WO2020076191A1 - Klebsiella pneumonia strain for producing microbial biomass - Google Patents

Klebsiella pneumonia strain for producing microbial biomass Download PDF

Info

Publication number
WO2020076191A1
WO2020076191A1 PCT/RU2019/050163 RU2019050163W WO2020076191A1 WO 2020076191 A1 WO2020076191 A1 WO 2020076191A1 RU 2019050163 W RU2019050163 W RU 2019050163W WO 2020076191 A1 WO2020076191 A1 WO 2020076191A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
methane
strain
oxidizing bacteria
klebsiella pneumonia
culture
Prior art date
Application number
PCT/RU2019/050163
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Елена Сергеевна БАБУСЕНКО
Валерий Алексеевич Быков
Нина Борисовна ГРАДОВА
Маргарита Витальевна ЛАЛОВА
Леонид Евгеньевич Левитин
Александр Иванович Сафонов
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ"
Publication of WO2020076191A1 publication Critical patent/WO2020076191A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the invention relates to the microbiological industry, in particular to a strain of heterotrophic bacteria Klebsiella pneumonia 1-17 for producing protein biomass by an associative culture, including methane-oxidizing bacteria and heterotroph bacteria.
  • Microbial protein mass can be used in agriculture for feeding animals, as well as raw materials for advanced processing.
  • soybean meal The main source of protein product is soybean meal. However, the natural conditions of our country are not suitable for growing soybeans in sufficient quantities. Professionals have to look for other ways to produce feed protein.
  • microorganisms that belong to different taxonomic groups and are able to grow on various substrates.
  • bacteria as producers of feed protein is more effective, since bacteria accumulate up to 79% of the protein by weight, while yeast - not more than 60%.
  • Bacterial strains known as methanol-based protein producers and belonging to the genus Acetobacter Acetobacter methylicum VSB-924 TsMPM B-2942 are used as protein and biomass producers; Acetobacter methylicum VSB-867 TsMPM B-1947 (RF patent Ns 925112, C 12 Ns 15/00, 1982); Acetobacter methylovorans VSB-914 TsMPM B-2479 (RF patent Ns 1070916, C 12 Ns 15/00, 1983). All strains are characterized by a protein content of up to 76% to absolutely dry matter (ASV).
  • the strains differ in sensitivity to typical phages and thermal stability: optimal growth in Acetobacter methylicum VSB-867 at 28-30 ° ⁇ , in Acetobacter methylicum VSB-924 - 30-36 ° ⁇ and Acetobacter methylovorans VSB-914 at 36-40 ° ⁇ .
  • Obligatory methane-oxidizing bacteria contain the enzyme methane monooxygenase, which is not substrate-specific and can oxidize not only methane, but also methane homologs (e.g. ethane, propane and butane) contained in natural gas.
  • methane monooxygenase which is not substrate-specific and can oxidize not only methane, but also methane homologs (e.g. ethane, propane and butane) contained in natural gas.
  • species characteristics of methane-oxidizing bacteria and cultivation conditions among the products of incomplete oxidation of methane and its homologs methanol, formaldehyde, formate, ethanol, acetaldehyde, acetate, propionic aldehyde, propionic acid, butyraldehyde may be present in different ratios in the cultivation medium .
  • These products when they accumulate in the cultivation medium at a certain concentration, have an inhibitory effect on the methane-oxidizing culture and on the oxidation of methane.
  • Stable continuous cultivation on natural gas is possible only when using an associative culture of methane-oxidizing microorganisms and heterotrophic microorganisms - satellites using products of incomplete oxidation of methane homologs, possibly products of autolysis of microorganism cells.
  • DNAase is obtained by growing a strain on liquid or dense nutrient medium, biomass sedimentation, ultrasonic disintegration and centrifugation. Deoxyribonuclease is recovered from the supernatant.
  • the known strain Klebsiella pneumoniae GISKKya 215 is used as a reference strain for determining the catalase activity of microorganisms in the differentiation of pathogenic and non-pathogenic microorganisms (RF patent N 2070923).
  • strain Methylococcus capsulatus VSB-874 - producer of fodder biomass The strain is stored in the collection of cultures of the Institute "VNIIG Enetika” under the collection number TsMPM V-1743 (Aut. St. USSR JVe 770200).
  • the strain uses methane as a source of carbon and energy, both pure and as part of natural gas.
  • the disadvantage of this strain is its sensitivity to products resulting from the co-oxidation of methane homologs, which are invariably, in greater or lesser amounts, present in natural gas. The resulting products inhibit the growth of the producer.
  • the aim of the invention is to increase productivity and achieve high productivity when culturing natural gas methane-oxidizing bacteria in the presence of heterotrophic bacteria as an associate producer of microbial protein mass.
  • the technical result of the invention is the identification of a new strain, which is an associate of methane-oxidizing bacteria and is able to use the products of co-oxidation of methane homologs present in natural gas, and can also use proteins, amino acids and polysaccharides released during the lysis of bacteria.
  • the technical result was achieved using a strain of heterotrophic bacteria Klebsiella pneumonia 1-17, deposited in the State collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "GKPM - OBOLENSK” under registration number B-8465, as a component of the associative culture of methane-oxidizing bacteria to obtain microbial protein mass.
  • the strain Klebsiella pneumoniae 1-17 is used as one of the components of the associative culture of methane-oxidizing bacteria for the industrial production of feed biomass based on natural gas for animal feeding, as well as a raw material for advanced processing.
  • Source of strain isolation the claimed heterotrophic strain Klebsiella pneumoniae 1-17 was isolated from an association including methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15.
  • methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15.
  • a mixture of active accumulative cultures isolated from groundwater from a number of gas and oil-bearing regions of the Russian Federation was used .
  • a strain was obtained which, when culturing methane-oxidizing bacteria under industrial conditions on natural gas, can be used as part of various associations.
  • the strain grows as an associate of the main producer of methane-oxidizing bacteria on the mineral medium and, under physicochemical conditions that are optimal for the producer, consumes the products of the co-oxidation of methane homologs present in natural gas, as well as metabolic products of the main producer.
  • the strain is not genetically modified.
  • the strain Klebsiella pneumoniae 1-17 is avirulent, non-toxigenic, non-toxic and harmless.
  • timing belt JN ° 1 (FBUN SSC PMB) forms smooth, translucent, mucous colonies, 3-4 mm in diameter.
  • Virulence for laboratory animals LD50 for BALB / s mice -, 2x 10 8 CFU.
  • the 16Sp RNA gene sequence was determined and analyzed in the BLAST Nucleotide collection (nr / nt) database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Homology of the l6SpPHK gene of the studied strain with the 16S rRNA gene of the reference strain Klebsiella pneumonia subsp. Pneumonia HS11286 (CP003200.1) is 99% (1526/1527).
  • Cultivation conditions dense or liquid nutrient medium - GRM JNe 1, GRM broth, nutrient agar or nutrient broth, 34 ° C, 24 hours; mineral medium into which either methanol or ethanol or propanol is added as a carbon source, 40 ° C, 36-48 hours.
  • Nutrient agar, composition (in terms of 1 l of the finished medium): protein enzymatic hydrolyzate, dry - 10.5 g; peptone is enzymatic, dry - 10.5 g; clarified yeast extract - 2.0 g; sodium chloride - 5.0 g; microbiological agar - 12.0 g. Sterilize at a temperature of 121 ° C for 15 minutes.
  • Nutrient broth, composition (in terms of 1 liter of the finished medium): protein hydrolyzate, dry - 9.1 g; dry peptone - 9.9 g; autolized yeast extract clarified - 4.7 g; sodium chloride - 5.0 g; sodium carbonate - 0.3 g. Sterilize at 121 ° C for 15 minutes.
  • GRM-A 1 (medium composition, g / l): pancreatic hydrolyzate of fish meal - 15.0, pancreatic hydrolyzate of casein - 10.0, yeast extract - 2.0, sodium chloride - 3.5, D-glucose - 1, 0, agar 10.0 ⁇ 2.
  • Timing - broth pancreatic hydrolyzate of fish meal - 8.0, dry enzymatic peptone - 8.0, sodium chloride - 4.0.
  • Mineral medium composition of the medium, g / l: (KH4) 2S04 - 0.52; MgSQt - 0.02; K2SO4 0.06; NH4H2PO4 - 1.53.
  • Microelement solution prepared separately (g / l): ZnSC> 4 - 0.43; MnSC> 4 - 0.88; C11SO4 0.78; Nzvoz - 0.4; Na 2 Mo0 4 x2H20 0.25; C0SO4X7H2O 0.25; FeS0 4 x7H20 - 4.97.
  • Methanol (up to 1.5% vol.), Ethanol (up to 2% vol.), Propanol (up to 1% vol.) Can be used as a substrate (a source of carbon and energy).
  • Cultivation temperature 40 ° C; aerobic conditions.
  • the strain is stored on nutrient agar (at a temperature of 4 ⁇ 2 ° C), reseeding is carried out once every 3 months, it is possible to store the strain in freeze-dried state, as well as in liquid nitrogen.
  • the claimed strain is characterized by: sustainable productive growth on media of various compositions; the ability to long-term activity in the lyophilized state; lack of virulence, toxigenicity, toxicity and harmlessness.
  • the strain Klebsiella pneumoniae 1-17 is used as a component of the associative culture of methane-oxidizing bacteria for the industrial production of feed biomass based on natural gas, as well as as a raw material for advanced processing.
  • Heterotrophic bacteria Klebsiella pneumoniae 1-17 use the resulting products (methanol, ethanol, propanol) as a carbon source, thereby removing the inhibitory effect on the main producer.
  • a heterotroph can use proteins, amino acids and polysaccharides released during the lysis of bacteria.
  • Methane-oxidizing bacteria develop due to natural gas methane, and another component of the associative culture - due to the products of the co-oxidation of methane homologs in natural gas and due to the metabolic products of methanotroph.
  • Deviation from these values in one direction or another can lead in the first case to a delay in the development of methane-oxidizing bacteria, and in the second to a delay in the growth of heterotrophic bacteria.
  • the biomass yield increases by 3-5 times compared with a pure culture of methane-oxidizing bacteria.
  • the addition of selected methane-free heterotrophs to methane-oxidizing bacteria that grow due to the products of co-oxidation of methane homologs can increase the biomass yield on methane.
  • heterotrophic bacteria that do not oxidize methane does not affect the quality of biomass, since even when heterotrophs that do not use methane are introduced in a high concentration, their content in a growing culture is limited by the amount of available carbon source, which is the products of the co-oxidation of methane homologs, and usually does not exceed 1 - 15% of the total number of cells.
  • EXAMPLE 1 The strain Klebsiella pneumoniae 1-17 is grown on a liquid mineral medium containing (g / l): (NH ⁇ SCF - 0.52; MgS0 4 - 0.02; K2SO4 - 0.06; NH4H2PO4 - 1.53.
  • the medium is sterilized at a temperature of 121 ° C for 15 minutes
  • Microelement solution (prepared and sterilized separately) (g / l): ZnS0 4 - 0.43; MnS0 4 - 0.88; CuS0 4 - 0.78; Nzvoz - 0.4; KagMoS gNgo - 0.25; CoSC bM) - 0.25; FeSC IbO - 4.97. 1 ml the prepared trace element solution is added per 1000 ml of mineral medium. The pH is adjusted to 6.0-6, 2. Methanol is used as a substrate (a source of carbon and energy) - 1.0%.
  • the cultivation of the strain is carried out periodically in flasks made of heat-resistant glass, a volume of 1 l with a fill factor of 0.3 -0.4 in a thermostatically controlled rocking chair. Cultivation is carried out for 48 hours at 34 ° C and pH 6.0. At the end of the cultivation, the solids concentration of 8.2 g of ASB / l.
  • the resulting culture is used as an inoculum for the subsequent growth of bacteria in an automated fermentation complex with a volume of 10 l (working volume of 7 l) or in an ejection-type fermenter with a volume of 40 l (working volume of 28 l).
  • EXAMPLE 2 The cultivation of the strain is carried out similarly to Example 1, but ethanol is used as a source of carbon and energy - 1.6%. Physico-chemical conditions and time of cultivation are the same, the concentration of solids is 10 g of ASB / l.
  • EXAMPLE 3 The cultivation of the strain is carried out similarly to Example 1, but as a source of carbon and energy using propanol - 0.5%. Physico-chemical conditions and time of cultivation are the same, the concentration of solids is 3.0 g of ASB / l.
  • EXAMPLE 4 An associative culture consisting of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 and heterotrophic bacteria Klebsiella pneumonia 1-17 is grown in an automated fermentation complex with a volume of 10 L (working volume 7 l) on a mineral medium of the following composition (g / l): NzRS 80 %) - 17.2; K2SO 4 - 5.0; MgS0 4 x 7H > 0 - 4.0; FeS0 4 x7H20 - 0.21; CuS0 4 - 0.78; MnS0 4 x 4 NgO - 0.38; ZnS0 4 x 7H - 0.06; Nzvoz - 0.25; Na 2 Mo0 4 x2H 2 0 - 0.009; CoS0 4 x7H 2 0 - 0.0095.
  • Ammonia water is supplied as a source of nitrogen and titrating agent.
  • the process is carried out at a temperature of 40-45 ° C, pH 5.4-5, 8 and a continuous supply of a gas mixture containing methane and oxygen.
  • the dominance of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 was 93% at a biomass concentration of 18.5 g ASV / L.
  • EXAMPLE 5 An associative culture consisting of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 and heterotrophic bacteria Klebsiella pneumonia 1-17 is grown in an ejection-type fermenter with a volume of 40 l (working volume 28 l) on a mineral medium of the following composition (g / l): ⁇ 0 4 (80%) - 17.2; K2SO4 - 5.0; MgS0 4 x7NgO - 4.0; FeS0 4 x 7H20 - 0.21; CuS0 4 - 0.78; MnS0 4 ⁇ 4 ⁇ - 0.38; ZnS0 4 c 7H 2 0 - 0.06; Nzvoz - 0.25; Na 2 Mo0 4 x2H 2 0 - 0.009; CoS0 4 x7H 2 0 - 0.0095.
  • a mineral medium of the following composition (g / l): ⁇ 0 4 (80%) - 17.2;
  • Ammonia water is supplied as a source of nitrogen and titrating agent.
  • the process is carried out at a temperature of 41-45 ° C, pH 5.4-5, 7 and a continuous supply of a gas mixture containing methane and oxygen.
  • a biomass concentration of 9-10 g ASB / l Upon reaching a biomass concentration of 9-10 g ASB / l, a gradual increase in pressure to 0.8 MPa is carried out. With increasing pressure, the supply of gaseous microbial power sources is gradually increased.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The invention relates to the bioindustry, and more particularly to a heterotrophic bacterial strain known as Klebsiella pneumonia 1-17 for producing protein biomass by means of an associative culture comprising methane-oxidizing bacteria and bacterial heterotrophs. The microbial protein biomass can be used in agriculture for feeding animals, and also as a feedstock for advanced processing. The technical result of the invention is the discovery of a new strain Klebsiella pneumonia 1-17 which is an associate of methane-oxidizing bacteria and is capable of utilizing methane homologue co-oxidation products present in natural gas, and also products of the metabolism of the main culture. The technical result is achieved by using the heterotrophic bacterial strain Klebsiella pneumonia 1-17, deposited in the State Collection of Pathogenic Microorganisms and Cell Cultures (GKPM-OBOLENSK) under registration number B-8465, as a component of an associative culture of methane-oxidizing bacteria for producing microbial protein biomass.

Description

ШТАММ KLEBSIELLA PNEUMONIA ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОБНОЙ  STRAIN KLEBSIELLA PNEUMONIA FOR PRODUCING MICROBIAL
БИОМАССЫ  BIOMASS
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к штамму гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17 для получения белковой биомассы ассоциативной культурой, включающей метанокисляющие бактерии и бактерии-гетеротрофы. Микробная белковая масса может быть использована в сельском хозяйстве для кормления животных, а также в качестве сырья для глубокой переработки. The invention relates to the microbiological industry, in particular to a strain of heterotrophic bacteria Klebsiella pneumonia 1-17 for producing protein biomass by an associative culture, including methane-oxidizing bacteria and heterotroph bacteria. Microbial protein mass can be used in agriculture for feeding animals, as well as raw materials for advanced processing.
На сегодняшний день общая картина в России по производству кормовых белков неблагоприятна. Согласно подписанной президентом России доктрины для обеспечения собственным продовольствием на 80-90 % дефицит кормовых продуктов может составить не менее 2 млн. тонн в год.  To date, the overall picture in Russia on the production of feed proteins is unfavorable. According to the doctrine signed by the president of Russia to provide 80-90% of own food, the deficit of feed products can be at least 2 million tons per year.
Основным источником белкового продукта является соевый шрот. Однако природные условия нашей страны не подходят для выращивания сои в достаточных количествах. Специалистам приходится искать другие способы производства кормового белка.  The main source of protein product is soybean meal. However, the natural conditions of our country are not suitable for growing soybeans in sufficient quantities. Professionals have to look for other ways to produce feed protein.
Среди продуцентов кормовой биомассы известны микроорганизмы, относящиеся к различным таксономическим группам, способные расти на различных субстратах.  Among the producers of fodder biomass, microorganisms are known that belong to different taxonomic groups and are able to grow on various substrates.
Использование бактерий в качестве продуцентов кормового белка является более эффективным, так как бактерии накапливают до 79 % белка по массе, в то время как дрожжи - не более 60 %.  The use of bacteria as producers of feed protein is more effective, since bacteria accumulate up to 79% of the protein by weight, while yeast - not more than 60%.
В качестве продуцентов белка и биомассы применяют штаммы бактерий, известные как продуценты белка на основе метанола и относящиеся к роду Acetobacter Acetobacter methylicum ВСБ-924 ЦМПМ В-2942 (патент РФ Ns 116363, С 12 Ns 15/00, 1984); Acetobacter methylicum ВСБ- 867 ЦМПМ В-1947 (патент РФ Ns 925112, С 12 Ns 15/00, 1982); Acetobacter methylovorans ВСБ-914 ЦМПМ В-2479 (патент РФ Ns 1070916, С 12 Ns 15/00, 1983). Все штаммы характеризуются содержанием белка - до 76 % к абсолютно сухому веществу (АСВ).  Bacterial strains known as methanol-based protein producers and belonging to the genus Acetobacter Acetobacter methylicum VSB-924 TsMPM B-2942 (RF patent Ns 116363, C 12 Ns 15/00, 1984) are used as protein and biomass producers; Acetobacter methylicum VSB-867 TsMPM B-1947 (RF patent Ns 925112, C 12 Ns 15/00, 1982); Acetobacter methylovorans VSB-914 TsMPM B-2479 (RF patent Ns 1070916, C 12 Ns 15/00, 1983). All strains are characterized by a protein content of up to 76% to absolutely dry matter (ASV).
Штаммы различаются чувствительностью к типовым фагам и термоустойчивостью: оптимальный рост у Acetobacter methylicum ВСБ-867 при 28-30°С, у Acetobacter methylicum ВСБ-924 - 30-36°С и Acetobacter methylovorans ВСБ-914 при 36-40°С.  The strains differ in sensitivity to typical phages and thermal stability: optimal growth in Acetobacter methylicum VSB-867 at 28-30 ° С, in Acetobacter methylicum VSB-924 - 30-36 ° С and Acetobacter methylovorans VSB-914 at 36-40 ° С.
Однако, при нестерильном культивировании в ферментере на ферментолизатах отрубей и/или муки в кислой среде при pH ниже 6,0 происходит, как показали опыты, быстрое инфицирование дрожжами и грибами и вытеснение продуцента из процесса на 30-40 % и более от общего числа клеток. В результате в получаемом продукте в сильной степени снижается содержание белка. Одним из перспективных путей получения полноценного белкового кормового продукта является использование метанокисляющих бактерий. Метанотрофные бактерии в подходящих условиях активно перерабатывают метан природного газа, быстро размножаются и наращивают биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными соединениями. However, during non-sterile cultivation in the fermenter on fermentolysates of bran and / or flour in an acidic environment at a pH below 6.0, experiments have shown that rapid infection with yeast and fungi and displacement of the producer from the process by 30-40% or more of the total number of cells . As a result, the protein content in the resulting product is greatly reduced. One of the promising ways to obtain a complete protein feed product is the use of methane-oxidizing bacteria. Under suitable conditions, methanotrophic bacteria actively process natural gas methane, multiply rapidly and build up biomass rich in valuable protein, vitamins and other biologically active compounds.
Использование метана природного газа для получения белка одноклеточных имеет ряд преимуществ по сравнению с жидкими углеводородами и другими субстратами, а именно: большие запасы природного газа, хорошая его транспортабельность, возможность получения кормового продукта без дополнительной очистки от субстрата.  The use of natural gas methane to produce unicellular protein has several advantages over liquid hydrocarbons and other substrates, namely: large reserves of natural gas, good transportability, and the possibility of obtaining a feed product without additional purification from the substrate.
Учитывая, что в России большие газовые запасы недр, по некоторым данным они составляют до 40 % мировых, внедрение микробиологического производства белка одноклеточных на российских предприятиях сулит не только экономический эффект, но и способно обеспечить продовольственную безопасность страны.  Given that Russia has large gas reserves of the bowels, according to some sources, they make up 40% of the world’s, the introduction of microbiological production of unicellular protein at Russian enterprises promises not only economic benefits, but also can ensure the country's food security.
Облигатные метанокисляющие бактерии, содержат фермент метанмонооксигеназу, который не является субстратспецифичным и может окислять не только метан, но и гомологи метана (например, этан, пропан и бутан), содержащиеся в природном газе.  Obligatory methane-oxidizing bacteria contain the enzyme methane monooxygenase, which is not substrate-specific and can oxidize not only methane, but also methane homologs (e.g. ethane, propane and butane) contained in natural gas.
В зависимости от состава природного газа, видовых особенностей метанокисляющих бактерий и условий культивирования среди продуктов неполного окисления метана и его гомологов могут присутствовать в разных соотношениях в среде культивирования метанол, формальдегид, формиат, этанол, ацетальдегид, ацетат, пропионовый альдегид, пропионовая кислота, масляный альдегид. Данные продукты при их накоплении в среде культивирования в определённой концентрации оказывают ингибирующее воздействие на метанокисляющую культуру, на окисление метана.  Depending on the composition of natural gas, species characteristics of methane-oxidizing bacteria and cultivation conditions among the products of incomplete oxidation of methane and its homologs, methanol, formaldehyde, formate, ethanol, acetaldehyde, acetate, propionic aldehyde, propionic acid, butyraldehyde may be present in different ratios in the cultivation medium . These products, when they accumulate in the cultivation medium at a certain concentration, have an inhibitory effect on the methane-oxidizing culture and on the oxidation of methane.
Стабильное непрерывное культивирование на природном газе возможно только при использовании ассоциативной культуры метанокисляющих микроорганизмов и гетеротрофных микроорганизмов - спутников, использующих продукты неполного окисления гомологов метана, возможно и продуктов автолиза клеток микроорганизмов.  Stable continuous cultivation on natural gas is possible only when using an associative culture of methane-oxidizing microorganisms and heterotrophic microorganisms - satellites using products of incomplete oxidation of methane homologs, possibly products of autolysis of microorganism cells.
В настоящее время установлено, что даже при использовании моносубстрата, в случае накопления в среде продуктов неполного окисления, целесообразно использовать не чистую культуру, а ассоциативную. При культивировании ассоциативной культуры заметно повышается активность роста основной культуры и ее устойчивость к стрессовым воздействиям некоторых физико-химических параметров.  It has now been established that even when using monosubstrate, in the case of accumulation of products of incomplete oxidation in the medium, it is advisable to use not a pure culture, but an associative one. When cultivating an associative culture, the growth activity of the main culture and its resistance to stressful effects of certain physicochemical parameters noticeably increase.
Известен штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК М 214 продуцент фермента дезоксирибонуклеазы, на основе которого могут быть созданы лекарственные препараты (патент РФ N° 2057178). ДНК-азу получают путем выращивания штамма на жидкой или плотной питательной среде, осаждением биомассы, ультразвуковой дезинтеграцией и центрифугированием. Из надосадочной жидкости извлекают дезоксирибонуклеазу. Known strain Klebsiella pneumoniae GISK M 214 producer of the deoxyribonuclease enzyme, on the basis of which drugs can be created (RF patent N ° 2057178). DNAase is obtained by growing a strain on liquid or dense nutrient medium, biomass sedimentation, ultrasonic disintegration and centrifugation. Deoxyribonuclease is recovered from the supernatant.
Известен штамм Klebsiella azeanae ВКМ В-2008Д продуцент эндонуклеазы рестрикции (патент РФ N° 2044055). Данный фермент узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5'-PuGGNC lCPy-3A Рестриктаза, продуцируемая штаммом может найти применение в генно-инженерных исследованиях.  Known strain Klebsiella azeanae VKM B-2008D producer of restriction endonuclease (RF patent N ° 2044055). This enzyme recognizes and cleaves the 5'-PuGGNC lCPy-3A nucleotide sequence. The restriction enzyme produced by the strain can be used in genetic engineering studies.
Известен штамм Klebsiella pneumoniae ГИСККя 215 , используемый в качестве референс- штамма для определения каталазной активности микроорганизмов при дифференциации патогенных и непатогенных микроорганизмов (патент РФ N» 2070923).  The known strain Klebsiella pneumoniae GISKKya 215 is used as a reference strain for determining the catalase activity of microorganisms in the differentiation of pathogenic and non-pathogenic microorganisms (RF patent N 2070923).
Известен штамм Klebsiella pneumoniae ВКПМ В-7001 , который содержит конъюгативную плазмиду рВК1, детерминирующую устойчивость данного сообщества микроорганизмов к соединениям мышьяка. Использование предложенного штамма позволяет получить штаммы бактерий-биодеструкторов соединений, содержащих мышьяк (патент РФ JVs 2260044).  Known strain Klebsiella pneumoniae VKPM B-7001, which contains the conjugative plasmid rVK1, which determines the resistance of this community of microorganisms to arsenic compounds. Using the proposed strain allows to obtain strains of bacteria-biodestructive compounds containing arsenic (RF patent JVs 2260044).
Известен штамм Methylococcus capsulatus ВСБ-874 - продуцент кормовой биомассы. Штамм хранится в коллекции культур института «ВНИИГ енетика» под коллекционным номером ЦМПМ В- 1743 (Авт. свид. СССР JVe 770200). В качестве источника углерода и энергии штамм использует метан, как чистый, так и в составе природного газа. Недостатком данного штамма является его чувствительность к продуктам, образующимся при соокислении гомологов метана, которые неизменно, в большем или меньшем количестве, присутствуют в природном газе. Образующиеся продукты ингибируют рост продуцента.  Known strain Methylococcus capsulatus VSB-874 - producer of fodder biomass. The strain is stored in the collection of cultures of the Institute "VNIIG Enetika" under the collection number TsMPM V-1743 (Aut. St. USSR JVe 770200). The strain uses methane as a source of carbon and energy, both pure and as part of natural gas. The disadvantage of this strain is its sensitivity to products resulting from the co-oxidation of methane homologs, which are invariably, in greater or lesser amounts, present in natural gas. The resulting products inhibit the growth of the producer.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 регистрационный номер ВКПМ В- 12549 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов для получения микробной белковой массы (патент РФ N° 2613365).  The closest in technical essence and the achieved result is a methane-oxidizing bacteria strain Methylococcus capsulatus GBS-15 VKPM B-12549 registration number in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms for the production of microbial protein mass (RF patent N ° 2613365).
Целью изобретения является повышение производительности и достижение высокой продуктивности при культивировании на природном газе метанокисляющих бактерий в присутствии гетеротрофных бактерий в качестве ассоцианта продуцента микробной белковой массы.  The aim of the invention is to increase productivity and achieve high productivity when culturing natural gas methane-oxidizing bacteria in the presence of heterotrophic bacteria as an associate producer of microbial protein mass.
Техническим результатом изобретения является выявление нового штамма, который является ассоциантом метанокисляющих бактерий и способен использовать продукты соокисления гомологов метана, присутствующие в природном газе, а также может использовать белки, аминокислоты и полисахариды, выделяющиеся в процессе лизиса бактерий.  The technical result of the invention is the identification of a new strain, which is an associate of methane-oxidizing bacteria and is able to use the products of co-oxidation of methane homologs present in natural gas, and can also use proteins, amino acids and polysaccharides released during the lysis of bacteria.
Технический результат достигнут при использовании штамма гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17, депонированного в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - ОБОЛЕНСК» под регистрационным номером В- 8465, в качестве компонента ассоциативной культуры метанокисляющих бактерий для получения микробной белковой массы. The technical result was achieved using a strain of heterotrophic bacteria Klebsiella pneumonia 1-17, deposited in the State collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "GKPM - OBOLENSK" under registration number B-8465, as a component of the associative culture of methane-oxidizing bacteria to obtain microbial protein mass.
Обозначение штамма, присвоенное депозитором 1-17.  The strain designation assigned by the depositor 1-17.
Штамм Klebsiella pneumoniae 1-17 используется в качестве одного из компонентов ассоциативной культуры метанокисляющих бактерий для промышленного получения на основе природного газа кормовой биомассы для кормления животных, а также в качестве сырья для глубокой переработки. The strain Klebsiella pneumoniae 1-17 is used as one of the components of the associative culture of methane-oxidizing bacteria for the industrial production of feed biomass based on natural gas for animal feeding, as well as a raw material for advanced processing.
Источник выделения штамма: заявляемый гетеротрофный штамм Klebsiella pneumoniae 1- 17 выделен из ассоциации, включающей метанокисляющие бактерии Methylococcus capsulatus ГБС- 15. Для селекции быстрорастущей смешанной культуры бактерий была использована смесь активных накопительных культур, выделенных из подземных вод ряда газо- и нефтеносных районов Российской Федерации. В результате проведенной селекции получен штамм, который при культивировании метанокисляющих бактерий в промышленных условиях на природном газе может быть использован в составе различных ассоциаций. При ферментации штамм растет как ассоциант основного продуцента метанокисляющих бактерий на минеральной среде и при физико-химических условиях, оптимальных для продуцента, потребляет продукты соокисления гомологов метана, присутствующие в природном газе, а также продукты метаболизма основного продуцента.  Source of strain isolation: the claimed heterotrophic strain Klebsiella pneumoniae 1-17 was isolated from an association including methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15. For the selection of a fast-growing mixed bacterial culture, a mixture of active accumulative cultures isolated from groundwater from a number of gas and oil-bearing regions of the Russian Federation was used . As a result of the selection, a strain was obtained which, when culturing methane-oxidizing bacteria under industrial conditions on natural gas, can be used as part of various associations. During fermentation, the strain grows as an associate of the main producer of methane-oxidizing bacteria on the mineral medium and, under physicochemical conditions that are optimal for the producer, consumes the products of the co-oxidation of methane homologs present in natural gas, as well as metabolic products of the main producer.
Штамм не является генетически модифицированным.  The strain is not genetically modified.
Информация о биологической опасности (безопасности) штамма: вид Klebsiella pneumoniae значится в списке IV группы патогенности (Приложение N° 1 «Классификация микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности» к Санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», в ред. Дополнений и изменений No 2, утвержденных Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29 июня 2011 г. Ne 86).  Information about the biological hazard (safety) of the strain: the species Klebsiella pneumoniae is listed in the pathogenicity group IV (Appendix N ° 1 "Classification of microorganisms - causative agents of human infectious diseases, protozoa, helminths and poisons of biological origin by pathogenicity groups" to the Sanitary and Epidemiological Rules SP 1.3 .2322-08 "Safety of work with microorganisms of the III - IV pathogenicity (danger) groups and pathogens of parasitic diseases", as amended by Supplements and amendments No. 2 approved by the Decree of the Main State shock sanitary doctor of the Russian Federation of June 29, 2011 Ne 86).
Другие сведения о патогенности или вирулентности штамма: штамм Klebsiella pneumoniae 1-17 является авирулентным, не токсигенным, не токсичным и безвредным.  Other information about the pathogenicity or virulence of the strain: the strain Klebsiella pneumoniae 1-17 is avirulent, non-toxigenic, non-toxic and harmless.
ХАРАКТЕРНЫЕ ПРИЗНАКИ:  CHARACTERISTIC SIGNS:
Обозначение штамма, присвоенное депозитором Klebsiella pneumoniae 1-17.  The strain designation assigned by the depositor Klebsiella pneumoniae 1-17.
Методы и результаты идентификации: масс-спектрометрия MALDI Biotyper (Score Value 2,561), VITEK 2 (Вероятность 98 %), секвенирование последовательности гена 16S -р РНК (99 %), полногеномное секвенирование. Морфологические признаки: грамотрицательные палочки размером 0,5-0, 9x 1, 0-1, 2 мкм, неподвижные, спор не образуют. Identification methods and results: MALDI Biotyper mass spectrometry (Score Value 2.561), VITEK 2 (98% probability), 16S-p RNA gene sequence sequencing (99%), genome-wide sequencing. Morphological signs: gram-negative rods of size 0.5-0, 9x 1, 0-1, 2 microns, motionless, do not form spores.
Культуральные особенности: на питательном агаре ГРМ JN° 1 (ФБУН ГНЦ ПМБ) образует гладкие, полупрозрачные, слизистые колонии, 3-4 мм в диаметре.  Cultural features: on nutrient agar, the timing belt JN ° 1 (FBUN SSC PMB) forms smooth, translucent, mucous colonies, 3-4 mm in diameter.
Биохимические свойства: VITEK 2 Systems: 06.01 (bioMerieux) (табл. 1).  Biochemical properties: VITEK 2 Systems: 06.01 (bioMerieux) (Table 1).
Таблица 1.  Table 1.
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0001
Вирулентность для лабораторных животных: ЛД50 для мышей линии BALB/с - ,2x 108КОЕ. Virulence for laboratory animals: LD50 for BALB / s mice -, 2x 10 8 CFU.
Устойчивость (чувствительность) к антибактериальным препаратам (табл. 2).  Resistance (sensitivity) to antibacterial drugs (table. 2).
Таблица 2.  Table 2.
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000009_0001
Генетические характеристики: сделано полногеномное секвенирование на платформе Illumina MiSeq. Количество полученных ридов - 2 087 324, количество проанализированных нуклеотидов - 469 180 422, количество контигов (программа SPAdes 3.11.1) - 531, общая длина полученных контигов 5 627 276 пар нуклеотидов, средняя глубина покрытия 88, GC состав 57,01 %. Genetic characteristics: genome-wide sequencing was performed on the Illumina MiSeq platform. The number of obtained reeds is 2 087 324, the number of analyzed nucleotides is 469 180 422, the number of contigs (SPAdes 3.11.1 program) is 531, the total length of the obtained contigs is 5 627 276 nucleotides, the average coating depth is 88, and the GC is 57.01%.
В сборке контигов определена последовательность гена 16Sp РНК и проанализирована в базе данных BLAST Nucleotide collection (nr/nt) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Гомология гена l6SpPHK исследуемого штамма с геном 16S рРНК референсного штамма Klebsiella pneumonia subsp. Pneumonia HS11286 (CP003200.1) составляет 99 % (1526/1527).  In the contig assembly, the 16Sp RNA gene sequence was determined and analyzed in the BLAST Nucleotide collection (nr / nt) database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Homology of the l6SpPHK gene of the studied strain with the 16S rRNA gene of the reference strain Klebsiella pneumonia subsp. Pneumonia HS11286 (CP003200.1) is 99% (1526/1527).
Последовательность участка гена 16Sp РНК штамма Klebsiella pneumonia 1-17 :  The sequence of the plot of the 16Sp RNA gene of the strain Klebsiella pneumonia 1-17:
AGGTGATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCAT AGGTGATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCAT
GAATCACAAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTGAATCACAAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACT
CCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATC
TACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGAC
ATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCAC
GTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTAGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTA
TCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGC
TCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGT
CTCACAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTGTGGATGTCAAGACCAGGTACTCACAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTGTGGATGTCAAGACCAGGTA
AGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAA
TTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGTTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCG
GAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGG
GTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGGCC
GCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACC
CCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTUDPTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATT
TCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTT
GCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAAC
GTCAATCGATGAGGTTATTAACCTTACGCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAGTCAATCGATGAGGTTATTAACCTTACGCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGA
AGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCC
ACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCA
GACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGG
GCACATCTGATGGCATGAGGCCCGAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTGCGACATTATGCGGTATGCACATCTGATGGCATGAGGCCCGAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTGCGACATTATGCGGTAT
TAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGT CCGCCGCTCGTCACCCGAGAGCAAGCTCTCTGTGCTACCGCTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGT CCGCCGCTCGTCACCCGAGAGCAAGCTCTCTGTGCTACCGCTCGACTTGCATGTGTTAGGCC
TGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCT TGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCT
Условия культивирования: плотная или жидкая питательная среда- ГРМ JNe 1, ГРМ- бульон, питательный агар или питательный бульон, 34°С, 24 часа; минеральная среда, в которую в качестве источника углерода вносят либо метанол, либо этанол, либо пропанол, 40°С, 36-48 часов. Cultivation conditions: dense or liquid nutrient medium - GRM JNe 1, GRM broth, nutrient agar or nutrient broth, 34 ° C, 24 hours; mineral medium into which either methanol or ethanol or propanol is added as a carbon source, 40 ° C, 36-48 hours.
Питательный агар, состав (в пересчете на 1 л готовой среды): гидролизат ферментативный белковый, сухой - 10,5 г; пептон ферментативный, сухой - 10,5 г; экстракт автолизированных дрожжей осветленный - 2,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; агар микробиологический - 12,0 г. Стерилизовать при температуре 121°С в течение 15 мин.  Nutrient agar, composition (in terms of 1 l of the finished medium): protein enzymatic hydrolyzate, dry - 10.5 g; peptone is enzymatic, dry - 10.5 g; clarified yeast extract - 2.0 g; sodium chloride - 5.0 g; microbiological agar - 12.0 g. Sterilize at a temperature of 121 ° C for 15 minutes.
Питательный бульон, состав (в пересчете на 1 л готовой среды): гидролизат фермативный белковый, сухой - 9,1 г; пептон ферментативный сухой - 9,9 г; экстракт автолизированных дрожжей осветленный - 4,7 г; натрий хлористый - 5,0 г; натрий углекислый - 0,3 г. Стерилизовать при температуре 121°С в течение 15 мин.  Nutrient broth, composition (in terms of 1 liter of the finished medium): protein hydrolyzate, dry - 9.1 g; dry peptone - 9.9 g; autolized yeast extract clarified - 4.7 g; sodium chloride - 5.0 g; sodium carbonate - 0.3 g. Sterilize at 121 ° C for 15 minutes.
ГРМ- А 1 (состав среды, г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 15,0, панкреатический гидролизат казеина - 10,0, дрожжевой экстракт - 2,0, натрия хлорид - 3,5, Д- глюкоза - 1,0, агар 10,0±2.  GRM-A 1 (medium composition, g / l): pancreatic hydrolyzate of fish meal - 15.0, pancreatic hydrolyzate of casein - 10.0, yeast extract - 2.0, sodium chloride - 3.5, D-glucose - 1, 0, agar 10.0 ± 2.
ГРМ - бульон (состав среды, г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 8,0, пептон сухой ферментативный - 8,0, натрия хлорид - 4,0.  Timing - broth (medium composition, g / l): pancreatic hydrolyzate of fish meal - 8.0, dry enzymatic peptone - 8.0, sodium chloride - 4.0.
Минеральная среда (состав среды, г/л): (KH4)2S04 - 0,52; MgSQt - 0,02; K2SO4 - 0,06; NH4H2PO4 - 1,53. Раствор микроэлементов (готовится отдельно) (г/л): ZnSC>4 - 0,43; MnSC>4 - 0,88; C11SO4 - 0,78; НзВОз - 0,4; Na2Mo04x2H20 - 0,25; C0SO4X7H2O - 0,25; FeS04x7H20 - 4,97. Mineral medium (composition of the medium, g / l): (KH4) 2S04 - 0.52; MgSQt - 0.02; K2SO4 0.06; NH4H2PO4 - 1.53. Microelement solution (prepared separately) (g / l): ZnSC> 4 - 0.43; MnSC> 4 - 0.88; C11SO4 0.78; Nzvoz - 0.4; Na 2 Mo0 4 x2H20 0.25; C0SO4X7H2O 0.25; FeS0 4 x7H20 - 4.97.
1 мл приготовленного раствора микроэлементов добавить на 1000 мл минеральной среды. Стерилизовать при температуре 121°С в течение 15 мин. pH доводят до 6.0-6, 2.  Add 1 ml of the prepared trace element solution per 1000 ml of mineral medium. Sterilize at 121 ° C for 15 minutes. The pH is adjusted to 6.0-6, 2.
В качестве субстрата (источника углерода и энергии) могут быть использованы - метанол (до 1,5 % об.), этанол (до 2 % об ), пропанол (до 1 % об.). Температура культивирования 40°С; аэробные условия.  Methanol (up to 1.5% vol.), Ethanol (up to 2% vol.), Propanol (up to 1% vol.) Can be used as a substrate (a source of carbon and energy). Cultivation temperature 40 ° C; aerobic conditions.
Условия хранения: штамм хранят на питательном агаре (при температуре 4±2°С), пересевы осуществляются 1 раз в 3 месяца, возможно хранение штамма в лиофильно высушенном состоянии, а также в жидком азоте.  Storage conditions: the strain is stored on nutrient agar (at a temperature of 4 ± 2 ° C), reseeding is carried out once every 3 months, it is possible to store the strain in freeze-dried state, as well as in liquid nitrogen.
Таким образом, для заявляемого штамма характерны: устойчивый продуктивный рост на средах различного состава; способность длительно сохранять активность в лиофилизированном состоянии; отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность. Штамм Klebsiella pneumoniae 1-17 используется в качестве компонента ассоциативной культуры метанокисляющих бактерий для промышленного получения кормовой биомассы на основе природного газа, а также в качестве сырья для глубокой переработки. Thus, the claimed strain is characterized by: sustainable productive growth on media of various compositions; the ability to long-term activity in the lyophilized state; lack of virulence, toxigenicity, toxicity and harmlessness. The strain Klebsiella pneumoniae 1-17 is used as a component of the associative culture of methane-oxidizing bacteria for the industrial production of feed biomass based on natural gas, as well as as a raw material for advanced processing.
Гетеротрофные бактерии Klebsiella pneumoniae 1-17 используют образующиеся продукты (метанол, этанол, пропанол) в качестве источника углерода, тем самым снимая ингибирующее действие на основной продуцент. Кроме того, гетеротроф может использовать белки, аминокислоты и полисахариды, выделяющиеся в процессе лизиса бактерий.  Heterotrophic bacteria Klebsiella pneumoniae 1-17 use the resulting products (methanol, ethanol, propanol) as a carbon source, thereby removing the inhibitory effect on the main producer. In addition, a heterotroph can use proteins, amino acids and polysaccharides released during the lysis of bacteria.
Метанокисляющие бактерии развиваются за счет метана природного газа, а другой компонент ассоциативной культуры - за счет продуктов соокисления гомологов метана в природном газе и за счет продуктов жизнедеятельности метанотрофа.  Methane-oxidizing bacteria develop due to natural gas methane, and another component of the associative culture - due to the products of the co-oxidation of methane homologs in natural gas and due to the metabolic products of methanotroph.
В процессе совместного выращивания их содержание независимо от величины засева находится на уровне, определяемом количеством используемых продуктов, образующихся в результате соокисления газообразных гомологов метана, находящихся в природном газе, так как на минеральной среде эти продукты являются единственным доступным источником углерода для не использующего метан компонента ассоциативной культуры. В результате такой саморегуляции культур в процессе выращивания начальное соотношение клеток культур в засевном материале не имеет существенного значения, но рекомендуется вносить не окисляющих метан микроорганизмов не менее 0, 1 % и не более 15 % от общего числа клеток. Отклонение от этих значений в ту или иную сторону может привести в первом случае к задержке развития метанокисляющих бактерий, а во втором к задержке роста гетеротрофных бактерий. В смеси с подобранными не использующими метан бактериями выход биомассы увеличивается в 3-5 раз по сравнению с чистой культурой метанокисляющих бактерий. Таким образом, добавление к метанокисляющим бактериям подобранных не использующих метан гетеротрофов, растущих за счет продуктов соокисления гомологов метана, может повысить выход биомассы на метане. Добавление не окисляющих метан гетеротрофных бактерий не влияет на качество биомассы, так как даже при введении в высокой концентрации гетеротрофов, не использующих метан, их содержание в растущей культуре ограничивается количеством доступного источника углерода, которым являются продукты соокисления гомологов метана, и обычно не превышает 1 -15 % от общего числа клеток.  In the process of co-cultivation, their content, regardless of the seeding size, is at a level determined by the amount of products used resulting from the co-oxidation of gaseous methane homologs in natural gas, since these products are the only available carbon source for the non-methane associative component on the mineral medium culture. As a result of such self-regulation of crops during the growing process, the initial ratio of culture cells in the inoculum is not significant, but it is recommended that microorganisms not oxidizing methane be added with at least 0, 1% and no more than 15% of the total number of cells. Deviation from these values in one direction or another can lead in the first case to a delay in the development of methane-oxidizing bacteria, and in the second to a delay in the growth of heterotrophic bacteria. In a mixture with selected methane-free bacteria, the biomass yield increases by 3-5 times compared with a pure culture of methane-oxidizing bacteria. Thus, the addition of selected methane-free heterotrophs to methane-oxidizing bacteria that grow due to the products of co-oxidation of methane homologs can increase the biomass yield on methane. The addition of heterotrophic bacteria that do not oxidize methane does not affect the quality of biomass, since even when heterotrophs that do not use methane are introduced in a high concentration, their content in a growing culture is limited by the amount of available carbon source, which is the products of the co-oxidation of methane homologs, and usually does not exceed 1 - 15% of the total number of cells.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.  The invention is illustrated by the following examples.
ПРИМЕР 1. Штамм Klebsiella pneumoniae 1-17 выращивают на жидкой минеральной среде, содержащей (г/л): (NH^SCF - 0,52; MgS04 - 0,02; K2SO4 - 0,06; NH4H2PO4 - 1,53. EXAMPLE 1. The strain Klebsiella pneumoniae 1-17 is grown on a liquid mineral medium containing (g / l): (NH ^ SCF - 0.52; MgS0 4 - 0.02; K2SO4 - 0.06; NH4H2PO4 - 1.53.
Среду стерилизуют при температуре 121°С в течение 15 мин.  The medium is sterilized at a temperature of 121 ° C for 15 minutes
Раствор микроэлементов (готовят и стерилизуют отдельно) (г/л): ZnS04 - 0,43; MnS04 - 0,88; CuS04 - 0,78; НзВОз - 0,4; КагМоС гНгО - 0,25; CoSC bM) - 0,25; FeSC IbO - 4,97. 1 мл приготовленного раствора микроэлементов добавляют на 1000 мл минеральной среды. pH доводят до 6.0-6, 2. В качестве субстрата (источника углерода и энергии) используют метанол - 1,0 %. Microelement solution (prepared and sterilized separately) (g / l): ZnS0 4 - 0.43; MnS0 4 - 0.88; CuS0 4 - 0.78; Nzvoz - 0.4; KagMoS gNgo - 0.25; CoSC bM) - 0.25; FeSC IbO - 4.97. 1 ml the prepared trace element solution is added per 1000 ml of mineral medium. The pH is adjusted to 6.0-6, 2. Methanol is used as a substrate (a source of carbon and energy) - 1.0%.
Культивирование штамма проводят в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0,3 -0,4 в термостатируемой качалке. Культивирование проводят в течение 48 ч при 34°С и pH 6,0. По окончании культивирования концентрация сухих веществ 8,2 г АСВ/л. Полученную культуру используют в качестве инокулята для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 10 л (рабочий объем 7 л) или в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем 28 л).  The cultivation of the strain is carried out periodically in flasks made of heat-resistant glass, a volume of 1 l with a fill factor of 0.3 -0.4 in a thermostatically controlled rocking chair. Cultivation is carried out for 48 hours at 34 ° C and pH 6.0. At the end of the cultivation, the solids concentration of 8.2 g of ASB / l. The resulting culture is used as an inoculum for the subsequent growth of bacteria in an automated fermentation complex with a volume of 10 l (working volume of 7 l) or in an ejection-type fermenter with a volume of 40 l (working volume of 28 l).
ПРИМЕР 2. Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но в качестве источника углерода и энергии используют этанол - 1,6 %. Физико-химические условия и время культивирования те же, концентрация сухих веществ - 10 г АСВ/л.  EXAMPLE 2. The cultivation of the strain is carried out similarly to Example 1, but ethanol is used as a source of carbon and energy - 1.6%. Physico-chemical conditions and time of cultivation are the same, the concentration of solids is 10 g of ASB / l.
ПРИМЕР 3. Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, но в качестве источника углерода и энергии используют пропанол - 0,5 %. Физико-химические условия и время культивирования те же, концентрация сухих веществ - 3,0 г АСВ/л.  EXAMPLE 3. The cultivation of the strain is carried out similarly to Example 1, but as a source of carbon and energy using propanol - 0.5%. Physico-chemical conditions and time of cultivation are the same, the concentration of solids is 3.0 g of ASB / l.
ПРИМЕР 4. Ассоциативную культуру, состоящую из метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС- 15 и гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17 выращивают в автоматизированном ферментационном комплексе объемом Ю л (рабочий объем 7 л) на минеральной среде следующего состава (г/л): НзРС 80%)- 17,2; K2SO4 - 5,0; MgS04 х7Н>0 - 4,0; FeS04x7H20 - 0,21; CuS04 - 0,78; MnS04 х4НгО - 0,38; ZnS04 х7Н - 0,06; НзВОз - 0,25; Na2Mo04x2H20 - 0,009; CoS04x7H20 - 0,0095. EXAMPLE 4. An associative culture consisting of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 and heterotrophic bacteria Klebsiella pneumonia 1-17 is grown in an automated fermentation complex with a volume of 10 L (working volume 7 l) on a mineral medium of the following composition (g / l): NzRS 80 %) - 17.2; K2SO 4 - 5.0; MgS0 4 x 7H > 0 - 4.0; FeS0 4 x7H20 - 0.21; CuS0 4 - 0.78; MnS0 4 x 4 NgO - 0.38; ZnS0 4 x 7H - 0.06; Nzvoz - 0.25; Na 2 Mo0 4 x2H 2 0 - 0.009; CoS0 4 x7H 2 0 - 0.0095.
В качестве источника азота и титрующего агента подают аммиачную воду. Процесс ведут при температуре 40-45°С, pH 5,4-5, 8 и непрерывной подаче газовой смеси, содержащей метан и кислород. При достижении концентрации биомассы 9 г АСВ/л переходят на непрерывный процесс культивирования с коэффициентом разбавления среды D=0,25 ч 1. Доминирование метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС- 15 составляло 93 % при концентрации биомассы 18,5 г АСВ/л. Ammonia water is supplied as a source of nitrogen and titrating agent. The process is carried out at a temperature of 40-45 ° C, pH 5.4-5, 8 and a continuous supply of a gas mixture containing methane and oxygen. Upon reaching a biomass concentration of 9 g ASB / l, they switch to a continuous cultivation process with a dilution factor of the medium D = 0.25 h 1 . The dominance of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 was 93% at a biomass concentration of 18.5 g ASV / L.
ПРИМЕР 5. Ассоциативную культуру, состоящую из метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС -15 и гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17 выращивают в ферментере эжекционного типа объемом 40 л (рабочий объем 28 л) на минеральной среде следующего состава (г/л):НзР04 (80 %)- 17,2; K2SO4 - 5,0; MgS04 х7НгО - 4,0; FeS04 x7H20 - 0,21; CuS04 - 0,78; MnS04 х4ШЭ - 0,38; ZnS04 c7H20 - 0,06; НзВОз - 0,25; Na2Mo04x2H20 - 0,009; CoS04x7H20 - 0,0095. EXAMPLE 5. An associative culture consisting of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 and heterotrophic bacteria Klebsiella pneumonia 1-17 is grown in an ejection-type fermenter with a volume of 40 l (working volume 28 l) on a mineral medium of the following composition (g / l): НзР0 4 (80%) - 17.2; K2SO4 - 5.0; MgS0 4 x7NgO - 4.0; FeS0 4 x 7H20 - 0.21; CuS0 4 - 0.78; MnS0 4 х4ШЭ - 0.38; ZnS0 4 c 7H 2 0 - 0.06; Nzvoz - 0.25; Na 2 Mo0 4 x2H 2 0 - 0.009; CoS0 4 x7H 2 0 - 0.0095.
В качестве источника азота и титрующего агента подают аммиачную воду. Процесс ведут при температуре 41-45°С, pH 5,4-5, 7 и непрерывной подаче газовой смеси, содержащей метан и кислород. При достижении концентрации биомассы 9-10 г АСВ/л осуществляют постепенное повышение давления до 0,8 МПа. С увеличением давления постепенно увеличивают подачу газообразных источников питания микроорганизмов. При этом показатели процесса были следующими: D=0,30 ч 1, концентрация биомассы 37 г АСВ/л, доминирование метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 93%. Ammonia water is supplied as a source of nitrogen and titrating agent. The process is carried out at a temperature of 41-45 ° C, pH 5.4-5, 7 and a continuous supply of a gas mixture containing methane and oxygen. Upon reaching a biomass concentration of 9-10 g ASB / l, a gradual increase in pressure to 0.8 MPa is carried out. With increasing pressure, the supply of gaseous microbial power sources is gradually increased. The process indicators were as follows: D = 0.30 h 1 , biomass concentration of 37 g ASV / l, the dominance of methane-oxidizing bacteria Methylococcus capsulatus GBS-15 93%.

Claims

ФОРМУЛА FORMULA
Штамм гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - ОБОЛЕНСК» под регистрационным номером В-8465, в качестве компонента ассоциативной культуры метанокисляюгцих бактерий для получения микробной белковой массы. The strain of heterotrophic bacteria Klebsiella pneumonia 1-17, deposited in the State collection of pathogenic microorganisms and cell cultures "GKPM - OBOLENSK" under registration number B-8465, as a component of the associative culture of methane-oxidizing bacteria to obtain microbial protein mass.
PCT/RU2019/050163 2018-10-11 2019-10-01 Klebsiella pneumonia strain for producing microbial biomass WO2020076191A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018136037A RU2687137C1 (en) 2018-10-11 2018-10-11 Strain of heterotrophic bacteria klebsiella pneumonia is an associate for producing a microbial protein mass
RU2018136037 2018-10-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020076191A1 true WO2020076191A1 (en) 2020-04-16

Family

ID=66430660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/050163 WO2020076191A1 (en) 2018-10-11 2019-10-01 Klebsiella pneumonia strain for producing microbial biomass

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JP2020058339A (en)
EA (1) EA037039B1 (en)
RU (1) RU2687137C1 (en)
WO (1) WO2020076191A1 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2717991C1 (en) * 2019-07-22 2020-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ"ООО " ГИПРОБИОСИНТЕЗ" Protein feed supplement for farm animals and fish
RU2720121C1 (en) * 2019-10-29 2020-04-24 Ооо "Гипробиосинтез" Method of producing microbial protein based on hydrocarbon material

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1788965A3 (en) * 1991-03-26 1993-01-15 Poctobckий-Ha-Дohу Haучho-Иccлeдobateльckий Иhctиtуt Эпидemиoлoгии, Mиkpoбиoлoгии, Пapaзиtoлoгии И Гигиehы Strain of bacteria klebsiella pneumonia usable for lipopolysaccharide preparation
RU2083663C1 (en) * 1994-05-19 1997-07-10 Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии STRAIN OF BACTERIUM KLEBSIELLA PNEUMONIAE-232 - A PRODUCER OF β --HEMOLYSIN
RU2221864C2 (en) * 2002-02-07 2004-01-20 Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина Bacterium strain klebsiella pneumoniae deposited in vgnki at = 23 mgavmib-dep for producing vaccine against klebsiellosis in agriculture young stock

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5221591B2 (en) * 1973-12-26 1977-06-11
FR2729969B1 (en) * 1995-01-26 1997-04-18 Bieurope NEW STRAIN OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE, SUBSP. PNEUMONIAE AND PROCESS FOR PRODUCING L-FUCOSE-CONTAINING POLYSACCHARIDE
CN104774792B (en) * 2015-04-13 2017-12-19 中国科学院天津工业生物技术研究所 The Methyldmonas of one plant of enduring high-concentration methanol and its application

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1788965A3 (en) * 1991-03-26 1993-01-15 Poctobckий-Ha-Дohу Haучho-Иccлeдobateльckий Иhctиtуt Эпидemиoлoгии, Mиkpoбиoлoгии, Пapaзиtoлoгии И Гигиehы Strain of bacteria klebsiella pneumonia usable for lipopolysaccharide preparation
RU2083663C1 (en) * 1994-05-19 1997-07-10 Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии STRAIN OF BACTERIUM KLEBSIELLA PNEUMONIAE-232 - A PRODUCER OF β --HEMOLYSIN
RU2221864C2 (en) * 2002-02-07 2004-01-20 Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина Bacterium strain klebsiella pneumoniae deposited in vgnki at = 23 mgavmib-dep for producing vaccine against klebsiellosis in agriculture young stock

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020058339A (en) 2020-04-16
RU2687137C1 (en) 2019-05-07
EA037039B1 (en) 2021-01-29
EA201900129A1 (en) 2020-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2613365C1 (en) Strain of methane-oxidizing bacteria methylococcus capsulatus gbs-15 for obtaining of microbial protein mass
Khamna et al. L-asparaginase production by actinomycetes isolated from some Thai medicinal plant rhizosphere soils
CN113549578B (en) Bacillus siamensis BsNlG13 for inhibiting Pyricularia oryzae and promoting seed germination and application thereof
WO2020076190A1 (en) Stenotrophomonas acidaminiphila strain for producing microbial biomass
CN113846039A (en) Bacillus belgii and application thereof
WO2020076191A1 (en) Klebsiella pneumonia strain for producing microbial biomass
RU2687135C1 (en) Strain of heterotrophic bacteria cupriavidus gilardii - associate for producing microbial protein mass
CN109988728B (en) Endophytic actinomycete CR22 and application thereof
RU2745093C1 (en) Methylococcus capsulatus bf 19-07 methane-oxidizing bacteria strain - producer for obtaining microbial protein mass
CN106834165B (en) Paracoccus capable of degrading penicillin, cell fraction and composition thereof
CN113801804B (en) Banana wilt biocontrol antagonistic strain and application thereof
CN112195137B (en) Bacillus belgii for antagonizing magnaporthe grisea and producing gamma-polyglutamic acid and application thereof
CN115927234A (en) application of amt gene and mutant M107 in expression of azotobacter siderophin
CN109554321B (en) Genetically engineered bacterium for high-yield lipopeptide and application thereof
CN113817653A (en) Pseudomonas fluorescens BsEB-1 and application thereof
Iftikhar et al. Isolation, identification of an axenic fungal isolate of aspergillus sp.(mbl-1511) and its subsequent improvement for enhanced extracellular lipolytic potential through monoculture fermentation
CN115927043B (en) Pseudomonas palehrli Long Nishi strain ZJUCS1001 and application thereof
CN108441437A (en) A kind of composite bacteria agent and its application
RU2808127C1 (en) Bacteria strain methylobacillus methanolivorans gsa, producer of feed protein
CN116083321B (en) Bacillus pumilus F1-3 and application thereof in plant virus control
RU2773502C1 (en) Strain of methanol-oxidizing bacteria acidomonas methanolica bf 21-05m is a producer for obtaining microbial protein mass
Ghasemi et al. In Vitro antagonistic and biodegradation activity of a newly isolated Delftia tsuruhatensis from rice plant in Iran
Kaziūnienė et al. Paenibacillus Polymyxa MVY-024: Plant Growth Promoting Bacteria Which is Easy to Apply on an Industrial Scale
CN106834161B (en) Bacillus subtilis Z12 and application thereof
Pande et al. Endophytes of Finger Millet (Eleusine coracana Gaertn. L.)

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19870540

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19870540

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1