WO2020091032A1 - 大腸がんの検査方法 - Google Patents

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WO2020091032A1
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colorectal cancer
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advanced
test
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原　英二
聡 長山
真 吉本
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公益財団法人がん研究会
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining colorectal cancer.
  • the present invention relates to a method for detecting whether a subject has colorectal cancer by performing a metasequence analysis on the sequence of the 16S rRNA gene of bacteria in the feces of the subject.
  • cancer According to statistics from the Ministry of Health, Labor and Welfare, cancer is the leading cause of death among Japanese for both men and women. Since the number of cancer cases and deaths in Japan is increasing with the aging of the population, it is expected that the number of cancer cases will increase in the future. By organ, although the number of morbidity is increasing, such as gastric cancer, prostate cancer, and breast cancer, the number of deaths is flat or slightly increased. On the other hand, some cancers, such as colorectal cancer, have both increased morbidity and mortality. Colorectal cancer is the top cause of cancer death among women and the third highest among men, according to the cancer-specific statistics of the Japan Cancer Society, and approximately 50,000 men and women annually suffer from colorectal cancer. He has died (2015 statistics).
  • colorectal cancer screening is generally performed by a fecal occult blood test.
  • the fecal occult blood test is a test that detects blood because cancer or polyps may bleed into the large intestine. Even if there is no symptom, it can be detected if there is bleeding from colorectal cancer or polyp, and it is a non-invasive method of examining feces. It is a test widely performed in Japan.
  • Fecal occult blood tests can be broadly divided into two types: test methods such as the chemical methods such as the orthotolidine method and Gayak method, and immunoassay methods using antibodies. Since the chemical method also reacts with hemoglobin such as meat and fish, it is necessary to restrict the diet from 2 to 3 days before.
  • the immunization method is a test performed using an antibody specific to human hemoglobin in stool.Since there is no restriction on diet and medication and the burden on the examinee is small, the examination is usually performed by the immunization method. ing. However, in any fecal occult blood test, if no bleeding occurs, it becomes negative and cannot be detected.
  • Non-Patent Document 1 the sensitivity of the fecal occult blood test by the immunological method varies depending on the number of tests (one-day method, two-day method, three-day method), but in Japan the sensitivity is 55.6-99.2%, and overseas it is 30-87. % (Non-Patent Document 1).
  • S-shaped colonoscopy and total colonoscopy which use an endoscope, are highly sensitive tests.
  • whole colonoscopy is extremely sensitive because it is an endoscopy of the entire large intestine.
  • pre-treatment, pre-medication, examination, and the burden on the patient are heavy, and rarely there is bleeding or perforation caused by inserting the camera into the large intestine, so it is highly sensitive but recommended for the primary screening of group screening. It has not been. Therefore, the present condition is that the endoscopic examination is performed for individual examination or for those who have symptoms.
  • Non-Patent Document 3 is a review and summarizes the bacterial species that increase / decrease in correlation with colon cancer that has been reported so far.
  • these bacteria are bacteria that can cause colorectal cancer or can suppress the development of colorectal cancer, and colorectal cancer cannot be detected with high sensitivity by detecting these bacteria.
  • Non-Patent Document 4 discloses an optimal algorithm for analyzing the intestinal bacterial flora of a patient as a method for diagnosing colorectal cancer.
  • Patent Document 1 discloses a method for examining colorectal cancer and adenomatous polyps by measuring 16S rRNA of one or more kinds of bacteria by quantitative PCR.
  • Patent Document 1 has an AUC of about 0.7, and cannot be said to be a highly sensitive test. Also, quantification of all four disclosed bacterial sequences does not result in increased sensitivity, as they are independent tests.
  • Non-Patent Document 4 discloses that colorectal cancer can be tested with high sensitivity by using a specific algorithm.
  • the number of samples used for analysis is small, and there is a high possibility of overfitting.
  • the possibility that a high AUC is obtained cannot be denied, and the reliability of the data is poor.
  • Non-Patent Document 4 does not analyze early cancer and advanced cancer separately.
  • the group of the present inventors separately analyzed early cancer and advanced cancer it was revealed that the intestinal microbiota was significantly different between early cancer and advanced cancer. Colorectal cancer is often found only after it has become advanced. Therefore, the group used for analysis is a group containing many advanced cancers. It is not possible to detect early-stage cancer patients based on the analysis results obtained using a group that includes many patients with advanced cancer. In order to detect early stage colon cancer, it is necessary to analyze based on samples obtained from patients with early stage cancer.
  • An object of the present invention is to provide a method for examining colorectal cancer with high sensitivity even though it is a non-invasive examination.
  • the present invention relates to a method for examining colorectal cancer with good sensitivity and specificity using a stool sample. In particular, it relates to a method for detecting early stage colon cancer.
  • a method for examining colorectal cancer which comprehensively analyzes the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene of the bacterial flora collected from a subject to obtain a data group of the obtained base sequence in advance.
  • a test method that detects colorectal cancer by analyzing it using a diagnostic algorithm.
  • the diagnostic algorithm is a diagnostic algorithm obtained by distinguishing a nucleotide sequence data group of 16S ribosomal RNA gene obtained from an advanced colorectal cancer patient or an early colorectal cancer patient, The test method according to (1), wherein the early colorectal cancer is distinguished and analyzed.
  • the diagnostic algorithm is a diagnostic algorithm created by integrating the features of the base sequence and the appearance frequencies of the results obtained by a plurality of machine learning algorithms (1), or (2) ) Described inspection method.
  • the data group of the nucleotide sequence is analyzed by a diagnostic algorithm for diseases other than colorectal cancer, and diagnosis is performed in combination with colorectal cancer (1) to (3) Inspection method.
  • FIG. 1A shows the analysis result of the Traning set
  • Fig. 1B shows the analysis result of the Test set.
  • the ROC curve by the diagnostic algorithm of advanced colorectal cancer is shown.
  • Fig. 2A shows the analysis result of the Training set
  • Fig. 2B shows the analysis result of the Test set.
  • the ROC curve by the diagnosis algorithm of early stage colon cancer is shown.
  • FIG. 3A shows the analysis result of the Training set
  • FIG. 3B shows the analysis result of the Test set.
  • FIG. 4A shows a box and whisker plot of the distribution of early cancer prediction values in the Test group of the early colorectal cancer diagnosis algorithm.
  • FIG. 4B is a box and whisker plot of the distribution of predicted values when the Test group is divided by the depth of invasion.
  • the method of the present invention is a method of comprehensively determining the base sequence of the target intestinal bacterium and analyzing the disease risk based on that information. Therefore, if a disease and a disease in which changes in the intestinal microbiota have been clarified, not only can the same test be performed, but analysis based on the same data can also be performed to obtain test results for different diseases. You can That is, although it is a non-invasive method and a single test, a plurality of diseases can be tested at the same time.
  • Example 1 Diagnostic algorithm for all colorectal cancer In the case of colorectal cancer, many patients do not have subjective symptoms even if they have advanced cancer. Further, in the examination at the time of physical examination, there is no distinction between early cancer and advanced cancer, so analysis of cancer patients including early cancer and advanced cancer was performed.
  • the histopathological diagnosis (patientological staging) of the specimen is performed, and it is judged by the depth of invasion, and the Tis or T1 (the cancer remains in the mucosal layer, which does not reach the basement membrane, T2 to T4b (cancer invades the submuscular layer, where the cancer has invaded the submucosal layer, or the cancer has invaded the submucosal layer but does not reach the muscular layer) It is analyzed as advanced cancer from the state where it is in progress to the state where it directly invades other organs.). Endoscopic resection of early cancer is possible in treatment, whereas laparoscopic surgery or open surgery is required for advanced cancer. In addition, in cases of advanced cancer undergoing preoperative chemotherapy or radiochemotherapy, preoperative test data (endoscopic examination, CT test, rectal cancer plus MRI examination) Based on the results of 2), two doctors are doing clinical staging.
  • Stool samples were collected in a stool collection container (Techno Suruga Lab Co., Ltd.). DNA was extracted from stool samples obtained from colorectal cancer patients and healthy subjects by the following method.
  • the stool test sample was prepared by adding zirconia beads (0.1 mm, Yasui Kikai Co., Ltd.), heating the mixture at 85 ° C. for 15 minutes, and then crushing it using a cell disrupter (Yasui Kikai Co., Ltd., Multishocker).
  • the fecal disruption solution was purified using QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen Co., Ltd.).
  • the purified DNA was stored at -20 ° C after measuring the absorbance at 260 nm and 280 nm. The quality of the obtained DNA was confirmed by PCR amplification of 16S rRNA.
  • DNA samples obtained from colorectal cancer patients and healthy subjects were subjected to metasequence analysis of the intestinal bacterial 16s rRNA gene sequence.
  • a sequence common to the 16S rRNA was set as a PCR primer so that the sequence including the V1V2 region, which is a region specific to the species or group, can be analyzed, and PCR amplification was performed in a batch
  • the gene sequences of variable regions that differed among the species present in the sequence were analyzed.
  • a PCR primer that amplifies the V1 and V2 regions, which are the variable regions of 16S rRNA, is set to create a library by PCR, but the present invention is not limited to this, and it is possible to comprehensively analyze the intestinal flora.
  • the primer may be set in any region for analysis.
  • any method may be used as the sequence method. For example, it goes without saying that analysis can be performed using a method using a nanopore sequencer or a new sequencing method that will be developed in the future.
  • the V1-V2 region library was amplified by using the DNAs extracted from stool samples as the 1st PCR and using the primers shown in SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • the PCR reaction was checked by electrophoresis.
  • the 2nd PCR was amplified by combining the Forward primer of SEQ ID NOS: 3 to 10 and the Reverse primer of SEQ ID NOs: 11 to 22, respectively, for a total of 96 combinations.
  • the 2nd PCR reaction was confirmed by electrophoresis, in which the library of the V1 to V2 regions was PCR amplified using the primers of SEQ ID NOs: 23 and 24.
  • n is a, c, g, or t.
  • the DNA sequence was determined by MiSeq using MiSeq Reagent Kit V2 500 cycles.
  • PhiX Control v3 all above, Illumina Corporation was used.
  • the sequence obtained from each sample was analyzed using QIIME2.
  • the sequence error is automatically judged by QIIME2, and the one with 100% sequence read match is analyzed as the same Feature, so the result is very stable and the existence ratio in each sample is accurate.
  • the sequence reads that are 100% matched are the same Feature, the same bacterial species is assigned to a plurality of Features.
  • the analysis by Feature is more suitable for creating a diagnostic model than the analysis using OTU that clusters by sequence similarity.
  • H2O Open source machine learning analysis platform
  • Analysis was performed using ai.
  • ai is a platform that makes it possible to build better models by performing both machine learning and deep learning.
  • a generalized linear model Distributed Random Forest, Extremery Randomized Trees, Gradient Boosting Machine, Deep Learning diagnostic results are integrated using a generalized linear model. did.
  • 294 Feature was selected.
  • a diagnostic algorithm was created in the previously divided Training group, and validation was performed in the Test group.
  • the data in the Training group was randomly divided into 10 and 9/10 was used as the Running set, and 1/10 was used as the Test set for cross-validation. Note that all steps such as parameter adjustment are set to be performed automatically by H2O. The results are shown in Fig. 1.
  • the ROC curve in the Training group was the average AUC 0.8799 ( ⁇ 95% CI: 0.0035), and the result assigned to the Test group was the average AUC 0.8812 ( ⁇ 95% CI: 0.0083). It is essential to evaluate the model with the data of Test set, because the parameter values of Training set are adjusted so that the results of cross-validation are improved.
  • the average AUC in the Test group is 0.8812, which indicates that colorectal cancer patients can be diagnosed with extremely high sensitivity.
  • the method that integrates multiple calculation methods to obtain a diagnostic method is the first method that has been conducted this time.
  • a highly accurate and highly reliable diagnostic method could be obtained.
  • the algorithm is constructed using the above-mentioned analysis methods, but if it becomes possible to make highly accurate diagnoses with new statistical analysis methods or analysis methods with new combinations in the future, algorithms will be constructed using those methods. May be built.
  • the cohort 1 colorectal gastric cancer diagnosis algorithm was created using 294 Feature (SEQ ID NOs: 25 to 318). Some of these features were identifiable to the species, but some were identifiable only to the eyes.
  • the detected Feature is, Actinomycetales, Aeromonadales, Bacillales, Bacteroidales, Betaproteobacteriales, Bifidobacteriales, Clostridiales, Coriobacteriales, Desulfovibrionales, Enterobacteriales, Erysipelotrichales, Fusobacteriales, Lactobacillales, Mollicutes RF39, Selenomonadales, was bacteria are classified into 16 eyes of Verrucomicrobiales ..
  • Example 2 Advanced Cancer Diagnostic Algorithm Next, in Cohort 1, only advanced cancer patients were extracted, and a diagnostic algorithm for advanced cancer patients was created. As described above, in colon cancer, as a result of analyzing the intestinal microbiota of patients with advanced cancer and early cancer, the intestinal microbiota profiles of advanced cancer and early cancer were significantly different. Although there are few early stage cancers in the cohort 1 colorectal cancer patients, since 63 cases are included, the sample of the early stage cancer patients is excluded from the samples of the colorectal cancer patients and only the advanced cancers are included. Was extracted and analyzed. A diagnostic algorithm was prepared in the same manner as in Example 1 for 316 cases of advanced cancer in cohort 1 and 815 healthy subjects, and an ROC curve was obtained (FIG. 2).
  • the ROC curve in the Training group was the average AUC 0.8975 ( ⁇ 95% CI: 0.0031), and the result assigned to the Test group was the average AUC 0.8877 ( ⁇ 95% CI: 0.0104).
  • the advanced cancer diagnosis algorithm of cohort 1 is based on 319 Feature (SEQ ID NOs: 26 to 61, 63, 64, 66 to 70, 72 to 74, 76 to 80, 82, 83, 85 to 88, 90 to 98, 100, 102 to 111, 113, 114-118, 120, 121, 123 to 125, 127 to 130, 132 to 142, 144 to 153, 155 to 157, 159 to 161, 163 to 169, 171 to 173, 176 to 181, 183 to 191, 193 to 210, 212, 213, 215 to 217, 220, 222, 224 to 230, 232 to 235, 238 to 240, 242 to 247, 249 to 261, 263 to 270, 272 to 278, 281 to 296, 298 to 309, 311 to 317, 319 to 385). Some of them overlap with the features used to create the algorithm for all colorectal cancer, but many features used only to create the
  • Example 3 Early cancer diagnosis algorithm Next, a model capable of diagnosing early cancer was created. New colon cancer samples and healthy volunteer samples were newly collected from January to September 2017. In addition, a sample of patients having an adenoma (adenoma) which is a pre-lesion for colorectal cancer was also collected (hereinafter referred to as cohort 2).
  • the adenoma sample is a collected fecal sample of a patient having an advanced adenoma with a diameter of 10 mm or more.
  • an early cancer patient diagnosis algorithm was created using the samples of cohort 2.
  • ROC curves of the Training group and the Test group are shown in FIG.
  • the ROC curve in the Training group was the average AUC 0.9243 ( ⁇ 95% CI: 0.0045), and the result assigned to the Test group was the average AUC 0.9274 ( ⁇ 95% CI: 0.0084).
  • a diagnostic algorithm for diagnosing early-stage colorectal cancer could be created with a very high AUC of 0.92 or more. With this diagnostic algorithm, patients with early-stage colorectal cancer, which are difficult to detect by a fecal occult blood test, can be detected with high sensitivity and accuracy.
  • the early cancer diagnosis algorithm of cohort 2 is the feature of 152 (SEQ ID NO: 27, 93, 126, 150, 166, 191, 244, 246, 256, 330, 332, 334, 352, 383, 386-522). Created by. These features belong to eight orders of the bacterium belonging to Bacteroides, Betaproteobacteriales, Bifidobacterium, Clostridials, Coriobacterium, Desulfovibionales, Lactobacilales, and Selenomonadales. In addition, Feature common to both the advanced cancer diagnosis algorithm and the early cancer diagnosis algorithm remains at 13, suggesting that the intestinal microbiota of the patient is greatly different between advanced cancer and early cancer. This also suggests that it is important to create a diagnostic algorithm for each stage.
  • colon cancer patients can be detected more accurately by applying different diagnostic algorithms for detection.
  • the same test data may be analyzed by applying the early cancer diagnosis algorithm and the advanced cancer diagnosis algorithm. That is, it is only necessary to apply the data obtained by one sequence analysis to different diagnostic algorithms.
  • neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, and diseases such as myocardial infarction for which the correlation between intestinal flora and diseases is becoming clear
  • these diseases will also occur. It is possible to carry out the inspection in combination using the same data.
  • FIG. 4A a box and whisker plot of the early cancer predictive value distribution in the test group of the early colorectal cancer diagnostic model (Fig. 4A) and a predictive value distribution by invasion depth (Fig. 4B) are shown.
  • the numbers in parentheses indicate the number of samples in each group. As shown in FIG. 4, it was shown that it is possible to accurately diagnose healthy subjects and colorectal cancer patients with early cancer, invasion depth Tis, and early cancer divided into T1.
  • the adenomas which are the pre-cancerous lesions of colorectal cancer, can be detected and excised by the early cancer diagnosis algorithm, it will lead to a reduction in the incidence of colorectal cancer, which is a great advantage.
  • Intestinal bacteria of 81 patients with advanced adenoma were similarly analyzed, and the obtained data were analyzed by an early cancer diagnosis algorithm.
  • a threshold was set so that the specificity was 93%, and it was applied to the data obtained from adenoma patients.
  • the positive rate was 43.36% on average (95% CI 1.9%). It is said that the positive rate is about 20% when the conventional colon cancer test method is applied to adenoma patients. Therefore, the positive rate was clearly higher than that of the conventional method, and it was shown that adenomas can also be detected.

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Abstract

腸内細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子配列のメタシークエンス解析を行い、複数の機械学習アルゴリズムを統合した解析方法により大腸がんを高感度で検出することのできる診断アルゴリズムを確立した。また、早期がん、進行がんを分けて解析することにより、今まで検出することが難しかった早期の大腸がん患者を高感度で検出することが可能となった。非侵襲的で感度の高い大腸がんの検査方法を提供できる。

Description

大腸がんの検査方法
　本発明は、大腸がんの検査方法に関する。特に、被験者の糞便中の細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の配列をメタシーケンス解析し、被験者が大腸がんに罹患しているかを検出する方法に関する。
　厚生労働省の統計によれば、日本人の死因は男女ともにがんが第１位となっている。日本におけるがんの罹患数、死亡数は、人口の高齢化に伴い増加していることから、今後増々がんの罹患数は増加するものと考えられる。臓器別では、胃がんや前立腺がん、乳がんのように罹患数は増加しているにもかかわらず、死亡数は横ばい、あるいは微増のがんがある。その一方で、大腸がんのように罹患数、死亡数ともに増加しているがんもある。大腸がんは、日本対がん協会のがんの部位別統計によれば、がんによる死因のうち、女性ではトップ、男性でも３位であり、男女合わせて年間約５万人が大腸がんにより死亡している（２０１５年統計）。
　一般にがんは早期に発見し手術を行えば、完治、寛解する率が高くなる。大腸がんのように、罹患数、死亡数ともに増加しているがんは、早期発見が難しく、早期に治療を開始することができない患者が多いことを意味している。早期大腸がんの生存率は高いと言われていることから、早期発見をすることができれば、死亡数は減少するものと考えられる。したがって、大腸がんを早期発見することのできる検査方法が重要となる。
　現在、大腸がん検診は、一般に便潜血検査によって行われている。便潜血検査は、がんやポリープがあると大腸内に出血することがあるため、その血液を検出する検査である。症状がない場合であっても、大腸がん、あるいはポリープから出血があれば検出が可能であり、便を調べるという非侵襲的な方法であることから、無症状者を対象とした健康診断などで広く行われている検査である。
　便潜血検査には、大別してオルトトリジン法やガヤック法のような化学法と、抗体を用いた免疫法の２種類の検査方法がある。化学法は肉や魚などのヘモグロビンなどにも反応するため、２～３日前から食事制限が必要となる。一方、免疫法は便中のヒトヘモグロビンに特異的な抗体を用いて行う検査であり、食事や服薬の制限がなく受診者に対する負担が少ないことから、通常検診では、免疫法によって検査が行われている。しかし、いずれの便潜血検査であっても、出血していない場合には陰性となり、検出することができない。また、検診で広く行われている免疫法による検査では、胃に近い部位にがんがある場合には、ヘモグロビンが変性してしまうため、出血があっても検出できないことがある。そのため、便潜血検査では、検査によって大腸がんを発見できないいわゆる偽陰性が多いことが問題となっている。
　実際に、免疫法による便潜血検査の感度は、検査の回数（１日法・２日法・３日法）により異なるが、我が国では感度５５．６～９９．２％、海外では３０～８７％と報告されている（非特許文献１）。
　また、内視鏡を用いて検査を行うＳ字結腸鏡検査や全大腸内視鏡検査は、感度の良い検査であると言われている。特に、全大腸内視鏡検査は内視鏡による大腸全体の検査であることから、非常に感度が高い。しかしながら、前処置、前投薬、検査と患者の負担も大きく、また、まれにカメラを大腸に入れることによる出血や、穿孔を起こすことがあるため、感度は高いものの集団検診の一次検診には推奨されていない。したがって、内視鏡検査は、個人検診、あるいは症状のある者に対して行っているのが現状である。
　近年、次世代シーケンサーを用いて核酸配列を解析することができるようになり、糞便中の細菌の１６Ｓ　リボソームＲＮＡ（１６Ｓ　ｒＲＮＡ）配列解析から、腸内細菌叢と種々の疾患が相関することが報告されてきている。腸内細菌叢と相関する疾患としては、炎症性大腸炎、過敏性腸症候群などの大腸疾患だけではなく、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎などの慢性疾患や、神経性疾患などの疾患との相関も報告されている（非特許文献２）。大腸がんと腸内細菌叢の相関に関しても多数報告されており、大腸がん発生と相関の高い菌種が報告されている（非特許文献３）。非特許文献３は総説であり、今までに報告されている大腸がんと相関して増減する菌種がまとめられている。しかしこれらの細菌は、大腸がんの原因となり得る菌、あるいは大腸がん発症を抑制し得る菌であり、これらの菌を検出することによって、大腸がんを感度良く検出できるわけではない。
　非特許文献４には、大腸がんを診断する方法として、患者の腸内細菌叢を解析する最適のアルゴリズムについて開示されている。非特許文献４は特定のアルゴリズムを用いることによってＡＵＣ＝０．９９４と非常に感度良く大腸がんを診断できることが報告されている。食習慣の全く異なる中国とフランスの集団において、Ｂａｙｅｓ　ＮｅｔとＲａｎｄａｍ　Ｆｏｒｅｓｔという２つのアルゴリズムがどちらの集団においても精度良く大腸がんを診断できることが記載されている。
　また、特許文献１には定量的ＰＣＲによって１種又は複数種の細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡを測定することにより大腸がんや腺腫性ポリープを検査する方法が開示されている。
特表２０１７－５０８４６４号公報
有効性評価に基づく大腸がん検診ガイドライン　平成１６年度　厚生労働省がん研究助成金「がん検診の適切な方法とその評価法の確立に関する研究」班　２００５年３月２４日 Martinez,K.B. et al., 2017, doi：10.1074/jbc.R116.752899 Gagniere,J. et al., World J. Gastroenterol., 2016, Vol.22(2), pp.501-518. Ai,L. et al., Oncotarget, 2017, Vol.8, No.6, p.9545-9556. Segata, N. et al., Genome Biology, 2011, 12:R60.
　上述のように、現在行われている大腸がんの検査は、非侵襲的な検査である便潜血検査は感度が低く、内視鏡検査は、感度は高いものの受診者に対する不利益が大きいという問題がある。近年提案されている腸内細菌を検査する方法は、次世代シーケンサーの普及とともに広く行われるようになってきたが、現在のところ特定の菌種が大腸がんをはじめとする種々の疾患へ相関することを指摘する研究が主流であり、疾患を診断するには至っていない（非特許文献２、３）。また、いずれの場合も早期がんを対象とするものではなく、早期の大腸がんを感度良く検査できる方法ではない。
　特許文献１に記載の方法は、ＡＵＣが０．７程度と、さほど感度の良い検査ということはできない。また、開示されている４つの細菌配列すべてについて定量を行ったとしても、個々に独立した検査であることから、感度が増強されることにはならない。
　非特許文献４に記載の方法は特定のアルゴリズムを用いることによって、感度良く大腸がんを検査できることが開示されている。しかし、解析に用いたサンプル数が少なく、過適合の可能性が高い。その結果、高いＡＵＣが得られている可能性を否定できず、データとして信頼性に乏しい。
　さらに、非特許文献４に記載の方法は早期がんと進行がんを分けて解析してはいない。本発明者らのグループが早期がんと進行がんを分けて解析したところ、早期がんと進行がんとでは腸内細菌叢が大きく異なることが明らかとなった。大腸がんは多くの場合、進行がんになってから発見されることが多い。そのため、解析に用いられているのは進行がんを多く含む群となる。進行がん患者が多く含まれる群を用いて得られた解析結果をもとに、早期がん患者を検出することはできない。早期の大腸がんを検出するためには、早期がん患者から得られた試料をもとに解析する必要がある。
　本発明は、非侵襲的な検査でありながら、感度が高い大腸がんの検査方法を提供することを課題とする。便潜血検査に代わる一次スクリーニング検査として腸内細菌叢の検査を行い、陽性であった者を対象として大腸内視鏡検査を行えば、今まで検出することのできなかった早期の大腸がんを検出できるだけではなく、患者の負担も非常に少なくて済む。
　本発明は、便試料を用いて大腸がんを感度、及び特異度良く検査する方法に関する。特に、早期の大腸がんを検出する方法に関する。
（１）大腸がんの検査方法であって、被験者から採取された糞便中の細菌叢の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解析し、得られた塩基配列のデータ群を予め得られている診断アルゴリズムによって解析し大腸がんを検出する検査方法。
（２）前記診断アルゴリズムが、進行大腸がん患者、又は早期大腸がん患者から得られた１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列データ群を区別して求めた診断アルゴリズムであって、進行大腸がん、又は早期大腸がんを区別して解析することを特徴とする（１）記載の検査方法。
（３）前記診断アルゴリズムが、前記塩基配列のＦｅａｔｕｒｅとその出現頻度を複数の機械学習アルゴリズムによって得られた結果を統合して作成した診断アルゴリズムであることを特徴とする（１）、又は（２）記載の検査方法。
（４）前記塩基配列のデータ群を大腸がん以外の疾患の診断アルゴリズムによって解析し、大腸がんと併せて診断を行うことを特徴とする（１）～（３）いずれか１つ記載の検査方法。
全大腸がんの診断アルゴリズムによるＲＯＣ曲線を示す。図１ＡはＴｒａｎｉｎｇ　ｓｅｔ、図１ＢはＴｅｓｔ　ｓｅｔの解析結果を示す。 進行大腸がんの診断アルゴリズムによるＲＯＣ曲線を示す。図２ＡはＴｒａｎｉｎｇ　ｓｅｔ、図２ＢはＴｅｓｔ　ｓｅｔの解析結果を示す。 早期大腸がんの診断アルゴリズムによるＲＯＣ曲線を示す。図３ＡはＴｒａｎｉｎｇ　ｓｅｔ、図３ＢはＴｅｓｔ　ｓｅｔの解析結果を示す。 図４Ａは、早期大腸がん診断アルゴリズムのＴｅｓｔ群での早期がん予測値の分布の箱ひげ図を示す。図４Ｂは、Ｔｅｓｔ群を深達度別に分けた場合の予測値の分布の箱ひげ図を示す。
　本発明の方法は、対象の腸内細菌の塩基配列を網羅的に決定し、その情報をもとに疾患リスクを解析する方法である。したがって、疾患と腸内細菌叢の変化が明らかにされた疾患であれば、同様に検査を行うことができるだけではなく、同じデータをもとに解析し、異なる疾患も併せて検査結果を得ることができる。すなわち、非侵襲的な方法であり、かつ単一の検査でありながら、複数の疾患を同時に検査することができる。
　［実施例１］全大腸がんの診断アルゴリズム
　大腸がんの場合は、進行がんであっても自覚症状のない患者も多い。また、健康診断時の検査においては、早期がん、進行がんを区別して検査することはないので、早期がん、進行がんを含めたがん患者の解析を行った。
　２０１３年１２月から２０１５年３月にかけて、がん研有明病院、併設の健診センターにおいて、得られた糞便サンプルを用いて解析を行った（以下、この群をコホート１という。）。インフォームド・コンセントが得られた大腸がん患者５０９例、健常者９２８例の便試料のうち、採便日不適正、消化管再建手術既往などの除外基準に該当したサンプルを除外し、大腸がん３７９例（早期がん６３例、進行がん３１６例）、健常者８１５例のサンプルについて解析を行った。また、すべての健常者は、５年以内に大腸内視鏡（Ｃｏｌｏｎｏ　Ｆｉｂｅｒｓｃｏｐｙ：ＣＦ）検査の受診歴があり、大腸がんがないことが確認されている者（ｎ＝６１７）、あるいは、採便後２年間のフォロ-アップで大腸がん発症がないことが確認されている者（ｎ＝１９８）を対象としている。それぞれの群の臨床病理学的特徴を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　早期がん、進行がんの判断は、検体の病理組織学的診断（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔａｇｉｎｇ）を行い、深達度で判断し、基底膜に達していないＴｉｓ、Ｔ１（がんが粘膜層にとどまり、粘膜下層に及んでいない、あるいはがんが粘膜下層に浸潤しているが、固有筋層に及んでいない状態）を早期、基底膜に達しているＴ２からＴ４ｂ（がんが固有筋層まで浸潤している状態から直接他臓器に浸潤している状態までを含む。）を進行がんとして解析している。治療においても早期がんは内視鏡的切除が可能であるのに対し、進行がんでは腹腔鏡手術、あるいは開腹手術が必要となる。なお、進行がんのうち術前に化学療法、又は放射線化学療法を施行した症例については、術前治療前の検査データ（内視鏡検査、ＣＴ検査、直腸がんの場合は加えてＭＲＩ検査）の結果をもとに医師２名でｃｌｉｎｉｎｃａｌ　ｓｔａｇｉｎｇを行っている。
　便試料は採便容器（株式会社テクノスルガ・ラボ）に採取したものを回収した。大腸がん患者、健常者から得られた便試料から、以下の方法によりＤＮＡを抽出した。検便サンプルは、ジルコニアビーズ（０．１ｍｍ、安井器械株式会社）を添加し、８５℃、１５分間、加熱した後、細胞破砕機（安井器械株式会社、マルチショッカー）によって破砕した。糞便破砕液は、ＱＩＡａｍｐ　Ｆａｓｔ　ＤＮＡ　Ｓｔｏｏｌ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて精製した。
　精製したＤＮＡは、２６０ｎｍ、２８０ｎｍの吸光度を測定後、－２０℃で保存した。また、得られたＤＮＡの品質は１６Ｓ　ｒＲＮＡをＰＣＲ増幅して品質確認を行った。
　大腸がん患者、健常者から得られたＤＮＡ試料は、腸内細菌１６ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子配列をメタシーケエンス解析によって解析した。１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子において、種、あるいはグループに特異的な領域であるＶ１Ｖ２領域を含む配列を解析可能なように、１６Ｓ　ｒＲＮＡに共通する配列をＰＣＲプライマーとして設定し、一括してＰＣＲ増幅し増幅された配列中に存在する種間で異なる可変領域の遺伝子配列の解析を行った。
　ヒト腸管には数百種の腸内常在菌が生息していると言われているが、多くの菌は嫌気性の細菌であり、培養することの難しい難培養性細菌であると言われている。次世代シークエンサを用いた１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のメタシーケンス解析によれば、菌を分離培養することなく、菌種の解析を進めることができる。その結果、培養の容易性、困難性といったバイアスをかけることなく、腸内に生息する細菌集団の配列データを高速にかつ網羅的に取得することができる。
　ここでは、１６Ｓ　ｒＲＮＡの可変領域であるＶ１～Ｖ２領域を増幅するＰＣＲプライマーを設定しＰＣＲによりライブラリーを作製しているが、これに限らず腸内細菌叢を網羅的に解析できる領域であれば、どのような領域にプライマーを設定して解析を行ってもよい。また、シーケンス方法についても、どのような方法を用いてもよい。例えば、ナノポアシーケンサーによる方法や今後開発される、新しいシーケンス方法を用いて解析を行うことができることは言うまでもない。
　ライブラリーの作製方法、シーケエンス方法についての概要を記載する。以下のＰＣＲはすべて、ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（東洋紡株式会社）を用いて行っている。Ｖ１～Ｖ２領域のライブラリーは、便試料より抽出したＤＮＡを１ｓｔ　ＰＣＲとして配列番号１、及び２に記載のプライマーを用いて増幅した。なお、ＰＣＲ反応は、電気泳動によりチェックした。２ｎｄ　ＰＣＲは以下の配列番号３～１０のＦｏｒｗａｒｄプライマー、配列番号１１～２２のＲｅｖｅｒｅｓｅプライマーを夫々組合せ、計９６通りの組合せにより増幅した。なお、２ｎｄ　ＰＣＲの反応は、Ｖ１～Ｖ２領域のライブラリーを配列番号２３及び２４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、電気泳動により確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　なお、ｍはａ又はｃ、ｙはｃ又はｇ、ｎはａ、ｃ、ｇ、ｔいずれかの塩基であることを示す。
　ＤＮＡ配列はＭｉＳｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　Ｖ２　５００ｃｙｃｌｅｓを用い、ＭｉＳｅｑにより決定した。クオリティコントロールはＰｈｉＸ　コントロールｖ３（以上、全てイルミナ株式会社）を用いた。
　各試料から得られた配列は、ＱＩＩＭＥ　２を用いて解析を行った。ＱＩＩＭＥ　２によりシーケンスエラーを自動的に判断し、１００％シーケンスリードが一致しているものを同一のＦｅａｔｕｒｅとして解析するため、結果が非常に安定であり、各サンプルにおける存在比率が正確である。また、１００％一致するシーケンスリードを同一のＦｅａｔｕｒｅとするため、複数のＦｅａｔｕｒｅに同じ菌種が割り当てられる。Ｆｅａｔｕｒｅによる解析は、配列類似性でクラスタリングするＯＴＵを用いた解析に比べより診断モデル作成に適している。
　サンプルは、予めランダムにＴｒａｉｎｉｎｇ群（８割、大腸がん患者２９３～３１２例、健常者６３８～６５９例）とＴｅｓｔ群（２割、大腸がん患者６７～８６例、健常者１５６～１７７例）に分けた。また、ＬＥｆＳｅ（Ｌｉｎｅｒ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｅｆｆｅｃｔ　Ｓｉｚｅ、非特許文献５）を用いて、健常者群、がん患者群に特徴的に出現する菌を解析した。
　次に機械学習アルゴリズムを用いて診断モデルを作成した。オープンソースの機械学習分析プラットフォームであるＨ２Ｏ．ａｉを用いて解析を行った。Ｈ２Ｏ．ａｉは機械学習とディープ・ラーニングの両方を行うことによって、より良いモデルを構築することを可能とするプラットフォームである。具体的には、一般化線形モデル、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｆｏｒｅｓｔ、Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ　Ｒａｎｄｍｉｚｅｄ　Ｔｒｅｅｓ、Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｂｏｏｓｔｉｎｇ　Ｍａｃｈｉｎｅ、Ｄｅｅｐ　Ｌｅａｒｉｎｇで得られた結果を一般化線形モデルを用いて統合するＳｔａｃｋｅｄ　Ｅｎｓｅｍｂｌｅｓ法により診断精度の良いアルゴリズムを作成した。その結果、２９４のＦｅａｔｕｒｅを選択した。予め分けたＴｒａｉｎｉｎｇ群で診断アルゴリズムを作成し、Ｔｅｓｔ群でバリデーションを行った。
　まず、Ｔｒａｉｎｉｎｇ群における診断モデルの内的妥当性を検証するために、Ｔｒａｉｎｉｎｇ群のデータをランダムに１０に分け９／１０をＴｒａｎｉｎｇ　ｓｅｔとし、１／１０をＴｅｓｔ　ｓｅｔとして交差検証を行った。なお、パラメータの調整等、すべての工程はＨ２Ｏによって自動的に行われるように設定されている。結果を図１に示す。
　Ｔｒａｉｎｉｎｇ群におけるＲＯＣ曲線は、平均ＡＵＣ０．８７９９（±９５％ＣＩ：０．００３５）、Ｔｅｓｔ群にあてた結果は、平均ＡＵＣ０．８８１２（±９５％ＣＩ：０．００８３）であった。Ｔｒａｉｎｉｎｇ　ｓｅｔの結果は交差検証の結果が改善するようにパラメータ値を調整するので、Ｔｅｓｔ　ｓｅｔのデータでモデルを評価することは必須である。Ｔｅｓｔ群における平均ＡＵＣは０．８８１２であることから、非常に高い感度で大腸がん患者を診断できることを示している。
　複数の計算方法を統合して、診断方法を得る方法は、今回初めて行われた方法である。複数の解析方法を組み合わせるということにより、非常に精度が高く信頼性の高い診断方法を得ることができた。ここでは、上記の解析方法を用いてアルゴリズムを構築しているが、今後新しい統計解析方法や、新しい組み合わせによる解析方法で精度高く診断を行うことが可能となれば、それらの方法を用いてアルゴリズムを構築してもよい。
　なお、コホート１の全大腸胃がん診断アルゴリズムは、２９４のＦｅａｔｕｒｅ（配列番号２５～３１８）を用いて作成した。これらＦｅａｔｕｒｅは、種まで同定可能なものもあったが、目までしか同定できないものも含まれていた。検出されたＦｅａｔｕｒｅは、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ　ＲＦ３９、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓの１６の目に分類される菌であった。
［実施例２］進行がんの診断アルゴリズム
　次に、コホート１において、進行がん患者のみを抽出し、進行がん患者の診断アルゴリズムを作成した。前述のように、大腸がんにおいて、進行がんと早期がん患者の腸内細菌叢の解析を行った結果、進行がんと早期がんでは腸内細菌叢プロファイルが大きく異なっていた。コホート１の大腸がん患者は、早期がんが少ないとはいえ、６３例含まれていることから、大腸がん患者のサンプルの中から、早期がん患者のサンプルを除外し進行がんのみを抽出して解析を行った。コホート１の進行がん３１６例、健常者８１５例を対象として、実施例１と同様にして診断アルゴリズムを作成し、ＲＯＣ曲線を求めた（図２）。
　Ｔｒａｉｎｉｎｇ群におけるＲＯＣ曲線は、平均ＡＵＣ０．８９７５（±９５％ＣＩ：０．００３１）、Ｔｅｓｔ群にあてた結果は、平均ＡＵＣ０．８８７７（±９５％ＣＩ：０．０１０４）であった。進行がんに限定して診断アルゴリズムを作成したことで、診断の精度が改善している。
　なお、コホート１の進行がん診断アルゴリズムは、３１９のＦｅａｔｕｒｅ（配列番号２６～６１、６３、６４、６６～７０、７２～７４、７６～８０、８２、８３、８５～８８、９０～９８、１００、１０２～１１１、１１３、１１４－１１８、１２０、１２１、１２３～１２５、１２７～１３０、１３２～１４２、１４４～１５３、１５５～１５７、１５９～１６１、１６３～１６９、１７１～１７３、１７６～１８１、１８３～１９１、１９３～２１０、２１２、２１３、２１５～２１７、２２０、２２２、２２４～２３０、２３２～２３５、２３８～２４０、２４２～２４７、２４９～２６１、２６３～２７０、２７２～２７８、２８１～２９６、２９８～３０９、３１１～３１７、３１９～３８５）を用いて作成した。全大腸がんのアルゴリズム作成に使用したＦｅａｔｕｒｅと重複しているものもあるが、進行がんのアルゴリズム作成にのみ使用しているＦｅａｔｕｒｅも多数含まれている。病期を分けて解析を行うことの重要性を示している。
　これらＦｅａｔｕｒｅは、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ　ＲＦ３９、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓの１６の目に分類される菌であった。
［実施例３］早期がんの診断アルゴリズム
　次に早期がんを診断可能なモデルの作成を行った。２０１７年１月～９月に新たに早期の大腸がんサンプルと、健常者サンプルを収集した。また、併せて大腸がんの前病変であるアデノーマ（腺腫）を有する患者サンプルを集めた（以下、コホート２という。）。アデノーマのサンプルは、直径１０ｍｍ以上の進行したアデノーマを有する患者の糞便サンプルを収集している。
　消化器がん併存例、既往例など、早期がん患者８例、健常者９例を除外サンプルとした。その結果、早期がん患者１３５例、健常者１５４例、アデノーマ患者８１例のサンプルが解析対象となった。
　実施例１と同様にして、コホート２のサンプルを用いて早期がん患者診断アルゴリズムを作成した。Ｔｒａｉｎｉｎｇ群、Ｔｅｓｔ群のＲＯＣ曲線を図３に示す。Ｔｒａｉｎｉｎｇ群におけるＲＯＣ曲線は、平均ＡＵＣ０．９２４３（±９５％ＣＩ：０．００４５）、Ｔｅｓｔ群にあてた結果は、平均ＡＵＣ０．９２７４（±９５％ＣＩ：０．００８４）であった。ＡＵＣが０．９２以上と非常に感度良く早期の大腸がんを診断する診断アルゴリズムが作成できた。便潜血検査では発見の難しい早期の大腸がん患者もこの診断アルゴリズムによって、感度・精度ともに高く検出することができる。
　なお、コホート２の早期がん診断アルゴリズムは、１５２のＦｅａｔｕｒｅ（配列番号２７、９３、１２６、１５０、１６６、１９１、２４４、２４６、２５６、３３０、３３２、３３４、３５２、３８３、３８６～５２２）によって作成した。これらＦｅａｔｕｒｅは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓの８つの目に属する菌であった。また、進行がん診断アルゴリズムと早期がん診断アルゴリズムの双方で共通するＦｅａｔｕｒｅは１３に留まり、進行がんと早期がんでは患者の腸内細菌叢が大きく異なることが示唆される。このことからも病期を分けて診断アルゴリズムを作成することが重要であることが示唆される。
　早期がん患者、進行がん患者の腸内細菌叢は異なることから、別々の診断アルゴリズムを適用して検出を行うことにより、より精度良く大腸がん患者を検出することができる。具体的には同じ検査データを早期がん診断アルゴリズム、進行がん診断アルゴリズムを適用して解析を行えばよい。すなわち、１度のシーケンス解析によって得られたデータを異なる診断アルゴリズムに適用するだけでよい。さらに、アルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患や、心筋梗塞など、腸内細菌叢と疾患との相関が明らかになってきている疾患についても精度の良い診断アルゴリズムが作成されれば、これら疾患も同じデータを用いて併せて検査を行うことが可能となる。
　次に、早期大腸がん診断モデルのＴｅｓｔ群での早期がん予測値分布の箱ひげ図（図４Ａ）、及び深達度別の予測値分布の箱ひげ図（図４Ｂ）を示す。なお、かっこ内に示す数字は各群のサンプル数を示す。図４に示すように、早期がん、深達度Ｔｉｓ、Ｔ１に分けた早期がん、いずれにおいても明らかに健常者と大腸がん患者を精度良く診断できることが示された。
　早期がん診断アルゴリズムで、大腸がんの前病変であるアデノーマを検出し、切除を行うことができれば、大腸がんの罹患率を減らすことにつながり、大きなメリットがある。８１例の進行したアデノーマ患者の腸内細菌を同様に解析し、得られたデータを早期がん診断アルゴリズムで解析を行った。
　特異度が９３％になるように閾値を設定し、アデノーマ患者から得られたデータに適用した。その結果、陽性率は平均４３．３６％（９５％ＣＩ１．９％）であった。従来の大腸がんの検査方法をアデノーマ患者に適用した場合、陽性率は２０％程度であると言われている。したがって、従来法に比べて明らかに高い陽性率を示しており、アデノーマも検出可能であることが示された。

Claims (4)

  1. 　大腸がんの検査方法であって、
    　被験者から採取された糞便中の細菌叢の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解析し、
    　得られた塩基配列のデータ群を予め得られている診断アルゴリズムによって解析し大腸がんを検出する検査方法。
  2. 　前記診断アルゴリズムが、
    　進行大腸がん患者、又は早期大腸がん患者から得られた１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列データ群を区別して求めた診断アルゴリズムであって、
    　進行大腸がん、又は早期大腸がんを区別して解析することを特徴とする請求項１記載の検査方法。
  3. 　前記診断アルゴリズムが、
    　前記塩基配列のＦｅａｔｕｒｅとその出現頻度を
    　複数の機械学習アルゴリズムによって得られた結果を統合して作成した診断アルゴリズムであることを特徴とする請求項１、又は２記載の検査方法。
  4. 　前記塩基配列のデータ群を大腸がん以外の疾患の診断アルゴリズムによって解析し、
    　大腸がんと併せて診断を行うことを特徴とする請求項１～３いずれか１項記載の検査方法。
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