KR102158016B1 - 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이의 제조 방법 - Google Patents

담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102158016B1
KR102158016B1 KR1020180119839A KR20180119839A KR102158016B1 KR 102158016 B1 KR102158016 B1 KR 102158016B1 KR 1020180119839 A KR1020180119839 A KR 1020180119839A KR 20180119839 A KR20180119839 A KR 20180119839A KR 102158016 B1 KR102158016 B1 KR 102158016B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
liver
dimensional
channel
vitro model
bile duct
Prior art date
Application number
KR1020180119839A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200044191A (ko
Inventor
이형석
조동우
Original Assignee
주식회사 에드믹바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 에드믹바이오 filed Critical 주식회사 에드믹바이오
Priority to KR1020180119839A priority Critical patent/KR102158016B1/ko
Priority to PCT/KR2019/004791 priority patent/WO2020075938A1/ko
Publication of KR20200044191A publication Critical patent/KR20200044191A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102158016B1 publication Critical patent/KR102158016B1/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C64/00—Additive manufacturing, i.e. manufacturing of three-dimensional [3D] objects by additive deposition, additive agglomeration or additive layering, e.g. by 3D printing, stereolithography or selective laser sintering
    • B29C64/10—Processes of additive manufacturing
    • B29C64/106—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 3차원 프린터를 이용한 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법 및 이 방법에 의해 제조된 3차원 간 체외 모델에 관한 것이다. 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 하부 담관 채널, 간세포, 및 상부 혈관 채널을 포함하는 이중 유동 채널을 구비하므로, 혈관 채널에 의한 영양분 공급과 담관 채널에 의한 담즙산 및 노폐물 배출이 가능한 실제 간 생체 구조와 매우 근접한 간 조직 모사 구조를 가진다. 따라서, 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 높은 신뢰도로 간 독성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이의 제조 방법{3D Liver In Vitro Model Having Biliary System and Method for Preparing the Same}
본 발명은 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
신약 개발에 있어서 간 독성 평가는 매우 중요한 부분이다. 이는 대부분의 약물이 간을 거쳐 해로운 물질들을 해독되는 과정을 거치기 때문이다. 실제로, 어떤 다른 조직에서 약물 독성이 없다는 것이 밝혀지더라도, 간 독성에 문제가 되어 사용할 수 없는 약물들이 매우 많은 것으로 알려져 있다. 따라서, 약물의 간 독성 평가는 신약 개발 과정에서 필수적인 과정이라 할 수 있다. 이러한 간 독성을 확인하기 위하여 다양한 플랫폼들이 이용되고 있다. 예를 들어, 2차원 세포 플랫폼, 3차원 세포 플랫폼, 장기 칩 플랫폼 등이 존재한다. 다양한 플랫폼들이 간 독성 테스트를 위한 플랫폼으로 이용되고 있으나, 간 조직을 완전하게 모사하는 플랫폼들은 전무하다. 완전한 간 조직 플랫폼을 위해서는, (i) 간세포의 3차원 배양, (ⅱ) 간세포 이외의 혈관 세포 및 담관 세포 등이 필요하며, (ⅲ) 간세포에서 만들어지는 담즙(Bile acid)을 제거할 수 있어야 한다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
대한민국 공개특허 제10-2017-0113253호
본 발명자들은 생체 환경을 매우 유사하게 모사하는 3차원 간 체외 모델 플랫폼을 제작하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 폴리머와 하이드로젤을 포함하는 바이오잉크를 사용한 3차원 프린팅 기술을 이용해 담관시스템이 포함된 3차원 간의 체외 모델을 성공적으로 제작하였고, 이의 우수한 기능을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 3차원 프린터를 이용하여 담관시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 방법으로 제조된 담관시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 3차원 프린터를 이용한 담관 시스템이 포함된 3차원 간(liver) 체외모델을 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 폴리머를 사용하여 하부 담관 채널(lower biliary channel)을 3차원 프린팅 하는 단계;
(b) 상기 하부 담관 채널 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공 구조(micro porous structure)을 3차원 프린팅하는 단계;
(c) 상기 미세기공 구조 상부에 간 전구세포(liver progenitor cell)을 포함하는 바이오 잉크를 사용하여 간 조직 모사 구조를 3차원 프린팅하는 단계;
(d) 상기 간 조직 모사 구조 상부에 폴리머를 사용하여 상부 혈관 채널(upper vascular channel)을 3차원 프린팅하는 단계; 및
(e) 상기 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포(endothelial cell)을 포함하는 바이오잉크를 사용하여 내피 세포층을 3차원 프린팅하는 단계.
이하에서, 본 발명을 각 단계 별로 나누어 상세히 설명한다.
단계 (a): 폴리머를 사용하여 하부 담관 채널을 3차원 프린팅 하는 단계
본 발명에서 하부 담관 채널은 3차원 프린터를 사용한 3차원 프린팅(3D printing) 기술을 이용하여 제조된다.
본 명세서에서 용어 "3차원 프린터"는 밀링 또는 절삭이 아닌, 기존 잉크젯 프린터에서 쓰이는 것과 유사한 적층 방식으로 입체물로 제작하는 장치를 의미하며, 일반적으로 컴퓨터로 제어되기 때문에 만들 수 있는 형태가 다양하고, 다른 제조 기술에 비해 사용하기 쉬운 이점이 있다.
본 명세서에서 용어 "3차원 프린팅"은 3차원 프린터를 사용하여 연속적인 계층의 물질을 뿌리면서 3차원 물체를 만들어내는 제조 기술을 의미한다. 3차원 프린팅 기술은 가루나 액체 형태의 재료를 굳혀가며 한 층씩 쌓는 방식의 "적층제조"방식과, 재료를 공구로 깎아가며 모양을 만드는 "절삭제조"방식으로 나누어진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 3차원 프린팅 방식은 적층제조 방식이다.
본 발명에서 3차원 프린팅 기술을 이용한 하부 담관 채널 제조시에 사용되는 재료 물질은 폴리머 물질이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 하부 담관 채널 제조에 사용되는 폴리머 물질은 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(Poly(ethylene-co-vinyl acetate), PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "하부 담관 채널(lower biliary channel)"은 본 발명의 3차원 간 체외 모델에서 간세포(hepatocyte)들이 분비하는 담즙산(bile acid) 및/또는 노폐물(waste product)들이 흘러 배출될 수 있는 관(tube)으로서의 역할을 하는 채널을 의미한다.
상기 하부 담관 채널의 모양이나 크기는 특별히 한정되지 않으나, 수 ㎛ 내지 수십 ㎝의 크기의 범위를 가질 수 있으며, 유체가 흐를 수 있는 관(tube) 형상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 하부 담관 채널의 너비는 2 mm 이하이며, 구체적으로는 0.01 mm 이상 ~ 2 mm 이하이고, 보다 구체적으로는 0.1 mm 이상 ~ 2 mm 이하이다. 상기 하부 담관 채널의 너비가 2 mm를 초과할 경우, 하부 담관채널의 형상이 유지되기 어렵고, 하부 담관 채널 상부에 미세기공 구조를 3차원 프린팅 하는 것이 어렵게 된다.
단계 (b): 상기 하부 담관 채널 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공 구조를 3차원 프린팅하는 단계
하부 담관 채널을 형성한 후, 상기 하부 담관 채널 상부에 폴리머를 이용한 3차원 프린팅 기술에 의해 미세기공을 갖는 구조를 형성한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 미세기공의 길이 방향의 크기는 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 ~ 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 1 ㎛ 이상 ~ 700 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 10 ㎛ 이상 ~ 700 ㎛ 이하이다.
또한, 상기 미세기공의 두께(폭)은 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 ~ 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 ~ 500 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 ~ 400 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 ~ 700 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 1 ㎛ 이상 ~ 200 ㎛ 이하, 가장 구체적으로는 5 ㎛ 이상 ~ 200 ㎛ 이하이다.
상기 미세기공은, 미세기공을 갖는 구조 상부에, 후술하는 바와 같이 세포를 포함하는 하이드로젤 바이오잉크를 프린팅하는 경우 상기 하이드로젤을 지지하는 지지대 역할을 한다.
상기 미세기공은 3차원 프린팅 기술을 통해 형성하고자 하는 미세기공의 모양과 크기 등을 먼저 디자인한 후, 상기 디자인한 미세기공을 3차원 프린팅 기술을 통해 제조한다. 상기 미세기공의 모양과 크기는 3차원 프린팅 조건, 예컨대 노즐 사이즈 또는 프린팅 속도를 조절하거나 변경하여 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미세기공 구조를 형성하는 폴리머 물질은 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(Poly(ethylene-co-vinyl acetate), PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단계 (c): 상기 미세기공 구조 상부에 간 전구 세포를 포함하는 바이오잉크를 사용하여 간 조직 모사 구조를 3차원 프린팅하는 단계
미세기공 구조를 형성한 후, 상기 미세기공 구조 상부에 간 전구 세포를 포함하는 바이오 잉크를 사용하여 간 조직 모사 구조를 3차원 프린팅 기술에 의해 형성한다.
본 명세서에서 사용되는 상기 용어 "간 조직 모사 구조"는 체외에서 실제 간 조직의 기능을 최대한 모사할 수 있도록 제조된 구조를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 "간 조직 모사 구조"는 간세포를 포함할 수 있으며, 추가적으로 담관 세포를 포함할 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 "간 전구세포"는 간세포(hepatocyte)로 분화될 수 있는 세포, 또는 간세포 및 담관 상피 세포로 분화 가능한 세포를 포함한다.
본 발명에서 상기 "간 전구세포"는 예를 들어 1차 간세포(primary hepatocyte), HepG2 간세포(liver cell line), HepaRG 간세포, 또는 이들로부터 유도된 세포를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오잉크"또는 "3차원 바이오잉크"는 3차원 프린터로 생체 모방 구조체를 형성하는 3차원 프린팅 기술에 사용되는 바이오 원천 소재 물질을 의미한다. 바이오 잉크는 인쇄적성(printability), 젤화(gelation)특성, 생분해성(biodegradability), 세포적합성(cell-compatibility)의 가져야 하며, 세포성장과 분화를 조절할 수 있는 특성을 가져야 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서의 바이오잉크는 히알루론산(Hyaluronic acid), 콜라젠(Collagen), 젤라틴(Gelatin), 엘라스틴(Elastin), 피브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin), 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans), 헤파란설페이트(Heparan sulfate), 콘드로이틴설페이트(Chondroitin sulfate), 케라탄설페이트(Keratan sulfate), 피브린(Fibrin), 또는 알지네이트(Alginate) 기반 바이오잉크 또는 간 탈세포화 세포외기질(liver decellularized extracellular matrix)-기반 바이오잉크일 수 있다.
단계 (d): 상기 간 조직 모사 구조 상부에 폴리머를 사용하여 상부 혈관 채널을 3차원 프린팅하는 단계
간 조직 모사 구조를 형성한 후, 상기 간 조직 모사 구조 상부에 폴리머를 사용한 3차원 프린팅에 의해 상부 혈관 채널을 형성한다.
본 명세서에서 용어 "상부 혈관 채널(upper vascular channel)"은 3차원 간 체외 모델의 간세포(hepatocyte)에 영양분을 공급할 수 있는 유체가 흐를 수 있는 관(tube)으로서의 역할을 하는 채널을 의미한다.
상기 상부 혈관 채널의 모양이나 크기는 특별히 한정되지 않으나, 수 ㎛ 내지 수십 ㎝의 크기의 범위를 가질 수 있으며, 유체가 흐를 수 있는 관(tube) 형상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상부 혈관 채널의 너비는 2 mm 이하이며, 구체적으로는 0.01 mm 이상 ~ 2 mm 이하이고, 보다 구체적으로는 0.1 mm 이상 ~ 2 mm 이하이다.
본 발명에서 3차원 프린팅 기술을 이용한 상부 혈관 채널 제조시에 사용되는 재료 물질은 폴리머 물질이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상부 혈관 채널 제조에 사용되는 폴리머 물질은 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(Poly(ethylene-co-vinyl acetate), PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단계 (e): 상기 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포를 포함하는 바이오잉크를 사용하여 내피 세포층을 3차원 프린팅하는 단계
상부 혈관 채널을 형성한 후, 상기 형성된 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포를 포함하는 바이오잉크를 사용하여 내피 세포층을 3차원 프린팅한다.
본 발명에서 용어 "내피 세포(endothelial cell)는 심장내강, 동맥, 모세혈관, 정맥, 또는 림프관 등의 내면을 덮는 단층의 편평한 세포를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 내피 세포는 HUVEC 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 바이오잉크는 히알루론산, 콜라젠, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 케라탄설페이트, 피브린, 또는 알지네이트-기반 바이오잉크일 수 있으며, 상기 바이오잉크는 혈관 탈세포화 세포외기질(vascular decellularized extraceullular matrix)-기반 바이오잉크일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 구조를 포함하는 3차원 프린터를 이용하여 제작된 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외모델을 제공한다:
(i) 폴리머를 사용하여 3차원 프린팅된 하부 담관 채널(lower biliary channel);
(ⅱ) 상기 하부 담관 채널 상부에, 폴리머를 사용하여 3차원 프린팅된 미세기공 구조(micro porous structure);
(ⅲ) 상기 미세 기공 구조 상부에, 간 전구세포(liver progenitor cell)을 포함하는 바이오잉크를 사용하여 3차원 프린팅된 간 조직 모사 구조;
(ⅳ) 상기 간조직 모사 구조 상부에 폴리머를 사용하여 3차원 프린팅된 상부 혈관 채널(upper vascular channel); 및
(v) 상기 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포(endothelial cell)을 포함하는 바이오잉크를 사용하여 3차원 프린팅된 내피 세포층.
본 발명의 3차원 간 체외모델은 하부 담관 채널; 그 상부에 간 조직 모사 구조; 및 상부 혈관 채널을 구비함으로써, 이중 유동 채널 구조를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 하부 담관 채널의 너비는 2 mm 이하인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제공한다. 구체적으로, 상기 하부 담관 채널의 너비는 0.01 mm 이상 ~ 2 mm 이하이고, 보다 구체적으로는 0.1 mm 이상 ~ 2 mm 이하이다. 상기 하부 담관 채널의 너비가 2 mm를 초과할 경우, 하부 담관채널의 형상이 유지되기 어렵고, 하부 담관 채널 상부에 미세 기공을 가지는 구조를 3차원 프린팅 하는 것이 어렵게 된다.
상기 미세기공구조에서 미세기공은 미세기공을 갖는 구조 상부에 바이오잉크를 사용하여 간 조직 모사 구조를 3차원 프린팅으로 형성하는 경우 이를 지지할 수 있은 지지대 역할을 한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 미세기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하이고, 상기 미세 기공의 두께(폭)은 700 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제공한다.
상기 미세기공의 길이 방향의 크기는 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 ~ 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 1 ㎛ 이상 ~ 700 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 10 ㎛ 이상 ~ 700 ㎛ 이하이다. 또한, 상기 미세기공의 두께(폭)은 700 ㎛ 이하이고, 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 ~ 700 ㎛ 이하, 보다 구체적으로는 0.1 ㎛ 이상 ~ 500 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 ~ 400 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 ~ 200 ㎛ 이하, 보다 더 구체적으로는 1 ㎛ 이상 ~ 200 ㎛ 이하, 가장 구체적으로는 5 ㎛ 이상 ~ 200 ㎛ 이하이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 폴리머는 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 간 전구세포는 간세포(hepatocyte), 또는 간세포 및 간 담관 상피 세포(liver biliary epithelial cell)로 분화 가능한 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 간 전구세포는 1차 간세포, HepG2 간세포, HepaRG 간세포, 또는 이들로부터 유도된 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 내피 세포는 HUVEC 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 바이오 잉크는 히알루론산, 콜라젠, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 케라탄설페이트, 피브린, 또는 알지네이트-기반 바이오잉크 또는 간 탈세포화 세포외기질-기반 바이오잉크, 또는 혈관 탈세포화 세포외기질-기반 바이오잉크인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제공한다.
본 발명은 3차원 프린터를 이용한 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법 및 이 방법에 의해 제조된 3차원 간 체외 모델에 관한 것이다. 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 하부 담관 채널, 간세포, 및 상부 혈관 채널을 포함하는 이중 유동 채널을 구비하므로, 혈관 채널에 의한 영양분 공급과 담관 채널에 의한 담즙산 및 노폐물 배출이 가능한 실제 간 생체 구조와 매우 근접한 간 조직 모사 구조를 가진다. 따라서, 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 높은 신뢰도로 간 독성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명 3차원 간 체외 모델의 디자인을 보여준다.
도 2a는 본 발명에 따라 제작한 3차원 간 체외모델의 구조를 보여준다. 패널 A는 세포가 3차원 프린팅된 3차원 간 체외모델의 전체 구조를 보여준다. 패널 B는 상부 채널과 하부 채널로 구성되는 이중 채널을 보여준다. 패널 C는 패널 A의 사진에서 상부 혈관 채널, 하부 혈관 채널, 프린팅된 미세기공 구조, 및 간세포를 포함하는 A-A' 단면의 구조를 보여준다. 패널 D는 3차원 프린팅된 미세기공 구조 및 HepaRG-간-dECM 바이오잉크로 프린팅된 구조의 SEM 이미지이다(스케일 막대: 300 ㎛).
도 2b는 미세기공을 갖는 구조를 제조하기 위한 3차원 프린팅 경로와 이 경로에 따라 제조된 미세기공 구조를 보여준다.
도 3a는 PCR 방법에 의해 본 발명의 3차원 간 체외 모델에서 담관 특이 유전자 발현을 측정한 결과이다. 담관시스템을 갖는 3차원 간 체외 모델과 담관시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델에서 실험 7일 째에 담관 특이적 유전자 CK19, MRP2, 및 OATP1B3의 발현을 측정한 결과이다(*P<0.05, **P<0.01).
도 3b는 면역 염색방법에 의해 본 발명의 3차원 간 체외 모델에서 담관 특이 유전자의 발현을 측정한 결과이다. 담관시스템을 갖는 3차원 간 체외 모델과 담관시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델에서 실험 7일 째에 대표 유전자인 MRP2의 발현 단백질 면역 형광 염색 결과이다(Z-stack images, 스케일 막대: 100 μm).
도 4a는 담관시스템을 갖는 본 발명의 3차원 간 체외 모델(W/Biliary)과 담관시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델(WO/Biliary)에서 간 특이 유전자인 ALB (Albumin, 알부민) 유전자, AFP(fetal hepatic marker alpha-fetoprotein) 유전자, 및 성숙 간-특이 유전자 TTR (transthyretin)의 발현 수준을 측정한 결과이다(*P<0.05, *P<0.005).
도 4b는 담관시스템을 갖는 본 발명의 3차원 간 체외 모델(W/ Biliary)과 담관시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델(W/O Biliary)에서 알부민(albumin)과 우레아(urea)의 분비 수준을 측정한 결과이다.(*P<0.05).
도 4c는 담관시스템을 갖는 본 발명의 3차원 간 체외 모델(W/ Biliary)과 담관시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델(W/O Biliary)에서 CYP1A2, CYP3A4, 및 CYP2C19의 유전자 발현 수준을 측정한 결과이다.(*P<0.05, **P<0.01)
실시예
실시예 1: 3차원 간 체외 모델의 제조
(1) 3차원 간 체외 모델의 디자인
실제 생체 간(liver)에서는 혈액 및 담즙(bile)이 간의 동맥, 정맥 및 담관을 통해 흐른다. 따라서, 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 실제 간 구조를 모사하여 2개의 유동 채널인 상부 혈관 채널과 하부 담관 채널을 각각 포함하도록 제작하였다. 상부 혈관 채널은 세포에 영양분을 제공하는 역할을 하며, 하부 담관 채널은 간 조직으로부터 담즙산(bile acid)과 노폐물을 배출하도록 설계하였다. 상부 혈관 채널과 하부 담관 채널의 사이에, 먼저 미세기공을 갖는 구조를 3차원 프린팅한 후, 이 미세기공 구조 상부에 간세포(hepatocyte) 및 내피세포(endothelial cell)를 3차원 프린팅하여 배치시켜 전체적으로 간 조직 모사 구조를 이루도록 제작하였다(도 1 참조).
(2) 하부 담관 채널의 프린팅
투명하고 멸균한 메타크릴레이트(PMMA) 플레이트상에 채널의 너비가 2 mm 미만이 되도록 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA, Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)를 재료로 사용한 3차원 프린터를 이용하여 하부 담관 채널을 3차원 프린팅하였다. 상기 하부 담관 채널의 3차원 프린팅시에 배양액 수용부(medium reservoir)도 함께 프린팅하였다.
(3) 미세기공 구조(micro pore structure)의 프린팅
상기 PMMA 상에 3차원 프린팅한 하부 담관 채널의 상부에 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA, Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)를 재료로 사용한 3차원 프린터를 이용하여 미세 기공을 갖는 구조를 3차원 프린팅하였다. 이때, 미세 기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하가 되도록 프린팅하였고, 미세 기공의 두께(폭)는 200 ㎛ 이하가 되도록 프린팅하였다. 상기 미세기공의 형성은 도 2b에 왼쪽 패널 그림에 도시된 바와 같이, 초록색으로 표시한 3차원 프린팅 경로를 설정한 후, 설정된 경로에 따라 적합한 프린팅 조건(노즐 사이즈, 프린팅 속도)을 설정하여 프린팅하여 완성하였다. 상기 미세기공 구조 및 미세기공 구조에서의 미세 기공의 크기는 3차원 간 체외 모델에서 노폐물의 배출과, 후술하는 HepaRG-간 dECM 바이오잉크를 지탱하는데 있어서 매우 중요한 역할을 한다.
(4) 간 조직 모사 구조의 프린팅
상기 미세 기공 구조 상부에 간 전구세포(liver progenitor cell)을 포함하는 바이오잉크를 사용한 3차원 프린터를 이용하여 간 조직 모사 구조를 3차원 프린팅하였다.
상기 간 전구세포로는 HepaRG 세포주를 Biopredic International (프랑스)로부터 구입하여 사용하였다. HepaRG 세포주는 간세포 및 간 담관상피세포(liver biliary-epithelial cell)로 분화될 수 있는 간 전구 세포(liver progenitor cell)이다. 분화된 HepaRG 세포주는 사용하기 전까지 제조자 제공의 지시서에 따라 세포를 37℃에서 5% CO2 분위기하에서 배양하면서 유지하였다.
HepaRG 세포 프린팅을 위해서, 간 탈세포화 세포외기질(liver decellularized extracelluar matrix, "간-dECM") 바이오 잉크를 준비하였다. 간-dECM 바이오잉크는 문헌 "Lee, Hyungseok, et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering, Biomacromolecules 18.4 (2017): 1229-1237"에 기재된 프로토콜에 따라 제조하였다. 세포 프린팅을 행하기 전에, HepaRG 세포를 간-dECM 바이오잉크에 봉입(encapsulate)시켰다. HepaRG-간 dECM 바이오잉크 혼합물(5 ~ 10 x 106 세포/ml)을 상기 미세기공 구조 상부에 주위 장벽과 함께 3차원 프린팅하였다.
(5) 상부 혈관 채널의 프린팅
상기 HepaRG-간 dECM 바이오잉크 혼합물의 프린팅을 행한 후, 채널의 너비가 2 mm 미만이 되도록 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA, Polysciences Inc., Warrington, PA, USA)를 재료로 사용한 3차원 프린터를 이용하여 상부 혈관 채널을 3차원 프린팅하였다. 상기 상부 혈관 채널의 3차원 프린팅시에 배양액 수용부(medium reservoir)도 함께 프린팅하였다.
(6) 내피 세포(endothelial cell)층의 프린팅
상부 혈관 채널을 프린팅 한 후, 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포층을 프린팅하였다. 내피세포로는 HUVEC 세포주를 사용하였다. HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells) 세포주는 Lonza (Basel, Switzerland)에서 구입하였다. HUVEC 세포는 완전 내피 세포 배지(complete endothelium medium) (EGM-2 BulletKit, Lonza)를 사용하여 배양하였다. 세포는 37℃에서 5% CO2 분위기하에서 배양하여 유지하였다.
HUVEC 세포 프린팅을 위해서, 젤라틴 바이오잉크를 준비하였다. 젤라틴 바이오잉크는 3% w/v 젤라틴 (Porcine skin G6144-500G, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로서, 젤라틴을 무혈청 내피세포 배지(EGM, Lonza)에 녹여서 제조하였다.
세포 프린팅을 행하기 전에, HUVEC 세포를 젤라틴 바이오잉크에 봉입(encapsulate)시켰다. HUVEC-젤라틴 바이오잉크 혼합물(1 ~ 2 x 106 세포/ml)을 상기 상부 혈관 채널의 빈 공간을 채우도록 프린팅하였다. HUVEC 세포가 포함된 젤라틴 바이오잉크를 프린팅한 후, 이를 인큐베이션하여 액체상에서 젤라틴을 제거하였다. 모든 세포 프린팅 공정을 행한 후에, 프린팅된 3차원 간 체외모델을 37℃에서 인큐베이션하여 안정화시켰다. 3차원 간 체외모델의 내부 구조를 확인하기 위해, 구조를 수평방향으로 슬라이스한 후 상온에서 진공하에서 건조시켰다. 건조된 구조물을 백금(platinum)으로 코팅하였다(Ion Sputter E-1045, Hitachi, Tokyo, Japan). 이어서, 15 kV의 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy) (SEM, SU-6600, Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용하여 미세기공 구조와 세포-바이오잉크의 구조를 관찰하였다(도 2 참조).
실시예 2 : 3차원 간 체외 모델에서 유체 흐름
실시예 1에서 제작한 3차원 간 체외 모델에서 상부 혈관 채널과 하부 담관 채널은 2가지의 서로 다른 유체가 흐르도록 하였다(도 2의 패널 B 참조).
상부 혈관 채널에는 3차원 간 체외 모델 내부에 존재하는 세포들에게 영양분을 공급하기 위한 유체가 흐르고, 하부 담관 채널을 통해서는 3차원 간 체외 모델 내부에 존재하는 간세포(hepatocyte)들이 분비하는 담즙산 및 노폐물들이 빠져나가게 된다. 본 발명의 3차원 간 체외 모델에서는 서로 분리된 유체 흐름은 각각의 역할을 수행하는 동시에 원활한 유체 전달이 가능하도록 함으로써, 3차원 간 체외모델에서 각 세포들의 기능을 증대시킨다. 또한, 본 발명의 3차원 간 체외 모델은 높이 차를 이용한 중력 기반 미세 유체 환경이 지속적으로 유지된다.
실시예 3 : 하부 담관 채널을 갖는 3차원 간 체외 모델의 기능 평가
본 발명의 3차원 간 체외 모델의 특징 중의 하나는 담관 채널을 구성하여 생체 간 조직에서 담관 시스템을 모사하였다는 점이다. 담관 채널을 갖는 3차원 간 체외 모델(W/Biliary)과 담관 채널을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델(WO/Biliary)의 기능을 비교 분석하였다.
(1) 실험방법
① RNA 추출과 정량 실시간 PCR
3차원 간 체외 모델을 1주일간 배양한 후에, 이로부터 샘플을 수득하고, 각 샘플에서 TRIzolㄾ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여, 총 RNA를 추출하였다. Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하고, SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR machine (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머들은 Primer Express 3.0 software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 디자인하였다. GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), ALB(albumin), AFP(alpha-fetoprotein), TTR (transthyretin), cytokeratin 19 (CK19), MRP2 (multidrug resistance-associated protein 2), OATP1B3 (organic anion transporter protein 1B3), 및 CYP(Cytochromes)1A2, CYP3A4, 및 CYP2C19에 대한 전방향 프라이머와 역방향 프라이머들은 바이오니어(Bioneer, 한국)으로부터 구입하였다. 타겟 유전자들의 발현 수준은 GAPDH 유전자 발현 수준에 대해 정규화(normalize)하였다.
Figure 112018099091393-pat00001
② 면역형광염색
샘플을 상온에서 15분간 4％-파라포름알데히드에서 고정화하였다. 투과화(permeabilization)는 0.1％ Triton X-100을 사용하여 15분간 수행하였다. 이어서, 비특이적 결합을 방지하기 위해 샘플을 3％ 우혈청알부민(Affimetrix, USA)으로 15분간 처리하였다. 각 단계에서, 샘플은 15분간 PBS로 3최 세척하였다. 항-인간 MRP2 래빗 항체 (Abcam, UK), 샘플을 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. PBS로 세정한 후, 샘플을 Alexa Fluor 594 고우트(goat) 항-래빗 항체로 처리하였다.
③ 간기능 측정
제조한 3차원 간 체외 모델의 간 기능 테스트로서, 3차원 간 체외 모델로부터 분비된 알부민/우레아를 분석하기 위해 배지(medium)를 수득하였다. 분비된 알부민은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) (DuoSet ELISA Development System, Genzyme, USA)를 사용하여 정량하였다. 분비된 우레아는 우레아 분석 키트 (BioVision, USA)를 사용하여 정량하였다. 정량은 마이크로플레이트 리더(Epoch 2 Microplate Spectrophotometer, BioTek, USA)를 사용하여 수행하였다.
(2) 담관 특이 유전자 발현의 측정 결과
CK19 (Cytokeratin 19)는 담관 세포에서 발현되는 유전자 중의 하나이고(J. Tan, et al., Liver International 2002, 22, 365.); MRP2 (multidrug resistance-associated protein 2)는 간 특이적 담즙 운반체이고(T. Grix, et al., Genes 2018, 9, 176); OATP1B3 (Organic Anion Transporter Protein 1B3)은 약물과 담즙산을 포함하는 다양한 화합물들의 간 흡수를 조절하는 막 운반 단백질(membrane transport protein)이다. 담관 시스템을 갖는 3차원 간 체외모델(W/biliary)에서 실제 간과 유사한 환경을 유도하는지를 평가하기 위해 주요 담관 특이적 유전자인 CK19, MRP2, 및 OATP1B3의 유전자의 발현을 측정하였다(도 3a 참조).
실험결과, 담관 시스템을 갖는 3차원 간 체외모델(W/biliary)에서 CK19, MRP2, 및 OATP1B3 유전자의 발현 수준이, 담관 시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외모델(WO/biliary)의 유전자의 발현 수준과 비교하여 유의성 있게 높았다. 이는 담관 시스템을 갖는 모델이 간 조직의 모사에 더욱 효과적이라는 것을 암시한다.
또한, 단백질 수준에서의 발현 수준을 평가하기 위해, 면역 염색법을 이용하여 MRP2 유전자의 단백질 발현 수준을 분석하였다(도 3b). 그 결과, PCR 분석 결과와 일치하게, 담관 시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델과 비교하여, 담관 시스템을 갖는 3차원 간 체외 모델에서 HepaRG 세포는 MRP2 유전자의 단백질 발현 수준이 더욱 높게 나타났다.
담관 시스템을 갖는 모델에서 담관 특이적 유전자의 발현이 더욱 높게 나타난 것은 상부 혈관 채널을 통해 충분한 영양분과 산소가 세포들에게 공급되고, 하부 담관 채널을 통해 담즙산과 노폐물이 배출된 결과이다.
(3) 간 세포 특이 유전자 발현, 간 기능 및 해독 능력 측정
담관 시스템의 존재 여부에 따라, 3차원 간 체외 모델에서의 간 기능들이 향상되는지를 조사하였다. 간세포 특이적 유전자 발현 수준, 알부민/우레아 분비 및 시토크롬 450(CYP) 유전자 발현 수준을 분석하였다.
알부민(ALB) 유전자, AFP(fetal hepatic marker alpha-fetoprotein) 유전자, 및 성숙 간-특이 유전자 TTR(transthyretin)의 발현을 측정한 결과, 담관 시스템을 갖는 3차원 간 체외 모델에서 담관 시스템을 갖지 않는 3차원 간 체외 모델 보다 더 높게 나타났는데, 이는 간기능이 더 우수하다는 것을 나타낸다(도 4a 참조).
또한, 세포 배양 동안에 배지에서 분비된 알부민과 우레아의 수준을 측정하였다. 그 결과, 담관 시스템이 없는 모델과 비교하여, 담관 시스템을 갖는 3차원 간 체외 모델에서 알부민 및 우레아의 수준이 더 높게 나타났다(도 4b 참조).
이러한 기능의 향상은 간 기능을 정확하게 반영하기 때문에 약물 스크리닝에서 매우 유용하다. 하부 담관 채널을 갖지 못하는 간 체외 모델의 경우 세포에 의해 생성된 세포 독성을 갖는 노폐물과 담즙산이 제거되지 못하고 축적된다. 그러나, 담관 시스템을 갖는 경우, 배지가 상부 채널 및 하부 채널 모두를 통해 공급되고, 담즙은 간-담관 시스템을 통해 효과적으로 제거될 수 있다.
간 기능 확인실험에 이어서, 약물 대사 및 해독 과정에 강하게 관련되어 있는 핵심 CYP 효소인 CYP1A2, CYP3A4, 및 CYP2C19의 유전자 발현 수준을 조사하였다. 모든 CYP 유전자 발현 수준은 담관 시스템을 갖지 않는 체외 간 모델 보다 담관 시스템을 갖는 체외 간 모델에서 더욱 높게 나타났다(도 4c 참조). 이러한 결과들은 담관 시스템을 갖는 간 모델에서 더욱 우수한 해독 능력을 갖는다는 것을 암시한다. CYP3A4는 다양한 약물의 대사에 관련되어 있는 풍부하고 중요한 효소이고, 새로운 약물에도 매우 강하게 관련되어 있다. 또한, CYP3A4는 담즙산의 해독에도 관련되어 있다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 체외 간 모델에서 CYP3A4의 높은 발현은 더 높은 약물 대사 및 해독 능력을 암시한다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
<110> POSTECH Research and Business Development Foundation <120> 3D Liver In Vitro Model Having Biliary System and Method for Preparing the Same <130> DPB182911 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for GAPDH <400> 1 atggaaatcc catcaccatc tt 22 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for GAPDH <400> 2 cgccccactt gattttgg 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for ALB <400> 3 tgaggttgct catcggttta aa 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for ALB <400> 4 gcaatcaaca ccaaggcttt g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for AFP <400> 5 caacttgagg ctgtcattgc a 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for AFP <400> 6 ctggccttgg cagcattt 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for TTR <400> 7 tggcatctcc ccattccat 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for TTR <400> 8 cggagtcgtt ggctgtgaa 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for CK19 <400> 9 tgagcggcag aatcaggagt a 21 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for CK19 <400> 10 ctccagccgc gacttga 17 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for MRP2 <400> 11 gtcacgaccc cagcttcaa 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for MRP2 <400> 12 cccaagcgaa ggttccatta 20 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for OATP1B3 <400> 13 cgatgatatc cttcttgttt caacttc 27 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for OATP1B3 <400> 14 gccggcaact gatttgct 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for CYP1A2 <400> 15 gccttggaca gcagcaactc 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for CYP1A2 <400> 16 accactttgc catccactat cc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for CYP3A4 <400> 17 accactttgc catccactat cc 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for CYP3A4 <400> 18 catgctgtag gccccaaaga 20 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer for CYP2C19 <400> 19 caagaatcga tggacatcaa caa 23 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer for CYP2C19 <400> 20 tctccatttt gatcaggaag ca 22

Claims (16)

  1. (a) 폴리머를 사용하여 하부 담관 채널(lower biliary channel)을 3차원 프린팅 하는 단계;
    (b) 상기 하부 담관 채널 상부에 폴리머를 사용하여 미세기공 구조(micro porous structure)을 3차원 프린팅하는 단계;
    (c) 간 전구세포(liver progenitor cell)을 봉입한 바이오잉크를 사용하여 상기 미세기공 구조 상부에 간 조직 모사 구조를 3차원 프린팅하는 단계;
    (d) 상기 간 조직 모사 구조 상부에 폴리머를 사용하여 상부 혈관 채널(upper vascular channel)을 3차원 프린팅하는 단계;
    (e) 내피 세포(endothelial cell)를 봉입한 바이오잉크를 사용하여 상기 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 내피 세포층을 3차원 프린팅하는 단계;
    를 포함하여, 상기 상부 혈관 채널에서 배출된 영양분이 상기 간 조직 모사 구조로 이동하거나, 상기 간 조직 모사 구조로부터 배출된 담즙산과 노폐물이 상기 하부 담관 채널로 이동 시 중력에 의해 하향 이동이 가능한, 3차원 프린터를 이용한 담관 시스템이 포함된 3차원 간(liver) 체외모델을 제조하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 하부 담관 채널의 너비는 2 mm 이하인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 미세기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하이고, 상기 미세 기공의 두께는 700 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a), (b), 또는 (d)에서 사용되는 폴리머는 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 간 전구세포는 간세포(hepatocyte), 또는 간세포 및 간 담관 상피세포(liver biliary epithelial cell)로 분화 가능한 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 간 전구세포는, 1차 간세포, HepG2 간세포, HepaRG 간세포 또는 이들로부터 유도된 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 내피 세포는 HUVEC 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c) 또는 (e)에서의 바이오 잉크는 히알루론산(Hyaluronic acid), 콜라젠(Collagen), 젤라틴(Gelatin), 엘라스틴(Elastin), 피브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin), 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans), 헤파란설페이트(Heparan sulfate), 콘드로이틴설페이트(Chondroitin sulfate), 케라탄설페이트(Keratan sulfate), 피브린(Fibrin), 또는 알지네이트(Alginate)-기반 바이오잉크, 간 탈세포화 세포외기질(liver decellularized extracellular matrix)-기반 바이오잉크, 또는 혈관 탈세포화 세포외기질(vascular decellularized extracellular matrix)-기반 바이오 잉크인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델을 제조하는 방법.
  9. (i) 폴리머를 사용하여 3차원 프린팅된 하부 담관 채널(lower biliary channel);
    (ⅱ) 상기 하부 담관 채널 상부에, 폴리머를 사용하여 3차원 프린팅된 미세 기공 구조(micro porous structure);
    (ⅲ) 간 전구세포(liver progenitor cell)을 봉입한 바이오잉크를 사용하여 상기 미세 기공 구조 상부에 3차원 프린팅된 간 조직 모사 구조;
    (ⅳ) 상기 간 조직 모사 구조 상부에 폴리머를 사용하여 3차원 프린팅된 상부 혈관 채널(upper vascular channel); 및
    (v) 내피 세포(endothelial cell)를 봉입한 바이오잉크를 사용하여 상기 상부 혈관 채널 상부 또는 주위에 3차원 프린팅된 내피 세포층;
    을 포함하여, 상기 상부 혈관 채널에서 배출된 영양분이 상기 간 조직 모사 구조로 이동하거나, 상기 간 조직 모사 구조로부터 배출된 담즙산과 노폐물이 상기 하부 담관 채널로 이동 시 중력에 의해 하향 이동이 가능한, 3차원 프린터를 이용한 담관 시스템이 포함된 3차원 간(liver) 체외모델.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 하부 담관 채널의 너비는 2 mm 이하인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 미세기공의 크기는 길이 방향으로 700 ㎛ 이하이고, 상기 미세 기공의 두께는 700 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리(에틸렌/비닐아세테이트)(PEVA), 폴리락틱-co-글리콜산(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리글리콜산(PGA), 폴리에테르설폰(PES), 폴리우레탄(PU), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA) 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 폴리 [(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)]으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 간 전구 세포는 간세포(hepatocyte), 또는 간세포 및 간 담관 상피 세포(liver biliary epithelial cell)로 분화 가능한 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 간 전구 세포는 1차 간세포, HepG2 간세포, HepaRG 간세포, 또는 이들로부터 유도된 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  15. 제 9 항에 있어서, 상기 내피 세포는 HUVEC 세포인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
  16. 제 9 항에 있어서, 상기 바이오 잉크는 히알루론산, 콜라젠, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 글리코사미노글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 케라탄설페이트, 피브린, 또는 알지네이트-기반 바이오잉크 또는 간 탈세포화 세포외기질-기반 바이오잉크, 또는 혈관 탈세포화 세포외기질-기반 바이오잉크인 것을 특징으로 하는 3차원 간 체외모델.
KR1020180119839A 2018-10-08 2018-10-08 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이의 제조 방법 KR102158016B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180119839A KR102158016B1 (ko) 2018-10-08 2018-10-08 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이의 제조 방법
PCT/KR2019/004791 WO2020075938A1 (ko) 2018-10-08 2019-04-19 다공성 이중 유동 채널, 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이들의 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180119839A KR102158016B1 (ko) 2018-10-08 2018-10-08 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200044191A KR20200044191A (ko) 2020-04-29
KR102158016B1 true KR102158016B1 (ko) 2020-09-21

Family

ID=70466904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180119839A KR102158016B1 (ko) 2018-10-08 2018-10-08 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이의 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102158016B1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017070542A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Systems and methods for producing micro-engineered models of the human cervix
US20170158997A1 (en) * 2015-12-04 2017-06-08 President And Fellows Of Harvard College Devices for simulating a function of a liver tissue and methods of use and manufacturing thereof
WO2018017605A1 (en) 2016-07-18 2018-01-25 President And Fellows Of Harvard College Human lymphoid tissue-on-chip
CN108004144A (zh) 2017-12-18 2018-05-08 清华大学深圳研究生院 一种含管道网络的器官芯片单元
US20180221874A1 (en) 2015-08-07 2018-08-09 President And Fellows Of Harvard College Fluidic devices incorporating functional muscle tissue and methods of use

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170113253A (ko) 2016-03-25 2017-10-12 포항공과대학교 산학협력단 3차원 세포 프린팅 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180221874A1 (en) 2015-08-07 2018-08-09 President And Fellows Of Harvard College Fluidic devices incorporating functional muscle tissue and methods of use
WO2017070542A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Systems and methods for producing micro-engineered models of the human cervix
US20170158997A1 (en) * 2015-12-04 2017-06-08 President And Fellows Of Harvard College Devices for simulating a function of a liver tissue and methods of use and manufacturing thereof
WO2018017605A1 (en) 2016-07-18 2018-01-25 President And Fellows Of Harvard College Human lymphoid tissue-on-chip
CN108004144A (zh) 2017-12-18 2018-05-08 清华大学深圳研究生院 一种含管道网络的器官芯片单元

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200044191A (ko) 2020-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019203265B2 (en) Engineered liver tissues, arrays thereof, and methods of making the same
Zhang et al. 3D bioprinting of urethra with PCL/PLCL blend and dual autologous cells in fibrin hydrogel: An in vitro evaluation of biomimetic mechanical property and cell growth environment
EP2756073B1 (en) Engineered tissues for in vitro research uses, arrays thereof, and methods of making the same
AU2013277275B2 (en) Engineered three-dimensional connective tissue constructs and methods of making the same
Lima et al. Bottom-up approach to construct microfabricated multi-layer scaffolds for bone tissue engineering
KR102158016B1 (ko) 담관 시스템이 포함된 3차원 간 체외 모델 및 이의 제조 방법
Lee et al. Perichondrium-inspired permeable nanofibrous tube well promoting differentiation of hiPSC-derived pellet toward hyaline-like cartilage pellet
Alekseeva Introducing controllable 3D features into dense collagen constructs for tissue engineering applications

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant