WO2020111372A1 - 간세포 및 캡슐화한 간세포 구상체의 동결 보존을 위한 동결보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 동결보존법 - Google Patents

간세포 및 캡슐화한 간세포 구상체의 동결 보존을 위한 동결보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 동결보존법 Download PDF

Info

Publication number
WO2020111372A1
WO2020111372A1 PCT/KR2018/016677 KR2018016677W WO2020111372A1 WO 2020111372 A1 WO2020111372 A1 WO 2020111372A1 KR 2018016677 W KR2018016677 W KR 2018016677W WO 2020111372 A1 WO2020111372 A1 WO 2020111372A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
serum
solution
free
rate
hepatocyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2018/016677
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이지현
이석구
이상훈
이두훈
노정권
정종갑
윤희훈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Samsung Life Public Welfare Foundation
HLB Cell Co Ltd
Original Assignee
Samsung Life Public Welfare Foundation
Lifeliver Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Samsung Life Public Welfare Foundation, Lifeliver Co Ltd filed Critical Samsung Life Public Welfare Foundation
Publication of WO2020111372A1 publication Critical patent/WO2020111372A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A01N1/125—Freeze protecting agents, e.g. cryoprotectants or osmolarity regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/16—Physical preservation processes
    • A01N1/162—Temperature processes, e.g. following predefined temperature changes over time
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C12N2500/62—DMSO
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a serum-free cryopreservation solution for cryopreservation and a hepatocyte cryopreservation method using the same for cryopreservation of hepatocytes and encapsulated hepatocyte beads.
  • hepatocyte transplantation and extracorporeal circulating biospatial devices it can be considered as one of the methods to maximize the practicality of the research that a large amount of hepatocytes can be used immediately if necessary.
  • cells that play an important role in the biospatial device use hepatocytes separated from the pig liver.
  • preparation of a ready-made bioartificial liver system with immediate response to patient development is essential. . Therefore, rather than performing a complicated and time-consuming separation and pretreatment process whenever necessary, a technique for stably storing all completed hepatocytes for a long period of time is required. For this, a technique for cryopreserving hepatocytes in large quantities is required.
  • hepatocytes are cryopreserved in the usual way, the cell viability or activity is rapidly reduced after thawing. Therefore, a method for cryopreservation of hepatocytes capable of maintaining a high level of survival rate and activity should be developed.
  • hepatocytes Since hepatocytes rarely proliferate in the in vitro culture state and cannot be subcultured, in order to use it for research, it is difficult to separate or cryopreserve and use for research. Unlike other tissue cells, in the case of hepatocytes, a method for stably freezing cells for a long time has not been established.
  • cryopreservation of primary hepatocytes which are mostly single cells, and mainly used antioxidants such as a cryoprotectant or a cryopreservative, and a polyphenolic compound that can reduce warm injury during thawing.
  • a new cryopreservation method is required for the use of globular and encapsulated hepatocytes. The main reason for this is that a new freezing method should be implemented due to the modification of the thermodynamic behavior caused by the fact that the non-single-cell-to-cell contact is a highly spherical spheroid and the addition of a new polymer called calcium-alginate.
  • This method of cryopreservation of calcium-alginate-immobilized hepatocyte spheroids is clinical because it can present very important basic data and methods for bio-spatial application using human hepatocytes derived from brain dead liver in addition to using heterologous cells such as porcine hepatocytes. It is very important.
  • conditions for increasing the effect of cryopreservation of cells include the composition of a cryopreservation solution, the addition of a cryoprotectant, and optimization of the cooling rate.
  • Various studies have been conducted to optimize the cryopreservation method of tissue cells in which these conditions are properly combined.
  • Cryoprotectants include substances such as dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, and starch (HES), and currently DMSO is commonly used as a cryoprotectant for animal cells.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • HES starch
  • DMSO minimizes the formation of ice crystals during freezing and thawing, but cell damage due to the formation of ionic and osmotic imbalance and free radicals generated during freezing and thawing cannot be avoided. There is this.
  • cryopreservative normal physiological saline or medium or fetal calf serum is used as the cryopreservative.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • FBS fatal bovine serum
  • Serum is used as a nutrient to promote cell growth and/or proliferation in vitro, or as a source of biologically active substances such as hormones.
  • Proteins such as albumin present in fetal bovine serum during the freezing process appropriately change the freezing point of water to suppress the formation of ice crystals and adjust the osmotic pressure appropriately to maintain and stabilize the cell properties during the initial freezing process.
  • fetal bovine serum plays an important role in the initial freezing process as well as a supply factor of various important factors necessary for cell proliferation. Therefore, if the cells are cryopreserved without using fetal calf serum in the reference method, cell activity cannot be expected to a sufficient extent.
  • serum is economically very burdensome and is a natural product, the composition of serum is very different for each serum.
  • cultured cells since the cultured cells must be purified by removing serum-derived proteins and the like from the cultured cells, this leads to a complicated process. Furthermore, there is a risk that cultured cells (viruses, pathogenic prions, etc.) are infected with unknown pathogens.
  • human serum or other animal serum may be used instead of fetal calf serum.
  • culturing cells for autologous transplantation that cultivates cells obtained from a patient and transplants the cultured cells to a patient uses autologous human serum obtained from the same patient. In this way, contamination of the cultured cells can be avoided.
  • a large amount of blood is required to produce serum, which places a heavy burden on the patient.
  • serum free serum preservation solutions should be developed. If a serum-free cryopreservation solution is developed, it is possible to immediately apply the living space using freeze-preserved hepatocytes to the clinic.
  • the present invention provides a serum-free hepatocyte cryopreservation solution comprising HTK (histidine-tryptophan-ketoglutaric acid) solution, dimethyl sulfoxide (DMSO), dexamethasone and human serum albumin. do.
  • HTK histidine-tryptophan-ketoglutaric acid
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • dexamethasone human serum albumin
  • the hepatocyte may include primary hepatocytes, hepatocyte spheroids, encapsulated hepatocytes and encapsulated hepatocyte spheroids.
  • the encapsulated hepatocytes and the encapsulated hepatocyte spheroids may be encapsulated with calcium-alginate beads.
  • the HTK solution may include 30 to 70 parts by weight.
  • the dimethyl sulfoxide (DMSO) may include 10 to 30 parts by weight.
  • the human serum albumin may include 10 to 40 parts by weight with 20% human serum albumin.
  • the dexamethasone may contain 0.1 to 10 parts by weight at 5 mg/ml.
  • the serum-free hepatocyte cryopreservation solution may further include N-acetyl cysteine (NAC).
  • NAC N-acetyl cysteine
  • the N-acetylcysteine may include 0.01 to 100mM.
  • the serum-free hepatocyte cryopreservation solution may further include an amino acid solution.
  • the amino acid solution may be any of Basal Medium Eagle (BME) amino acid solution, Minimal Essential Medium (MEM) amino acid solution, or Hepatamin® solution.
  • BME Basal Medium Eagle
  • MEM Minimal Essential Medium
  • Hepatamin® solution may be any of Basal Medium Eagle (BME) amino acid solution, Minimal Essential Medium (MEM) amino acid solution, or Hepatamin® solution.
  • the Basal Medium Eagle (BME) amino acid solution may include 1 to 5 parts by weight.
  • the minimum essential medium (MEM) amino acid solution may include 0.5 to 2 parts by weight.
  • the hepatamine solution may include 0.1 to 5 parts by weight.
  • the serum-free hepatocyte cryopreservation solution may further include sucrose or glucose, and insulin.
  • the sucrose or glucose may include 0.01 to 300mM.
  • the insulin may include 1 to 10 parts by weight of 100U/ml insulin.
  • a serum freeze-preservation method of serum-free hepatocytes comprising a suspension preparation step of suspending hepatocytes in the serum-free preservation solution and a freezing step of freezing the suspension.
  • a rate of reduction of freezing temperature may be changed.
  • the temperature can be adjusted to be -80°C at a rate of -1°C/min.
  • the cryopreservation solution according to the present invention can eliminate the possibility of unnecessary infection in the freezing and thawing process by not adding animal extracts such as fetal bovine serum, and cryopreserved cellular artificial tissue can be used for therapeutic purposes.
  • hepatic cells capable of maintaining high levels of survival and activity sufficient for long-term storage by reducing cell damage due to imbalance of ion and osmotic pressure and generation of free radicals Can provide.
  • the improved hepatocyte cryopreservation method of the present invention enables stable supply of not only hepatocytes but also various tissue cells, thereby ex vivo liver disease studies, diabetic model studies, liver metabolic syndrome metabolism studies, multiple organ failure studies according to liver failure, and severe burn patients. It can be used as a material for research on liver failure, metabolic rare diseases such as hemophilia, and other metabolic studies in the body.
  • the calcium-alginate-immobilized hepatocyte spheroids cryopreserved by the present invention can be thawed at any time in an emergency when applied to a biospatial system to treat patients with fulminant hepatic insufficiency, and the aspect of the stability of the biospatial system supply In addition, safety will be improved because it provides sufficient time to test for pathogenic bacteria or viruses that may occur between species.
  • Figure 1 shows the survival rate of hepatocytes when thawed after 1 month after cryopreservation of primary pig hepatocytes using FBS and an improved serum free hepatocytes (modified JH solution, SM21, 22, 64)
  • hepatocytes ammonia removal rate is a result showing the results.
  • Figure 2 shows that when the pig hepatocyte spheroids were cryopreserved using FBS and an improved serum free hepatocyte spheroid solution (SM21, 22, 64), thawed 1 month and 1 year later. It is a result showing the survival rate of hepatocytes (Fig. 2(a)) and ammonia removal rate of hepatocytes (Fig. 2(b)).
  • FIG. 3 shows the hepatocyte cells encapsulated with calcium-alginate beads using FBS and the existing serum-free cryopreservation solution (JH, Korean Patent No. 1480987) and an improved hepatocyte cryopreservation solution (modified JH solution SM21, SM64).
  • JH Korean Patent No. 1480987
  • modified JH solution SM21, SM64 modified JH solution SM21, SM64.
  • FIG. 4 shows that when thawing frozen hepatocyte spheroids using thawing solution containing FBS (FBS), thawing solution containing 20% human serum albumin (ALB) and improved serum-free hepatocyte thawing solution (JHT) -Hepatocyte survival rate (Fig. 4(a)), hepatocyte ammonia removal rate (Fig. 4(b)), hepatocyte urea synthesis rate (Fig. 4(c)) This is the result of the albumin secretion rate of liver cells (Fig. 4(d)).
  • FBS thawing frozen hepatocyte spheroids using thawing solution containing FBS
  • ALB human serum albumin
  • JHT serum-free hepatocyte thawing solution
  • the present invention is a research project of “off-the-shelf” bioin-space commercialization using hepatocyte spheroid cryopreservation technology of the bio-industry core technology development project (promising bio-IP commercialization promotion, Ministry of Trade, Industry and Energy of Korea) (Task No.: 10078349) Is the result of
  • the serum-free cryopreservation solution according to the present invention is a solution that freezes (cryopreservation) and preserves hepatocytes and thaws them in an emergency so that they can be used immediately in the in-spatial system, excluding fetal bovine serum (FBS), HTK (histidine -Tryptophan-ketoglutaric acid) solution, dimethyl sulfoxide (DMSO), dexamethasone, and human serum albumin.
  • FBS fetal bovine serum
  • HTK histidine -Tryptophan-ketoglutaric acid
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • dexamethasone human serum albumin
  • the hepatocyte may include primary hepatocytes, hepatocyte spheroids, encapsulated hepatocytes and encapsulated hepatocyte spheroids.
  • the encapsulation may be by Ca-alginate beads.
  • the calcium-alginate beads can be encapsulated by mixing with 1 to 2, preferably 1.5 parts by weight of alginate.
  • hepatocyte cryopreservation solution is applied to primary hepatocytes, which are single cells, and there is no cryopreservation solution for spheroids or encapsulated hepatocytes and encapsulated hepatocyte spheroids. Therefore, when freeze-preserving hepatocellular spheroids by a general method, since the spheroids have a large cell-to-cell contact area unlike single cells, cell viability or activity is rapidly reduced after thawing.
  • the conventional hepatocyte cryopreservation solution could not prevent deformation of the thermodynamic behavior due to the addition of a new polymer called calcium-alginate in encapsulated hepatocytes and encapsulated hepatocyte spheroids filled in the living space.
  • the serum-free cryopreservation solution according to the present invention has excellent hepatocyte survival rate, ammonia removal rate, urea synthesis rate and albumin secretion rate, especially in encapsulated hepatocytes and encapsulated hepatocytes.
  • the serum-free cryopreservation solution according to the present invention does not include fetal bovine serum (FBS), it can be applied to the clinical field immediately after filling in the living space without adding a separate tablet to thawed hepatocytes after cryopreservation.
  • FBS fetal bovine serum
  • the HTK solution may include 30 to 70 parts by weight based on the total solution volume.
  • the serum-free cryopreservation solution according to the present invention may include 10 to 30 parts by weight of dimethyl sulfoxide (DMSO). Preferably it may include 13 to 18 parts by weight.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the amount is exceeded, the risk of cell damage increases. Conversely, when added in less than 10 parts by weight, the cryopreservation effect is reduced.
  • dimethyl sulfoxide may include up to 30 parts by weight in consideration of the addition amount of a calcium-alginate polymer.
  • the human serum albumin may include 10 to 40 parts by weight. If it is less than 10 parts by weight, the survival rate decreases. Preferably it may be 10 to 20 parts by weight.
  • the serum-free cryopreservation solution according to the present invention may further include sucrose or glucose, human serum albumin, or insulin.
  • the serum-free hepatocyte cryopreservation solution may further include an amino acid solution.
  • the amino acid solution may be a Basal Medium Eagle (BME) amino acid solution, a MEM amino acid solution, or a Hepatamine® solution.
  • the Basal Medium Eagle (BME) amino acid solution may preferably be sigma B6766, and the MEM amino acid solution may preferably be sigma M7145.
  • the hepatamine is 1.750 g of aminoacetic acid (glycine) in 1 L, 5.475 g of L-alanine, 4.500 g of L-arginine, 1.875 g of L-histidine, 8.275 g of L-leucine, 6.775 g of L-isoleucine, 6.775 g of L-lysine HCl 6.934 g, L-methionine 0.450 g, L-phenylalanine 0.600 g, L-proline 6.00 g, L-serine 3.450 g, L-threonine 3.375 g, L-tryptophan 0.375 g, L-valine 6.3 g and N-acetyl- L-cysteine may be a 6% state (foreign pharmaceutical) of Choongwa Tropamine containing 0.337 g as an active ingredient.
  • the insulin may include 1 to 10 parts by weight at 100U/ml. When considering the survival rate and adhesion rate of hepatocytes after cryopreservation, it may preferably include 3 to 5 parts by weight, most preferably 3 parts by weight.
  • the Basal Medium Eagle (BME) amino acid solution may include 1 to 5 parts by weight, preferably 1 to 3, more preferably 2 parts by weight, considering the survival rate and adhesion rate of hepatocytes after cryopreservation.
  • the MEM amino acid (sigma M7145) may include 0.5 to 2 parts by weight, preferably 1 part by weight.
  • the dexamethasone solution (5mg/mL) may include 0.1 to 10 parts by weight.
  • the acetylcysteine may include 0.01 to 100mM.
  • the present invention provides a serum-free hepatocyte cryopreservation method comprising a suspension preparation step of suspending hepatocytes in a serum-free cryopreservation solution and a freezing step of freezing the suspension. .
  • the suspension preparation step is a HTK (histidine-tryptophan-ketoglutaric acid) solution, a suspension step of suspending hepatocytes in a first freeze-preserving solution containing dexamethasone and human serum albumin; And an addition step of adding a second freezing preservation solution comprising HTK (histidine-tryptophan-ketoglutaric acid) solution, human serum albumin, and dimethyl sulfoxide (DMSO) to the first freezing preservation solution in which the liver cells are suspended. It can contain.
  • HTK histidine-tryptophan-ketoglutaric acid
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the first freeze-preservation solution may not include dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • the first freeze-preservation solution may further include dexamethasone, insulin, an amino acid solution or glucose.
  • the second freezing storage solution may be a hepatocyte cryopreservation solution according to the present invention.
  • the second freeze-preserving solution may be dimethyl sulfoxide (DMSO) added to the first freeze-preserving solution that does not contain dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the present invention is characterized by providing a method for cryopreservation of hepatocytes using temperature control.
  • the cryopreservation method may use the serum-free cryopreservation solution according to the present invention described above.
  • the temperature of the chamber can be automatically adjusted using a speed-controlled freezer, and hepatocytes can be cryopreserved by controlling the rate of temperature change to -80°C.
  • the temperature of the chamber is automatically adjusted as follows. (a) temperature control to be 0°C at a rate of -1°C/min; (b) maintained at 0° C.
  • temperature control to be -10 °C at a rate of -3 °C/min;
  • temperature control to be -25 °C at a rate of -1 °C/min;
  • temperature control to -75°C at a rate of -50°C/min;
  • temperature control held at -75°C for 1 minute;
  • temperature control to -40°C at a rate of -12°C/min;
  • temperature control to be -80°C at a rate of -1°C/min.
  • the method of cryopreservation of hepatocytes using temperature control characterized in that the rate of decrease in freezing temperature according to the present invention is changed, is a mixture of a rapid cooling (shock cooling program) and a slow cooling (slow cooling) method. It has the effect of improving the survival rate.
  • HTK human-tryptophan-ketoglutaric acid
  • human serum albumin 20 parts by weight of 20% human serum albumin
  • 3 parts by weight of 100 U/ml insulin 1 part by weight of Dexamethasone
  • 50X Basal Medium Eagle (BME) amino acid sigma B6766
  • MEM amino acid sigma M7145
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • HTK human-tryptophan-ketoglutaric acid
  • 20 parts by weight of 20% human serum albumin 20 parts by weight of 20% human serum albumin
  • 5 parts by weight of 4M glucose 3 parts by weight of 100 U/ml insulin
  • 1 part by weight of dexamethasone 50X Basal medium Eagle (BME) amino acid (sigma B6766) 2 parts by weight
  • MEM amino acid 14 parts by weight
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • HTK histidine-tryptophan-ketoglutaric acid
  • human serum albumin 20 parts by weight of 20% human serum albumin
  • 3 parts by weight of 100 U/ml insulin 1 part by weight of dexamethasone
  • 2.5 parts by weight of Hepatamine 2.5 parts by weight of acetylcysteine Part
  • 15 parts by weight of dimethyl sulfoxide (DMSO) were mixed to prepare a serum-free cryopreservation solution (SM22 solution).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a serum-free hepatocyte thawing solution was prepared by mixing 20 parts by weight of 20% human serum albumin, 200 mM glucose, and 10 mM acetylcysteine in William's E medium.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a fetal bovine serum (FBS) solution was prepared by mixing 85 parts by weight of FBS and 15 parts by weight of DMSO.
  • HTK histidine-tryptophan-ketoglutaric acid
  • human serum albumin 20 parts by weight of 20% human serum albumin
  • 3 parts by weight of 100 U/ml insulin 2 parts by weight of 50X Basal Medium Eagle (BME) amino acid (sigma B6766)
  • BME Basal Medium Eagle
  • MEM MEM
  • JH solution serum free hepatocyte cryopreservation solution was prepared by mixing 1 part by weight of amino acid (sigma M7145) and 15 parts by weight of dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • FBS fetal serum
  • Porcine hepatocytes are seeded at a concentration of 1x10 ⁇ 6/mL using HDM medium of Comparative Example 1 in a spinner flask, and cultured for 10-12 hours with stirring at a rate of 15 rpm to form globular bodies.
  • Porcine hepatocyte spheroids were mixed with 1.5 parts by weight of alginate at a concentration of 3x10 ⁇ 7 cells/ml, and added to a calcium solution of 100 mmol/L. Subsequently, calcium-alginate encapsulated porcine hepatocytes were prepared by injecting them into a high-concentration/high-speed fixation device.
  • a suspension was prepared by mixing the solutions of Examples 1, 2, 3, and Comparative Example 2 with primary hepatocytes isolated from pigs according to Experimental Example 1.
  • the suspension was frozen on ice and then put into a speed controlled freezer (using CryoMed from Thermo Forma).
  • the temperature control of the chamber in the rate-controlled freezer is (a) temperature controlled to be 0°C at a rate of -1°C/min; (b) maintained at 0° C.
  • cryopreserved hepatocytes were rapidly thawed in a 37° C. water bath.
  • the thawing solution of Comparative Example 4 was added in a 50-fold volume of the thawed solution and then gently mixed. Cells were washed by centrifugation at 50 g, 4° C. for 3 minutes for 3 minutes, and the cryopreservation solution was removed. The cells were added to HDM (hormone limited medium) at a concentration of 5x10 ⁇ 5 cells/ml.
  • HDM hormone limited medium
  • Porcine hepatocyte spheroids prepared according to Experimental Example 2 were mixed with the solutions of Examples 1, 2, 3, and Comparative Example 2, respectively, to prepare a suspension.
  • the suspension was frozen on ice and then put into a speed controlled freezer (using CryoMed from Thermo Forma).
  • the temperature control of the chamber in the rate-controlled freezer is (a) temperature controlled to be 0°C at a rate of -1°C/min; (b) maintained at 0° C.
  • cryopreserved hepatocytes were rapidly thawed in a 37° C. water bath.
  • the thawing solution of Comparative Example 4 was added in a 50-fold volume of the thawed solution and then gently mixed. Cells were washed by centrifugation at 50 g, 4° C. for 3 minutes for 3 minutes, and the cryopreservation solution was removed. The cells were added to HDM (hormone limited medium) at a concentration of 5x10 ⁇ 5 cells/ml.
  • HDM hormone limited medium
  • Example 2 A solution in which the dimethyl sulfoxide (DMSO) solution in Example 1 was increased to 22.5 parts by weight and the HTK solution was reduced to 50.5 parts by weight, and in Example 3, a solution in which dimethyl sulfoxide (DMSO) solution was increased to 22.5 parts by weight and the HTK solution was reduced to 48.5 parts by weight
  • Comparative Examples 2 and 3 were prepared by mixing 0.5 mL of each of the 1.8 mL frozen vials and 0.5 mL of encapsulated porcine hepatocyte spheroids. The whole process is done on ice.
  • the vial containing the capsule was frozen on ice while being put in a speed control freezer (using Thermo Forma's CryoMed).
  • the temperature control of the chamber in the rate-controlled freezer is (a) temperature controlled to be 0°C at a rate of -1°C/min; (b) maintained at 0° C.
  • cryopreserved encapsulated hepatocyte spheroids were rapidly thawed in a 37° C. water bath.
  • the thawing solution of Comparative Example 4 was added in a 50-fold volume of the thawed solution and then gently mixed. Cells were washed by centrifugation at 50 g, 4° C. for 3 minutes for 3 minutes, and the cryopreservation solution was removed.
  • the encapsulated hepatocyte spheroid was introduced into HDM (hormone-limited medium) at a concentration of 5x10 ⁇ 5 cells/ml.
  • the survival rate of cryopreserved porcine hepatocytes according to Experimental Examples 4, 5 and 6 was measured by MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) conversion.
  • the ammonia removal rate, urea secretion rate, and albumin synthesis rate were determined by the method of Lee (Lee JH, Lee DH, Son JH, et al: Optimization of chitosanalginate encapsulation process using pig hepatocytes for development of bioartificial liver.J Microbiol Biotechnol 15:7, 2005). It was measured accordingly. All data are averages from 3 experiments.
  • Figure 1 (a) of the hepatocytes after cryopreservation of pig hepatocytes (Pig hepatocyte) using the hepatocyte cryopreservation solution according to Example 1, Example 2, Comparative Example 2 and Example 3 according to the present invention It is a graph showing the survival rate and adhesion rate. Survival rate after thawing (black graph) and adhesion rate (gray graph) are shown.
  • the serum-free cryopreservation solution (SM21 solution) according to Example 1 of the present invention showed a high survival rate of 20% or more compared to the fetal calf serum (FBS) solution used as the conventional cryopreservation solution.
  • FBS fetal calf serum
  • the serum-free hepatocyte cryopreservation solutions (SM21, SM64 solutions) according to Example 1 and Example 3 of the present invention are 30% higher ammonia compared to fetal bovine serum (FBS) solutions used as conventional cryopreservation solutions.
  • FBS fetal bovine serum
  • Figure 2 (a) was frozen after preservation of pig hepatocyte spheroids (Pig hepatocyte spheroids) using the hepatocyte cryopreservation solutions according to Example 1, Example 2, Comparative Examples 2 and 3 according to the present invention and thawed.
  • This is a graph showing the survival rate and adhesion rate of hepatocyte spheroids.
  • the serum-free cryopreservation solution (SM22 solution) according to Example 2 of the present invention showed a high survival rate of 25% or more compared to the fetal bovine serum (FBS) solution used as a conventional cryopreservation solution.
  • FBS fetal bovine serum
  • the serum-free cryopreservation solution (SM22, SM64 solution) according to Example 2 and Example 3 of the present invention is 15% higher ammonia compared to fetal bovine serum (FBS) solution used as a conventional cryopreservation solution.
  • FBS fetal bovine serum
  • Figure 3(a) shows the survival rate when thawed after cryopreservation of encapsulated porcine hepatocyte spheroids using the hepatocyte cryopreservation solutions according to Example 1, Example 3, Comparative Example 2 and Example 3 according to the present invention. It is the graph shown. The bar graph showed the survival rate after thawing (black graph) and the survival rate on the second day (gray graph).
  • Serum hepatocyte cryopreservation solutions (SM21, SM64 solutions) according to Example 1 and Example 3 of the present invention showed a high survival rate of 25% or more compared to fetal bovine serum (FBS) solutions used as conventional cryopreservation solutions. It showed a high survival rate of 9% or more compared to JH solution, and a survival rate of 30 days or more compared to the fetal calf serum (FBS) solution and the existing JH solution.
  • FBS fetal bovine serum
  • serum-free hepatocyte cryopreservation solutions (SM21, SM64 solutions) according to Examples 1 and 3 of the present invention have a high removal rate of 83% or more compared to fetal bovine serum (FBS) solution used as a conventional cryopreservation solution. And 49% higher removal rate than the existing JH solution. (Drawing 3(b))
  • the serum-free cryopreservation solution (SM21, SM64 solution) according to Example 1 and Example 3 of the present invention is 2.7 times, 3.2 compared to the fetal bovine serum (FBS) solution used as the conventional cryopreservation solution. It showed twice as high secretion rate and more than 1.4 times higher secretion rate than the existing JH solution. (Drawing 3(c))
  • the serum-free cryopreservation solution (SM21, SM64 solution) according to Example 1 and Example 3 of the present invention is more than 2 times higher than the fetal bovine serum (FBS) solution used as the conventional cryopreservation solution. It showed the ability to synthesize and exhibited a 1.4% higher synthesis rate than the existing JH solution. (Drawing 3(d))
  • Fig. 3(e) is a fluorescence staining micrograph stained with Ethidium homodimer-1 (PE) for cells killed by Fluorescent calcein (FITC) in the liver after thawing.
  • PE Ethidium homodimer-1
  • FITC Fluorescent calcein
  • cryopreserved encapsulated hepatocyte spheroids were rapidly thawed in a 37° C. water bath.
  • the thawing solutions of Example 4 and Comparative Examples 4 and 5 were added in a 50-fold volume of the thawed solution and gently mixed. Cells were washed by centrifugation at 50 g, 4° C. for 3 minutes for 3 minutes, and the cryopreservation solution was removed.
  • the encapsulated hepatocyte spheroid was introduced into HDM (hormone-limited medium) at a concentration of 5x10 ⁇ 5 cells/ml.
  • Figure 4 is an experimental result of comparing the hepatocyte spheroids encapsulated with calcium-alginate beads using a defrosting medium containing FBS and a serum-free hepatocyte thawing solution when thawing after freeze-preservation using FBS solution.
  • the serum-free freezing and thawing process uses a solution containing serum (including 10% FBS). It is thought that the serum contributes to stabilization of the damaged cell membrane during the freezing process, and especially in the case of a single cell, it greatly affects the adhesion rate.
  • NAC is an antioxidant that can be considered to play a role in reducing the damage caused by thawing (warm injury).
  • Figure 4 (a) is a graph showing the survival rate when thawed encapsulated porcine hepatocyte globules using the hepatocyte thawing solution according to Comparative Example 4, Comparative Example 5 and Example 4 after cryopreservation as Comparative Example 2 according to the present invention to be.
  • the serum-free hepatocyte thawing solution (JHT solution) according to Example 4 of the present invention showed a high survival rate of 18% or more compared to the solution containing fetal bovine serum (FBS) used as a conventional thawing solution.
  • FBS fetal bovine serum
  • the serum-free hepatocyte thawing solution (JHT solution) exhibited a similar removal rate to the solution containing fetal bovine serum (FBS) used as a conventional thawing solution.
  • FBS fetal bovine serum
  • the serum-free hepatocyte thawing solution (JHT solution) according to Example 4 of the present invention exhibited a 1.6-fold higher secretion rate than the solution containing fetal bovine serum (FBS) used as a conventional thawing solution.
  • FBS fetal bovine serum
  • the serum-free hepatocyte thawing solution (JHT solution) according to Example 4 of the present invention showed a synthesis ability of at least 1.3 times higher than the solution containing fetal bovine serum (FBS) used as a conventional thawing solution.
  • FBS fetal bovine serum
  • the synthesis rate was 1.7 times higher.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산) 용액, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 덱사메타손 및 인간 혈청 알부민을 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액에 대한 것으로, 종래의 동결보존용액에 덱사메타손 및/또는 N-아세틸시스테인을 추가하여 종래의 동결보전용액보다 간세포의 생존율, 암모니아 제거율, 우레아 합성율 및 알부민 분비율이 향상된 것을 특징으로 한다.

Description

간세포 및 캡슐화한 간세포 구상체의 동결 보존을 위한 동결보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 동결보존법
본 발명은 간세포 및 캡슐화된 간세포 비드의 동결 보존을 위한 동결보존용 무혈청 동결보전용액 및 이를 이용한 간세포 동결보존방법에 대한 것이다.
생체로부터 채취한 각종 조직 세포의 동결보존에 관한 연구는 세포 생물학에 관련된 기초 연구 활동에 있어서 중요한 분야의 하나이다.
정상세포 및 확립된 세포주를 적절히 저장하는 것은 장기간에 걸쳐 반복적으로 그 정상세포와 세포주를 사용할 수 있도록 할 뿐 아니라, 특히 유용물질 생산 및 의약용으로서 동물 세포를 사용할 경우에는 안전성 및 재현성 확보에 매우 중요하다.
또한 간, 췌장, 혈관, 골수 세포의 이식 및 세포치료(cell therapy)을 위한 임상연구에 있어서도 첫째, 공여자로부터 획득한 다량의 조직 세포나 줄기세포(stem cell)을 필요시까지 안정적으로 보존 가능하다는 점, 둘째, 다량의 세포를 보존 가능함에 따라 이식용 조직 세포의 수급이 원활하게 유지 될 수 있다는 점에 있어서 임상 의학적으로도 매우 중요한 연구 분야임에 틀림이 없다.
특히, 간세포 이식과 체외 순환형 생인공간 장치에 있어서 대량의 간세포를 필요시 즉시 사용할 수 있음은 연구의 실용성을 극대화시키는 방안의 하나로 손꼽을 수 있다. 그 예로써 생인공간 장치에서 중요한 역할을 하는 세포는 돼지 간으로부터 분리된 간세포(hepatocyte)를 이용하게 되는데, 신속한 임상치료를 위해서는 환자 발생에 대한 즉응성을 지니는 ready-made bioartificial liver system 제작이 필수적이다. 따라서 필요시마다 복잡하고 많은 시간이 소모되는 간세포 분리와 전처리과정을 수행하기보다는 모든 과정이 완료된 간세포를 대량으로 장기간 안정하게 보관하는 기술이 요구되는 것이다. 이를 위해서는 대량으로 간세포를 동결 보존하는 기술이 필요하게 된다. 그러나 일반적인 방법으로 간세포를 동결 보존하였을 경우 해동 후 세포 생존율이나 활성이 급격히 감소한다. 따라서 고수준의 생존율과 활성 유지가 가능한 간세포 동결 보존 방법이 개발되어야 한다.
특히 간세포를 응급상황에서 언제든지 생인공간 시스템에 적용하기 위해서는 생인공간에 충진되는 최종 형태인 칼슘-알지네이트 간세포 구상체를 냉동 보존하는 것이 아주 중요하다. 이러한 안정적인 이유 외에 이종간에 발생할 수 있는 병원성 세균이나 바이러스 등을 냉동 보존되어 있는 기간 동안에 검사할 수 있다는 안전성의 측면에서도 상당히 중요하다.
간세포는 체외 배양 상태에서 거의 증식을 하지 않고 계대 배양을 할 수 없기 때문에 이를 연구에 사용하기 위해서는 매번 새롭게 분리하거나, 동결 보존하여 연구에 사용하여야 하는 어려움이 따른다. 타 조직세포와 달리 간세포의 경우, 장기간 안정적으로 세포를 동결보존 할 수 있는 방법이 확립되어 있지 않다.
현재까지 진행된 간세포 동결보존에 관한 연구는 대부분 단일세포인 일차 간세포를 냉동 보존하는 것으로, 주로 냉동보호제나 냉동보존액의 조성, 그리고 해동 시 발생하는 warm injury를 줄일 수 있는 polyphenolic compound 같은 항산화제의 사용 하였다. 그러나 구상체 형태의 간세포 및 캡슐화된 간세포의 이용을 위해서는 새로운 동결보존방법이 필요하다. 이의 가장 큰 이유는 단일세포가 아닌 세포-세포간 접촉이 상당히 높은 구상체라는 점과 칼슘-알지네이트라는 새로운 고분자가 첨가된다는 점때문에 발생하는 열역학적 거동의 변형으로 인해 새로운 냉동 방법이 실행 되어져야 한다. 이러한 칼슘-알지네이트 고정화 간세포 구상체의 냉동 보존 방법은 돼지 간세포와 같은 이종세포를 이용하는 경우 외에도 뇌사자 간에서 유래한 인체 간세포를 이용한 생인공간 적용에 있어서도 상당히 중요한 기초자료와 방법들을 제시할 수 있기 때문에 임상적으로 상당히 중요하다.
일반적으로 세포의 동결 보존의 효과를 증대시키기 위한 조건으로는 동결 보존액의 조성, 냉동보호제의 첨가, 냉각속도의 최적화 등을 들 수 있다. 이 조건들을 적절히 조합한 조직세포의 동결 보존법 최적화 연구가 다양하게 진행되고 있다.
냉동보호제에는 dimethyl sulfoxide(DMSO), glycerol, starch(HES) 등의 물질들이 있으며 현재 동물세포의 냉동보호제로 DMSO를 일반적으로 사용하고 있다.
DMSO가 동결과 해동 과정에서 얼음결정의 형성을 최소화하지만 동결과 해동과정에서 발생하는 이온과 삼투압 불균형(ionic and osmotic imbalance)과 활성산소유리기(free radical)의 생성으로 인한 세포 손상은 피할 수 없다는 문제점이 있다.
냉동보존액에는 냉동보호제 외에 일반 생리식염수나 배지, 또는 우태아 혈청 등을 이용한다.
현재 정상세포 및 세포주 등 동물 세포를 저장하는 데 있어 가장 널리 사용되는 기준 방법은 저장하고자 하는 정상세포 또는 세포주에 최적화된 완전한 세포배양액(complete medium)으로 세포를 재현탁(resuspend)시킨 다음 우태아 혈청(fatal bovine serum, FBS) 등과 같은 10 내지 90% 비인간 동물-유래 혈청에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 부피비 5-20% 넣고 -80℃에서 천천히 동결시킨 다음 액체 질소에서 보관하는 것이다.
혈청은 시험관 내(in vitro) 세포 성장 및/또는 증식을 촉진하기 위한 영양원, 또는 호르몬 등과 같은 생물학적 활성 물질의 공급원(resource)으로 사용된다.
동결과정중에 우태아 혈청내에 존재하는 알부민 등과 같은 단백질은 물의 어는점을 적절히 변화시켜 얼음 결정의 생성을 억제하고 삼투압을 적절히 조절하여 초기 동결과정에서 세포의 성상 유지 및 안정화 작용을 한다. 즉 우태아 혈청은 세포의 증식에 필요한 여러 중요한 인자들의 공급 요소로서뿐만 아니라 초기 동결과정에서도 중요한 역할을 한다. 그러므로 기준 방법에서 우태아 혈청을 사용하지 않고 세포를 동결 저장할 경우에는 충분한 정도로 세포활성도를 기대할 수 없다. 그러나 혈청은 경제적으로 부담이 매우 크며, 또한 자연 생성물이기 때문에 혈청의 구성 성분은 혈청마다 매우 다르다.
더욱이, 배양된 세포로부터 혈청-유래 단백질 등을 제거함으로써 배양된 세포를 정제해야만 하므로, 복잡합 과정을 야기한다. 더 나아가 배양된 세포가 (바이러스, 병원성 프라이온 등) 알려지지 않은 병원체에 감염될 위험이 있다.
물론 저장되는 세포의 종류와 이후 사용 목적에 따라서는 우태 혈청 대신 사람의 자가 혈청이나 다른 동물의 혈청이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 환자로부터 수득한 세포를 배양하고 배양된 세포를 환자에게 이식하는 자가 이식 치료를 위한 세포의 배양은 동일 환자로부터 수득된 자가 인간 혈청을 사용한다. 이러한 방법으로 배양된 세포의 오염을 피할 수 있다. 그러나 혈청을 생산하기 위하여 많은 양의 혈액이 요구되며, 이는 환자에게 큰 부담이 된다.
이러한 문제를 피하기 위하여, 혈청이 포함되지 않은 무혈청 동결보존용액이 개발되어야 한다. 무혈청의 냉동보존액을 개발한다면 동결 보존되었던 간세포를 이용한 생인공간을 임상에 바로 적용시킬 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산) 용액, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 덱사메타손 및 인간 혈청 알부민을 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액을 제공한다.
상기 간세포는 일차 간세포, 간세포 구상체, 캡슐화된 간세포 및 캡슐화된 간세포 구상체를 포함할 수 있다.
상기 캡슐화된 간세포 및 캡슐화된 간세포 구상체는 칼슘-알지네이트 비드 (Ca-alginate bead)로 캡슐화된 것일 수 있다.
상기 HTK 용액은 30 내지 70중량부를 포함할 수 있다.
상기 디메틸 설폭사이드(DMSO)은 10 내지 30 중량부를 포함할 수 있다.
상기 인간 혈청 알부민은 20% 인간 혈청 알부민으로 10 내지 40 중량부를 포함할 수 있다.
상기 덱사메타손은 5mg/ml 으로 0.1 내지 10 중량부를 포함할 수 있다.
상기 무혈청 간세포 동결보존용액은 N-아세틸시스테인 (NAC, N-acetyl cysteine)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 N-아세틸시스테인은 0.01 내지 100mM을 포함할 수 있다.
상기 무혈청 간세포 동결보존용액은 아미노산 용액을 추가로 포함할 수 있다.
상기 아미노산 용액은 바살 미디엄 이글(BME) 아미노산 용액, 미니멈 에센셜 미디엄 (MEM) 아미노산 용액 또는 헤파타민®(hepatamin®)용액중 어느 하나일 수 있다.
상기 바살 미디엄 이글(BME) 아미노산 용액은 1 내지 5중량부를 포함할 수 있다.
상기 미니멈 에센셜 미디엄 (MEM) 아미노산 용액은 0.5 내지 2중량부를 포함할 수 있다.
상기 헤파타민 용액은 0.1 내지 5 중량부를 포함할 수 있다.
상기 무혈청 간세포 동결보존용액은 수크로오스 또는 글루코스, 및 인슐린을 추가로 포함할 수 있다.
상기 수크로오스 또는 글루코스는 0.01 내지 300mM을 포함할 수 있다.
상기 인슐린은 100U/ml 인슐린을 1 내지 10중량부를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 상기 무혈청 간세포 동결보존용액에 간세포를 현탁하는 현탁액제조단계 및 상기 현탁액을 동결시키는 동결단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존방법을 제공한다.
상기 동결단계는 동결온도 감소율이 변화할 수 있다.
상기 동결온도 감소율은
(a) -1℃/분 속도로 0℃가 되도록 온도 조절되고;
(b) 0℃에서 8분간 유지되고;
(c) -3℃/분의 속도로 -10℃가 되도록 온도 조절되고;
(d) -1℃/분의 속도로 -25℃가 되도록 온도 조절되고;
(e) -50℃/분의 속도로 -75℃가 되도록 온도 조절되고;
(f) -75℃에서 1분간 유지되고;
(g) -12℃/분의 속도로 -40℃가 되도록 온도 조절되고;
(h) -1℃/분의 속도로 -80℃가 되도록 온도 조절될 수 있다.
본 발명에 의한 동결보존용액은 우태아혈청과 같은 동물성 추출물를 첨가하지 않음으로써 동결 및 해동과정에서 불필요한 감염 가능성을 배제할 수 있으며, 동결보존된 세포성 인공조직을 치료목적으로 사용할 수가 있다.
또한, 종래의 동결보존용액에 덱사메타손 및/또는 N-아세틸시스테인을 추가하여 종래보다 간세포의 생존율, 암모니아 제거율, 우레아 합성율 및 알부민 분비율이 향상되었다.
세포 동결보존의 전 단계에서 냉동보호제인 DMSO를 제외하고 세포를 현탁함으로써 이온과 삼투압 불균형 및 활성산소유리기의 생성으로 인한 세포손상을 감소시켜 장기간의 보관에도 충분한 고수준의 생존율과 활성 유지가 가능한 간세포를 제공할 수 있다.
본 발명의 개선된 간세포 동결보존방법은 간세포 뿐만 아니라 각종 조직 세포의 안정적인 공급이 가능하게 하여 간질환 생체외 시험 연구, 당뇨 모델 연구, 간신증후군 대사 연구, 간부전에 따른 다장기부전 연구, 중증 화상환자 간부전 연구, 혈우병 등 대사성 희귀질환 연구, 기타 체내 대사 연구의 소재로 활용될 수 있다. 특히, 본 발명에 의해 냉동보존된 칼슘-알지네이트 고정화 간세포 구상체는 전격성 간부전 환자를 치료하기위해 생인공간 시스템에 적용할 경우 응급상황에서 언제든지 해동하여 사용할 수 있으며, 생인공간 시스템 공급의 안정성이라는 측면뿐만 아니라 이종간 발생할 수 있는 병원성 세균이나 바이러스를 검사할 수 있는 충분한 시간을 제공하기 때문에 안전성도 향상시킬 수 있을 것이다.
도면 1은 FBS 그리고 개선된 무혈청 간세포 동결보존용액(modified JH solution, SM21, 22, 64)을 이용하여 일차 돼지 간세포 (primary pig hepatocyte)를 동결보존 시킨 후 1개월 후 해동하였을 때 간세포의 생존율(도면1(a)), 간세포의 암모니아 제거율(도면 1(b))을 나타낸 결과이다.
도면 2는 FBS 그리고 개선된 무혈청 간세포 동결보존용액(modified JH solution, SM21, 22, 64)을 이용하여 돼지 간세포 구상체 (pig hepatocyte spheroids)를 동결보존 시킨 후 1개월과 1년 후 해동하였을 때 간세포의 생존율(도면 2(a)),간세포의 암모니아 제거율(도면 2(b)) 을 나타낸 결과이다.
도면 3는 FBS 그리고 기존의 무혈청 간세포 동결보존용액(JH, 한국등록특허 제1480987호) 및 개선된 간세포 동결보존용액( modified JH solution SM21, SM64)을 이용하여 칼슘-알지네이트 비드로 캡슐화한 간세포 구상체를 6개월 동결보존 시킨 후 해동하였을 때 간세포의 생존율 및 부착율(도면 3(a)), 간세포의 암모니아 제거율(도면 3(b)), 간세포의 우레아 합성율(도면 3(c)), 간세포의 알부민 분비율(도면 3(d))을 나타내고, 살아있는 세포를 fluorescent calcein (FITC)으로 죽은 세포는 Ethidium homodimer-1 (PE)로 염색한 현미경 사진(도면 3(e))이다.
도면 4는 FBS를 포함하는 해동 용액(FBS), 20% 인간 혈청 알부민을 포함하는 해동용액(ALB) 및 개선된 무혈청 간세포 해동 용액(JHT)을 이용하여 동결된 간세포 구상체를 해동하였을 때 칼슘-알지네이트 비드로 캡슐화된 간세포를 동결보존 시킨 후 해동하였을 때 간세포의 생존율(도면 4(a)), 간세포의 암모니아 제거율(도면 4(b)), 간세포의 우레아 합성율(도면 4(c)), 간세포의 알부민 분비율(도면 4(d)나타낸 결과이다.
본 발명은 바이오산업핵심기술개발사업(유망바이오IP사업화촉진, 대한민국 산업통상자원부)의 간세포 스페로이드 동결보존 기술을 이용한 “off-the-shelf” 바이오인공간 사업화 연구과제(과제고유번호 : 10078349)의 결과물이다.
본 발명에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액은 간세포를 동결(cryopreservation) 및 보존하여 응급 시에 해동하여 인공간 시스템에서 즉시 사용할 수 있도록 한 용액으로서, 우태아혈청(FBS)을 제외하며, HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산) 용액, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 덱사메타손 및 인간 혈청 알부민을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 간세포(hepatocyte)는 일차 간세포, 간세포 구상체, 캡슐화된 간세포 및 캡슐화된 간세포 구상체를 포함할 수 있다. 특히 생인공간에 충진되는 최종 형태인 캡슐화된 간세포 구상체인 것이 바람직하다. 상기 캡슐화는 칼슘-알지네이트 비드(Ca-alginate bead)에 의한 것일 수 있다. 상기 칼슘-알지네이트 비드는 1 내지 2, 바람직하게는 1.5중량부의 알지네이트와 혼합되어 캡슐화될 수 있다.
종래 간세포 동결보존 용액은 단일세포인 일차 간세포에 적용되는 것으로, 구상체(spheroids) 또는 캡슐화된 간세포 및 캡슐화된 간세포 구상체에 대한 동결보존 용액은 존재하지 않았다. 따라서 일반적인 방법으로 간세포 구상체를 동결보존 할 경우, 구상체는 단일세포와 달리 세포-세포 간 접촉면적이 크므로 해동 후 세포 생존율이나 활성이 급격히 감소하였다. 또한, 종래 간세포 동결보존 용액으로는 생인공간에 충진되는 캡슐화된 간세포 및 캡슐화된 간세포 구상체에 있어 칼슘-알지네이트라는 새로운 고분자의 첨가로 인한 열역학적 거동의 변형을 방지할 수 없었다. 이에 반해 본 발명에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액은 특히 캡슐화된 간세포 및 캡슐화된 간세포 구상체에서 간세포의 생존율, 암모니아 제거율, 우레아 합성율 및 알부민 분비율이 우수하다.
본 발명에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액은 우태아혈청(FBS)을 포함하지 않으므로, 동결보존된 후 해동된 간세포에 별도의 정제를 가하지 않고 바로 생인공간에 충진되어 임상에 적용될 수 있다.
HTK 용액은 전체 용액 볼륨 대비 30 내지 70중량부 포함할 수 있다.
바람직하게는 40 내지 60중량부 포함할 수 있다. 특히, 50 내지 60중량부가 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액은 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 10 내지 30중량부 포함할 수 있다. 바람직하게는 13 내지 18중량부를 포함할 수 있다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 동결과 해동 과정에서 얼음결정의 형성을 최소화하지만 동결과 해동과정에서 발생하는 이온과 삼투압 불균형 및 활성산소유리기의 생성으로 인한 세포손상은 피할 수 없다는 문제점이 있으므로, 20중량부를 초과할 경우 세포손상의 위험성이 커진다. 반대로 10 중량부 미만으로 첨가할 경우 동결보존 효과가 작아진다.
그러나 캡슐화한 간세포 및 간세포 구상체의 경우, 칼슘-알지네이트라는 고분자의 첨가량을 고려하여 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 30중량부까지 포함할 수 있다.
상기 인간 혈청 알부민은 10 내지 40중량부 포함할 수 있다. 10중량부 미만일 경우 생존율이 낮아진다. 바람직하게는 10 내지 20중량부일 수 있다.
본 발명에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액은 수크로오스 또는 글루코스, 인간 혈청 알부민, 또는 인슐린을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 무혈청 간세포 동결보존용액은 추가로 아미노산 용액을 추가로 포함할 수 있다. 아미노산 용액에는 바살 미디엄 이글(BME) 아미노산 용액, MEM 아미노산 용액, 또는 헤파타민® 용액일 수 있다.
상기 바살 미디엄 이글(BME) 아미노산 용액은 바람직하게는 sigma B6766일 수 있으며, 상기 MEM 아미노산 용액은 바람직하게는 sigma M7145일 수 있다.
상기 헤파타민은 1L 중에 아미노초산(글리신) 6.750g, L-알라닌 5.475g, L-알기닌 4.500g, L-히스티딘 1.875g, L-루신 8.275g, L-이소루신 6.775g,L-라이신 HCl 6.934g, L-메티오닌 0.450g, L-페닐알라닌 0.600g, L-프로린 6.00g,L-세린 3.450g,L-쓰레오닌 3.375g,L-트립토판 0.375g,L-발린 6.3g 및 N-아세틸-l-시스테인 0.337g을 유효성분으로 포함하는 중외트로파민6%주(중외제약)일 수 있다.
상기 인슐린은 100U/ml으로 1 내지 10중량부 포함할 수 있다. 동결보존 후 간세포의 생존률 및 부착률을 고려하였을 때 바람직하게는 3 내지 5중량부를 포함할 수 있으며, 3중량부가 가장 바람직하다.
상기 바살 미디엄 이글(BME) 아미노산 용액은 1 내지 5중량부, 동결보존 후 간세포의 생존률 및 부착률을 고려하였을 때 바람직하게는 1 내지 3, 더욱 바람직하게는 2중량부를 포함할 수 있다. 상기 MEM 아미노산 (sigma M7145)은 0.5 내지 2중량부, 바람직하게는 1중량부를 포함할 수 있다.
상기 덱사메타손 용액(5mg/mL)은 0.1 내지 10중량부를 포함할 수 있다.
상기 아세틸시스테인 (NAC, N-acetyl cysteine) 은 0.01 내지 100mM을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위해, 무혈청 간세포 동결보존용액에 간세포를 현탁하는 현탁액 제조단계 및 상기 현탁액을 동결시키는 동결단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존방법을 제공한다.
상기 현탁액 제조단계는 HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산) 용액, 덱사메타손 및 인간 혈청 알부민을 포함하는 제1동결보존용액에 간세포를 현탁하는 현탁단계; 및 상기 간세포가 현탁된 제1동결보존용액에 HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산) 용액, 인간 혈청 알부민, 및 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함하는 제2동결보존용액을 첨가하는 첨가단계를 포함할 수 있다.
상기 제1동결보존용액은 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함하지 않을 수 있다.
상기 제1동결보존용액은 추가로 덱사메타손, 인슐린, 아미노산 용액 또는 글루코오스를 포함할 수 있다.
상기 제2동결보존용액은 본 발명에 따른 간세포 동결보존용액일 수 있다.
상기 제2동결보존용액은 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함하지 않는 제1동결보존용액에 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가한 것일 수 있다.
한편, 본 발명은 온도 조절을 이용한 간세포 동결보존 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 상기 동결보존 방법은 상기한 본 발명에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액을 이용할 수 있다.
상기 동결보존 방법은 속도제어 냉동기를 이용하여 챔버의 온도를 자동으로 조절할 수 있으며, -80℃까지 온도 변화율을 조절하여 간세포를 동결보존할 수 있다. 챔버의 온도가 아래와 같이 자동적으로 조절된다. (a) -1℃/분 속도로 0℃가 되도록 온도 조절; (b) 0℃에서 8분간 유지; (c) -3℃/분의 속도로 -10℃가 되도록 온도 조절;(d) -1℃/분의 속도로 -25℃가 되도록 온도 조절; (e) -50℃/분의 속도로 -75℃가 되도록 온도 조절; (f) -75℃에서 1분간 유지; (g) -12℃/분의 속도로 -40℃가 되도록 온도 조절; 및 (h) -1℃/분의 속도로 -80℃가 되도록 온도 조절.
상기한 바와 같이 본 발명에 따른 동결온도 감소율이 변화되는 것을 특징으로 하는 온도 조절을 이용한 간세포 동결보존 방법은 급냉(shock cooling program)과 서냉(slow cooling) 방식을 혼합한 것으로서, 동결보존 시 간세포의 생존율을 향상시키는 효과가 있다.
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예들을 통해 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서, 이하의 실시예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
실시예 1. 글루코스를 포함하지 않은 무혈청 간세포 동결보존용액 (SM21 용액)의 제조
HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산) 용액 58중량부, 20% 인간 혈청 알부민 20중량부, 100U/ml 인슐린 3중량부, 덱사메타손(Dexamethasone) 1중량부, 50X 바살 미디엄 이글(BME) 아미노산(sigma B6766) 2중량부, MEM 아미노산(sigma M7145) 1중량부, 및 디메틸 설폭사이드(DMSO) 15중량부를 혼합하여 무혈청 간세포 동결보존용액(SM21 용액)을 제조하였다.
실시예 2. 글루코스 200mM의 무혈청 간세포 동결보존용액(SM22 용액)의 제조
HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산) 용액 53중량부, 20% 인간혈청 알부민 20중량부, 4M 글루코스 5중량부, 100U/ml 인슐린 3중량부, 덱사메타손(Dexamethasone) 1중량부, 50X 바살 미디엄이글(BME) 아미노산(sigma B6766) 2중량부, MEM 아미노산(sigma M7145) 1중량부, 및 디메틸 설폭사이드(DMSO) 15중량부를 혼합하여 무혈청 간세포 동결보존용액(SM22 용액)을 제조하였다.
실시예 3. 글루코스를 포함하지 않은 무혈청 간세포 동결보존용액(SM64 용액)의 제조
HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산) 용액 56중량부, 20% 인간혈청 알부민 20중량부, 100U/ml 인슐린 3중량부, 덱사메타손(Dexamethasone) 1중량부, Hepatamine 2.5중량부, 아세틸시스테인 2.5중량부 및 디메틸 설폭사이드(DMSO) 15중량부를 혼합하여 무혈청 간세포 동결보존용액(SM22 용액)을 제조하였다.
실시예 4. 무혈청 간세포 해동용액 (JHT)
William’s E 배지에, 20% 인간혈청 알부민 20중량부, 200mM 글루코스, 10mM 아세틸시스테인을 혼합하여 무혈청 간세포 해동용액을 제조하였다.
비교예 1. HDM(호르몬 한정 배지)의 제조
William’s E 배지에 표피성장인자(EGF) 20ug/L, 인슐린(insulin) 10mg/L, 하이드로코티손 (hydrocortisone) 1.7 mg/L, 황산구리(CuSO4·5H2O) 24.97 ug/L, 황산아연(ZnSO4·7H2O) 14.38pg/L, 셀레늄산(H2SeO3) 3ug/L, 리놀레산 (linoleic acid) 50 mg/L, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 1.05g/L, HEPES 1.19 g/L, 페니실린(penicillin) 58.8 mg/L, 및 스트렙토마이신(streptomycin) 0.1 g/L을 첨가하고, 15중량부의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 HDM(호르몬 한정 배지)을 제조하였다.
비교예 2. 우태아 혈청(FBS) 용액의 제조
FBS 85중량부와 DMSO 15중량부를 혼합하여 우태아 혈청(FBS) 용액을 제조하였다.
비교예 3. 글루코스를 포함하지 않은 무혈청 간세포 동결보존용액 (JH 용액)의 제조
HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산) 용액 59중량부, 20% 인간 혈청 알부민 20중량부, 100U/ml 인슐린 3중량부, 50X 바살 미디엄 이글(BME) 아미노산(sigma B6766) 2중량부, MEM 아미노산(sigma M7145) 1중량부, 및 디메틸 설폭사이드(DMSO) 15중량부를 혼합하여 무혈청 간세포 동결보존용액(JH 용액)을 제조하였다.
비교예 4. 우태아 혈청(FBS)을 포함하는 해동용액의 제조
FBS 10중량부와 Williams'E medium 90중량부를 혼합하여 우태아 혈청(FBS) 해동용액을 제조하였다.
비교예 5. 20% 인간 혈청 알부민을 포함하는 해동용액 (ALB)의 제조
20% 인간 혈청 알부민을 20중량부와 Williams'E medium 80중량부를 혼합하여 인간 혈청 알부민을 포함하는 해동용액 (ALB)을 제조하였다.
실험예 1. 돼지 간세포 분리
Seglen(Seglen PO. Preparation of rat liver cells. 3.Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp Cell Res 82:391, 1973)에 기재된 방법에서 수정한 2단계 인 시튜(in situ) 콜라게나아제(collagenase) 관류 기법을 이용하여 10kg의 3주 돼지로부터 간세포를 분리하였다. 모든 실험은 미국실험동물관리협회(AALAC)의 가이드라인에 따라 수행되었다.
실험예 2. 돼지 간세포 구상체 제조
돼지 간세포는 spinner flask에 비교예 1의 HDM 배지를 이용하여 1x10^6/mL의 농도로 seeding 하고 15rpm의 속도로 교반하면서 10-12시간 배양하여 구상체를 형성한다.
실험예 3. 칼슘-알지네이트 캡슐화된 돼지 간세포 구상체의 제조
돼지 간세포 구상체를 3x10^7 cells/ml의 농도로 1.5중량부의 알지네이트와 혼합하고, 100mmol/L의 칼슘용액에 투입하였다. 이후 고농도/고속도 고정기기에 투입하여 칼슘-알지네이트 캡슐화된 돼지 간세포를 제조하였다.
실험예 4. 돼지 간세포의 동결보존 실험
실험예 1에 따라 돼지로부터 분리된 일차 간세포에 실시예 1, 2, 3, 및 비교예 2의 용액을 각각 혼합하여 현탁액을 제조하였다.
상기 현탁액은 얼음 위에서 대기하다가 속도제어 냉동기(Thermo Forma의 CryoMed 사용)로 투입시켜 동결시켰다. 속도제어 냉동기 내에서 챔버의 온도 조절은 (a) -1℃/분 속도로 0℃가 되도록 온도 조절; (b) 0℃에서 8분간 유지; (c) -3℃/분의 속도로 -10℃가 되도록 온도 조절; (d) -1℃/분의 속도로 -25℃가 되도록 온도 조절; (e) -50℃/분의 속도로 -75℃가 되도록 온도 조절; (f) -75℃에 서 1분간 유지; (g) -12℃/분의 속도로 -40℃가 되도록 온도 조절; 및 (h) -1℃/분의 속도로 -80℃가 되도록 온도 조절에 의해 이루어졌다(JH program). 챔버 및 세포 현탁액의 온도는 냉동기의 온도 감지기에 의해 연속적으로 측정하였다. 동결과정이 끝난 후 세포 현탁액이 담긴 동결 바이알을 액체 질소에 담갔다.
1개월 후 동결보존된 간세포들을 37℃의 워터배스에서 급속 해동시켰다. 비교예 4의 해동용액을 상기 해동된 용액의 50배 부피로 첨가한 후 부드럽게 혼합하였다. 세포들을 50g, 4℃, 3분간 3회 원심 분리하여 세척하고 냉동보존액을 제거하였다. 상기 세포들을 5x10^5cells/ml 농도로 HDM(호르몬 한정 배지)에 투입하였다.
실험예 5. 돼지 간세포 구상체의 동결보존 실험
실험예 2에 따라 제조된 돼지 간세포 구상체를 실시예 1, 2, 3, 및 비교예 2의 용액을 각각 혼합하여 현탁액을 제조하였다.
상기 현탁액은 얼음 위에서 대기하다가 속도제어 냉동기(Thermo Forma의 CryoMed 사용)로 투입시켜 동결시켰다. 속도제어 냉동기 내에서 챔버의 온도 조절은 (a) -1℃/분 속도로 0℃가 되도록 온도 조절; (b) 0℃에서 8분간 유지; (c) -3℃/분의 속도로 -10℃가 되도록 온도 조절; (d) -1℃/분의 속도로 -25℃가 되도록 온도 조절; (e) -50℃/분의 속도로 -75℃가 되도록 온도 조절; (f) -75℃에 서 1분간 유지; (g) -12℃/분의 속도로 -40℃가 되도록 온도 조절; 및 (h) -1℃/분의 속도로 -80℃가 되도록 온도 조절에 의해 이루어졌다(JH program). 챔버 및 세포 현탁액의 온도는 냉동기의 온도 감지기에 의해 연속적으로 측정하였다. 동결과정이 끝난 후 세포 현탁액이 담긴 동결 바이알을 액체 질소에 담갔다.
1개월 그리고 1년 후, 각각 동결보존된 간세포들을 37℃의 워터배스에서 급속 해동시켰다. 비교예 4의 해동용액을 상기 해동된 용액의 50배 부피로 첨가한 후 부드럽게 혼합하였다. 세포들을 50g, 4℃, 3분간 3회 원심 분리하여 세척하고 냉동보존액을 제거하였다. 상기 세포들을 5x10^5cells/ml 농도로 HDM(호르몬 한정 배지)에 투입하였다.
실험예 6. 캡슐화된 돼지 간세포 구상체 동결보존 실험
실시예 1에서 디메틸 설폭사이드(DMSO) 용약을 22.5중량부로 늘리고 HTK 용액을 50.5중량부로 줄인 용액과, 실시예 3에서 디메틸 설폭사이드(DMSO) 용약을 22.5중량부로 늘리고 HTK 용액을 48.5중량부로 줄인 용액 및 비교예 2, 3의 용액을 각각 1.8mL 의 동결바이알에 0.5mL 넣고 캡슐화된 돼지 간세포 구상체를 0.5mL 넣어 혼합하여 제조하였다. 모든 과정은 얼음위에서 행해진다.
상기 캡슐이 포함된 바이알은 얼음 위에서 대기하다가 속도제어 냉동기(Thermo Forma의 CryoMed 사용)로 투입시켜 동결시켰다. 속도제어 냉동기 내에서 챔버의 온도 조절은 (a) -1℃/분 속도로 0℃가 되도록 온도 조절; (b) 0℃에서 8분간 유지; (c) -3℃/분의 속도로 -10℃가 되도록 온도 조절; (d) -1℃/분의 속도로 -25℃가 되도록 온도 조절; (e) -50℃/분의 속도로 -75℃가 되도록 온도 조절; (f) -75℃에 서 1분간 유지; (g) -12℃/분의 속도로 -40℃가 되도록 온도 조절; 및 (h) -1℃/분의 속도로 -80℃가 되도록 온도 조절에 의해 이루어졌다(JH program). 챔버 및 세포 현탁액의 온도는 냉동기의 온도 감지기에 의해 연속적으로 측정하였다. 동결과정이 끝난 후 세포 현탁액이 담긴 동결 바이알을 액체 질소에 담갔다.
6달 후 동결보존된 캡슐화된 간세포 구상체들을 37℃의 워터배스에서 급속 해동시켰다. 비교예 4의 해동용액을 상기 해동된 용액의 50배 부피로 첨가한 후 부드럽게 혼합하였다. 세포들을 50g, 4℃, 3분간 3회 원심 분리하여 세척하고 냉동보존액을 제거하였다. 상기 캡슐화된 간세포 구상체는 5x10^5cells/ml 농도로 HDM(호르몬 한정 배지)에 투입하였다.
실험예 7. 동결보존된 간세포의 생존율, 부착율, 및 암모니아 제거율, 우레아 분비율 및 알부민 합성율 측정
실험예 4, 5, 6에 따라 동결보존된 돼지 간세포의 생존율을 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 컨버젼에 의하여 측정하였다. 암모니아 제거율, 우레아 분비율, 알부민 합성율은 Lee(Lee JH, Lee DH, Son JH, et al: Optimization of chitosanalginate encapsulation process using pig hepatocytes for development of bioartificial liver. J Microbiol Biotechnol 15:7, 2005)의 방법에 따라 측정하였다. 모든 데이터는 3회 실험의 평균값이다.
도면 1(a)은 본 발명에 따라 실시예 1, 실시예2, 비교예 2 및 실시예 3에 따른 간세포 동결보존 용액을 이용하여 돼지 간세포(Pig hepatocyte)를 동결 보존시킨 후 해동하였을 때 간세포의 생존율 및 부착율을 나타낸 그래프이다. 해동 후(thawing) 생존율(검은색 그래프), 부착율(회색 그래프)을 나타내었다.
본 발명의 실시예 1에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액(SM21 용액)은 종래 동결보존용액으로 사용된 우태아혈청(FBS) 용액 대비 20% 이상의 높은 생존율을 보였다.
암모니아 제거율의 경우, 본 발명의 실시예 1과 실시예 3에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액(SM21, SM64 용액)은 종래 동결보존용액으로 사용된 우태아혈청(FBS) 용액 대비 30% 이상의 높은 암모니아 제거율을 보였다. (도면 1(b))
도면 2(a)는 본 발명에 따라 실시예 1, 실시예2, 비교예 2 및 실시예 3에 따른 간세포 동결보존 용액을 이용하여 돼지 간세포 구상체(Pig hepatocyte spheroids)를 동결 보존시킨 후 해동하였을 때 간세포 구상체의 생존율 및 부착율을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 실시예 2에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액(SM22 용액)은 종래 동결보존용액으로 사용된 우태아혈청(FBS) 용액 대비 25% 이상의 높은 생존율을 보였다.
암모니아 제거율의 경우, 본 발명의 실시예 2와 실시예 3에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액(SM22, SM64 용액)은 종래 동결보존용액으로 사용된 우태아혈청(FBS) 용액 대비 15% 이상의 높은 암모니아 제거율을 보였다. (도면 2(b))
도면 3(a)는 본 발명에 따라 실시예 1, 실시예 3, 비교예 2 및 실시예 3에 따른 간세포 동결보존 용액을 이용하여 캡슐화된 돼지 간세포 구상체를 동결 보존시킨 후 해동하였을 때 생존율을 나타낸 그래프이다. 막대그래프는 해동 후(thawing) 생존율(검은색 그래프), 2일째 생존율(회색 그래프)을 나타내었다.
본 발명의 실시예 1과 실시예 3에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액(SM21, SM64 용액)은 종래 동결보존용액으로 사용된 우태아혈청(FBS) 용액 대비 25% 이상의 높은 생존율을 보였으며 기존의 JH용액 대비 9%이상 높은 생존율을 나타내었으며 2일째 생존율의 경우 우태아혈청(FBS) 용액과 기존의 JH용액 대비 30%이상 높은 생존율을 나타내었다.
암모니아 제거율의 경우, 본 발명의 실시예 1과 실시예 3에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액 (SM21, SM64 용액)은 종래 동결보존용액으로 사용된 우태아혈청(FBS) 용액 대비 83% 이상의 높은 제거율을 보였으며 기존의 JH용액 대비 49%이상 높은 제거율을 나타내었다. (도면 3(b))
우레아 분비율의 경우, 본 발명의 실시예 1과 실시예 3에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액 (SM21, SM64 용액)은 종래 동결보존용액으로 사용된 우태아혈청(FBS) 용액 대비 2.7배, 3.2배 높은 분비율을 보였으며 기존의 JH용액 대비 1.4배 이상 높은 분비율을 나타내었다. (도면 3(c))
알부민 합성능의 경우, 본 발명의 실시예 1과 실시예 3에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액 (SM21, SM64 용액)은 종래 동결보존용액으로 사용된 우태아혈청(FBS) 용액 대비 2배 이상의 높은 합성능을 보였으며 기존의 JH용액 대비 1.4배 이상 높은 합성율을 나타내었다. (도면 3(d))
도면 3(e)는 해동 후 캡슐내에 살아있는 간세포 구상체를 Fluorescent calcein (FITC)으로 죽은 세포는 Ethidium homodimer-1 (PE)로 염색한 형광염색 현미경사진이다. 본 발명의 실시예 1과 실시예 3에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액 (SM21, SM64 용액)에서 살아있는 간세포의 초록색 형광을 확인할 수 있다.
실험예 8. 동결된 돼지 간세포 구상체 캡슐의 해동 용액 비교 실험
실험예 6에서와 같이 1.8mL 의 동결바이알에 캡슐화된 돼지 간세포 구상체를 0.5mL 넣고 비교예 2를 혼합하여 동결보존하였다.
6개월 후 동결보존된 캡슐화된 간세포 구상체들을 37℃의 워터배스에서 급속 해동시켰다. 실시예 4 및 비교예 4, 5의 해동용액을 상기 해동된 용액의 50배 부피로 첨가한 후 부드럽게 혼합하였다. 세포들을 50g, 4℃, 3분간 3회 원심 분리하여 세척하고 냉동보존액을 제거하였다. 상기 캡슐화된 간세포 구상체는 5x10^5cells/ml 농도로 HDM(호르몬 한정 배지)에 투입하였다.
도면 4는 칼슘-알지네이트 비드로 캡슐화된 간세포 구상체를 FBS용액을 이용하여 동결보존 후 해동 시 FBS가 포함된 해동 배지 그리고 무혈청 간세포 해동 용액을 이용하여 비교한 실험결과이다.
현재 대부분의 무혈청 동결용액을 개발하고자 하는 문헌에서 무혈청 동결 후 해동공정에서는 혈청을 포함한 용액 (10% FBS를 포함)을 사용하고 있음. 이는 혈청이 동결과정 중 손상된 세포막의 안정화에 기여하는 것으로 생각되며 특히 단일 세포의 경우 부착율에 크게 영향을 미친다.
본 발명에서는 기존의 혈청을 대신하여 20% 인간 혈청 알부민을 사용하였으며 아세틸시스테인 (NAC)을 첨가하였다.
NAC는 항산화제로 해동 시 발생하는 손상 (warm injury)를 줄여주는 역활을 수행한다고 볼 수 있다.
도면 4(a)는 본 발명에 따라 비교예 2로 동결 보존 후 비교예 4, 비교예 5 및 실시예 4에 따른 간세포 해동 용액을 이용하여 캡슐화된 돼지 간세포 구상체를 해동하였을 때 생존율을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 실시예 4에 따른 무혈청 간세포 해동용액 (JHT 용액)은 종래 해동용액으로 사용된 우태아혈청(FBS)이 포함된 용액 대비 18% 이상의 높은 생존율을 나타내었다.
암모니아 제거율의 경우, 실시예 4에 따른 무혈청 간세포 해동용액 (JHT 용액)은 종래 해동용액으로 사용된 우태아혈청(FBS)이 포함된 용액과 비슷한 제거율을 나타내었다. (도면 4(b))
우레아 분비율의 경우, 본 발명의 실시예 4에 따른 무혈청 간세포 해동용액 (JHT 용액)은 종래 해동용액으로 사용된 우태아혈청(FBS)이 포함된 용액 대비 1.6배 높은 분비율을 나타내었다. (도면 4(c))
알부민 합성능의 경우, 본 발명의 실시예 4에 따른 무혈청 간세포 해동용액 (JHT 용액)은 종래 해동용액으로 사용된 우태아혈청(FBS)이 포함된 용액 대비 1.3배 이상의 높은 합성능을 보였으며 2일째 알부민 합성능의 경우 1.7배 이상 높은 합성율을 나타내었다. (도면 4(d))

Claims (16)

  1. HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산) 용액, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 덱사메타손 및 인간 혈청 알부민을 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 간세포는 일차 간세포, 간세포 구상체, 캡슐화된 간세포 및 캡슐화된 간세포 구상체를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 캡슐화된 간세포 및 캡슐화된 간세포 구상체는 칼슘-알지네이트 비드 (Ca-alginate bead)로 캡슐화된 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 HTK 용액은 30 내지 70중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 디메틸 설폭사이드(DMSO)은 10 내지 30 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 인간 혈청 알부민은 20% 인간 혈청 알부민으로 10 내지 40 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 덱사메타손은 5mg/ml 으로 0.1 내지 10 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 무혈청 간세포 동결보존용액은 N-아세틸시스테인 (NAC, N-acetyl cysteine)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 N-아세틸시스테인은 0.01 내지 100mM을 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 무혈청 간세포 동결보존용액은 아미노산 용액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 아미노산 용액은 바살 미디엄 이글(BME) 아미노산 용액, 미니멈 에센셜 미디엄 (MEM) 아미노산 용액 또는 헤파타민®(hepatamin®)용액중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 무혈청 간세포 동결보존용액은 인슐린을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 인슐린은 100U/ml 인슐린으로 1 내지 10중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존용액.
  14. 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 따른 무혈청 간세포 동결보존용액에 간세포를 현탁하는 현탁액제조단계 및 상기 현탁액을 동결시키는 동결단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 동결단계는 동결온도 감소율이 변화하는 것을 특징으로 하는 무혈청 간세포 동결보존방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 동결온도 감소율은
    (a) -1℃/분 속도로 0℃가 되도록 온도 조절되고;
    (b) 0℃에서 8분간 유지되고;
    (c) -3℃/분의 속도로 -10℃가 되도록 온도 조절되고;
    (d) -1℃/분의 속도로 -25℃가 되도록 온도 조절되고;
    (e) -50℃/분의 속도로 -75℃가 되도록 온도 조절되고;
    (f) -75℃에서 1분간 유지되고;
    (g) -12℃/분의 속도로 -40℃가 되도록 온도 조절되고;
    (h) -1℃/분의 속도로 -80℃가 되도록 온도 조절되는 것을 특징하는 무혈청 간세포 동결보존방법.
PCT/KR2018/016677 2018-11-29 2018-12-26 간세포 및 캡슐화한 간세포 구상체의 동결 보존을 위한 동결보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 동결보존법 Ceased WO2020111372A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180151073A KR102148998B1 (ko) 2018-11-29 2018-11-29 간세포 및 캡슐화한 간세포 구상체의 동결 보존을 위한 동결보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 동결보존법
KR10-2018-0151073 2018-11-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020111372A1 true WO2020111372A1 (ko) 2020-06-04

Family

ID=70853324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/016677 Ceased WO2020111372A1 (ko) 2018-11-29 2018-12-26 간세포 및 캡슐화한 간세포 구상체의 동결 보존을 위한 동결보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 동결보존법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102148998B1 (ko)
WO (1) WO2020111372A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022017763A1 (en) * 2020-07-23 2022-01-27 Xvivo Perfusion Ab Organ preservation and/or perfusion solution

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102319110B1 (ko) 2021-07-12 2021-10-29 주식회사 이노스템바이오 세포성 바이오 의약품의 장기 보존을 위한 동결보존액 조성물
WO2025155129A1 (ko) * 2024-01-19 2025-07-24 주식회사 모닛셀 지방조직 유래 줄기세포 분리 및 동결 보존용 조성물

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006524260A (ja) * 2003-04-23 2006-10-26 ヒューマン バイオシステムズ ドナー臓器の貯蔵用の改良された方法及び溶液
KR20140132648A (ko) * 2013-05-08 2014-11-18 사회복지법인 삼성생명공익재단 간세포 동결 보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 간세포 동결 보존방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200042022A (ko) * 2010-12-30 2020-04-22 안트로제네시스 코포레이션 세포의 동결보존 및 캡슐화 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006524260A (ja) * 2003-04-23 2006-10-26 ヒューマン バイオシステムズ ドナー臓器の貯蔵用の改良された方法及び溶液
KR20140132648A (ko) * 2013-05-08 2014-11-18 사회복지법인 삼성생명공익재단 간세포 동결 보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 간세포 동결 보존방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE, J.-H. ET AL.: "Cryopreservation of immobilized rat hepatocytes for the development of a bioartificial liver system", TRANSPLANTATION PROCEEDINGS, vol. 44, 2012, pages 1005 - 1008, XP028482402, DOI: 10.1016/j.transproceed.2012.03.050 *
LEE, J.-H. ET AL.: "Stow cooling rate with a shock cooling program can effectively cryopreserve pig hepatocytes", TRANSPLANTATION PROCEEDINGS, vol. 44, 2012, pages 1002 - 1004, XP028482401, DOI: 10.1016/j.transproceed.2012.01.105 *
PUHL, GERO ET AL.: "Low viscosity histidine-tryptophan-ketoglutarate graft flush improves subsequent extended cold storage in University of Wisconsin solution in an extracorporeal rat liver perfusion and rat liver transplantation model", LIVER TRANSPLANTATION, vol. 12, 2006, pages 1841 - 1849, XP055711732 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022017763A1 (en) * 2020-07-23 2022-01-27 Xvivo Perfusion Ab Organ preservation and/or perfusion solution
US12568959B2 (en) 2020-07-23 2026-03-10 Xvivo Perfusion Ab Organ preservation and/or perfusion solution

Also Published As

Publication number Publication date
KR102148998B1 (ko) 2020-08-27
KR20200064680A (ko) 2020-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2332701C (en) Medium and matrix for long-term proliferation of cells
TWI670371B (zh) 用於細胞冷凍保存的組成物和方法
US20220104481A1 (en) Cryopreservation of stem cells
WO2020111372A1 (ko) 간세포 및 캡슐화한 간세포 구상체의 동결 보존을 위한 동결보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 동결보존법
EP2998389A1 (en) Production method for sheet-shaped cell culture
CN107183012A (zh) 人体干细胞的冷冻液及冷冻储存方法
JPH09509827A (ja) 機能性ヒト組織の再生と利用
CN110495450B (zh) 一种细胞冻存运输液及其应用
AU2011316904B2 (en) Cultured pancreas islets
KR101480987B1 (ko) 간세포 동결 보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 간세포 동결 보존방법
US20070086986A1 (en) Preparation of three-dimensional mammalian ovarian follicular cell and ovarin follicle culture systems in a biocompatible matrix
US20220192178A1 (en) Trehalose-containing liquid for mammalian cell preservation
KR20030094224A (ko) 세포의 보존방법
CN116458493A (zh) 一种无dmso的干细胞保存液及其制备方法和使用方法
KR19990014353A (ko) 췌도의 대량 배양증식방법
CN1078248C (zh) 分泌胰岛素的细胞系,生产方法及应用
JP6475242B2 (ja) ホウ素添加細胞低温保存培地
WO2023286962A1 (ko) 세포성 바이오 의약품의 장기 보존을 위한 동결보존액 조성물
Mariana et al. Hepatocytes isolation from adult rats for liver recellularization
Plaksina et al. Cryopreservation of multicellular spheroids derived from newborn piglet adrenal glands
EP4501337A1 (en) Corneal endothelial cell preparation containing no culture-derived component, and method for producing same
CN113999810B (zh) 一种mrc-5细胞复苏培养液以及复苏方法
WO2013002553A2 (ko) 반월상 연골 이식을 위한 연골세포의 증식방법
WO2021261961A1 (ko) 장기칩의 동결보존 방법
CN121080478A (zh) 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18941775

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18941775

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1