WO2020075938A1 - 다공성 이중 유동 채널, 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이들의 제조 방법 - Google Patents

다공성 이중 유동 채널, 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이들의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다공성 이중 유동 채널, 3차원 간 체외모델 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 다공성 이중 유동 채널은 생체 유체 물성 및 유동 연구, 마이크로 유체 시스템 설계 및 응용기술 개발, 진료용 의료기기 및 바이오 칩의 설계 등의 다양한 연구에 적용이 가능하다. 또한, 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 하부 담관 채널, 간세포, 및 상부 혈관 채널을 포함하는 이중 유동 채널을 구비하여, 실제 간 생체 구조와 매우 근접한 간 조직 모사 구조를 가지므로, 높은 신뢰도로 간 독성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

다공성 이중 유동 채널, 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이들의 제조 방법
본 발명은 다공성 이중 유동 채널, 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
바이오 미세 유체 공학은 최근 대두 되고 있는 기술 분야 중 하나이다. 바이오 미세 유체 공학을 이용하면 다양한 분야의 연구가 가능한데, 예를 들어, 생체 유체 물성 및 유동 연구, 마이크로 유체 시스템 설계 및 응용기술 개발, 진료용 의료기기 및 바이오칩의 설계 등에 적용이 가능하다. 미세 유체를 이용하기 위해서는 수십 내지 수백 마이크로 사이즈를 가지는 유동 채널을 제작하여야 하는데, 이러한 크기의 유동 채널을 제작하기 위한 다양한 플랫폼 기술들이 연구되고 있다. 예를 들어, 미세 유동 채널은 주로 멤스 (Microelectromechanical systems, MEMS) 및 PDMS (Polydimethylsiloxane) 몰딩 과정 통하여 제작되고 있다.
단일 층을 가지는 유동 채널 뿐만 아니라, 다양한 분석 및 생물학적 모방을 위해서는 다공성 이중 유동 채널이 필요한 경우들이 존재한다. 그러나, 현재 까지 개발된 방법으로는 이중 유동 채널을 제작하는 데에 있어 몇몇 한계점들이 존재한다. 다공성 이중 유동 채널을 만드는데 있어 여러 공정 과정들이 필요하다. 실제로 바이오 멤스(Bio MEMS) 기술을 이용하여 다공성 이중 유동 채널을 제작하기 위해서는 다공성 멤브레인 제작, 멤스(MEMS)를 통한 유동 채널의 제작 및 이들의 결합 공정들이 필요하다.
3차원 바이오 프린팅 기술은 최근 바이오 엔지니어링 분야에서 대두되고 있는 혁신적인 기술 중 하나이다. 3차원 바이오 프린팅 기술은 폴리머(polymer), 다양한 세포외기질 성분(Extracellular matrix, ECM) 및 세포들을 원하는 위치에 분사시켜 복잡한 3차원 구조물을 만들 수 있다는 점에서 큰 이점을 가진다.
신약 개발에 있어서 간 독성 평가는 매우 중요한 부분이다. 이는 대부분의 약물이 간을 거쳐 해로운 물질들을 해독되는 과정을 거치기 때문이다. 실제로, 어떤 다른 조직에서 약물 독성이 없다는 것이 밝혀지더라도, 간 독성에 문제가 되어 사용할 수 없는 약물들이 매우 많은 것으로 알려져 있다. 따라서, 약물의 간 독성 평가는 신약 개발 과정에서 필수적인 과정이라 할 수 있다. 이러한 간 독성을 확인하기 위하여 다양한 플랫폼들이 이용되고 있다. 예를 들어, 2차원 세포 플랫폼, 3차원 세포 플랫폼, 장기 칩 플랫폼 등이 존재한다. 다양한 플랫폼들이 간 독성 테스트를 위한 플랫폼으로 이용되고 있으나, 간 조직을 완전하게 모사하는 플랫폼들은 전무하다. 완전한 간 조직 플랫폼을 위해서는, (i) 간세포의 3차원 배양, (ii) 간세포 이외의 혈관 세포 및 담관 세포 등이 필요하며, (iii) 간세포에서 만들어지는 담즙(Bile acid)을 제거할 수 있어야 한다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명자들은 바이오 미세 유체 공학에 유용하게 사용될 수 있는 이중 유동 채널(dual fluidic channel) 및 생체 환경을 매우 유사하게 모사하는 3차원 간 체외 모델 플랫폼을 제작하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 폴리머 및 하이드로젤를 사용한 3차원 프린팅 기술을 이용하여, 원하는 기능을 갖는 다공성 이중 유동 채널을 간편한 공정을 통해 저비용으로 제작할 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 또한, 상기 3차원 프린팅 기술을 이용하여 담관 시스템이 포함된 3차원 간의 체외모델을 성공적으로 제작하여, 이 모델의 우수한 기능을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 다공성 이중 유동 채널을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 다공성 이중 유동 채널을 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 3차원 간 체외 모델을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 3차원 간 체외 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면,
폴리머로 제조된 제1 유동 채널;
상기 제1 유동 채널 상부에 위치하며, 폴리머로 제조된 미세기공 구조(micro porous structure);
상기 미세기공 구조 상부에 위치하는 다공성 하이드로젤; 및
상기 다공성 하이드로젤 상부에 위치하며, 폴리머로 제조된 제2 유동 채널;을 포함하는 다공성 이중 유동 채널을 제공한다.
본 발명의 다공성 이중 유동채널에서 상기 "다공성" 은 상기 미세 기공 구조에서의 "다공성"과, 다공성 하이드로젤의 "다공성"을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 유동 채널의 너비는 2 mm 이하이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 미세기공 구조에서 미세기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하이고, 상기 미세 기공의 두께는 700 ㎛ 이하이다.
상기 미세기공의 길이 방향의 크기는 700 ㎛ 이하이고, 보다 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 10 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하이다. 또한, 상기 미세기공의 두께(폭)은 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 500 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 - 400 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 1 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하, 가장 구체적으로는 5 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 폴리머는 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 3차원 프린팅된 하이드로젤의 강도는 가교 이후 평균 저장 탄성율(storage modulus)가 106.9±6.3 Pa 값 이상이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 하이드로젤은 폴리비닐알코올, 녹말, 셀룰로오스, 젤라틴, 폴리에틸렌, 아가로즈, 키토산, 구아검(guar gum), 젤란검(gellan gum), 글리콜키토산, 알지네이트(Alginate), 히드록삼산 알지네이트(Hydroxamated alginates), 알지네이트 비드(Allginate bead), 피브린(fibrin), 스크렐로글루칸(Scleroglucan), 폴리(아크릴릭-co-비닐술폰닉)산, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴아미드/구아검 그래프트 코폴리머, 세포, 조직탈세포화 바이오 조성물 및 세포외기질으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 물질이며, 상기 세포외기질은 히알루론산, 콜라젠, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 케라탄설페이트을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 하이드로젤은 세포, 콜라젠, 글리코사미노클리칸, 라미닌, 히알루론산, 피브로넥틴, 알지네이트, 피브린 또는 젤라틴일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 다공성 이중 유동 채널은 3차원 프린터를 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면,
(a) 폴리머를 사용하여 제1 유동 채널을 형성하는 단계;
(b) 상기 제1 유동 채널 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공 구조를 형성하는 단계;
(c) 상기 미세기공 구조 상부에 다공성 하이드로젤을 형성하는 단계; 및
(d) 상기 다공성 하이드로젤 상부에 폴리머를 사용하여 제2 유동 채널을 형성하는 단계;를 포함하는 다공성 이중 유동 채널을 제조하는 방법을 제공한다.
이하에서, 본 발명의 제조방법을 각 단계에 따라 상세히 설명한다.
단계 (a): 폴리머를 사용하여 제1 유동 채널을 형성하는 단계
일 구현예 따르면, 본 발명에서 제1 유동 채널의 형성은 3차원 프린터를 사용한 3차원 프린팅(3D printing) 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "3차원 프린터"는 밀링 또는 절삭이 아닌, 기존 잉크젯 프린터에서 쓰이는 것과 유사한 적층 방식으로 입체물을 제작하는 장치를 말하며, 일반적으로 컴퓨터로 제어되기 때문에 만들 수 있는 형태가 다양하고, 다른 제조 기술에 비해 사용하기 쉬운 이점이 있다.
본 명세서에서 용어 "3차원 프린팅"은 상기 3차원 프린터를 사용하여 연속적인 계층의 물질을 뿌리면서 3차원 물체를 만들어내는 제조 기술을 의미한다. 3차원 프린팅 기술은 가루나 액체 형태의 재료를 굳혀가며 한 층씩 쌓는 방식의 "적층제조" 방식과, 재료를 공구로 깎아가며 모양을 만드는 "절삭제조" 방식으로 나누어진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 3차원 프린팅 방식은 적층제조 방식이다.
본 명세서에서 용어 "유동 채널(fluidic channel)" 은 유체가 흐를 수 있는 구조를 갖는 채널을 의미한다.
상기 제1 유동 채널의 모양이나 크기는 특별히 한정되지 않으나, 수 ㎛ 내지 수십 ㎝의 크기의 범위를 가질 수 있으며, 유체가 흐를 수 있는 관(tube) 형상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 유동 채널의 너비는 2 mm 이하이며, 구체적으로는 0.01 mm 이상 - 2 mm 이하이고, 보다 구체적으로는 0.1 mm 이상 - 2 mm 이하이다. 상기 제1의 유동 채널의 너비가 2 mm를 초과할 경우, 미세 유동 채널의 형상이 유지되기 어렵고, 제1 유동 채널 상부에 미세기공 구조를 3차원 프린팅 하는 것이 어렵게 된다.
본 발명에서 제1 유동 채널 제조시에 사용되는 재료 물질은 폴리머 물질이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 유동 채널 제조에 사용되는 폴리머 물질은 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(Poly(ethylene-co-vinyl acetate), PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단계 (b): 상기 제1 유동 채널 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공 구조를 형성하는 단계
제1 유동채널을 형성한 후, 상기 제1 유동채널의 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공을 갖는 구조(microporous structure)를 형성한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 미세기공 구조(microporous structure)의 형성은 3차원 프린터를 사용한 3차원 프린팅 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 미세기공 구조에서 미세 기공의 길이 방향의 크기는 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 10 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하이다.
또한, 상기 미세 기공의 두께(폭)은 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 500 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 - 400 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 1 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하, 가장 구체적으로는 5 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하이다.
상기 미세기공은 미세기공을 갖는 구조 상부에, 후술하는 바와 같이 하이드로젤을 프린팅하는 경우, 하이드로젤을 지지할 수 있은 지지대 역할을 한다.
일 구현예에 따르면, 3차원 프린팅 기술을 통해 상기 미세기공을 제조하는 경우, 형성하고자 하는 미세기공의 모양과 크기 등을 먼저 디자인한 후, 상기 디자인한 미세기공을 3차원 프린팅 기술을 통해 제조할 수 있다. 상기 미세기공의 모양과 크기는 3차원 프린팅 조건, 예컨대 노즐 사이즈 또는 프린팅 속도를 조절하거나 변경하여 결정할 수 있다.
본 발명에서 미세기공을 갖는 구조를 3차원 프린팅 기술을 이용하여 형성할 때에 프린팅에 사용되는 재료 물질은 폴리머 물질이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미세기공 구조 제조에 사용되는 폴리머는 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(Poly(ethylene-co-vinyl acetate), PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단계 (c): 상기 미세기공 구조 상부에 다공성 하이드로젤을 형성하는 단계
상기 단계 (b)에서 제조한 미세기공을 갖는 구조의 상부에 다공성 하이드로젤을 형성한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 다공성 하이드로젤의 형성은 3차원 프린터를 사용한 3차원 프린팅 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "하이드로젤(hydrogel)"은 폴리머 재료로서 이의 가교된 3차원적 네트워크 구조내에 다량의 물을 보유할 수 있는 친수성 구조를 갖는 물질을 의미한다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 하이드로젤 물질은 그 유래 원천상 천연의 물질이거나 합성 물질일 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 하이드로젤 물질은 예를 들어 폴리비닐알코올, 녹말, 셀룰로오스, 젤라틴, 폴리에틸렌, 아가로즈, 키토산, 구아검(guar gum), 젤란검(gellan gum), 글리콜키토산, 알지네이트(Alginate), 히드록삼산 알지네이트(Hydroxamated alginates), 알지네이트 비드(Allginate bead), 피브린(fibrin), 스크렐로글루칸(Scleroglucan), 폴리(아크릴릭-co-비닐술폰닉)산, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴아미드/구아검 그래프트 코폴리머, 세포, 조직탈세포화 바이오 조성물 및 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 세포외기질(ECM)은 히알루론산(Hyaluronic acid), 콜라젠(Collagen), 젤라틴(Gelatin), 엘라스틴(Elastin), 피브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin), 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans), 헤파란설페이트(Heparan sulfate), 콘드로이틴설페이트(Chondroitin sulfate), 케라탄설페이트(Keratan sulfate)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 세포는 뼈세포, 연골세포, 신경세포, 피부세포, 상피세포, 내피세포, 근육세포, 분비세포, 지방세포, 혈구세포, 간세포, 또는 혈관세포 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 하이드로젤 물질은 세포, 콜라젠, 글리코사미노클리칸, 라미닌, 히알루론산, 피브로넥틴, 알지네이트, 피브린 또는 젤라틴일 수 있다.
본 발명에서 상기 다공성 하이드로젤의 강도는 다공성 이중 유동 채널에서 안정한 이중 유동 흐름 유지를 위해서 매우 중요하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 형성된 다공성 하이드로젤의 강도는 가교 이후 평균 저장 탄성율(storage modulus)이 106.9±6.3 Pa 값 이상일 수 있다.
상기 다공성 하이드로젤의 강도가 가교 이후 평균 저장 탄성율(storage modulus)이 106.9±6.3 Pa 값 미만인 경우 다공성 이중 유동 채널에서 이중 유동 흐름이 안정하게 유지되기 어렵다.
단계 (d): 상기 다공성 하이드로젤 상부에 폴리머를 사용하여 제2 유동 채널을 형성하는 단계
상기 단계 (c)에서 프린팅한 다공성 하이드로젤 상부에 폴리머를 사용하여 제2 유동 채널을 형성한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 제2 유동 채널의 형성은 3차원 프린터를 사용한 3차원 프린팅 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 제2 유동 채널의 모양이나 크기는 특별히 한정되지 않으나, 수 ㎛ 내지 수십 ㎝의 크기의 범위를 가질 수 있으며, 유체가 흐를 수 있는 관(tube) 형상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2 유동 채널의 너비는 2 mm 이하이며, 구체적으로는 0.01 mm 이상 - 2 mm 이하이고, 보다 구체적으로는 0.1 mm 이상 - 2 mm 이하이다. 상기 제1의 유동 채널의 너비가 2 mm를 초과할 경우, 미세 유동 채널의 형상이 유지되기 어렵고, 제1 유동 채널 상부에 미세기공 구조를 3차원 프린팅 하는 것이 어렵게 된다.
본 발명에서 제2 유동 채널 제조시에 사용되는 재료 물질은 폴리머 물질이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제2 유동 채널 제조에 사용되는 폴리머 물질은 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(Poly(ethylene-co-vinyl acetate), PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면,
폴리머로 제조된 하부 담관 채널(lower biliary channel);
상기 하부 담관 채널 상부에 위치하며, 폴리머로 제조된 미세기공 구조(micro porous structure);
상기 미세기공 구조 상부에 위치하며, 간 전구 세포를 포함하는 바이오 조성물로 제조된 간 조직 모사 구조;
상기 간 조직 모사 구조 상부에 위치하며, 폴리머로 제조된 상부 혈관 채널(upper vascular channel); 및
상기 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 위치하며, 내피 세포(endothelial cell)를 포함하는 바이오 조성물로 제조된 내피 세포층;을 포함하는 3차원 간 체외모델을 제공한다.
본 발명의 3차원 간 체외모델은 하부 담관 채널; 그 상부에 간 조직 모사 구조; 및 상부 혈관 채널을 구비함으로써, 이중 유동 채널 구조를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 3차원 간 체외모델은 3차원 프린터를 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 하부 담관 채널의 너비는 2 mm 이하인 3차원 간 체외모델을 제공한다. 구체적으로, 상기 하부 담관 채널의 너비는 0.01 mm 이상 - 2 mm 이하이고, 보다 구체적으로는 0.1 mm 이상 - 2 mm 이하이다. 상기 하부 담관 채널의 너비가 2 mm를 초과할 경우, 하부 담관채널의 형상이 유지되기 어렵고, 하부 담관 채널 상부에 미세 기공을 가지는 구조를 형성하는 것이 어렵게 된다.
상기 미세기공구조에서 미세기공은 미세기공을 갖는 구조 상부에 바이오 조성물을 사용하여 간 조직 모사 구조를 형성하는 경우 이를 지지할 수 있은 지지대 역할을 한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 미세기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하이고, 상기 미세 기공의 두께(폭)은 700 ㎛ 이하이다.
상기 미세기공의 길이 방향의 크기는 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 10 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하이다. 또한, 상기 미세기공의 두께(폭)은 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 500 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 - 400 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 1 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하, 가장 구체적으로는 5 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 폴리머는 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 간 전구세포는 간세포(hepatocyte), 또는 간세포 및 간 담관 상피 세포(liver biliary epithelial cell)로 분화 가능한 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 간 전구세포는 1차 간세포, 냉동보존된 1차 간세포, iPSC-유도된 간세포, 줄기세포로부터 유도된 간세포, HepG2 간세포, HepaRG 간세포, Hepg2/C3A 간세포, Huh-7 간세포, 또는 이들로부터 유도된 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 내피 세포는 1차 인간 내피 세포(primary human endothelial cell), 냉동보존된 1차 인간 내피 세포, HUVEC 세포, 간 시누소이드(liver sinusoid) 내피 세포, iPSC-유도된 내피 세포, 줄기세포 유도된 내피 세포, TMNK-1 세포, 또는 TRP3 세포일 수 있다.
상기 내피 세포(endothelial cell)를 포함하는 바이오 조성물은 다음의 세포를 추가로 포함할 수 있다:
(i) 쿠퍼 세포(Kupffer cell): 생(fresh) 1차 쿠퍼 세포, 동결보존된 1차 쿠퍼 세포, 줄기세포 유도된 쿠퍼 세포, 또는 쿠퍼 세포주.
(ii) 간성상 세포(Hepatic Stellate cell): 1차 생(fresh) 간성상 세포, 1차 동결보존된 간성상 세포, 줄기세포 유도된 간성상 세포, 또는 간성상 세포주(LX1 세포, LX2 세포, TWNT-1 세포, LI90 세포).
(iii) 담관 상피세포(cholangiocyte): 생(fresh) 1차 담관 상피세포, 동결보존된 1차 담관 상피세포, 줄기세포 유도된 담관 상피세포, 담관 상피세포주(H69 세포).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 바이오 조성물은 히알루론산, 콜라젠, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 케라탄설페이트, 피브린, 또는 알지네이트-기반 바이오 조성물 또는 간 탈세포화 세포외기질-기반 바이오 조성물, 또는 혈관 탈세포화 세포외기질-기반 바이오 조성물일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면,
(a´) 폴리머를 사용하여 하부 담관 채널(lower biliary channel)을 형성하는 단계;
(b´) 상기 하부 담관 채널 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공 구조(micro porous structure)를 형성하는 단계;
(c´) 상기 미세기공 구조 상부에 간 전구세포(liver progenitor cell)를 포함하는 바이오 조성물을 사용하여 간 조직 모사 구조를 형성하는 단계;
(d´) 상기 간 조직 모사 구조 상부에 폴리머를 사용하여 상부 혈관 채널(upper vascular channel)을 형성하는 단계; 및
(e´) 상기 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포(endothelial cell)을 포함하는 바이오 조성물을 사용하여 내피 세포층을 형성하는 단계;를 포함하는 3차원 간(liver) 체외모델을 제조하는 방법을 제공한다.
이하에서, 본 발명을 각 단계 별로 나누어 상세히 설명한다.
단계 (a´): 폴리머를 사용하여 하부 담관 채널을 형성하는 단계
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 하부 담관 채널의 형성은 3차원 프린터를 사용한 3차원 프린팅(3D printing) 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "3차원 프린터"는 밀링 또는 절삭이 아닌, 기존 잉크젯 프린터에서 쓰이는 것과 유사한 적층 방식으로 입체물로 제작하는 장치를 의미하며, 일반적으로 컴퓨터로 제어되기 때문에 만들 수 있는 형태가 다양하고, 다른 제조 기술에 비해 사용하기 쉬운 이점이 있다.
본 명세서에서 용어 "3차원 프린팅"은 3차원 프린터를 사용하여 연속적인 계층의 물질을 뿌리면서 3차원 물체를 만들어내는 제조 기술을 의미한다. 3차원 프린팅 기술은 가루나 액체 형태의 재료를 굳혀가며 한 층씩 쌓는 방식의 "적층제조" 방식과, 재료를 공구로 깎아가며 모양을 만드는 "절삭제조" 방식으로 나누어진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 3차원 프린팅 방식은 적층제조 방식이다.
본 발명에서 하부 담관 채널 제조시에 사용되는 재료 물질은 폴리머 물질이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 하부 담관 채널 제조에 사용되는 폴리머 물질은 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(Poly(ethylene-co-vinyl acetate), PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "하부 담관 채널(lower biliary channel)"은 본 발명의 3차원 간 체외 모델에서 간세포(hepatocyte)들이 분비하는 담즙산(bile acid) 및/또는 노폐물(waste product)들이 흘러 배출될 수 있는 관(tube)으로서의 역할을 하는 채널을 의미한다.
상기 하부 담관 채널의 모양이나 크기는 특별히 한정되지 않으나, 수 ㎛ 내지 수십 ㎝의 크기의 범위를 가질 수 있으며, 유체가 흐를 수 있는 관(tube) 형상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 하부 담관 채널의 너비는 2 mm 이하이며, 구체적으로는 0.01 mm 이상 - 2 mm 이하이고, 보다 구체적으로는 0.1 mm 이상 - 2 mm 이하이다. 상기 하부 담관 채널의 너비가 2 mm를 초과할 경우, 하부 담관채널의 형상이 유지되기 어렵고, 하부 담관 채널 상부에 미세기공 구조를 형성하는 것이 어렵게 된다.
단계 (b´): 상기 하부 담관 채널 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공 구조를 형성하는 단계
하부 담관 채널을 형성한 후, 상기 하부 담관 채널의 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공을 갖는 구조를 형성한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 미세기공 구조(microporous structure)의 형성은 3차원 프린터를 사용한 3차원 프린팅 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 미세기공의 길이 방향의 크기는 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 10 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하이다.
또한, 상기 미세기공의 두께(폭)은 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 - 500 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 - 400 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 - 700 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 1 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하, 가장 구체적으로는 5 ㎛ 이상 - 200 ㎛ 이하이다.
상기 미세기공은, 미세기공을 갖는 구조 상부에, 후술하는 바와 같이 세포를 포함하는 하이드로젤 바이오 조성물을 사용하여 간 조직 모사 구조를 형성하는 경우, 상기 하이드로젤로 이루어지는 간 조직 모사 구조를 지지하는 지지대 역할을 한다.
일 구현예에 따르면, 3차원 프린팅 기술을 통해 상기 미세기공을 제조하는 경우, 형성하고자 하는 미세기공의 모양과 크기 등을 먼저 디자인한 후, 상기 디자인한 미세기공을 3차원 프린팅 기술을 통해 제조할 수 있다. 상기 미세기공의 모양과 크기는 3차원 프린팅 조건, 예컨대 노즐 사이즈 또는 프린팅 속도를 조절하거나 변경하여 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미세기공 구조 형성에 사용되는 폴리머 물질은 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(Poly(ethylene-co-vinyl acetate), PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단계 (c´): 상기 미세기공 구조 상부에 간 전구세포를 포함하는 바이오 조성물을 사용하여 간 조직 모사 구조를 형성하는 단계
미세기공 구조를 형성한 후, 상기 미세기공 구조 상부에 간 전구 세포를 포함하는 바이오 조성물을 사용하여 간 조직 모사 구조를 형성한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 간 조직 모사 구조의 형성은 3차원 프린팅 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 상기 용어 "간 조직 모사 구조"는 체외에서 실제 간 조직의 기능을 최대한 모사할 수 있도록 제조된 구조를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 "간 조직 모사 구조"는 간세포를 포함할 수 있으며, 추가적으로 담관 세포를 포함할 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 "간 전구세포"는 간세포(hepatocyte)로 분화될 수 있는 세포, 또는 간세포 및 담관 상피 세포로 분화 가능한 세포를 포함한다.
본 발명에서 상기 "간 전구세포"는 예를 들어 1차 간세포(primary hepatocyte), 냉동보존된 1차 간세포, iPSC-유도된 간세포, 줄기세포로부터 유도된 간세포, HepG2 간세포(liver cell line), HepaRG 간세포, Hepg2/C3A 간세포, Huh-7 간세포, 또는 이들로부터 유도된 세포를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오 조성물" 또는 "3 차원 바이오 조성물"은 생체 모방 구조체를 형성하는데에 사용되는 바이오 원천 소재 물질을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 상기 바이오 조성물은 3차원 프린터를 사용하는 3차원 프린팅 기술에 사용되는 원재료 물질이 될 수 있으며, 이 경우 바이오 조성물은 “바이오 잉크”일 수 있다.
상기 “바이오 조성물”또는 “바이오 잉크”는 인쇄적성(printability), 젤화(gelation) 특성, 생분해성(biodegradability), 세포적합성(cell-compatibility)의 가져야 하며, 세포성장과 분화를 조절할 수 있는 특성을 가져야 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서의 바이오 조성물은 히알루론산(Hyaluronic acid), 콜라젠(Collagen), 젤라틴(Gelatin), 엘라스틴(Elastin), 피브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin), 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans), 헤파란설페이트(Heparan sulfate), 콘드로이틴설페이트(Chondroitin sulfate), 케라탄설페이트(Keratan sulfate), 피브린(Fibrin), 또는 알지네이트(Alginate) 기반 바이오 조성물 또는 간 탈세포화 세포외기질(liver decellularized extracellular matrix)-기반 바이오 조성물일 수 있다.
단계 (d´): 상기 간 조직 모사 구조 상부에 폴리머를 사용하여 상부 혈관 채널을 형성하는 단계
간 조직 모사 구조를 형성한 후, 상기 간 조직 모사 구조 상부에 폴리머를 사용하여 상부 혈관 채널을 형성한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상부 혈관 채널의 형성은 3차원 프린팅 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "상부 혈관 채널(upper vascular channel)"은 3차원 간 체외 모델의 간세포(hepatocyte)에 영양분을 공급할 수 있는 유체가 흐를 수 있는 관(tube)으로서의 역할을 하는 채널을 의미한다.
상기 상부 혈관 채널의 모양이나 크기는 특별히 한정되지 않으나, 수 ㎛ 내지 수십 ㎝의 크기의 범위를 가질 수 있으며, 유체가 흐를 수 있는 관(tube) 형상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상부 혈관 채널의 너비는 2 mm 이하이며, 구체적으로는 0.01 mm 이상 - 2 mm 이하이고, 보다 구체적으로는 0.1 mm 이상 - 2 mm 이하이다.
본 발명에서 상부 혈관 채널 제조시에 사용되는 재료 물질은 폴리머 물질이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상부 혈관 채널 제조에 사용되는 폴리머 물질은 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(Poly(ethylene-co-vinyl acetate), PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단계 (e´): 상기 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포를 포함하는 바이오 조성물을 사용하여 내피 세포층을 형성하는 단계
상부 혈관 채널을 형성한 후, 상기 형성된 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포를 포함하는 바이오 조성물을 사용하여 내피 세포층을 형성한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 내피 세포층의 형성은 3차원 프린팅 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 용어 "내피 세포(endothelial cell)“는 심장내강, 동맥, 모세혈관, 정맥, 또는 림프관 등의 내면을 덮는 단층의 편평한 세포를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 내피 세포는 1차 인간 내피 세포(primary human endothelial cell), 냉동보존된 1차 인간 내피 세포, HUVEC 세포, 간 시누소이드(liver sinusoid) 내피 세포, iPSC-유도된 내피 세포, 줄기세포 유도된 내피 세포, TMNK-1 세포, 또는 TRP3 세포일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 내피 세포를 포함하는 바이오 조성물은 다음의 세포를 추가로 포함할 수 있다:
(i) 쿠퍼 세포(Kupffer cell): 생(fresh) 1차 쿠퍼 세포, 동결보존된 1차 쿠퍼 세포, 줄기세포 유도된 쿠퍼 세포, 또는 쿠퍼 세포주.
(ii) 간성상 세포(Hepatic Stellate cell): 1차 생(fresh) 간성상 세포, 1차 동결보존된 간성상 세포, 줄기세포 유도된 간성상 세포, 또는 간성상 세포주(LX1 세포, LX2 세포, TWNT-1 세포, LI90 세포).
(iii) 담관 상피세포(cholangiocyte): 생(fresh) 1차 담관 상피세포, 동결보존된 1차 담관 상피세포, 줄기세포 유도된 담관 상피세포, 담관 상피세포주(H69 세포).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 바이오 조성물은 히알루론산, 콜라젠, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 케라탄설페이트, 피브린, 또는 알지네이트-기반 바이오 조성물일 수 있으며, 상기 바이오 조성물은 혈관 탈세포화 세포외기질(vascular decellularized extraceullular matrix)-기반 바이오 조성물일 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명에 의해 제조된 다공성 이중 유동 채널은 생체 유체 물성 및 유동 연구, 마이크로 유체 시스템 설계 및 응용기술 개발, 진료용 의료기기 및 바이오 칩의 설계 등의 다양한 연구에 적용이 가능하다.
(ii) 본 발명의 다공성 이중 유동 채널은 3차원 프린팅 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 폴리머 또는 하이드로젤 재료를 사용하는 3차원 프린팅 기술을 이용하므로, 다공성 이중 유동 채널의 제조 공정이 매우 간단하며 비용 및 제조 시간의 면에서 매우 유리하다.
(iii) 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 하부 담관 채널, 간세포, 및 상부 혈관 채널을 포함하는 이중 유동 채널을 구비하므로, 혈관 채널에 의한 영양분 공급과 담관 채널에 의한 담즙산 및 노폐물 배출이 가능한 실제 간 생체 구조와 매우 근접한 간 조직 모사 구조를 가진다.
(iv) 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 높은 신뢰도로 간 독성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 방법을 통해 제조된 다공성 이중 유동채널의 수직 단면 구조의 모식도이다.
도 1b는 다공성 이중 유동채널 중간에서의 3차원 단면도를 나타낸다.
도 1c는 본 발명의 방법을 통해 3차원 프린팅 기술로 제조된 다공성 이중 유동 채널을 외부에서 본 사진이다.
도 2a는 본 발명의 방법을 통해 제조된 다공성 이중 유동채널의 구조에서 미세기공을 갖는 구조의 수평 단면을 보다 상세히 보여준다.
도 2b는 본 발명의 방법을 통해 제조된 다공성 이중 유동채널의 구조의 상부에 프린팅된 하이드로젤의 구조를 보여준다.
도 2c는 미세기공을 갖는 구조를 제조하기 위한 3차원 프린팅 경로와 이 경로에 따라 제조된 미세기공 구조를 보여준다.
도 3a는 본 발명의 방법을 통해 제조된 다공성 이중 유동 채널을 이용하여 유체의 흐름을 측정한 결과를 보여준다.
도 3b는 본 발명의 방법을 통해 제조된 다공성 이중 유동 채널을 이용하여 고농도의 유체와 저농도의 유체를 흘려주는 경우의 유체의 흐름을 측정한 결과를 보여준다.
도 4는 콜라젠-기반 하이드로젤을 사용하여 이중 유동 채널을 제조하는 경우 안전한 이중 유동 유지를 위한 적합한 하이드로젤의 강도를 점탄성 측정 방법(Rheology test)로 측정한 결과이다.
도 5은 본 발명 3차원 간 체외 모델의 디자인을 보여준다.
도 6a는 본 발명에 따라 제작한 3차원 간 체외모델의 구조를 보여준다. 패널 A는 세포가 3차원 프린팅된 3차원 간 체외모델의 전체 구조를 보여준다. 패널 B는 상부 채널과 하부 채널로 구성되는 이중 채널을 보여준다. 패널 C는 패널 A의 사진에서 상부 혈관 채널, 하부 혈관 채널, 프린팅된 미세기공 구조, 및 간세포를 포함하는 A-A' 단면의 구조를 보여준다. 패널 D는 3차원 프린팅된 미세기공 구조 및 HepaRG-간-dECM 바이오잉크로 프린팅된 구조의 SEM 이미지이다(스케일 막대: 300 ㎛).
도 6b는 미세기공을 갖는 구조를 제조하기 위한 3차원 프린팅 경로와 이 경로에 따라 제조된 미세기공 구조를 보여준다.
도 7a는 PCR 방법에 의해 본 발명의 3차원 간 체외 모델에서 담관 특이 유전자 발현을 측정한 결과이다. 담관시스템을 갖는 3차원 간 체외 모델과 담관시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델에서 실험 7일 째에 담관 특이적 유전자 CK19, MRP2, 및 OATP1B3의 발현을 측정한 결과이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 7b는 면역 염색방법에 의해 본 발명의 3차원 간 체외 모델에서 담관 특이 유전자의 발현을 측정한 결과이다. 담관시스템을 갖는 3차원 간 체외 모델과 담관시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델에서 실험 7일 째에 대표 유전자인 MRP2의 발현 단백질 면역 형광 염색 결과이다(Z-stack images, 스케일 막대: 100 μm).
도 8a는 담관시스템을 갖는 본 발명의 3차원 간 체외 모델(W/Biliary)과 담관시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델(WO/Biliary)에서 간 특이 유전자인 ALB (Albumin) 유전자, AFP(fetal hepatic marker alpha-fetoprotein) 유전자, 및 성숙 간-특이 유전자 TTR (transthyretin)의 발현 수준을 측정한 결과이다(*P<0.05, *P<0.005).
도 8b는 담관시스템을 갖는 본 발명의 3차원 간 체외 모델(W/ Biliary)과 담관시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델(W/O Biliary)에서 알부민(albumin)과 우레아(urea)의 분비 수준을 측정한 결과이다.(*P<0.05).
도 8c는 담관시스템을 갖는 본 발명의 3차원 간 체외 모델(W/ Biliary)과 담관시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델(W/O Biliary)에서 CYP1A2, CYP3A4, 및 CYP2C19의 유전자 발현 수준을 측정한 결과이다.(*P<0.05, **P<0.01)
도 9는 본 발명의 3차원 간 체외모델의 내부 세포 배열을 측정한 결과이다. 패널 A는 3차원 간 체외모델을 제조한 후의 세포 위치를 평가한 사진이다(scale bar: 100μm). 패널 B는 4일째에 HepaRG 세포의 MRP2 유전자의 면역형광염색의 결과이이고(scale bar: 50 μm), 패널 C는 4일째에 HUVEC 세포의 CD31 유전자의 면역형광염색의 결과이다(scale bar: 50 μm).
도 10은 본 발명의 3차원 간 체외모델의 담관 기능을 측정한 결과이다. 패널 A는 담관시스템을 갖는 본 발명의 3차원 간 체외모델(W/ Biliary)에서 7일째의 콜릴-라이실-플루오레신의 형광이미지이다. 패널 B는 담관시스템을 갖지 않는 간 체외 모델(W/O Biliary)에서 7일째의 콜릴-라이실-플루오레신의 형광이미지이다(Z-stack 이미지, 스케일 막대: 100μm). 패널 C는 3차원 간 체외모델에서 담관 시스템을 통해 배출되는 인도시아닌 그린(ICG)을 평가한 결과이다(n=3).
도 11은 알부민 배출 및 우레아 배출 측정을 통한 간 특이적 기능 테스트 결과이다. 2D는 종래의 2차원 모델, 3D는 종래의 3차원 모델, Liver Chip은 본 발명의 3차원 간 체외모델이다(*P<0.05, **P<0.001, n=3).
도 12는 3차원 간 체외모델의 기능 테스트에 적합한 아세트아미노펜 약물의 농도를 측정한 결과이다.
도 13은 간 특이적 기능 테스트 결과이다. 3차원 간 체외모델에서 알부민 배출 및 우레아 배출을 약물 처리한 경우(W/Drug)와 약물을 처리하지 않은 경우(W/O Drug)에서 측정하였다 (*P<0.05, **P<0.01, n=3).
실시예
실시예 1: 3차원 프린팅 기술을 이용한 다공성 이중 유동 채널의 제조
3차원 프린팅 기술을 이용하여 이중 유동 채널을 제작하기 위해서는 다음과 같은 다양한 공정들이 고려되어야 한다: 즉 (i) 순차적인 3차원 프린팅 과정, (ii) 다공성 이중 유동 채널을 위한 하이드로젤, 및 (iii) 상기 하이드로젤을 위치시킬 수 있는 지지대 역할을 하는 미세 기공(micro pore)을 갖는 구조가 유동 채널 위에 프린팅되어야 한다.
(1) 제1 유동채널의 제작
폴리(에틸렌/비닐아세테이트) (PEVA, Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)를 재료로 사용한 3차원 프린팅 방법을 이용하여 투명한 살균된 폴리(메틸메타크릴레이트(PMMA) 플레이트상에 유동 채널의 너비가 2 mm 미만이 되도록 제1 유동채널(유동채널 1)을 제작하였다.
(2) 미세기공(micro pore)을 갖는 구조의 제작
상기 PMMA 플레이트상에 3차원 프린팅한 제1 유동채널 상부 쪽에 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA, Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)를 재료로 사용한 3차원 프린팅 방법을 이용하여 미세기공을 갖는 구조를 제작하였다. 상기 구조에서 미세 기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하가 되도록 제작하였으며, 미세 기공의 두께(폭)는 200 ㎛ 이하가 되도록 제작하였다. 상기 미세기공의 형성은 도 2c에 왼쪽 패널 그림에 도시된 바와 같이, 초록색으로 표시한 3차원 프린팅 경로를 설정한 후, 설정된 경로에 따라 적합한 프린팅 조건(노즐 사이즈, 프린팅 속도)을 설정하여 프린팅하여 완성하였다.
(3) 다공성 하이드로젤의 제작
상기 제작한 미세기공을 갖는 구조의 상부에 콜라젠-기반 바이오잉크를 사용한 3차원 프린팅에 의해 다공성 하이드로젤을 프린팅하였다. 또한, 콜라젠-기반 바이오 잉크 이외에, 알지네이트-기반 바이오 잉크 또는 피브린-기반 바이오 잉크를 사용한 3차원 프린팅에 의해 다공성 하이드로젤을 프린팅하였다. 다공성 이중 유동 채널을 이용한 이중 유동 흐름에서, 이중 유동 흐름이 유지될 수 있도록 지지해야한다는 점에서 미세 기공을 갖는 구조 위에 프린팅되는 하이드로젤의 강도는 매우 중요하다. 이중 유동 채널에서 안전한 이중 유동 유지를 위한 적합한 하이드로젤의 강도는 1.5％의 콜라젠 기반의 하이드로젤을 사용하는 경우 가교 이후 적어도 평균 저장 탄성율(storage modulus)가 106.9±6.3 Pa 값 이상을 가져야 함을 확인하였다(도 4 참조).
(4) 제2 유동채널의 제작
상기 3차원 프린팅한 하이드로젤의 상부에 폴리(에틸렌/비닐아세테이트) (PEVA, Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)을 재료로 사용한 3차원 프린팅 방법을 이용하여 제2 유동채널(유동채널 2)을 제작하였다. 상기 방법을 통해 제조된 다공성 이중 유동채널의 구조를 도 1a 내지 도 1c에 나타내었다. 도 1a는 상기 방법을 통해 제조된 다공성 이중 유동채널의 구조의 모식도이며, 도 1b는 다공성 이중 유동채널 중간에서의 3차원 단면도를 나타내며, 도 1c는 실제 제조된 3차원 바이오프린팅된 다공성 이중 유동채널을 보여준다. 도 2a는 상기 방법을 통해 제조된 다공성 이중 유동채널의 구조에서 미세기공을 갖는 구조를 보다 상세히 보여준다. 도 2b는 상기 방법을 통해 제조된 다공성 이중 유동채널의 구조의 상부에 프린팅된 하이드로젤의 구조를 보여준다. 도 2c는 미세기공을 갖는 구조를 제조하기 위한 3차원 프린팅 경로와 이 경로에 따라 제조된 미세기공 구조를 보여준다.
실시예 2: 이중 유동 채널에서 유체의 흐름 측정
상기 실시예 1에서 제작한 다공성 이중 유동 채널을 이용하여, 유체의 흐름을 측정하였다. 서로 다른 색을 가지는 유체를 흘려주어 다공성 이중 유동 채널에서 유체의 흐름을 측정한 결과, 이중 유동 채널에서 유체가 서로 섞이지 않고 이중 유동의 흐름을 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 3a). 또한, 고농도의 유체(파란색)와 일반 증류수을 흘려주는 경우에 대해서 유체가 서로 섞이는지 여부를 확인하였다. 이중 유동 채널 중 상부 유동 채널에서 고농도의 용액을 흐르게 하고, 하부 유동 채널에서 저농도의 용액을 흐르게 한 경우, 상부 유동 채널에서 흐르는 고농도의 용액이 하부 유동 채널에서 흐르는 저농도 용액으로 다공성 이중 유동 채널의 효과로 인하여 흐르지 않았으며, 2종류의 유체가 서로 혼합되어 섞이지 않음을 확인할 수 있었다(도 3b). 상기 실험 결과로부터, 고농도 및 저농도의 용액 사용 여부와 관계없이, 농도가 서로 다른 용액들에 대해서도, 다공성 이중 유동 채널이 2종류의 서로 다른 유체를 분리하여 사용하는 데에 있어 충분히 이용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 3차원 간 체외 모델의 제조
(1) 3차원 간 체외모델의 디자인
실제 생체 간(liver)에서는 혈액 및 담즙(bile)이 간의 동맥, 정맥 및 담관을 통해 흐른다. 따라서, 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 실제 간 구조를 모사하여 2개의 유동 채널인 상부 혈관 채널과 하부 담관 채널을 각각 포함하도록 제작하였다. 상부 혈관 채널은 세포에 영양분을 제공하는 역할을 하며, 하부 담관 채널은 간 조직으로부터 담즙산(bile acid)과 노폐물을 배출하도록 설계하였다. 상부 혈관 채널과 하부 담관 채널의 사이에, 먼저 미세기공을 갖는 구조를 3차원 프린팅한 후, 이 미세기공 구조 상부에 간세포(hepatocyte) 및 내피세포(endothelial cell)를 3차원 프린팅하여 배치시켜 전체적으로 간 조직 모사 구조를 이루도록 제작하였다(도 5).
(2) 하부 담관 채널의 프린팅
투명하고 멸균한 메타크릴레이트(PMMA) 플레이트상에 채널의 너비가 2 mm 미만이 되도록 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA, Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)를 재료로 사용한 3차원 프린터를 이용하여 하부 담관 채널을 3차원 프린팅하였다. 상기 하부 담관 채널의 3차원 프린팅시에 배양액 수용부(medium reservoir)도 함께 프린팅하였다.
(3) 미세기공 구조(micro pore structure)의 프린팅
상기 PMMA 상에 3차원 프린팅한 하부 담관 채널의 상부에 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA, Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)를 재료로 사용한 3차원 프린터를 이용하여 미세 기공을 갖는 구조를 3차원 프린팅하였다. 이때, 미세 기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하가 되도록 프린팅하였고, 미세 기공의 두께(폭)는 200 ㎛ 이하가 되도록 프린팅하였다. 상기 미세기공의 형성은 도 6b에 왼쪽 패널의 그림에 도시된 바와 같이, 초록색으로 표시한 3차원 프린팅 경로를 설정한 후, 설정된 경로에 따라 적합한 프린팅 조건(노즐 사이즈, 프린팅 속도)을 설정하여 프린팅하여 완성하였다. 상기 미세기공 구조 및 미세기공 구조에서의 미세 기공의 크기는 3차원 간 체외 모델에서 노폐물의 배출과, 후술하는 HepaRG-간 dECM 바이오잉크를 지탱하는데 있어서 매우 중요한 역할을 한다.
(4) 간 조직 모사 구조의 프린팅
상기 미세 기공 구조 상부에 간 전구세포(liver progenitor cell)을 포함하는 바이오잉크를 사용한 3차원 프린터를 이용하여 간 조직 모사 구조를 3차원 프린팅하였다. 상기 간 전구세포로는 HepaRG 세포주를 Biopredic International (프랑스)로부터 구입하여 사용하였다. HepaRG 세포주는 간세포 및 간 담관상피세포(liver biliary-epithelial cell)로 분화될 수 있는 간 전구 세포(liver progenitor cell)이다. 분화된 HepaRG 세포주는 사용하기 전까지 제조자 제공의 지시서에 따라 세포를 37℃에서 5% CO2 분위기하에서 배양하면서 유지하였다. HepaRG 세포 프린팅을 위해서, 간 탈세포화 세포외기질(liver decellularized extracelluar matrix, "간-dECM") 바이오 잉크를 준비하였다. 간-dECM 바이오잉크는 문헌 "Lee, Hyungseok, et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering, Biomacromolecules 18.4 (2017): 1229-1237"에 기재된 프로토콜에 따라 제조하였다. 세포 프린팅을 행하기 전에, HepaRG 세포를 간-dECM 바이오잉크에 봉입(encapsulate)시켰다. HepaRG-간 dECM 바이오잉크 혼합물(5 - 10 x 106 세포/ml)을 상기 미세기공 구조 상부에 주위 장벽과 함께 3차원 프린팅하였다.
(5) 상부 혈관 채널의 프린팅
상기 HepaRG-간 dECM 바이오잉크 혼합물의 프린팅을 행한 후, 채널의 너비가 2 mm 미만이 되도록 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA, Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)를 재료로 사용한 3차원 프린터를 이용하여 상부 혈관 채널을 3차원 프린팅하였다. 상기 상부 혈관 채널의 3차원 프린팅시에 배양액 수용부(medium reservoir)도 함께 프린팅하였다.
(6) 내피 세포(endothelial cell)층의 프린팅
상부 혈관 채널을 프린팅 한 후, 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포층을 프린팅하였다. 내피세포로는 HUVEC 세포주를 사용하였다. HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells) 세포주는 Lonza (Basel, Switzerland)에서 구입하였다. HUVEC 세포는 완전 내피 세포 배지(complete endothelium medium) (EGM-2 BulletKit, Lonza)를 사용하여 배양하였다. 세포는 37℃에서 5% CO2 분위기하에서 배양하여 유지하였다. HUVEC 세포 프린팅을 위해서, 젤라틴 바이오잉크를 준비하였다. 젤라틴 바이오잉크는 3% w/v 젤라틴 (Porcine skin G6144-500G, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로서, 젤라틴을 무혈청 내피세포 배지(EGM, Lonza)에 녹여서 제조하였다. 세포 프린팅을 행하기 전에, HUVEC 세포를 젤라틴 바이오잉크에 봉입(encapsulate)시켰다. HUVEC-젤라틴 바이오잉크 혼합물(1 - 2 x 106 세포/ml)을 상기 상부 혈관 채널의 빈 공간을 채우도록 프린팅하였다. HUVEC 세포가 포함된 젤라틴 바이오잉크를 프린팅한 후, 이를 인큐베이션하여 액체상에서 젤라틴을 제거하였다. 모든 세포 프린팅 공정을 행한 후에, 프린팅된 3차원 간 체외모델을 37℃에서 인큐베이션하여 안정화시켰다. 3차원 간 체외모델의 내부 구조를 확인하기 위해, 구조를 수평방향으로 슬라이스한 후 상온에서 진공하에서 건조시켰다. 건조된 구조물을 백금(platinum)으로 코팅하였다(Ion Sputter E-1045, Hitachi, Tokyo, Japan). 이어서, 15 kV의 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy)(SEM, SU-6600, Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용하여 미세기공 구조와 세포-바이오잉크의 구조를 관찰하였다(도 6a).
실시예 4 : 3차원 간 체외 모델에서 유체 흐름
실시예 3에 제작한 3차원 간 체외 모델에서 상부 혈관 채널과 하부 담관 채널은 2가지의 서로 다른 유체가 흐르도록 하였다(도 6a의 패널 B 참조). 상부 혈관 채널에는 3차원 간 체외 모델 내부에 존재하는 세포들에게 영양분을 공급하기 위한 유체가 흐르고, 하부 담관 채널을 통해서는 3차원 간 체외 모델 내부에 존재하는 간세포(hepatocyte)들이 분비하는 담즙산 및 노폐물들이 빠져나가게 된다. 본 발명의 3차원 간 체외 모델에서는 서로 분리된 유체 흐름은 각각의 역할을 수행하는 동시에 원활한 유체 전달이 가능하도록 함으로써, 3차원 간 체외모델에서 각 세포들의 기능을 증대시킨다. 또한, 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 높이 차를 이용한 중력 기반 미세 유체 환경이 지속적으로 유지된다.
실시예 5 : 하부 담관 채널을 갖는 3차원 간 체외 모델의 기능 평가
본 발명의 3차원 간 체외 모델의 특징 중의 하나는 담관 채널을 구성하여 생체 간 조직에서 담관 시스템을 모사하였다는 점이다. 담관 채널을 갖는 본 발명의 3차원 간 체외 모델의 기능을 평가 및 분석하였다.
(1) 실험방법
① RNA 추출과 정량 실시간 PCR
3차원 간 체외 모델을 1주일간 배양한 후에, 이로부터 샘플을 수득하고, 각 샘플에서 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여, 총 RNA를 추출하였다. Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하고, SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR machine (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머들은 Primer Express 3.0 software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 디자인하였다. GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), ALB(albumin), AFP(alpha-fetoprotein), TTR (transthyretin), cytokeratin 19 (CK19), MRP2 (multidrug resistance-associated protein 2), OATP1B3 (organic anion transporter protein 1B3), 및 CYP(Cytochromes)1A2, CYP3A4, 및 CYP2C19에 대한 전방향 프라이머와 역방향 프라이머들은 바이오니어(Bioneer, 한국)으로부터 구입하였다. 타겟 유전자들의 발현 수준은 GAPDH 유전자 발현 수준에 대해 정규화(normalize)하였다.
명칭 전방향 서열(5‘- 3’) 역방향 서열(5‘- 3’)
GAPDH ATGGAAATCCCATCACCATCTT(서열번호 1) CGCCCCACTTGATTTTGG(서열번호 2)
ALB TGAGGTTGCTCATCGGTTTAAA(서열번호 3) GCAATCAACACCAAGGCTTTG(서열번호 4)
AFP CAACTTGAGGCTGTCATTGCA(서열번호 5) CTGGCCTTGGCAGCATTT(서열번호 6)
TTR TGGCATCTCCCCATTCCAT(서열번호 7) CGGAGTCGTTGGCTGTGAA(서열번호 8)
CK19 TGAGCGGCAGAATCAGGAGTA(서열번호 9) CTCCAGCCGCGACTTGA(서열번호 10)
MRP2 GTCACGACCCCAGCTTCAA(서열번호 11) CCCAAGCGAAGGTTCCATTA(서열번호 12)
OATP1B3 CGATGATATCCTTCTTGTTTCAACTTC(서열번호 13) GCCGGCAACTGATTTGCT (서열번호 14)
CYP1A2 GCCTTGGACAGCAGCAACTC(서열번호 15) ACCACTTTGCCATCCACTATCC(서열번호 16)
CYP3A4 AGGCGGGAAGCAGAGACA(서열번호 17) CATGCTGTAGGCCCCAAAGA(서열번호 18)
CYP2C19 CAAGAATCGATGGACATCAACAA(서열번호 19) TCTCCATTTTGATCAGGAAGCA(서열번호 20)
② 면역형광염색 및 콜릴-라이실-플루오레신 검사
샘플을 상온에서 15분간 4％-파라포름알데히드에서 고정화하였다. 투과화(permeabilization)는 0.1％ Triton X-100을 사용하여 15분간 수행하였다. 이어서, 비특이적 결합을 방지하기 위해 샘플을 3％ 우혈청알부민(Affimetrix, USA)으로 15분간 처리하였다. 각 단계에서, 샘플은 15분간 PBS로 3최 세척하였다. 항-인간 MRP2 래빗 항체 (Abcam, UK), 샘플을 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. PBS로 세정한 후, 샘플을 Alexa Fluor 594 고우트(goat) 항-래빗 항체로 처리하였다.콜릴-라이실-플루오레신(cholyl-lysyl-fluorescein, CLF, BD Biosciences)을 사용하여 담즙산 분비를 검사하였다. 3차원 간 체외모델의 세포들을 세척하고, HBSS내의 1μ의 MCLF와 25분가 인큐베이션하였다. 모든 샘플들을 콘포칼 이미징 이전에 다시 세척하였다. 모든 염색 이미지들은 콘포칼 현미경(LSM 510 Meta, Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 얻었다.
③ 간기능 측정
제조한 3차원 간 체외 모델의 간 기능 테스트로서, 3차원 간 체외 모델로부터 분비된 알부민/우레아를 분석하기 위해 배지(medium)를 수득하였다. 분비된 알부민은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) (DuoSet ELISA Development System, Genzyme, USA)를 사용하여 정량하였다. 분비된 우레아는 우레아 분석 키트 (BioVision, USA)를 사용하여 정량하였다. 정량은 마이크로플레이트 리더(Epoch 2 Microplate Spectrophotometer, BioTek, USA)를 사용하여 수행하였다.
④ 스캐닝 전자 현미경 관찰
제조한 3차원 간 체외 모델에서, 간 조직 모사 구조의 내부 구조를 확인하기 위해, 구조체를 얇게 슬라이스하여 수평 방향의 절편을 제작하고, 상온 및 진공 조건 하에서 건조하였다. 건조한 절편을 백금(platinum)으로 코팅하였다(Ion Sputter E-1045, Hitachi, Tokyo, Japan). 최종적으로, 15 kV 에서 스캐닝 전자 현미경을 사용하여, 3차원 간 체외모델의 미세기공 구조 및 바이오 잉크의 위치를 관찰하였다.
⑤ 인도시아닌 그린의 간 흡수 및 담관 배출 실험
배지를 제거한 후에 3차원 간 체외모델을 PBS로 세척하고, 인도시아닌 그린(indocyanine green, ICG, Dongindang pharmaceutical, Korea)을 1 mg/ml의 농도로 준비하고, 3차원 간 체외모델의 상부 혈관 채널로 전달하였다. 이어서, ICG를 포함하는 3차원 간 체외모델을 간 흡수를 위해 37℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후에, 3차원 간 체외모델을 PBS로 3회 세척하고 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 24시간 배양 후에, 마이크로플레이트 리더기(Epoch 2 Microplate Spectrophotometer, Bio-Tek, USA)를 사용하여 805 nm의 파장에서, 3차원 간 체외모델의 하부 담관 채널을 통해 배출되는 ICG 배출량을 측정하였다.
⑥ 간 기능 테스트 및 약물 반응성 측정
간 기능 테스트를 수행하기 위해, 3차원 간 체외모델로부터 배지 샘플(200 ㎕)을 수집하여 분비된 알부민 및 우레아를 분석하였다. 분비된 알부민은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, DuoSet ELISA Development System, Genzyme, USA)으로 정량하였다. 또한, 분비된 우레아는 우레아 분석 키트(BioVision, USA)를 사용하여 정량하였다. 정량은 마이크로플레이트 리더(Epoch 2 Microplate Spectrophotometer, BioTek, USA)을 사용하여 수행하였다. 아세트아미노펜(Acetaminophen, APAP)는 시그마-알드리치로부터 구매하여 3차원 간 체외모델의 간독성을 체크하는데 사용하였다. 5 mM의 APAP 를 포함하는 배지를 제공하고 매일 새로운 배지로 교체하였다. APAP의 농도는 종래의 연구결과들로부터 선택하였고, 먼저 2차원 배양 조건에서 7일 시점에 간독성을 평가하기 위해 테스트하였다. 세포 생존율을 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Japan)을 사용하였다.
(2) 실험결과
① 담관 특이 유전자 발현의 측정 결과
CK19 (Cytokeratin 19)는 담관 세포에서 발현되는 유전자 중의 하나이고(J. Tan, et al., Liver International 2002, 22, 365.); MRP2 (multidrug resistance-associated protein 2)는 간 특이적 담즙 운반체이고(T. Grix, et al., Genes 2018, 9, 176); OATP1B3 (Organic Anion Transporter Protein 1B3)은 약물과 담즙산을 포함하는 다양한 화합물들의 간 흡수를 조절하는 막 운반 단백질(membrane transport protein)이다. 담관 시스템을 갖는 3차원 간 체외모델(W/biliary)에서 실제 간과 유사한 환경을 유도하는지를 평가하기 위해 주요 담관 특이적 유전자인 CK19, MRP2, 및 OATP1B3의 유전자의 발현을 측정하였다(도 7a). 실험결과, 담관 시스템을 갖는 3차원 간 체외모델(W/biliary)에서 CK19, MRP2, 및 OATP1B3 유전자의 발현 수준이, 담관 시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외모델(WO/biliary)의 유전자의 발현 수준과 비교하여 유의성 있게 높았다. 이는 담관 시스템을 갖는 모델이 간 조직의 모사에 더욱 효과적이라는 것을 암시한다. 또한, 단백질 수준에서의 발현 수준을 평가하기 위해, 면역 염색법을 이용하여 MRP2 유전자의 단백질 발현 수준을 분석하였다. 그 결과, PCR 분석 결과와 일치하게, 담관 시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델과 비교하여, 담관 시스템을 갖는 3차원 간 체외 모델에서 HepaRG 세포는 MRP2 유전자의 단백질 발현 수준이 더욱 높게 나타났다(도 7b). 담관 시스템을 갖는 모델에서 담관 특이적 유전자의 발현이 더욱 높게 나타난 것은 상부 혈관 채널을 통해 충분한 영양분과 산소가 세포들에게 공급되고, 하부 담관 채널을 통해 담즙산과 노폐물이 배출된 결과이다.
② 간 세포 특이 유전자 발현, 간 기능 및 해독 능력 측정
담관 시스템의 존재 여부에 따라, 3차원 간 체외 모델에서의 간 기능들이 향상되는지를 조사하였다. 간세포 특이적 유전자 발현 수준, 알부민/우레아 분비 및 시토크롬 450(CYP) 유전자 발현 수준을 분석하였다. 알부민(ALB) 유전자, AFP(fetal hepatic marker alpha-fetoprotein) 유전자, 및 성숙 간-특이 유전자 TTR(transthyretin)의 발현을 측정한 결과, 담관 시스템을 갖는 3차원 간 체외 모델에서 담관 시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델 보다 더 높게 나타났는데, 이는 간기능이 더 우수하다는 것을 나타낸다(도 8a). 또한, 세포 배양 동안에 배지에서 분비된 알부민과 우레아의 수준을 측정하였다. 그 결과, 담관 시스템이 없는 모델과 비교하여, 담관 시스템을 갖는 3차원 간 체외 모델에서 알부민 및 우레아의 수준이 더 높게 나타났다(도 8b). 이러한 기능의 향상은 간 기능을 정확하게 반영하기 때문에 약물 스크리닝에서 매우 유용하다. 하부 담관 채널을 갖지 못하는 간 체외 모델의 경우 세포에 의해 생성된 세포 독성을 갖는 노폐물과 담즙산이 제거되지 못하고 축적된다. 그러나, 담관 시스템을 갖는 경우, 배지가 상부 채널 및 하부 채널 모두를 통해 공급되고, 담즙은 간-담관 시스템을 통해 효과적으로 제거될 수 있다. 간 기능 확인실험에 이어서, 약물 대사 및 해독 과정에 강하게 관련되어 있는 핵심 CYP 효소인 CYP1A2, CYP3A4, 및 CYP2C19의 유전자 발현 수준을 조사하였다. 모든 CYP 유전자 발현 수준은 담관 시스템을 갖지 않는 체외 간 모델 보다 담관 시스템을 갖는 체외 간 모델에서 더욱 높게 나타났다(도 8c 참조). 이러한 결과들은 담관 시스템을 갖는 간 모델에서 더욱 우수한 해독 능력을 갖는다는 것을 암시한다. CYP3A4는 다양한 약물의 대사에 관련되어 있는 풍부하고 중요한 효소이고, 새로운 약물에도 매우 강하게 관련되어 있다. 또한, CYP3A4는 담즙산의 해독에도 관련되어 있다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 체외 간 모델에서 CYP3A4의 높은 발현은 더 높은 약물 대사 및 해독 능력을 암시한다.
③ 간 모사 조직 내부 구조의 현미경 측정 결과
3차원 간 체외 모델에서 정확한 세포의 위치를 확인하기 위해 슬라이스한 수평 방향의 절편을 스캐닝 전자 현미경으로 관찰하였다. 세포 프린팅한 후에 수득한 녹색 표지된 HepaRG 세포 및 적색 표지된 HUVEC 세포의 이미지에서 정렬된 세포 패턴을 관찰할 수 있었다. HUVEC 세포들은 HepaRG 세포가 있는 간 dECM 바이오잉크 상부에 위치하였다. 이러한 결과들은 안정화 이후에 HepaRG 세포가 있는 간 dECM 바이오잉크 상부에 HUVEC 세포들을 정확하게 전달하여 위치시켰음을 보여주는 것이다.(도 9의 패널 A). 또한, 담관 유사 HepaRG 세포를 단백질 수준에서 검증하기 위해 HepaRG 세포의 MRP2 수준을 면역염색법(DAPI 대비 염색)을 사용하여 분석하였다(도 9의 패널 B). HepaRG 세포는 주로 간 유사 세포 및 담관 유사 세포로 분화되었다. HepaRG 세포는 담관 시스템 형성 및 담즙산 제거를 촉진하는 담관 유사 세포를 갖는다. 또한, HepaRG 세포가 있는 간 dECM 바이오잉크상의 HUVEC 세포는 접착 연접(adherens junction)을 가지는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 간 시누소이드(liver sinusoid)를 정확히 모사한 것을 나타낸다.(도 9의 패널 C).
④ 간 담관 시스템의 형성 평가
3차원 간 체외 모델에서 담즙산의 배출 및 담즙 소관계(canaliculi) 형성을, 간에서 간 담즙 시스템의 이송 능력을 평가하는데 사용되는 형광 담즙산 유도체인, 콜릴-라이실-플루오레신(CLF)을 사용하여, 평가하였다. CLF 분석에 기초하여 담도계 형성을 평가한 결과, 담관 시스템을 갖지 않은 군(W/O biliary group)(도 10의 패널 B)보다 담관 시스템을 가진 군(W/biliary group)(도 10의 패널 A)에서 담도계 형성이 더욱 우수하게 나타났다. 상기 결과에서 언급한 바와 같이, MRP2 및 OATP1B3의 유전자 발현 수준이 더 높게 나타난 것이 담즙 시스템이 더 우수하게 형성되었을 가능성을 암시한다.
⑤ 인도시아닌 그린 배출 테스트
인도시아닌 그린은 임상적으로 간 기능을 테스트하는데 사용되는 비-독성 유기 음이온이며, 간세포를 가로질러 통과할 수 있다. 간세포에서 ICG가 축적되고 담관 시스템으로 배출된다. 따라서, 3차원 간 체외 모델에서 ICG의 배출을 측정함으로써 담관 시스템을 통한 담즙산 제거능을 간접적으로 평가하였다. 3차원 간 체외 모델에서 하부 담관 채널로부터 ICG 배출 수준을 결정하고, 정상 배지(normal medium)을 갖는 3차원 간 체외 모델을 대조군으로 포함시켰다. 실험 결과, 3차원 간 체외 모델에서 하부 담관 채널을 통해 ICG가 잘 방출되고, 높은 광학밀도(optical density)을 나타내어, 담즙관 채널의 기능성을 지시한다는 것을 확인하였다(도 10의 패널 C).
⑥ 종래 2차원 및 3차원 모델과의 비교 실험
본 발명의 3차원 간 체외모델의 알부민 및 우레아 분비를 종래의 2차원 모델 및 3차원 모델과 비교하였다. 종래의 2차원 모델은 디쉬에서 간세포 배양을 통해 제조한 것이며, 종래의 3차원 모델은 하이드로젤-캡슐화된 간 세포 배양을 통해 제조한 것이다. 실험 결과, 종래의 2차원 모델에서 분비되는 알부민 및 우레아 수준은 시간 경과에 따라 연속적으로 감소하였다. 종래의 3차원 모델에서 분비되는 알부민 및 우레아 수준은 일정하였고, 약간 증가하는 패턴을 보였으나, 전체적으로 종래의 2차원 모델의 결과와 큰 차이가 없었다. 본 발명의 3차원 간 체외모델에서 분비되는 알부민 및 우레아 수준은 종래의 2차원 모델 및 3차원 모델의 것과 비교하여 높게 나타났다(도 11).
⑦ 3차원 간 체외 모델에서 약효 테스트
본 발명의 3차원 간 체외모델에서의 약효 테스트를 위해, 먼저 약효 테스트의 유효성 판별을 위한 약물의 처리 농도를 확인하였다. 2차원 세포배양으로 제조한 2차원 모델에서 아세트아미노펜(Acetaminophen)을 농도별로 처리한 결과, 세포의 생존율이 급격히 떨어지는 농도가 5 mM인 것을 확인하였고(도 12), 이 농도를 선택하여 약효 테스트를 행하였다. 본 발명의 3차원 간 체외모델을 5 mM의 아세트아미노펜을 처리한 후에 분비되는 알부민 및 우레아의 수준을 측정하였다. 실험 결과, 아세트아미노펜 약물을 처리한 3차원 간 체외모델에서 알부민 및 우레아의 분비 수준이 약물을 처리하지 않은 3차원 간 체외모델에 비해 급격히 감소한 결과를 얻었다(도 13). 종래 2차원 간 체외모델에 비해, 본 발명의 3차원 간 체외모델의 약물 처리군에서 이러한 간의 기초적인 기능이 급격히 감소한 것은 본 발명의 3차원 간 체외모델이 아세트아미노펜 약물에 대한 높은 민감도 및 약물 반응성을 보여주는 것이다. 이러한 결과에 의해, 본 발명의 3차원 간 체외모델은 약물 반응성을 가지므로, 간독성에 관한 약물 후보물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있음을 입증하였다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
서열번호 1 (DNA, Artificial Sequence)
atggaaatcc catcaccatc tt
서열번호 2 (DNA, Artificial Sequence)
cgccccactt gattttgg
서열번호 3 (DNA, Artificial Sequence)
tgaggttgct catcggttta aa
서열번호 4 (DNA, Artificial Sequence)
gcaatcaaca ccaaggcttt g
서열번호 5 (DNA, Artificial Sequence)
caacttgagg ctgtcattgc a
서열번호 6 (DNA, Artificial Sequence)
ctggccttgg cagcattt
서열번호 7 (DNA, Artificial Sequence)
tggcatctcc ccattccat
서열번호 8 (DNA, Artificial Sequence)
cggagtcgtt ggctgtgaa
서열번호 9 (DNA, Artificial Sequence)
tgagcggcag aatcaggagt a
서열번호 10 (DNA, Artificial Sequence)
ctccagccgc gacttga
서열번호 11 (DNA, Artificial Sequence)
gtcacgaccc cagcttcaa
서열번호 12 (DNA, Artificial Sequence)
cccaagcgaa ggttccatta
서열번호 13 (DNA, Artificial Sequence)
cgatgatatc cttcttgttt caacttc
서열번호 14 (DNA, Artificial Sequence)
gccggcaact gatttgct
서열번호 15 (DNA, Artificial Sequence)
gccttggaca gcagcaactc
서열번호 16 (DNA, Artificial Sequence)
accactttgc catccactat cc
서열번호 17 (DNA, Artificial Sequence)
aggcgggaag cagagaca
서열번호 18 (DNA, Artificial Sequence)
catgctgtag gccccaaaga
서열번호 19 (DNA, Artificial Sequence)
caagaatcga tggacatcaa caa
서열번호 20 (DNA, Artificial Sequence)
tctccatttt gatcaggaag ca

Claims (32)

  1. 폴리머로 제조된 제1 유동 채널;
    상기 제1 유동 채널 상부에 위치하며, 폴리머로 제조된 미세 기공 구조(micro porous structure);
    상기 미세기공 구조 상부에 위치하는 다공성 하이드로젤; 및
    상기 다공성 하이드로젤 상부에 위치하며, 폴리머로 제조된 제2 유동 채널;을 포함하는 다공성 이중 유동 채널.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 유동 채널의 너비는 2 mm 이하인 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 미세기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하이고, 미세 기공의 두께는 700 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 하이드로젤은 폴리비닐알코올, 녹말, 셀룰로오스, 젤라틴, 폴리에틸렌, 아가로즈, 키토산, 구아검(guar gum), 젤란검(gellan gum), 글리콜키토산, 알지네이트(Alginate), 히드록삼산 알지네이트(Hydroxamated alginates), 알지네이트 비드(Allginate bead), 피브린(fibrin), 스크렐로글루칸(Scleroglucan), 폴리(아크릴릭-co-비닐술폰닉)산, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴아미드/구아검 그래프트 코폴리머, 세포, 히알루론산, 콜라젠, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 및 케라탄설페이트으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성 하이드로젤의 강도는 가교 이후 평균 저장 탄성율(storage modulus)가 106.9±6.3 Pa 값 이상인 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성 이중 유동 채널은 3차원 프린터를 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널.
  8. (a) 폴리머를 사용하여 제1 유동 채널을 형성하는 단계;
    (b) 상기 제1 유동 채널 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공 구조를 형성하는 단계;
    (c) 상기 미세기공 구조 상부에 다공성 하이드로젤을 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 다공성 하이드로젤 상부에 폴리머를 사용하여 제2 유동 채널을 형성하는 단계; 를 포함하는 다공성 이중 유동 채널을 제조하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 제1 유동 채널의 너비는 2 mm 이하인 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널을 제조하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 미세기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하이고, 미세 기공의 두께는 700 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널을 제조하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널을 제조하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 하이드로젤은 폴리비닐알코올, 녹말, 셀룰로오스, 젤라틴, 폴리에틸렌, 아가로즈, 키토산, 구아검(guar gum), 젤란검(gellan gum), 글리콜키토산, 알지네이트(Alginate), 히드록삼산 알지네이트(Hydroxamated alginates), 알지네이트 비드(Allginate bead), 피브린(fibrin), 스크렐로글루칸(Scleroglucan), 폴리(아크릴릭-co-비닐술폰닉)산, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴아미드/구아검 그래프트 코폴리머, 세포, 히알루론산, 콜라젠, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 및 케라탄설페이트으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널을 제조하는 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 다공성 하이드로젤의 강도는 가교 이후 평균 저장 탄성율(storage modulus)이 106.9±6.3 Pa 값 이상인 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널을 제조하는 방법.
  14. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (a) 내지 (d) 중 하나 이상의 단계는 3차원 프린터를 이용하여 행하는 것을 특징으로 하는 다공성 이중 유동 채널을 제조하는 방법.
  15. 폴리머로 제조된 하부 담관 채널;
    상기 하부 담관 채널 상부에 위치하며, 폴리머로 제조된 미세기공 구조;
    상기 미세기공 구조 상부에 위치하며, 간 전구 세포를 포함하는 바이오 조성물로 제조된 간 조직 모사 구조;
    상기 간 조직 모사 구조 상부에 위치하며, 폴리머로 제조된 상부 혈관 채널; 및
    상기 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 위치하며, 내피 세포를 포함하는 바이오 조성물로 제조된 내피 세포층;을 포함하는 3차원 간 체외모델.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 하부 담관 채널의 너비는 2 mm 이하인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 미세기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하이고, 상기 미세 기공의 두께는 700 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  19. 제 15 항에 있어서, 상기 간 전구 세포는 간세포(hepatocyte), 또는 간세포 및 간 담관 상피 세포(liver biliary epithelial cell)로 분화 가능한 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  20. 제 15 항에 있어서, 상기 간 전구 세포는, 1차 간세포, 냉동보존된 1차 간세포, iPSC-유도된 간세포, 줄기세포로부터 유도된 간세포, HepG2 간세포, HepaRG 간세포, Hepg2/C3A 간세포, Huh-7 간세포, 또는 이들로부터 유도된 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  21. 제 15 항에 있어서, 상기 내피 세포는 1차 인간 내피 세포(primary human endothelial cell), 냉동보존된 1차 인간 내피 세포, HUVEC 세포, 간 시누소이드(liver sinusoid) 내피 세포, iPSC-유도된 내피 세포, 줄기세포 유도된 내피 세포, TMNK-1 세포, 또는 TRP3 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  22. 제 15 항에 있어서, 상기 바이오 조성물은 히알루론산, 콜라젠, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 케라탄설페이트, 피브린, 또는 알지네이트-기반 바이오 조성물 또는 간 탈세포화 세포외기질-기반 바이오 조성물, 또는 혈관 탈세포화 세포외기질-기반 바이오 조성물인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  23. 제 15 항에 있어서, 상기 3차원 간 체외모델은 3차원 프린터를 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  24. (a) 폴리머를 사용하여 하부 담관 채널을 형성하는 단계;
    (b) 상기 하부 담관 채널 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공 구조를 형성하는 단계;
    (c) 상기 미세기공 구조 상부에 간 전구세포(liver progenitor cell)를 포함하는 바이오 조성물을 사용하여 간 조직 모사 구조를 형성하는 단계;
    (d) 상기 간 조직 모사 구조 상부에 폴리머를 사용하여 상부 혈관 채널(upper vascular channel)을 형성하는 단계; 및
    (e) 상기 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포(endothelial cell)을 포함하는 바이오 조성물을 사용하여 내피 세포층을 형성하는 단계; 를 포함하는 3차원 간(liver) 체외모델을 제조하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 하부 담관 채널의 너비는 2 mm 이하인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 미세기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하이고, 상기 미세 기공의 두께는 700 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (a), (b), 또는 (d)에서 사용되는 폴리머는 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  28. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 간 전구세포는 간세포, 또는 간세포 및 간 담관 상피세포로 분화 가능한 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  29. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 간 전구 세포는, 1차 간세포, 냉동보존된 1차 간세포, iPSC-유도된 간세포, 줄기세포로부터 유도된 간세포, HepG2 간세포, HepaRG 간세포, Hepg2/C3A 간세포, Huh-7 간세포, 또는 이들로부터 유도된 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  30. 제 24 항에 있어서, 상기 내피 세포는 1차 인간 내피 세포(primary human endothelial cell), 냉동보존된 1차 인간 내피 세포, HUVEC 세포, 간 시누소이드(liver sinusoid) 내피 세포, iPSC-유도된 내피 세포, 줄기세포 유도된 내피 세포, TMNK-1 세포, 또는 TRP3 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  31. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (c) 또는 (e)에서의 바이오 조성물은 히알루론산(Hyaluronic acid), 콜라젠(Collagen), 젤라틴(Gelatin), 엘라스틴(Elastin), 피브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin), 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans), 헤파란설페이트(Heparan sulfate), 콘드로이틴설페이트(Chondroitin sulfate), 케라탄설페이트(Keratan sulfate), 피브린(Fibrin), 또는 알지네이트(Alginate)-기반 바이오 조성물, 간 탈세포화 세포외기질(liver decellularized extracellular matrix)-기반 바이오 조성물, 또는 혈관 탈세포화 세포외기질(vascular decellularized extracellular matrix)-기반 바이오 조성물인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  32. 제 24 항에 있어서, 상기 단계 (a) 내지 (e) 중 하나 이상의 단계는 3차원 프린터를 이용하여 행하는 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
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