WO2020101185A1 - 삼차원 공배양을 통한 신생혈관능이 증가된 이식용 지방줄기세포 시트 및 이의 제조방법 - Google Patents

삼차원 공배양을 통한 신생혈관능이 증가된 이식용 지방줄기세포 시트 및 이의 제조방법 Download PDF

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stem cell
adipose stem
cell sheet
dimensional
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임도선
주형준
김종호
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Korea University Research and Business Foundation
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    • C12N2502/1382—Adipose-derived stem cells [ADSC], adipose stromal stem cells
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    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers

Definitions

  • the present invention relates to an adipose stem cell sheet for transplantation with increased angiogenesis, and more specifically, it contains a three-dimensional globular cell characterized in that three-dimensional globular cells of adipose stem cells are co-cultured on a sheet composed of adipose stem cells. It relates to a fat stem cell sheet and a method for manufacturing the same.
  • Stem cells are cells that have the ability to differentiate into any tissue. As undifferentiated cells, differentiation rates to various cells can be increased by providing appropriate environmental, chemical, and physical conditions. Selective regenerative therapies that change the differentiation ability and environmental, chemical and physical conditions of these stem cells have been actively studied.
  • adipose stem cells are one of stem cells capable of differentiating into specific cells of various tissues or organs because they have the same multi-differentiation ability, and have functions to induce growth and development of tissues and maintenance and regeneration of adult tissues.
  • Adipose stem cells unlike embryonic stem cells extracted from human embryos, have less ethical problems because they are extracted from adult tissues, have excellent self-renewal ability, and have multipotential effects such as fat, bone, cartilage, vascular endothelial and cardiomyocytes.
  • adipose stem cells play an important role in the differentiation or proliferation of peripheral cells through secretion of growth factors including various cytokines (Kim et al., Tissue Eng Part A. 23: 1-11, 2017).
  • transplantation After transplantation of stem cells for damaged organs and tissue regeneration, a case of restoring damage has been reported (Strauer et al., Circulation 106: 1913, 2002), and the method of transplanting stem cells directly to damaged organs or tissues There are a method of injecting stem cells and a method of injecting into blood vessels.
  • transplanted stem cells have a low engraftment rate, and most are reported to be washed out.
  • transplantation is carried out by increasing the amount and frequency of stem cells, but there is a problem in that the number of cells in a high concentration must be continuously repeated, and even if the transplantation is successful, the therapeutic effect beyond expectations is expected due to the poor cell environment. There is a limit to the look.
  • transplantation using the existing sheet-forming technique requires a technique to overcome this, since the angiogenesis is lower than expected after transplantation into an organ.
  • the present inventors confirmed that the expression of angiogenesis-related markers increased in three-dimensional globular cells obtained by culturing adipose stem cells in wells pretreated with poly-2-hydroxyethyl methacrylate. (Republic of Korea Patent Registration 10-188151), the engraftment rate at the time of animal transplantation is low, and improvement in angiogenesis is also necessary.
  • the present inventors successfully transplanted stem cells to create a cellular environment with high angiogenesis, and as a result of their diligent efforts, three-dimensional globular cells with increased angiogenesis obtained through three-dimensional co-culture and autologous adipose stem cells as supports
  • the sheet was co-cultured with adipose stem cell sheet for transplantation, and applied to an animal model of ischemia of the lower limb, it was confirmed that it exhibited high stem cell engraftment rate and angiogenesis, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a fat stem cell sheet containing three-dimensional globular cells having a high engraftment rate and angiogenesis when transplanted into a human body.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a fat stem cell sheet containing three-dimensional globular cells exhibiting high stem cell engraftment rate and angiogenesis.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating ischemic disease containing adipose stem cell sheet containing the three-dimensional globular cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating or preventing ischemic disease, comprising administering a fat stem cell sheet containing the three-dimensional globular cells.
  • the present invention provides a fat stem cell sheet containing three-dimensional globular cells, characterized in that the three-dimensional globular cells of the fat stem cells are co-cultured on the fat stem cell sheet.
  • the present invention also, (a) culturing adipose stem cells to produce adipose stem cell sheet; (b) culturing adipose stem cells in a well pretreated with poly-2-hydroxyethyl methacrylate to prepare three-dimensional globular cells; And (c) co-culturing the adipose stem cell sheet prepared in step (a) and the three-dimensional globular cells prepared in step (b) to produce a fat stem cell sheet containing three-dimensional globular cells.
  • a method of manufacturing a fat stem cell sheet containing spherical cells are provided.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating ischemic disease containing adipose stem cell sheet containing the three-dimensional globular cells.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing ischemic disease, comprising administering a sheet of adipose stem cells containing the three-dimensional globular cells.
  • the present invention also provides the use of adipose stem cell sheet containing the three-dimensional globular cells for the treatment or prevention of ischemic disease.
  • the present invention also provides the use of adipose stem cell sheets containing the three-dimensional globular cells for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of ischemic disease.
  • 1 is 1 x 10 5 ⁇ 5 X 10 5 adipose stem cells seeded in a 6-well plate pretreated with poly-2-hydroxyethyl methacrylate, 24 hours and 48 This is a photograph obtained by using an optical microscope to change the morphology of three-dimensional spherical cells over time while continuing to incubate for a period of time.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • Figure 2 shows the expression of mature vascular endothelial factors FGF1, FGF2, CD144, Efnb4, Hey1, Hes1, Lyve1, Nrp1, Nrp2, Nos3, Nr2f2, Robo4, Sox17, Tie1, Tie2, vWF and Zo1 in cultured three-dimensional globular cells. It shows the results confirmed at the mRNA level.
  • Figure 3 shows the results of comparing the hypoxic related factor HIF-1 ⁇ in the cultured three-dimensional globular cells at the protein and mRNA level.
  • FIG. 4 is a photograph obtained by using an optical microscope to produce 1 x 10 6 fat stem cells after seeding, and cultured in a 5% CO 2 cell incubator for 24 hours after seeding 1 x 10 6 fat stem cells. .
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • B is a photograph obtained by seeding 5 X 10 5 , 1 X 10 6 and 2 X 10 6 fat stem cells, and culturing in a 5% CO 2 cell incubator at 37 ° C. for 24 hours using an optical microscope. to be.
  • Figure 6 shows the results confirmed by staining the representative factors related to angiogenesis in the three-dimensional co-cultured adipose stem cell sheet FGF2, PDGF and CD144 by immunofluorescence staining.
  • FIG. 7 shows the results of comparing various cytokines and growth factors secreted from a normal cultured adipose stem cell, a three-dimensional globular cell, and an adipose stem cell sheet having increased angiogenesis in a cytokine array technique.
  • FIG. 8 is a photograph confirming the degree of improvement of blood flow through a laser Doppler 28 days after implantation of a three-dimensional spherical cell, adipose stem cell sheet, and adipose stem cell sheet with increased angiogenesis in the lower limb ischemia animal model.
  • Figure 9 is acute myocardial infarction animal model in the heart of the three-dimensional globular cells, fat stem cell sheet and angiogenesis-enhanced fat stem cell sheet 42 days after implantation, myocardial infarction to determine whether myocardial infarction (Masson's trichrome) staining This is a cross-section of the heart confirmed by the technique.
  • stem cell treatment of ischemic vascular disease is currently in a standstill is that the rate at which transplanted cells differentiate into vascular endothelial cells is very small.
  • cell transplantation using stem cells has been attempted in various ways for a long time, and a method of using a cell sheet as one of the stem cell transplantation methods has been recently attempted. It is possible to manufacture a sheet by mixing a multi-layer or a cell, but when transplanted into a tissue to be actually transplanted, there was a limit in the degree of engraftment and the effect of enhancing angiogenesis.
  • While simulating the in vivo environment, securing the cells with increased angiogenesis through the formation of three-dimensional globular cells obtained through three-dimensional co-cultivation of fat stem cells, and the fat stem cells as a support are autologous cells and can be cultured of mixed cells. By providing a base, it increases the stable engraftment rate and has the advantage of maximizing the function of the mixed cells in proliferation and survival.
  • a new adipose stem cell sheet with improved new angiogenic function was prepared.
  • the present invention relates to an adipose stem cell sheet containing three-dimensional globular cells, characterized in that three-dimensional globular cells of adipose stem cells are co-cultured on a sheet composed of adipose stem cells.
  • the implantable adipose stem cell sheet having increased angiogenesis according to the present invention is superior to an angiogenesis function using only the existing cell sheet and three-dimensional globular cells, and is easy to manipulate the manufacturing method.
  • it is a method to minimize the economic burden through the supply of growth factors and cytokines and the time to prepare for cell transplantation in the study for the purpose of promoting new blood vessels. It is possible to expect an improved effect of cell therapy through the corresponding sheet in organs and tissues requiring few cell transplants.
  • the three-dimensional globular cells may be characterized by being prepared by culturing adipose stem cells in wells pretreated with poly-2-hydroxyethyl methacrylate.
  • the co-culture may be characterized in that the adipose stem cell sheet and the three-dimensional globular cells are seeded and cultured at a ratio of 4 to 1: 0.2 to 2 cells, more preferably 2 to 1: 0.5. It can be characterized as ⁇ 1.
  • adipose stem cells present in the living body discharges a variety of growth factors, and when the same is cultured with the angiogenesis function, It was confirmed that the expression of related cytokines and growth factors increased.
  • the technology for making three-dimensional globular cells can secure three-dimensional globular cells without difficulty through three-dimensional co-culture within a short time by using poly-2-hydroxyethyl methacrylate pretreatment technology.
  • adipose stem cells as a support have the advantage of being able to easily create and recover cell sheets of various layers using purely adipose stem cells without using other chemical treatments or materials other than living organisms.
  • the implantable adipose stem cell sheet having increased angiogenesis according to the present invention is compared with the results of transplantation studies of various stem cells previously reported in the treatment study of damaged tissue in the lower limb ischemia mouse model and myocardial infarction rat model.
  • the angiogenesis is more excellent. This could be expected to have an advantageous effect to shorten the treatment time in the target tissue.
  • the present invention is a very useful invention in the fields of basic differentiation and regenerative engineering, cell engineering, tissue engineering, and medical and biological fields.
  • a transplantable adipose stem cell sheet with increased angiogenesis was produced.
  • the co-cultured transplanted adipose stem cell sheet with increased angiogenesis has the advantage of being easy to recover, and can exhibit a high engraftment rate and angiogenic effect when transplanted into the body.
  • the present invention in another aspect, (a) culturing adipose stem cells to produce adipose stem cell sheet; (b) culturing adipose stem cells in a well pretreated with poly-2-hydroxyethyl methacrylate to prepare three-dimensional globular cells; And (c) co-culturing the adipose stem cell sheet prepared in step (a) and the three-dimensional globular cells prepared in step (b) to produce a fat stem cell sheet containing three-dimensional globular cells. It relates to a method for producing a fat stem cell sheet containing spherical cells.
  • the cells used as a support are characterized by fat stem cells.
  • Adipose stem cells used as a support are preferred to use adipose stem cells for maximizing the cooperative effect with cells to be mixed as differentiation into various cells and recovery effects in damaged organs and tissues have been reported.
  • human-derived adipose stem cells in the present invention are used, the present invention is not limited thereto, and can be applied to adipose stem cells isolated from all mammals including mice, white paper, pigs, and monkeys.
  • Adipose stem cells to be co-cultured in a 6-well plate pretreated with poly-2-hydroxyethyl methacrylate for production of the support and three-dimensional globular cells are derived from in vivo and can undergo engraftment and proliferation in damaged organs and tissues after in vivo transplantation. Stem cells that are compatible with surrounding tissue and minimize inflammatory response.
  • adipose stem cells The origin of adipose stem cells is not particularly limited in its kind in the present invention, but adipose tissue collectively refers to all adipose tissue regardless of its location in the body, including mature fat cells. In the present invention, representative human-derived adipose stem cells were used.
  • the three-dimensional globular cells are preferably included as 1 X 10 5 ⁇ 1 X 10 6 / well when cultured in a 6-well plate, more It is preferably 5 X 10 5 individuals.
  • Adipose stem cells for the support sheet, when cultured in a 6-well plate preferably contains 5 X 10 5 ⁇ 2 X 10 6 pieces, more preferably 1 X 10 6 pieces.
  • the number of fat stem cells is less than the suggested number of cells, there is a problem in the low survival rate of fat stem cells and formation of three-dimensional spherical cells.
  • the number of cells exceeds two times or more in the above-mentioned range, there are relatively many three-dimensional spherical cells. Density per area is most suitable because there is a problem that the possibility of contamination such as turbidity of the culture medium increases.
  • the three-dimensional globular cells formed through pre-treatment of poly-2-hydroxyethyl methacrylate after 48 hours of culture typically vascular endothelial factors FGF1, FGF2, CD144, Efnb4, Hey1, Hes1, Lyve1 , Nrp1, Nrp2, Nos3, Nr2f2 , Robo4, Sox17, Tie1, Tie2, vWF and the time when the seeded general culture and 2 X 10 5 cells have the expression of Zo1 seeded 5 X 10 5 cells confirm that the increased It was confirmed (see FIG. 2), and it was confirmed that the expression of HIF-1 ⁇ , a hypoxic environment factor, was increased in the three-dimensional globular cells (see FIG. 3). Hypoxic environment is well known as one way to induce differentiation into vascular endothelial cells.
  • the size of the three-dimensional spherical cells for making the hypoxic state of the present invention can be freely configured.
  • the origin of stem cells is not particularly limited, and it is preferable to seed at least 1 X 10 6 / well, which is a density capable of producing sheets, in a typical 6-well plate. (See Figure 4). If the number of adipose stem cells is less than the number of cells suggested, there is a problem in that a dense sheet that cannot function as a support is not formed, and on the contrary, if the number of cells exceeds 2 times or more in the suggested range, recovery for transplantation is performed. And since there is a problem that the possibility of contamination such as turbidity of the culture medium increases, the density per area is most suitable for simultaneous culture.
  • an adipocyte stem cell sheet having increased angiogenesis function through simultaneous culture of adipose stem cell sheet and three-dimensional globular cells as a support of the present invention was prepared.
  • the production conditions as a support are adipose stem cells as a support, seeded and cultured in a 6-well plate of 1 X 10 6 cells / well in a 37%, 5% CO 2 cell incubator for 24 hours.
  • 5 x 10 5 adipocytes were seeded in a 6-well plate in a 6-well plate pretreated with poly-2-hydroxyethyl methacrylate, and then recovered by incubation in a 5% CO 2 cell incubator at 37 ° C. for 24 hours.
  • One cell was obtained by co-incubation for 24 hours.
  • the incubation time is less than the above time, there is insufficient time to engraft and stabilize the three-dimensional globular cells, and thus there is a problem in that an adipose stem cell sheet with increased angiogenesis is not produced.
  • the above time is most appropriate because there is a problem that can lead to a decrease in stem cell titer due to excessive proliferation of the stem cell sheet and cell death due to hypoxia.
  • the ratio of the sheet of adipose stem cells to the three-dimensional globular cells is preferably seeded and cultured at a ratio of 4 to 1: 0.2 to 2 cells, and more preferably 2 to 1: 0.5 to 1 It is preferred, and more preferably 2: 1.
  • the number of three-dimensional spherical cells may be excessive, and a new layer may be formed, so it may not be possible to secure an optimal sheet in the form of embossing.
  • angiogenesis may not be excellent. Therefore, it is most appropriate to co-culture at the above ratio conditions (see FIG. 5 left).
  • hypoxic environment factor HIF-1 ⁇ which was confirmed in three-dimensional globular cells, was maintained in the adipose stem cell sheet having increased angiogenesis in the present invention (see FIG. 5).
  • Hypoxic environment is well known as one way to induce an increase in angiogenesis-related factors.
  • markers that can be identified in connection with angiogenesis are not limited to HIF-1 ⁇ .
  • the sheet of the present invention can be configured to be freely sized to replenish an area of an damaged organ or tissue.
  • the shape and area of the sheet as the support There is no particular limitation on the shape and area of the sheet as the support.
  • FGF2, PDGF and CD144 which are representative angiogenesis-related factors, in the adipose stem cell sheet having increased angiogenesis is confirmed by immunofluorescence staining (see FIG. 6).
  • the factors related to angiogenesis are mainly expressed in three-dimensional globular cells, and include, but are not limited to, these factors.
  • cytokines and growth factors secreted from the normal cultured adipose stem cells, three-dimensional globular cells, and adipose stem cell sheets with increased angiogenesis the secretion of superior cytokines and growth factors from the adipose stem cell sheets with increased angiogenesis was increased. It was confirmed that increases (see FIG. 7).
  • factors related to angiogenesis bFGF, VEGF, ANGPT1 and ANGPT2
  • Factors associated with angiogenesis include, but are not limited to, the factors listed above. However, the angiogenesis can be evaluated by the phenotype of these cells.
  • a method of implanting experimental group cells into a mouse lower limb ischemia animal model induced through ligation of the femoral artery of the right leg is implanted using a syringe, adipose stem cell sheet and new blood vessel
  • the adipose stem cell sheet with increased ability was removed by scraping with a scraper, and then transplanted to the ligation periphery.
  • the transplantation method is not necessarily limited to this.
  • a comparison analysis was conducted by measuring the blood flow rate using a total of two laser Dopplers immediately after transplantation and up to 28 days.
  • the control group, three-dimensional globular cells, and fat stem cell sheet transplantation groups over time When transplanting adipose stem cell sheets with increased angiogenesis, better blood flow could be confirmed (see FIG. 8).
  • the animal model of acute myocardial infarction was induced through ligation of the coronary artery, and a three-dimensional spherical cell, adipose stem cell sheet, and adipose stem cell sheet with increased angiogenesis were implanted.
  • the heart of the control group, three-dimensional spherical cells, adipose stem cell sheet and adipose stem cell sheet with increased angiogenesis was recovered and histologically analyzed the area of the myocardial infarction between the groups, heart wall thickness, etc.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating ischemic disease containing adipose stem cell sheet containing the three-dimensional globular cells.
  • adipose stem cell sheet having increased angiogenesis in the present invention can be configured to be freely sized to replenish an area of an damaged organ or tissue.
  • the shape and area of the support There is no particular limitation on the shape and area of the support.
  • the indication for transplantation is not limited to ischemia and myocardial infarction.
  • the ischemic disease may include ischemic syndromes of the lower extremity ischemia syndrome, myocardial infarction, heart failure, arrhythmia, cerebral infarction, ischemia and hypoxia, vascular dementia, Vince Banger disease, Burger's disease, etc. However, it is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared as an aqueous solution.
  • a physically suitable buffer solution such as Hank's solution, Ringer's solution, or physically buffered saline may be used.
  • the aqueous injection suspension can be added with a substrate that can increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol or dextran.
  • suspensions of the active ingredients can be prepared as suitable oily injection suspensions.
  • Suitable lipophilic solvents or carriers include fatty acids such as sesame oil or synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate, triglycerides or liposomes. Polycationic amino polymers can also be used as carriers.
  • the suspension may use suitable stabilizers or medicaments to increase the solubility of the compound and prepare a high concentration solution.
  • the present invention relates to a method for treating or preventing ischemic disease, comprising administering a sheet of adipose stem cells containing the three-dimensional globular cells.
  • the present invention relates to the use of adipose stem cell sheet containing the three-dimensional globular cells for the treatment or prevention of ischemic disease.
  • the present invention relates to the use of adipose stem cell sheet containing the three-dimensional globular cells for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of ischemic disease.
  • Example 1 Securing three-dimensional spherical cells and support sheets using adipose stem cells
  • various cell densities (1 X 10 5 cells / well, in a 6-well plate pretreated with poly-2-hydroxyethyl methacrylate) Stem cells were cultured with 2 X 10 5 cells / well and 5 X 10 5 cells / well) to obtain three-dimensional globular cells.
  • the culture conditions were seeded and cultured in a 5% CO 2 cell incubator at 37 ° C. for 24 hours, respectively, and the survival and size of three-dimensional globular cells by culture time and number of seeding cells were compared.
  • the pre-treatment of the poly-2-hydroxyethyl methacrylate was dissolved in 100% ethanol for 30 minutes and prepared at a concentration of 12 g / mL, dispensed in an amount of 1 ml / well in a 6-well culture plate, and then 72 in a 37 ° C. incubator. Ethanol was evaporated for an hour to coat poly-2-hydroxyethyl methacrylate.
  • the culture time of the three-dimensional spherical cells could be selected as 48 hours.
  • vascular endothelial cells of cultured three-dimensional globular cells are FGF1, FGF2, CD144, Efnb4, Hey1, Hes1, Lyve1, Nrp1, Nrp2, Nos3, Nr2f2, Robo4, Sox17, Tie1, Tie2, vWF and Zo1. Expression was confirmed.
  • hypoxia-related factors HIF-1 ⁇
  • adipose stem cells with various cell densities were seeded in a 6-well plate to confirm whether or not the sheet was formed according to the cell density per area.
  • the culture conditions were seeded and incubated for 24 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 cell incubator.
  • 6-well plates were seeded with various cell numbers (5 X 10 5 , 1 X 10 6 and 2 X 10 6 ).
  • a support sheet for co-cultivation was established at a certain amount (1,000,000) of cell numbers.
  • cultivation was preferable in a 5% CO 2 cell incubator at 37 ° C. for 24 hours, and when seeding a cell number of less than 5 X 10 5 cells, a complete sheet was not formed due to perforation, and 2 X In the case of seeding more than 10 6 cells, sheet recovery was impossible.
  • Example 2 Fabrication of a transplantable adipose stem cell sheet with increased angiogenesis
  • adipose stem cells As a support, 1 X 10 6 cells were seeded and cultured in a 6-well plate at 37 ° C. and 5% CO 2 cell incubator for 24 hours. If the incubation time is more than 24 hours, there is a problem that the stem cell titer of adipose stem cells may decrease due to the long incubation time, and cell death by hypoxia, so the cell sheet incubation time for simultaneous culture is most appropriate 24 hours. .
  • 5 x 10 5 adipose stem cells were seeded in a 6-well plate in a 6-well plate pretreated with poly-2-hydroxyethyl methacrylate, and then cultured in a 5% CO 2 cell incubator at 37 ° C for 24 hours.
  • the formed three-dimensional globular cells were co-cultured on the obtained adipose stem cell sheet.
  • the conditions of co-culture were incubated in a 37 ° C, 5% CO 2 cell incubator for 24 hours.
  • a cross-section of a three-dimensional co-cultured adipose stem cell sheet is obtained and H & E stained photograph is shown on the left side of FIG. From this cross-section, it was confirmed that three-dimensional spherical cells were engrafted onto the adipose stem cell sheet as a support.
  • the ratio of adipose stem cell sheet and three-dimensional globular cells was 2: 1, but is not limited thereto.
  • the number of three-dimensional spherical cells may be excessive, and a new layer may be formed, so it may not be possible to secure an optimal sheet in the form of embossing.
  • angiogenesis may not be excellent.
  • HIF-1 ⁇ a hypoxic related factor of three-dimensional globular cells
  • FGF2, PDGF and CD144 related to angiogenesis were stained and confirmed by immunofluorescence staining in a three-dimensional co-cultured adipose stem cell sheet.
  • Figure 6 it was confirmed that the expression of FGF2, PDGF and CD144 increased. This confirms that the angiogenesis is maintained even through simultaneous culture.
  • cytokine array technique various cytokines and growth factors secreted from the normal cultured adipose stem cells, three-dimensional globular cells, and adipose stem cell sheets having increased angiogenesis by the three-dimensional co-culture were compared by cytokine array technique.
  • cytokine array In order to proceed with the cytokine array, culture medium was recovered after 24 hours during normal cultured adipose stem cells, three-dimensional globular cells, and adipose stem cell sheet culture with increased angiogenesis by the three-dimensional coculture.
  • the cytokine array (Ray biotech; USA) was designed by selecting a target marker, and the method was analyzed by proceeding according to a conventional method in the manufacturer's manual.
  • the adipose stem cell sheet as a support in the adipose stem cell sheet having an increased angiogenic function increased the expression of the related factors through synergistic effect with the factors secreted by the adipose stem cell sheet and the angiogenic factor related by three-dimensional globular cells. .
  • Example 3 Transplantation into an animal model of lower extremity ischemia using adipose stem cell sheet with increased angiogenesis
  • the animal model of lower limb ischemia (BALB / C nude) is induced through ligation of the femoral artery of the right leg (Fig. 8A), and the group of mice with femoral artery damage is three-dimensional spherical cells, adipose stem cell sheets, and new blood vessels. Adipose stem cell sheet with increased ability was transplanted.
  • the left leg was used as a control group according to the damage, and the lower limb ischemia mouse model was continuously observed and compared for 28 days after induction of lower limb ischemia.
  • Nude mouse limb ischemia transplantation into animal models were transplanted enclosing the injection or the ligated vessel in the femoral artery ligation peripheral right leg of a sheet, once a graft amount of 5 X 10 5 cells were seeded to recover the three-dimensional rectangular cells two sets, Adipose stem cell sheets made of 1 X 10 6 cells and 3D spherical cells recovered by seeding 5 X 10 5 cells and 3D co-cultures made of 1 X 10 6 cells were transplanted into fat stem cell sheets with increased angiogenesis. .
  • Example 4 Transplantation of adipose stem cell sheets with increased angiogenesis in a rat myocardial infarction animal model
  • the acute myocardial infarction animal model was induced by ligation of the coronary artery using rats (SD; Orient Bio), and the experimental group was a control group, a three-dimensional globular cell, adipose stem cell sheet, and an adipose stem cell sheet transplantation group with increased angiogenesis. Divided and proceeded.
  • the white paper model of acute myocardial infarction continued to be observed for 42 days after induction of infarction.
  • echocardiography was performed on the 1st, 7th, and 28th days after transplantation, respectively. The degree was compared and evaluated.
  • the animal model of acute myocardial infarction was injected into the periphery of the infarction caused by ligation of the coronary artery by dividing it three times by one third of the implant amount.
  • 10 5 cells three-dimensional co-culture made with a seeded to recover the three-dimensional rectangular cells recovered by seeding the two sets, 1 X 10 6 fat stem cell sheet and 5 X 10 5 cells made from the cell three-dimensional rectangular cells and 1 X 10 6 cells
  • a fat stem cell sheet with increased angiogenesis was transplanted by.
  • the heart of the myocardial infarction region between the groups was collected for histological analysis by recovering the heart of the control group, normal cultured adipocytes, three-dimensional globular cells, and adipocyte stem sheets with increased angiogenesis.
  • the comparison was made, and changes in the infarct region were compared by Masson's trichrome staining, a fibroblast staining technique. Masson's trichrome staining was performed by a conventional tissue staining method (Kim JH et al., PLoS One . 11 (6): e0158067, 2016).
  • the area of infarction was higher than that of the other groups in the adipose stem cell sheet transplantation group in which the angiogenesis was increased by confirming that the area of the portion (arrow) showing the infarct area was small and the thickness of the heart wall was thick. It was confirmed that decreased.
  • the degree of fibrosis in the heart tissue recovered 42 days after induction and transplantation of acute myocardial infarction was confirmed.
  • the area of fibrosis was decreased in the adipose stem cell sheet transplantation group with increased angiogenesis, compared to the control group, normal cultured adipose stem cell and three-dimensional globular cell transplantation group (between the arrows), and the angiogenesis in thickness.
  • the fat stem cell transplantation group with increased ability was thicker than other transplantation groups.
  • the adipose stem cell sheet containing the three-dimensional globular cells of the present invention When the adipose stem cell sheet containing the three-dimensional globular cells of the present invention is transplanted into a patient with ischemic disease, it exhibits a high stem cell engraftment rate and nephrogenic function, and thus is judged to be effective in treating ischemic disease.

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Abstract

지방줄기세포로 구성된 시트 상에 지방줄기세포의 삼차원 구형세포가 공배양되어 있는 것을 특징으로 하는 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 허혈성 질환 환자에 이식하는 경우, 높은 줄기세포 생착율과 신샌혈관능을 나타내어, 허혈성 질환 치료에 효과적일 것으로 판단된다.

Description

삼차원 공배양을 통한 신생혈관능이 증가된 이식용 지방줄기세포 시트 및 이의 제조방법
본 발명은 신생혈관능이 증가된 이식용 지방줄기세포 시트에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 지방줄기세포로 구성된 시트 상에 지방줄기세포의 삼차원 구형세포가 공배양되어 있는 것을 특징으로 하는 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
줄기세포는 어떤 조직으로든 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 말하며 미분화 세포로써 각각의 적절한 환경적, 화학적 및 물리적 조건을 제공해주면, 다양한 세포로의 분화률을 증대시킬 수 있다. 이러한 줄기세포의 분화 능력 및 환경적, 화학적 및 물리적 조건을 변화시키는 선택적 재생치료가 활발히 연구되고 있다.
대표적으로 지방줄기세포는 같은 다분화능을 가지고 있어 다양한 조직이나 기관의 특이적인 세포로 분화할 수 있는 줄기세포 중 하나로서, 조직의 성장과 발달 및 성체 조직의 유지와 재생을 유도하는 기능을 가지고 있다(A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004). 지방줄기세포는 인간 배아에서 추출한 배아 줄기세포와 달리, 성체의 조직에서 추출하기 때문에 윤리적인 문제가 적으며 자가재생능이 뛰어나고 지방, 골, 연골, 혈관내피, 심장근세포 등 다분화능을 가지고 있다. 또한, 지방줄기세포는 다양한 싸이토카인을 비롯한 성장인자 분비를 통해 주변세포의 분화나 증식에 중요한 역할을 하고 있다(Kim et al., Tissue Eng Part A. 23:1-11, 2017).
손상된 장기 및 조직재생을 위하여 줄기세포를 이식한 후, 손상의 회복되는 캐이스가 보고되고 있으며(Strauer et al., Circulation 106:1913, 2002), 줄기세포를 이식하는 방법에는 손상된 장기나 조직에 직접 줄기세포를 주사하는 방법과 혈관 등으로 주사하여 투여하는 방법 등이 있다. 하지만 이식된 줄기세포는 생착률이 낮으며, 대부분이 씻겨나가는(wash-out) 것으로 보고되고 있다. 이를 극복하기 위하여, 줄기세포의 양과 빈도를 높여 이식을 시행하고 있지만, 고농도의 세포 수를 지속적으로 반복해야 하는 문제점이 있으며, 이식을 성공적으로 할지라도 빈곤한 세포 환경의 등으로 기대 이상의 치료 효과를 보기에 한계가 있다. 아울러, 기존의 시트 형성기술을 이용한 이식은 장기에 이식 후 신생혈관능이 기대치보다 낮기에 이를 극복하는 기술이 필요하다.
본 발명자들은 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트(Poly-2-hydroxyethyl methacrylate)로 전처리된 웰에서 지방줄기세포를 배양하여 수득한 삼차원 구형세포에서 신생혈관 관련 마커의 발현이 증가하는 것을 확인하였으나(대한민국 특허등록 10-188151), 동물 이식 시에 생착율이 낮고, 신생혈관능에 있어서도 개선이 필요하였다.
이에, 본 발명자들은 줄기세포를 성공적으로 이식하여 높은 신생혈관능을 갖도록 하는 세포환경을 조성하고자 예의 노력한 결과, 삼차원 공배양을 통해 확보한 신생혈관능이 증가된 삼차원 구형세포와 지지체로서의 자가 지방줄기세포 시트를 공배양한 이식용 지방줄기세포 시트를 사용하여, 하지허혈 동물모델에 적용하는 경우, 높은 줄기세포 생착율과 신생혈관능을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 인체에 이식 시에 높은 생착율과 신생혈관능을 가지는 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 높은 줄기세포 생착율과 신생혈관능을 나타내는 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 함유하는 허혈성 질환 치료용 의약조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 질환 의 치료 또는 예방 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방줄기세포 시트 상에 지방줄기세포의 삼차원 구형세포가 공배양되어 있는 것을 특징으로 하는 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 지방줄기세포를 배양하여 지방줄기세포 시트를 제조하는 단계; (b) 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트로 전처리된 웰에서 지방줄기세포를 배양하여 삼차원 구형세포를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계에서 제조된 지방줄기세포 시트와 상기 (b) 단계에서 제조된 삼차원 구형세포를 공배양하여 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 제조하는 단계를 포함하는 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 함유하는 허혈성 질환 치료용 의약조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 허혈성 질환의 치료 또는 예방을 위한 상기 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 허혈성 질환의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 상기 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트의 사용을 제공한다.
도 1은 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트(poly-2-hydroxyethyl methacrylate)로 전처리된 6 웰 플레이트에서 지방줄기세포를 1 X 105 ~ 5 X 105개 시딩한 뒤, 24시간 및 48시간 동안 배양을 지속하면서 시간에 따른 삼차원 구형세포의 형태변화를 광학현미경을 이용하여 획득한 사진이다. 스케일 바는 100 ㎛이다.
도 2는 배양된 삼차원 구형세포에서 성숙 혈관내피세포 인자들인 FGF1, FGF2, CD144, Efnb4, Hey1, Hes1, Lyve1, Nrp1, Nrp2, Nos3, Nr2f2, Robo4, Sox17, Tie1, Tie2, vWF 및 Zo1의 발현을 mRNA 수준에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 배양된 삼차원 구형세포에서 저산소 관련인자인 HIF-1α를 단백질 및 mRNA 수준에서 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 지방줄기세포 시트 제작을 위하여, 1 X 106개 지방줄기세포를 시딩한 뒤, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한 결과를 광학현미경을 이용하여 획득한 사진이다. 스케일 바는 100 ㎛이다. B는 5 X 105, 1 X 106 및 2 X 106개 지방줄기세포를 시딩한 뒤, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한 결과를 광학현미경을 이용하여 획득한 사진이다.
도 5의 (좌)는 삼차원 동시배양 후, 지방줄기세포 시트의 단면을 H&E 염색한 결과를 나타낸 것이고, (우)는 지방줄기세포 시트에서 저산소 관련인자인 HIF-1α의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 삼차원 공배양 지방줄기세포 시트에서 신생혈관능과 관련된 대표적 인자 FGF2, PDGF 및 CD144를 면역 형광염색법으로 염색하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 일반배양 지방줄기세포, 삼차원 구형세포 및 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트에서 분비하는 다양한 싸이토카인 및 성장인자를 싸이토카인 어레이 기법으로 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 하지허혈 동물모델에서의 삼차원 구형세포, 지방줄기세포 시트 및 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트를 이식한 후 28일 후, 혈액 흐름의 개선도를 레이저 도플러를 통해 확인한 사진이다.
도 9는 급성심근경색 동물모델의 심장에서의 삼차원 구형세포, 지방줄기세포 시트 및 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트를 이식한지 42일 후, 심근경색 여부를 확인하는 섬유화세포(Masson’s trichrome) 염색기법으로 확인한 심장 단면 사진이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
난치성 질환의 세포 치료법이 임상에 적용되기 위해서는 미분화 줄기세포로부터 원하는 세포 계통으로 분화를 조절할 수 있어야 한다. 현재 허혈성 혈관질환의 줄기세포치료가 답보 상태에 머무르고 있는 가장 큰 이유가 이식된 세포가 혈관내피세포 등으로의 분화하는 비율이 매우 미미하다는 점이다. 이를 극복하기 위해 줄기세포를 이용한 세포 이식이 오랫동안 다양한 방법으로 시도되었으며, 최근 줄기세포 이식방법 중 하나로 세포시트를 이용하는 방법이 시도되고 있다. 다층 또는 세포를 혼합하여 시트로의 제작이 가능하나, 실제 이식하고자 하는 조직에 이식되었을 때, 생착되는 정도와 신생혈관능을 증진시키는 효과에는 한계가 있었다. 이를 극복하는 시도에서 많은 화합물, 싸이토카인 및 성장인자 등의 추가를 진행한 시도가 있었지만, 시간과 비용이 많이 들고 생체 이외의 재료 사용으로 그에 따른 부작용이 존재하는 것이 보고되고 있으며, 싸이토카인의 대부분이 씻겨나가는 등의 이유로 이식된 세포의 분화 및 증식을 보장하지 못하며, 효율이 낮고, 이식 후의 부작용 측면에서 한계를 가지고 있었다. 본 발명에서는 이를 극복하기 위하여 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트를 제조하였다.
생체 내 환경을 모사하면서 지방줄기세포를 삼차원 공배양을 통해 확보한 삼차원 구형세포 형성을 통해 신생혈관능이 증가된 세포를 확보, 지지체로서의 지방줄기세포는 자가 세포이며, 혼합된 세포의 배양될 수 있는 터전을 제공함으로써 안정적인 생착률 높이며, 증식 및 생존에 있어서 혼합된 세포의 기능을 극대화할 수 있는 장점이 있다. 이에 삼차원 구형세포와 지지체로서의 지방줄기세포 시트의 동시배양을 통하여 기존의 신생혈관능보다 증가된 새로운 신생혈관능이 증진된 지방줄기세포 시트를 제조하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 지방줄기세포로 구성된 시트 상에 지방줄기세포의 삼차원 구형세포가 공배양되어 있는 것을 특징으로 하는 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신생혈관능이 증가된 이식 가능한 지방줄기세포 시트는 기존의 세포시트 및 삼차원 구형세포만을 이용한 신생혈관능보다 우수하며, 제조방법의 조작이 쉽다. 또한, 신생혈관을 증진시키는 목적으로의 연구에서 성장인자 및 싸이토카인의 공급을 통한 경제적 부담과 세포 이식을 준비하는 시간을 최소화하는 방법이며, 이식 후에도 세포생존이 탁월하고 지방줄기세포를 이용하여 부작용이 적어 세포이식이 필요한 장기 및 조직에서 해당 시트를 통한 세포치료의 향상된 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 삼차원 구형세포는 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트로 전처리된 웰에서 지방줄기세포를 배양하여 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 공배양은 지방줄기세포 시트와 삼차원 구형세포가 4~1 : 0.2~2의 세포 수 비율로 시딩하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 2~1 : 0.5~1인 것을 특징으로 할 수 있다.
보다 구체적으로, 신생혈관능이 증가된 이식 가능한 지방줄기세포 시트에서 삼차원 구형세포와 시트의 제작에는 생체 내에 존재하는 지방줄기세포를 사용함으로써 다양한 성장인자의 배출 및 이를 동시배양 했을 때 더욱 신생혈관능과 관련된 싸이토카인 및 성장인자의 발현이 증가됨을 확인하였다. 특히, 삼차원 구형세포를 만드는 기술은 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트(Poly-2-hydroxyethyl methacrylate) 전처리 기술을 이용함으로써 짧은 시간 내에 삼차원 공배양을 통하여 어렵지 않게 삼차원 구형세포를 확보할 수 있다. 또한, 지지체로서의 지방줄기세포는 기타 화학적 처리나 생체 이외 재료를 사용하지 않고 순수하게 지방줄기세포만을 이용하여 다양한 층의 세포시트를 쉽게 만들고 회수 할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 일 양태에서는 본 발명에 따른 신생혈관능이 증가된 이식 가능한 지방줄기세포 시트가 하지허혈 마우스 모델 및 심근경색 랫트 모델에서 손상된 조직의 치료연구에서 종래 보고된 다양한 줄기세포의 이식연구 결과와 비교하면 세포 전달 성공적이면서 신생혈관능이 더욱 우수함을 확인하였다. 이는 표적조직 내에서 치료 시간을 단축하게 할 수 있는 유리한 효과를 기대할 수 있었다.
따라서 본 발명을 이용하여 기존의 화합물, 싸이토카인 및 성장인자의 추가 없이 기존의 생체성분으로만 만들어짐으로써 달리 부작용이 없고, 이식 후의 안정적인 효과를 보여줌에 따라 국소 재생치료 등의 임상 응용으로의 발전 가능성이 기대된다. 본 발명은 분화 기초연구 및 재생공학, 세포공학, 조직공학 그리고 의학 및 생물학 분야에 매우 유용한 발명이다.
본 발명에서는 지방줄기세포를 일반 6 웰 플레이트에 시딩하여 확보한 시트를 지지체로 하여, 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트 전처리 기술을 이용한 삼차원 구형세포를 획득하여 상기 지지체와 삼차원 구형세포를 동시배양하여 신생혈관능이 증가된 이식 가능한 지방줄기세포 시트를 제작하였다. 동시배양된 신생혈관능이 증가된 이식 가능한 지방줄기세포 시트는 회수가 쉬운 장점이 있으며, 체내에 이식되었을 때 높은 생착율과 혈관신생효과를 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 지방줄기세포를 배양하여 지방줄기세포 시트를 제조하는 단계; (b) 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트로 전처리된 웰에서 지방줄기세포를 배양하여 삼차원 구형세포를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계에서 제조된 지방줄기세포 시트와 상기 (b) 단계에서 제조된 삼차원 구형세포를 공배양하여 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 제조하는 단계를 포함하는 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 손상된 장기 또는 조직으로의 이식에 있어서, 지지체로 쓰이는 세포는 지방줄기세포인 것이 특징이다. 지지체로 사용된 지방줄기세포는 다양한 세포로의 분화 및 손상된 장기 및 조직에서의 회복 효과가 보고된 만큼 혼합하는 세포와의 협력 효과를 극대화를 위해 지방줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 삼차원 구형세포는 신생혈관능과 관련된 싸이토카인 및 성장인자가 다른 줄기세포보다 증가하여 분비하는 지방줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서의 인간유래 지방줄기세포를 사용하고 있으나, 이에 한정하지 않고, 마우스, 백서, 돼지 그리고 원숭이들을 포함하는 모든 포유류에서 분리한 지방줄기세포에 적용이 가능하다.
상기 지지체 및 삼차원 구형세포 제작을 위한 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트 전처리 6 웰 플레이트에서 공배양 될 지방줄기세포는 생체 내에서 유래하며 체내 이식 후, 손상된 장기 및 조직에서 생착과 증식을 할 수 있으며, 주위조직과 융화되어 염증 반응을 최소화하는 줄기세포를 말한다.
지방줄기세포의 유래는 본 발명에서 특별히 그 종류를 한정하지 않으나, 지방조직은 성숙한 지방세포를 포함한 체내 위치에 상관없이 모든 지방조직을 총칭한다. 본 발명에서는 대표적으로 인간유래 지방줄기세포를 이용하였다.
본 발명에 있어서, 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트의 제작을 위하여 상기 삼차원 구형세포는 6 웰 플레이트에서 배양하는 경우, 1 X 105 ~ 1 X 106/웰로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 5 X 105개인 것이 바람직하다. 지지체 시트를 위한 지방줄기세포는 6 웰 플레이트에서 배양하는 경우, 5 X 105 ~2 X 106개를 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1 X 106개 포함하는 것이 바람직하다.
만약 상기 지방줄기세포의 개수가 상기 제시된 세포 수 미만이면 지방줄기세포의 낮은 생존율과 삼차원 구형세포 형성에 문제점이 있고, 이와 반대로 상기 제시된 범위에서 세포 수가 2배 이상 초과하면 상대적으로 삼차원 구형세포가 많아지며, 배양액의 혼탁 등 오염의 가능성이 커지는 문제점이 있으므로 상기 면적당 밀도가 가장 적합하다.
본 발명의 일양태에서, 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트 전처리를 통해 형성된 삼차원 구형세포는 배양 48시간 이후, 대표적으로 혈관내피세포 인자인 FGF1, FGF2, CD144, Efnb4, Hey1, Hes1, Lyve1, Nrp1, Nrp2, Nos3, Nr2f2, Robo4, Sox17, Tie1, Tie2, vWF 및 Zo1의 발현이 5 X 105개 세포를 시딩했을 때 일반배양 및 2 X 105개 세포 시딩했을 때 보다 증가함을 확인할 수 있었으며(도 2 참조), 삼차원 구형세포는 저산소 환경인자인 HIF-1α의 발현이 증대되어 있음을 확인하였다 (도 3 참조). 저산소 환경은 혈관내피세포로의 분화를 유도하는 하나의 방법으로 잘 알려져 있다. 본 발명의 저산소 상태를 만들기 위한 삼차원 구형 세포의 크기는 자유롭게 구성할 수 있다.
또한, 지방줄기세포를 지지체로 한 시트 확립을 위해 특별히 줄기세포의 유래를 한정하지 않으며, 대표적으로 일반 6 웰 플레이트에 시트제작이 가능한 밀도인 1 X 106개/웰 이상을 시딩하는 것이 바람직하다(도 4 참조). 만약 상기 지방줄기세포의 개수가 상기 제시된 세포 수 미만이면 지지체의 역할을 수행할 수 없는 조밀한 시트가 형성되지 않는 문제점이 있고, 이와 반대로 상기 제시된 범위에서 세포 수가 2배 이상 초과하면 이식을 위한 회수 및 배양액의 혼탁 등 오염의 가능성이 커지는 문제점이 있으므로 상기 면적당 밀도가 동시배양에 있어 가장 적합하다.
본 발명의 다른 양태에서는 본 발명의 지지체로서의 지방줄기세포 시트와 삼차원 구형세포의 동시배양을 통한 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트를 제작하였다. 동시배양에 있어서 지지체로서의 제작조건은 지지체로서의 지방줄기세포는 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2 세포배양기에서 1 X 106개/웰의 세포를 6 웰 플레이트에 시딩하여 배양하며, 삼차원 구형세포는 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트 전처리 된 6 웰 플레이트에 5 X 105개의 지방줄기세포를 6 웰 플레이트에 시딩한 후, 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하여 회수한 세포를 24시간 동안 동시배양하여 획득하였다.
상기 본 발명의 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트를 제작에 있어서 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양이 바람직하다. 만약 배양시간이 상기 시간 미만이면 삼차원 구형세포의 생착 및 안정화까지의 시간이 충분하지 않아 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트가 만들어지지 않는 문제점이 있으며, 상기 시간 이상이면 오랜 배양시간으로 지지체로서의 지방줄기세포 시트의 과다한 증식으로 인한 줄기세포 역가의 저하, 저산소에 의한 세포사멸로 이어질 수 있는 문제점이 있으므로 상기 시간이 가장 적절하다.
또한, 동시배양에 있어서 지방줄기세포의 시트와 삼차원 구형세포의 비율은4~1 : 0.2~2의 세포 수 비율로 시딩하여 배양하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 2~1 : 0.5~1인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2 : 1로 하는 것이 바람직하다. 다만 삼차원 구형세포가 과도하게 많을 수 새로운 층이 생겨날 수 있어서 엠보싱 모양의 최적 시트를 확보하지 못할 수 있다. 적은 수의 삼차원 구형세포를 동시배양 했을 때는 신생혈관능이 탁월하지 않을 수 있다. 이에 상기의 비율조건으로 동시배양하는 것이 가장 적절하다(도 5좌 참조).
나아가, 본 발명의 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트에서 삼차원 구형세포에서 발현을 확인한 저산소 환경인자인 HIF-1α의 발현이 유지되어 있음을 확인하였다(도 5우 참조). 저산소 환경은 신생혈관능 관련 인자의 증가를 유도하는 하나의 방법으로 잘 알려져 있다. 이를 통해 삼차원 구형세포와 지지체로서의 지방줄기세포 시트의 동시배양에도 다양한 인자의 발현이 유지되며 생착할 수 있음을 확인하였다. 다만, 신생혈관능 관련하여 확인할 수 있는 마커를 HIF-1α으로 한정하지 아니한다.
상기 본 발명의 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 제작에 있어서, 본 발명의 시트는 손상된 장기나 조직의 면적을 보충하기 위해 자유로운 크기로 구성할 수 있다. 상기 지지체로서 시트의 형상 및 면적에 대해서는 특별히 한정은 없다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트에서 대표적으로 신생혈관능 관련 인자인 FGF2, PDGF 및 CD144의 발현을 면역 형광염색법으로 확인할 수 있었다(도 6 참조). 신생혈관능 관련 인자는 주로 삼차원 구형세포에서 발현이 많았으며, 상기 인자를 포함하며 이들만으로 제한되지는 않는다.
또한, 일반배양 지방줄기세포, 삼차원 구형세포 및 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트에서 분비하는 싸이토카인 및 성장인자를 비교하였을 때, 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트에서 탁월한 싸이토카인 및 성장인자의 분비가 증가함을 확인하였다(도 7 참고). 추가로 신생혈관능과 관련된 인자(bFGF, VEGF, ANGPT1 및 ANGPT2)의 발현이 통계적으로 발현량이 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트에서 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 신생혈관능과 관련되어 있는 인자는 상기에 나열한 인자 등을 포함하며 이들만으로 제한되지는 않는다. 다만, 이런 세포의 표현형으로 신생혈관능을 평가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 우측다리의 대퇴부 동맥의 결찰을 통해 유도된 마우스 하지허혈 동물모델에 실험군 세포를 이식하는 방법으로 삼차원 구형세포는 주사기를 이용하여 이식하고, 지방줄기세포 시트 및 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트는 스크레이퍼로 박리하여 회수하여 결찰 주변부에 이식하였다. 이식방법은 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 이식 후, 하지혈류량의 평가를 위하여 이식 직후 및 28일까지 총 2번의 레이저 도플러를 이용한 혈류량을 측정하여 비교분석을 한 결과, 시간이 지남에 따라 대조군, 삼차원 구형세포 및 지방줄기세포 시트 이식군 보다 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식 시 더 나은 혈류개선을 확인할 수 있었다(도 8 참조).
본 발명의 또 다른 양태에서는 관상동맥의 결찰을 통해 급성심근경색 동물모델은 랫을 유도하였으며, 삼차원 구형세포, 지방줄기세포 시트 및 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트를 이식하였다. 이식 42일 후, 대조군, 삼차원 구형세포, 지방줄기세포 시트 및 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식군의 심장을 회수하여 조직학적으로 분석을 위해 군 간의 심근경색 부위의 면적, 심장벽 두께 등을 비교하고, 섬유화세포 염색기법인 Masson's trichrome 염색으로 경색 부위의 변화를 비교한 결과, 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식군에서 다른 군보다 경색의 부위가 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 함유하는 허혈성 질환 치료용 의약조성물에 관한 것이다.
본 발명의 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식연구에 있어서, 손상된 장기나 조직의 면적을 보충하기 위해 자유로운 크기로 구성할 수 있다. 상기 지지체의 형상 및 면적에 대해서는 특별히 한정은 없다. 또한, 이식대상 적응증에 대해 하지허혈 및 심근경색증에 한정하지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 허혈성 질환은 하지 허혈증후군, 심근경색, 심부정, 부정맥 등의 허혈성 심장질환, 뇌경색, 허혈과 저산소증(ischemia and hypoxia), 혈관성 치매, 빈스뱅거병, 버거씨병 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액(oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 허혈성 질환의 치료 또는 예방을 위한 상기 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 허혈성 질환의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 상기 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트의 사용에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 지방줄기세포를 이용한 삼차원 구형세포 및 지지체 시트의 확보
인간유래 지방줄기세포(LONZA, USA)를 이용하여 2계대 배양 후 삼차원 구형세포 및 지지체 시트를 확립하였다.
구체적으로 지방줄기세포의 삼차원 구형세포를 확보하기 위하여 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트(poly-2-hydroxyethyl methacrylate)로 전처리된 6 웰 플레이트에 다양한 세포밀도(1 X 105 세포/웰, 2 X 105 세포/웰 및 5 X 105세포/웰)로 줄기세포를 배양하여 삼차원 구형세포를 획득하였다. 배양조건은 세포를 시딩하여 각각 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하고, 배양 시간대별 및 시딩세포 수별 삼차원 구형세포의 생존 및 크기를 비교하였다.
상기 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트의 전처리는 100% 에탄올에 30분간 녹여 12g/mL의 농도로 제조하여, 6-웰 배양 플레이트에 1ml/웰의 양으로 분 주 후 37℃ 인큐베이터에서 72시간 동안 에탄올을 증발시켜 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트를 코팅하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 삼차원 구형세포의 지방줄기세포를 확인할 수 있었으며, 획득한 삼차원 구형세포는 배양 시간 및 시딩한 세포 수에 따라 다양한 크기의 세포를 획득할 수 있었다. 이에 삼차원 구형세포의 배양시간은 48시간으로 선정할 수 있었다.
아울러, 배양된 삼차원 구형세포의 성숙 혈관내피세포의 대표적 인자들인 FGF1, FGF2, CD144, Efnb4, Hey1, Hes1, Lyve1, Nrp1, Nrp2, Nos3, Nr2f2, Robo4, Sox17, Tie1, Tie2, vWF 및 Zo1의 발현을 확인하였다.
저산소 관련인자인 HIF-1α과 혈관내피세포의 대표적인 인자들의 발현확인은 일반배양 지방줄기세포와 삼차원 구형세포를 회수하여 단백질 수준에서 비교하였다. 이를위해 웨스턴블롯 및 mRNA 수준에서 확인을 위해 각 타깃 human primer를 제작하여 RT-PCR기법을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 성숙 혈관내피세포의 대표적 인자들인 FGF1, FGF2, CD144, Efnb4, Hey1, Hes1, Lyve1, Nrp1, Nrp2, Nos3, Nr2f2, Robo4, Sox17, Tie1, Tie2, vWF 및 Zo1의 발현이 5 X 105개 세포를 시딩했을 때 일반배양 및 200,000개 세포를 시딩했을 때 보다 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 높은 신생혈관능을 가지는 삼차원 구형세포 배양을 위한 최초 세포의 시딩 수는 5 X 105세포로 선정하였다.
또한, 구상체 배양에 있어서 저산소 상태에 의한 세포 변화가 중요하므로, 삼차원 구형세포의 저산소 정도를 확인하기 위하여 저산소 관련인자인 HIF-1α를 단백질 및 mRNA 수준에서 비교하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 삼차원 구형세포에서 저산소 관련인자(HIF-1α)의 증가를 확인할 수 있었다.
지방줄기세포 지지체 시트를 확보하기 위해 다양한 세포밀도로 지방줄기세포를 6웰 플레이트에 시딩하여 면적당 세포의 밀도에 따른 시트 형성의 여부를 확인하였다. 배양조건은 세포를 시딩하여 각각 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다. 면적당 세포의 밀도에 따른 시트 형성의 여부를 알아보기 위하여 다양한 세포 수(5 X 105, 1 X 106 및 2 X 106)로 6 웰 플레이트에 시딩하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 일정량(1,000,000개)의 세포 수에서 동시배양을 위한 지지체 시트를 확립하였다. 지지체 시트 형성에 있어서 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양이 바람직하였으며, 5 X 105개 미만의 세포수를 시딩한 경우는 구멍이 나서 완전한 시트가 형성이 안되었으며, 2 X 106개 이상의 세포수를 시딩한 경우는 시트회수가 불가능하였다.
실시예 2: 신생혈관능이 증가된 이식 가능한 지방줄기세포 시트의 제작
지지체로서의 지방줄기세포를 형성에 있어서 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2 세포배양기에서 1 X 106개의 세포를 6 웰 플레이트에 시딩하여 배양하였다. 만약 배양시간이 24시간 이상이면 오랜 배양시간으로 인해 지방줄기세포의 줄기세포 역가의 저하, 저산소에 의한 세포사멸로 이어질 수 있는 문제점이 있으므로 동시배양을 위한 세포시트 배양시간은 24시간이 가장 적절하다.
다음으로 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트로 전처리된 6웰 플레이트에 5 X 105개의 지방줄기세포를 6웰 플레이트에 시딩한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하여, 형성된 삼차원 구형세포를 상기 확보한 지방줄기세포 시트에 위에 동시배양을 하였다. 동시배양의 조건은 24시간 동안 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다.
삼차원 공배양 지방줄기세포 시트의 단면을 획득하여 H&E 염색한 사진을 도 5의 좌측에 나타내었다. 해당 단면에서 삼차원 구형세포가 지지체로서의 지방줄기세포 시트 위에 생착한 것을 확인할 수 있었다. 동시배양에 있어서 지방줄기세포의 시트와 삼차원 구형세포의 비율은 2 : 1로 하였으나, 이에 한정하지 아니한다. 다만 삼차원 구형세포가 과도하게 많을 수 새로운 층이 생겨날 수 있어서 엠보싱 모양의 최적 시트를 확보하지 못할 수 있다. 적은 수의 삼차원 구형세포를 동시배양 했을 때는 신생혈관능이 탁월하지 않을 수 있다.
삼차원 구형세포의 저산소 관련인자인 HIF-1α의 발현이 삼차원 공배양 지방줄기세포 시트에도 유지되는 것을 HIF-1α를 염색하여 확인하였다(도 5 우측). 아울러, 삼차원 공배양 지방줄기세포 시트에서 신생혈관능과 관련된 대표적 인자 FGF2, PDGF 및 CD144를 면역 형광염색법으로 염색하여 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와같이, FGF2, PDGF 및 CD144의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이는 동시배양을 통해서도 신생혈관능이 유지되고 있는 것을 확인할 수 있다.
또한, 일반배양 지방줄기세포, 삼차원 구형세포 및 상기 삼차원 공배양에 의해 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트에서 분비하는 다양한 싸이토카인 및 성장인자를 싸이토카인 어레이 기법으로 비교하였다.
싸이토카인 어레이를 진행하기 위하여, 일반배양 지방줄기세포, 삼차원 구형세포 및 상기 삼차원 공배양에 의해 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 배양 중에 24시간 후, 배양액을 회수하였다. 싸이토카인 어레이는(Ray biotech; USA) 타깃 마커를 선택하여 디자인 하였으며 수행방법은 제조사 매뉴얼 내 통상적인 방법을 따라 진행하여 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트에서 분비하는 인자가 일반배양 지방줄기세포, 삼차원 구형세포 분비 인자보다 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 신생혈관능과 관련된 인자(bFGF, VEGF, ANGPT1 및 ANGPT2)의 발현이 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트에서 증가하였음을 확인하였다. 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트에서 지지체로서의 지방줄기세포 시트가 분비하는 인자 및 삼차원 구형세포가 분비하는 신생혈관능 관련 인자와 동반 상승효과를 통해 관련 인자들의 발현을 증진하게 시킨 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트를 이용한 마우스 하지허혈 동물모델로의 이식
누드마우스(BALB/C nude; 오리엔트바이오) 하지허혈 동물모델은 우측다리의 대퇴부 동맥의 결찰을 통해 유도하며(도 8A), 대퇴부 동맥 손상 마우스의 군은 삼차원 구형세포, 지방줄기세포 시트 및 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트를 이식하였다. 손상에 따른 대조군은 좌측다리를 이용하였으며, 하지허혈 마우스모델은 하지허혈 유도 후 28일 동안 지속해서 관찰하여 비교하였다.
누드마우스 하지허혈 동물모델로의 이식은 우측다리 대퇴부 동맥 결찰 주변부에 주입 또는 결찰된 혈관을 시트로 감싸서 이식하였으며, 1회 이식량은 5 X 105 세포를 시딩하여 회수한 삼차원 구형세포 두 세트, 1 X 106 세포로 만들어진 지방줄기세포 시트 및 5 X 105 세포를 시딩하여 회수한 삼차원 구형세포와 1 X 106 세포로 만들어진 삼차원 공배양에 의해 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트를 이식하였다.
이식 후, 하지혈류량의 평가를 위하여 이식 직후 및 28일까지 총 2번의 레이저 도플러를 이용한 혈류량을 측정하여 비교분석을 하였다. 그 결과, 도 8B에 나타난 바와 같이, 우측다리 내 혈류(빨간색; 화살표)가 증가되는 것을 확인함으로써 시간이 지남에 따라 대조군, 삼차원 구형세포 및 지방줄기세포 시트 이식군 보다 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식 시 더 나은 혈류개선을 확인할 수 있었다.
상세하게, 하지허혈 동물모델의 우측다리의 대퇴부 동맥 결찰을 유도하여 혈류의 흐름이 없는 것으로 제대로된 하지허혈 동물의 성공적인 확립을 확인하고(0 Day) 상기 세포이식량과 방법으로 이식하였다. 28일 이후, 대조군은 신생혈관이 생기지 않아 두측다리 하단부가 괴사됨을 확인할 수 있었으나 삼차원 구형세포 및 지방줄기세포 시트 이식군에서 혈류의 흐름이 확인이되나 발끈에서의 괴사가 일어남을 확인할 수 있었다. 반면에 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식군에서는 혈류의 개선과 다리 및 발의 괴사를 확인할 수 없었다.
실시예 4: 랫 심근경색 동물모델로의 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식
급성심근경색 동물모델은 랫(SD; 오리엔트바이오)을 이용하여 관상동맥의 결찰을 통해 유도하였으며, 실험군은 대조군, 삼차원 구형세포, 지방줄기세포 시트 및 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식군으로 나누어 진행하였다. 급성심근경색 백서모델은 경색유도 후 42일 동안 지속해서 관찰한 결과 이식 후 1일, 7일, 28일째에 각각 심초음파 검사를 시행하여 심장 기능의 증진 여부 및 군 간의 경색된 부위를 평가하는 섬유화 정도를 비교하여 평가하였다.
급성심근경색 동물모델은 관상동맥 결찰로 생긴 경색주변주위에 이식량의 1/3씩 세 번으로 나누어 주입하였으며, 시트의 경우 경색부위를 포한한 심장표면에 이식하였으며, 1회 이식량은 5 X 105 세포를 시딩하여 회수한 삼차원 구형세포 두세트, 1 X 106 세포로 만들어진 지방줄기세포 시트 및 5 X 105 세포를 시딩하여 회수한 삼차원 구형세포와 1 X 106 세포로 만들어진 삼차원 공배양에 의해 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트를 이식하였다.
이식 42일 후, 대조군, 일반배양 지방줄기세포, 삼차원 구형세포 및 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식군의 심장을 회수하여 조직학적으로 분석을 위해 군 간의 심근경색 부위의 면적, 심장벽 두께 등을 비교하고, 섬유화세포 염색기법인 Masson's trichrome 염색으로 경색 부위의 변화를 비교하였다. Masson's trichrome 염색은 통상적인 조직 염색방법으로 진행하였다(Kim JH et al., PLoS One. 11(6):e0158067, 2016).
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 경색부위를 나타내는 부분(화살표)의 면적이 작으며, 심벽의 두께가 두꺼움을 확인함으로써 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식군에서 다른 군보다 경색의 부위가 감소한 것을 확인할 수 있었다.
상세하게, 급성심근경색을 유도, 이식하여 42일 후 회수한 심장조직에서 섬유도화 정도를 확인하였다. 섬유화정도에 있어 대조군, 일반배양 지방줄기세포 및 삼차원 구형세포 이식군보다 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식군에서 섬유화된 면적이 감소된 것을 확인할 수 있었으며(화살표간), 두께에 있어서도 신생혈관능이 증가된 지방줄기세포 시트 이식군에서 다른 이식군보다 두꺼운 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 허혈성 질환 환자에 이식하는 경우, 높은 줄기세포 생착율과 신샌혈관능을 나타내어, 허혈성 질환 치료에 효과적일 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 지방줄기세포 시트 상에 지방줄기세포의 삼차원 구형세포가 공배양되어 있는 것을 특징으로 하는 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트.
  2. 제1항에 있어서, 삼차원 구형세포는 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트로 전처리된 웰에서 지방줄기세포를 배양하여 제조되는 것을 특징으로 하는 지방줄기세포 시트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 공배양은 지방줄기세포 시트와 삼차원 구형세포가 4~1:0.2~2의 세포 수 비율로 시딩하여 배양하는 것을 특징으로 하는 지방줄기세포 시트.
  4. 다음 단계를 포함하는 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트의 제조방법:
    (a) 지방줄기세포를 배양하여 지방줄기세포 시트를 제조하는 단계;
    (b) 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트로 전처리된 웰에서 지방줄기세포를 배양하여 삼차원 구형세포를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (a) 단계에서 제조된 지방줄기세포 시트와 상기 (b) 단계에서 제조된 삼차원 구형세포를 공배양하여 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 제조하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 상기 삼차원 구형세포는 6 웰 플레이트에서 배양하는 경우, 1 X 105 ~ 1 X 106개 세포/웰로 시딩되고, 지방줄기세포 시트 제조를 위한 지방줄기세포는 6웰 플레이트에서 배양하는 경우, 5 X 105 ~2 X 106세포/웰로 시딩되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항의 삼차원 구형세포를 함유하는 지방줄기세포 시트를 함유하는 허혈성 질환 치료용 약학조성물.
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