WO2020100910A1 - 変異酵母及びそれを使用したタンパク質の製造方法 - Google Patents
変異酵母及びそれを使用したタンパク質の製造方法 Download PDFInfo
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
Definitions
- the present invention relates to a mutant yeast and a method for producing a protein using the mutant yeast.
- Cutinase-like enzymes that rapidly decompose biodegradable plastics such as esterase (PaE) produced by Pseudozyma antarctica
- PaE esterase
- Patent Document 1 an enzyme produced by a bacterium is decomposed by a protease derived from the bacterium.
- Patent Document 1 nothing is known about a protease that decomposes a cutinase-like enzyme.
- Degradation products of PaE accumulate in the culture solution of yeast that produces and secretes PaE as the culture progresses. In order to industrially use PaE, it is necessary to suppress such decomposition.
- the present invention seeks to efficiently produce PaE by searching for a peptidase or protease involved in the degradation of PaE and suppressing the activity of the peptidase or protease.
- the present inventors have found a protease involved in the degradation of PaE. Then, surprisingly, it was found that suppressing the activities suppresses not only the degradation of PaE but also the degradation of other proteins, and thus completed the present invention. That is, the present invention provides a mutant yeast described below, a method for producing a protein using the mutant yeast, and a method for producing a protein using yeast.
- a mutation is introduced into at least one peptidase or protease gene involved in the degradation of esterase (PaE) produced by Pseudozyma antarctica, whereby the activity of the peptidase or protease is suppressed. I have yeast.
- the peptidase or protease is PAN1 — 016f05330 (SEQ ID NO: 1), PAN1 — 004r02266 (SEQ ID NO: 2), PAN1 — 003r01856 (SEQ ID NO: 3), PAN1 — 003r01668 (SEQ ID NO: 4), PAN1 — 001f00846 (SEQ ID NO: 5), PAN1_01 (PAN) — 058 (SEQ ID NO: 5), PAN1_09.
- PAN1 — 024f06685 (SEQ ID NO: 7), PAN1 — 012r04564 (SEQ ID NO: 8), PAN1 — 010r04227 (SEQ ID NO: 9), PAN1 — 013r06779 (SEQ ID NO: 10), and PAN1 — 023r06563 (SEQ ID NO: 11), or Pseudozyma anta.
- the yeast according to any one of [1] to [3] above, which comprises one or more enzymes encoded by the homologue or orthologue. [5]
- [6] The yeast according to any one of [1] to [5], which produces the PaE.
- [7] The yeast according to any one of [1] to [6] above, which produces a recombinant protein.
- [8] A method for producing a protein using the yeast according to any one of [1] to [7] above.
- [9] The method according to [8] above, wherein the protein is PaE.
- a yeast in which the activity of the peptidase or protease is suppressed by introducing a mutation into the gene of at least one peptidase or protease involved in the degradation of PaE is provided.
- a mutant yeast not only the degradation of PaE in the culture solution can be suppressed, but also the degradation of other proteins can be suppressed surprisingly.
- the protein is produced using yeast, if the activity of at least one peptidase or protease gene involved in the degradation of PaE is suppressed, not only the degradation of PaE in the culture solution but also that of other proteins can be suppressed. Decomposition can also be suppressed. Therefore, efficient protein production becomes possible.
- the electrophoretic photograph of PaE and its degradation product in a culture supernatant is shown.
- the photograph of the membrane which analyzed PaE and its degradation product in the culture supernatant of each gene disruption strain by the Western blotting method is shown.
- the result of the complementation experiment of ProA gene is shown.
- the western blot analysis result of PaE and its degradation product when cultured by different methods is shown.
- the graph of the lipase activity of the culture supernatant of each gene-disrupted strain is shown.
- the photograph of the gel showing the gelatinolytic activity of the culture supernatant of each gene-disrupted strain is shown.
- the graph of the change of PaE activity of a culture solution and dry cell weight according to culture time is shown.
- the electrophoretic photograph of PaE in a culture solution and its decomposition product is shown.
- the graph which shows the residual activity of PaE of a culture solution and the change of the dry cell weight according to stationary time is shown.
- the electrophoretic photograph of PaE in the culture solution after leaving still and its degradation product is shown.
- 3 is a graph showing changes in the residual activity of PaE of the culture supernatant and the dry cell weight depending on the standing time. 3 shows an electrophoretic photograph of PaE and its degradation products in the culture supernatant after standing.
- the yeast of the present invention is characterized in that the activity of the peptidase or protease is suppressed by introducing a mutation into at least one gene of peptidase or protease involved in PaE degradation.
- the "yeast” described in the present specification refers to fungi exhibiting unicellularity, which may be basidiomycete yeast or ascomycete yeast.
- the yeast may be Pseudozyma, Rhodotorula, Cryptococcus, Moesdiomyces, Pichia, Saccharomyces, or Schizosaccharomyces.
- the yeast may also produce PaE and / or other recombinant proteins.
- the yeast that produces PaE may be one that originally expresses PaE or one that has been transformed to express PaE.
- the PaE decomposes biodegradable plastics from Pseudozyma antactica (which has been recently classified, and is sometimes referred to as Moeszionomyces antarcticus), which is a plant-resident basidiomycete yeast. It is a cutinase-like enzyme that has been isolated and identified as an enzyme.
- the PaE is P. ANTACTICA GB-4 (0) strain (Yeast deposited at the Patent Microorganism Depositary Center, National Institute of Product Evaluation Technology, National Institute of Technology; Accession No.
- the cutinase-like enzyme has a lipase box common to cutinase in its amino acid sequence, it does not necessarily have a cutin-degrading activity like cutinase, and cutinase with respect to the amino acid sequence of the entire protein The homology of is not high.
- cutinase has high decomposition activity for short-chain fatty acid ester and low decomposition activity for long-chain fatty acid ester
- cutinase-like enzyme has both short-chain fatty acid ester and long-chain fatty acid ester. Disassembles well. As described above, cutinase and cutinase-like enzyme are recognized as different kinds of enzymes having different characteristics.
- the candidate gene of interest into which the mutation is introduced has a production amount of PaE of It may be selected by transcriptome analysis and proteome analysis comparing mRNA or protein expressed under elevated conditions with mRNA or protein expressed under other conditions, respectively.
- an ortholog of a peptidase or a protease of Ascomycete yeast, whose genome analysis has been advanced, is a P. You may select as a candidate of the target gene which introduce
- a mutant in which each candidate gene is deleted by a conventional method is prepared, and PaE produced by the mutant and its degradation product are confirmed by Western blotting or the like, whereby at least 1 involved in the degradation of PaE is produced.
- Species peptidases or proteases may be identified.
- the peptidase or protease thus identified may be one that directly degrades the PaE, or a peptidase or protease that cleaves and activates a precursor of the peptidase or protease that directly degrades the PaE. May be
- the at least one peptidase or protease involved in PaE degradation may include one or more enzymes encoded by a Pseudozyma antactica gene or a homolog or ortholog thereof selected from the following group.
- PAN1 — 016f05330 SEQ ID NO: 1
- PAN1_004r02266 SEQ ID NO: 2
- PAN1_003r01856 SEQ ID NO: 3
- PAN1_003r01668 SEQ ID NO: 4
- PAN1_001f00846 SEQ ID NO: 5
- PAN1 — 019f05845 SEQ ID NO: 6
- PAN1 — 024f06685 SEQ ID NO: 7
- PAN1 — 012r04564 SEQ ID NO: 8
- PAN1_010r04227 SEQ ID NO: 9
- PAN1 — 013r04779 SEQ ID NO: 10
- PAN1 — 023r06563 SEQ ID NO: 11
- the specific base sequence of each gene is as follows.
- the mutation introduced into the gene of at least one peptidase or protease involved in the degradation of PaE is not particularly limited as long as the activity of the peptidase or protease is suppressed, but, for example, deletion of at least one base of the gene is not required. Loss, substitution of at least one base of the gene, or insertion of at least one base into the gene.
- the entire gene is deleted.
- the present invention also relates to a method for producing a protein using the yeast.
- the protein various proteins can be adopted, but PaE is preferable.
- a mutation target gene most suitable for improving the stability of the produced protein may be selected.
- the mutation target gene may include PAN1 — 001f00846 (SEQ ID NO: 5) and / or PAN1 — 010r04227 (SEQ ID NO: 9) or a homolog or ortholog thereof.
- the present invention also relates to a method for producing a protein using yeast, which method comprises:
- the yeast is characterized by including a step of suppressing the activity of at least one peptidase or protease involved in the degradation of PaE or a peptidase or protease encoded by a homolog or ortholog of the gene thereof.
- a suppressing means means commonly used in the art can be adopted without particular limitation, and for example, by introducing a mutation into the gene of the peptidase or protease or its homolog or ortholog.
- the activity may be suppressed, or the activity may be suppressed by using an antibody or an inhibitor against the peptidase or protease or the peptidase or protease encoded by the homolog or ortholog of the gene.
- the activity may be suppressed by controlling culture conditions such as pH, separation / purification, and storage conditions.
- Example 1 Confirmation of degradation of PaE degradation product and enzyme activity generated during yeast culture P.
- the GB-4 (0) -X14 strain (see Non-patent Document 1 as needed), which is a mutant strain of high-producing PaE of antactica (see Non-Patent Document 1 if necessary) was cultured in the presence of xylose by a conventional method.
- the culture supernatant containing the recombinant PaE was recovered by centrifugation and left standing at room temperature.
- the culture supernatant immediately after culturing and the culture supernatant after refrigeration were subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue (CBB).
- CBB Coomassie Brilliant Blue
- Example 2 Search for candidate gene for peptidase or protease involved in PaE degradation P.
- the antactica GB-4 (0) strain was cultured in the presence of xylose or glucose, and P.
- the tactical transcriptome of Antactica is described in P. It was analyzed with time using a DNA array prepared based on the genomic information of Antactica.
- the PaE gene When cultured in the presence of xylose, the PaE gene is strongly expressed in the early stage of culture.
- a gene which is characteristically expressed in the culture in the presence of xylose as compared with the culture in the presence of glucose and whose expression level increases toward the latter stage of the culture is decomposed into PaE.
- the putative protease gene in the antactica genome was also selected as a candidate for genes involved in PaE degradation. Then, proteomic analysis of the culture supernatant was performed, and it was a protein characteristically produced during the culture in the presence of xylose as compared with the culture in the presence of glucose, and the production amount increased toward the latter stage of the culture. The gene encoding the protein that does this was selected as a candidate for the gene involved in the degradation of PaE.
- Table 2 shows candidate genes for peptidases or proteases involved in the degradation of PaE selected by transcriptome analysis, putative protease gene search, and proteome analysis.
- Example 3 Effect of disruption of candidate gene on degradation product of PaE
- any of the genes listed in Table 2 was disrupted by a conventional method. Briefly, a gene disruption fragment is prepared by inserting a nourseothricin resistance gene as a drug resistance marker and inserting it between target genes, and introducing the gene disruption fragment into cells by homologous recombination to prepare a gene disruption strain. did. Whether the gene could be destroyed was confirmed by colony PCR.
- Each gene-disrupted strain prepared was cultured for 5 days (30 ° C., 200 rpm) in a 300 mL Erlenmeyer flask containing a xylose-containing medium. The cells were removed from each culture solution by centrifugation (5000 rpm, 5 minutes) to obtain a culture supernatant, which was allowed to stand at 25 ° C for 8 days. PaE and its degradation products in each culture supernatant were analyzed by Western blotting.
- each gene-disrupted strain produced PaE and secreted it into the culture supernatant.
- the signal derived from the PaE degradation product was observed to be as strong as or higher than that of the wild type.
- the disrupted strains of candidate gene 1, 2, 4-9, or 11-13 the signal derived from the PaE degradation product was lower than that in the wild type, and particularly in the disrupted strain of candidate gene 1 and candidate gene 9 In the disrupted strain of No. 1, a signal derived from the PaE degradation product was hardly confirmed.
- the candidate genes 1, 2, 4-9, or 11-13 were involved in the degradation of PaE, and thus these gene-disrupted strains are useful for the production of PaE.
- the disrupted strain of gene 12 abnormal growth was observed under the present culture conditions, but the culture conditions were not optimized and were not used in the subsequent experiments.
- Example 4 Complementation experiment of ProA gene A complementary gene fragment containing the ProA gene (pUXV1-neo :: ProA) or a control gene fragment (pUXV1-neo) was added to the antactica GB-4 (0) strain or the disrupted strain ( ⁇ ProA) of the candidate gene 1 (ProA gene). It was introduced to prepare a transformant. The culture supernatant was prepared by the method described in Example 3 using these transformants. A culture solution containing each culture supernatant and cells before centrifugation was allowed to stand at 25 ° C. for 7 days, and then a PaE degradation product was detected by Western blotting. The result is shown in FIG.
- Example 5 Effect of gene disruption in jar culture Since the profile of the expressed gene can be changed under different culture conditions, the effect of gene disruption on the PaE degradation product was determined by culturing in a flask as in Example 3. Was also confirmed in a large-scale jar culture. Specifically, the disrupted strain of candidate gene 1 (ProA gene) or candidate gene 9 (ProB gene) was cultured in a 5 L jar fermenter containing a xylose-containing medium for 3 days (20 ° C., 423 rpm). PaE and its degradation products in each culture supernatant were analyzed by Western blotting. The result is shown in FIG.
- Example 6 Lipase activity of each gene-disrupted strain It is known that lipase A is contained in the culture supernatant of antactica. It was confirmed whether the gene-disrupted strain selected using PaE degradation as an index affects the activity of this lipase A. Specifically, using the culture supernatant of each gene-disrupted strain prepared according to the method of Example 3, the lipase activity was measured with Lipase Kit S (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). The result is shown in FIG.
- the lipase activity was improved in the culture supernatants of the disrupted strains of candidate genes 2 to 4, 6, 8 to 11, or 13 as compared to the culture supernatants of the wild-type strain.
- the lipase activity was particularly high in the disrupted strain of candidate gene 6 or 11. Therefore, it was suggested that the degradation of lipase A was suppressed in these gene-disrupted strains.
- Example 7 Gelatin-degrading activity of culture supernatant of each gene-disrupted strain Since the gelatin-degrading activity is considered as an index of general protease activity, if the gelatin-degrading activity is low, various proteins can be stabilized. Considered to be advantageous for producing. In order to evaluate whether the disrupted strain of the gene selected using PaE degradation as an index is also useful for the production of other proteins, as a typical example, gelatin of the culture supernatant of the disrupted strains of candidate genes 1 to 7 is used. The decomposition activity was confirmed.
- the culture supernatant of each gene-disrupted strain prepared according to the method of Example 3 was used as a sample buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 0.002%. It was mixed with BPB) and subjected to gel containing 0.1% gelatin, and SDS-PAGE was performed. The electrophoresed gel was treated with 2.5% Triton X-100 and then immersed in 0.1 M Tris-HCl. This was incubated at 37 ° C. for 16 hours and then stained with CBB. The result is shown in FIG.
- Example 8 Stability of PaE during culture P.
- An expression cassette containing a xylanase promoter and a PaE gene derived from an antactica GB4 (0) strain and a neomycin resistance gene as a marker was used as a wild-type P.
- the PaE high-producing mutant strain (XG8 strain) or its ProB gene-disrupted strain ( ⁇ proB strain) produced by introducing it into the antactica GB4 (0) strain was cultured in a 3 L jar fermenter by a conventional method in the presence of xylose. 24 hours, 48 hours, and 72 hours after the start of culture, each culture solution was collected and the dry cell weight was measured.
- the subsequent method for measuring PaE activity was performed as follows.
- the PBSA emulsion was suspended in 25 mM HEPES buffer (pH 7.3 ⁇ 0.1) so that the absorbance (OD 660 ) was about 0.55.
- 1.995 mL of the aqueous suspension was placed in a test tube having a diameter of 10 mm, 5 ⁇ L of the above culture supernatant was appropriately diluted and shaken at 30 ° C. and 150 rpm for 15 minutes to measure the absorbance of the aqueous suspension.
- 1 U was defined as the amount of enzyme that reduces the absorbance by 1.0 per minute.
- each culture supernatant was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and the gel was stained with CBB.
- Example 9 Stability of PaE in bacterial cell suspension
- an enzyme is industrially produced in a large capacity (for example, in a 300 L tank)
- all the culture solutions are subjected to centrifugal filtration. It may take more than one day.
- the culture medium is left to stand for 24 hours or more, but at that time, there is a risk that lysis will proceed and PaE in the culture supernatant will be decomposed by protease. Therefore, it was examined whether disruption of the ProB gene is effective in maintaining PaE after the culture.
- the XG8 strain or the ⁇ proB strain was cultured for 72 hours in the same manner as in Example 8, and 1 mL of each culture solution was dispensed into the low-adhesion microtube. These tubes were mixed by inversion and centrifuged for 10 minutes at 15,000 rpm immediately after dispensing (still standing for 0 hour) or after standing at 25 ° C. for 4, 8, 12, 24, 36, or 48 hours. The recovered culture supernatant was immediately stored at ⁇ 30 ° C., and the remaining cells were dried at 105 ° C. for 6 hours, and the weight (dry cell weight) was measured.
- each culture supernatant was measured by the method described in Example 8, and the residual activity (%) based on the PaE activity of the culture supernatant immediately after dispensing was determined. Then, each culture supernatant was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and the gel was stained with CBB.
- Example 10 Stability of PaE in Culture Filtrate The XG8 strain or ⁇ proB strain was cultured for 72 hours in the same manner as in Example 8, and 700 mL of the culture medium immediately after the culturing was respectively performed at 8,000 rpm for 10 minutes. It was centrifuged. Further, 700 mL of each culture solution was transferred to two 500 mL Erlenmeyer flasks, allowed to stand at 25 ° C. for 24 hours, and then centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes. Each recovered culture supernatant was filtered with a 0.45 ⁇ m pore Steri cup and 18 mL each was dispensed into three 20 mL vials.
- each culture supernatant was sampled immediately after dispensing (still standing for 0 hour) or after standing at 25 ° C. for 1, 3, 5, 7, 11, or 14 days.
- the PaE activity of each culture supernatant was measured by the method described in Example 8, and the residual activity (%) was determined based on the PaE activity of the culture supernatant immediately after dispensing.
- each culture supernatant was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and the gel was stained with CBB.
- the PaE activity of the culture supernatant recovered immediately after culturing was maintained at least 80% during the stationary period thereafter, but the XG8 recovered after 24 hours of culturing.
- PaE activity decreased with the passage of standing time, and decreased to about 30% after 14 days (FIG. 11). It is considered that this is because the peptidase or protease that decomposes PaE is released from the lysed cells between the end of the culture and the collection of the culture supernatant, and PaE in the culture supernatant is decomposed.
- the disruption of the ProB gene was effective not only in suppressing the degradation of PaE during culture, but also in suppressing the degradation of PaE accompanying lysis after culture. Therefore, if a mutant yeast in which the activity of the peptidase or protease is suppressed by introducing a mutation into the gene of at least one peptidase or protease involved in the degradation of PaE is used, a large-capacity industrial process that requires time for work In efficient production as well, efficient protein production becomes possible.
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Abstract
本発明は、クチナーゼ様酵素の分解に関与するペプチダーゼ又はプロテアーゼを探し出し、当該ペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制することによって、クチナーゼ様酵素を効率的に製造することを目的としている。 ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されている酵母が提供される。
Description
本発明は、変異酵母及びそれを使用したタンパク質の製造方法に関する。
シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）が産生するエステラーゼ（ＰａＥ）など、生分解性プラスチックを速やかに分解するクチナーゼ様酵素が、植物常在性の酵母や糸状菌から単離同定されている。そのような酵素を生成する菌の培養条件の最適化、高生産株の選定、及び高発現遺伝子カセットの導入などにより、クチナーゼ様酵素の生産量を向上させることが研究されてきた（非特許文献１）。
一方、菌によって生産された酵素が、当該菌に由来するプロテアーゼによって分解される現象が一般的に知られている（特許文献１）。しかしながら、クチナーゼ様酵素を分解するプロテアーゼについては知られていない。
Watanabe et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 100, No. 7, pp. 3207-3217, 2016.
ＰａＥを産生して分泌する酵母の培養液中には、当該ＰａＥの分解物が培養経過に伴って蓄積される。ＰａＥを産業利用するためには、このような分解を抑制することが必要である。本発明は、ＰａＥの分解に関与するペプチダーゼ又はプロテアーゼを探し出し、当該ペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制することによって、ＰａＥを効率的に製造することを目的としている。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＰａＥの分解に関与するプロテアーゼを見出した。そして、それらの活性を抑制すると、意外なことに、ＰａＥの分解はもちろん、他のタンパク質の分解も抑制されることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示す変異酵母及びそれを使用してタンパク質を製造する方法、並びに、酵母を使用してタンパク質を製造する方法を提供するものである。
〔１〕シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）が産生するエステラーゼ（ＰａＥ）の分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されている、酵母。
〔２〕前記遺伝子の少なくとも１つの塩基が欠失している若しくは他の塩基で置換されているか、又は、前記遺伝子に少なくとも１つの塩基が挿入されている、前記〔１〕に記載の酵母。
〔３〕前記遺伝子全体が欠失している、前記〔１〕又は〔２〕に記載の酵母。
〔４〕前記ペプチダーゼ又はプロテアーゼが、ＰＡＮ１＿０１６ｆ０５３３０（配列番号１）、ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６（配列番号２）、ＰＡＮ１＿００３ｒ０１８５６（配列番号３）、ＰＡＮ１＿００３ｒ０１６６８（配列番号４）、ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６（配列番号５）、ＰＡＮ１＿０１９ｆ０５８４５（配列番号６）、ＰＡＮ１＿０２４ｆ０６６８５（配列番号７）、ＰＡＮ１＿０１２ｒ０４５６４（配列番号８）、ＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７（配列番号９）、ＰＡＮ１＿０１３ｒ０４７７９（配列番号１０）、及び、ＰＡＮ１＿０２３ｒ０６５６３（配列番号１１）からなる群から選択されるシュードザイマ・アンタクティカの遺伝子又はそのホモログ若しくはオルソログにコードされている酵素を１種以上含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔５〕シュードザイマ属の酵母である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔６〕前記ＰａＥを産生する、前記〔１〕～〔５〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔７〕組換えタンパク質を産生する、前記〔１〕～〔６〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔８〕前記〔１〕～〔７〕のいずれか一項に記載の酵母を使用して、タンパク質を製造する方法。
〔９〕前記タンパク質がＰａＥである、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕酵母を使用してタンパク質を製造する方法であって、
前記酵母において、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制する工程を含むことを特徴とする、方法。
〔１〕シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）が産生するエステラーゼ（ＰａＥ）の分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されている、酵母。
〔２〕前記遺伝子の少なくとも１つの塩基が欠失している若しくは他の塩基で置換されているか、又は、前記遺伝子に少なくとも１つの塩基が挿入されている、前記〔１〕に記載の酵母。
〔３〕前記遺伝子全体が欠失している、前記〔１〕又は〔２〕に記載の酵母。
〔４〕前記ペプチダーゼ又はプロテアーゼが、ＰＡＮ１＿０１６ｆ０５３３０（配列番号１）、ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６（配列番号２）、ＰＡＮ１＿００３ｒ０１８５６（配列番号３）、ＰＡＮ１＿００３ｒ０１６６８（配列番号４）、ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６（配列番号５）、ＰＡＮ１＿０１９ｆ０５８４５（配列番号６）、ＰＡＮ１＿０２４ｆ０６６８５（配列番号７）、ＰＡＮ１＿０１２ｒ０４５６４（配列番号８）、ＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７（配列番号９）、ＰＡＮ１＿０１３ｒ０４７７９（配列番号１０）、及び、ＰＡＮ１＿０２３ｒ０６５６３（配列番号１１）からなる群から選択されるシュードザイマ・アンタクティカの遺伝子又はそのホモログ若しくはオルソログにコードされている酵素を１種以上含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔５〕シュードザイマ属の酵母である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔６〕前記ＰａＥを産生する、前記〔１〕～〔５〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔７〕組換えタンパク質を産生する、前記〔１〕～〔６〕のいずれか一項に記載の酵母。
〔８〕前記〔１〕～〔７〕のいずれか一項に記載の酵母を使用して、タンパク質を製造する方法。
〔９〕前記タンパク質がＰａＥである、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕酵母を使用してタンパク質を製造する方法であって、
前記酵母において、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制する工程を含むことを特徴とする、方法。
本発明に従えば、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されている酵母が提供される。このような変異酵母を使用することにより、培養液中におけるＰａＥの分解を抑制することができるだけなく、意外なことに、他のタンパク質の分解も抑制することができる。また、酵母を使用してタンパク質を製造する際に、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子の活性を抑制すれば、培養液中におけるＰａＥの分解だけでなく他のタンパク質の分解も抑制することができる。したがって、効率的なタンパク質の生産が可能となる。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の酵母は、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されていることを特徴としている。本明細書に記載の「酵母」とは、単細胞性を示す真菌類のことをいい、担子菌酵母であってもいいし、子嚢菌酵母であってもよい。ある態様では、前記酵母は、シュードザイマ属、ロドトルーラ属、クリプトコッカス属、モエスジオマイセス属、ピキア属、サッカロマイセス属、又は、シゾザッカロマイセス属の酵母であってもよい。また、前記酵母は、ＰａＥ及び／又は他の組換えタンパク質を産生してもよい。前記ＰａＥを産生する酵母は、もともとＰａＥを発現するものであってもいいし、ＰａＥを発現するように形質転換されたものであってもよい。
本発明の酵母は、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されていることを特徴としている。本明細書に記載の「酵母」とは、単細胞性を示す真菌類のことをいい、担子菌酵母であってもいいし、子嚢菌酵母であってもよい。ある態様では、前記酵母は、シュードザイマ属、ロドトルーラ属、クリプトコッカス属、モエスジオマイセス属、ピキア属、サッカロマイセス属、又は、シゾザッカロマイセス属の酵母であってもよい。また、前記酵母は、ＰａＥ及び／又は他の組換えタンパク質を産生してもよい。前記ＰａＥを産生する酵母は、もともとＰａＥを発現するものであってもいいし、ＰａＥを発現するように形質転換されたものであってもよい。
前記ＰａＥは、植物常在性の担子菌酵母であるシュードザイマ・アンタクティカ（最近分類が変更され、モエスジオマイセス・アンタクティクス（Ｍｏｅｓｚｉｏｍｙｃｅｓ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）と呼ばれることもある。）から、生分解性プラスチックを分解する酵素として単離同定されたクチナーゼ様酵素である。具体的には、前記ＰａＥは、Ｐ．アンタクティカのＧＢ－４（０）株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された酵母；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２３９２）、ＧＢ－４（１）Ｗ株、ＧＢ－４（０）－ＨＰＭ７株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された酵母；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２３８）及びＯＭＭ６２－２株（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された酵母；受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２３９）などにより産生され得る。なお、クチナーゼ様酵素は、そのアミノ酸配列中にクチナーゼと共通するリパーゼボックスを有しているものの、必ずしもクチナーゼのようなクチン分解活性を有しているわけではないし、タンパク質全体のアミノ酸配列に関してクチナーゼとの相同性が高いわけでもない。基質特異性に関しても、クチナーゼでは、短鎖脂肪酸エステルの分解活性が高く、長鎖脂肪酸エステルの分解活性は低いのに対して、クチナーゼ様酵素は、短鎖脂肪酸エステル及び長鎖脂肪酸エステルのどちらもよく分解する。このように、クチナーゼとクチナーゼ様酵素とは、それぞれ特性が異なる別種の酵素であると認識されている。
前記ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼは、前記ＰａＥの産生条件下で産生され得るものであるので、例えば、前記変異を導入する対象遺伝子の候補は、前記ＰａＥの産生量が高まる条件下で発現されるｍＲＮＡ又はタンパク質と、そうでない条件下で発現されるｍＲＮＡ又はタンパク質とをそれぞれ比較するトランスクリプトーム解析及びプロテオーム解析によって選出してもよい。あるいは、ゲノム解析が進んでいる子嚢菌酵母のペプチダーゼ又はプロテアーゼのオルソログを、ＰａＥをもともと発現するＰ．アンタクティカのゲノムから、前記変異を導入する対象遺伝子の候補として選出してもよい。そして、各候補遺伝子を常法によって欠失させた変異体を作製し、当該変異体が産生するＰａＥ及びその分解物をウェスタンブロット法などによって確認することによって、前記ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼを同定してもよい。また、このようにして同定されたペプチダーゼ又はプロテアーゼは、前記ＰａＥを直接分解するものであってもいいし、前記ＰａＥを直接分解するペプチダーゼ又はプロテアーゼの前駆体を切断して活性化させるペプチダーゼ又はプロテアーゼであってもよい。
ある態様では、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼは、以下の群から選択されるシュードザイマ・アンタクティカの遺伝子又はそのホモログ若しくはオルソログにコードされている酵素を１種以上含んでもよい。
ＰＡＮ１＿０１６ｆ０５３３０（配列番号１）
ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６（配列番号２）
ＰＡＮ１＿００３ｒ０１８５６（配列番号３）
ＰＡＮ１＿００３ｒ０１６６８（配列番号４）
ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６（配列番号５）
ＰＡＮ１＿０１９ｆ０５８４５（配列番号６）
ＰＡＮ１＿０２４ｆ０６６８５（配列番号７）
ＰＡＮ１＿０１２ｒ０４５６４（配列番号８）
ＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７（配列番号９）
ＰＡＮ１＿０１３ｒ０４７７９（配列番号１０）
ＰＡＮ１＿０２３ｒ０６５６３（配列番号１１）
各遺伝子の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。
ＰＡＮ１＿０１６ｆ０５３３０（配列番号１）
ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６（配列番号２）
ＰＡＮ１＿００３ｒ０１８５６（配列番号３）
ＰＡＮ１＿００３ｒ０１６６８（配列番号４）
ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６（配列番号５）
ＰＡＮ１＿０１９ｆ０５８４５（配列番号６）
ＰＡＮ１＿０２４ｆ０６６８５（配列番号７）
ＰＡＮ１＿０１２ｒ０４５６４（配列番号８）
ＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７（配列番号９）
ＰＡＮ１＿０１３ｒ０４７７９（配列番号１０）
ＰＡＮ１＿０２３ｒ０６５６３（配列番号１１）
各遺伝子の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。
＜ＰＡＮ１＿０１６ｆ０５３３０＞
5'-ATGGCGTTGGGGAAAGGACCCCTTTTTGGCTCTCTGGCTCAGCTGACCGTGGCAGGGATGGGATCGTCGCCGGCTGCCCTCCACCCTTTTCTCGAGGCGAGGCGCAGCGGCGCAGCGTACGCGGCCAGTTGGAGAGGACTGCATGCAGCCGCTCACTTACACCGCCCAGCTGCCGCTCGCTCGCCAAGCCGAGAGAGAGAGAGAACCCTGCCGCATCGAATCAGCCCAACGGCTGCTCCACACCCCGGCCGCAACTCAGCACAGCTCAGCGCTATCTCTCTCGCGGTCCATCCGCACTGGCCCGCTGCTCATCCTCTGTGGCTGGCTGCGTATAATCGGCTGAGCGCCGCTTCCCCCTCTCCTCCCTCCTCCACCATCCTCCTCAACGTCCACTCATCTCTCCCCTCTCTCCAATTTAGGAGTGGCACAATGAAGCTCAATCTCTCGCTCACGTTTGTCGCCGCACTCGCCACCGCCTTTGCCGGCGTCGAGGCGGGCGTGCACAAGGCCAAGCTGCAGAAGGTGACGCCCTCGCGCGAGCTCACCCTCGAGGGCCTCGCCGCCCAGGCCGAGGTGCTCCAGCTCAAGTACGGCGGCGGTGCCTCCAAGAAGCAGGCGCCCTTCGCCGCCAACCCGGAGCACGACTTTAGCATCCAGCCCATCGCGCCCAAGGACTCGGCCTCGGCGTGGTATGCCGAAGCCAAGAAGGGCCACGGCGTGCCCCTCACCGACTTCCTCAACGCCCAGTACTTTTGCGACATCTCGCTCGGCACCCCCGCCCAGGAGTTCAAGGTGATCCTCGACACCGGCTCCTCCAACCTCTGGGTGCCCTCCACCAAGTGCTCCTCCATCGCCTGCTTCCTCCACAAGAAGTACGACAGCTCCGCCTCGTCCAGCTACAAGAAGAACGGCACCGAGTTCAAGATCCAGTACGGCTCCGGTTCCATGGAGGGCATCGTCTCGAACGACGTGCTCAAGATCGGCGACCTCACCATCAAGGGTCAGGACTTCGCCGAGGCCACCAGCGAGCCTGGCCTGGCGTTCGCCTTTGGCAAGTTTGACGGCATCCTGGGCCTGGCGTACGACACGATCTCGGTCAACGGCATCGTGCCGCCCATGTACCAGATGATCGACCAGGGCCTGCTTGATGCGCCCCAGGTGTCGTTCTACCTCGGCTCCTCGGAGGCCGACGGCGGCGAGGCGGTGTTTGGCGGCATCGACGACTCGCACTACACGGGCAAGATCCACTGGGCGCCCGTCAAGCGCAAGGGCTACTGGGAGGTGGCGCTGGACAAGCTCGCGCTCGGAGATGAGGAGCTCGAGCTCGACAACGGCTCGGCCGCCATCGACACGGGCACCTCGCTCATCGCCATGGCCACCGACACCGCCGAGATCCTCAACGCCGAGATCGGCGCCACCAAGTCGTGGAACGGCCAGTACTCGGTGGACTGCGAAAAGGTCAAGGACCTGCCGCCGCTCACGTTCTACATTGACGGCAAGCCGTTCAAGCTCGAGGGCAAGGACTATGTGCTCGAGGTGCAGGGCTCGTGCATCTCGAGCTTCTCGGGCATCAACTTGCCCGGCCCGCTCGCCGATATGCTGATTGTCGGCGACGTCTTCCTCAGGAAGTACTACTCGGTGTATGATCTCGGCAGGAACGCTGTTGGTCTCGCCGAGGCCAAGTGA-3'（配列番号１）
5'-ATGGCGTTGGGGAAAGGACCCCTTTTTGGCTCTCTGGCTCAGCTGACCGTGGCAGGGATGGGATCGTCGCCGGCTGCCCTCCACCCTTTTCTCGAGGCGAGGCGCAGCGGCGCAGCGTACGCGGCCAGTTGGAGAGGACTGCATGCAGCCGCTCACTTACACCGCCCAGCTGCCGCTCGCTCGCCAAGCCGAGAGAGAGAGAGAACCCTGCCGCATCGAATCAGCCCAACGGCTGCTCCACACCCCGGCCGCAACTCAGCACAGCTCAGCGCTATCTCTCTCGCGGTCCATCCGCACTGGCCCGCTGCTCATCCTCTGTGGCTGGCTGCGTATAATCGGCTGAGCGCCGCTTCCCCCTCTCCTCCCTCCTCCACCATCCTCCTCAACGTCCACTCATCTCTCCCCTCTCTCCAATTTAGGAGTGGCACAATGAAGCTCAATCTCTCGCTCACGTTTGTCGCCGCACTCGCCACCGCCTTTGCCGGCGTCGAGGCGGGCGTGCACAAGGCCAAGCTGCAGAAGGTGACGCCCTCGCGCGAGCTCACCCTCGAGGGCCTCGCCGCCCAGGCCGAGGTGCTCCAGCTCAAGTACGGCGGCGGTGCCTCCAAGAAGCAGGCGCCCTTCGCCGCCAACCCGGAGCACGACTTTAGCATCCAGCCCATCGCGCCCAAGGACTCGGCCTCGGCGTGGTATGCCGAAGCCAAGAAGGGCCACGGCGTGCCCCTCACCGACTTCCTCAACGCCCAGTACTTTTGCGACATCTCGCTCGGCACCCCCGCCCAGGAGTTCAAGGTGATCCTCGACACCGGCTCCTCCAACCTCTGGGTGCCCTCCACCAAGTGCTCCTCCATCGCCTGCTTCCTCCACAAGAAGTACGACAGCTCCGCCTCGTCCAGCTACAAGAAGAACGGCACCGAGTTCAAGATCCAGTACGGCTCCGGTTCCATGGAGGGCATCGTCTCGAACGACGTGCTCAAGATCGGCGACCTCACCATCAAGGGTCAGGACTTCGCCGAGGCCACCAGCGAGCCTGGCCTGGCGTTCGCCTTTGGCAAGTTTGACGGCATCCTGGGCCTGGCGTACGACACGATCTCGGTCAACGGCATCGTGCCGCCCATGTACCAGATGATCGACCAGGGCCTGCTTGATGCGCCCCAGGTGTCGTTCTACCTCGGCTCCTCGGAGGCCGACGGCGGCGAGGCGGTGTTTGGCGGCATCGACGACTCGCACTACACGGGCAAGATCCACTGGGCGCCCGTCAAGCGCAAGGGCTACTGGGAGGTGGCGCTGGACAAGCTCGCGCTCGGAGATGAGGAGCTCGAGCTCGACAACGGCTCGGCCGCCATCGACACGGGCACCTCGCTCATCGCCATGGCCACCGACACCGCCGAGATCCTCAACGCCGAGATCGGCGCCACCAAGTCGTGGAACGGCCAGTACTCGGTGGACTGCGAAAAGGTCAAGGACCTGCCGCCGCTCACGTTCTACATTGACGGCAAGCCGTTCAAGCTCGAGGGCAAGGACTATGTGCTCGAGGTGCAGGGCTCGTGCATCTCGAGCTTCTCGGGCATCAACTTGCCCGGCCCGCTCGCCGATATGCTGATTGTCGGCGACGTCTTCCTCAGGAAGTACTACTCGGTGTATGATCTCGGCAGGAACGCTGTTGGTCTCGCCGAGGCCAAGTGA-3'（配列番号１）
＜ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６＞
5'-ATGAAGTTCCTTTCGCTCGCTGCGGCGGCCGCCAGTGCCGGTCTGCTGCTTCTCAGCGGCGTCGAGGCCGCCAACAACCCGGCTGTCGTCGCCGGTCCCAAGCCCATCGCCGGTCCTGCTACCGCTCCCAACGCTCCTGCCACGCTCAGGAACAGCAGGGGCAAGGTCGCCCAGCTCGAGAAGGCAAACTACGTGCCGCGCGGCTACATCGTCGAGCTCGAGTCGTCGTCGTCCAAGGGCGGCAAGCGCGACAACCCGCATGCCGAGGTGCACGACCACCTCGCCAAGCGCGGCAAGTCGTACAAGACGCGCTTCGAGTACAACGACCCCGCCACCTTTGTCGGCATGTCGGTCATCCTCGACAGCGACGACGACTACCAGTCGCTCGCATCCGCCCCGGGTGTCAAGAAGGTCTACCGCACCACGCTCTACTCGATCCCCGCTTACGAGCCTACCACTGTCTCGGACGAGTTCGTCAAGGCTGCCACCGGCAAGGATGGCGCTGCCGCCGCTGGCCCCGCTAGCCGCAAGAAGCGCCGCGACGAGCCCAAGAACGCCGAGCAGGGCTACACCGACACCTTCTCCCCCCACGTCATGACTGGTGTCGACAAGGTCCATGCCAAGGGCTTCCTGGGCAAGGGCCAGACCGTCGGTATTATTGACACTGGTATCGACTACACCCACCCTGGTCTCGGCGGCAAGCCGGGCAACAAGCCCTGCTTCGGCGCTGGCTGCCTCGTCATTGGCGGATACGCCTTCGTCGACGATGCCTTCAACGGTACCAACACTCCCGTCGCTAGCGCCGACCCCTTCGACTGCAACGGTCACGGCACCCACGTCGCCGGTACCGTCGCTGCCAACGACACCACCCTCGGCTTCACTGGTGTTGCTCCCCATGCCAAGATCCGTGCCTACCGTGTCTTTGGCTGCCAGGGCAGCACTCCGGACGACATCATCATCGCCGCGCTGCAGCGTGCCTACTTTGACGGAAACGACGTGCTCAGTCTCTCGCTCGGTGGCCCCGGTGGCTGGAGCGAGGCTCCCTCGTCGGCCGTCGCCTCGCGTATCGCCAGTCTCGGAACTCCTCTCGCTATTGCTCAGTCCAACTCGGGTGCCTACGGTATGGCTTACGCTTCGTCGCCTGCCAGCGGTGATCTCGTCATGAGCGTCGGCTCGGTCCAGAACACCGACCTCACCGGTATCTCGGCCGCCATTGTCCCCAACACTCTCGACCGCAAGACCGTCACCGTGCTCAAGGGATCGCCCTTCACCTTTGCCGATGGCCAGTCCAAGACGCTCGAGGTGTACCCGACTTCGTCCAGCCTCACTGTTACCGACGACGTCTGCTCTCCCCTTCCGGACTCGACACCCGATCTGTCGAACAAGGTCGTCCTGGTCGGACGTGGCACTTGTCTCTTTGCCACAAAGTTCCAAAACATCGCAGCAAAGGGCGGCAAGTACGTGCTTGTGTACAACTCGGCGGCTTCCATCACCTACGTCGAGACCGACGTTGCCGGTCAGCAGGCTGCCTCGCTCACCCGCGACGACGGCCTCTACCTCAAGCAGCAGATCAACAACGGCGTCAAGGTCTCGCTCGACTTTAGCAACTCGCAGATCGCCACCATCAAGGACACTGCCACCGGTGGCCTCATGAGCTCCTTCTCGACCTACGGCCCCACCTACGAGAACCGTCTCGACTCGCCCACCACCTCGGCTCCCGGCGGCAACATCCTCTCGACCTACCCGATCAAGAAGGGTGCGTACGCTATCCTCTCCGGTACCTCGATGGCCACGCCGTTCATGTCGGGCTCCATCGCCGTCTTCCAGGCCGCGCGTGGAAAGTTCTCGCCCGATGCGCTCAACAGCATCTTCTCCAACACTGCCGCCCCACTCATGAACGACACAACGAGCAACCTGTACGAGACCGTCGCCAAGCAGGGTACTGGTCTGGTGGACGTCAACAAGGCGCTGTACCAGCAGATCACGCTCAGCCCCTCGGTGATCGAGCTCAACGACACGGTGCACTTCAACGGCTCGCAGACCATCACGGTCAAGAACCTGGGCAGCAAGCCGCTGGCGTATAAGCTCTCGCACCTCCCCGTCGGCACCGCCCAGTCGCAGGAGGACGACTCGATCTTCTTCAACCTCGCCCCCGTGCCGCTGAGCACCAACTACGCCAGCGTCAAGTTCAGCAAGACCAACCTCGTCGTGCCGCCCAAGGGCACTGCCAAGTTCACGGCGACCTTCACGCCGCCTGAGGGTGTGCGCACGGACAAGCTGCCCTTCTACTCGGGCTTCATCCACCTCGAGCCCCAGTCCAAGGACTACAGCGCTGCCAACATCGCCTACGGTGGCTACAAAGCCGACACGTCCAAGACGCAGATCCTTGACAACACCTCGGAACTGTTCGGCGTGGGACTGCCCGTTCTCGCCTCGGCTGATGGCAACACGTTTATCGAGTCGGATAACACCAGCTACAGCCTGAGTAACGTTGCCAACTGGCCGCAGTTTGTGTACCGCCTCAACTACGGTACGCCTTACCTGCAGATCGACCTTGTCAACGCCACCACCGACTTCAAGCCCACGTACAACGTCGACGGCTCGGCCGCCCAGAGTGCAGCTGCCAACCACAGGAGGTTCATCCACCGTCGTCAGCTCAACGGTCAGAAGACGCCTCAGCCCATGCCTGTGCCTGGTGGTCCCAAGCCTCCCGCGCCCAAGCCCGGCAACGGCCCCAAGCCCAAGCCTGGTCCCAAGCCCGGTCATGGCGGTGAGCCTGCTCCGGCTCCCAAGCCCGTCGCGGGTGCTGGCTTTGCCGACGTCAAGACGGTGGGCATGCTCGCCAACGGCTACTACAGCGGCAGGAACAGTGCGACCGGTCAGCTGGCTGACTACTCGTACAACGTTCAGCTCATCACCCCGCAGCTCCAGCTGCCCCAGAACGGAAGCACCACCCTCACTCCGGGTACTTACAAGGTGCTTCTCCGCGCCCAGCGCGTGCTCACCGAGGGCAAGCTCGAGAGCGACTACGAGTCGTACCTCTCGCACGCCTTCACCATCACCGCTTAA-3'（配列番号２）
5'-ATGAAGTTCCTTTCGCTCGCTGCGGCGGCCGCCAGTGCCGGTCTGCTGCTTCTCAGCGGCGTCGAGGCCGCCAACAACCCGGCTGTCGTCGCCGGTCCCAAGCCCATCGCCGGTCCTGCTACCGCTCCCAACGCTCCTGCCACGCTCAGGAACAGCAGGGGCAAGGTCGCCCAGCTCGAGAAGGCAAACTACGTGCCGCGCGGCTACATCGTCGAGCTCGAGTCGTCGTCGTCCAAGGGCGGCAAGCGCGACAACCCGCATGCCGAGGTGCACGACCACCTCGCCAAGCGCGGCAAGTCGTACAAGACGCGCTTCGAGTACAACGACCCCGCCACCTTTGTCGGCATGTCGGTCATCCTCGACAGCGACGACGACTACCAGTCGCTCGCATCCGCCCCGGGTGTCAAGAAGGTCTACCGCACCACGCTCTACTCGATCCCCGCTTACGAGCCTACCACTGTCTCGGACGAGTTCGTCAAGGCTGCCACCGGCAAGGATGGCGCTGCCGCCGCTGGCCCCGCTAGCCGCAAGAAGCGCCGCGACGAGCCCAAGAACGCCGAGCAGGGCTACACCGACACCTTCTCCCCCCACGTCATGACTGGTGTCGACAAGGTCCATGCCAAGGGCTTCCTGGGCAAGGGCCAGACCGTCGGTATTATTGACACTGGTATCGACTACACCCACCCTGGTCTCGGCGGCAAGCCGGGCAACAAGCCCTGCTTCGGCGCTGGCTGCCTCGTCATTGGCGGATACGCCTTCGTCGACGATGCCTTCAACGGTACCAACACTCCCGTCGCTAGCGCCGACCCCTTCGACTGCAACGGTCACGGCACCCACGTCGCCGGTACCGTCGCTGCCAACGACACCACCCTCGGCTTCACTGGTGTTGCTCCCCATGCCAAGATCCGTGCCTACCGTGTCTTTGGCTGCCAGGGCAGCACTCCGGACGACATCATCATCGCCGCGCTGCAGCGTGCCTACTTTGACGGAAACGACGTGCTCAGTCTCTCGCTCGGTGGCCCCGGTGGCTGGAGCGAGGCTCCCTCGTCGGCCGTCGCCTCGCGTATCGCCAGTCTCGGAACTCCTCTCGCTATTGCTCAGTCCAACTCGGGTGCCTACGGTATGGCTTACGCTTCGTCGCCTGCCAGCGGTGATCTCGTCATGAGCGTCGGCTCGGTCCAGAACACCGACCTCACCGGTATCTCGGCCGCCATTGTCCCCAACACTCTCGACCGCAAGACCGTCACCGTGCTCAAGGGATCGCCCTTCACCTTTGCCGATGGCCAGTCCAAGACGCTCGAGGTGTACCCGACTTCGTCCAGCCTCACTGTTACCGACGACGTCTGCTCTCCCCTTCCGGACTCGACACCCGATCTGTCGAACAAGGTCGTCCTGGTCGGACGTGGCACTTGTCTCTTTGCCACAAAGTTCCAAAACATCGCAGCAAAGGGCGGCAAGTACGTGCTTGTGTACAACTCGGCGGCTTCCATCACCTACGTCGAGACCGACGTTGCCGGTCAGCAGGCTGCCTCGCTCACCCGCGACGACGGCCTCTACCTCAAGCAGCAGATCAACAACGGCGTCAAGGTCTCGCTCGACTTTAGCAACTCGCAGATCGCCACCATCAAGGACACTGCCACCGGTGGCCTCATGAGCTCCTTCTCGACCTACGGCCCCACCTACGAGAACCGTCTCGACTCGCCCACCACCTCGGCTCCCGGCGGCAACATCCTCTCGACCTACCCGATCAAGAAGGGTGCGTACGCTATCCTCTCCGGTACCTCGATGGCCACGCCGTTCATGTCGGGCTCCATCGCCGTCTTCCAGGCCGCGCGTGGAAAGTTCTCGCCCGATGCGCTCAACAGCATCTTCTCCAACACTGCCGCCCCACTCATGAACGACACAACGAGCAACCTGTACGAGACCGTCGCCAAGCAGGGTACTGGTCTGGTGGACGTCAACAAGGCGCTGTACCAGCAGATCACGCTCAGCCCCTCGGTGATCGAGCTCAACGACACGGTGCACTTCAACGGCTCGCAGACCATCACGGTCAAGAACCTGGGCAGCAAGCCGCTGGCGTATAAGCTCTCGCACCTCCCCGTCGGCACCGCCCAGTCGCAGGAGGACGACTCGATCTTCTTCAACCTCGCCCCCGTGCCGCTGAGCACCAACTACGCCAGCGTCAAGTTCAGCAAGACCAACCTCGTCGTGCCGCCCAAGGGCACTGCCAAGTTCACGGCGACCTTCACGCCGCCTGAGGGTGTGCGCACGGACAAGCTGCCCTTCTACTCGGGCTTCATCCACCTCGAGCCCCAGTCCAAGGACTACAGCGCTGCCAACATCGCCTACGGTGGCTACAAAGCCGACACGTCCAAGACGCAGATCCTTGACAACACCTCGGAACTGTTCGGCGTGGGACTGCCCGTTCTCGCCTCGGCTGATGGCAACACGTTTATCGAGTCGGATAACACCAGCTACAGCCTGAGTAACGTTGCCAACTGGCCGCAGTTTGTGTACCGCCTCAACTACGGTACGCCTTACCTGCAGATCGACCTTGTCAACGCCACCACCGACTTCAAGCCCACGTACAACGTCGACGGCTCGGCCGCCCAGAGTGCAGCTGCCAACCACAGGAGGTTCATCCACCGTCGTCAGCTCAACGGTCAGAAGACGCCTCAGCCCATGCCTGTGCCTGGTGGTCCCAAGCCTCCCGCGCCCAAGCCCGGCAACGGCCCCAAGCCCAAGCCTGGTCCCAAGCCCGGTCATGGCGGTGAGCCTGCTCCGGCTCCCAAGCCCGTCGCGGGTGCTGGCTTTGCCGACGTCAAGACGGTGGGCATGCTCGCCAACGGCTACTACAGCGGCAGGAACAGTGCGACCGGTCAGCTGGCTGACTACTCGTACAACGTTCAGCTCATCACCCCGCAGCTCCAGCTGCCCCAGAACGGAAGCACCACCCTCACTCCGGGTACTTACAAGGTGCTTCTCCGCGCCCAGCGCGTGCTCACCGAGGGCAAGCTCGAGAGCGACTACGAGTCGTACCTCTCGCACGCCTTCACCATCACCGCTTAA-3'（配列番号２）
＜ＰＡＮ１＿００３ｒ０１８５６＞
5'-ATGATCGCTGGATCGTTCACAGCTTCCAGACTCTCTAGGGGGAGCCTTTCGGGCATCGGCCGCCTGGCGCTGCGTGTGCCCGCAGCAGCACGTTGCTACACCGCCGGCAGCCTCAAGATCAATGCGGACCGAATGATGAAGACGCTGCACGAGACGTGCGAATGGGGCGCAGCGCACCGATACGGCGACGGACCATTCGAGACGGGTATGGCGCGTCTGACGCTTGACAAGGACGACGCGACTGCTCGACGCTGGCTGTGGAAGGAGGCGGAGAAGCTAGGCTGTTCGGTGGACGTCGACGAGATGGGCAACATGTTTATGATCCGCAAAGGCAAGAAGAACGGCAGACCCACCGCGATGGGCAGCCATCTGGACACACAGCCGACGGGTGGAAGGTACGACGGCATCCTGGGCGTGATGGCCGGACTGGAAGCGCTGCGCACGATGAACGACCACGATCTAGAGACCGAGTATCCCGTGGCGCTGGTCAACTGGACCAACGAGGAGGGCGCACGCTTCCCACAGTCGATCGTCGGCTCGGGTGTGTGGTGCCACGACGTGCCGCTGGAGAAGGCATGGAATCTGCAGGACGTGAAGGATGCGTCGCTCACGATGAAGTCGGAGCTCGCCAAGATCGGCTTCCTCGGATCGACGCGGTGCAGCCACGAAGCCACGCCACTGGCGGCACACTTTGAGCTTCATATCGAGCAGGGTCCGATCCTGGAAGCGACGGGCAAGAAGGTCGGCATCGTTCAGGGTGGACAGGCGTACAAGTGGTTTGACATCAATGTGCGCGGTCGTGAATGCCACACGGGATCCACACCGTTCGACACCCGCTCCGACGCCATGCTGTGCGCATCGCGCATCATTGTCGAGAGCAATCGCATCGCCAAGCAGCACAAAGGCCTTGCAAGCACGGTAAGTCTCGACTGTACAGACGCAGGTCTTGAAGAATCTCAGCTGACGCCTTGGCTGTGCTCCGCGTTTCGGCGGAATTGCAGGGCATCTTGCGCCTCTCGCCTGGAAGCGTCAACACATGCCCTGGCCATGTCTTTTTCACACTGGACGTTCGGCATCCTTCGACGGACAAGCTCGCGGCGCTGTGCGGTGAGATCGAAGCGGCGGCGCAGCGAATCGCGGCCGAGGAGAGCGGAAAGGGGTGCAGCCTCGAGTGGGTCGAGACGTTCGACAGCCCAGCGATCACGTTCCACCACGACTGCATCGACAGCGTGCGCAAGGCAGTCGAGGCCAACTACGGCAGCGATGCAGGCGTTGACATCTACAGCGGCGCAGGCCACGATACATGCTCGACCAGCAAGGTGTGCCCATCCTCGATGGTCTTCATCACGAGCAAGGAGGGCATCTCGCACAATCCGCGGGAGTATTCGTCGCCGCAAGACTGGTGGGTACAGCTGCGCCGTGATCTGCGTGAGAACCGGGTGGGCGTGAAAGCTGAAACTGACTTCATTTAACCTTGTGTGGCTGCGCAGTGCGACCGGTGCGCAGGTCCTCATGGATGCAGCACTGCTGTACGATTCGCAGCGCCAGCAATGAAGTGCGCGGGAAAGAAAAAGCCCCGCTCATCAGCCACAGATCGCCGACACAATGGTACCAACAGATATGAACACCGGTGATGCTGATTGTGACAGGCAGTCACGGCAACGTCCGAGGCAATGGTGGGAAGTCGCGGCAAGGCGGCTCCAAGGACTGCTGCTGCTGCTACCCTGGGTTGGTCGCGCGGGGTAAGTTGAAGTGACTTGGCGGCTGAATCCCGCTCGGCTGCAGCTGTGCATGTCTCAGCGTGGATTGGGCTAGGTGGAATTGGGACGCCACGAGAGCAGAGCTTAAATTTGCCGTGGGCGCGTGCAATTCGGCAGCTTTTGGCGCGCGTTGGAAGCGCAAGGAGGCCCGTGCTAGGTTAAACTCTCTCTGGCGCTGCAGATGCCTCTCTGCCTTCGGATGAGCTTGTGGATGGCGCATGCGGATCGTCTCGGACACCAATGAGGCGTAGAAGAGCAGAAGAGCAAGGTGGCTTGAACGGCGCTCGATTGGATGCGCATCCGAGCGTCGGCCGGCGGGCGCTAACGCAAGCCGATGCTGTGTGAACACGGCAAGGAGGTGGGAGAAGCTTGCGCAGCGCACAAAGCCTCGCTTTGCTGCAGGGAGCGACAGGGAGCGACAGGGAGCCCAAGGTGCGGATGTGCCTCGGGTTTGCGCTCGAAGCACCTCGACGCTCGGCCCTGAGCTACCCGTGGGCTGCTCGACAACCGATTGCCGAAGCTGTCGGTGCGCCCATGCATGCCTTGGTGTTGCGCAGCGCAAGAATATTGACTCGCCGCCACTCGCTGTTGAGCGCCCGCAGCTACGGCATTCCGCTAGCTCAAGCTCCGCCGCAGCCTCCAGTCCGCCAAGCTGTCCCGCACCCTATCCCCCCCACCACCCTCGCGTATAAAGCACACCCGCGCTCGTCGCCTGCGCCATCTTTGCCCGTCTTCCCAAACCCCACCCTGCTTAAGCCACTCGATTCCCCATCCATCATGGCAGCTCCCTATACCGACACGGGCGTCAAGCCCGACGACTTCACCGAGTTCGACTATGTCGTCGTTGGCGGCGGCACGGCGGGTCTGGCGGTGGCTGCGCGTCTGTCTGAAGACGCCTCCGTGTCGGTCGGTGTGATCGAAGCGGGGCTGTGGCGTCCCGAGTGCCCCAAGATCAACTACCCGGCGTTCATCGGTCAGACGCCCATGAATCCGGACTACGACTGGTGCTACGAGACCGAGCCGCAGCAGCACTCGAACGGACGCAAGTACCCGTGGCCGCGCGGCAAGGTGCTCGGCGGCAGCAGTGCGCTCAACTTTCTCGTGTGGCAGCGCGGCTACAAGGGCGAGTACGACGACATTGGCAAGCTCGGCAACTCGGGCTGGTCGTGGGACGACTTTGCCAACTTTGCGCGCAAGAGCGCCACGCTCGAAAAGCCGGCCGAGCAACTGCAAGAGGCACACCTCGCCACGTACGACGAAGAGGTTCACGGCTCCGACGGTCCGGTTCAGACCTCGTACAGCAAGTGGTACACCGAGGCGCAGCGTCCGTGGTTCGAGGCGCTCAAGAGTCTCGGCCTCGCCAATGTTAGGGACGGTCTGGCCGGCAGCAACGCCGGCTTCTGGGTCTCACCTGGTACGCTGTGCCCCAAGAACGGCGTGCGCTCGTACTCGGCCAGCGCCTACTATGCTCCCAACGCCAAGCGCTCCAACCTCAAGGTCATCACGGGCGCCCTTGCCTCCAAGATCCTCTTTGGCGAGGCCAAGAACGCTGCAGGCGAGCTCGTCGCCTCGGGTGTCGAGTATTCGGTCGACGGCGCTAGCTACACCGTCAAGGCGCGCAGGGAGGTGGTGGTGAGCGGCGGCACGATCAACAGCCCGCACCTGCTCGAGCTCTCGGGCATCGGCAAGGCGGACGTGCTCAAGGCAGCAGGCATCGAGCAGCGCATCGAGCTCGACGTGGGCGAAAACGTCCAGGACCATCTCTACACCACCACCACCTTCAAGCTCAAGCCGGGCCACACCACCTGGGACAAGATGCGCCAGGACGACTTTGCCAAGGCGGCCATGGAGCAGTACGCGGCCGGCGGCGACGATCGCGGCATCGTTGCATCGATCATCTCGGGCTTCGCCTACGTCCCGCTGAAGCAGTACCTCTCTGCGGACGAGATTGCCAAGATCAAGGACGAGGTGGCCAAGATCGACTGGAGCCAGTACTCGAACGGCGTGCGCGAGACGGTTCAGCTGCAGCTTGCGCGTCTGGACGACGAGCAGTGTCCCTTCACCGAGTTCATCTTTACACCGGGCTACTTTGCAACCTTCTCTGCGCCAGAGGAGGGTCAGGAGTACTACAGCATCCTGGCGTGTCTGCAGCAGCCCTTTTCGCGCGGCTCCATCCATGCTGCCTCGTCCGACCCCGCGCAACCGCCCAAGATCAACGCCAACTACTTTAGCGTCGACGCGGATCTCGAGATCCTCTCCAAGGCGGTCAAGTACTGCGACACCATCACCACCACTTCTCCACTCAAGGACATTACCGTGGCAAGGCAGGATCCCGATCCGGAGAAGTGCACCACGGACGACGACTTCCGCGAGTTTACAAAGGACGTCACCAGCACCGAGTACCATCCGATCGGAAGCTGCTCCATGATGCCGCGCGACAAGGGCGGCGTGGTGGATGCAAGGCTCAAGGTGTACGGTACCGCCAACGTGCGTGTGGCCGATGCCTCCATCATCCCCATCCACGTCTCGTCGCACATCCAGTCCGCCGTTTACGCCGTCGGCGAAAAGGCAGCCCACATGATCCGCGAGGATGCCAAAAAGGCCCACTAG-3'（配列番号３）
5'-ATGATCGCTGGATCGTTCACAGCTTCCAGACTCTCTAGGGGGAGCCTTTCGGGCATCGGCCGCCTGGCGCTGCGTGTGCCCGCAGCAGCACGTTGCTACACCGCCGGCAGCCTCAAGATCAATGCGGACCGAATGATGAAGACGCTGCACGAGACGTGCGAATGGGGCGCAGCGCACCGATACGGCGACGGACCATTCGAGACGGGTATGGCGCGTCTGACGCTTGACAAGGACGACGCGACTGCTCGACGCTGGCTGTGGAAGGAGGCGGAGAAGCTAGGCTGTTCGGTGGACGTCGACGAGATGGGCAACATGTTTATGATCCGCAAAGGCAAGAAGAACGGCAGACCCACCGCGATGGGCAGCCATCTGGACACACAGCCGACGGGTGGAAGGTACGACGGCATCCTGGGCGTGATGGCCGGACTGGAAGCGCTGCGCACGATGAACGACCACGATCTAGAGACCGAGTATCCCGTGGCGCTGGTCAACTGGACCAACGAGGAGGGCGCACGCTTCCCACAGTCGATCGTCGGCTCGGGTGTGTGGTGCCACGACGTGCCGCTGGAGAAGGCATGGAATCTGCAGGACGTGAAGGATGCGTCGCTCACGATGAAGTCGGAGCTCGCCAAGATCGGCTTCCTCGGATCGACGCGGTGCAGCCACGAAGCCACGCCACTGGCGGCACACTTTGAGCTTCATATCGAGCAGGGTCCGATCCTGGAAGCGACGGGCAAGAAGGTCGGCATCGTTCAGGGTGGACAGGCGTACAAGTGGTTTGACATCAATGTGCGCGGTCGTGAATGCCACACGGGATCCACACCGTTCGACACCCGCTCCGACGCCATGCTGTGCGCATCGCGCATCATTGTCGAGAGCAATCGCATCGCCAAGCAGCACAAAGGCCTTGCAAGCACGGTAAGTCTCGACTGTACAGACGCAGGTCTTGAAGAATCTCAGCTGACGCCTTGGCTGTGCTCCGCGTTTCGGCGGAATTGCAGGGCATCTTGCGCCTCTCGCCTGGAAGCGTCAACACATGCCCTGGCCATGTCTTTTTCACACTGGACGTTCGGCATCCTTCGACGGACAAGCTCGCGGCGCTGTGCGGTGAGATCGAAGCGGCGGCGCAGCGAATCGCGGCCGAGGAGAGCGGAAAGGGGTGCAGCCTCGAGTGGGTCGAGACGTTCGACAGCCCAGCGATCACGTTCCACCACGACTGCATCGACAGCGTGCGCAAGGCAGTCGAGGCCAACTACGGCAGCGATGCAGGCGTTGACATCTACAGCGGCGCAGGCCACGATACATGCTCGACCAGCAAGGTGTGCCCATCCTCGATGGTCTTCATCACGAGCAAGGAGGGCATCTCGCACAATCCGCGGGAGTATTCGTCGCCGCAAGACTGGTGGGTACAGCTGCGCCGTGATCTGCGTGAGAACCGGGTGGGCGTGAAAGCTGAAACTGACTTCATTTAACCTTGTGTGGCTGCGCAGTGCGACCGGTGCGCAGGTCCTCATGGATGCAGCACTGCTGTACGATTCGCAGCGCCAGCAATGAAGTGCGCGGGAAAGAAAAAGCCCCGCTCATCAGCCACAGATCGCCGACACAATGGTACCAACAGATATGAACACCGGTGATGCTGATTGTGACAGGCAGTCACGGCAACGTCCGAGGCAATGGTGGGAAGTCGCGGCAAGGCGGCTCCAAGGACTGCTGCTGCTGCTACCCTGGGTTGGTCGCGCGGGGTAAGTTGAAGTGACTTGGCGGCTGAATCCCGCTCGGCTGCAGCTGTGCATGTCTCAGCGTGGATTGGGCTAGGTGGAATTGGGACGCCACGAGAGCAGAGCTTAAATTTGCCGTGGGCGCGTGCAATTCGGCAGCTTTTGGCGCGCGTTGGAAGCGCAAGGAGGCCCGTGCTAGGTTAAACTCTCTCTGGCGCTGCAGATGCCTCTCTGCCTTCGGATGAGCTTGTGGATGGCGCATGCGGATCGTCTCGGACACCAATGAGGCGTAGAAGAGCAGAAGAGCAAGGTGGCTTGAACGGCGCTCGATTGGATGCGCATCCGAGCGTCGGCCGGCGGGCGCTAACGCAAGCCGATGCTGTGTGAACACGGCAAGGAGGTGGGAGAAGCTTGCGCAGCGCACAAAGCCTCGCTTTGCTGCAGGGAGCGACAGGGAGCGACAGGGAGCCCAAGGTGCGGATGTGCCTCGGGTTTGCGCTCGAAGCACCTCGACGCTCGGCCCTGAGCTACCCGTGGGCTGCTCGACAACCGATTGCCGAAGCTGTCGGTGCGCCCATGCATGCCTTGGTGTTGCGCAGCGCAAGAATATTGACTCGCCGCCACTCGCTGTTGAGCGCCCGCAGCTACGGCATTCCGCTAGCTCAAGCTCCGCCGCAGCCTCCAGTCCGCCAAGCTGTCCCGCACCCTATCCCCCCCACCACCCTCGCGTATAAAGCACACCCGCGCTCGTCGCCTGCGCCATCTTTGCCCGTCTTCCCAAACCCCACCCTGCTTAAGCCACTCGATTCCCCATCCATCATGGCAGCTCCCTATACCGACACGGGCGTCAAGCCCGACGACTTCACCGAGTTCGACTATGTCGTCGTTGGCGGCGGCACGGCGGGTCTGGCGGTGGCTGCGCGTCTGTCTGAAGACGCCTCCGTGTCGGTCGGTGTGATCGAAGCGGGGCTGTGGCGTCCCGAGTGCCCCAAGATCAACTACCCGGCGTTCATCGGTCAGACGCCCATGAATCCGGACTACGACTGGTGCTACGAGACCGAGCCGCAGCAGCACTCGAACGGACGCAAGTACCCGTGGCCGCGCGGCAAGGTGCTCGGCGGCAGCAGTGCGCTCAACTTTCTCGTGTGGCAGCGCGGCTACAAGGGCGAGTACGACGACATTGGCAAGCTCGGCAACTCGGGCTGGTCGTGGGACGACTTTGCCAACTTTGCGCGCAAGAGCGCCACGCTCGAAAAGCCGGCCGAGCAACTGCAAGAGGCACACCTCGCCACGTACGACGAAGAGGTTCACGGCTCCGACGGTCCGGTTCAGACCTCGTACAGCAAGTGGTACACCGAGGCGCAGCGTCCGTGGTTCGAGGCGCTCAAGAGTCTCGGCCTCGCCAATGTTAGGGACGGTCTGGCCGGCAGCAACGCCGGCTTCTGGGTCTCACCTGGTACGCTGTGCCCCAAGAACGGCGTGCGCTCGTACTCGGCCAGCGCCTACTATGCTCCCAACGCCAAGCGCTCCAACCTCAAGGTCATCACGGGCGCCCTTGCCTCCAAGATCCTCTTTGGCGAGGCCAAGAACGCTGCAGGCGAGCTCGTCGCCTCGGGTGTCGAGTATTCGGTCGACGGCGCTAGCTACACCGTCAAGGCGCGCAGGGAGGTGGTGGTGAGCGGCGGCACGATCAACAGCCCGCACCTGCTCGAGCTCTCGGGCATCGGCAAGGCGGACGTGCTCAAGGCAGCAGGCATCGAGCAGCGCATCGAGCTCGACGTGGGCGAAAACGTCCAGGACCATCTCTACACCACCACCACCTTCAAGCTCAAGCCGGGCCACACCACCTGGGACAAGATGCGCCAGGACGACTTTGCCAAGGCGGCCATGGAGCAGTACGCGGCCGGCGGCGACGATCGCGGCATCGTTGCATCGATCATCTCGGGCTTCGCCTACGTCCCGCTGAAGCAGTACCTCTCTGCGGACGAGATTGCCAAGATCAAGGACGAGGTGGCCAAGATCGACTGGAGCCAGTACTCGAACGGCGTGCGCGAGACGGTTCAGCTGCAGCTTGCGCGTCTGGACGACGAGCAGTGTCCCTTCACCGAGTTCATCTTTACACCGGGCTACTTTGCAACCTTCTCTGCGCCAGAGGAGGGTCAGGAGTACTACAGCATCCTGGCGTGTCTGCAGCAGCCCTTTTCGCGCGGCTCCATCCATGCTGCCTCGTCCGACCCCGCGCAACCGCCCAAGATCAACGCCAACTACTTTAGCGTCGACGCGGATCTCGAGATCCTCTCCAAGGCGGTCAAGTACTGCGACACCATCACCACCACTTCTCCACTCAAGGACATTACCGTGGCAAGGCAGGATCCCGATCCGGAGAAGTGCACCACGGACGACGACTTCCGCGAGTTTACAAAGGACGTCACCAGCACCGAGTACCATCCGATCGGAAGCTGCTCCATGATGCCGCGCGACAAGGGCGGCGTGGTGGATGCAAGGCTCAAGGTGTACGGTACCGCCAACGTGCGTGTGGCCGATGCCTCCATCATCCCCATCCACGTCTCGTCGCACATCCAGTCCGCCGTTTACGCCGTCGGCGAAAAGGCAGCCCACATGATCCGCGAGGATGCCAAAAAGGCCCACTAG-3'（配列番号３）
＜ＰＡＮ１＿００３ｒ０１６６８＞
5'-ATGCGATCCTCCTGGCTCTCCACCGCCTCGGCCGTGCTCGTGTGCGCTGCTGCGCTCGCCAACTCGGCCAAGCTCCCCGCCCCCGTCGAGCAGATCCACTACGACCAGTCGGGCAACCTCGTCTGGAACGGAGATGCCGACGCGAGTCCCGCCGTCCCTTCGCTCGGCCGTCCCGACTTTTCCGGCCTCAGCCTCAGCGACATCGCTGCTGCCGCTGCTCCCGCCAAGCAGGCCGCCCAGGACGTCTACGCCGACTCGATGAAGTACGCCGACGACGTTCTCTCCTGGGCTGAGCACGAGATCGAGCGCATCGAGGACAAGGTCCAGGAAGTCGTCGCCGGCACTCACAAGGAGATCAAGGACTGGATCCACACCGGCAAGGTCCTCGTCGATGGCCTCGAGTTCGAGCGCCTCACCCACCCCGCCTTCCCCGAGTACTCGCTCCGCCTCAACGCCAAGTCCGAGTCCTTCTGCGACCAGGACGTCGTCCAGCACAGCGGCTACCTCGACATCTCGGACTCCAAGCATCTCTGGTTCATCTTCTTCGAGTCGCGCAGCAAGCCCAAGTCCGACCCCGTCGTCCTCTGGCTCAACGGCGGTCCCGGCTGCTCCTCCTCCACCGGTCTTCTCTTCGAGCTCGGCCCCTGCCGCGTCACCGACGAGGGCCGCGCCGTCAAGAACAACCCGCACTCGTGGAACAACAACGCAAACCTCCTCTTCCTCGACCAGCCCGTCGACGTCGGTTACTCCTACTCGGACAACGACTCGGTCAACAACTCACCCGCCGCTGCCGAGGACGTCTACGCCTTCCTCCAGCTCTTCTTCACCAAGTTCCCCGAGTACTCCAAGCTCCCCTTCACCGCCTCGGGCGAGTCGTACGCAGGCACCTACCTGCCCAACATCGCCTCCACCATCTACAAGAAGAACAACAACCTCGCTCTCTCCCGCTACGCCAACCCCGAGCTCGCTCCCAAGCACATCAACCTCGACACCGTCATGATCGGCAACGGTCTCAGCTCGCCCCAGTACCAGTTCCCCTCCGTCCCCACCTACGCCTGCGGCGCCGAGAACAAGTATGCGCTCTTTGACCCTTCCAGCTCCACCTGCGCCACGCTCGAGCAGCAGGCCACCACATGCAAGTCGCTCATCGAGTCGTGCCAGAAGTACAACTCGCGCCTCACCTGCACGCCCGCCGCGCTCTACTGCTGGAGCCGCCTCTACGGCCCCGCACAGGAGACCGGCAGGAACCTGTACGATGTGCGCAAGAAGTGCGACCGCGAGAAGGACGGCCCGCTCTGCTACAAGGACATGGAGTACATCGAGACGCTCCTCAACACGCCCAGCATCAAGAAGAACCTCGGCGTGCCCGAGTCGGTGAACTTCCAGTCGTGCAACATGAACATTAACCAGGCCTTCCTCCTCCAGGGCGACTCGATGCACGACTCGGCCGCCCTCCTGCCCGAGCTCATCGAGGACGGCATCCGCGTCCTCATCTACGCCGGCGAGGCCGACTTCATGTGCAACTACATGGGCAACCTCGAGTGGATGCAGAACCTCCAGACCAGCTACCTCGACGACTTTAACAACGGCACTGCCCAGGACTGGATCGTCAACGGCAAGAAGGCCGGCTCCGTACGCAAGGGCGGCAAGGGCGCCGGTTCCGTCGCCTTTGTCAGGGTCGCAGAGGCCGGTCACATGGTCCCCTACGACCAGCCCGAGAACGCGTTGGACATGATCAACAAGTGGCTCGCCAACAAGCCTCTTGCTTGA-3'（配列番号４）
5'-ATGCGATCCTCCTGGCTCTCCACCGCCTCGGCCGTGCTCGTGTGCGCTGCTGCGCTCGCCAACTCGGCCAAGCTCCCCGCCCCCGTCGAGCAGATCCACTACGACCAGTCGGGCAACCTCGTCTGGAACGGAGATGCCGACGCGAGTCCCGCCGTCCCTTCGCTCGGCCGTCCCGACTTTTCCGGCCTCAGCCTCAGCGACATCGCTGCTGCCGCTGCTCCCGCCAAGCAGGCCGCCCAGGACGTCTACGCCGACTCGATGAAGTACGCCGACGACGTTCTCTCCTGGGCTGAGCACGAGATCGAGCGCATCGAGGACAAGGTCCAGGAAGTCGTCGCCGGCACTCACAAGGAGATCAAGGACTGGATCCACACCGGCAAGGTCCTCGTCGATGGCCTCGAGTTCGAGCGCCTCACCCACCCCGCCTTCCCCGAGTACTCGCTCCGCCTCAACGCCAAGTCCGAGTCCTTCTGCGACCAGGACGTCGTCCAGCACAGCGGCTACCTCGACATCTCGGACTCCAAGCATCTCTGGTTCATCTTCTTCGAGTCGCGCAGCAAGCCCAAGTCCGACCCCGTCGTCCTCTGGCTCAACGGCGGTCCCGGCTGCTCCTCCTCCACCGGTCTTCTCTTCGAGCTCGGCCCCTGCCGCGTCACCGACGAGGGCCGCGCCGTCAAGAACAACCCGCACTCGTGGAACAACAACGCAAACCTCCTCTTCCTCGACCAGCCCGTCGACGTCGGTTACTCCTACTCGGACAACGACTCGGTCAACAACTCACCCGCCGCTGCCGAGGACGTCTACGCCTTCCTCCAGCTCTTCTTCACCAAGTTCCCCGAGTACTCCAAGCTCCCCTTCACCGCCTCGGGCGAGTCGTACGCAGGCACCTACCTGCCCAACATCGCCTCCACCATCTACAAGAAGAACAACAACCTCGCTCTCTCCCGCTACGCCAACCCCGAGCTCGCTCCCAAGCACATCAACCTCGACACCGTCATGATCGGCAACGGTCTCAGCTCGCCCCAGTACCAGTTCCCCTCCGTCCCCACCTACGCCTGCGGCGCCGAGAACAAGTATGCGCTCTTTGACCCTTCCAGCTCCACCTGCGCCACGCTCGAGCAGCAGGCCACCACATGCAAGTCGCTCATCGAGTCGTGCCAGAAGTACAACTCGCGCCTCACCTGCACGCCCGCCGCGCTCTACTGCTGGAGCCGCCTCTACGGCCCCGCACAGGAGACCGGCAGGAACCTGTACGATGTGCGCAAGAAGTGCGACCGCGAGAAGGACGGCCCGCTCTGCTACAAGGACATGGAGTACATCGAGACGCTCCTCAACACGCCCAGCATCAAGAAGAACCTCGGCGTGCCCGAGTCGGTGAACTTCCAGTCGTGCAACATGAACATTAACCAGGCCTTCCTCCTCCAGGGCGACTCGATGCACGACTCGGCCGCCCTCCTGCCCGAGCTCATCGAGGACGGCATCCGCGTCCTCATCTACGCCGGCGAGGCCGACTTCATGTGCAACTACATGGGCAACCTCGAGTGGATGCAGAACCTCCAGACCAGCTACCTCGACGACTTTAACAACGGCACTGCCCAGGACTGGATCGTCAACGGCAAGAAGGCCGGCTCCGTACGCAAGGGCGGCAAGGGCGCCGGTTCCGTCGCCTTTGTCAGGGTCGCAGAGGCCGGTCACATGGTCCCCTACGACCAGCCCGAGAACGCGTTGGACATGATCAACAAGTGGCTCGCCAACAAGCCTCTTGCTTGA-3'（配列番号４）
＜ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６＞
5'-ATGGAAGCAGGCAGGAGAGGCTCGGATGAGAGGCTGCCGGATGTTGCATACGGCATGGGGGGAGGGACCGGCGAGGTGTTGATGGACTGGGATTGGATCGGGCGAGGTTGAGCCGAAACGCGGCAGTCGGCGCCGCTACCGGCCACACTATGCGGCGCTTATTTGGACTTCGCTCCGATGAGCTCCCAGGCCCCAATCTCGCGCCTTGCTCGGTCAATCGCAACGGACGCTTTGTGCAAGATACCTAGCCTGGTCTTCAGAGCCGTGCCGCTCGTCTGACCAGATTCCAAAGACGAAGAAGAGAGCACTTTCGGACGTCACGGACTGTGTTTAGCGCACGGTGCACCTTGCGAAAAAAAAAGGGTCAAAAAGTCGAAGGAGACCAACACAGCTCGCCATGTCGCGTGCCGGCAGCAGAGAGAGAAAAAAAAGGGGGAGAGAGAGAGAGGAGAGCGGGTGCAGCTCAGCCGAGCGTCGACGGTGAGCTCTCTGCCTGCCCTCTTCGGACTCCTCCCGTCCGCTGCAGCCGCCTCCTCGTCGGAAGCACACCGCACTCGATGGAATGCCTGCGCTGAGCCTTCTTTAGAGCTTTGGGCGACTGGCGAAGCGTCTTCAGCGTCGCCATCAAAGTCAAGCGCTTGCTCTGCTACCACCATCACCACCATCGTCTCTCTCTCTCCCCGTCTCGATCCGTGTCTCGAGTTTTTCTCTTTGCGCGTGGCTTTCCTACTCCACTCCACCCAGCAAGGCCCGCATTGCGCATTTCAGAGGCCATCTCGCGTCGGTTGCAAAAGAAAAATCGCGTTCGTGCGTAAGTGCTTTTTGGGCTTCCCGGGCTCCGTTGGCACCGGCCGGCCACCCTTCGTCAGCCGCCGCTGTCGTCGTCCGTCGCTCGCTCGGGCCAGCCAGCGATCTGTGCGAGAGCCTGTGCATTTGGCTAACTGAGCTTTTTTCCGTTGCCTTCCCTCCCCTCTCTCGCCACCAATCCACTTTCTCTTCGCGTGCAGATGAAAGTGAACTCGCTCCTTGCCTCCTGCATTCGAGCCCAATCAGCTCCACGTTCAATCCTTCGTCCCCACACTCTCGGCGCCAACCCCACCGTCGCAAGCCTCGCTCGTGCTCACACGCCGATTCGCCCTCGTCTTCTGCAAAACCATCTTGCAAAGGTACGCTTTCTCTTCCTCTTCCCCCAGCGGTGATTTCCCAAACTTCTTCTCGCCCTCGCAGCTTCAACTCTTCTGCACACGCAGCGGCTACATGTCGCCATCTGATCCGCGCCGAGCCAGAAACACTTACATCGCATTTGCGCTCTCCATCTGTGCTGCTCTGGCTGCCGTCCTCGTCGCTCCATCCTTTGGCGATTCGATCTGGCAGTCGCTCCGCTCCTCGGTCGGCTCTACCTTCCACCGCACCCACGCAACTTGTGCCCTCGCAGACCCAGCCTTCGCGCCCGTCTCTTCCACCATGACCGACGCCACCGACGCCTCCAAGTGGTTCCGCTTGCCCCGCAATGTCGTGCCCACCCACTACGACATTACGCTCAAGTCCGACCTCGAGGCGCTCCAGTTCTCCGGAACCGCCACCATCGACCTCGACGTGCTCGAGGACACTGACTCGATCGTCTTCAACGCCGCCGAGAAGCTCGCCCTCTCCAAGTCCCTCGTCCTCAGCCAGGCGCTCAAGACCGACAACAAGAGCTTCGTCACCCTCGACATCGACGCAAAGCATGAGCGCGCAACCGCAAAGCTCCCCAACACCCTCCCCAAGGGCTCCAAGGCGCAGCTCGTCGTCGCCTTCGCCAGCGACATCGACAAGAGCATGATGGGCTTCTATCGCTCCACCTGGGAGCACGAGGGCAAGAAGGGCTACTACGCACTTACCCAGTTCGAGCCCACCGCCGCCCGCCGCGCCATCCCCACCTGGGACGAGCCCAACCTCAAGGCCACCTACACCTTCCGCATGATCCACCGCAAGGACACCACCGCCCTCGCCAACATGAACGTCGTCAGCTCCCACGACATCTCCCAGTCCGAGCAGGACAAGCTGCTCCGCGCCGCCGAGCTCGGCCTCGACGACATCCTTGCCACCACCAGCAAGACCGAGGGCAAGACCGAAGGCAAGACCGAGGGCAAGACCGAGCTCGCCTCCACCGCCTCCAACGACTGGACCGTCACCGAGTTCGCCACCACGCCCAAGGTGTCCACCTACCTCGTCGCCTGGGCCAACGGCCCCTTTGTCAGCATCGAGAGCAGCTACACCAGCCCGCTCACCGGCAACGTCATCCCCATGAAGGTCTACACCACCCCAGAGTACATCCACCAGGCCCAGTACGCGCTCGACGTCAAGGTCAAGGTGCTCCCCGAGTACGAGCGCGTCTTTGACGTCGCCTACCCGCTCCCCAAGCTCGACACGCTCGTCGCCTCCGACTTTGACGCAGGCGCCATGGAGAACTGGGGCCTCATCACCGGCCGCACCTCGGTCTACCTCTACGACCCCGAGAAGTCGGGCCTGCAGTCGCAGAAGCGCACCGCAGGCGTCCAGTCGCACGAGGTCGCGCACCAGTGGTTCGGCAACATCGCCACGCTCGACTGGTGGGACAACCTCTGGCTCAACGAGGCCTTCGCCACGCTCATGGGCGAGGTCGTCATCCTCGACCGATGCTTCCCCGAGTGGGAGTCCGCCTCCGAGTTCATCAACGTCCACCTCGACCGCGCGCTCGACCTCGACGGCAAGCGCTCCAGCCACCCCATCGAGGTGCCGCTCCAGGGCGAGAACGTCGAGGACGCCATCAACCAGGTCTTTGACGCCATCTCCTACTCCAAGGGCGCCAGTGTGCTCCGCATGCTCTCCAACATGATTGGCGAGGACGTCTTCCTCAAGGGCGTCTCGATCTACCTCAAGAAGCACCTCTACTCCAACGCCGTCACCAAGGACCTCTGGAACGGCATCAGCGAGTCGTCCGGCCGCGACATTGCCTCGATCATGGCCAACTGGGTGCTCAAGCAGGGCTTCCCCGTGCTCACCGTCACCGAGGATGCCGATGGCCTCACCGTCAAGCAGAACCGCTTCCTCTCCACCGGCGACCCCACCGCCGAGGAGGACAAGACGCTGTGGTACGTGCCGCTCATGCTCAAGACCGTCGGCGCCGACGGCAAGGTCGCCGTCGACCGCGACGCCTTCCTCAACAGCGAGCGCGAGGTCAAGATCCCGCTTGCCAACGCCAAGGACGCCACCTACAAGCTCAACGCCGAGACCATCGGCGTCTACCGCGTCGCTTACTCGCCCGAGCGCCTCGCCAAGCTCGGTGAGGAGGCTGCCAAGAAGGATTCGGCCTTCTCGCTCGAGGACCGCCTGGGTCTGGTCTCGGACGCCTTTACGCTCGCCTCGGCCGGCTACGGCAAGACGTCCGGTGGTCTGTCGCTTGCCAAGGCGCTGCGCAACGACCCCACGTACCTGGTCAACTCGGCGTCGTCGCTCAACCTCGGCACGCTCGCCAGCGCGTGGTGGGAGCAGGATGCGCAGGTGACGGGCGCGATCAAGAAGCTGCGCGCCGACATCTTTGGCCCTACGGCCAAGAAGCTCGGCTTCGAGTTTGGCGCCGACGACTCGCCCGATCTCAAGCAGCTGCGTGCGGTCGCCATCGCGGCTGCGTCTGCGGGCGAGGATGCGTGGACGCTGGGCGAGATCAAGAGGCGCTTTGACCACCTTGCCACCACGGGCGACGACAGCCAGATCCACCCGGATCTGTTGCGCACCACCATGGCGCGTGCGGTCGAGCACGGTGGCGAGAAGGAGTACGAGGCAGTGCTTGCCATTTACCGCAAGCCTTCGACGCCTACGCACAAGATTGCGGCCATGCTGGCGCTGGGTGCGTCCAAGGACGTTGCGCTGCTGGAGCGCACCGTGGACTTCCTGTTCGGTGACGAGGTCAAGGAGCAGGACTTTATGTTCTTCTTTGCGGCGCTGTCGGGCAACCCTGCTGGGCGACGTCTGATTTGGGATGCGACCAAGAGCCGCTGGGAGGCGCTGTCCAAGCGGTTCGCGGGCAACTTTTCGCTCTCGCGCATCATCGAGTACTCGTTCAGCGCCTTTTCGTCCGAGCAGGATGCGCAGGATGTGGAGCAGTTCTTCAAGGACAAGGACACCGCCAAGTTCTCCATGGGTCTCAGCCAGGGTCTCGATGCTGTGCGCGCCCGCGCTAGGTGGGTCGAGCGCGATGCCGAGGATGTCAAGCAGTGGCTCCAGGCCAACGGCTACCTTGCCTGA-3'（配列番号５）
5'-ATGGAAGCAGGCAGGAGAGGCTCGGATGAGAGGCTGCCGGATGTTGCATACGGCATGGGGGGAGGGACCGGCGAGGTGTTGATGGACTGGGATTGGATCGGGCGAGGTTGAGCCGAAACGCGGCAGTCGGCGCCGCTACCGGCCACACTATGCGGCGCTTATTTGGACTTCGCTCCGATGAGCTCCCAGGCCCCAATCTCGCGCCTTGCTCGGTCAATCGCAACGGACGCTTTGTGCAAGATACCTAGCCTGGTCTTCAGAGCCGTGCCGCTCGTCTGACCAGATTCCAAAGACGAAGAAGAGAGCACTTTCGGACGTCACGGACTGTGTTTAGCGCACGGTGCACCTTGCGAAAAAAAAAGGGTCAAAAAGTCGAAGGAGACCAACACAGCTCGCCATGTCGCGTGCCGGCAGCAGAGAGAGAAAAAAAAGGGGGAGAGAGAGAGAGGAGAGCGGGTGCAGCTCAGCCGAGCGTCGACGGTGAGCTCTCTGCCTGCCCTCTTCGGACTCCTCCCGTCCGCTGCAGCCGCCTCCTCGTCGGAAGCACACCGCACTCGATGGAATGCCTGCGCTGAGCCTTCTTTAGAGCTTTGGGCGACTGGCGAAGCGTCTTCAGCGTCGCCATCAAAGTCAAGCGCTTGCTCTGCTACCACCATCACCACCATCGTCTCTCTCTCTCCCCGTCTCGATCCGTGTCTCGAGTTTTTCTCTTTGCGCGTGGCTTTCCTACTCCACTCCACCCAGCAAGGCCCGCATTGCGCATTTCAGAGGCCATCTCGCGTCGGTTGCAAAAGAAAAATCGCGTTCGTGCGTAAGTGCTTTTTGGGCTTCCCGGGCTCCGTTGGCACCGGCCGGCCACCCTTCGTCAGCCGCCGCTGTCGTCGTCCGTCGCTCGCTCGGGCCAGCCAGCGATCTGTGCGAGAGCCTGTGCATTTGGCTAACTGAGCTTTTTTCCGTTGCCTTCCCTCCCCTCTCTCGCCACCAATCCACTTTCTCTTCGCGTGCAGATGAAAGTGAACTCGCTCCTTGCCTCCTGCATTCGAGCCCAATCAGCTCCACGTTCAATCCTTCGTCCCCACACTCTCGGCGCCAACCCCACCGTCGCAAGCCTCGCTCGTGCTCACACGCCGATTCGCCCTCGTCTTCTGCAAAACCATCTTGCAAAGGTACGCTTTCTCTTCCTCTTCCCCCAGCGGTGATTTCCCAAACTTCTTCTCGCCCTCGCAGCTTCAACTCTTCTGCACACGCAGCGGCTACATGTCGCCATCTGATCCGCGCCGAGCCAGAAACACTTACATCGCATTTGCGCTCTCCATCTGTGCTGCTCTGGCTGCCGTCCTCGTCGCTCCATCCTTTGGCGATTCGATCTGGCAGTCGCTCCGCTCCTCGGTCGGCTCTACCTTCCACCGCACCCACGCAACTTGTGCCCTCGCAGACCCAGCCTTCGCGCCCGTCTCTTCCACCATGACCGACGCCACCGACGCCTCCAAGTGGTTCCGCTTGCCCCGCAATGTCGTGCCCACCCACTACGACATTACGCTCAAGTCCGACCTCGAGGCGCTCCAGTTCTCCGGAACCGCCACCATCGACCTCGACGTGCTCGAGGACACTGACTCGATCGTCTTCAACGCCGCCGAGAAGCTCGCCCTCTCCAAGTCCCTCGTCCTCAGCCAGGCGCTCAAGACCGACAACAAGAGCTTCGTCACCCTCGACATCGACGCAAAGCATGAGCGCGCAACCGCAAAGCTCCCCAACACCCTCCCCAAGGGCTCCAAGGCGCAGCTCGTCGTCGCCTTCGCCAGCGACATCGACAAGAGCATGATGGGCTTCTATCGCTCCACCTGGGAGCACGAGGGCAAGAAGGGCTACTACGCACTTACCCAGTTCGAGCCCACCGCCGCCCGCCGCGCCATCCCCACCTGGGACGAGCCCAACCTCAAGGCCACCTACACCTTCCGCATGATCCACCGCAAGGACACCACCGCCCTCGCCAACATGAACGTCGTCAGCTCCCACGACATCTCCCAGTCCGAGCAGGACAAGCTGCTCCGCGCCGCCGAGCTCGGCCTCGACGACATCCTTGCCACCACCAGCAAGACCGAGGGCAAGACCGAAGGCAAGACCGAGGGCAAGACCGAGCTCGCCTCCACCGCCTCCAACGACTGGACCGTCACCGAGTTCGCCACCACGCCCAAGGTGTCCACCTACCTCGTCGCCTGGGCCAACGGCCCCTTTGTCAGCATCGAGAGCAGCTACACCAGCCCGCTCACCGGCAACGTCATCCCCATGAAGGTCTACACCACCCCAGAGTACATCCACCAGGCCCAGTACGCGCTCGACGTCAAGGTCAAGGTGCTCCCCGAGTACGAGCGCGTCTTTGACGTCGCCTACCCGCTCCCCAAGCTCGACACGCTCGTCGCCTCCGACTTTGACGCAGGCGCCATGGAGAACTGGGGCCTCATCACCGGCCGCACCTCGGTCTACCTCTACGACCCCGAGAAGTCGGGCCTGCAGTCGCAGAAGCGCACCGCAGGCGTCCAGTCGCACGAGGTCGCGCACCAGTGGTTCGGCAACATCGCCACGCTCGACTGGTGGGACAACCTCTGGCTCAACGAGGCCTTCGCCACGCTCATGGGCGAGGTCGTCATCCTCGACCGATGCTTCCCCGAGTGGGAGTCCGCCTCCGAGTTCATCAACGTCCACCTCGACCGCGCGCTCGACCTCGACGGCAAGCGCTCCAGCCACCCCATCGAGGTGCCGCTCCAGGGCGAGAACGTCGAGGACGCCATCAACCAGGTCTTTGACGCCATCTCCTACTCCAAGGGCGCCAGTGTGCTCCGCATGCTCTCCAACATGATTGGCGAGGACGTCTTCCTCAAGGGCGTCTCGATCTACCTCAAGAAGCACCTCTACTCCAACGCCGTCACCAAGGACCTCTGGAACGGCATCAGCGAGTCGTCCGGCCGCGACATTGCCTCGATCATGGCCAACTGGGTGCTCAAGCAGGGCTTCCCCGTGCTCACCGTCACCGAGGATGCCGATGGCCTCACCGTCAAGCAGAACCGCTTCCTCTCCACCGGCGACCCCACCGCCGAGGAGGACAAGACGCTGTGGTACGTGCCGCTCATGCTCAAGACCGTCGGCGCCGACGGCAAGGTCGCCGTCGACCGCGACGCCTTCCTCAACAGCGAGCGCGAGGTCAAGATCCCGCTTGCCAACGCCAAGGACGCCACCTACAAGCTCAACGCCGAGACCATCGGCGTCTACCGCGTCGCTTACTCGCCCGAGCGCCTCGCCAAGCTCGGTGAGGAGGCTGCCAAGAAGGATTCGGCCTTCTCGCTCGAGGACCGCCTGGGTCTGGTCTCGGACGCCTTTACGCTCGCCTCGGCCGGCTACGGCAAGACGTCCGGTGGTCTGTCGCTTGCCAAGGCGCTGCGCAACGACCCCACGTACCTGGTCAACTCGGCGTCGTCGCTCAACCTCGGCACGCTCGCCAGCGCGTGGTGGGAGCAGGATGCGCAGGTGACGGGCGCGATCAAGAAGCTGCGCGCCGACATCTTTGGCCCTACGGCCAAGAAGCTCGGCTTCGAGTTTGGCGCCGACGACTCGCCCGATCTCAAGCAGCTGCGTGCGGTCGCCATCGCGGCTGCGTCTGCGGGCGAGGATGCGTGGACGCTGGGCGAGATCAAGAGGCGCTTTGACCACCTTGCCACCACGGGCGACGACAGCCAGATCCACCCGGATCTGTTGCGCACCACCATGGCGCGTGCGGTCGAGCACGGTGGCGAGAAGGAGTACGAGGCAGTGCTTGCCATTTACCGCAAGCCTTCGACGCCTACGCACAAGATTGCGGCCATGCTGGCGCTGGGTGCGTCCAAGGACGTTGCGCTGCTGGAGCGCACCGTGGACTTCCTGTTCGGTGACGAGGTCAAGGAGCAGGACTTTATGTTCTTCTTTGCGGCGCTGTCGGGCAACCCTGCTGGGCGACGTCTGATTTGGGATGCGACCAAGAGCCGCTGGGAGGCGCTGTCCAAGCGGTTCGCGGGCAACTTTTCGCTCTCGCGCATCATCGAGTACTCGTTCAGCGCCTTTTCGTCCGAGCAGGATGCGCAGGATGTGGAGCAGTTCTTCAAGGACAAGGACACCGCCAAGTTCTCCATGGGTCTCAGCCAGGGTCTCGATGCTGTGCGCGCCCGCGCTAGGTGGGTCGAGCGCGATGCCGAGGATGTCAAGCAGTGGCTCCAGGCCAACGGCTACCTTGCCTGA-3'（配列番号５）
＜ＰＡＮ１＿０１９ｆ０５８４５＞
5'-ATGCAGTTCAAGAGCCTCGCCGTTATCCTTGGCGCCGCCCTCATGGTGGCGTCGCCCGTCTTTGCCGCCCCCGCCACGCGCACCTGTGGTAACACCGAGGTTGCCCCCGCTGATGTGGAGCAGGCTCTCTCTGCCCGCGTCGCTGCCGCCCGCTCGGCCCGCACCTCCGGGAGTACTAGCGACCTCGCCTTCACTTCCGCCAGCATCCCCGTCTACTACCACGTGATCACCGACGGCACCAACGGCCGCCTCACCTCGAGCCAGATCAACTCTCAGATCTCGGTTCTCAACCAGGGCTACTCGGGCACTGGTGTGTCGTTCTACCTCGCCGGTACCGAGACCACCGTCAACTCGAACTGGTTCAACAACGTTAACCAGGGCACCTCTGCCGAGGCTGCCATGAAGAACACCCTCCGCAAGGGCGGTGCCAACGCGCTCAACGTCTACACCGTCAACTTCACCGGCGGTCTTCTCGGTTACGCCACTTTCCCCTGGAGCTACGCTTCGGCTCCCAAGAACGACGGTATCGTTCTCCAGTGGACTTCCTACCCCGGAGGTCCGATCTCAAACTACAACCAGGGCAAGACTCTCGTCCATGGTAAGCTTTTTTTCCATCAAACATTGTGGATTCGTTTGACCATATACTGACAATCGAACTTGATACTTTTTGATGCCAATAGAGGTCGGACACTGGGTTGGTCTTTACCACACCTTCCAGGGCGGTTGCTCCAGCCCCGGTGACTACGTCGACGACACCCCCGCTCAGGGCCAGCCCACCCAGGGCTGCCCTACTACTGCCCCCGACACATGCTCGGGCGGCGGTGCTGACGACATCAAGAACTACATGAACTACAGCTACGACGTCTGCCTCACCCGCTTCACCGCCGGTCAGGTCTCGCGCCTCCAGGCTGCCCTTGATGCCTACCGTTAAAGCAACGGGATCGACCCCAAAAGAACTCGTTCCGCAGGTCTCGTCGTCGGGCTTGCATGTCACCTTTCGCCTTCGCACCGCATCTTTTCTAGCCGCACTTTTGGAATCAACAGCTTTTACATTTGAGCGTTTCGACTGCCAGCCTGTACGGGCTTCTCGTCTTCTCAGCAACCCACAACTTTTGCAGCCTCAGTGTTTGAAGTGATCAACGACTTTGCTTCAGGATGCGAGCCGCTCGTACGAGCTCCTCCTCCGGTCTGTGGAATCGACGCGCCACCGGGGTCTGCAGCTGCAGCGCTGTCGATTTCCGCCGCGCCAAAATTCCAAATCCCGCACACTGACGTCCTGCCTGCCCGGGCAAACGCCGCGGAATTGCCCGACGCCACTTCCCGCACTTTCCGCACTTTCGGCACACCGCAGCTCCTCACGCGCGGAAGCTCGCAATCAGCTCCAACACCCCGCGAGCACATGCGGTCCGCTCCTCCGCAGCAAGACTCTCCGCGTTGA-3'（配列番号６）
5'-ATGCAGTTCAAGAGCCTCGCCGTTATCCTTGGCGCCGCCCTCATGGTGGCGTCGCCCGTCTTTGCCGCCCCCGCCACGCGCACCTGTGGTAACACCGAGGTTGCCCCCGCTGATGTGGAGCAGGCTCTCTCTGCCCGCGTCGCTGCCGCCCGCTCGGCCCGCACCTCCGGGAGTACTAGCGACCTCGCCTTCACTTCCGCCAGCATCCCCGTCTACTACCACGTGATCACCGACGGCACCAACGGCCGCCTCACCTCGAGCCAGATCAACTCTCAGATCTCGGTTCTCAACCAGGGCTACTCGGGCACTGGTGTGTCGTTCTACCTCGCCGGTACCGAGACCACCGTCAACTCGAACTGGTTCAACAACGTTAACCAGGGCACCTCTGCCGAGGCTGCCATGAAGAACACCCTCCGCAAGGGCGGTGCCAACGCGCTCAACGTCTACACCGTCAACTTCACCGGCGGTCTTCTCGGTTACGCCACTTTCCCCTGGAGCTACGCTTCGGCTCCCAAGAACGACGGTATCGTTCTCCAGTGGACTTCCTACCCCGGAGGTCCGATCTCAAACTACAACCAGGGCAAGACTCTCGTCCATGGTAAGCTTTTTTTCCATCAAACATTGTGGATTCGTTTGACCATATACTGACAATCGAACTTGATACTTTTTGATGCCAATAGAGGTCGGACACTGGGTTGGTCTTTACCACACCTTCCAGGGCGGTTGCTCCAGCCCCGGTGACTACGTCGACGACACCCCCGCTCAGGGCCAGCCCACCCAGGGCTGCCCTACTACTGCCCCCGACACATGCTCGGGCGGCGGTGCTGACGACATCAAGAACTACATGAACTACAGCTACGACGTCTGCCTCACCCGCTTCACCGCCGGTCAGGTCTCGCGCCTCCAGGCTGCCCTTGATGCCTACCGTTAAAGCAACGGGATCGACCCCAAAAGAACTCGTTCCGCAGGTCTCGTCGTCGGGCTTGCATGTCACCTTTCGCCTTCGCACCGCATCTTTTCTAGCCGCACTTTTGGAATCAACAGCTTTTACATTTGAGCGTTTCGACTGCCAGCCTGTACGGGCTTCTCGTCTTCTCAGCAACCCACAACTTTTGCAGCCTCAGTGTTTGAAGTGATCAACGACTTTGCTTCAGGATGCGAGCCGCTCGTACGAGCTCCTCCTCCGGTCTGTGGAATCGACGCGCCACCGGGGTCTGCAGCTGCAGCGCTGTCGATTTCCGCCGCGCCAAAATTCCAAATCCCGCACACTGACGTCCTGCCTGCCCGGGCAAACGCCGCGGAATTGCCCGACGCCACTTCCCGCACTTTCCGCACTTTCGGCACACCGCAGCTCCTCACGCGCGGAAGCTCGCAATCAGCTCCAACACCCCGCGAGCACATGCGGTCCGCTCCTCCGCAGCAAGACTCTCCGCGTTGA-3'（配列番号６）
＜ＰＡＮ１＿０２４ｆ０６６８５＞
5'-ATGCTCAAGTTCAGCCTGCTCCAGCTCACCACGCTCGCACTCGTGCTGCTTGGCAGCCAAGAAGCACTCGCCGCACCAGGCAAGAAGCGCCCTGTCGAAGCCGTGAGTTTCCTTTAGCAGGCCGTCGCGATGTTGAATCGCTCGCTCACCACCGTCCTCCTTTTGCAACAACAGAAACGCCTCCGCAACGATGTCAAGCGCAAGGATCTTCTCGACGGCGCCAAGAGGCTGCAGGAGATCGCCTACGCCACCACGGAGCGCAACCGCGTGTTTGGCTCGCCCGGCCACAAGGCGACGGTGGAGTACATCCAGAGCGAGCTGCGCAAGGCGGGCGACTACTACGACGTGTACCTGCAGCCCTTCACCGCGACGTATGCCGAGCACTCGGCCGAGGTGGCGATCGACAACAAGGCGGTCGAGTCCAACACGTTCACCTACTCGCCCAATGGCGAGTTCAACGATCTCGAACTCGTACCCGTCAACAACCTCGGTTGCGACCAGGCCGACTTCCCCGCAGGCGTCGAGGGCAAGATCGCACTGATCAAGCGAGGCACTTGCGCGTTCGGCATCAAGGTCGCTCGTGCGGGCACGGCCAAGGCGGCTGCTGTGCTCATCTACAACAATGCACCGGGCGATGTGTCGGGCACGCTCGGCAGTGCAGGACCTACGCCCGAGGGCCCCTTTGTGCCCGTCGCCGGCGTCGACCAGGAGACCGGTGACGCTCTTGCGGCTCGTCTGGCTGCGGGCGAAAAGGTGACGGCCGACATGAAGCTCGAGGGCGTCATCGAGGACCGCACCACGCACAACGTCATCGCCGAATCGCGCGGCGGCTCCAAGGATCAGGTTCTCATGCTGGGTGCGCACTCGGACAGCGTCACCGCCGGTCCCGGCATCAACGACAACGGATCCGGTTCGGTTGCGCTGCTCACCGTCGCCAAGAACCTGGCCAAGTACAGCGTGAACAACGCGGTCCGCTTTGCCTGGTGGTCGGCCGAGGAGTACGGCCTGCTGGGTGCCGAGCACTACGTCGGCGAGCTCTCGCAGCAGCAGAAGGACCAGATCCGCATCTACCTCAACTTTGACATGATCGCCTCGCCCAACTATGTGCTGAGCGTGCACGACGGCGATGGCAGCACCTTCAACACCACCGGCCCCGCCGGATCGGCGCAGGCCGAGGCGATGTTCTTTGACTACTTTAAGAACGTCGCCAAGAAGCCGCTGATCGAGGGACCCTTCGATGGCCGTAGCGACTACGGGCCGTTCCTGGACGCCGGGATTGCTGCTGGCGGTCTCGACACTGGTGCCGAGGGTCTCAAGACCGAGGAGGAGGCCAAGCTGTTTGGCGGCGAGGCGGGCATCGCGTACGACCCCAACTACCACGCGGCTGGCGACACCATCGACAACCTCGCCATGGAGGCGTTTGAGGTCAACACCAAGGCCATCTCGCACGCCGTCGCGCTCTACTCGACGTCGTTCGACAGCCTCGGCCCCCGCGCCAAGGTGGCAGCCAACCGCAGGGACGTCGCCAAGAAGGTCGACCACAGCAACCACCGATGCGGCGGCGACCTTGCGCTTCTGTGA-3'（配列番号７）
5'-ATGCTCAAGTTCAGCCTGCTCCAGCTCACCACGCTCGCACTCGTGCTGCTTGGCAGCCAAGAAGCACTCGCCGCACCAGGCAAGAAGCGCCCTGTCGAAGCCGTGAGTTTCCTTTAGCAGGCCGTCGCGATGTTGAATCGCTCGCTCACCACCGTCCTCCTTTTGCAACAACAGAAACGCCTCCGCAACGATGTCAAGCGCAAGGATCTTCTCGACGGCGCCAAGAGGCTGCAGGAGATCGCCTACGCCACCACGGAGCGCAACCGCGTGTTTGGCTCGCCCGGCCACAAGGCGACGGTGGAGTACATCCAGAGCGAGCTGCGCAAGGCGGGCGACTACTACGACGTGTACCTGCAGCCCTTCACCGCGACGTATGCCGAGCACTCGGCCGAGGTGGCGATCGACAACAAGGCGGTCGAGTCCAACACGTTCACCTACTCGCCCAATGGCGAGTTCAACGATCTCGAACTCGTACCCGTCAACAACCTCGGTTGCGACCAGGCCGACTTCCCCGCAGGCGTCGAGGGCAAGATCGCACTGATCAAGCGAGGCACTTGCGCGTTCGGCATCAAGGTCGCTCGTGCGGGCACGGCCAAGGCGGCTGCTGTGCTCATCTACAACAATGCACCGGGCGATGTGTCGGGCACGCTCGGCAGTGCAGGACCTACGCCCGAGGGCCCCTTTGTGCCCGTCGCCGGCGTCGACCAGGAGACCGGTGACGCTCTTGCGGCTCGTCTGGCTGCGGGCGAAAAGGTGACGGCCGACATGAAGCTCGAGGGCGTCATCGAGGACCGCACCACGCACAACGTCATCGCCGAATCGCGCGGCGGCTCCAAGGATCAGGTTCTCATGCTGGGTGCGCACTCGGACAGCGTCACCGCCGGTCCCGGCATCAACGACAACGGATCCGGTTCGGTTGCGCTGCTCACCGTCGCCAAGAACCTGGCCAAGTACAGCGTGAACAACGCGGTCCGCTTTGCCTGGTGGTCGGCCGAGGAGTACGGCCTGCTGGGTGCCGAGCACTACGTCGGCGAGCTCTCGCAGCAGCAGAAGGACCAGATCCGCATCTACCTCAACTTTGACATGATCGCCTCGCCCAACTATGTGCTGAGCGTGCACGACGGCGATGGCAGCACCTTCAACACCACCGGCCCCGCCGGATCGGCGCAGGCCGAGGCGATGTTCTTTGACTACTTTAAGAACGTCGCCAAGAAGCCGCTGATCGAGGGACCCTTCGATGGCCGTAGCGACTACGGGCCGTTCCTGGACGCCGGGATTGCTGCTGGCGGTCTCGACACTGGTGCCGAGGGTCTCAAGACCGAGGAGGAGGCCAAGCTGTTTGGCGGCGAGGCGGGCATCGCGTACGACCCCAACTACCACGCGGCTGGCGACACCATCGACAACCTCGCCATGGAGGCGTTTGAGGTCAACACCAAGGCCATCTCGCACGCCGTCGCGCTCTACTCGACGTCGTTCGACAGCCTCGGCCCCCGCGCCAAGGTGGCAGCCAACCGCAGGGACGTCGCCAAGAAGGTCGACCACAGCAACCACCGATGCGGCGGCGACCTTGCGCTTCTGTGA-3'（配列番号７）
＜ＰＡＮ１＿０１２ｒ０４５６４＞
5'-ATGTACACGAAGCGATACCTCGGCCTCCTGGCCCTCGCTCTGAGCCTCCCGCTCGCCGCGCTCGCCGCTCCCGCTCACCAGCCCTTCGTGCCCGGTTCGAGCGCCAACGCATACTCCCCCTCGACTCAGTTTGCGCCCCTCACCGCAAACCCTGACCTCGAGACCATCCCGGGCGCCTACATGGTCGTCCTCAAGGATGGCGTCAGCTCCGCAGACTTCTTTGCCCACCAGGGCCTCATCTCGTCCGCTCAGCTCTCGGCAAACGGCTTCCACGGCGAGGATGCGGAAGGCATCCGCCACGTCTACGACCTCGAGGGCCACCTCCAGGGCTACGCCGGCAAGTTCACCGATGACGTCCTCGACTACATTCGCGCACAGCCCGAGGTCGAGTACGTCGAGATGGACTCGCGCGTCTCGATCGAGGTCATGCCTCAGGCCGAGGACAAGACCTGGGACGTTCAGTACGACGCCGACCTCGGCCAGGCCGCCCTCTCGGTCATGAACACGGACAAGGTCGGCGCCTATGACATTGAGAAGGGCGCCCCCTGGGGTCTCGCCCGCATCTCGCACCGCAAGCGCCTCGGCCTCAGCACCTTCAACAAGTACGTCTACCAGGGCGACGGCGGTGAGGGCGTCACCGCCTACATCATCGACACCGGCATCAACATCAACCACGTCGAGTTCGAGGGTCGCGCTCGCTGGGGCAAGACCATGCCCCAGAACGACGTCGACGAGGACGGCAACGGTCACGGCACCCACTGCGCCGGTACCATCGGCTCGCGCAAGTACGGCGTAGCAAAGAAGGCCGACCTCGTCGCCGTCAAGGTGCTCGGCTCCGGCGGCTCCGGCTCCATGTCGGACGTCACCGGCGGCGTCCTCTGGGCCGTCGACGACGCCAAGAAGCTCACCGCACAGTTCCGCGCCAACCCGCGCTCGGCGGCGGCCAAGAAGCACAAGGGCTTCGTCGCCAACATGTCGCTCGGCGGCGGCAAGTCGATCACGCTCGACAAGGCCGTCAACGGCGCCGTCACCGCAGGCATGCACTTTGGCGTCGCCGCAGGCAACGAGAACCAGGACGCCTGCAACGTCTCGCCCGCCGGCGCATCCAACCCCGTCACCGTCGGCGCCTCCACCGTCCAGGACGAGCGCGCCTACTTCTCCAACAAGGGCAAGTGCGTCGACATCTTTGCGCCCGGCCTCAACATCCTCTCCACCTGGAACACGGGCAACACCTCGGTCAACACCATCTCGGGCACCTCGATGGCCAGCCCGCACATTGTCGGCCTGCTCGCCTATCTGCTCTCGATCTACGGCACCGCCGACTTCAAGCTGCTCGCTGGCGGCCAGGCGGACCACCTCTCGATCGCCGCCGTCGAGGACTCGCTCGCCTCGAAGCTCTCGAGCGTGCTTCCCATCCCCGCCATGGCGCTCGACCTGGTGAGCAGCGTCGCCGGCTACTTTGCCGGTGCCGATGCCGCCAAGCCCGACATTGACGGCGTGCTGTCGCCCACCGAGCTCAAGAAGGCGCTCATCAAGCTCGCCTCGCCTGGCGTCCTCACGGGCCTCGACGCGGACACGGTCAACAAGCTCGCCTTCAACAACGCCACCTCGTCGGCCTGA-3'（配列番号８）
5'-ATGTACACGAAGCGATACCTCGGCCTCCTGGCCCTCGCTCTGAGCCTCCCGCTCGCCGCGCTCGCCGCTCCCGCTCACCAGCCCTTCGTGCCCGGTTCGAGCGCCAACGCATACTCCCCCTCGACTCAGTTTGCGCCCCTCACCGCAAACCCTGACCTCGAGACCATCCCGGGCGCCTACATGGTCGTCCTCAAGGATGGCGTCAGCTCCGCAGACTTCTTTGCCCACCAGGGCCTCATCTCGTCCGCTCAGCTCTCGGCAAACGGCTTCCACGGCGAGGATGCGGAAGGCATCCGCCACGTCTACGACCTCGAGGGCCACCTCCAGGGCTACGCCGGCAAGTTCACCGATGACGTCCTCGACTACATTCGCGCACAGCCCGAGGTCGAGTACGTCGAGATGGACTCGCGCGTCTCGATCGAGGTCATGCCTCAGGCCGAGGACAAGACCTGGGACGTTCAGTACGACGCCGACCTCGGCCAGGCCGCCCTCTCGGTCATGAACACGGACAAGGTCGGCGCCTATGACATTGAGAAGGGCGCCCCCTGGGGTCTCGCCCGCATCTCGCACCGCAAGCGCCTCGGCCTCAGCACCTTCAACAAGTACGTCTACCAGGGCGACGGCGGTGAGGGCGTCACCGCCTACATCATCGACACCGGCATCAACATCAACCACGTCGAGTTCGAGGGTCGCGCTCGCTGGGGCAAGACCATGCCCCAGAACGACGTCGACGAGGACGGCAACGGTCACGGCACCCACTGCGCCGGTACCATCGGCTCGCGCAAGTACGGCGTAGCAAAGAAGGCCGACCTCGTCGCCGTCAAGGTGCTCGGCTCCGGCGGCTCCGGCTCCATGTCGGACGTCACCGGCGGCGTCCTCTGGGCCGTCGACGACGCCAAGAAGCTCACCGCACAGTTCCGCGCCAACCCGCGCTCGGCGGCGGCCAAGAAGCACAAGGGCTTCGTCGCCAACATGTCGCTCGGCGGCGGCAAGTCGATCACGCTCGACAAGGCCGTCAACGGCGCCGTCACCGCAGGCATGCACTTTGGCGTCGCCGCAGGCAACGAGAACCAGGACGCCTGCAACGTCTCGCCCGCCGGCGCATCCAACCCCGTCACCGTCGGCGCCTCCACCGTCCAGGACGAGCGCGCCTACTTCTCCAACAAGGGCAAGTGCGTCGACATCTTTGCGCCCGGCCTCAACATCCTCTCCACCTGGAACACGGGCAACACCTCGGTCAACACCATCTCGGGCACCTCGATGGCCAGCCCGCACATTGTCGGCCTGCTCGCCTATCTGCTCTCGATCTACGGCACCGCCGACTTCAAGCTGCTCGCTGGCGGCCAGGCGGACCACCTCTCGATCGCCGCCGTCGAGGACTCGCTCGCCTCGAAGCTCTCGAGCGTGCTTCCCATCCCCGCCATGGCGCTCGACCTGGTGAGCAGCGTCGCCGGCTACTTTGCCGGTGCCGATGCCGCCAAGCCCGACATTGACGGCGTGCTGTCGCCCACCGAGCTCAAGAAGGCGCTCATCAAGCTCGCCTCGCCTGGCGTCCTCACGGGCCTCGACGCGGACACGGTCAACAAGCTCGCCTTCAACAACGCCACCTCGTCGGCCTGA-3'（配列番号８）
＜ＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７＞
5'-ATGAAGTCCAACACGGCCTGGGCTGGCCTCGCCGCCACCGCCACCCTCACCGCGCTCGTCTCGGCAAAGCACGAGCTCGACGTCTCGCACGAGCCCATCACCTCGCTCTTCAAGGCCGACGGCACCCCTTCCCACCCGCACTTCCTCCAGTCGCGATGGGTCACCTCCGAGCTGCCCCTCGACTACCGCAAACGCGACCTCTCCGGCACCGGTTCCAAGCGCAGCTCAAAGACCTGCCGCGCCGACAAGTCCAAGCCACGCACCGACGACCGCAAGCACCACGGCCGCCACAGCGTCCTCCACACGCTCGACCACCTCGGCCACCAGGTCGCCAGCTGGATCGAGGGCGGCAAGTACCACGACCACTCGCTCGGCATCGTCATCAACAAGGCCACCGACAACTCGGCAGACAACGAGTGGCTCGTCAACGTCGGCTTTGGCTCGCCCGCCCAGACGCTCAAGATGGTCTTTGACTCGGGCAGCTCCGACACCTGGGTCTACTCGCCCCAGTGCTGCTACGCCAACAACCACACCTTCTTCGACCCCAACCAGTCCGACACCTTCCACAACCGCACCGTCGTCAACAACGTCGCCGTCCCCGCTCCCGACGGCACCCCGGGCCAGGCTTGGTCCTCCACCTACGGCTCCGGCTCCAGCGTCTCGGGCTACGTCGGCATCGACGACTTCACCTTTGGCCAGCAGAGGCTCACCGTCGACCAGCTGCCCCTCGCCCTCGTCACCTCCATCAAGGGCTCGCGCGCGGGCCGTGGCATGGAGGGCCTCGTCGGCCTTTCCGCAGGCTCCGGCTCCGAAACCCCGGGCGAGTGGACCACGCCCTTTGAGGCCATGTCGTCGCGCGGCCAGATCGACCAGACCTACCTCACTGCCACGCTGCGCAAGGCCAACCGCAACACGGGCAAGGGCGGCGGAGGCCGCTACACCTTTGGCGAGATCGACGACCGCCTGCTCGACGGCAACATCACCTGGACGCGCGCCCTCTCCCCCTACCTCTGGGCAGGTTACTTTGACCAGATGACCTTTGGCGACTCGCTCCTCGCCGCCGCACCGGGCACCCAGGAACGCCCGATCCGCTTCATGATCGACACCGGCTCCGCCGTCTTCTATCTGCCCCCACCCATCGTCAAGCAGATCAACAGCCAGATCGCCGGCTCGCTCGTCGCCAACTCGTCGAGCGGCCTCGCCTTCCCTTACCTCGTCCCCTGCGACACCGGCCTCAAGAGGCACGAGAGGACCGCCAACAACCCCAGCTTCAACCTCCAGATCGGCGGCACCAACTTCACCATCCCCAAGGAGGACTACGTCTTCTACGCCAACCAGCCCGTGCCCGCGGCGGCGGCGGGCGGCAAGACCGACATGTGCTACTCGGCCTTCCAGACCGGTCCCGCGCAGATCTCGATCATCGGCCTCAGCTTCATCAAGAACCACGTCGTCGTGCTCGACCAGGGCGGACGCAACCTCACCGTCTCCGCCAGGCGCATCGGTCTGGGCCAGCGCAAGGACGTGCGCTACGACTGA-3'（配列番号９）
5'-ATGAAGTCCAACACGGCCTGGGCTGGCCTCGCCGCCACCGCCACCCTCACCGCGCTCGTCTCGGCAAAGCACGAGCTCGACGTCTCGCACGAGCCCATCACCTCGCTCTTCAAGGCCGACGGCACCCCTTCCCACCCGCACTTCCTCCAGTCGCGATGGGTCACCTCCGAGCTGCCCCTCGACTACCGCAAACGCGACCTCTCCGGCACCGGTTCCAAGCGCAGCTCAAAGACCTGCCGCGCCGACAAGTCCAAGCCACGCACCGACGACCGCAAGCACCACGGCCGCCACAGCGTCCTCCACACGCTCGACCACCTCGGCCACCAGGTCGCCAGCTGGATCGAGGGCGGCAAGTACCACGACCACTCGCTCGGCATCGTCATCAACAAGGCCACCGACAACTCGGCAGACAACGAGTGGCTCGTCAACGTCGGCTTTGGCTCGCCCGCCCAGACGCTCAAGATGGTCTTTGACTCGGGCAGCTCCGACACCTGGGTCTACTCGCCCCAGTGCTGCTACGCCAACAACCACACCTTCTTCGACCCCAACCAGTCCGACACCTTCCACAACCGCACCGTCGTCAACAACGTCGCCGTCCCCGCTCCCGACGGCACCCCGGGCCAGGCTTGGTCCTCCACCTACGGCTCCGGCTCCAGCGTCTCGGGCTACGTCGGCATCGACGACTTCACCTTTGGCCAGCAGAGGCTCACCGTCGACCAGCTGCCCCTCGCCCTCGTCACCTCCATCAAGGGCTCGCGCGCGGGCCGTGGCATGGAGGGCCTCGTCGGCCTTTCCGCAGGCTCCGGCTCCGAAACCCCGGGCGAGTGGACCACGCCCTTTGAGGCCATGTCGTCGCGCGGCCAGATCGACCAGACCTACCTCACTGCCACGCTGCGCAAGGCCAACCGCAACACGGGCAAGGGCGGCGGAGGCCGCTACACCTTTGGCGAGATCGACGACCGCCTGCTCGACGGCAACATCACCTGGACGCGCGCCCTCTCCCCCTACCTCTGGGCAGGTTACTTTGACCAGATGACCTTTGGCGACTCGCTCCTCGCCGCCGCACCGGGCACCCAGGAACGCCCGATCCGCTTCATGATCGACACCGGCTCCGCCGTCTTCTATCTGCCCCCACCCATCGTCAAGCAGATCAACAGCCAGATCGCCGGCTCGCTCGTCGCCAACTCGTCGAGCGGCCTCGCCTTCCCTTACCTCGTCCCCTGCGACACCGGCCTCAAGAGGCACGAGAGGACCGCCAACAACCCCAGCTTCAACCTCCAGATCGGCGGCACCAACTTCACCATCCCCAAGGAGGACTACGTCTTCTACGCCAACCAGCCCGTGCCCGCGGCGGCGGCGGGCGGCAAGACCGACATGTGCTACTCGGCCTTCCAGACCGGTCCCGCGCAGATCTCGATCATCGGCCTCAGCTTCATCAAGAACCACGTCGTCGTGCTCGACCAGGGCGGACGCAACCTCACCGTCTCCGCCAGGCGCATCGGTCTGGGCCAGCGCAAGGACGTGCGCTACGACTGA-3'（配列番号９）
＜ＰＡＮ１＿０１３ｒ０４７７９＞
5'-ATGCGTTCCAATTCCAGCTTCGACAACACCGCATCCCACCAGCCAGCACCCGATTCCACCACGCAAATCACCCCACCCATCGACGCAGACCCTTCATCATCACAACACTCTAGCTCCTCCTCGGCGCGCCGTCCACCACCCTCGCCGCACGCCAGCCCAGAGCACAAACCTAGCCCGCGTTTCCCCACAGCCCTCTCAGCCACGGATCACCGCAGGTCGAGCGCATACAAGCGAGCGCGCACCGCCAGCCCCATCATCGACGACAACAGCAGCGACGTCGAGAACGACAACAGGTCCGCTTACTCCCGTTCCGCTAGCGACTTGGGCGATCTCGACCTCACCGAACACGCGTCGTCCGTGCAACCTACACCGCTCCGCCAGAGCGTCTCGTCAGCCGAACTGCTCCATTCAGCACGCCCTTTCGGAAGCGGCATCGTCATGGCATCACTCGACCCCAACGTTGAGGGTCTCATGACCGAGCAGTCCCTCAGTCTCGACGACGGCGCTGTCGCCGCACCCGCCTCGGTCGCCGCCATGTCCGCCGATCTCAGCCACGACGAAGAGCCGCCCTCGTACCAGGAGGCTGTGCCTCTGCCTCCCTCGTCCTTGGCGCCTAGCAACGAGCCAAGACCCACAGGCCAACAGCAGCTCAGCATCGTTTCACCCATGAGGAACCTCCCCTTGCACGCCGGCGACACCTGGTATATCGTCAGCCGAGCGTGGTACCGTCGCTGGGATGCCGCTTGTTCGGAGCATCGCGACGCGGATCCATCAGAGAAGGCAGATCCTCCCGTCGGCCCCATCGACAACGCCGACCTCTTGGACTCCGAGGCGCCAACCGGATTCGCACAGCTGCGACAGCACATCAACGAACACATCGACTACGAGATGCTTCCCGAGCAAGGTTGGAAGCTCCTCGTCGCTTGGTACGGCTGCACTGGTCCCGTCTTTGCCAGAAACGCCATCGAAGGTCTCAGTCCCGGCCAGGAGAGTGTCGAGTTCTACCCGCCCATCATCCGACTGCTCCGCGTGGTCCAGGACGACACCAAAGACGACGTCACCCGCGCGCCCTTGTTCAGCTTGTCCGTCAGCACCGAGCTGTCCGAGCTCAAGGCCAAGGCCAAGACCACCTTCGACCTCGGCGACGTTGCCGATGTCGATCTGCGCTTCTACCACTTCCCCGAGCCCGAAGACAGCGAGCTGCAATCGGGTCGGGTGACCATCGCTCGGGTCGAGCTCGACGGCGTCGACCTCATCGATGCCAACGAAGACAAGCCCGACACCTACCGCTCCGACGTCACGCTCAAGTCGATCGGCATCGACGAGATCGAGGTCAACTTGGTCGTCGAGACGCGCAAGTCCGGAAGATGGCAATCAGAAGGACCCGCCGAGGAAGCGCCCTCGGTCAAAGGCATCTTTGCACAGCAGAGCGGCGACTTTTTCAGCAACCTGCAACAGCCCAGCGCGAGCACCACCAGCATCACCGCTGCTGGCTCCGCGGGCGATGCTCTTGGCAGAGTCACGCGTTCGCAAACAGCGACCGACCGCACCATGGGTAGGTCGCGCGGATTGCGCGGCCTCAACAACCTCGGCAACACGTGTTTCATGAACAGTGCGCTGCAGTGCCTGAGCAACACGTACGAGCTGCAGCAGTACTTTGTCTCGGGCGCGTATCGCGACGAGCTCAACACCGACAACCCGCTCGGCATGGGCGGCGCCATCGCAGAAGCCTTCGGAAACCTCATCTCCAACATCTGGAACGGCCAGGGCGGCTCGTTCTGGCCGCGCGAGTTCAAGTTCGCCCTCTCGCGATTCGCTCCCCAGTTCAGCGGCTACGCACAGCACGATAGCCAGGAGCTGCTTGCCTTCTTGCTCGACGGCCTCCACGAGGATCTCAACCGCATTCTCAAGAAGCCCTACATCGAGGCGCCCGACTGGGACGGCGGCGACGAAAAGGCGCTCGTCGCCTTTGCAAAGCGTCAGTGGGACATCTACAAGGCACGCAACGACTCGGTCATCGTCGATCTCTTCCAGGGCCAGTACCGCAGCACACTCGTGTGTCCCGAGTGCAGCAAGATCTCGATCAAGTTTGATCCATTCATGTACCTCACGCTGCCCATCCCCAACAAGAAGGTCTGGCGCGCACAGGTCTACTTTGTGCCGCTCGAGCCCACCAAGCCCTTGCAAAAGTTTCACGTCCAGCTTCCAGCCGGCAGCACCGTCAGCAAGCTTCGCCAGAAGGTGGCCGCGCAGTTTGGCGTCGAGACGCGCCAGCTGATCTGTGGCGAGGTCTGGCACCACCGCATCTACAAGTGGATCGACGATTACGAGCCGCTCGTCGACATCAAGGACGGCGACTTTGTCTACTTCTGGGAGGTGCCTGCCGCGCCGCGCTTGTCCAAGCAGCGCCACTACCGCTACCATCGCTCCGTGGAGGACGCCGAGGAGGCGCTCGACATTCCCGAGGCAGACCATGCCATCGTGCCCGTCTTTGCCAACTATGCCCAAAAGATTGCCTCCGCCTCGTCGAGCCAGGCCTTTGTCAGCCGCCGCACTCGTGGCGAGCCGGTAGGCATCCCCTTCTTCATCGCTGTGCCAAAGCAGGACATCAACGATCTCAACGCCGTGCGCAAGCTCGTCACCGACGGCTTCTCTCGCTTCGCGCGCGATCAGGACGCGTATCGGAATGTGGTTGAAGAGCAAACCGAAGATGTCGCACGCCTTGCGACAGCCGAGACATCCKCTCAGGCCCAAATCTCGGACTGGGAAATGGTCGACGACGATGCCGCAAACGAGGCCAACGTCGAGGTCGTACCACCGAGCCAACCGGTCGGCCCAGATGCGGTCACCGAGATTCACGAAGATGGGAATGCTGTTGTGGTGTCCGACGCCAGTGCATCAAGCACCGACGTTTCGCTGGCCGCCAGCAAAGCTCTCGTGCAGTCCGAGCCGTCGCTTCGCATCCGTTTCAGCGTCGCCGAAGCCGGTCAAGGTCTTCCCAAGGGCAGCGAAAGCGGCGCAGATCACCTCTCGGAGGAGATCACGGAACGACAGGCGCGCCTCGCCAAGCGTGCTCTCGCAACACCAATCGACGCGGACGAGGAGGACATGGACGAGGGCGATGACGAGTCTCAGGCCGCACCCAAAGCGTCCAAGGCGATTCCGCTGGTCTACACTGGCGGCGCGATCGTGTGCACATGGTCGTCCGCCTTCTGCGAACGCGACCTGCTGGTCGAATCCGATTCCGGCCAGCTGTGGGGAGACTACGAGCAAGTGGTCGACGAGGCCATCCGCGAGCGCGACGCGGCTGGCCCCTCGCGCCCCAAGTCGCTGTCGATCGAGGACTGCATGGACGAATTCACCAGGGAGGAGCAGCTCGGAGAGGACGATCCGTGGTACTGCCCATCGTGCAAGGAGTTCCGACAGGCGACCAAGAAGTTTGACCTTTGGAAAGCACCGGACATCCTGGTGGTGCATCTGAAGCGCTTCAGCGCGGGGCGCCACTCGCGCGACAAGCTCAACATGCTCGTCGACTTCCCGCTCGAGGGACTGGATCTGACGGATCGGGTCGAGGGCACGCAGGCGCTGCGGCGCGTGCAGGAGGAGGCCAAGCAGAGCGGCGAGGAGCTTTCGGAGAGCATGCTGGGCTCGGGCATCCTGCGTCCGCTCGAAGACAACGACGATGCGGTGGCGGTGGACAAGCCGATCTACGACCTGTACGCGGTGGACAACCACTTTGGCGGGCTTGGCGGCGGGCACTACACGGCGTTCGCAAAGAGCCCGGCAGATGGCAAGTGGTACGAATTCGACGACTCGAGCGTACGGCCGGTGGCGAACCCCGAGAGTGTTAAGAGCGCTTCGGCGTATCTGCTCTTCTATCGCCGGCGGACGACGAGGCCGATCGGTGGCAAGTCGAGGCAAAAATTCCAGGAGGCCGCCAAGTCCAAGGCGTCGAGTGCATCGCAGAGCGCCGAGGCTAGCACGTCGGGGCTGCAGAACCAGCTCACTCCGGCCGACGATGACGACTCGAGCGACTCGTCGAGTGACGAAGCACCTGAATGGTCGCTGAACCTGCGAAGCGGCGCGGGTGTTGATGCGGTAGAGCCTGCGTCTGGCTGGTCGAGCACCGGCAACTCGCCCCCATCCTCCAGTCGCGCTTCTAGTCCCGATAGCGACCGCGATCTGGACTCTCCGTGA-3'（配列番号１０）
5'-ATGCGTTCCAATTCCAGCTTCGACAACACCGCATCCCACCAGCCAGCACCCGATTCCACCACGCAAATCACCCCACCCATCGACGCAGACCCTTCATCATCACAACACTCTAGCTCCTCCTCGGCGCGCCGTCCACCACCCTCGCCGCACGCCAGCCCAGAGCACAAACCTAGCCCGCGTTTCCCCACAGCCCTCTCAGCCACGGATCACCGCAGGTCGAGCGCATACAAGCGAGCGCGCACCGCCAGCCCCATCATCGACGACAACAGCAGCGACGTCGAGAACGACAACAGGTCCGCTTACTCCCGTTCCGCTAGCGACTTGGGCGATCTCGACCTCACCGAACACGCGTCGTCCGTGCAACCTACACCGCTCCGCCAGAGCGTCTCGTCAGCCGAACTGCTCCATTCAGCACGCCCTTTCGGAAGCGGCATCGTCATGGCATCACTCGACCCCAACGTTGAGGGTCTCATGACCGAGCAGTCCCTCAGTCTCGACGACGGCGCTGTCGCCGCACCCGCCTCGGTCGCCGCCATGTCCGCCGATCTCAGCCACGACGAAGAGCCGCCCTCGTACCAGGAGGCTGTGCCTCTGCCTCCCTCGTCCTTGGCGCCTAGCAACGAGCCAAGACCCACAGGCCAACAGCAGCTCAGCATCGTTTCACCCATGAGGAACCTCCCCTTGCACGCCGGCGACACCTGGTATATCGTCAGCCGAGCGTGGTACCGTCGCTGGGATGCCGCTTGTTCGGAGCATCGCGACGCGGATCCATCAGAGAAGGCAGATCCTCCCGTCGGCCCCATCGACAACGCCGACCTCTTGGACTCCGAGGCGCCAACCGGATTCGCACAGCTGCGACAGCACATCAACGAACACATCGACTACGAGATGCTTCCCGAGCAAGGTTGGAAGCTCCTCGTCGCTTGGTACGGCTGCACTGGTCCCGTCTTTGCCAGAAACGCCATCGAAGGTCTCAGTCCCGGCCAGGAGAGTGTCGAGTTCTACCCGCCCATCATCCGACTGCTCCGCGTGGTCCAGGACGACACCAAAGACGACGTCACCCGCGCGCCCTTGTTCAGCTTGTCCGTCAGCACCGAGCTGTCCGAGCTCAAGGCCAAGGCCAAGACCACCTTCGACCTCGGCGACGTTGCCGATGTCGATCTGCGCTTCTACCACTTCCCCGAGCCCGAAGACAGCGAGCTGCAATCGGGTCGGGTGACCATCGCTCGGGTCGAGCTCGACGGCGTCGACCTCATCGATGCCAACGAAGACAAGCCCGACACCTACCGCTCCGACGTCACGCTCAAGTCGATCGGCATCGACGAGATCGAGGTCAACTTGGTCGTCGAGACGCGCAAGTCCGGAAGATGGCAATCAGAAGGACCCGCCGAGGAAGCGCCCTCGGTCAAAGGCATCTTTGCACAGCAGAGCGGCGACTTTTTCAGCAACCTGCAACAGCCCAGCGCGAGCACCACCAGCATCACCGCTGCTGGCTCCGCGGGCGATGCTCTTGGCAGAGTCACGCGTTCGCAAACAGCGACCGACCGCACCATGGGTAGGTCGCGCGGATTGCGCGGCCTCAACAACCTCGGCAACACGTGTTTCATGAACAGTGCGCTGCAGTGCCTGAGCAACACGTACGAGCTGCAGCAGTACTTTGTCTCGGGCGCGTATCGCGACGAGCTCAACACCGACAACCCGCTCGGCATGGGCGGCGCCATCGCAGAAGCCTTCGGAAACCTCATCTCCAACATCTGGAACGGCCAGGGCGGCTCGTTCTGGCCGCGCGAGTTCAAGTTCGCCCTCTCGCGATTCGCTCCCCAGTTCAGCGGCTACGCACAGCACGATAGCCAGGAGCTGCTTGCCTTCTTGCTCGACGGCCTCCACGAGGATCTCAACCGCATTCTCAAGAAGCCCTACATCGAGGCGCCCGACTGGGACGGCGGCGACGAAAAGGCGCTCGTCGCCTTTGCAAAGCGTCAGTGGGACATCTACAAGGCACGCAACGACTCGGTCATCGTCGATCTCTTCCAGGGCCAGTACCGCAGCACACTCGTGTGTCCCGAGTGCAGCAAGATCTCGATCAAGTTTGATCCATTCATGTACCTCACGCTGCCCATCCCCAACAAGAAGGTCTGGCGCGCACAGGTCTACTTTGTGCCGCTCGAGCCCACCAAGCCCTTGCAAAAGTTTCACGTCCAGCTTCCAGCCGGCAGCACCGTCAGCAAGCTTCGCCAGAAGGTGGCCGCGCAGTTTGGCGTCGAGACGCGCCAGCTGATCTGTGGCGAGGTCTGGCACCACCGCATCTACAAGTGGATCGACGATTACGAGCCGCTCGTCGACATCAAGGACGGCGACTTTGTCTACTTCTGGGAGGTGCCTGCCGCGCCGCGCTTGTCCAAGCAGCGCCACTACCGCTACCATCGCTCCGTGGAGGACGCCGAGGAGGCGCTCGACATTCCCGAGGCAGACCATGCCATCGTGCCCGTCTTTGCCAACTATGCCCAAAAGATTGCCTCCGCCTCGTCGAGCCAGGCCTTTGTCAGCCGCCGCACTCGTGGCGAGCCGGTAGGCATCCCCTTCTTCATCGCTGTGCCAAAGCAGGACATCAACGATCTCAACGCCGTGCGCAAGCTCGTCACCGACGGCTTCTCTCGCTTCGCGCGCGATCAGGACGCGTATCGGAATGTGGTTGAAGAGCAAACCGAAGATGTCGCACGCCTTGCGACAGCCGAGACATCCKCTCAGGCCCAAATCTCGGACTGGGAAATGGTCGACGACGATGCCGCAAACGAGGCCAACGTCGAGGTCGTACCACCGAGCCAACCGGTCGGCCCAGATGCGGTCACCGAGATTCACGAAGATGGGAATGCTGTTGTGGTGTCCGACGCCAGTGCATCAAGCACCGACGTTTCGCTGGCCGCCAGCAAAGCTCTCGTGCAGTCCGAGCCGTCGCTTCGCATCCGTTTCAGCGTCGCCGAAGCCGGTCAAGGTCTTCCCAAGGGCAGCGAAAGCGGCGCAGATCACCTCTCGGAGGAGATCACGGAACGACAGGCGCGCCTCGCCAAGCGTGCTCTCGCAACACCAATCGACGCGGACGAGGAGGACATGGACGAGGGCGATGACGAGTCTCAGGCCGCACCCAAAGCGTCCAAGGCGATTCCGCTGGTCTACACTGGCGGCGCGATCGTGTGCACATGGTCGTCCGCCTTCTGCGAACGCGACCTGCTGGTCGAATCCGATTCCGGCCAGCTGTGGGGAGACTACGAGCAAGTGGTCGACGAGGCCATCCGCGAGCGCGACGCGGCTGGCCCCTCGCGCCCCAAGTCGCTGTCGATCGAGGACTGCATGGACGAATTCACCAGGGAGGAGCAGCTCGGAGAGGACGATCCGTGGTACTGCCCATCGTGCAAGGAGTTCCGACAGGCGACCAAGAAGTTTGACCTTTGGAAAGCACCGGACATCCTGGTGGTGCATCTGAAGCGCTTCAGCGCGGGGCGCCACTCGCGCGACAAGCTCAACATGCTCGTCGACTTCCCGCTCGAGGGACTGGATCTGACGGATCGGGTCGAGGGCACGCAGGCGCTGCGGCGCGTGCAGGAGGAGGCCAAGCAGAGCGGCGAGGAGCTTTCGGAGAGCATGCTGGGCTCGGGCATCCTGCGTCCGCTCGAAGACAACGACGATGCGGTGGCGGTGGACAAGCCGATCTACGACCTGTACGCGGTGGACAACCACTTTGGCGGGCTTGGCGGCGGGCACTACACGGCGTTCGCAAAGAGCCCGGCAGATGGCAAGTGGTACGAATTCGACGACTCGAGCGTACGGCCGGTGGCGAACCCCGAGAGTGTTAAGAGCGCTTCGGCGTATCTGCTCTTCTATCGCCGGCGGACGACGAGGCCGATCGGTGGCAAGTCGAGGCAAAAATTCCAGGAGGCCGCCAAGTCCAAGGCGTCGAGTGCATCGCAGAGCGCCGAGGCTAGCACGTCGGGGCTGCAGAACCAGCTCACTCCGGCCGACGATGACGACTCGAGCGACTCGTCGAGTGACGAAGCACCTGAATGGTCGCTGAACCTGCGAAGCGGCGCGGGTGTTGATGCGGTAGAGCCTGCGTCTGGCTGGTCGAGCACCGGCAACTCGCCCCCATCCTCCAGTCGCGCTTCTAGTCCCGATAGCGACCGCGATCTGGACTCTCCGTGA-3'（配列番号１０）
＜ＰＡＮ１＿０２３ｒ０６５６３＞
5'-ATGTGCTCGCCCAACGTCCACTTTGAGCACCTTATCGGCTCGTCCAATCCATCGCCTGCATCGCCTGCATCGCCATCACAACCGTTCCGCAGCCTCTCGCACGCACGCATCGCCGGCGCATCATCCTGGCGCTCGAATAGCGACCAATCCGCATCGACAGCAGCGCCACTGAGCCACACCATCAACCACCACTCGTCCGTGCTCTCGCTCGCGGTCGATGAGCGTCGCAACCTGCTCTACTCGGGCTCCCAGGAGGGCTGCATCCACGTTTGGGACCTCGAGACATTCCAGCCAGCTGCGCGGCTACAAGGCCACACAGGGAGCGTGCTTGCGCTCGAGCTCGCTCCGGAGAAGCGCTGGCTCTTTAGCTCGTCCGGGGACAACACGATCCGCGTATGGAACACCGACACGAATTCGCCGCTCTTTGTGGTACATCCTGCCGAAGAGAACGTCGGCGACATCTTTGCACTCAAGTGGTGCGCCAGGCTCCAGACGCTGTACCTGGGATGCCAGTCCACCTCGATCCAGTGGATCTGCCTGGCGGGATTCGACAAGCAGCCCGGCCCGTCGAAGCGGCTCGACGCCAACGAGTTGCTCGCGCCGCATGCTGACGTGGGCACAGCACCAGTCGGCTTCAACCAGGCAGGCGCGGACAGTCCCATCATCTCGACGCCGGACATCGTCGCACGGCCGCACAGGTTCTTCGACTCGGTCCCCGTTGCGCTCAGCAGGTCCGGCCTCGGCAGCGCCGGAAGCTCGACTCCAGCACGTGTCCGACCACCGTCCTCGGCCCCTCTGAAATTCTCCAAGGCAACCGCTTCGACTGACGGACCGCTATCCACCGAGCTAGATTCGCATCTGAGCGACAAGGGGCCGCTGTCGACCACCCGCGCCACCGAAAAGGTTCTGCACGCCGCATCGCAACGCCTGGATAGCACGGCCGTGCGCGACGAGATGGCACGCGACGACTCGGGCGGATCGGTGCGCACGCTGCTCGTGCCGCCGAGCTCTGCAGTGCCCTCGGCGCACTTTGGCTACGTCTACTGCCTGGCGCTGCTGACGCTCGAGGGCGATGCGCAGCACCCGACCGTGCTCGCCTCGGGCTCGGGCGACGAGACCATCAAGCTGTGGCACGCCACGCGCGCCGGCCTCTCGCTGCTCGCCACGCTTGAAAGCCCAAATGCGGACGGCAACGCTGTGCTCGCGCTTGCCTCGTGGAAGACGACGCTCTTCGCCGGTCTGCAGGGCGGAGAGGTCGAGGTGTGGGATCTCGAGACGTGTACGCTCGTGCGCACCATCCGCGCGCACTCGGACGATGTCATCTGTCTAGAGACGTGTGCCGAGTCCGGCCTGCTGTTCACCGCGGGCGCGGATGGGAATGTGCACACGTGGGACCGGTCCTTTAGACGCATCAACAGGGTGCAGGCGCACAAAGGCATCGTGTTGTCCATGACCAAGGTGCGCACGCCTGCTAAAAGCGGCGAGGCAGCGAGGGTGGCACAGCTAGTCACGGGGTCCAGCGACAACTTTATCCGCATCTGGGACACGACCGCCTCGCCCGCACTGCCGTCATCGTCGCGCGAACCTGTAGCCGAACTGCGCCGCCGCGAGCTGGAGCATCTGTCGCTCGAAGAGCCCGCTATGCCCTCGCTCTCCTCGACGCCGATTGCCACGTCGTCTGCCGTCGTGACGCGCGCGCAGGGTGCCGAGCAGGCCGAGACGCCCGAGGCAGTGTCGGCGCAGTGGCCGCTGCTGCGTTCGCTGCTGCGCAGGTTCATCGCGATTCCCAGCATCAGTTCGAGCGAAGAGCACCGCGAAGACTGCCGGCAGGCGGCGCACTTTCTCAAGACGTGCTTCCAAGAGCTCGGCGCCGAGGCGCGCATCCTACCCAATCCGGTGGGCACCAATCCGCTCGTGCTCGCCACGTTCAAGGCCAACGCCTACCGCTCGCGGCGGCGCAGGACGGCGGCGAGTGGCGCGAACGAACGCTCGCGCAGTGCATCCACCTCGGCGTCGGCATCGACCGCGTCGACGAGCTCGTCCGAATCGCACACCGTGGACAACGACGACGACGACGACGAGGACGCGCAGGGCCTGAGCGGGTCCATCATGTTTGACCACCTGGACGGGCGGGATGCTGCAGCGGATGCGGACGAGGCGAGGACACCGCGCGCACGACCGCAGAAGCGGTGTCTGTTCTACGGCCACTACGACTGCATCGCCGCCGAGGGCTCGTGGGCGTCGGAGCCGTTTACGCTCGACGGGCGCGACGGCTTCCTGTACGGCCGCGGTGTGTCGGACAACAAGGGCCCCATCCTGGCGGCGGCGTGTGCGGTGCATCGGCTGCTCTCGACGCGCCGGCTGCACTCGGACGTGGTGTTCCTGATCGAGGGCGAGGAGGAGAATGGCTCGGTGGGCTTCGTAGAGGCGGTGCGCAGGTTCAAGAGCGAGATCGGACCGATCGATGTGGTGCTGCTCTCCAACTCGTACTGGTTGGACGACGAGACGCCGTGCATCACGGTCGGGCTGCGCGGGGTTGTGCGCGCCACGGTGAGTGTGGGCAGTGGCGAACGCGATGTGCACTCGGGCGTCGAGGGCGGTGCGATCCGCGAACCGATGGTCGACATGGTCAAGCTGCTTGCTGCGCTCACTGCCGAAGGTGAGCGTGTCGCGCTGCCCGGATTCTACGATGCGGTGAGGCAGACGACCGAGGACGAGGTGCAGGCGTACCGCGATATCGTGCACATCAAACAGCACGCCGGTGCGCATGCGGATACCGTGGAATCGCTCATGGCCAAGTGGAGATACCCGTCGCTATCGGTGCACAACCTGCGCGTGTCGGGCCCGGGCAACTCGACGGTGATTCCGTCGAGCGTCGAGGCGCAAGTGTCGCTGCGCATCGTTCCGGACCAACAGCTGGCGCAGATCGAGGCGTCGCTGCGCGCCCACGTCGCATCGACGTTCGACGCGCTGTATGCAACGCCTGCATCGGCGGCGGGCCGCGTGGTGCGCAACAAGGTGTGCGTCACCGTAGACCACCGTGCCGACTGGTGGCTCGGCTCGGATGCGAGCGTGTACTTTGCGCTTCTGCGCGATGCGGTGCGCCACGAGTGGAAGGCGGAGCCCATCTCGATCCGCGAGGGCGGCAGTATCCCTGCGATTGCGATTCTGGAAAAGGAGCTCGGCGCGGCGGCAGTGCACTTGCCCATGGGCCAGAGCAGCGACAGCGCACACCTGCCCAACGAACGCCTCCGCCAGTCCAACCTGGTCAAGGGCCACAACGTCGTCATGCGCTTCATCGCCGGGCTCGCTCATGTGTAG-3'（配列番号１１）
5'-ATGTGCTCGCCCAACGTCCACTTTGAGCACCTTATCGGCTCGTCCAATCCATCGCCTGCATCGCCTGCATCGCCATCACAACCGTTCCGCAGCCTCTCGCACGCACGCATCGCCGGCGCATCATCCTGGCGCTCGAATAGCGACCAATCCGCATCGACAGCAGCGCCACTGAGCCACACCATCAACCACCACTCGTCCGTGCTCTCGCTCGCGGTCGATGAGCGTCGCAACCTGCTCTACTCGGGCTCCCAGGAGGGCTGCATCCACGTTTGGGACCTCGAGACATTCCAGCCAGCTGCGCGGCTACAAGGCCACACAGGGAGCGTGCTTGCGCTCGAGCTCGCTCCGGAGAAGCGCTGGCTCTTTAGCTCGTCCGGGGACAACACGATCCGCGTATGGAACACCGACACGAATTCGCCGCTCTTTGTGGTACATCCTGCCGAAGAGAACGTCGGCGACATCTTTGCACTCAAGTGGTGCGCCAGGCTCCAGACGCTGTACCTGGGATGCCAGTCCACCTCGATCCAGTGGATCTGCCTGGCGGGATTCGACAAGCAGCCCGGCCCGTCGAAGCGGCTCGACGCCAACGAGTTGCTCGCGCCGCATGCTGACGTGGGCACAGCACCAGTCGGCTTCAACCAGGCAGGCGCGGACAGTCCCATCATCTCGACGCCGGACATCGTCGCACGGCCGCACAGGTTCTTCGACTCGGTCCCCGTTGCGCTCAGCAGGTCCGGCCTCGGCAGCGCCGGAAGCTCGACTCCAGCACGTGTCCGACCACCGTCCTCGGCCCCTCTGAAATTCTCCAAGGCAACCGCTTCGACTGACGGACCGCTATCCACCGAGCTAGATTCGCATCTGAGCGACAAGGGGCCGCTGTCGACCACCCGCGCCACCGAAAAGGTTCTGCACGCCGCATCGCAACGCCTGGATAGCACGGCCGTGCGCGACGAGATGGCACGCGACGACTCGGGCGGATCGGTGCGCACGCTGCTCGTGCCGCCGAGCTCTGCAGTGCCCTCGGCGCACTTTGGCTACGTCTACTGCCTGGCGCTGCTGACGCTCGAGGGCGATGCGCAGCACCCGACCGTGCTCGCCTCGGGCTCGGGCGACGAGACCATCAAGCTGTGGCACGCCACGCGCGCCGGCCTCTCGCTGCTCGCCACGCTTGAAAGCCCAAATGCGGACGGCAACGCTGTGCTCGCGCTTGCCTCGTGGAAGACGACGCTCTTCGCCGGTCTGCAGGGCGGAGAGGTCGAGGTGTGGGATCTCGAGACGTGTACGCTCGTGCGCACCATCCGCGCGCACTCGGACGATGTCATCTGTCTAGAGACGTGTGCCGAGTCCGGCCTGCTGTTCACCGCGGGCGCGGATGGGAATGTGCACACGTGGGACCGGTCCTTTAGACGCATCAACAGGGTGCAGGCGCACAAAGGCATCGTGTTGTCCATGACCAAGGTGCGCACGCCTGCTAAAAGCGGCGAGGCAGCGAGGGTGGCACAGCTAGTCACGGGGTCCAGCGACAACTTTATCCGCATCTGGGACACGACCGCCTCGCCCGCACTGCCGTCATCGTCGCGCGAACCTGTAGCCGAACTGCGCCGCCGCGAGCTGGAGCATCTGTCGCTCGAAGAGCCCGCTATGCCCTCGCTCTCCTCGACGCCGATTGCCACGTCGTCTGCCGTCGTGACGCGCGCGCAGGGTGCCGAGCAGGCCGAGACGCCCGAGGCAGTGTCGGCGCAGTGGCCGCTGCTGCGTTCGCTGCTGCGCAGGTTCATCGCGATTCCCAGCATCAGTTCGAGCGAAGAGCACCGCGAAGACTGCCGGCAGGCGGCGCACTTTCTCAAGACGTGCTTCCAAGAGCTCGGCGCCGAGGCGCGCATCCTACCCAATCCGGTGGGCACCAATCCGCTCGTGCTCGCCACGTTCAAGGCCAACGCCTACCGCTCGCGGCGGCGCAGGACGGCGGCGAGTGGCGCGAACGAACGCTCGCGCAGTGCATCCACCTCGGCGTCGGCATCGACCGCGTCGACGAGCTCGTCCGAATCGCACACCGTGGACAACGACGACGACGACGACGAGGACGCGCAGGGCCTGAGCGGGTCCATCATGTTTGACCACCTGGACGGGCGGGATGCTGCAGCGGATGCGGACGAGGCGAGGACACCGCGCGCACGACCGCAGAAGCGGTGTCTGTTCTACGGCCACTACGACTGCATCGCCGCCGAGGGCTCGTGGGCGTCGGAGCCGTTTACGCTCGACGGGCGCGACGGCTTCCTGTACGGCCGCGGTGTGTCGGACAACAAGGGCCCCATCCTGGCGGCGGCGTGTGCGGTGCATCGGCTGCTCTCGACGCGCCGGCTGCACTCGGACGTGGTGTTCCTGATCGAGGGCGAGGAGGAGAATGGCTCGGTGGGCTTCGTAGAGGCGGTGCGCAGGTTCAAGAGCGAGATCGGACCGATCGATGTGGTGCTGCTCTCCAACTCGTACTGGTTGGACGACGAGACGCCGTGCATCACGGTCGGGCTGCGCGGGGTTGTGCGCGCCACGGTGAGTGTGGGCAGTGGCGAACGCGATGTGCACTCGGGCGTCGAGGGCGGTGCGATCCGCGAACCGATGGTCGACATGGTCAAGCTGCTTGCTGCGCTCACTGCCGAAGGTGAGCGTGTCGCGCTGCCCGGATTCTACGATGCGGTGAGGCAGACGACCGAGGACGAGGTGCAGGCGTACCGCGATATCGTGCACATCAAACAGCACGCCGGTGCGCATGCGGATACCGTGGAATCGCTCATGGCCAAGTGGAGATACCCGTCGCTATCGGTGCACAACCTGCGCGTGTCGGGCCCGGGCAACTCGACGGTGATTCCGTCGAGCGTCGAGGCGCAAGTGTCGCTGCGCATCGTTCCGGACCAACAGCTGGCGCAGATCGAGGCGTCGCTGCGCGCCCACGTCGCATCGACGTTCGACGCGCTGTATGCAACGCCTGCATCGGCGGCGGGCCGCGTGGTGCGCAACAAGGTGTGCGTCACCGTAGACCACCGTGCCGACTGGTGGCTCGGCTCGGATGCGAGCGTGTACTTTGCGCTTCTGCGCGATGCGGTGCGCCACGAGTGGAAGGCGGAGCCCATCTCGATCCGCGAGGGCGGCAGTATCCCTGCGATTGCGATTCTGGAAAAGGAGCTCGGCGCGGCGGCAGTGCACTTGCCCATGGGCCAGAGCAGCGACAGCGCACACCTGCCCAACGAACGCCTCCGCCAGTCCAACCTGGTCAAGGGCCACAACGTCGTCATGCGCTTCATCGCCGGGCTCGCTCATGTGTAG-3'（配列番号１１）
前記ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に導入される変異は、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制される限り特に制限されないが、例えば、前記遺伝子の少なくとも１つの塩基の欠失、前記遺伝子の少なくとも１つの塩基の置換、又は、前記遺伝子への少なくとも１つの塩基の挿入などであってもよい。ある態様では、本発明の酵母においては、前記遺伝子全体が欠失している。
別の態様では、本発明は、前記酵母を使用して、タンパク質を製造する方法にも関している。前記タンパク質としては、種々のタンパク質が採用され得るが、好ましくはＰａＥである。前記ＰａＥ以外のタンパク質を製造する場合には、製造するタンパク質の安定性向上に最適な変異対象遺伝子を選択してもよい。例えば、前記タンパク質がリパーゼＡである場合には、前記変異対象遺伝子は、ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６（配列番号５）及び／又はＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７（配列番号９）又はそのホモログ若しくはオルソログを含んでもよい。また、ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６（配列番号２）又はそのホモログ若しくはオルソログがコードするペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されると、タンパク質の分解が広く抑制されることから、様々なタンパク質の安定性を向上することができると期待される。
また別の態様では、本発明は、酵母を使用してタンパク質を製造する方法にも関しており、当該方法は、
前記酵母において、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ若しくはプロテアーゼ又はその遺伝子のホモログ若しくはオルソログがコードするペプチダーゼ若しくはプロテアーゼの活性を抑制する工程を含むことを特徴としている。このような抑制手段としては、当技術分野で通用使用される手段を特に制限されることなく採用することができるが、例えば、前記ペプチダーゼ若しくはプロテアーゼの遺伝子又はそのホモログ若しくはオルソログに変異を導入して活性を抑制してもいいし、前記ペプチダーゼ若しくはプロテアーゼ又はその遺伝子のホモログ若しくはオルソログがコードするペプチダーゼ若しくはプロテアーゼに対する抗体や阻害剤を使用して活性を抑制してもよい。また、ｐＨなどの培養、分離・精製、及び保管条件を制御することで活性を抑制してもよい。
前記酵母において、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ若しくはプロテアーゼ又はその遺伝子のホモログ若しくはオルソログがコードするペプチダーゼ若しくはプロテアーゼの活性を抑制する工程を含むことを特徴としている。このような抑制手段としては、当技術分野で通用使用される手段を特に制限されることなく採用することができるが、例えば、前記ペプチダーゼ若しくはプロテアーゼの遺伝子又はそのホモログ若しくはオルソログに変異を導入して活性を抑制してもいいし、前記ペプチダーゼ若しくはプロテアーゼ又はその遺伝子のホモログ若しくはオルソログがコードするペプチダーゼ若しくはプロテアーゼに対する抗体や阻害剤を使用して活性を抑制してもよい。また、ｐＨなどの培養、分離・精製、及び保管条件を制御することで活性を抑制してもよい。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕酵母の培養中に生じるＰａＥ分解物及び酵素活性の低下の確認
Ｐ．アンタクティカのＰａＥ高生産変異株であるＧＢ－４（０）－Ｘ１４株（要すれば非特許文献１を参照）を、キシロース存在下で常法により培養した。遠心分離によって組換え型ＰａＥを含む培養上清を回収し、室温で静置した。培養直後の培養上清及び冷蔵保存後の培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色した。また、培養直後の培養上清及び冷蔵保存後の培養上清のＰａＥ活性を測定した。
Ｐ．アンタクティカのＰａＥ高生産変異株であるＧＢ－４（０）－Ｘ１４株（要すれば非特許文献１を参照）を、キシロース存在下で常法により培養した。遠心分離によって組換え型ＰａＥを含む培養上清を回収し、室温で静置した。培養直後の培養上清及び冷蔵保存後の培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色した。また、培養直後の培養上清及び冷蔵保存後の培養上清のＰａＥ活性を測定した。
その結果、ＰａＥに由来するバンドの下に、ＰａＥ分解物に由来するバンドが確認され、培養後の日数が経過するにしたがって、ＰａＥ分解物のバンドが太くなった（図１）。また、以下の表１に示すように、培養後の日数が経過するにしたがって、培養上清のＰａＥ活性が低下することが確認された。なお、ＰａＥ活性の測定は、従来の方法に従って行った。すなわち２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に、吸光度（ＯＤ６６０）が約０．６５となるようにポリブチレンサクシネート－コ－アジペート（ＰＢＳＡ）のエマルジョンを懸濁した。その水懸濁液１．９ｍＬを口径１３ｍｍの試験管に入れ、上記培養上清を適宜希釈して１００μＬ加え、３０℃、１８０ｒｐｍで１５分間振とうし、水懸濁液の吸光度を測定した。酵素活性の単位として、１分間当たりに吸光度を１．０減少させる酵素量を１Ｕと定義した。
〔実施例２〕ＰａＥの分解に関与するペプチダーゼ又はプロテアーゼの候補遺伝子の探索
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株をキシロース存在下又はグルコース存在下で培養し、Ｐ．アンタクティカのトランスクリプトームを、Ｐ．アンタクティカのゲノム情報に基づいて作製したＤＮＡアレイで経時的に解析した。キシロース存在下で培養すると、培養初期にＰａＥ遺伝子が強く発現する。これに対して、グルコース存在下での培養時と比較してキシロース存在下での培養時に特徴的に発現する遺伝子であって、かつ培養後期に向けて発現量が増加する遺伝子を、ＰａＥの分解に関与する遺伝子の候補として選定した。
また、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノム情報から予測されるＰ．アンタクティカのゲノム中の推定プロテアーゼ遺伝子も、ＰａＥの分解に関与する遺伝子の候補として選定した。
そして、培養上清のプロテオーム解析を行い、グルコース存在下での培養時と比較してキシロース存在下での培養時に特徴的に産生されるタンパク質であって、かつ培養後期に向けて産生量が増加するタンパク質をコードする遺伝子を、ＰａＥの分解に関与する遺伝子の候補として選定した。
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株をキシロース存在下又はグルコース存在下で培養し、Ｐ．アンタクティカのトランスクリプトームを、Ｐ．アンタクティカのゲノム情報に基づいて作製したＤＮＡアレイで経時的に解析した。キシロース存在下で培養すると、培養初期にＰａＥ遺伝子が強く発現する。これに対して、グルコース存在下での培養時と比較してキシロース存在下での培養時に特徴的に発現する遺伝子であって、かつ培養後期に向けて発現量が増加する遺伝子を、ＰａＥの分解に関与する遺伝子の候補として選定した。
また、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノム情報から予測されるＰ．アンタクティカのゲノム中の推定プロテアーゼ遺伝子も、ＰａＥの分解に関与する遺伝子の候補として選定した。
そして、培養上清のプロテオーム解析を行い、グルコース存在下での培養時と比較してキシロース存在下での培養時に特徴的に産生されるタンパク質であって、かつ培養後期に向けて産生量が増加するタンパク質をコードする遺伝子を、ＰａＥの分解に関与する遺伝子の候補として選定した。
以下の表２に、トランスクリプトーム解析、推定プロテアーゼ遺伝子探索、及びプロテオーム解析によって選定されたＰａＥの分解に関与するペプチダーゼ又はプロテアーゼの候補遺伝子を示す。
〔実施例３〕ＰａＥ分解物に対する候補遺伝子破壊の影響
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株において、表２に記載の遺伝子のいずれかを常法により破壊した。簡単に説明すると、ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性遺伝子を薬剤耐性マーカーとして、これを標的遺伝子の間に挿入した遺伝子破壊断片を作製し、当該遺伝子破壊断片を相同組換えによって細胞に導入することで遺伝子破壊株を作製した。遺伝子が破壊できたかどうかはコロニーＰＣＲで確認した。
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株において、表２に記載の遺伝子のいずれかを常法により破壊した。簡単に説明すると、ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性遺伝子を薬剤耐性マーカーとして、これを標的遺伝子の間に挿入した遺伝子破壊断片を作製し、当該遺伝子破壊断片を相同組換えによって細胞に導入することで遺伝子破壊株を作製した。遺伝子が破壊できたかどうかはコロニーＰＣＲで確認した。
作製した各遺伝子破壊株を、キシロース含有培地を含む３００ｍＬ三角フラスコ中で５日間培養（３０℃、２００ｒｐｍ）した。各培養液から遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分間）により菌体を除去して培養上清を取得し、これを２５℃で８日間静置した。各培養上清中のＰａＥ及びその分解物を、ウェスタンブロット法により解析した。ウェスタンブロット法では、抗ＰａＥポリクローナル抗体及びＨＲＰ－抗ウサギＩｇＧ抗体を使用し、ＥＣＬプライム（ＧＥヘルスケア社製）を用いた化学発光により、メンブレン上に転写したＰａＥ及びその分解物を検出した（露光時間６０分）。対照として、野生型のＰ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の培養上清（ＷＴ）及び粗精製したＰａＥを使用した。
２～４回行った実験の代表的な結果を図２に示し、ＰａＥ分解物に由来するシグナルの強さを以下の表３にまとめる。
＋＋＋＋：毎回の実験で野生型よりも強いシグナルを検出
＋＋＋：半数回以上の実験で野生型よりも強いシグナルを検出し、他の実験では同程度あるいは弱いシグナルを検出
＋＋：半数回以上の実験で野生型と同程度のシグナルを検出したが他の実験では弱いシグナルを検出
＋：毎回の実験で弱いシグナルを検出
－：毎回の実験で検出されるシグナルなし
＋＋＋：半数回以上の実験で野生型よりも強いシグナルを検出し、他の実験では同程度あるいは弱いシグナルを検出
＋＋：半数回以上の実験で野生型と同程度のシグナルを検出したが他の実験では弱いシグナルを検出
＋：毎回の実験で弱いシグナルを検出
－：毎回の実験で検出されるシグナルなし
各遺伝子破壊株はＰａＥを産生し、それを培養上清中に分泌した。候補遺伝子３又は１０の破壊株では、ＰａＥ分解物に由来するシグナルが、野生型と同等かそれ以上に強く観察された。一方、候補遺伝子１、２、４～９、又は１１～１３の破壊株では、ＰａＥ分解物に由来するシグナルが、野生型と比較して低下し、特に候補遺伝子１の破壊株及び候補遺伝子９の破壊株では、ＰａＥ分解物に由来するシグナルがほとんど確認されなかった。したがって、候補遺伝子１、２、４～９、又は１１～１３は、ＰａＥの分解に関与していることがわかったので、これらの遺伝子破壊株は、ＰａＥの生産に有用である。なお、遺伝子１２の破壊株については、今回の培養条件では増殖に異常が見られたが、培養条件の最適化は行わず、以降の実験では使用しなかった。
〔実施例４〕ＰｒｏＡ遺伝子の相補実験
野生型のＰ．アンタクティカＧＢ－４（０）株又は候補遺伝子１（ＰｒｏＡ遺伝子）の破壊株（ΔＰｒｏＡ）に、ＰｒｏＡ遺伝子を含む相補用遺伝子断片（ｐＵＸＶ１－ｎｅｏ：：ＰｒｏＡ）又は対照遺伝子断片（ｐＵＸＶ１－ｎｅｏ）を導入して、形質転換体を作製した。これらの形質転換体を使用して実施例３に記載の方法で培養上清を調製した。各培養上清及び遠心分離前の菌体を含む培養液を２５℃で７日間静置した後、ウェスタンブロット法でＰａＥ分解物を検出した。その結果を図３に示す。
野生型のＰ．アンタクティカＧＢ－４（０）株又は候補遺伝子１（ＰｒｏＡ遺伝子）の破壊株（ΔＰｒｏＡ）に、ＰｒｏＡ遺伝子を含む相補用遺伝子断片（ｐＵＸＶ１－ｎｅｏ：：ＰｒｏＡ）又は対照遺伝子断片（ｐＵＸＶ１－ｎｅｏ）を導入して、形質転換体を作製した。これらの形質転換体を使用して実施例３に記載の方法で培養上清を調製した。各培養上清及び遠心分離前の菌体を含む培養液を２５℃で７日間静置した後、ウェスタンブロット法でＰａＥ分解物を検出した。その結果を図３に示す。
ＰｒｏＡ遺伝子破壊株（ΔＰｒｏＡ）に対照遺伝子断片を導入した形質転換体の培養上清では、ＰａＥ分解物に由来するシグナルがほとんど確認されなかったが、ＰｒｏＡ遺伝子を含む相補用遺伝子断片を導入した形質転換体の培養上清では、ＰａＥ分解物に由来するシグナルが増加した。また、野生型の菌株にＰｒｏＡ遺伝子を含む相補用遺伝子断片を導入した形質転換体の培養上清でも、対照用遺伝子断片を導入した形質転換体の培養上清と比較して、ＰａＥ分解物に由来するシグナルが増加した。したがって、ＰｒｏＡ遺伝子の破壊によるＰａＥ分解物の減少は、ＰｒｏＡ遺伝子の導入により相補されることが確認された。
〔実施例５〕ジャー培養での遺伝子破壊の影響
培養条件が異なると発現する遺伝子のプロファイルも変化し得るので、ＰａＥ分解物に対する遺伝子破壊の影響を、実施例３のようなフラスコでの培養よりもスケールの大きいジャー培養においても確認した。具体的には、候補遺伝子１（ＰｒｏＡ遺伝子）又は候補遺伝子９（ＰｒｏＢ遺伝子）の破壊株を、キシロース含有培地を含む５Ｌ容ジャーファーメンターで３日間培養（２０℃、４２３ｒｐｍ）した。各培養上清中のＰａＥ及びその分解物を、ウェスタンブロット法により解析した。その結果を図４に示す。
培養条件が異なると発現する遺伝子のプロファイルも変化し得るので、ＰａＥ分解物に対する遺伝子破壊の影響を、実施例３のようなフラスコでの培養よりもスケールの大きいジャー培養においても確認した。具体的には、候補遺伝子１（ＰｒｏＡ遺伝子）又は候補遺伝子９（ＰｒｏＢ遺伝子）の破壊株を、キシロース含有培地を含む５Ｌ容ジャーファーメンターで３日間培養（２０℃、４２３ｒｐｍ）した。各培養上清中のＰａＥ及びその分解物を、ウェスタンブロット法により解析した。その結果を図４に示す。
ジャー培養によりＰａＥを生産した場合であっても、ＰａＥ分解物に由来するシグナルは、野生型の菌株の培養上清と比較して、ＰｒｏＡ遺伝子破壊株及びＰｒｏＢ遺伝子破壊株のいずれの培養上清においても減少していた。一方、ＰｒｏＡ遺伝子破壊株の培養上清とＰｒｏＢ遺伝子破壊株の培養上清とを比較すると、後者の培養上清の方が、前者の培養上清よりもＰａＥ分解物に由来するシグナルは少なく、全く検出されなかった。したがって、ＰａＥを大規模に製造する場合には、ＰｒｏＢ遺伝子破壊株が特に有用である可能性が示唆された。
〔実施例６〕各遺伝子破壊株のリパーゼ活性
Ｐ．アンタクティカの培養上清中には、リパーゼＡが含まれていることが知られている。ＰａＥの分解を指標にして選択した遺伝子の破壊株が、このリパーゼＡの活性に影響を及ぼすかどうか確認した。具体的には、実施例３の方法に従って作製した各遺伝子破壊株の培養上清を使い、リパーゼキットＳ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）で、リパーゼ活性を測定した。その結果を図５に示す。
Ｐ．アンタクティカの培養上清中には、リパーゼＡが含まれていることが知られている。ＰａＥの分解を指標にして選択した遺伝子の破壊株が、このリパーゼＡの活性に影響を及ぼすかどうか確認した。具体的には、実施例３の方法に従って作製した各遺伝子破壊株の培養上清を使い、リパーゼキットＳ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）で、リパーゼ活性を測定した。その結果を図５に示す。
野生型の菌株の培養上清と比較して、候補遺伝子２～４、６、８～１１、又は１３の破壊株の培養上清では、リパーゼ活性が向上していた。候補遺伝子６又は１１の破壊株ではリパーゼ活性が特に高かった。したがって、これらの遺伝子破壊株では、リパーゼＡの分解が抑制されていることが示唆された。
〔実施例７〕各遺伝子破壊株の培養上清のゼラチン分解活性
ゼラチン分解活性は、一般的なプロテアーゼ活性の指標として考えられているため、ゼラチン分解活性が低ければ、種々のタンパク質を安定して生産するために有利であると考えられる。ＰａＥの分解を指標にして選択した遺伝子の破壊株が、他のタンパク質の生産にも有用であるかどうか評価するために、代表例として、候補遺伝子１～７の破壊株の培養上清のゼラチン分解活性を確認した。具体的には、実施例３の方法に従って作製した各遺伝子破壊株の培養上清を、サンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、０．００２％ ＢＰＢ）と混合し、０．１％ゼラチンを含むゲルに供し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。そして、泳動後のゲルを２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理した後、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに浸漬した。これを３７℃で１６時間インキュベートした後、ＣＢＢで染色した。その結果を図６に示す。
ゼラチン分解活性は、一般的なプロテアーゼ活性の指標として考えられているため、ゼラチン分解活性が低ければ、種々のタンパク質を安定して生産するために有利であると考えられる。ＰａＥの分解を指標にして選択した遺伝子の破壊株が、他のタンパク質の生産にも有用であるかどうか評価するために、代表例として、候補遺伝子１～７の破壊株の培養上清のゼラチン分解活性を確認した。具体的には、実施例３の方法に従って作製した各遺伝子破壊株の培養上清を、サンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、０．００２％ ＢＰＢ）と混合し、０．１％ゼラチンを含むゲルに供し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。そして、泳動後のゲルを２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理した後、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに浸漬した。これを３７℃で１６時間インキュベートした後、ＣＢＢで染色した。その結果を図６に示す。
ゲル中のゼラチンが分解されると、その部分はＣＢＢで染色されないため、ゲルが白く抜けたように見えるが、候補遺伝子２の破壊株の培養上清では、ゼラチンが分解されずゲルが白くならなかった。すなわち、これらの遺伝子破壊の培養上清では、プロテアーゼの活性が一般的に抑制されていた。ゼラチンゲルのｐＨを５．２又は９．８に調整した場合でも、同様の結果が得られた。したがって、ＰａＥの分解を指標にして選択した遺伝子の破壊株が、他のタンパク質の生産にも有用であることが示唆された。
以上より、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異を導入することによりそのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制した変異酵母を使用すれば、培養液中におけるＰａＥの分解を抑制することができるだけなく、意外なことに、他のタンパク質の分解も抑制することができることがわかった。したがって、効率的なタンパク質の生産が可能となる。
〔実施例８〕培養中のＰａＥの安定性
Ｐ．アンタクティカＧＢ４（０）株に由来するキシラナーゼプロモーター及びＰａＥ遺伝子並びにマーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子を含む発現用カセットを、野生型のＰ．アンタクティカＧＢ４（０）株に導入して作製したＰａＥ高生産変異株（ＸＧ８株）又はそのＰｒｏＢ遺伝子破壊株（ΔｐｒｏＢ株）を、キシロース存在下で常法により３Ｌ容ジャーファーメンターで培養した。培養開始２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に各培養液を採取して、その乾燥菌体重量を測定した。また、以降のＰａＥ活性測定方法は次のように行った。すなわち２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３ ± ０．１）に、吸光度（ＯＤ660）が約０．５５となるようにＰＢＳＡのエマルジョンを懸濁した。その水懸濁液１．９９５ｍＬを口径１０ｍｍの試験管に入れ、上記培養上清を適宜希釈して５μＬ加え、３０℃、１５０ｒｐｍで１５分間振とうし、水懸濁液の吸光度を測定した。酵素活性の単位として、１分間当たりに吸光度を１．０減少させる酵素量を１Ｕと定義した。そして、各培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをＣＢＢにより染色した。
Ｐ．アンタクティカＧＢ４（０）株に由来するキシラナーゼプロモーター及びＰａＥ遺伝子並びにマーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子を含む発現用カセットを、野生型のＰ．アンタクティカＧＢ４（０）株に導入して作製したＰａＥ高生産変異株（ＸＧ８株）又はそのＰｒｏＢ遺伝子破壊株（ΔｐｒｏＢ株）を、キシロース存在下で常法により３Ｌ容ジャーファーメンターで培養した。培養開始２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に各培養液を採取して、その乾燥菌体重量を測定した。また、以降のＰａＥ活性測定方法は次のように行った。すなわち２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３ ± ０．１）に、吸光度（ＯＤ660）が約０．５５となるようにＰＢＳＡのエマルジョンを懸濁した。その水懸濁液１．９９５ｍＬを口径１０ｍｍの試験管に入れ、上記培養上清を適宜希釈して５μＬ加え、３０℃、１５０ｒｐｍで１５分間振とうし、水懸濁液の吸光度を測定した。酵素活性の単位として、１分間当たりに吸光度を１．０減少させる酵素量を１Ｕと定義した。そして、各培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをＣＢＢにより染色した。
その結果、乾燥菌体重量に関しては、ＸＧ８株とΔｐｒｏＢ株との間に差はなかったが、ＰａＥ活性は、ΔｐｒｏＢ株の培養上清の方が大きかった（図７）。このことは、ＣＢＢ染色の結果と一致していた。すなわち、ＸＧ８株の培養上清では、ＰａＥに由来するバンドの下に、ＰａＥ分解物に由来するバンドが確認され、培養後の日数が経過するにつれて、ＰａＥ分解物のバンドが太くなっていたが、ΔｐｒｏＢ株の培養上清では、ＰａＥ分解物はほとんど確認されなかった（図８）。
〔実施例９〕菌体懸濁液中でのＰａＥの安定性
酵素を工業的に大容量で（例えば３００Ｌタンクで）製造する場合には、培養終了後、すべての培養液を遠心ろ過するまでに１日以上を要することがある。その間、培養液は２４時間以上菌体が入ったまま放置されることになるが、その際に溶菌が進み、培養上清中のＰａＥがプロテアーゼによって分解されてしまう危険がある。そこで、ＰｒｏＢ遺伝子の破壊が、培養終了後のＰａＥの維持に有効であるかどうか検討した。具体的には、ＸＧ８株又はΔｐｒｏＢ株を、実施例８と同様の方法で７２時間培養し、各培養液を低付着性マイクロチューブに１ｍＬずつ分注した。これらのチューブを、分注直後（０時間静置）又は２５℃で４、８、１２、２４、３６、又は４８時間静置後に、転倒混和して、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。回収した培養上清はすぐに－３０℃で保管し、残った菌体は、１０５℃で６時間乾燥させた後に、その重量（乾燥菌体重量）を測定した。また、各培養上清のＰａＥ活性を、実施例８に記載の方法で測定し、分注直後の培養上清のＰａＥ活性を基準とした残存活性（％）を求めた。そして、各培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをＣＢＢにより染色した。
酵素を工業的に大容量で（例えば３００Ｌタンクで）製造する場合には、培養終了後、すべての培養液を遠心ろ過するまでに１日以上を要することがある。その間、培養液は２４時間以上菌体が入ったまま放置されることになるが、その際に溶菌が進み、培養上清中のＰａＥがプロテアーゼによって分解されてしまう危険がある。そこで、ＰｒｏＢ遺伝子の破壊が、培養終了後のＰａＥの維持に有効であるかどうか検討した。具体的には、ＸＧ８株又はΔｐｒｏＢ株を、実施例８と同様の方法で７２時間培養し、各培養液を低付着性マイクロチューブに１ｍＬずつ分注した。これらのチューブを、分注直後（０時間静置）又は２５℃で４、８、１２、２４、３６、又は４８時間静置後に、転倒混和して、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。回収した培養上清はすぐに－３０℃で保管し、残った菌体は、１０５℃で６時間乾燥させた後に、その重量（乾燥菌体重量）を測定した。また、各培養上清のＰａＥ活性を、実施例８に記載の方法で測定し、分注直後の培養上清のＰａＥ活性を基準とした残存活性（％）を求めた。そして、各培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをＣＢＢにより染色した。
その結果、ＸＧ８株及びΔｐｒｏＢ株のどちらでも乾燥菌体重量が減少しており、静置中に溶菌が起こっていることが確認された。一方、ＸＧ８株の培養上清においては、静置時間が経過するにつれてＰａＥ活性が低下し、４８時間後には５５．１％にまで減少していたのに対して、ΔｐｒｏＢ株の培養上清においては、ＰａＥ活性の低下はほとんど起こっていなかった（図９）。このことは、ＣＢＢ染色の結果と一致していた。すなわち、ＸＧ８株の培養上清では、ＰａＥに由来するバンドの下に、ＰａＥ分解物に由来するバンドが確認され、静置時間が経過するにつれて、ＰａＥ分解物のバンドが太くなっていたが、ΔｐｒｏＢ株の培養上清では、ＰａＥ分解物はほとんど確認されなかった（図１０）。
〔実施例１０〕培養ろ液中でのＰａＥの安定性
ＸＧ８株又はΔｐｒｏＢ株を、実施例８と同様の方法で７２時間培養し、培養直後の培養液７００ｍＬを、それぞれ８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。また、各培養液７００ｍＬを、５００ｍＬ容三角フラスコ２本に移して２５℃で２４時間静置した後に、それぞれ８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。回収した各培養上清を０．４５μｍ孔ステリカップでフィルターろ過し、それぞれ１８ｍＬずつを２０ｍＬ容のバイアル瓶３本に分注した。これらのバイアル瓶から、分注直後（０時間静置）又は２５℃で１、３、５、７、１１、又は１４日静置後に、１ｍＬずつサンプリングした。各培養上清のＰａＥ活性を、実施例８に記載の方法で測定し、分注直後の培養上清のＰａＥ活性を基準とした残存活性（％）を求めた。そして、各培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをＣＢＢにより染色した。
ＸＧ８株又はΔｐｒｏＢ株を、実施例８と同様の方法で７２時間培養し、培養直後の培養液７００ｍＬを、それぞれ８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。また、各培養液７００ｍＬを、５００ｍＬ容三角フラスコ２本に移して２５℃で２４時間静置した後に、それぞれ８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。回収した各培養上清を０．４５μｍ孔ステリカップでフィルターろ過し、それぞれ１８ｍＬずつを２０ｍＬ容のバイアル瓶３本に分注した。これらのバイアル瓶から、分注直後（０時間静置）又は２５℃で１、３、５、７、１１、又は１４日静置後に、１ｍＬずつサンプリングした。各培養上清のＰａＥ活性を、実施例８に記載の方法で測定し、分注直後の培養上清のＰａＥ活性を基準とした残存活性（％）を求めた。そして、各培養上清をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、当該ゲルをＣＢＢにより染色した。
その結果、ＸＧ８株及びΔｐｒｏＢ株のどちらにおいても、培養直後に回収した培養上清のＰａＥ活性は、その後の静置期間中に少なくとも８０％は維持されていたが、培養２４時間後に回収したＸＧ８株の培養上清においては、静置時間が経過するにつれてＰａＥ活性が低下し、１４日後には約３０％程度にまで減少していた（図１１）。これは、培養が終了してから培養上清を回収するまでの間に溶菌した菌体からＰａＥを分解するペプチダーゼ又はプロテアーゼが放出され、培養上清中のＰａＥを分解したものと考えられる。一方、ΔｐｒｏＢ株の培養上清においては、ＰａＥ活性の低下がほとんど起こっていなかった（図１１）。これらのことは、ＣＢＢ染色の結果と一致していた。すなわち、ＸＧ８株の培養上清では、ＰａＥに由来するバンドの下に、ＰａＥ分解物に由来するバンドが確認され、静置時間が経過するにつれて、ＰａＥ分解物のバンドが太くなっていたが、ΔｐｒｏＢ株の培養上清では、ＰａＥ分解物はほとんど確認されなかった（図１２）。
実施例８～１０の試験結果によれば、ＰｒｏＢ遺伝子の破壊は、培養中のＰａＥの分解の抑制だけでなく、培養後の溶菌に伴うＰａＥの分解の抑制にも有効であった。したがって、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異を導入することによりそのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制した変異酵母を使用すれば、作業に時間を要する大容量での工業的製造においても、効率的なタンパク質の生産が可能となる。
Claims (10)
- シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）が産生するエステラーゼ（ＰａＥ）の分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの遺伝子に変異が導入されることにより、そのペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性が抑制されている、酵母。
- 前記遺伝子の少なくとも１つの塩基が欠失している若しくは他の塩基で置換されているか、又は、前記遺伝子に少なくとも１つの塩基が挿入されている、請求項１に記載の酵母。
- 前記遺伝子全体が欠失している、請求項１又は２に記載の酵母。
- 前記ペプチダーゼ又はプロテアーゼが、ＰＡＮ１＿０１６ｆ０５３３０（配列番号１）、ＰＡＮ１＿００４ｒ０２２６６（配列番号２）、ＰＡＮ１＿００３ｒ０１８５６（配列番号３）、ＰＡＮ１＿００３ｒ０１６６８（配列番号４）、ＰＡＮ１＿００１ｆ００８４６（配列番号５）、ＰＡＮ１＿０１９ｆ０５８４５（配列番号６）、ＰＡＮ１＿０２４ｆ０６６８５（配列番号７）、ＰＡＮ１＿０１２ｒ０４５６４（配列番号８）、ＰＡＮ１＿０１０ｒ０４２２７（配列番号９）、ＰＡＮ１＿０１３ｒ０４７７９（配列番号１０）、及び、ＰＡＮ１＿０２３ｒ０６５６３（配列番号１１）からなる群から選択されるシュードザイマ・アンタクティカの遺伝子又はそのホモログ若しくはオルソログにコードされている酵素を１種以上含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の酵母。
- シュードザイマ属の酵母である、請求項１～４のいずれか一項に記載の酵母。
- 前記ＰａＥを産生する、請求項１～５のいずれか一項に記載の酵母。
- 組換えタンパク質を産生する、請求項１～６のいずれか一項に記載の酵母。
- 請求項１～７のいずれか一項に記載の酵母を使用して、タンパク質を製造する方法。
- 前記タンパク質がＰａＥである、請求項８に記載の方法。
- 酵母を使用してタンパク質を製造する方法であって、
前記酵母において、ＰａＥの分解に関与する少なくとも１種のペプチダーゼ又はプロテアーゼの活性を抑制する工程を含むことを特徴とする、方法。
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Non-Patent Citations (7)
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| ZHANG, YEWANG ET AL.: "The proteolytic systems and heterologous proteins degradation in the methylotrophic yeast Pichia pastoris", ANNALS OF MICROBIOLOGY, vol. 57, no. 4, 2007, pages 553 - 560, XP055080203 * |
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