可能である。例えば、ヒトにおける成熟マイクロＲＮＡは以下の表のものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本明細書において、「ロングノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）」とは、タンパク質へ翻訳されずに機能する２００ｎｔ以上のＲＮＡを指す。ｌｎｃＲＮＡの具体的な情報（配列など）は、例えば、ＲＮＡｃｅｎｔｒａｌ（http://rnacentral.org/）を参照することで利用可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本明細書において、「リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）」とは、リボソームを構成するＲＮＡを指す。ｒＲＮＡの具体的な情報（配列など）は、例えば、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照することで利用可能である。
　本明細書において、「トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）」とは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によりアミノアシル化されることが公知であるｔＲＮＡを指す。ｔＲＮＡの具体的な情報（配列など）は、例えば、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照することで利用可能である。
　本明細書において、核酸の文脈において使用される「修飾」とは、核酸の構成単位またはその末端の一部または全部が他の原子団と置換されること、または官能基が付加されている状態を指す。ＲＮＡの修飾の集合は「ＲＮＡ　Ｍｏｄｏｍｉｃｓ」「ＲＮＡ」　Ｍｏｄ」などとよぶことがあり、これらは、ＲＮＡがトランスクリプトであることから、エピトランスクリプトームと呼ばれることもあり、本明細書では同義で使用される。
　ＲＮＡの修飾として以下の表に示されるものが挙げられるがこれらに限定されず、修飾に該当するものであれば、任意のものを利用することができることが理解される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　これらの修飾は、例えば、質量分析、特異的化学反応、標準合成品との比較（例えば、ＬＣによる保持時間の比較）などの当該分野で公知の任意の方法によって、必要に応じてそれまでに蓄積された情報を利用して、区別することができる。
　本明細書において、核酸の文脈において使用される「メチル化」とは、任意の種類のヌクレオチドの任意の位置のメチル化を指すが、代表的には、アデニンのメチル化（例えば、６位；ｍ６Ａ、１位；ｍ１Ａ）、シトシンのメチル化（例えば、５位；ｍ５Ｃ、３位；ｍ３Ｃ）である。検出された修飾部位は、当該分野で公知の手法を用いて特定することができる。例えばｍ１Ａとｍ６Ａ、ｍ３Ｃとｍ５Ｃについては、それぞれ化学修飾により確定は可能である。例えば、スタンダードとなる合成ＲＮＡを利用して、化学修飾及びＭＡＬＤＩでの測定による挙動が正しいのかを確定することができる。
　この他、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡなどにて見出されているＲＮＡ修飾のうち相当程度の種類は質量数の差異として識別することができる。例えば、化学修飾により質量数の差異を作り出して、理論的には識別することができる。ただし、質量数が同じものについては、当該分野で公知の他の手法を用いて識別することができる。
　本明細書において、「測定」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、ある対象について、量がどれほどか測って求めることをいう。本明細書において「検出」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、物質や成分等を検査して見つけだすことをいい、「同定」とは、ある対象について、そのものにかかわる既存の分類のなかからそれの帰属先をさがす行為をいい、化学分野において使用される場合、対象となる物質の化学物質としての同一性を決定する（例えば、化学構造を決定する）ことをいい、「定量」とは、対象となる物質の存在する量を決定することをいう。
　本明細書で使用されるとき、試料中の分析物の「量」は、一般には、試料の体積中で検出し得る分析物の質量を反映する絶対値を指す。しかし、量は、別の分析物量と比較した相対量も企図する。例えば、試料中の分析物の量は、試料中に通常存在する分析物の対照レベルまたは正常レベルより大きい量であってもよい。
　用語「約」は、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関連して本明細書で使用されるとき、示された値プラスまたはマイナス１０％を指す。なお、「約」と明示的に示されない場合でも「約」があると同義で解釈されうる。質量分析機器は、所与の分析物の質量の決定においてわずかに異なり得る。イオンの質量またはイオンの質量／電荷比との関連において用語「約」は、＋／－０．５原子質量単位を指す。
　本明細書において「対象」とは、本開示の分析、診断または検出等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した細胞、血液、尿、血清等）をいう。
　本明細書において使用され得る「器官」とは「臓器」とも称し、生物のうち、動物や植物などの多細胞生物の体を構成する単位で、形態的に周囲と区別され、それ全体としてひとまとまりの機能を担うもののことをいう。例えば、代表的には、肝臓、脾臓およびリンパ節が挙げられ、このほか、腎臓、肺、副腎、すい臓、心臓等の他の臓器などを挙げることができるがそれらに限定されない。
　本明細書において腫瘍またはがんについての「原発性」とは、当該技術分野において使用される通常の意味で使用され、当該腫瘍またはがんが、化学物質または放射線などによる物理化学的刺激などの任意の要因において自然発生的に生じたもの、あるいはこのように自然発生的に生じる腫瘍またはがんを模して意図的にがん細胞を移植した結果発生したものであることを意味する。
　本明細書において「転移」とは、当該技術分野において使用される通常の意味で使用され、腫瘍細胞が原発病変とは違う場所に到達し、そこで増殖することを指す。転移は、細胞局在化、細胞遊走、細胞接着、細胞外マトリクス、免疫系および血管新生などの種々の要因が関連する複雑な生物学的事象である。転移巣では、原発性部位に元来存在する細胞の性質が異所的に見出され得る。そのため、転移巣の治療のためには、転移巣が存在する部位に本来は有効である処置が適当でない可能性がある。例えば、肝臓に腫瘍が存在する場合、原発性の肝臓がんと、他の部位の原発巣から肝臓に転移したがんとの可能性がる。原発性の肝臓がんである場合、肝臓がんとして治療するのが効果的であるが、他の部位の原発巣から肝臓に転移したがんである場合は、原発巣の種類に応じて治療方針(抗がん剤の種類など)を決定する必要があるため、そのがんが原発なのか転移なのかを区別することは医療上の意義は大きい。
　本明細書において「がんの転移／原発性に関連する状態」とは、原発性腫瘍および転移性腫瘍の一方または両方の現在の状態（例えば、悪性度、規模、存在する部位、発生から経過した時間）、将来の発展性、治療可能性、耐性（例えば、薬剤および／または治療に対する耐性）獲得可能性、および治癒後経過の可能性を含む、がんの転移に関連する任意の状態を意味し、例えば、がんの浸潤の程度、がんの転移が発生しているかどうか、がんが転移している部位、腫瘍が原発性腫瘍であるかどうか、原発性腫瘍の発生部位、腫瘍（原発性腫瘍および／または転移性腫瘍）の薬剤または処置に対する応答性ならびにこれらの可能性が挙げられる。
　本明細書において「バイオマーカー」は、ある対象の状態または作用の評価の指標となるものである。本明細書において特に断らない限り、「バイオマーカー」は「マーカー」と称することがある。
　本開示の検出剤または検出手段は、検出可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、基材、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。
　本明細書においてポリヌクレオチド発現の「検出」または「定量」は、ＲＮＡ上の修飾情報を本明細書に記載の技術を用いて検出または定量することの他、これ以外の指標、例えば、マーカー検出剤への結合または相互作用を含む、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得るが、本開示では、ＰＣＲ産物の量をもって測定することができる。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子分析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat　Genet．2002　Dec；32　Suppl：526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄシステム、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム分析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
　本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識（検出）する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識（検出）することができる手段をいう。
　本明細書において「質量分析」または「ＭＳ」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、化合物をその質量により同定するための分析手法を指し、原子、分子、クラスター等の粒子を何らかの方法で気体状のイオンとし（イオン化）、真空中で運動させ電磁気力等を用いて、あるいは飛行時間差等によりそれらイオンを質量電荷比に応じて分離・検出する技術をいう。ＭＳは、イオンをこの質量対電荷比、すなわち「ｍ／ｚ」に基づきフィルタし、検出し、および測定する方法を指す。近年の検出感度や質量分解能の飛躍的な向上に伴い、益々その応用範囲が広がり、多くの分野で活用されている。代表的には、Clark　J　et　al.，　Nat　Methods.　2011　March　;　8(3):　267-272.doi:10.1038/nmeth.1564.に例示される方法を用いることができる。ＭＳ技術は、一般には、（１）化合物をイオン化して荷電化合物を形成するステップ：および（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量対電荷比を計算するステップを含む。化合物は、適切な手段によりイオン化および検出し得る。「質量分析計」は、一般には、イオン化装置、質量分析器およびイオン検出器を含む。一般に、目的とする１つまたは複数の分子がイオン化され、イオンはこの後、質量分析機器に導入され、ここでイオンは、磁場および電場の組み合わせのために、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存する空間中の経路を辿る。質量分析計についての総説は、例えば、Jurgen　H、「マススペクトロメトリー」、丸善出版（２０１４）を参照のこと。質量分析計には、例えば、磁場型、電場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられる。定量におけるイオンの検出は、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリングや、１つ目の質量分析部で精製したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分析部で、その前駆イオンの開裂によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）等が挙げられる。ＳＲＭでは、選択性が増し、ノイズが減ることによってシグナル／ノイズ比が向上する。
　本明細書で使用されるとき、用語「分解能」または「分解能（ＦＷＨＭ）」（「ｍ／Δｍ50%」としても当技術分野で公知の）は、最大高さの５０％での質量ピークの幅（全幅半値、「ＦＷＨＭ」）で除した観察された質量対電荷比を指す。分解能が高くなるほど、定性性および定量性が良くなり得る。
　本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、安定同位体標識法、蛍光法、ビオチン法、ラマン散乱を利用した光学手法、化学発光法等を挙げることができる。本開示のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。本開示のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、ラマン散乱を利用した光学手法によって標識する場合には、ラマン散乱が互いに異なる物質によって標識を行う。本開示では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
　本明細書において「診断」とは、被験体における状態（例えば、疾患、障害）などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような状態の現状または未来を判定することをいう。本開示の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体におけるがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本開示の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。本開示の技術は、このような診断技術に応用可能である。
　本明細書において「治療」とは、ある状態（例えば、疾患または障害）について、そのような状態になった場合に、そのような状態の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の状態、もしくは状態に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前
に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。本開示の技術を用いてＲＮＡの修飾を特定できると、特定のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）と関連づけられ得ることから、このようなコンパニオン治療またはコンパニオン診断において有用であり得る。
　本明細書において「予後」という用語は、がん等の疾患または障害などに起因する死亡または進行が起こる可能性を予測することを意味する。予後因子とは疾患または障害の自然経過に関する変数のことであり、これらは、いったん疾患または障害を発症した患者の再発率等に影響を及ぼす。予後の悪化に関連した臨床的指標には、例えば、本開示で使用される任意の細胞指標が含まれる。予後因子は、しばしば、患者を異なった病態をもつサブグループに分類するために用いられる。本開示の技術を用いてＲＮＡの修飾を特定できると、特定のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）と関連づけられ得ることから予後因子を提供する技術として有用であり得る。
　本明細書において「検出機器（機）（器）」とは、広義には、目的の対象を検出または検査することができるあらゆる機器をいう。本明細書において「診断薬」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、種分類、老化など）を診断できるあらゆる薬剤をいう。
　本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、試薬、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、試薬、標識などをどのように使用するか、あるいは、どのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、検査薬、診断薬、治療薬、試薬、標識等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。検査機器、診断機器等を組み合わせる場合は、「キット」は「システム」として提供され得る。
　本明細書において「指示書」は、医師または他の使用者に対して本開示を使用する方法の説明を記載したものである。この指示書は、本開示の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本開示が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FDA）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package　insert）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
　本明細書において「プログラム」は、当該分野で使用される通常の意味で用いられ、コンピュータが行うべき処理を順序立てて記述したものであり、法律上「物」として扱われるものである。すべてのコンピュータはプログラムに従って動作している。現代のコンピュータではプログラムはデータとして表現され、記録媒体または記憶装置に格納される。
　本明細書において「記録媒体」は、本開示を実行させるプログラムを格納した記録媒体であり、記録媒体は、プログラムを記録できる限り、どのようなものであってもよい。例えば、内部に格納され得るＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置でありうるがこれらに限定されない。
　本明細書において「システム」とは、本開示の方法またはプログラムを実行する構成をいい、本来的には、目的を遂行するための体系や組織を意味し、複数の要素が体系的に構成され、相互に影響するものであり、コンピュータの分野では、ハードウェア、ソフトウェア、OS、ネットワークなどの、全体の構成をいう。
　（本開示の方法の概略）
　（ＲＮＡ修飾）
　本開示は、ＲＮＡ上の修飾情報に基づいて対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析する方法を提供する。ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）上の修飾（例えば、メチル化）情報が対象（例えば、マウスなどの哺乳動物）におけるがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）に密接に関連しており、ＲＮＡ上、特にマイクロＲＮＡ上の修飾情報を分析することで対象の状態を高精度に分析可能であることは驚くべきことであった。特に、転移したがんおよび原発性がんなどの診断が困難な状態を区別可能であったことは、本開示が医療および産業上非常に有意義であることを示す。また、本開示によるがんの転移／原発性に関連する状態の分析は、液体生検（例えば、血液、尿、唾液）などの採取が容易で低侵襲性の試料を使用して実施することができるので、対象への負荷が少なく有用であり得る。一つの実施形態では、修飾情報は、マイクロＲＮＡ上の修飾情報を含む。一つの実施形態では、修飾情報は、ｌｎｃＲＮＡ上の修飾情報を含む。一つの実施形態では、修飾情報は、メチル化情報を含む。一つの実施形態では、修飾情報は、マイクロＲＮＡ上のメチル化情報を含む。一つの実施形態では、修飾情報は、ｌｎｃＲＮＡ上のメチル化情報を含む。
　（直接連結ビーズ濃縮分析）
　一つの局面では、本開示は、質量分析計を使用してＲＮＡ上の修飾を測定してがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析する方法を提供し、この方法は、
（Ａ）目的のＲＮＡと相補的な核酸が共有結合により連結されたビーズを使用して目的のＲＮＡを精製するステップと、
（Ｂ）精製したＲＮＡをＭＡＬＤＩによってイオン化して質量分析計で測定して、目的のＲＮＡ上の修飾状態に関する情報を取得するステップと、
（Ｃ）修飾状態に関する情報に基づいて対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態を分析するステップと、を含む。
　捕捉核酸とビーズとを直接結合させることで、捕捉核酸とビーズとがビオチン－ストレプトアビジン結合で間接的に結合されている場合と比較して、より過酷な条件で洗浄を行うことができることにより、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ測定の強度が大きく向上することを見出した。
　この手法では、従来では想定されていなかったRNAを対象にしたことが有利である点であり、従来内部配列や修飾塩基の位置を確認することができなかったが、本開示では、in　source　decayの設定を最適化することにより、改善することができた。アンモニアを用いたアルカリ加水分解を併用することで、内部配列及び、修飾塩基の位置が観察出来るようになったことも本開示における特徴であるといえる。また、新しい、「開始材料（ホモジネートや細胞ライセート、血清など）に変性剤を加え、直接ハイブリダイゼーションを行って特定配列のｍｉＲＮＡを精製する」プロトコルでは、捕捉核酸とビーズとを直接結合させる技術と、J.Engbergらの方法（J.Engbergら、Eur.J.Biochem,41,321-328(1974)）を組み合わせることで効率を高めることができたことも一つの実施形態では重要な側面であるといえる。
　（エキソソーム濃縮分析）
　一つの局面では、本開示は、質量分析計を使用してＲＮＡ上の修飾を測定してがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析する方法を提供し、この方法は、
（Ａ－１）細胞分画法によってエキソソームを精製するステップと、
（Ａ－２）抗ＣＤ６３抗体を使用してエキソソームを精製するステップと、
（Ｂ）目的のＲＮＡと相補的な核酸を使用して目的のＲＮＡを精製するステップと、
（Ｃ）精製したＲＮＡをイオン化法（例えば、ＭＡＬＤＩ）によってイオン化して質量分析計で測定して、目的のＲＮＡ上の修飾状態に関する情報を取得するステップと、
（Ｄ）修飾状態に関する情報に基づいて対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態を分析するステップと、を含む。
　相補的な核酸で目的の核酸を精製する場合、エキソソームを精製する工程を事前に行うことにより、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）測定の強度が大きく向上することを見出した。
　この開示は、理論に束縛されることを望まないが、ステップ（Ａ）とステップ（Ｂ）とを、または、ステップ（Ａ）とステップ（Ｃ）とを組み合わせることで精製が改善され、あるいは質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）測定の強度が大きく向上することが見いだされた。また、（Ａ－１）および（Ａ－２）を両方行ったときにＭＡＬＤＩ－ＭＳシグナルの強度が約２．５倍になった効果になっており、これは、従来予測できなかった効果であるといえる。
　本開示の方法を実施するための具体的手順を以下で説明する。
　（試料）
　本開示の方法は、ＲＮＡを含む任意の試料を使用して実施することができるが、臨床的に入手しやすいものが好ましい。一つの実施形態では、試料は、対象に由来し、ここで、対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、チンパンジー、サル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウマ、ブタ、ネコなど）、鑑賞・愛玩生物が挙げられるがこれらに限定されない。一つの実施形態では、試料は、がんに関する特定の状態であるか、またはがんに関する特定の状態である可能性のある対象に由来する。一つの実施形態では、がんに関する特定の状態として、疾患（例えば、ヒトパピローマウイルスなどのがん原性ウイルスによる感染症）、年齢、性別、人種、家系のがんの疾患歴、病歴（例えば、がんの疾患歴）、治療歴（例えば、抗がん処置の履歴）、喫煙状態、飲酒状態、職業、生活環境情報などが挙げられるがこれらに限定されない。一つの実施形態では、試料は、対象から得られた器官、組織、細胞（例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）など）、血液（例えば、血漿、血清など）、粘膜表皮（例えば、口腔、鼻腔、耳腔、膣などにおけるもの）、皮膚表皮、生体分泌液（例えば、唾液、鼻水、汗、涙、尿、胆汁など）またはその部分である。一つの実施形態では、試料は、手術的に切除または生検して得られたソリッドバイオプシーまたはその部分である。本発明者は、マイクロＲＮＡ上の修飾を測定することでがんの転移／原発性に関連する状態を分析可能であることを見出したが、マイクロＲＮＡは、組織や器官だけでなく、液体生検（例えば、血液、尿、唾液）などの採取が容易な試料中からも回収することができるので、対象への負荷を最小限に分析が可能であり得るという点において、液体生検などの試料を使用する方法は、本開示の好ましい実施形態であり得る。
　（ＲＮＡ精製方法）
　一つの実施形態では、ＲＮＡ修飾を分析するために事前にＲＮＡを精製してもよいし、精製しなくてもよい。本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、遺伝子マーカー等のＲＮＡまたはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本開示で用いられる物質は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書において「単離」されたとは、天然に存在する状態で付随する任意のものを少なくとも１つ除去したものをいい、例えば、全ＲＮＡ配列から特定のマイクロＲＮＡ配列を取り出した場合も単離といいうる。従って、本明細書において使用されるＲＮＡは、単離されたものでありうる。一つの実施形態では、全ての種類のＲＮＡを区別することなく他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、ポリＡを使用してＲＮＡを他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、全てのマイクロＲＮＡを他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、目的の配列（単一の種類または複数の種類）を有するＲＮＡを他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、複数種類の目的の配列を有するＲＮＡを配列毎に別々に精製してもよい。一つの実施形態では、修飾（単一の種類または複数の種類）を有するＲＮＡを他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、メチル化修飾を有するＲＮＡを他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、目的の配列（単一の種類または複数の種類）を有し、かつ修飾（単一の種類または複数の種類）を有するＲＮＡを他の成分から精製してもよい。
　一つの実施形態では、目的のＲＮＡは配列番号１～４：
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG（配列番号１）
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA（配列番号２）
CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG（配列番号３）
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU（配列番号４）
からなる群から選択される配列の少なくとも一部を含む。
　ＲＮＡの精製には任意の公知の手法を用いることができる。精製は、その修飾を測定することでがんの転移／原発性に関連する状態を分析することができる少なくとも１種類のＲＮＡの濃度を増大させるように実施される。一つの実施形態では、ＲＮＡ特異的な分子を使用して全ＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、ＤＮＡ分解酵素を作用させた後に、核酸分子を精製することで目的のＲＮＡを精製してもよい。複数種類のＲＮＡは、別々に精製してもよいし、並行して精製してもよいし、混合状態で精製してもよい。一つの実施形態では、１、２、３、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００または３０００種類のＲＮＡを並行して精製してもよい（例えば、担体に結合した配列特異的なＲＮＡ捕捉分子を使用して）。一つの実施形態では、目的の配列と少なくとも部分的に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を使用して、目的の配列を有するＲＮＡを精製してもよく、ここで、該相補的な核酸分子は、精製のための任意の部分を含んでいてもよい。例えば、精製のための任意の部分の例として、ビーズなどの担体（必要に応じて、磁性を帯びていてもよい）、ビオチンおよびストレプトアビジンなどの互いに結合するペア分子のうちの一方、互いに結合するペア分子を結合させるための部分（例えば、クリックケミストリーにおけるアルキン部分）、抗体認識部分などが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態では、特異的な結合分子（例えば、抗体）を使用して目的のＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、ＲＮＡ修飾（例えば、メチル化）に特異的な結合分子（例えば、抗体）を使用して目的のＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、特定の種類のＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）に特異的な結合分子（例えば、抗体）を使用して目的のＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、特定の配列に特異的な結合分子（例えば、抗体）を使用して目的のＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、特定の修飾および特定の配列に特異的な結合分子（例えば、抗体）を使用して目的のＲＮＡを精製してもよい。
　一つの実施形態では、配列番号５～８
CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG（配列番号５）
TCAACATCAGTCTGATAAGCTA（配列番号６）
CCAAACACTGCTGGGTAAGACG（配列番号７）
AACTATACAACCTACTACCTCA（配列番号８）
からなる群から選択される配列の少なくとも一部を含むＤＮＡを使用してＲＮＡを精製する。
　一つの実施形態では、細胞内小器官（例えば、エクソソーム）を精製することで目的のＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、遠心分離により細胞内小器官（例えば、エクソソーム）を精製してもよい。一つの実施形態では、細胞内小器官に存在する分子に結合する分子（例えば、抗体）を使用することで目的のＲＮＡを精製してもよい（例えば、抗ＣＤ６３抗体を使用してエキソソームを精製する）。
　目的のＲＮＡの精製は、単一の段階で実施してもよいし、複数の段階で実施してもよい。例えば、目的の配列を有するＲＮＡの精製は、試料から目的の配列を有するＲＮＡを直接精製してもよいし、試料から全ＲＮＡを精製した後に、目的の配列を有するＲＮＡを精製してもよい。
　一つの実施形態では、複数種類の目的のＲＮＡを精製する場合、この目的のＲＮＡのうちの少なくとも２種類が混合された状態で精製してもよいし、各目的のＲＮＡが別々に精製されてもよい。例えば、複数の目的の配列を有するＲＮＡを別々に精製する場合、試料を複数に分割して、それぞれの分割試料からそれぞれ異なる配列を有する目的の核酸を精製してもよいし、目的の各配列に相補的な核酸分子が複数の離れた位置に配置された担体に試料を適用することで目的の核酸を精製してもよい。
　（修飾の検出および同定）
　ＲＮＡ上の修飾の検出および同定は任意の公知の手法を用いて行うことができる。例えば、このようなＲＮＡ上の修飾の検出および同定する方法として、修飾特異的な抗体による蛍光検出、修飾および／またはＲＮＡ特異的なタンパク質（抗体など）によって免疫沈降したＲＮＡのシークエンシング、精製ＲＮＡの質量分析、バイサルファイトシークエンシングなどの化学処理を施したＲＮＡのシークエンシング（必要に応じてＰＣＲと組み合わせる）、ナノポアシークエンシング（例えば、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズのもの）、トンネル電流シークエンス（Scientific　Reports　2,doi:　10.1038/srep00501(2012)）が挙げられる。
　一つの実施形態では、ＲＮＡ上の修飾の検出および同定は、ＲＮＡの配列情報の特定と並行して実施されてもよい。本開示では、任意のＲＮＡ修飾情報が同定され得る。一つの実施形態では、目的のＲＮＡ上の修飾の種類（１つのヌクレオチド上の異なる位置に導入された同じ種類の官能基による修飾の種類を含む）、修飾された目的のＲＮＡの量および割合、目的のＲＮＡ上の修飾の量および割合、および目的のＲＮＡ上の修飾の位置のうちの少なくとも１つが、必要に応じて該ＲＮＡの量とともに、同定される。一つの実施形態では、目的のＲＮＡ上の修飾状態は、その修飾状態の信頼度（例えば、真陽性の確率）を含み得る。一つの実施形態では、ＲＮＡ上のメチル化が同定される。一つの実施形態では、ヌクレオシド上のメチル化が同定される。一つの実施形態では、ＲＮＡの核酸塩基上のメチル化が同定される。一つの実施形態では、ヌクレオシド上のメチル化が同定される。一つの実施形態では、ＲＮＡのｍ６Ａが同定される。一つの実施形態では、修飾を付加する酵素の認識モチーフ情報、修飾を除去する酵素の認識モチーフ情報、および修飾に結合するタンパク質の認識モチーフ情報のうちの少なくとも１つに基づいてＲＮＡの修飾状態（例えば、修飾の位置、修飾状態の信頼度など）が同定される。
　一つの実施形態では、
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG配列番号１の１３番目のＡのメチル化（配列番号１０）
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA配列番号２の９番目のＣのメチル化（配列番号１１）
CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG配列番号３の１３番目のＣのメチル化（配列番号１２）
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU配列番号５の１９番目のＡのメチル化（配列番号１３）
からなる群から選択される修飾を含む修飾が同定される。
　一つの実施形態では、miR-434-3p、miR-127-5p、miR-145a-5p、miR-143-5p、miR-300-3p、miR-495-3p、miR-3102-3p、miR-339-3p、miR-376b-5p、miR-382-3p、miR-204-5p、miR-679-5p、miR-547-3p、miR-431-3p、miR-370-5p、miR-1843a-3p、miR-431-5p、miR-409-5p、miR-668-3p、miR-341-3p、miR-329-5p、miR-465a-5p、miR-450b-5p、miR-380-5p、miR-466c-5p、miR-743b-5p、miR-26a-1-3p、miR-743a-5p、miR-34b-3p、miR-883a-3p、およびmiR-152-5p、miR-23a-5p、miR-19a-3p、miR-96-5p、let-7c-2-3p、miR-296-3p、miR-23b-5p、miR-5121、miR-298-5p、miR-7033-5p、miR-30c-1-3p、miR-30d-3p、let-7a-1-3p、miR-3470b、miR-301a-5p、miR-130a-3p、miR-362-5p、miR-21a-3p、miR-140-5p、miR-23a-3p、let-7f-1-3p、miR-339-5p、miR-181d-5p、miR-142a-5p、miR-24-2-5p、miR-181a-2-3p、miR-1983、miR-706、miR-30c-5p、miR-27a-5p、miR-7667-5p、miR-361-5p、miR-194-2-3p、miR-497a-5p、miR-20a-5p、miR-107-3p、miR-6937-5p、miR-465b-5p、miR-147-3p、miR-182-5p、miR-26b-5p、miR-30e-5p、miR-130b-3p、miR-34a-5p、miR-331-3p、miR-126b-5p、miR-9-5p、miR-421-3p、miR-139-3p、miR-138-5p、miR-378a-5p、miR-139-5p、miR-183-5p、miR-574-5p、miR-29b-3p、miR-17-5p、miR-672-5p、miR-598-3p、miR-1291、miR-455-5p、miR-200b-5p、miR-140-3p、miR-30a-5p、miR-1839-5p、miR-15b-5p、miR-185-3p、let-7c-1-3p、miR-342-3p、miR-3473b、miR-99b-3p、miR-425-5p、miR-21b、miR-27a-3p、miR-3074-1-3p、miR-185-5p、miR-450a-5p、miR-98-5p、miR-3099-3p、miR-381-3p、miR-3535、miR-429-3p、miR-98-3p、miR-322-3p、miR-320-3p、miR-210-3p、miR-501-3p、miR-181b-5p、miR-671-5p、miR-31-5p、miR-144-3p、miR-21a-5p、miR-1981-5p、miR-1957b、miR-9-3p、miR-216b-5p、miR-21c、miR-141-3p、miR-221-5p、miR-217-5p、miR-101b-3p、miR-103-3p、miR-30b-3p、miR-1195、miR-16-5p、let-7j、miR-15b-3p、miR-30b-5p、miR-149-5p、miR-3965、miR-451a、miR-148a-5p、miR-19b-3p、miR-101a-3p、miR-200b-3p、miR-361-3p、miR-709、miR-221-3p、miR-24-3p、miR-193a-3p、let-7e-5p、miR-99b-5p、miR-345-3p、miR-214-3p、miR-22-3p、miR-29c-3p、miR-1306-3p、miR-142a-3p、miR-191-5p、miR-3970、miR-184-3p、miR-532-5p、let-7a-5p、miR-378d、miR-122-5p
、let-7c-5p、miR-152-3p、miR-148b-3p、miR-126a-3p、miR-484、miR-192-5p、miR-92a-3p、miR-6538、miR-222-3p、miR-16-1-3p、miR-335-3p、miR-151-5p、miR-378b、miR-6988-3p、miR-195a-3p、let-7g-5p、miR-30e-3p、miR-744-5p、miR-25-3p、miR-28b、miR-200a-3p、miR-30d-5p、miR-374b-5p、miR-486a-3p、miR-93-5p、let-7b-3p、miR-30c-2-3p、miR-466i-5p、miR-200a-5p、miR-880-3p、miR-106b-5p、miR-6239、miR-6969-3p、miR-27b-5p、miR-186-5p、miR-5106、miR-26a-5p、miR-203-5p、miR-2137、miR-532-3p、miR-486b-5p、miR-132-3p、miR-423-5p、miR-486a-5p、miR-224-5p、miR-365-2-5p、let-7d-5p、miR-340-5p、miR-1843b-3p、miR-218-5p、miR-23b-5p、miR-27b-5p、miR-25-5p、miR-106b-3p、let-7i-5p、miR-30a-3p、miR-652-3p、miR-1843b-5p、let-7f-5p、miR-200c-3p、miR-1198-5p、miR-148a-3p、miR-1198-5p、miR-148a-3p、miR-132-5p、miR-22-5pからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ上の修飾（例えば、メチル化）を同定して対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）が分析される。
　一つの実施形態では、2410006H16Rik、Gm17034、4931413K12Rik、Gm14636、Pitpnm2os2、Mir17hg、Gm10501、Gm17251、6330418K02Rik、A830012C17Rik、2900052L18Rik、Gm16551、Snhg12、R74862、Snhg17、AI480526、2210408F21Rik、A330035P11Rik、Ino80dos、Gm16576、Gm12840、Pet100、G530011O06Rik、Tmem51os1、Gm17300、4930412M03Rik、Gm16046、Gm15298、およびGm16091からなる群から選択される少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ上の修飾（例えば、メチル化）を同定して対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）が分析される。
　一つの実施形態では、ＲＮＡ上の修飾は、その修飾を構成する部分（例えば、メチル部分）に含まれる放射性原子から放出された放射線によって検出および同定され得る。一つの実施形態では、ＲＮＡ上の修飾は、修飾に特異的に結合する分子（例えば、修飾特異的抗体）の結合の検出（例えば、蛍光の検出）、または修飾に特異的に反応する分子と反応して生成された反応物の検出（例えば、反応物である光の検出、反応して生成されたビオチン誘導体のストレプトアビジンによる検出など）によって特定され得る。
　一つの実施形態では、ＲＮＡ上の修飾は、バイサルファイトシークエンシング、修飾特異的抗体で濃縮したＲＮＡのシークエンシング（ＲＩＰシークエンシング）などの核酸の配列決定法において同定することができる。任意の適切な配列決定法を本開示に従って使用することができる。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術が好ましい。本明細書において「次世代シークエンシング」または「ＮＧＳ」という用語は、サンガー化学として公知の「従来の」シークエンシング法に対して、種々の核酸全体を小片に分割することによって核酸鋳型を核酸全体に沿って並行してランダムに読み取る、すべての新規ハイスループットシークエンシング技術を意味する。ＮＧＳ技術（超並列シークエンシング技術とも称する）は、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムのすべての転写配列）またはメチローム（ゲノムのすべてのメチル化配列）の核酸配列情報を非常に短期間、例えば１～２週間以内、好ましくは１～７日間以内、または最も好ましくは２４時間未満内に送達することができ、原理上は、単一細胞シークエンシングアプローチを可能にする。市販されているかまたは文献中で言及されている任意のＮＧＳプラットフォームを本開示の実施のために使用することができる。一つの実施形態では、ＰＣＲにより増幅した核酸を配列決定することでＲＮＡ上の修飾を同定することができる。
　一つの実施形態では、ＲＮＡは、修飾特異的な結合分子（例えば、抗ｍ６Ａ抗体などの抗体）によって精製されたことに基づいて修飾ＲＮＡであると同定される。シークエンシングで得られたデータは、任意の分析法によって処理してＲＮＡ修飾情報へと変換することができる。例えば、このような分析法の例として、ＭｅｔＰｅａｋ（Cuiら、Bioinformatics(2016)32(12):i378-i385を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。
　一つの実施形態では、ＲＮＡ上の修飾は、質量分析計によって同定することができる。本開示において使用することができる質量分析計として、磁場型、電場型、四重極型、飛行時間型（ＴＯＦ）等が挙げられる。一つの実施形態では、質量分析計によって、単鎖ＲＮＡを測定してもよいし、ＤＮＡまたはＲＮＡとともに二本鎖を形成したＲＮＡを測定してもよい。
　質量分析は任意のイオン化法と組み合わせることができる。本開示において使用することができるイオン化法として、例えば、電子イオン化法（ＥＩ）、化学イオン化法（ＣＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＳＩは、液体クロマトグラフィー、超臨界クロマトグラフィーなどを組み合わせることができ、クロマトグラフィーにより複数の種類のＲＮＡを分離しながら測定することが可能である。クロマトグラフィーに使用することができるカラムとして、例えば、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラム、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーカラムなどが挙げられる。
　ＭＡＬＤＩにおいては、試料は、マトリックスとしてレーザー光によってイオン化しやすい物質（塗布剤）と予め混合され、ターゲットプレート上のスポット（アンカーポジション）に配置され、これにレーザー光が照射されることでイオン化が起こる。本開示において使用することができる塗布剤として、３－ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）、ＣＨＣＡ（α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸）などが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態では、ターゲットプレート上の１つのスポット（アンカーポジション）に配置されるＲＮＡは複数の配列を有するＲＮＡを含んでもよいが、好ましくは、ターゲットプレート上の１つのスポットに配置されるＲＮＡは同じ配列を共有する一群のＲＮＡである。１つのアンカーポジション上に存在するＲＮＡの配列の種類が増加するにつれて、配列の確認および／または修飾位置の確認が困難となり得る。
　一つの実施形態では、断片化されていないイオン（親イオン）および／または断片化されたイオン（娘イオン）の測定値に基づいてＲＮＡの修飾状態（例えば、修飾の有無、修飾の位置、修飾の数、修飾の信頼度など）を同定することができる。一つの実施形態では、対照分子（例えば、安定同位体標識化核酸、非修飾核酸、相補的な二本鎖を形成していたペアのもう一方の核酸など）との比較によってＲＮＡの修飾状態（例えば、修飾の量など）を同定することができる。一つの実施形態では、参照情報（例えば、標準試料の測定結果、既知の修飾情報など）に基づいてＲＮＡの修飾状態を同定することができる。質量分析のデータは、任意のソフトウェアによって処理してＲＮＡ修飾状態へと変換することができる。例えば、このようなソフトウェアの例として、ＤＮＡメチル化分析システムMassARRAY（登録商標）EpiTYPER（シーケノム）が挙げられるがこれらに限定されない。
　（事前処理）
　一つの実施形態では、その修飾を測定することでがんの転移／原発性に関連する状態を分析することができる目的のＲＮＡを含む試料は、測定の前に物理的、化学的または生物的に事前処理されていてもよい。事前処理を行うことで、例えば、目的のＲＮＡの測定における感度、正確さおよび／または精度の向上、異なる種類の修飾の区別、試料間比較における定量性の向上、測定機器における分離の向上などの効果が得られ得る。このような事前処理として、例えば、硫酸ジメチル処理、ハロゲン化合物処理、アルカリ加水分解処理、安定同位体標識導入処理、検出向上剤（例えば、蛍光色素など、ＭＡＬＤＩにおいてレーザーの吸収が良好な部分を含む化合物）処理が挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態では、事前処理は、ＲＮＡを担持した基材（ビーズなど）に対して実施され得る。一つの実施形態では、事前処理に用いる薬剤は、ＲＮＡの塩基上のアミン部分、末端のリン酸基または水酸基に基を導入するように設計され得る。
　硫酸ジメチル処理は、ＲＮＡのアデニンのプリン環の１位の窒素原子を選択的にメチル化して、＋１４Ｄａの質量を与えることができるが、プリン環の１位の窒素原子がすでにメチル化されている場合にはこの反応は進行せず、１－ｍＡとＮ６－ｍＡとの区別が可能である。同様に、トリフルオロメタンスルホン酸メチルも使用され得る。ハロゲン化合物処理には、例えば、ハロゲン化アセトアルデヒドを使用することができ、ＲＮＡのシトシンの３位の窒素原子と４位のアミノ基との間を架橋して新たな５員環を形成して、質量数を変化させるが、シトシンの３位の窒素原子がメチル化されている場合にはこの反応は進行しない。ハロゲン化アセトアルデヒドとしては、ブロモアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドが挙げられ、これらの化合物の沸点は約６０℃であるためＲＮＡを分解させずに真空乾燥による除去が可能である。アルカリ加水分解は、例えば、ＲＮＡをアンモニアで処理することでＲＮＡを断片化する。
　（分析）
　取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、種々のがんの転移／原発性に関連する状態を分析することができる。がんの転移／原発性に関連する状態としては、がんの浸潤の程度、がんの転移が発生しているかどうか、がんが転移している部位、腫瘍が原発性腫瘍であるかどうか、原発性腫瘍の発生部位、腫瘍（原発性腫瘍および／または転移性腫瘍）の薬剤または処置に対する応答性ならびにこれらの可能性が挙げられる。転移に関連する状態を分析するがんは、任意のがんであり得るが、例えば、膵臓がん（例えば、早期膵臓がん）、肝臓がん、胆嚢がん、胆道がん、胃がん、大腸がん、膀胱がん、腎がん、乳がん、肺がん、脳腫瘍、皮膚がんなどが挙げられる。１つの実施形態では、転移に関連する状態を分析するがんは、膵臓がんを含む難治性のがんである。がんの転移／原発性に関連する状態に関する詳細な分析が可能となることは医療上非常に有益である。例えば、転移巣では原発性部位に元来存在する細胞の性質が異所的に見出される等、原発性腫瘍と転移性腫瘍とは性質が異なり、そのため適切な処置も両者で異なり得るが、従来の方法では、両者の区別は容易ではなかった。本開示の方法によれば、原発性腫瘍と転移性腫瘍とは容易に（例えば、血液試料を使用して）区別され得るため、非常に有益であり得る。
　本開示はまた、がんの転移／原発性に関連する状態を有するか、または有する可能性のある対象生物の薬剤（例えば、抗がん剤、分子標的薬、抗体医薬、生物製剤（例えば、核酸、タンパク質）など）または処置に対する応答性を分析することができる。例えば、薬剤耐性なども分析することができ、例えば、抗がん剤への応答性、適切な治療剤の選択の分析などにも応用することができる。本開示の分析はまた、重粒子線（例えば、Ｃａｒｂｏｎ／ＨＩＭＡＣ）またはＸ線による処置などの手術または放射線処置などの経過や予後の分析にも用いることができる。本開示を用いて、ロンサーフ（ＴＡＳ１０２）、ゲムシタビン、ＣＤＤＰ、５－ＦＵ、セツキシマブ、核酸医薬またはヒストン脱メチル化酵素阻害剤などの種々の医薬のがんの転移／原発性に関連する状態に与える影響を分析可能であり、治療戦略の基礎情報として活用し得ることが理解される。したがって、本開示を用いることによって、薬剤等の処置に対する応答性に基づいて、対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態を処置するための薬剤および／または前記対象に対するさらなる処置の選択などを行うことができる。本開示において、複数の薬剤についての応答性を検討する場合、複数の薬剤の中から前記状態を処置するための薬剤を示すことができる。分析を行う場合、薬剤の投与または前記処置の前後の前記対象における本開示のＲＮＡの修飾情報（例えば、メチル化）の比較に基づいて分析を行うことができる。
　本開示の１つの実施形態では、がんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析する対象について、その年齢、性別、人種、家系のがんの疾患歴、病歴（例えば、がんの疾患歴）、治療歴（例えば、抗がん処置の履歴）、喫煙状態、飲酒状態、職業情報、生活環境情報、がんマーカー情報、核酸情報、代謝物情報、タンパク質情報およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの情報をさらに考慮して、分析を行うことができる。本開示の方法において、利用し得る核酸情報としては、ゲノム情報、エピゲノム情報、トランスクリプトームの発現量情報、ＲＩＰシークエンシング情報、マイクロＲＮＡの発現量情報およびこれらのいずれかの組み合わせを挙げることができる。
　本開示が分析対象とするＲＮＡの種類は、分析の目的に応じて増減させることができ、例えば、少なくとも５種類、少なくとも１０種類、少なくとも２０種類、少なくとも３０種類、少なくとも５０種類、少なくとも１００種類、少なくとも２００種類、少なくとも３００種類、少なくとも５００種類、少なくとも１０００種類、少なくとも１５００種類、少なくとも２０００種類のＲＮＡ上の修飾情報を分析することができる。ここで、少なくとも１種類のＲＮＡは、当該ＲＮＡの修飾を測定することでがんの転移／原発性に関連する状態を分析することができるＲＮＡである。あるいは、マイクロＲＮＡを対象とする場合、表１に示すすべてのマイクロＲＮＡを対象としてもよい。ｌｎｃＲＮＡを対象とする場合、表２に示すすべてのｌｎｃＲＮＡを対象としてもよい。ＲＮＡの種類は、特に限定されないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを単独種類または複数の種類を組み合わせて用いてもよい。１つの実施形態では、同じ配列を含むＲＮＡ上の複数の修飾情報を分析することができる。別の実施形態では、ＲＮＡの構造情報にさらに基づいて、対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析することができる。
　１つの実施形態では、メチル化酵素（例えば、Ｍｅｔｔｌ３、Ｍｅｔｔｌ１４、Ｗｔａｐ）、脱メチル化酵素（例えば、ＦＴＯ、ＡｌｋＢＨ５）およびメチル化認識酵素（例えば、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ３などのＹＴＨドメインを持つファミリー分子）のうちの少なくとも１つがノックダウンされた生物におけるＲＮＡの修飾情報、および／またはメチル化酵素（例えば、Ｍｅｔｔｌ３、Ｍｅｔｔｌ１４、Ｗｔａｐ）、脱メチル化酵素（例えば、ＦＴＯ、ＡｌｋＢＨ５）およびメチル化認識酵素（例えば、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ３などのＹＴＨドメインを持つファミリー分子）のうちの少なくとも１つの認識モチーフ情報にさらに基づいて、対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析するステップを含んでいてもよい。
　１つの実施形態では、複数の修飾情報に基づいて状態の確率を計算する工程を実施してもよい。計算工程としては、任意の統計学的手法を実施することができ、例えば、主成分解析などが実施され得る。
　１つの実施形態では、臨床エビデンスが蓄積される抗がん剤（例えば、ロンサーフ（ＴＡＳ１０２）、ゲムシタビン、ＣＤＤＰ、５－ＦＵ、セツキシマブ、核酸医薬またはヒストン脱メチル化酵素阻害剤）の腫瘍組織に対する薬効を検討しがんの転移／原発性に関連する状態の治療戦略を立てることができる。
　１つの実施形態では、種々の薬剤の新たな作用機序を解明して更なるがんの転移／原発性に関連する状態の治療戦略で応用できる中分子化合物を創薬することができ、例えば、転移性がんを克服する戦略の立案に利用することができる。
　１つの実施形態では、マイクロＲＮＡを本開示の手法で分析することにより、がんの転移／原発性に関連する状態の作用機序の更なる解明を行うことができる。すなわち、本開示の方法を用いて、抗がん剤等の薬剤に特異的ながんの転移／原発性に関連する状態によって変動するマイクロＲＮＡを分析することができ、これを用いてコンパニオン診断薬を設計することができる。１つの実施形態では、低侵襲のリキッドバイオプシーで得られる末梢血中のｍｉＲＮＡを用いたコンパニオン診断を実施することができる。
　１つの実施形態では、本開示は、がん幹細胞またはCancer　Initiating　Cell（CIC）に関する分析を行うことができる。
　１つの実施形態では、本開示の分析は、修飾されたＲＮＡ自体が、がんの転移／原発性に関連する状態を処置するための薬の標的分子となる場合にも応用することができる。すなわち、本開示の分析技術を用いて、ＲＮＡの修飾または非修飾を検出することによって、新規薬剤のスクリーニングを行うことができる。特に、マイクロＲＮＡなどのＲＮＡの修飾（例えば、メチル化）をこのような新規薬剤のスクリーニングに応用することが従来知られておらず、本開示は新たな作用機序での薬剤を提供し得るものである。
　別の実施形態では、修飾されたＲＮＡ自体ががんの転移／原発性に関連する状態を処置するための薬の成分分子となる場合にも、本開示の分析を応用することができる。例えば、本開示の分析技術を用いて、ＲＮＡの修飾または非修飾を検出することによって、対象となるＲＮＡ修飾物またはその修飾を担う酵素などの外部因子が薬剤として利用可能かどうかを分析することで、新規薬剤のスクリーニングを行うことができる。
　本開示はまた、ＲＮＡ修飾の他、ＲＮＡ修飾以外の他の核酸の情報、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の塩基置換および／または修飾の情報を組み合わせて、がんの転移／原発性に関連する状態の分析を行うことができることが理解される。マルチオミクスの分析については、Sijia　Huang　et　al.,　Front　Genet.2017;8:84、Yehudit　Hasin　et　al.,Genome　Biol.2017;18:83などのＲＮＡ修飾（エピトランスクリプトーム）以外のオミクスのマルチオミクス分析の技術と組み合わせることができる。
　他の核酸の情報については、例えば、質量分析などにより、分析することができ、例えば、ＲＮＡには、ＲＩＰ－ｓｅｑを応用し、ＤＮＡにはＤＩＰ－ｓｅｑを応用し、ＦＤＮＡでは、ＢｒｄＵなどでＦＤＩＰ－ｓｅｑを行うことで分析することができる。
　１つの実施形態では、本開示の分析技術は、臨床エビデンスに基づく新しいがんの転移／原発性に関連する状態の機序の解明を行うことができる。
　1つの実施形態では、本開示は、腫瘍多様性に対応した創薬において利用することができる。本開示のＲＮＡ　ｍｏｄ（例えば、マイクロＲＮＡのメチル化情報）に加えて、ＣｈＩＰ－ｓｅｑやＦＴＤを取り込んだ修飾ＤＮＡの一分子計測、さらには腫瘍組織の間質のＣＡＦ（Cancer　Associated　Fibroblasts）やリンパ球のシングル細胞分析（Ｃ1)などを組み合わせて応用することができる。患者に薬剤を投与したきに、転移性腫瘍と原発性腫瘍との応答を区別して把握することができる。ＲＮＡ　ｍｏｄの情報を活用して阻害剤を分類することができれば、転移性腫瘍と原発性腫瘍とを差別化できる革新的な医薬品を創出できる。
　１つの実施形態では、本開示は、ある薬剤について、（１）適応疾患をがんの転移／原発性に関連する状態に広げる、（２）がんの転移／原発性に関連する状態を処置する能力に関して他の先行する薬剤との非劣性を示して２ｎｄライン治療以前に遡らせる、（３）がんの転移／原発性に関連する状態の新たな作用機序の解明と治療薬に結びつく可能性を検証することなどに応用することができる。
　１つの実施形態では、例えば、転移に関連する状態を有するがん患者などの患者の液体生検として血清エキソソーム内ｍｉＲＮＡの発現情報を整備し、分析対象の治療後の患者の血清エキソソーム内ｍｉＲＮＡの発現情報や本開示の修飾情報の分析を行うことができる。
　また、がんの転移／原発性に関連する状態を治療した後の患者の血清エキソソーム内ｍｉＲＮＡの発現情報や修飾情報を分析することができる。
　本開示のＲＮＡの情報を用いたがんの転移／原発性に関連する状態の分析では、標的は転写因子であるということ、つまり、標的の遺伝子の発現を（多くの場合に正に）制御する鍵となる誘導因子であることが重要な点でもありうる。この場合には、独立の転写因子を厳選することにより、数を絞っていくことができる。がん遺伝子があると転写因子の限定的な独立性が失われて、ｃｅｌｌ　ｃｏｎｔｅｘｔ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔにいろいろな作用が出てくることから、クリアに最小数を求めることができなくなると理解される。
　本開示の好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲ）が使用されるが、この場合、多対多対応であることが特徴である。つまり、１つのマイクロＲが複数に多く作用して、かつ異なった分子としてのマイクロＲＮＡ間でも共通した標的をシェアしているということも重要な点の一つであるといえる。このような「多対多対応」の制御系で、がんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を誘導する重要なセットが存在するとして、それが１つの分子でなかったからといって、驚くことはない。むしろ、それが限定性されたセットであるとか、そのセットの中のヒエラルヒーを表現できる重み値をつけて表出でききることができることも本開示が提供する分析の特徴であるといえる。
　（バイオマーカースクリーニング）
　一つの実施形態では、取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、新たなバイオマーカーの探索を行うことができる。一つの実施形態では、がんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）である対象において取得されたＲＮＡ修飾情報を、その状態でない対象において取得されたＲＮＡ修飾情報と比較して、ＲＮＡ修飾状態（例えば、量、修飾位置など）に差（例えば、統計的有意差）が観察されたＲＮＡまたはＲＮＡの群を、その状態を予測するためのバイオマーカーとすることができる。
　一つの実施形態では、薬物および／または処置を施したがんの転移／原発性に関連する状態を有する対象において取得されたＲＮＡ修飾情報を、その薬物および／または処置を施していない同様の状態の対象において取得されたＲＮＡ修飾情報と比較して、ＲＮＡ修飾状態（例えば、量、修飾位置など）に差（例えば、統計的有意差）が観察されたＲＮＡまたはＲＮＡの群を、その薬物および／または処置に対しての応答性および／または耐性を予測するためのバイオマーカーとすることができる。
　（薬物スクリーニング）
　一つの実施形態では、取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、がんの転移／原発性に関連する状態を処置する新たな薬物を評価することができる。一つの実施形態では、ある薬物で処置したがんの転移／原発性に関連する状態を有する対象において取得されたＲＮＡ修飾情報を、別の薬物で処置した同様の状態を有する対象において取得されたＲＮＡ修飾情報と比較することによって、各薬物の処置で変動したＲＮＡに基づいて、薬物間で分類を行うことができる。
　また、本開示において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質とは異なり、ＲＮＡ修飾（例えば、メチル化）では、視点を変えれば新たな展開が提供される。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡは、分解とともに連続した塩基配列の情報が失われていく（短く断片化していく）ことになるが、メチル化はその質を表現するものとして、標的サイトがある限り、メチル化率として表されるため、「もとあった素因が、経時的な変化の中で、どのように減衰していき、それが残っているか」をモニターできる点で、ユニークである。タンパク質は、両者の中間にあるだけでなく、標的が定まっていないので、追跡ツール、トレーサーとしては限界があるため、ＲＮＡ修飾（例えば、メチル化）では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質とは異なって、格別優れた効果が奏されるといえる。
　（追加情報の利用）
　一つの実施形態では、対象から取得したＲＮＡ修飾情報に加えて、他の情報、例えば、別の時点で対象から取得したＲＮＡ修飾情報（例えば、処置の前後）、該対象に関する情報、修飾に関連するタンパク質のモチーフ情報、他の対象から取得したＲＮＡ修飾に関する情報、ＲＮＡと結合する物質（タンパク質、脂質など）とＲＮＡとの複合体に関する情報（必要に応じて、さらにＲＮＡ修飾状態に関連した状態）などを使用して対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析することができる。
　追加で使用することができる対象に関する情報として、例えば、対象の年齢、性別、人種、家系のがんの疾患歴、病歴（例えば、がんの疾患歴）、治療歴（例えば、抗がん処置の履歴）、喫煙状態、飲酒状態、職業情報、生活環境情報、疾患マーカー情報、核酸情報、代謝物情報、タンパク質情報などが挙げられる。核酸情報として、例えば、ゲノム情報、ゲノム修飾情報、トランスクリプトーム情報（発現量および配列の情報を含む）、ＲＩＰシークエンシング情報、マイクロＲＮＡの情報（発現量および配列の情報を含む）が挙げられる。
　追加で使用することができる修飾に関連するタンパク質のモチーフ情報として、修飾を付加する酵素の認識モチーフ情報、修飾を除去する酵素の認識モチーフ情報、および修飾に結合するタンパク質の認識モチーフ情報が挙げられ、具体的には、メチル化酵素（例えば、Ｍｅｔｔｌ３、Ｍｅｔｔｌ１４、Ｗｔａｐ）、脱メチル化酵素（例えば、ＦＴＯ、ＡｌｋＢＨ５）およびメチル化認識酵素（例えば、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ３などのＹＴＨドメインを持つファミリー分子）などのモチーフ情報が挙げられる。
　追加で使用することができる他の対象から取得したＲＮＡ修飾に関する情報として、例えば、あるがんの転移／原発性に関連する状態の対象におけるＲＮＡ修飾情報、修飾に関連するタンパク質の発現について遺伝子操作された生物におけるＲＮＡ修飾情報、薬物および／または処置が施されたがんの転移／原発性に関連する状態を有する対象におけるＲＮＡ修飾情報、ＲＮＡと結合する物質（タンパク質、脂質など）とＲＮＡとの複合体に関する情報（必要に応じて、さらにＲＮＡ修飾状態に関連した状態）が挙げられるが、これらに限定されない。
　（がん転移関連状態分析方法）
　一つの実施形態では、本開示は、対象における少なくとも１種類のＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）上の修飾（例えば、メチル化）情報を取得するステップと、該修飾情報に基づいて該対象の状態を分析するステップとを含む、対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析する方法を提供する。本開示のがんの転移／原発性に関連する状態を分析する方法は、例えば、適切な処置が異なり得る原発性腫瘍と転移性腫瘍とを区別可能であり得るため、適切な処置の選択および対象のがんの治癒などにおいて非常に有益であり得る。修飾情報は、対象に由来する試料を測定することで取得することができる。本開示のがんの転移／原発性に関連する状態を分析する方法は、取得しても対象への負荷が少ない液体生検（例えば、血液、尿、唾液）などの試料を使用して実施すること可能である。一つの実施形態では、分析は、試料を取得した後短期間で（例えば、１日以内、１０時間以内、５時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、１５分以内など）測定を行うオンサイト分析である。一つの実施形態では、オンサイト分析の分析結果は、試料の取得から短期間で（例えば、１日以内、１０時間以内、５時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、１５分以内など）出力される。一つの実施形態では、試料を取得した後、試料が測定器および／または分析器のある場所に送達されて、そこで分析が実施される。試料の取得は対象自身が行なってもよい。一つの実施形態では、取得した試料は凍結して送達される。分析結果は、送達元に伝えられてもよいし、インターネット上のサイトにアクセスすることで利用可能であってもよい。
　例えば、病院などの医療機関において本開示の方法を実施する場合には、対象（例えば、がんの転移／原発性に関連する状態の危険性のある被験者など）から試料（例えば、血液、摘出器官など）を取得し、この試料を処理して目的のＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）を精製し、この目的のＲＮＡの修飾情報を同定する。このように同定したＲＮＡの修飾情報に基づいて、対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析することができる。一度取得したＲＮＡの修飾情報は、他の対象のがんの転移／原発性に関連する状態の分析に使用してもよいし、同じ対象の別の時点におけるがんの転移／原発性に関連する状態の分析に使用してもよいし、データベースに蓄積してもよい。
　例えば、製薬会社などの研究機関において本開示の方法を実施する場合には、対象から取得した試料（例えば、実験動物の組織または器官、臨床試料、培養細胞など）を処理して目的のＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）を精製し、この目的のＲＮＡの修飾情報を同定する。このように同定したＲＮＡの修飾情報を、他の分析により確認した同じ対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）と関連付けて情報を蓄積することができる。このように取得したＲＮＡの修飾情報に基づいて、対象のがんの転移／原発性に関連する状態に適当に適用できる薬物を決定することができる。
　（プログラム）
　１つの局面において、本開示は、ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析する方法をコンピュータに実装させるプログラムを提供する。このプログラムが実装する方法は：（ａ）対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を、該ＲＮＡの参照修飾情報と比較するステップ；および（ｂ）該比較するステップの出力結果に基づいて該対象の該状態を判定するステップ、を包含する。一つの実施形態では、参照修飾情報は、前記対象とは異なる対象における前記ＲＮＡ上の修飾情報を含む。一つの実施形態では、参照修飾情報は、前記修飾情報とは別の時点で取得された前記対象における前記ＲＮＡ上の修飾情報を含む。
　１つの局面において、本開示は、ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納する記録媒体を提供する。この記録媒体が格納するプログラムが実行する方法は：（ａ）対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を、該ＲＮＡの参照修飾情報と比較するステップ；および（ｂ）該比較するステップの出力結果に基づいて該対象の該状態を判定するステップ、を包含する。一つの実施形態では、参照修飾情報は、前記対象とは異なる対象における前記ＲＮＡ上の修飾情報を含む。一つの実施形態では、参照修飾情報は、前記修飾情報とは別の時点で取得された前記対象における前記ＲＮＡ上の修飾情報を含む。
　（システム）
　１つの局面において、本開示は、ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析するシステムを提供する。システムは：（ａ）ＲＮＡを測定する測定部；（ｂ）該測定の結果に基づいてＲＮＡ上の修飾状態を計算する計算部；および（ｃ）該修飾状態に基づいて該対象の状態を分析する分析部、を包含する。一つの実施形態では、システムは試料を処理して目的のＲＮＡを精製する試料処理部をさらに含む。特に、目的のＲＮＡが低濃度で含まれる液体生検（例えば、血液、尿、唾液）などの試料からＲＮＡを濃縮するための試料処理部が好適に含まれ得る。本開示のシステム（装置であってもよい）は、対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を取得する修飾情報取得部と、該修飾情報に基づいて該対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態を分析する分析部とを含む形態であってもよい。ＲＮＡ上の修飾情報は種々の測定装置（測定部）によって入手可能である。
　したがって、別の局面では、本開示は、対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を取得するステップと、該修飾情報に基づいて該対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態を分析するステップとを含む、対象の状態を分析する方法をコンピュータに実行させる指示を含むプログラム、およびそのようなプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。記録媒体としては、例えば、フロッピーディスク（ＦＤ）、ＨＤＤ（ハードディスクドライブ）、ＳＳＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ＣＤ－Ｒ、ＭＯ、ＤＶＤ、ＵＳＢメモリ、フラッシュメモリなどであってもよく、クラウド上にあってもよい。
　測定部は、ＲＮＡの修飾情報を提供する機能および配置を有する限り、どのような構成をとっていてもよい。計算部や分析部とは同一または異なる構造物として提供され得る。一つの実施形態では、測定部は、質量分析計（例えば、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）である。一つの実施形態では、測定部は、シークエンシング装置である。
　計算部は、測定データに基づいてＲＮＡ上の修飾状態（例えば、修飾位置、修飾の量など）を同定する。
　分析部は、得られたＲＮＡ修飾情報に基づいて、対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を分析する。一つの実施形態では、分析は、さらに上記の追加情報を参照して実施されてもよい。
　図１７の機能ブロック図を参照して、本開示のシステムの構成を説明する。なお、本図においては、単一のシステムで実現した場合を示しているが、複数のシステムで実現される場合も本開示の範囲に包含されることが理解される。このシステムで実現される方法は、プログラムとして記載することができる。このようなプログラムは記録媒体に記録することができ、方法として実現することができる。
　本開示のシステム１０００は、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵ１００１にシステムバス１０２０を介してＲＡＭ１００３、ＲＯＭ、ＳＳＤやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置１００５及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）１０２５が接続されて構成される。入出力Ｉ／Ｆ１０２５には、キーボードやマウスなどの入力装置１００９、ディスプレイなどの出力装置１００７、及びモデムなどの通信デバイス１０１１がそれぞれ接続されている。外部記憶装置１００５は、情報データベース格納部１０３０とプログラム格納部１０４０とを備えている。何れも、外部記憶装置１００５内に確保された一定の記憶領域である。
　このようなハードウェア構成において、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムがＣＰＵ１００１によってＲＡＭ１００３上に呼び出されて展開され実行されることで、ＯＳ（オペレーションシステム）と協働して本開示の機能を奏するようになっている。もちろん、このような協働する場合以外の仕組みでも本明細書に記載の方法を実装することは可能である。
　本開示の実装において、ＲＮＡ試料の測定（例えば、質量分析および／またはシークエンシング）を行ってＲＮＡ修飾データを得た場合、この測定を行って得られたＲＮＡ修飾データまたはこれと同等の情報（例えば、シミュレーションを行って得られたデータ）は、入力装置１００９を介して入力され、あるいは、通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介して入力されるか、あるいは、データベース格納部１０３０に格納されたものであってもよい。該ＲＮＡ試料の測定（例えば、質量分析および／またはシークエンシング）を行ってＲＮＡ修飾データを得て、該ＲＮＡ修飾データを分析するステップは、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この外部記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。このような分析を行うソフトウェアは、実施例に例示されるものを使用してよいが、これに限定されず、当該分野で公知の任意のソフトウェアを利用することができる。分析が行われたデータは、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。
　データベース格納部１０３０には、これらのデータや計算結果、もしくは通信デバイス１０１１等を介して取得した情報が随時書き込まれ、更新される。各入力配列セット中の各々の配列、参照データベースの各ＲＮＡ情報ＩＤ等の情報を各マスタテーブルで管理することにより、蓄積対象となる試料に帰属する情報を、各マスタテーブルにおいて定義されたＩＤにより管理することが可能となる。
　データベース格納部１０３０には、上記計算結果が、同じ試料から得られた別の核酸情報などの各種情報、がんの転移／原発性に関連する状態に関する既知の情報と関連付けて格納されてもよい。このような関連付けは、ネットワーク（インターネット、イントラネット等）を通じて入手可能なデータをそのまままたはネットワークのリンクとしてなされてもよい。
　また、プログラム格納部１０４０に格納されるコンピュータプログラムは、上記した処理システム、例えば、データ提供、修飾状態の分析、参照データとの比較、分類、クラスタリング、その他の処理等を実施するシステムとしてコンピュータを構成するものである。これらの各機能は、それぞれが独立したコンピュータプログラムやそのモジュール、ルーチンなどであり、上記ＣＰＵ１００１によって実行されることでコンピュータを各システムや装置として構成させるものである。
　（試薬）
　一つの実施形態では、本開示は、ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を判定するために、修飾が該状態と関連するＲＮＡを精製するための組成物であって、該対象における少なくとも１種類のＲＮＡを捕捉するための手段を含む、組成物を提供する。ここで、少なくとも１種類のＲＮＡは、当該ＲＮＡの修飾を測定することでがんの転移／原発性に関連する状態を分析することができるＲＮＡを少なくとも１種類含む。一つの実施形態では、捕捉するための手段は目的のＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な核酸を含む。一つの実施形態では、捕捉するための手段は修飾されたＲＮＡを捕捉するための手段（例えば、修飾特異的な抗体など）を含む。一つの実施形態では、捕捉するための手段は修飾された目的のＲＮＡに特異的な分子を含む。一つの実施形態では、捕捉するための手段は、精製するための部分（例えば、磁気を帯びていてもよい担体、相互に結合可能なペアの一方（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン））を含む。一つの実施形態では、捕捉するための手段は、精製するための部分に連結されたリンカーを含む。
　（プレート、チップ）
　一つの実施形態では、本開示は、少なくとも１種類のＲＮＡの修飾情報に基づいて対象のがんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を判定するためのプレートまたはチップを提供し、プレートまたはチップの表面には、該ＲＮＡを捕捉するための手段が配置されている。ここで、少なくとも１種類のＲＮＡは、当該ＲＮＡの修飾を測定することでがんの転移／原発性に関連する状態を分析することができるＲＮＡを少なくとも１種類含む。一つの実施形態では、このプレートまたはチップはＭＡＬＤＩ測定用である。一つの実施形態では、このプレートまたはチップは複数のスポットを有し、各スポットには、それぞれ異なる配列を有するＲＮＡを捕捉する手段が配置されている。一つの実施形態では、各スポットの大きさは、例えば、直径１０μｍ～１００μｍであり得る。一つの実施形態では、１つのプレートまたはチップ上に、１、２、３、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００または３０００のスポットが形成され得る。一つの実施形態では、各スポットには、１０７以上の捕捉する手段が配置され得る。一つの実施形態では、捕捉する手段は目的のＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な核酸である。プレートまたはチップの基材としては、限定されないが、例えば、導電性を付与したガラス及びプラスチック（ポリエチレン）等が挙げられる。
　異なるスポット同士が互いに近接している場合、スポットに含まれるＲＮＡをＭＡＬＤＩなどによってイオン化するためにスポットにレーザーを照射すると目的のスポットの周囲の他のスポットにもレーザーが照射され得る。その結果、質量分析による断片化測定において、近接するスポットに由来するシグナルによる干渉が生じ、目的のスポットの計測値に影響が生じ得る。そのため、一つの実施形態では、プレートまたはチップ上のスポットは、シグナル間の干渉の影響を低減または最小化するように配置され得る。一つの実施形態では、シグナル間の干渉の影響は、各スポットに配置する各ＲＮＡの断片化（実測による結果に基づいてもよいし、理論に基づいてもよい）によって生じるｍ／ｚの値の間の重なりおよび／または差に基づいて評価される。このとき、各ＲＮＡの断片化によって生じるｍ／ｚの値は、修飾の存在による質量数の増減が考慮されてもよいし、考慮されなくてもよい。一つの実施形態では、プレートまたはチップ上のスポットは、モンテカルロ法などの数理的統計的手法に基づいて配置される。
　（キット）
　一つの実施形態では、本開示は、ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象がんの転移／原発性に関連する状態（例えば、対象が転移性のがんを有するかどうか、がんが原発性であるかどうか）を判定するためのキットであって、目的のＲＮＡを精製するための組成物、目的のＲＮＡを捕捉する手段が配置されたプレートまたはチップ、および該対象から試料を取得するためのデバイスのうち少なくとも１つと、キットを使用するための説明書とを含む、キットを提供する。一つの実施形態では、キットは、試料からＲＮＡを精製するための手段を含む。一つの実施形態では、キットは、対象から液体生検（例えば、血液、尿、唾液）を取得するためのデバイス（例えば、採血シリンジ）を含む。
　一つの実施形態では、キットは、試料をＭＡＬＤＩ測定に適応するように処理するためのものである。一つの実施形態では、キットは、ＭＡＬＤＩ測定において使用するための塗布剤（例えば、３-ヒドロキシピコリン酸を含む）をさらに含む。
　一つの実施形態では、キットは、対象から試料を取得するためのものである。一つの実施形態では、対象から試料を取得するためのデバイスを含むキットは、試料の送付先が記載された説明書を含む。一つの実施形態では、キットは、採取した試料を凍結保存するための手段を含む。一つの実施形態では、キットは、対象から血液、粘膜表皮（例えば、口腔、鼻腔、耳腔、膣などにおけるもの）、皮膚表皮、生体分泌液（例えば、唾液、鼻水、汗、涙、尿、胆汁など）を取得するためのデバイス（例えば、採血シリンジ）を含む。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Current　Protocols　in　Molecular　Biology（http://onlinelibrary.wiley.com/book/10.1002/0471142727）およびMolecular　Cloning:　A　Laboratory　Manual　(Fourth　Edition)（http://www.molecularcloning.com）などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　以下に実施例を記載する。
　試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Sigma－Aldrich、和光純薬、ナカライ、R&D　Systems、USCN　Life　Science　INC等）の同等品でも代用可能である。
　（略号）
　本明細書において説明した略称の他、以下の略称も用いる。
３－ＨＰＡ（３－ヒドロキシピコリン酸）
ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）
　以下の実施例では、ＲＮＡのメチル化の検出は、以下のマイクロＲＮＡ上のメチル化を例として用いて実施した（表中、下線はメチル化を示す。）。これ以外のＲＮＡの誘導についても同様の分析が可能であると当業者は理解する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
・共通プロトコル
　本明細書において使用した標準的なプロトコルを以下に例示する。
　（ＲＮＡ抽出）
　試料から全ＲＮＡを抽出するときには、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）を説明書通りに使用した。
　（目的ＲＮＡの精製）
　特定のＲＮＡの精製には、それぞれのＲＮＡと相補的なオリゴＤＮＡを使用した。
　本明細書では、以下の表のヒトｍｉＲＮＡについてそれぞれ相補的なオリゴＤＮＡを設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　これらの標的ＲＮＡと相補的なＤＮＡ（捕捉オリゴＤＮＡ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　これらの捕捉オリゴＤＮＡが目的のＲＮＡ以外のＲＮＡとハイブリダイゼーションを起こす可能性が低いことを公知の配列データベースと照合することで確認した。
　（直接結合ビーズ）
　直接結合ビーズは以下のように作製した。上記捕捉オリゴＤＮＡの５’端のリン酸部分に６－アミノヘキシル基を導入した。それぞれの修飾捕捉オリゴＤＮＡを、２価のアミノクロスリンカー（ＢＳ３、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート）によって表面にアミノ基が共有結合した磁気ビーズ（Dynabeads　M270　Amine、サーモフィッシャーサイエンティフィック、東京）と連結させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　（ストレプトアビジン結合ビーズ）
　別のタイプのビーズも作製した。上記捕捉オリゴＤＮＡの５’端のリン酸部分にビオチンを導入した。表面にストレプトアビジンが共有結合している磁気ビーズ（Dynabeads　M270　Streptoavidin、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を、上記のビオチン化した捕捉オリゴＤＮＡと混合してアビジン－ビオチン結合を生じさせて、捕捉オリゴＤＮＡを磁気ビーズ上に固定した。
　また、ビオチン化した捕捉オリゴＤＮＡを目的のＲＮＡとハイブリダイズさせた後に磁気ビーズで精製するプロトコルも使用した。
　（直接結合ビーズのための精製プロトコル）
　このプロトコルは、J.Engbergら、Eur.J.Biochem,41,321-328(1974)の方法を改変したものである。
　複数種類の捕捉オリゴＤＮＡを使用する場合、試料を分割して、それぞれの分割試料に対して１種類の捕捉オリゴＤＮＡを使用した。
　具体的には、以下の通りである。
１．　試料に、上記捕捉オリゴＤＮＡ結合ビーズのうちの１種類と、６ｘＳＳＰＥ（０．９Ｍ　ＮａＣｌ、６０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、７．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）１０ｍＬを添加した。
２．　変性液Ｄ（４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸（ｐＨ７．０）、０．５％サルコシン、０．１Ｍ　２－メルカプトエタノール）５ｍＬを加えた（グアニジンチオシアネートの終濃度は１．２５Ｍ）。
３．　６０℃で１０分間加熱した後、室温で４５分旋回させた。
４．　磁石スタンドを使用して上清を除き、ビーズをBW　Buffer（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２．０Ｍ　ＮａＣｌ）１ｍＬで４回、Volatile　Rinse　Buffer（１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０）１ｍＬで２回洗浄した。
５．　洗浄液を完全に除いた後、ビーズに、１００μＬのRNase　free　SDWを加えて７０℃で３分間加熱した後、氷上で急冷し、上清を回収した。
６．　濃度が低い場合には、上清を凍結乾燥した。
　（ストレプトアビジン結合ビーズのための精製プロトコル）
　複数種類の捕捉オリゴＤＮＡを使用する場合、試料を分割して、それぞれの分割試料に対して１種類の捕捉オリゴＤＮＡを使用した。
１．　精製ＲＮＡに塩類溶液および上記ビオチン化捕捉オリゴＤＮＡを添加して終濃度１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ　ＫＣｌとした。
２．　混合物をＰＣＲ装置にセットして、９０℃で１分間変性させ、４５℃まで徐冷してアニーリングさせた。
３．　アビジン磁気ビーズ（Dynabeads　M-280　Streptavidin）を添加した。
４．　磁気スタンド上で非吸着画分（上清）を破棄した。
５．　１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、５０ｍＭ　ＫＣｌを用いて磁気スタンド上でビーズを３回洗浄した。
６．　１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）を用いて磁気スタンド上でビーズを３回洗浄した後、RNase　free　waterを用いて溶出した。
７．　濃度が低い場合には、上清を凍結乾燥した。
　（精製ＲＮＡの質量分析測定）
　ＲＮＡ試料は、必要に応じてZip　Tip　C18（ミリポア）を使用して精製した。
　アセトニトリル：０．１％　ＴＦＡ水溶液＝１：１の溶液に３－ＨＰＡ（３－ヒドロキシピコリン酸）を１０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、この溶液と１０ｍｇ／ｍＬのＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）水溶液とを１：１の比で混合した混合液１μＬをＭＡＬＤＩ用マトリクス（塗布剤）としてターゲットプレート（Target　Plate　MTP　Anchor　Chip　384(600micrometer）、Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）に塗布し乾燥させた。
この同じ位置に１μＬの精製したＲＮＡ水溶液を重層して乾燥させた。完全な乾燥を確認した後、ＭＡＬＤＩ型質量分析計（ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計、Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ社製）にて質量分析を行った。
　ＭＡＬＤＩの装置設定は以下の通りであった。
ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｍｏｄｅ（陽イオン検出モード）
ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ－ｍｏｄｅ（反射モード）
Ｌａｓｅｒ　Ｐｏｗｅｒ　Ｍａｘ（設定可能な最大の出力）
　（質量分析計による測定結果の分析）
　ＭＡＬＤＩで得られた測定結果の分析は以下のように行った。
　予想される質量のリストを、miRBase(Release　21)（http://www.mirbase.org）から取得したマイクロＲＮＡの配列情報に基づいて作成し、測定で得られたマススペクトログラムと比較してマニュアルで配列および修飾を特定した。
　（ＲＩＰシークエンシング測定）
　ＲＩＰシークエンシングは、以下のプロトコルに従って実施した。
　１ｍｌの血清につき２ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン）を使用して、ＲＮＡが回収できる。
使用した試薬等
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　（Ａ）ｐｌｏｙＡ　ＲＮＡの精製
　Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）（タカラバイオ）キットのプロトコルに従いｐｌｏｙＡ精製を行った。
　＊抽出は７５℃のＤＷ　３０μＬで３回行い、合計９０μＬを回収した。
　＊全ＲＮＡから１～３％のｐｏｌｙＡ　ＲＮＡが得られる。
　＊１サンプルにつき、ｐｏｌｙＡ　ＲＮＡ　５μｇが必要。
　（Ｂ）ＲＮＡ断片化
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
１．　ＲＮＡを７５０ｎｇ／１８μＬに調節する。
２．　ＲＮＡ　７５０ｎｇ／１８μＬ＋１０ＸFragmentation　Buffer　２μＬの合計２０μＬを８連チューブの各ウェルに分けた。
３．　９０℃で２分間インキュベーションした。
４．　２０μＬの反応液に、素早くＥＤＴＡ（０．５Ｍ）２μＬを入れ、反応を止めた。５．　反応液をサンプル毎に集め、エタノール沈殿を行った。
　例：ＲＮＡ　２００μＬ
　　　＋３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μＬ（ＲＮＡの１／１０量）
　　　＋グリコーゲン（２０ｍｇ／ｍｌストック）３．６μＬ　（２００倍）
　　　＋１００％エタノール５００μＬ　　　　　　　（ＲＮＡの２．５倍）
６．　－８０℃で１時間インキュベーションした。
７．　遠心分離（１２０００Ｇ、３０分、４℃）
　　上清を除き、７５％エタノール１ｍを加えた。
　　遠心分離（１２０００Ｇ、１５分、４℃）
　　上清を除き、２００μＬのRNAse　free　waterで溶解した。
８．　各サンプル１０μＬをＩＮＰＵＴとして－８０℃で保存した。
　（Ｃ）ＲＮＡ抗体複合体の形成
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
以上を混合し、ローテーションしながら4℃で２時間インキュベーションした。
　（Ｄ）磁気ビーズによる免疫沈降
１．　Dynabeads　ProteinG（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を１サンプル
につき５０μＬ使用し、１ｘIP　Buffer　１ｍｌで２回洗浄した。
２．　磁気で分離したビーズに１ｘIP　Buffer　１ｍｌ＋ＲＶＣ　１０μＬ＋RNAse　inhibitor　１μＬ＋ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）５０μＬを加え、ローテーションしながら４℃で２時間インキュベーションした（ビーズの非特異的結合の抑制）。
３．　ビーズを、１ＸIP　Buffer　１ｍｌ＋ＲＶＣ　１０μＬ＋RNAse　inhibitor　１μＬで２回洗浄した。
４．　サンプル毎に分け、磁気で分離したビーズにステップ（Ｃ）の反応液を加え、ローテーションしながら４℃で２時間（または一晩）インキュベートした。
　（Ｅ）溶出
１．　洗浄バッファー（１ＸIP　Buffer　１０ｍｌ＋ＲＶＣ　１０μＬ＋RNAse　inhibitor　５μＬ）で、ステップ（Ｄ）のビーズを３回洗浄した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
２．　Elution　bufferを１サンプルにつき１００μＬ加え、１５分毎にボーテックスしながら、４℃で２時間インキュベートした。
３．　ビーズを磁気分離し、上清を回収した。
４．　ビーズにさらに、（１ＸIP　Buffer　１ｍｌ＋ＲＶＣ　１０μＬ＋RNAse　inhibitor　１μＬ）から１００μＬを加えてタッピングし、ビーズを磁気分離し、上清を回収した。
５．　上の５～７のステップを繰り返し、上清を回収し、２回分を合わせた。
６．　上清４００μＬ＋酢酸ナトリウム４０μＬ＋１００％エタノール１０００μＬを混合し、エタノール沈殿を行った。（グリコーゲンなどのキャリアは加えない）
７．　－８０℃で一晩静置した。
８．　遠心分離（１２０００Ｇ、３０分、４℃）
　　　上清を除き、７５％エタノール１ｍｌを加えた。
　　　遠心分離（１２０００Ｇ、１５分、４℃）
９．　ペレットを１５μＬのRNAse　free　waterで溶解した。
ステップ（Ｂ）の８のＩＮＰＵＴとともにシークエンシングに供した。
　シークエンシングはHi-seq（2000　Ilumina）を使用して実施した。
　ＲＩＰシークエンシングで得られたデータを分析するプロトコルを以下に示す（Ｌｉｎｕｘ（登録商標）／Ｒ）。
　（ｆａｓｔｑファイルからピークの検出まで）
　ＳＲＡ　Ｔｏｏｌｋｉｔ、ｂｏｗｔｉｅ、ｓａｍｔｏｏｌｓ、ｍａｃｓをインストールし、ｈｇ１９のアノテーションファイルをダウンロードした（ＤＲＹ解析教本（秀潤社）などを参照）。
　データのクオリティチェックを行い、ＩＰ、ＩＮＰＵＴのデータをまとめた。例えば、免疫沈降サンプル（ＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３：３つのレプリケート）と、それに対応するＩＮＰＵＴ（ＩＮＰＵＴ１、ＩＮＰＵＴ２、ＩＮＰＵＴ３）があった場合には以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
　ｆａｓｔｑファイルをｂｏｗｔｉｅでマッピングし、ｓａｍファイルを作成し、ｓａｍファイルからｂａｍファイルを作成した
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000015
　データを染色体順でソートし、インデックスをつけ、ｍａｃｓでピークを検出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000016
　（Ｒによるピークの分析）
　以下のパッケージを使用した。
(Guitar)
(MeTPeak)
(openxlsx)
(ChIPpeakAnno)
(BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19)
(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
(rGADEM)
(ChIPseeker)
　（１．ｍａｃｓの出力エクセルファイルからのｍｅｔａｇｅｎｅ　ｐｌｏｔ）
　ｈｇ１９から、トランスクリプトームの情報だけ取り出し、ｇｃ＿ｔｘｄｂに格納し、エクセルは読み込めない上部を削除して、ｘｌｓからｘｌｓｘに変換して保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
　倍数変化が４倍以上かつＦＤＲ５％以下のものを有意なピークとして抽出し、ファイルをＧｒａｎｇｅｓファイルに変更した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
　Ｇｒａｎｇｅｓファイルをつなげてリスト化し、リストの各要素に名前をつけた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
　（２．モチーフ検索）
　サミットから前後５０塩基、合計１００塩基を抽出し、モチーフ検索に供し、ＦＤＲの低い方から１０００個を選択した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000020
　ファイルをＧｒａｎｇｅｓファイルに変更した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000021
　ＣｈＩＰｐｅａｋＡｎｎｏパッケージで配列を取得した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　（３．ピークがある遺伝子のアノテーションを得る）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000024
（４．ＭｅｔＰｅａｋ（ＲＩＰシークエンシングに特化した分析パッケージ）による分析）
　（Cuiら、Bioinformatics(2016)32(12):i378-i385を参照）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000025
　（実施例１）マイクロＲＮＡのメチル化分析
　本実施例では、マイクロＲＮＡのメチル化分析を行った。具体的には以下のとおりである。
　メチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００－ｃ－５ｐ（ヒト配列、配列番号９）をRNase　Free超純水に溶解し吸光度測定により濃度を確認し、１ｐｍｏｌ／μＬに調整した。このマイクロＲＮＡ水溶液１μＬを使用し、上記のプロトコルに従いＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行った。内部配列確認のためアンモニア処理によるＲＮＡ分解（５’→３’）を行った。また、観測されたプリカーサーイオンに対して、in　source　decay（インソース分解、ＩＳＤ）を用いた測定を実施した（図１）。
　以上のように、適当な質量分析法とＲＮＡ精製を組み合わせて、ＲＮＡ修飾を分析可能であることが確認された。
　（実施例２：ＲＮＡ修飾を用いた遺伝子のノックダウン分析）
　本実施例では、ＲＮＡ修飾を用いて遺伝子のノックダウン分析をしうるかどうかを分析した。
　（実施例２－１）Ｍｅｔｔｌ３のノックダウンがＲＮＡ修飾に及ぼす影響
　本実施例では、ＲＮＡ修飾を用いて遺伝子のノックダウン分析をしうるかどうかを分析した。ヒト膵臓腺癌細胞株ＭＩＡ　ＰａＣａ－２細胞を、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを使用した標準的な方法で処理してＭｅｔｔｌ３ノックダウン細胞株を作製した（Kosuke　Taketoら、Int　J　Oncol.2018　Feb;52(2):621-629を参照のこと）。その後、ＲＩＰシークエンシングを行った。
　（実施例２－２）転移モデルマウスの作製
　発明者らは、以下に示すＷＴｇマウスが転移の評価に有用であることを見出した。
　ＥＬ１マウスとＭＥＴＴＬ３Ｔｇマウスとを交配させてＷＴｇマウスを作製した。
　ＥＬ１マウスは、膵がん自然発がんモデルマウスであり、ＦＶＢ／Ｎ－Ｔｇ（Ｃｅｌａ１－Ｌｕｃ，　Ｃｅｌａ１－Ｔａｇ）１１６ＸｅｎマウスをＴａｃｏｎｉｃ社より購入した。ＭＥＴＴＬ３Ｔｇマウスは以下のように作製した。マウスのＭｅｔｔｌ３遺伝子をCAG発現ベクターに組み込み、これをＢＬ６マウスの受精卵に注入して仮親の子宮に移植してＭｅｔｔｌ３遺伝子の過剰発現マウスを作製した。このように作製したＭｅｔｔｌ３遺伝子過剰発現マウスと、ＥＬ１マウスとを通常の方法で交配させてダブルトランスジェニック（ＷＴｇ）マウスを作製した。その後、PCRなどによってこのＷＴｇマウスに、目的の遺伝子が組み込まれていることを確認した。各マウス１６匹を、通常の動物実験施設において１ケージあたり４匹ずつＳＰＦ環境下で飼育し、これを試験に用いた。解剖時はイソフルランを吸引させ、麻酔をかけた状態で腹部を切開し、観察を行った。
　ＷＴｇマウスおよびＥＬ１マウスでは腫瘍が自然発生的に生じるが、これらのマウスについて生存を観察した（図２）。写真（図３）は、２０週齢時点でのそれぞれのマウスから摘出した膵臓を示す（左：ＥＬ１マウス、右：ＷＴｇマウス）。ＷＴｇマウスでは、腫瘍の増殖がより速く、マウスの生存率が低かった。
　Ｍｅｔｔｌ３はＲＮＡメチル化酵素であるが、これらの結果から、１）ＲＮＡ修飾（エピトランスクリプトーム）はがんの発症・進行において重要な役割を果たすこと、２）がんへの寄与が大きいと従来考えられていた遺伝子（Ｐ５３、ＲＢ）における変化よりも、ＲＮＡ修飾の変化がより大きくがんに影響を及ぼすことが明らかとなった。
　さらに、ＷＴｇマウスでは腫瘍が転移を起こしていることが分かった。ＥＬ１マウスおよびＷＴｇ）マウスの解剖写真（図４）および摘出した肝臓の写真（図５）を示す。ＭＥＴＴＬ３Ｔｇマウスでは腫瘍の発生は見られず、ＥＬ１マウスでは、膵臓に腫瘍発生が見られたものの肝臓は正常であった。ＷＴｇマウスでは、膵臓に腫瘍発生が見られ、さらに肝臓において膵臓から転移したと考えられる腫瘍の発生が見られた。これらの知見から、ＲＮＡメチル化（ｍ６Ａ）の亢進は細胞の浸潤・転移に関与すると考えられる。
　（実施例３）転移によるＲＮＡの変動
　ＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスについて、全ＲＮＡの発現およびメチル化を分析した。
　ＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスにおける膵臓の腫瘍（約１ｇ）から全ＲＮＡを抽出し、分析のために使用した。
　ＲＮＡ－ｓｅｑのために、Ｉｓｏｇｅｎ（日本ジーン、東京）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ＲＩＰ－Ｓｅｑのためには、ｍ６Ａ抗体（ＭＢＬ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国、マサツーセッツ）を用いて免疫沈降した後、Ｉｓｏｇｅｎ（日本ジーン社）を使用してＲＮＡを抽出した。シークエンスのためのRNAライブラリーを、TruSeq　Stranded　Total　RNA　with　Ribo-Zero　kit(Illumina、米国、カリフォルニア)で作成した。シークエンシングはHiSeq　2500　platform(Illumina)を使用して実施した。その後、FASTX-toolkit,TopHat2(https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)のソフトウエアを使用してシークエンスの解析を行った。
　その結果、ＷＴｇマウスのＲＩＰ－ｓｅｑデータに基づいて、メチル化が起こる特徴的な生体経路として以下の表に示す経路が濃縮された。表中、上の生体経路ほどスコアが高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　この表において、「Extracellular　matrix　organization」、「collagen　catabolic　process」、「NABA　MATRISOME　ASSOCIATED」、「skeletal　system　development」、「Elastic　fibre　formation」、「positive　regulation　of　cell　adhesion」、「Crosslinking　of　collagen　fibrils」および「cell-cell　adhesion」の群（図６の●）は、細胞外マトリクスに関連する。また、「Interleukin-4　and　13　signaling」、「PID　AMB2　NEUTROPHILS　PATHWAY」および「lymphocyte　chemotaxis」の群（図６の〇）は、免疫に関連する。
　ＷＴｇマウスにおいてメチル化の亢進が見られた細胞外マトリクスまたは免疫に関連する遺伝子を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　また、ＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスのＲＮＡ－ｓｅｑデータをCibrsort(https://cibersort.stanford.edu/)で解析した（図７）。その結果、ＷＴｇマウスにおいて免疫系が抑制されていることが分かった。
（実施例４）転移とＰＤＬ１との関係
　ＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスのＲＮＡ－ｓｅｑデータおよびＲＩＰ－ｓｅｑデータからＰＤＬ１の結果を抽出した（図８、上段）。ＷＴｇマウスのＰＤＬ１遺伝子の３’ＵＴＲ領域は高度にメチル化されていることが分かった。
　また、ＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスの膵臓がんの組織からタンパク質を抽出し、Mini－PROTEAN　TGX　Precast　Gels　Bio　Rad（Bio-Rad、米国、カリフォルニア）で、ＰＤＬ１タンパク質をウェスタンブロットによって検出した。一次抗体には、抗ＰＤＬ１抗体（ａｂ８０２７６）（Ａｂｃａｍ、米国）を使用した。ＷＴｇマウスでは、ＰＤＬ１タンパク質の発現も向上していた。
　次に、ＷＴｇマウスに対する抗ＰＤＬ１抗体の治療効果を試験した。ユニーテック(千
葉)で作製したＭＥＴＴＬ３　Ｔｇ／ＥＬ－ＳＶ４０　Ｔｇマウスを約７週齢時に動物実
験専用飼育室へ搬入し、健康状態を確認するため、一般状態観察と体重測定を行った。試験スケジュールに従って雄では約８～約２０週齢で、雌では約８～約２２週齢で体重を測定した。試験スケジュールに従って約１０～約１７週齢の間ＰＤＬ１抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ　抗マウスＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）（Ｂｉｏ　Ｘ　Ｃｅｌｌ、ボストン））または生理食塩水（大塚生食注（大塚製薬、東京））を投与した。ＰＤＬ１抗体（処置群）は２００μＬ／匹の量で投与し、生理食塩水（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）はを１０ｍｌ／ｋｇの量で投与した。各群３匹のマウスを実験に使用した。
　処置群およびＶｅｈｉｃｌｅ群のマウスを解剖し、原発腫瘍である膵臓腫瘍と、Ｖｅｈｉｃｌｅ群において見出された転移性の肝臓腫瘍を摘出した。その結果、抗ＰＤＬ１抗体による顕著な原発腫瘍および転移腫瘍の抑制効果が観察された（図９）。
　ＰＤＬ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲのメチル化の亢進を引き起こすのはメチル化酵素ＭＥＴＴＬ３であり、この酵素は、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｌｅｔ７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐのメチル化率も上昇させる。以下の実施例に示されるようなｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｌｅｔ７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐのメチル化率の上昇が確認された場合には、同じ酵素によってＰＤＬ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲのメチル化も上昇すると予測される。このようにして、ｍｉＲＮＡのメチル化の上昇を確認することでもＰＤＬ１の発現レベルを予測可能であり、合わせて治療効果も予測可能である。
（実施例５）転移関連ｍｉＲＮＡ修飾
　上記転移マウスモデルを使用して、ｍｉＲＮＡの修飾状態を調べた。
　具体的には、実施例２で示したＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスについて以下の実験を行った。２０週齢前後のそれぞれ３匹のマウスから腫瘍および転移巣を摘出する直前に下大静脈から約１ｍＬ採血した。この血液を１０，０００Ｇ、１０分、４℃で遠心分離することで血清を取得した。この血清から共通プロトコルの通り、ｍｉＲＮＡを濃縮し、ＲＮＡ－Ｓｅｑおよび抗ｍ６Ａ抗体を使用したＲＩＰシークエンシングを実施した。
　以下の表に示すｍｉＲＮＡは、ＷＴｇマウスのみでメチル化が検出され、ＥＬ１マウスではメチル化が検出されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　以下の表に示すｍｉＲＮＡは、ＥＬ１マウスに対するＷＴｇマウスのメチル化率の比[（ＷＴｇマウスメチル化率／ＷＴｇマウス発現量）／（ＥＬ１マウスメチル化率／ＥＬ１マウス発現量）]が、２以上であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　同様に、実施例２で示したＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスから腫瘍を摘出し、この腫瘍からＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン、東京）により抽出し、抗ｍ６Ａ抗体（ＭＢＬ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国、マサチューセッツ）を使用したＲＩＰシークエンシングを実施した。
　以下の表に示すｍｉＲＮＡは、ＥＬ１マウスに対するＷＴｇマウスのメチル化率の比[（ＷＴｇマウスメチル化率／ＷＴｇマウス発現量）／（ＥＬ１マウスメチル化率／ＥＬ１マウス発現量）]が、１．５以上であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　実施例２に示したように、ＥＬ１マウスではがん転移は観察されず（原発巣のみ）、他方、ＷＴｇマウスではがん転移が観察されたため（原発巣＋転移巣）、ＷＴｇマウスのみでメチル化が検出されたまたはＷＴｇマウスにおいてメチル化が向上していたｍｉＲＮＡは、がんの原発性を示す指標となり得る。また、あるがんにおいてこれらのｍｉＲＮＡのメチル化が低度または検出不可であることは、そのがんが転移性であることを示す指標となり得る。なお、これらのｍｉＲＮＡのターゲットを探索したところ、Ｔｅｆ、Ｈｓｐａ５、Ｂａｃｈ１、Ｈｏｘｃ１など転移に関連する遺伝子がターゲットとなっていることが分かった。
　ｍｉＲＮＡはターゲットとするｍＲＮＡに結合してｍＲＮＡの分解を促進する。一方で、メチル化されたｍｉＲＮＡはターゲットに対する結合能を失い、ｍＲＮＡを制御できなくなることが明らかになってきている。したがって、転移でメチル化が亢進しているマイクロＲＮＡは、転移を促進する働きを持つターゲットのｍＲＮＡを抑制できず転移が促進されると考えられる。
（実施例５Ａ）
　上記のＲＩＰシークエンシングで見出された候補マイクロＲＮＡが転移状態の判定に使用できるかどうかを試験した。
　実施例２で示したＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスの血清からＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン、東京）により抽出し、ｌｅｔ７ａ－５ｐに対する捕捉オリゴＤＮＡ（上記）を使用してｌｅｔ７ａ－５ｐを濃縮し、共通プロトコルの通り、質量分析によってのメチル化のレベルを分析した。
　結果を図９Ｂに示す。転移あり（ＷＴｇ）の試料と転移なし（ＥＬ１）の試料との間で、ｌｅｔ７ａ－５ｐのメチル化率は優位に差があった。このことから、マイクロＲＮＡのメチル化状態は、腫瘍転移の状態を良好に反映するものであり、腫瘍が転移を起こしているかどうかの優れた指標になることが予測される。
（実施例６）ヒトにおけるｍｉＲＮＡ修飾と転移との相関
　ヒト大腸がん患者からサンプルを取得して、４種類のｍｉＲＮＡ上のメチル化率を調べた。これらの患者は、大腸がんと診断され、原発腫瘍切除手術を受けた後、１から２年後までに転移が見出された。転移は肝臓およびリンパ節に見出された。Beforeは原発腫瘍切除前の患者から取得した血清サンプルである。Afterは、原発切除後１から２年後までの間で転移が見つかった際に取得した血清サンプルである。
　これらのBeforeおよびAfterのサンプルについて、共通プロトコルの通り、質量分析によってのメチル化のレベルを分析した（図１０）。同じ患者由来のBeforeおよびAfterを関連付けた。
　原発腫瘍を切除した患者の血清では、転移巣が存在していたにもかかわらず、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｌｅｔ７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐのメチル化率が低下していた。このことから、これらのｍｉＲＮＡのメチル化の上昇は、腫瘍が原発性であることおよび／または患者が原発性の腫瘍を有することを示す指標となり得る。また、あるがんにおいてこれらのｍｉＲＮＡのメチル化が低度または検出不可であることは、そのがんが転移性であることを示す指標となり得る。
　（実施例７：大腸がん）
　事前にインフォームド・コンセントを得たヒト患者よりステージ２～４の原発巣のみの大腸がん（３名）の組織検体を手術時に採取した。同時に、健常組織として悪性腫瘍領域から５ｃｍ以上離間した領域から組織検体を採取した。
　上記の捕捉１７－５ｐ、捕捉２１－５ｐ、捕捉２００ｃ－３ｐ、捕捉２００ｃ－５ｐおよび捕捉ｌｅｔ７ａ－５ｐを、ストレプトアビジン結合ビーズとして製した。上記組織検体試料からＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡを生成し、その後、ビーズを使用して標的ｍｉＲＮＡを精製し、ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）で測定した。
　その結果、これらのｍｉＲＮＡについて非メチル化ＲＮＡが観察されるとともに、表に示す位置でメチル化が起こっているＲＮＡも観察された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　これらのそれぞれのメチル化の根拠となるＭＳシグナルを正常組織と腫瘍組織との間で比較した（図１１～１３）。その結果、正常組織と腫瘍組織とでＲＮＡのメチル化状態に差があることが見出された。これらのシグナル強度に基づいて、対象の配列の各ＲＮＡの中のメチル化ＲＮＡの割合（％）を計算した結果を、以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　また、ｑＲＴ－ＰＣＲによりＲＮＡの発現量分析を行った。ｑＲＴ－ＰＣＲは以下のように実施した。TaqMan　microRNA　reverse　transcription　kitおよびTaqMan　microRNA　assays（Applied　Biosystem）を、製品プロトコルに従って使用した。ＰＣＲマスターミックスとしてTHUNDERBIRD　SYBR(登録商標)qPCR　Mix（東洋紡）を用いた。ｑＲＴ－ＰＣＲのための装置としてLightCycler（登録商標）システム(Roche)を使用した。
　ｑＲＴ－ＰＣＲにより上記ｍｉＲＮＡのそれぞれの発現量を正常組織と腫瘍組織との間で比較した。各ｍｉＲＮＡについて、上記のメチル化率（ＭＳ）と発現量との結果を比較した（図１４）。
　その結果、これらのｍｉＲＮＡの発現量は正常組織と腫瘍組織との間で差がほとんど見られなかったのに対して、メチル化率（ＭＳ）における差は顕著であった。そのため、ＲＮＡのメチル化率（ＭＳ）は、発現量（ＲＴ－ＰＣＲ）より、有用なマーカーとなり得ることが示された。
　さらに、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐに関して、内部配列確認のためアンモニア処理によるＲＮＡ分解（５’→３’）を行い、質量分析を行った（図１５）。図１５に示すように、質量分析法によって特定のＲＮＡの特定の位置における修飾を正確に決定可能であることが確認された。
　これらの大腸がんの患者の原発巣においても、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｌｅｔ７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐのメチル化率は上昇していたため、これらのｍｉＲＮＡのメチル化の上昇が原発性腫瘍特異的であることがさらに確認された。
　（実施例８：早期膵臓がん）
　本実施例では、１７名のヒト膵臓がん患者から採取した血清検体を用いてＲＮＡ修飾状態を調べた。これらの膵臓がんは、ステージＩ～ＩＩと診断された早期膵がん（４名がステージＩＡ、５名がステージＩＩＡ、７名がステージＩＩＢ）であった。正常検体として、健常者の血清検体を使用した。
　上記の捕捉１７－５ｐ、捕捉２１－５ｐ、捕捉２００ｃ－３ｐ、捕捉２００ｃ－５ｐおよび捕捉ｌｅｔ７ａ－５ｐの直接結合ビーズを使用した。上記血清検体からＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡを精製し、その後、ビーズを使用して標的ｍｉＲＮＡを精製し、ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）で測定した。
　全ての膵がんの血清検体においてｍｉＲ－１７－５ｐのメチル化が検出されたが、正常検体からはこのメチル化は検出されないか、またはメチル化の程度が低かった。
　また、既存の膵がんマーカーであるＣＡ１９－９およびＣＥＡによる判定結果と比較して、ｍｉＲ－１７のメチル化の程度は、膵がんの検出においてより正確な指標となり得ることが示された。
　mRNAの８割以上がm6Aの修飾を受けており、さらにModomics（http://modomics.genesilico.pl/）にはＲＮＡ修飾の情報を多数収載されている。これに加え、本発明者らの開発した網羅性の高いＲＩＰシークエンシングによれば、少なくとも過半数、また頻度を問わなければ全アデニンの中でメチル化酵素に結合するものは、全てメチル化・脱メチル化を受ける可能性があると考えられる。本発明者らは、消化器のがんで重要と考えているマイクロRNAの中から５０種類についてメチル化状態を調べ、４種類のマイクロRNAが膵がんを含む消化器のがんの早期段階で重要であることが明らかとなった。他の疾患についても、同様にRNAの修飾情報は、その状態を反映するものであると考えられる。
　実施例６に示されるように、ここで調べたｍｉＲＮＡは、原発巣のみでメチル化が亢進することが確認されている。すなわち、膵臓にがんがあった場合、これらのｍｉＲＮＡのメチル化が亢進していれば原発巣だと判定でき、また亢進していなければ転移巣のがんであると判断できる。本実施例の結果は、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｌｅｔ７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐに基づいて、膵臓がんが転移状態なのか原発状態なのかを予測可能であることを裏付けるものであるといえる。
　（実施例９：他のがん試料）
　本実施例では、他のがん試料の分析を行った。
　実施例７と同様の手法を用いて、種々のがん試料について実施例８のＲＮＡの範囲において、メチル化を分析した。事前にインフォームド・コンセントを得たヒト患者より胃がん（４名）の組織検体を手術時に採取した。同時に、健常組織として悪性腫瘍領域から５ｃｍ以上離間した領域から組織検体を採取した。
　上記の捕捉１７－５ｐ、捕捉２１－５ｐ、捕捉２００ｃ－３ｐ、捕捉２００ｃ－５ｐおよび捕捉ｌｅｔ７ａ－５ｐを、ストレプトアビジン結合ビーズとして製した。上記試料からＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡを生成し、その後、ビーズを使用して標的ｍｉＲＮＡを精製し、ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）で測定した。
　胃がんにおける結果を示す（図１６）。本実施例の結果は、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｌｅｔ７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐが、胃がんの転移（原発性）の状態を予測できることを裏付けるものであるといえる。
（実施例１０）転移関連ｌｎｃＲＮＡ修飾
　実施例２の転移マウスモデルを使用して、実施例５と同様に、ｌｎｃＲＮＡの修飾状態を調べた。
　具体的には、実施例で示したＥＬ１マウスおよびＷＴｇマウスについて以下の実験を行った。２０週齢前後のそれぞれ３匹のマウスから腫瘍および転移巣を摘出する直前に下大静脈から約１ｍＬ採血した。この血液を１０，０００Ｇ、１０分、４℃で遠心分離することで血清を取得した。この血清から上記の共通プロトコルの通り、全ＲＮＡに対してＲＮＡ－Ｓｅｑおよび抗ｍ６Ａ抗体を使用したＲＩＰシークエンシングを実施した。得られたシークエンシングデータから、ｌｎｃＲＮＡのデータのみを抽出し、解析を行った。
　以下の表に示すｌｎｃＲＮＡは、ＥＬ１マウスに対するＷＴｇマウスのメチル化率の比[（ＷＴｇマウスメチル化率／ＷＴｇマウス発現量）／（ＥＬ１マウスメチル化率／ＥＬ１マウス発現量）]が、２以上であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　実施例２に示したように、ＥＬ１マウスではがん転移は観察されず（原発巣のみ）、他方、ＷＴｇマウスではがん転移が観察されたため（原発巣＋転移巣）、ＷＴｇマウスにおいてメチル化が向上していたｌｎｃＲＮＡは、がんの原発性を示す指標となり得る。また、あるがんにおいてこれらのｌｎｃＲＮＡのメチル化が低度または検出不可であることは、そのがんが転移性であることを示す指標となり得る。
　（実施例１１）ＲＮＡ修飾による薬剤スクリーニング
　本実施例では、ＲＮＡ修飾による薬剤スクリーニングが可能であることを実証する。
　耐性株を、任意の化合物ライブラリーで処理する。これらの細胞のＲＮＡ修飾を分析する。ＲＮＡ修飾情報に基づいて、これらの化合物を分類すると、化合物の一部は１つのクラスターを形成し、分析することができる。耐性株は転移をしやすい性質を持っているため、親株との比較を行えば転移しやすいがん細胞が持つメチル化状態を捉えることが可能である。
　（実施例１２－１）ＲＮＡ上の種々の修飾の分析
　本実施例では、他のＲＮＡ修飾を用いた転移／原発性に関連する状態の分析を実証する。
　ＲＮＡ－ｍｏｄの修飾の種類が広範囲にわたることを実証するものである。転移／原発性に関連する状態を分析した質量分析のデータを再解析し、マイクロＲＮＡ上のメチル化以外の修飾を分析することができ、これらの情報を用いて、ＲＮＡ上の種々の修飾を転移／原発性に関連する状態の分析のために使用することができる。
　（実施例１２－２）種々のＲＮＡ上の修飾の分析
　マイクロＲＮＡ以外のＲＮＡの修飾情報と、転移／原発性に関連する状態を関連付けるデータを結び付けることができる。例えば、質量分析でのピークは多数あり、１つ１つを手作業で当てることもできるし、機械学習で行うこともできる。また、これらについては、ブルカのMaldiの仕様書を参酌することができる。
　（実施例１３）ＲＮＡ修飾情報を他のデータと組み合わせた分析
　本実施例では、ＲＮＡ修飾情報を他のデータと組み合わせた転移／原発性に関連する状態の分析を実証する。
　例えば、トランスオミックス(RNA;例えば、Pagliarini　DJ,　Cell　Metab.　2016　Jul　12;24(1):13-4.　doi:　10.1016/j.cmet.2016.06.018.)。メチローム(メチル化結合蛋白；例えば、Shabalin　AA.,　Bioinformatics.　2018　Feb　12.　doi:　10.1093/bioinformatics/bty069.)、トランスクリプトーム(RNAseq；例えば、Jeong　Ｈ，　Front　Neurosci.　2018　Feb　2;12:31.　doi:　10.3389/fnins.2018.00031.　eCollection　2018)、本開示のエピトランスクリプトーム(今回の、低密度または高密度)、メタボローム(質量分析；例えば、Gupta　R　ｅｔ　ａｌ．、Proteomics.　2018　Feb　19.　doi:　10.1002/pmic.201700366)などを参照することができる。これらの例示した論文は、あくまで例示であり、これら以外でも、適宜の情報源を用いて、転移／原発性に関連する状態の分析に応用することができる。
　本開示のＲＮＡ修飾情報とその他の情報を組み合わせてさらに転移／原発性に関連する状態の分析精度が上がった結果、またはそのように分析精度を向上させることができることが理解される。
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、２０１８年１２月２８日に出願した日本国特許出願特許願2018-247964に対して、優先権主張をするものであり、同出願の内容の全体が本願において参考として援用される。
　本開示は、生物が関与するおよそ任意の分野における分析において利用可能性があり、特に医療分野での応用は計り知れない。
　本明細書における配列の名称および、その具体的配列を以下に示す。
miR-17-5p　CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG　(配列番号1)
miR-21-5p　UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA　(配列番号2)
miR-200c-5p　CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG　(配列番号3)
miR-let7a-5p　UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU　(配列番号4)
捕捉17-5p　CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG　(配列番号5)
捕捉21-5p　TCAACATCAGTCTGATAAGCTA　(配列番号6)
捕捉200c-5p　CCAAACACTGCTGGGTAAGACG　(配列番号7)
捕捉let7a-5p　AACTATACAACCTACTACCTCA　(配列番号8)
合成miR-200c-5p　CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG　(#7,mA;#13,mC)　(配列番号9)
miR-21-5p　UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA　(#9,mC)　(配列番号10)
miR-17-5p　CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG　(#13,mA)　(配列番号11)
let-7a-5p　UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU　(#19,mA)　(配列番号12)
miR-200c-5p　CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG　(#13,mC)　(配列番号13)
miR378a-3p　ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC　(配列番号14)
miR378d　ACUGGACUUGGAGUCAGAAA　(配列番号15)
miR378e　ACUGGACUUGGAGUCAGGA　(配列番号16)
miR378f　ACUGGACUUGGAGCCAGAAG　(配列番号17)
miR378h　ACUGGACUUGGUGUCAGAUGG　(配列番号18)
miR378i　ACUGGACUAGGAGUCAGAAGG　(配列番号19)
miR-16-1-3p　CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA　(配列番号20)
miR-16-5p　UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG　(配列番号21)

Claims (9)

  1. 　対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を取得するステップと、
    　該修飾情報に基づいて該対象におけるがんの転移／原発性に関連する状態を分析するステップと
    を含む、対象の状態を分析する方法。
  2. 　前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＲＮＡがｌｎｃＲＮＡを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記修飾がｍ６Ａまたはｍ５Ｃを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、前記対象が転移性腫瘍を有するかどうかである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、前記対象におけるがんが原発性であるかどうかである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記少なくとも１種類のＲＮＡが前記対象の血液から取得されたＲＮＡである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記少なくとも１種類のＲＮＡが前記対象の腫瘍から取得されたＲＮＡである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記がんの転移／原発性に関連する状態が、膵臓からの転移に関連する状態である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
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