WO2020070369A1 - Cepa de bifidobacterium longum sub. infantis y uso de la misma - Google Patents

Cepa de bifidobacterium longum sub. infantis y uso de la misma

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WO2020070369A1
WO2020070369A1 PCT/ES2019/070673 ES2019070673W WO2020070369A1 WO 2020070369 A1 WO2020070369 A1 WO 2020070369A1 ES 2019070673 W ES2019070673 W ES 2019070673W WO 2020070369 A1 WO2020070369 A1 WO 2020070369A1
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WO
WIPO (PCT)
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strain
composition
liver
infantis
bifidobacterium longum
Prior art date
Application number
PCT/ES2019/070673
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yolanda Sanz Herranz
Alfonso BENITEZ-PÁEZ
Eva Mª GÓMEZ DEL PULGAR VILLANUEVA
Rubén FRANCÉS GUARINOS
Isabel GÓMEZ-HURTADO CUBILLANA
Paula PIÑERO ROMERO
Oriol JUANOLA JUÁREZ
Original Assignee
Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Fundacion De La Comunitat Valenciana Para La Gestión De Instituto De Investigación Sanitaria Y Biomédica De Alicante (Fundación Para La Gestión De Isabial)
Universidad Miguel Hernandez De Elche
Consorcio Centro De Investigación Biomédica En Red (Ciber)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior De Investigaciones Científicas, Fundacion De La Comunitat Valenciana Para La Gestión De Instituto De Investigación Sanitaria Y Biomédica De Alicante (Fundación Para La Gestión De Isabial), Universidad Miguel Hernandez De Elche, Consorcio Centro De Investigación Biomédica En Red (Ciber) filed Critical Consejo Superior De Investigaciones Científicas
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria

Definitions

  • the present invention relates to the Bifidobacterium longum sub strain.
  • infantis CECT 9720 its cellular components, metabolites, and secreted molecules, and compositions comprising the above products, as well as the use of said strain for the prevention and / or treatment of diseases that cause intestinal and / or hepatic inflammation, as well as pathologies derived from them, such as, for example, liver cirrhosis.
  • the present invention falls within the field of therapeutic activity of pharmaceutical compositions or preparations, as well as within the field of food.
  • the human being is home to around 10 trillion intestinal bacteria, and its genome has a coding capacity much higher than that of the human (about 100-150 times higher).
  • the gastrointestinal tract is the largest surface area of the body with an epithelial surface of approximately 400 m 2 , constantly exposed to these live microorganisms.
  • Existing symbiosis demonstrated by lack of pro-inflammatory response against commensal bacteria (Littman DR et al. Role of the commensal microbiota in normal and pathogenic host immune responses. Cell host & microbe 201 1; 10 (4): 311-23; Hooper LV et al J. Interactions between the microbiota and the immune system.
  • the gut microbiota has been shown to have a direct role in the progression and development of complications in liver disease (Bajaj. JS et al. Linkage of gut microbiome with cognition in hepatic encephalopathy.
  • Cirrhosis is the common final stage of different liver diseases characterized by a histological distortion of the liver with the presence of regenerative nodules causing portal hypertension (Bosch J. et al Pathophysiology of portal hypertension. Gastroenterology clinics of North America 1992; 21 (1): 1-14). This fact, in turn, alters intestinal motility by inducing intestinal bacterial overgrowth (SBI) (Morencos F. C. Et al. Small bowel bacterial overgrowth in patients with alcoholic cirrhosis. Digestive diseases and Sciences 1995; 40 (6): 1252- 6; Pande C. Small- intestinal bacterial overgrowth in cirrhosis is related to the severity of liver disease.
  • SBI intestinal bacterial overgrowth
  • Small-intestinal bacterial overgrowth in cirrhosis is related to the severity of liver disease.
  • Hepatology 1998; 28 (5): 1187- 90 has been studied intensively in recent years and has highlighted the importance of constant communication between the intestine and the liver during the management of patients with cirrhosis (Garcia-Tsao G. et al. Gut microflora in the pathogenesis of the complications of cirrhosis. Best Pract f ⁇ es Clin Gastroenterol 2004; 18 (2): 353-72).
  • Complications such as hepatic encephalopathy (HD), spontaneous bacterial peritonitis (PBE), and bleeding from varicose veins in Cirrhotic patients are directly caused or aggravated by the translocation of enteric microbiota or its products to extra-intestinal territories.
  • HD hepatic encephalopathy
  • PBE spontaneous bacterial peritonitis
  • bleeding from varicose veins in Cirrhotic patients are directly caused or aggravated by the translocation of enteric microbiota or its products to extra-intestinal territories.
  • the direct communication between the liver and the intestine through the portal circulation plays an important role in the progression of complications of cirrhosis, the intestinal microbiota being a key regulator of inflammation and bacterial translocation in this context (Garcia-Tsao G. et al. Gut microflora in the pathogenesis of the complications of cirrhosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2004; 18 (2): 353-72).
  • endotoxins are immunogenic molecules derived from the cell walls of Gram-negative bacteria present in the gut microbiota, which can over-activate the innate immune system and break down immune homeostasis and gut barrier function.
  • probiotic strains of species belonging to the genus Bifidobacterium and Lactobacillus have been specially used for the treatment and / or prevention of various pathologies so that they naturally restore a situation of intestinal homeostasis, improving the symbiotic interaction between the microbiota and the Patients' immune system, while avoiding the non-selective eradication of microbiota associated with the use of antibiotics and the appearance of resistance, the main problems that occur with the use of antibiotics.
  • strains of Bifidobacterium longum subp has been related. infantis with the treatment of intestinal pathologies, for example:
  • WO2009134948A1 discloses the treatment of inflammatory bowel disorders including irritable bowel syndrome, lymphocytic colitis, collagen colitis, and indeterminate colitis, by administering a composition comprising an anti-inflammatory active agent and a probiotic such as Bifidobacterium infantis diseases, as an adjuvant,
  • W02010105207A1 refers to a composition useful for stimulating the growth of the beneficial microbiota, including species of the genus Bifidobacterium, in order to regulate bacterial dysbiosis in an animal.
  • the composition comprises galactooligosaccharides and a Bifidobacterium longum subps strain. infantis and as indicated may be used to treat, among other diseases, colitis, Crohn's disease, irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease,
  • the present invention relates to the strain Bifidobacterium longum subsp. infantis CECT 9720, to the cellular components, metabolites, secreted molecules of said strain, and to the compositions comprising the above products, as well as to their use for the prevention and / or treatment of intestinal and / or hepatic inflammation, and derived pathologies such as liver cirrhosis.
  • the strain of the The invention exhibits activity simultaneously in more than one of the indicated diseases.
  • the CECT 9720 strain which belongs to the species Bifidobacterium longum subsp. Infantis reduces peripheral levels of proinflammatory cytokine TNF-a and IL-6 in vivo in a model of liver damage and also reduces peripheral levels of proinflammatory cytokine TNF-a, IL-6 and MCP-1 in vivo in a intestinal inflammation model. Furthermore, this strain exerts its effect without inducing a proinflammatory response in vitro in Kupffer cells isolated from the liver or in isolated macrophages from the intestinal wall, which is essential in any strain with potential use as a probiotic. All this makes the strain of the present invention a bacterial strain of potential interest for probiotic use by reducing liver and intestinal inflammation.
  • the present invention brings to the state of the art a strain of the species Bifidobacterium longum subsp. infantis for the treatment of intestinal inflammation, liver inflammation and derived pathologies such as, for example, liver cirrhosis.
  • an aspect of the present invention relates to a strain of Bifidobacterium longum subsp. infantis with deposit number CECT 9720.
  • This strain was deposited in the Spanish collection of type cultures (CECT) on September 18, 2018 and the deposit number CECT 9720 corresponded to it.
  • the address of said International Deposit Authority is: Spanish Collection of Type Crops (CECT), Building 3 CUE, Pare Cient ⁇ fic Universitat de Valencia, Catedrático Agust ⁇ n Escardino 9, 46980 Paterna (Valencia) Spain.
  • strain of the invention will be made interchangeably as: Bifidobacterium longum subsp. infantis with deposit number CECT 9720, strain CECT 9720, strain Bifidobacter ⁇ um longum subsp infantis 16p1 or 16p1.
  • the CECT 9720 strain can be in the form of viable cells or in the form of non-viable cells.
  • the present invention also contemplates a strain derived from the CECT 9720 strain, where said strain maintains or improves the capabilities described throughout the present invention.
  • the derived microorganism can be produced naturally or intentionally, by mutagenesis methods known in the state of the art, such as, but not limited to, the growth of the original microorganism in the presence of mutagenic or stress-causing agents, or by genetic engineering. directed at the modification of specific genes.
  • the strain derived from the CECT S720 strain is a genetically modified mutant.
  • mutant strain or derived strain can be used interchangeably.
  • the cellular components of the bacterium could include components of the cell wall (such as, but not limited to, peptidoglycan), nucleic acids, membrane components, or others such as proteins, lipids, and carbohydrates and their combinations , such as lipoproteins, glycolipids, or glycoproteins.
  • Metabolites include any molecule produced or modified by the bacterium as a consequence of its metabolic activity during its growth, its use in technological processes (for example, but not limited to, food or drug manufacturing processes), during product storage or during gastrointestinal transit.
  • Examples of these metabolites are, but are not limited to, organic and inorganic acids, proteins, peptides, amino acids, enzymes, lipids, carbohydrates, lipoproteins, glycolipids, glycoproteins, vitamins, salts, metals, or nucleic acids.
  • Secreted molecules include any molecule exported or released abroad by the bacterium during its growth, its use in technological processes (for example, food or drug manufacturing), product storage, or gastrointestinal transit. Examples of these molecules are, but are not limited to, organic and inorganic acids, proteins, peptides, amino acids, enzymes, lipids, carbohydrates, lipoproteins, glycolipids, glycoproteins, vitamins, salts, metals, or nucleic acids.
  • compositions comprising the strain of the invention and / or the cellular components, metabolites, secreted molecules of the strain of the invention or any combination thereof.
  • the composition has a concentration of the strain of between 10 5 and 10 14 colony forming units (ufe) per gram or milliliter of final composition.
  • composition can also include at least one bioactive component (active substance, active ingredient or therapeutic agent).
  • bioactive component refers to a compound with biological activity in the scope of the patent that can improve or complement the activity of the CECT 9720 strain, including ingredients or components of food (for example and without limitation: acids polyunsaturated fats, conjugated linoleic acid, prebiotics, fiber, Guar gum, glucomannan, chitosan, copper picolinate, calcium, etc.), other probiotics, plants, extracts or components of plants and drugs.
  • ingredients or components of food for example and without limitation: acids polyunsaturated fats, conjugated linoleic acid, prebiotics, fiber, Guar gum, glucomannan, chitosan, copper picolinate, calcium, etc.
  • composition may be a pharmaceutical composition, in which case it will preferably comprise at least one pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.
  • the pharmaceutical composition or medicament can be presented under any clinically permitted administration form and in a therapeutically effective amount.
  • a form adapted for oral, sublingual, nasal, intracathecal, bronchial, lymphatic, rectal, transdermal, inhaled, or parenteral administration may be in form, preferably in a form adapted for oral administration.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be formulated in solid, semi-solid, liquid or gaseous forms, such as tablet, capsule, powder, granule, ointment, solution, suppository, injection, inhalant, gel, microsphere or aerosol.
  • the form adapted for oral administration is selected from the list comprising, but not limited to, drops, syrup, herbal tea, elixir, suspension, extemporaneous suspension, drinkable vial, tablet, capsule, granule, seal, pill, tablet, pill, troche or lyophilized.
  • excipient refers to a substance that assists in the absorption of any of the components of the composition of the present invention, stabilizes said components or helps the preparation of the pharmaceutical composition in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more enjoyable.
  • the excipients could have the function of holding the components together as per example starches, sugars or cellulose, sweetening function, coloring function, protection function of the medicine, such as to isolate it from air and / or moisture, filling function of a pill, capsule or any other form of presentation, such as For example, dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • excipient is defined as that matter that, included in the galenical forms, is added to the active ingredients or to their associations to enable their preparation and stability, modify their organoleptic properties or determine the physico-chemical properties of the pharmaceutical composition and its bioavailability.
  • pharmaceutically acceptable excipient must allow the activity of the compounds of the pharmaceutical composition, that is, to be compatible with said components.
  • the "pharmaceutical form” or “pharmaceutical form” is the arrangement to which the active ingredients and excipients are adapted to constitute a medicine. It is defined by the combination of the way in which the pharmaceutical composition is presented by the manufacturer and the way in which it is administered.
  • the "vehicle” or carrier is preferably an inert substance.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other compounds, to allow a better dosage and administration or to give consistency and shape to the pharmaceutical composition. Therefore, the vehicle is a substance that is used in the medicine to dilute any of the components of the pharmaceutical composition of the present invention to a determined volume or weight; or that even without diluting said components it is capable of allowing a better dosage and administration or giving consistency and shape to the medicine.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle is the diluent.
  • the excipient and vehicle must be pharmacologically acceptable, that is, that the excipient and vehicle are allowed and evaluated so as not to cause harm to the organisms to which it is administered.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to that amount of the component of the pharmaceutical composition that when administered to a mammal, preferably a human, is sufficient to produce the prevention and / or treatment, as defined below, of a disease or pathological condition of interest in the mammal, preferably a human.
  • the therapeutically effective amount will vary, for example, according to the activity of the strain of the invention; of the cellular components, metabolites, secreted molecules or any of their combinations, in any form of presentation; the therapeutically effective amount will also vary according to the metabolic stability and duration of action of the compound; the age, body weight, general health, sex and diet of the patient; the mode and time of administration; excretion rate, drug combination; the severity of the particular disorder or disease condition; and the subject undergoing therapy, but may be determined by a specialist in the art based on his or her own knowledge and description.
  • the composition can also be a nutritional composition such as a food, a supplement, a nutraceutical, a probiotic, or a symbiotic.
  • the term "nutritional composition” of the present invention refers to that food that, independently of providing nutrients to the subject who takes it, beneficially affects one or more functions of the organism, so as to provide a better state of health and well-being.
  • said nutritional composition can be used for the prevention and / or treatment of a disease or the causative factor of a disease. Therefore, the term “nutritional composition” of the present invention can be used as a synonym for functional food or food for specific nutritional purposes or medicinal food.
  • the term "nutraceutical” as used in the present invention refers to substances isolated from a food and used in dosages that have a beneficial effect on health.
  • probiotic refers to live microorganisms that when supplied in adequate amounts promote health benefits of the host organism.
  • symbiotic refers to those foods that contain a mixture of prebiotics and probiotics. As a general rule they contain a prebiotic component that favors growth and / or activity metabolic and ultimately the effect of the probiotic with which it is combined, as for example and without limitation may be the association of fructooligosaccharides or galactooligosaccharides with bifidobacteria.
  • dietary supplement synonymous with any of the terms “dietary supplement”, “nutritional supplements”; or “food supplement” is a “food ingredient” intended to supplement food.
  • dietary supplements include, but are not limited to, vitamins, minerals, botanicals, amino acids, and food components such as enzymes and glandular extracts. They are not presented as substitutes for a conventional food or as a single component of a meal or diet but rather as a supplement to the diet.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of a Bifidobacterium longum subsp. infantis CECT 9720 for the manufacture of a medicinal product with a nutritional composition or a food.
  • Another aspect of the present invention relates to the Bifidobacterium longum subsp. infantis CECT 9720 for use as a medicine.
  • the medicine to which the present invention refers can be for human or veterinary use.
  • the "medicine for human use” is any substance or combination of substances that is presented as possessing properties for the treatment or prevention of diseases in humans or that can be used in humans or administered to humans in order to restore, correct or to modify the physiological functions exerting a pharmacological, immunological or metabolic action, or to establish a medical diagnosis.
  • Veterinary medicine is any substance or combination of substances that is presented as having curative or preventive properties with respect to animal diseases or that can be administered to the animal in order to restore, correct or modify its physiological functions by exercising a pharmacological, immunological or metabolic action, or to establish a veterinary diagnosis.
  • Veterinary drugs are also considered to be "veterinary drugs” prepared to be incorporated into a feed.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to the use of a CECT 9720 strain, or of the cellular components, metabolites, secreted molecules, or any of their combinations; or of the composition of the invention; for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of inflammatory bowel disease, liver inflammation and / or derived pathologies such as, for example, liver cirrhosis.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to the CECT 9720 strain, or of the cellular components, metabolites, secreted molecules, or any of their combinations for use in the prevention and / or treatment of inflammatory bowel disease, liver inflammation and / or derived pathologies such as, for example, liver cirrhosis.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to the CECT 9720 strain, or of cellular components, metabolites, secreted molecules, or any of their combinations for use in the simultaneous prevention and / or treatment of inflammatory bowel disease and inflammation liver.
  • inflammatory bowel disease or intestinal inflammation is selected from the list comprising: Crohn's disease, ulcerative colitis, indeterminate colitis, collagen colitis, and lymphocytic colitis.
  • treatment refers to combating the effects caused as a consequence of a disease or pathological condition of interest in a subject (preferably mammal, and more preferably a human) that includes:
  • prevention consists in preventing the appearance of the disease, that is, preventing the disease or pathological condition from occurring in a subject (preferably a mammal, and more preferably a human), in particularly, when said subject has a predisposition for the pathological condition.
  • a subject preferably a mammal, and more preferably a human
  • treatment and / or prevention is effective against more than one disease, preferably inflammatory bowel disease and liver cirrhosis.
  • liver inflammation refers to an inflammatory response of the liver that can be initiated by physical injury, infection, or a local immune response and may include local accumulation of fluid, plasma proteins, and white blood cells, as well as migration and infiltration of neutrophils, lymphocytes and other cells of the immune system in the regions of the damaged liver.
  • inflammatory bowel disease or "intestinal inflammation” refers to an inflammatory response of the intestine that can be initiated by physical injury, infection, or a local immune response and may include local accumulation of fluid, plasma proteins, and white blood cells, as well as migration and infiltration of neutrophils, lymphocytes and other cells of the immune system in the regions of the damaged intestine.
  • liver cirrhosis is the end stage inflammatory liver disease and refers to a condition in which the liver slowly deteriorates and malfunctions because the liver tissue is changed by fibrous scar tissue and regenerative nodules.
  • the strain of the present invention is suitable for the treatment of cirrhosis of different causes, including alcohol related cirrhosis, hepatitis Chronic B, C or D, nonalcoholic liver steatosis (NASH), autoimmune hepatitis, primary or secondary biliary cirrhosis ndaria, primary sclerosing cholangitis, inherited diseases such as cystic fibrosis, alpha-1 antitrypsin deficiency, hemochromatosis, Wilson's disease, galactosemia, and glycogen storage diseases.
  • the present invention can be used to prevent or treat liver cirrhosis regardless of its etiology.
  • FIG. 1 Serum cytokine levels (IL-6, IL-10, MCP-1, TNF-a) in animals with BDL-induced cirrhosis (Bile Duct Ligation), distributed by study groups: Untreated (0), Bifidobacterium bifidum MT7 (MT7), Bifidobacterium bifidum G1 (G1), Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 (CECT 9720) according to the example of the invention.
  • Untreated (0) Bifidobacterium bifidum MT7 (MT7)
  • Bifidobacterium bifidum G1 (G1) Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 (CECT 9720) according to the example of the invention.
  • FIG. 2 Secreted levels of cytokines (IL-6, IL-10, MCP-1, TNF-a) in liver macrophage cultures from animals with BDL-induced cirrhosis: Untreated macrophages (MCF), lipopolysaccharide-stimulated macrophage ( MCF + LPS), Macrophages stimulated with Bifidobacterium bifidum MT7 (MCF + MT7), Macrophages stimulated with Bifidobacterium bifidum G1 (MCF + G1), Macrophages stimulated with Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1, (MCF + 16p1 of the invention) .
  • MCF Untreated macrophages
  • MCF + LPS lipopolysaccharide-stimulated macrophage
  • MCF + MT7 Macrophages stimulated with Bifidobacterium bifidum MT7
  • MCF + G1 Macrophages stimulated with
  • FIG. 3 Shows a direct comparison of the use of the Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 strain in Kupffer cells (liver macrophages) from animals with BDL-induced cirrhosis, against lipopolysaccharide (LPS) and cells not stimulated in the production of cytokines (IL -6, IL-10, MCP-1, TNF-a) in the culture supernatants, discarding the MT7 and G1 strains, according to the example of the invention.
  • Kupffer cells liver macrophages
  • LPS lipopolysaccharide
  • MCF Untreated macrophages
  • MCF + LPS Lipopolysaccharide-stimulated macrophage
  • MCF + 16p1 Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1-stimulated macrophages
  • FIG. 4 Secreted levels of cytokines (IL-6, IL-10, MCP-1, TNF-a) in cultures of intestinal wall macrophages from animals treated with DSS: Untreated macrophages (MCF), Macrophages stimulated with Bifidobacter ⁇ um bifidum MT7 (MCF + MT7), Bifidobacterium bifidum G1-stimulated macrophages (MCF + G1), Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1-stimulated macrophages, (MCF + 16p1) according to the example of the invention
  • MCF Untreated macrophages
  • MCF + MT7 Macrophages stimulated with Bifidobacter ⁇ um bifidum MT7
  • MF + G1-stimulated macrophages MCF + G1-stimulated macrophages
  • MCF + 16p1 Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1-sti
  • FIG. 6 Serum cytokine levels (IL-6, IL-10, MCP-1, TNF-a) in animals with intestinal inflammation induced by DSS treatment, distributed by study groups: Untreated (0), Bifidobacterium bifidum MT7 (MT7), Bifidobacterium bifidum G1 (G1), Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1, (16p1) according to the example of the invention.
  • Untreated (0) Bifidobacterium bifidum MT7 (MT7)
  • Bifidobacterium bifidum G1 (G1) Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1, (16p1) according to the example of the invention.
  • Strains of the genus Bifidobacterium were isolated from the faeces of healthy infants who had not eaten food containing bifidobacteria for at least the month prior to the analysis and who had not been subjected to antibiotic treatments. The samples were kept at 4 ° C and analyzed without more than two hours after collection. Two grams of each of them were diluted in 10 mM phosphate buffer with a content of NaCI with a concentration of 130 mM (PBS) and homogenized in a Lab-Blender 400 digester (Seward Medical, London, United Kingdom), for 3 min and then diluted in peptone water.
  • PBS mM phosphate buffer with a content of NaCI with a concentration of 130 mM
  • Rats Male Sprague-Dawley rats (Har ⁇ an, Barcelona, Spain) weighing 100-150 g were included in this study. Rats were individually housed at a constant room temperature of 21 ° C and exposed to a light / dark cycle of
  • the liver was then removed and placed in a tube with RPMI 1640 10% FBS, cut into small pieces and centrifuged at 1300 rpm for 10min at 4 ° C. The supernatant was carefully removed, the tissue was resuspended in 50 ml_ of digestion buffer (RPMI 1640, 1 mg / ml_ of collagenase I, 0.2 mg / ml_ of collagenase IV, 20 pg / mL of DNase I and 5 mM MgCh) and incubated for 1 h at 37 ° C with shaking (400 rpms).
  • RPMI 1640 1 mg / ml_ of collagenase I
  • 0.2 mg / ml_ of collagenase IV 20 pg / mL of DNase I and 5 mM MgCh
  • the mixture resulting from the digestion was passed through a sieve column after being completely mechanically disaggregated, washing everything with RPMI 1640 to recover as many cells as possible. Subsequently, a very gentle centrifugation (3min at 30 FCR (relative centrifugal force) and 4 ° C) was carried out to remove the hepatocytes. The pellet was discarded and the collected supernatant was centrifuged 10 min at 1300 rpm and 4 ° C. The resulting pellet was separated by means of a Percoll gradient, which was centrifuged for 10 min at 1500 rpm and without brakes.
  • the percoll cells After collecting the percoll cells, they were resuspended in Red Blood Cell Lysing Buffer (Sigma Aldrich) and lysed for 10min at 4 ° C to remove the remaining red blood cells. At the end of the Used time, the cells were washed with RPMI 1640 and the total cells were counted.
  • Red Blood Cell Lysing Buffer Sigma Aldrich
  • Isolation of Kupffer cells was carried out by magnetic separation, according to their expression of the monocyte differentiation marker CD68. Firstly, labeling (20min at 4 ° C) was performed with CD68 antibody bound to PE (Miltenyi Biotec) using 5 pL per million cells, followed by a 5min wash at 300gx to remove the rest of the antibody not bound to the cells. Subsequently, a second labeling (15min at 4 ° C) was carried out with anti-PE beads (Miltenyi Biotec) at a rate of 2 pL per million cells.
  • PE Miltenyi Biotec
  • Inflammatory responses in serum and culture supernatants were carried out using ELISA kits according to the manufacturer's instructions (R&D Systems, Minneapolis, MN). All samples were measured in triplicate in a Sunrise Microplate Reader (Tecan) and standard curves were generated for each of the plates, establishing in turn a standard zero value that was subtracted from the standard results as well as samples to obtain corrected values.
  • the U-Mann-Whitney test was used for paired comparisons between treatment groups, with the Bonferroni correction for multiple comparisons. The level of significance was 0.05. Statistical analyzes were performed using the SPSS program (version 22.0).
  • Figure 2 shows the in vitro production of cytokines measured in the culture supernatant.
  • Figure 3 shows the direct comparison of the use of the Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 strain in Kupffer cells against LPS and cells not stimulated in the production of cytokines in the culture supernatants, ruling out the MT7 and G1 strains.
  • the use of the strain of the invention maintained cytokine levels at concentrations similar to those of unstimulated cells. That is, the Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 strain does not induce the secretion of inflammatory mediators in Kupffer cells.
  • the Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 strain reduces peripheral levels in vivo of the proinflammatory cytokine TNF-a and IL-6 in a model of liver damage. Furthermore, this strain exerts its effect without inducing a proinflammatory response in vitro in Kupffer cells isolated from the liver, which is indispensable in any strain with potential use as a probiotic. All this makes the Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 strain a bacterial strain of potential interest for probiotic use by reducing inflammation induced in an experimental model of cholestasis liver damage.
  • Rats Male Sprague-Dawley rats (Har ⁇ an, Barcelona, Spain) weighing 100-150 g were included. Rats were individually housed at a constant room temperature of 21 ° C and exposed to a light / dark cycle of 12: 12. Animals they were fed standard food throughout the study protocol. The protocol spanned a total of 6 weeks. After one week of quarantine, animals were subjected to inflammatory bowel disease by treatment with 3% DSS in drinking water. Laparotomy and sampling was performed under Isofluorane anesthesia one week after the start of treatment.
  • Isolation of intestinal macrophages was carried out by magnetic separation, according to their expression of the macrophage differentiation marker CD45, F4 / 80 + and CD1 1c.
  • the extracted macrophages were cultured for 48 hours alone (10 6 cells / mL RPMI), with LPS, or with each of the three strains to be analyzed:
  • Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 (5- 10 5 CFUs / well).
  • Figure 4 shows the in vitro production of cytokines measured in the culture supernatant.
  • Figure 5 shows the comparison of the direct effect of the Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 strain on intestinal macrophages compared to that of LPS and cells without stimulation in the production of cytokines in culture supernatants, ruling out the MT7 and G1 strains.
  • the use of the strain of the invention maintained the levels of cytokines pro- inflammatory at concentrations similar to those of unstimulated cells. That is, the Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 strain does not induce the secretion of inflammatory mediators in intestinal macrophages.
  • the Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 strain reduces peripheral levels in vivo of the proinflammatory cytokine TNF-a, IL-6 and MCP-1 in a model of intestinal inflammation. Furthermore, this strain exerts its effect without inducing a proinflammatory response in vitro in isolated macrophages from the intestinal wall, which is essential in any strain with potential use as a probiotic. All this makes the Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 strain a bacterial strain of potential interest for probiotic use by reducing the inflammation induced in an experimental model of intestinal inflammation.

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Abstract

La presente invención se refiere a la cepa Bifidobacterium longum subsp. infantis CECT 9720, a sus componentes celulares, metabolitos, y moléculas secretadas, y a composiciones que comprenden los productos anteriores, así como al uso de dicha cepa para la prevención y/o tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales e inflamación de hígado, así como patologías derivadas, como por ejemplo la cirrosis de hígado.

Description

CEPA DE BIFIDOBACTERIUM LONGUM SUB. INFANTIS Y USO DE LA MISMA
La presente invención se refiere a la cepa Bifidobacteríum longum sub. infantis CECT 9720, a sus componentes celulares, metabolitos, y moléculas secretadas, y a composiciones que comprenden los productos anteriores, así como al uso de dicha cepa para la prevención y/o tratamiento de enfermedades que cursan con inflamación intestinal y/o hepática, así como patologías derivadas de las mismas, como, por ejemplo, la cirrosis hepática. La presente invención se encuadra dentro del campo de la actividad terapéutica de composiciones o preparaciones farmacéuticas, así como dentro del campo de la alimentación.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El ser humano alberga cerca de 10 trillones de bacterias intestinales, y su genoma tiene una capacidad codificante muy superior a la del humano (unas 100-150 veces superior). El tracto gastrointestinal es el área de superficie más grande del cuerpo con una superficie epitelial de aproximadamente 400 m2, en constante exposición a estos microorganismos vivos. La simbiosis existente, demostrada por la falta de respuesta pro-inflamatoria contra bacterias comensales (Littman D. R. etal. Role of the commensal microbiota in normal and pathogenic host immune responses. Cell host & microbe 201 1 ; 10(4): 311-23; Hooper L. V. et al J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science 2012; 336(6086): 1268-73) implica la presencia de líneas de comunicación claramente definidas. La literatura reciente sugiere que los organismos del tracto gastrointestinal desempeñan un papel indispensable en el mantenimiento de la homeostasis del hospedador (Wu G. D. et al. Analysis of the human gut microbiome and association with disease. Clinical gastroenterology and hepatology: the official dinical practice journal of the American Gastroenterological Association 2013; 11 (7): 774-7). Las alteraciones en la microbiota intestinal parecen tener un papel en la patogénesis y la progresión de varias enfermedades, incluyendo por ejemplo, las hepáticas y gastrointestinales.
Más concretamente, se ha demostrado que la microbiota intestinal tiene un papel directo en la progresión y desarrollo de complicaciones en enfermedad hepática (Bajaj. J. S. et al. Linkage of gut microbiome with cognition in hepatic encephalopathy. American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2012; 302(1): G168-75; Bajaj J. S. et al. Colonic mucosal microbiome differs from stool microbiome in cirrhosis and hepatic encephalopathy and is linked to cognition and inflammation. American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2012; 303(6): G675-85; Chen Y. et al. Characterization of fecal microbial communities in patients with liver cirrhosis. Hepatology 2011 ; 54(2): 562-72).
La cirrosis es la etapa final común de diferentes enfermedades hepáticas caracterizada por una distorsión histológica del hígado con presencia de nodulos regenerativos que provocan hipertensión portal (Bosch J. et al Pathophysiology of portal hypertension. Gastroenterology clinics of North America 1992; 21 (1): 1-14). Este hecho, a su vez, altera la motilidad intestinal induciendo sobrecrecimiento bacteriano intestinal (SBI) (Morencos F. C .et al. Small bowel bacterial overgrowth in patients with alcoholic cirrhosis. Digestive diseases and Sciences 1995; 40(6): 1252-6; Pande C. Small- intestinal bacterial overgrowth in cirrhosis is related to the severity of liver disease. Alimentary pharmacology & therapeutics 2009; 29(12): 1273-81 ; Bauer T. M. etal. Small intestinal bacterial overgrowth in patients with cirrhosis: prevalence and relation with spontaneous bacterial peritonitis. Am J Gastroenterol 2001 ; 96(10): 2962-67). En concreto, en pacientes con cirrosis existe un sobrecrecimiento de bacterias potencialmente patógenas (p.ej. especies Gram negativas), y un descenso en familias bacterianas autóctonas. La estrecha relación entre las complicaciones más frecuentes que surgen en los pacientes con cirrosis y la microbiota intestinal (edesma F. Small bowel bacterial overgrowth in patients with alcoholic cirrhosis. Digestive diseases and Sciences 1995; 40(6): 1252-6; Pande C. et al. Small-intestinal bacterial overgrowth in cirrhosis is related to the severity of liver disease. Alimentary pharmacology & therapeutics 2009; 29(12): 1273-81 ; Bauer T. M. et al. Small intestinal bacterial overgrowth in patients with cirrhosis: prevalence and relation with spontaneous bacterial peritonitis. Am J Gastroenterol 2001 ; 96(10): 2962-67; Chang C. S. et al. Small intestine dysmotility and bacterial overgrowth in cirrhotic patients with spontaneous bacterial peritonitis. Hepatology 1998; 28(5): 1187-90) se ha estudiado intensamente en los últimos años y ha resaltado la importancia de la constante comunicación entre el intestino y el hígado durante el manejo de pacientes con cirrosis (Garcia-Tsao G. et al. Gut microflora in the pathogenesis of the complications of cirrhosis. Best Pract fíes Clin Gastroenterol 2004; 18(2): 353-72). Las complicaciones como la encefalopatía hepática (EH), peritonitis bacteriana espontánea (PBE) y la hemorragia por varices en los pacientes cirróticos están directamente causadas o agravadas por la translocación de microbiota entérica o sus productos a territorios extraintestinales.
Ahondando en lo anterior, la comunicación directa entre el hígado y el intestino a través de la circulación portal denominada“eje hígado-intestino”, juega un papel importante en la progresión de las complicaciones de la cirrosis, siendo la microbiota intestinal un regulador clave de la inflamación y la traslocación bacteriana en este contexto (Garcia- Tsao G. et ai. Gut microflora in the pathogenesis of the complications of cirrhosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2004; 18(2): 353-72).
Por otra parte y en relación a la enfermedad intestinal, es también ampliamente conocido que la microbiota intestinal tiene un papel directo en la progresión y desarrollo de complicaciones en esta patología. Así, por ejemplo, las endotoxinas son moléculas inmunogénicas derivadas de las paredes celulares de las bacterias Gram-negativas presentes en la microbiota intestinal, que pueden sobre-activar el sistema inmune innato y romper la homeostasis inmunológica y la función barrera intestinal. (Rodes L. et al. Microencapsulated Bifidobacteríum longum subsp. infantis ATCC 15697 Favorably Modulates Gut Microbiota and Reduces Circulating Endotoxins in F344 Rats. BioMed Research International. Volume 2014, Article ID 602832, 11 pages).
En la práctica médica habitual, de forma alternativa o complementaria a los tratamientos farmacológicos, se ha generalizado en los últimos años el uso de un amplio abanico de cepas probióticas, ya que hay evidencias de su contribución en la restauración de las alteraciones en la permeabilidad intestinal, la composición microbiana intestinal y la respuesta inflamatoria. En este sentido, han sido especialmente utilizadas cepas probióticas de especies pertenecientes a los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus para el tratamiento y/o prevención de diversas patologías para que de forma natural, restablezcan una situación de homeostasis intestinal mejorando la interacción simbiótica entre la microbiota y el sistema inmunitario de los pacientes, al tiempo que evitan la erradicación no selectiva de microbiota asociada al uso de antibióticos y la aparición de resistencias, principales problemas que se dan con el uso de antibióticos.
Específicamente, se ha relacionado el uso de cepas de Bifidobacterium longum subp. infantis con el tratamiento de patologías intestinales, así por ejemplo:
- El documento WO2009134948A1 divulga el tratamiento de alteraciones inflamatorias intestinales que incluyen el síndrome del colon irritable, colitis linfocítica, colitis colágena, y colitis indeterminada, mediante la administración de una composición que comprende un agente activo antiinflamatorio y un probiótico tal como Bifidobacteríum infantis enfermedades, como adyuvante,
- El documento W02010105207A1 hace referencia a una composición útil para estimular el crecimiento de la microbiota beneficiosa, incluyendo las especies del género Bifidobacteríum, con el fin de regular disbiosis bacterianas en un animal. La composición comprende galactooligosacaridos y una cepa Bifidobacteríum longum subps. infantis y según se indica se puede usar para tratar, entre otras enfermedades, colitis, enfermedad de Crohn, síndrome del colon irritable y enfermedad inflamatoria intestinal,
- La publicación: Elian, S.D.A. et al. “Bifidobacteríum longum subsp infantis BB-02 attenuates acute murine experimental model of inflammatory bowel disease” Beneficial Microbes. 2015, 6 (3), 277 - 286 hace referencia a la utilización de la bacteria Bifidobacteríum longum subsp infantis BB-02 como probiótico que atenúa un modelo experimental murino agudo de enfermedad intestinal inflamatoria,
-Finalmente, la publicación: Rodes, L. et al.“Microencapsulated Bifidobacteríum longum subsp infantis ATCC 15697 Favorably Modulates Gut Microbiota and Reduces Circulating Endotoxins in F344 Rats” BioMed Research International 2014; 2014:602832., describe la aplicación de la cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis ATCC 15697 en forma microencapsulada, la cual modula la microbiota intestinal y reduce las endotoxinas circulantes en un modelo animal de ratón utilizado en envejecimiento, oncología y nutrición.
Se considera de interés la identificación de nuevas cepas bacterianas probióticas que tengan capacidad para el tratamiento y/o la prevención de patologías que cursan con inflamación, preferiblemente intestinales y hepáticas, así como patologías derivadas como por ejemplo, la cirrosis, y que preferiblemente sean efectivas simultáneamente contra más de una de ellas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la cepa Bifidobacteríum longum subsp. infantis CECT 9720, a los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas de dicha cepa, y a las composiciones que comprenden los productos anteriores, así como a su uso para la prevención y/o tratamiento de la inflamación intestinal y/o hepática, y patologías derivadas como, por ejemplo, la cirrosis hepática. Preferiblemente la cepa de la invención presenta actividad simultáneamente en más de una de enfermedad de las indicadas.
La cepa CECT 9720, que pertenece a la especie Bifidobacteríum longum subsp. Infantis, reduce los niveles periféricos in vivo de la citocina proinflamatoria TNF-a e IL-6 en un modelo de daño hepático y también reduce los niveles periféricos in vivo de la citocina proinflamatoria TNF-a, IL-6 y MCP-1 en un modelo de inflamación intestinal. Además, dicha cepa ejerce su efecto sin inducir una respuesta proinflamatoria in vitro en células de Kupffer aisladas del hígado ni en macrófagos aislados de pared intestinal, lo cual es indispensable en cualquier cepa con potencial uso como probiótico. Todo esto hace que la cepa de la presente invención sea una cepa bacteriana de potencial interés para uso probiótico al reducir la inflamación hepática e intestinal.
Por tanto, la presente invención aporta al estado de la técnica una cepa de la especie Bifidobacteríum longum subsp. infantis para el tratamiento de inflamación intestinal, inflamación hepática y patologías derivadas como, por ejemplo, la cirrosis hepática.
Luego, un aspecto de la presente invención se refiere a una cepa de Bifidobacteríum longum subsp. infantis con número de depósito CECT 9720. Dicha cepa ha sido depositada en la colección española de cultivos tipo (CECT) el 18 de septiembre de 2018 y le correspondió el n° de depósito CECT 9720. La dirección de dicha Autoridad Internacional de depósito es: Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Edificio 3 CUE, Pare Científic Universitat de Valencia, Catedrático Agustín Escardino 9, 46980 Paterna (Valencia) España.
En el ámbito del presente documento, la referencia a la cepa de la invención se hará indistintamente como: cepa de Bifidobacteríum longum subsp. infantis con número de depósito CECT 9720, cepa CECT 9720, cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 o 16p1.
La cepa CECT 9720 puede estar en la forma de células viables o en la forma de células no viables.
La presente invención también contempla una cepa derivada de la cepa CECT 9720, donde dicha cepa mantiene o mejora las capacidades descritas a lo largo de la presente invención. E! microorganismo derivado puede producirse de forma natural o bien de forma intencionada, por métodos de mutagénesis conocidos en ei estado de ia técnica como por ejemplo pero sin limitarse, el crecimiento del microorganismo original en presencia de agentes mutagénicos o causantes de estrés, o mediante ingeniería genética dirigida a ia modificación de genes específicos. Según una realización preferida, la cepa derivada de ia cepa CECT S720 es un muíante genéticamente modificado. Los términos cepa mutante o cepa derivada pueden ser utilizados indistintamente.
En la presente invención también se contempla la combinación de los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas o cualquiera de sus combinaciones, obtenidos a partir de la cepa CECT 9720.
Entre los componentes celulares de la bacteria se podrían incluir los componentes de la pared celular (como por ejemplo pero sin limitarse, peptidoglicano), los ácidos nucleicos, los componentes de la membrana, u otros como proteínas, lípidos e hidratos de carbono y sus combinaciones, como lipoproteínas, glicolípidos o glicoproteínas. Los metabolitos incluyen cualquier molécula producida o modificada por la bacteria como consecuencia de su actividad metabólica durante su crecimiento, su uso en procesos tecnológicos (por ejemplo, pero sin limitarse, procesos de elaboración de alimentos o fármacos), durante el almacenamiento del producto o durante el tránsito gastrointestinal. Ejemplos de estos metabolitos son, pero sin limitarse, los ácidos orgánicos e inorgánicos, proteínas, péptidos, aminoácidos, enzimas, lípidos, hidratos de carbono, lipoproteínas, glicolípidos, glicoproteínas, vitaminas, sales, metales o ácidos nucleicos. Las moléculas secretadas incluyen cualquier molécula exportada o liberada al exterior por la bacteria durante su crecimiento, su uso en procesos tecnológicos (por ejemplo de elaboración de alimentos o fármacos), el almacenamiento del producto o el tránsito gastrointestinal. Ejemplos de estas moléculas son, pero sin limitarse, ácidos orgánicos e inorgánicos, proteínas, péptidos, aminoácidos, enzimas, lípidos, hidratos de carbono, lipoproteínas, glicolípidos, glicoproteínas, vitaminas, sales, metales o ácidos nucleicos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende la cepa de la invención y/o los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas de la cepa de la invención o cualquiera de sus combinaciones. En una realización preferida, la composición tiene una concentración de la cepa de entre 105 y 1014 unidades formadoras de colonias (ufe) por gramo o mililitro de composición final.
La composición puede también incluir al menos un componente bioactivo (sustancia activa, principio activo o agente terapéutico).
El término “componente bioactivo” hace referencia a un compuesto con actividad biológica en el ámbito de aplicación de la patente que pueda mejorar o complementar la actividad de la cepa CECT 9720, incluyendo ingredientes o componentes de los alimentos (por ejemplo y sin limitar: ácidos grasos poli-insaturados, ácido linoléico conjugado, prebióticos, fibra, goma Guar, glucomanano, quitosano, picolinato de cobre, calcio, etc.), otros probióticos, plantas, extractos o componentes de plantas y fármacos.
La composición puede ser una composición farmacéutica, en cuyo caso comprenderá preferiblemente al menos un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica o medicamento se puede presentar bajo cualquier forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente efectiva. Por ejemplo, puede estar en forma una forma adaptada a la administración oral, sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica, inhalada o parenteral, preferiblemente en una forma adaptada a la administración oral. La composición farmacéutica de la invención se puede formular en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimido, cápsula, polvo, gránulo, ungüento, solución, supositorio, inyección, inhalante, gel, microesfera o aerosol. La forma adaptada a la administración oral se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, píldora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado.
El término“excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de los componentes de la composición de la presente invención, estabiliza dichos componentes o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los componentes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como, por ejemplo, el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Por tanto, el término “excipiente” se define como aquella materia que, incluida en las formas galénicas, se añade a los principios activos o a sus asociaciones para posibilitar su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades físico-químicas de la composición farmacéutica y su biodisponibilidad. El excipiente “farmacéuticamente aceptable” debe permitir la actividad de los compuestos de la composición farmacéutica, es decir, que sea compatible con dichos componentes.
La“forma galénica” o“forma farmacéutica” es la disposición a que se adaptan los principios activos y excipientes para constituir un medicamento. Se define por la combinación de la forma en la que la composición farmacéutica es presentada por el fabricante y la forma en la que es administrada.
El“vehículo” o portador, es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la composición farmacéutica de la presente invención hasta un volumen o peso determinado; o bien que aún sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.
Además, el excipiente y el vehículo deben ser farmacológicamente aceptables, es decir, que el excipiente y el vehículo esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
En la presente invención, la expresión“cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a aquella cantidad del componente de la composición farmacéutica que cuando se administra a un mamífero, con preferencia un humano, es suficiente para producir la prevención y/o el tratamiento, tal como se define más adelante, de una enfermedad o condición patológica de interés en el mamífero, con preferencia un humano. La cantidad terapéuticamente efectiva variará, por ejemplo, según la actividad de la cepa de la invención; de los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas o cualquiera de sus combinaciones, en cualquier forma de presentación; la cantidad terapéuticamente efectiva variará también según la estabilidad metabólica y duración de la acción del compuesto; la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el tiempo de administración; la velocidad de excreción, la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o la condición patológica particulares; y el sujeto que se somete a terapia, pero puede ser determinada por un especialista en la técnica según su propio conocimiento y esa descripción.
La composición también puede ser una composición nutritiva tal como un alimento, un suplemento, un nutracéutico, un probiótico o un simbiótico.
El término“composición nutritiva” de la presente invención se refiere a aquel alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosamente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. Como consecuencia, dicha composición nutritiva puede ser destinada a la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o del factor causante de una enfermedad. Por tanto, el término“composición nutritiva” de la presente invención se puede emplear como sinónimo de alimento funcional o alimento para fines nutricionales específicos o alimento medicinal.
El término“nutracéutico” tal como se emplea en la presente invención se refiere a sustancias aisladas de un alimento y utilizadas de forma dosificada que tienen un efecto beneficioso sobre la salud.
El término “probiótico” tal como se emplea en la presente invención se refiere a microorganismos vivos que cuando son suministrados en cantidades adecuadas promueven beneficios en la salud del organismo hospedador.
El término“simbiótico” tal como se emplea en la presente invención se refiere a aquellos alimentos que contienen una mezcla de prebióticos y probióticos. Por regla general contienen un componente prebiótico que favorece el crecimiento y/o actividad metabólica y en definitiva el efecto del probiótico con el que se combina, como por ejemplo y sin limitar puede ser la asociación de la fructooligosacáridos o galactooligosacáridos a las bifidobacterias.
El término“suplemento”, sinónimo de cualquiera de los términos“suplemento dietético”, “suplementos nutricional”; o“suplemento alimenticio” es un “ingrediente alimenticio” destinado a complementar la alimentación. Algunos ejemplos de suplementos dietéticos son, pero sin limitarse, las vitaminas, los minerales, los productos botánicos, aminoácidos y componentes de los alimentos como las enzimas y los extractos glandulares. No se presentan como sustitutos de un alimento convencional ni como componente único de una comida o de la dieta alimenticia sino como complemento de la dieta.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una cepa Bifidobacteríum longum subsp. infantis CECT 9720 para la fabricación de un medicamento de una composición nutritiva o de un alimento.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a la cepa Bifidobacteríum longum subsp. infantis CECT 9720 para su uso como medicamento.
El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El “medicamento de uso humano” es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El“medicamento de uso veterinario” es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán“medicamentos veterinarios” las “premezclas para piensos medicamentosos” elaboradas para ser incorporadas a un pienso. Otra realización preferida de la presente invención se refiere al uso de una cepa CECT 9720, o de los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas, o cualquiera de sus combinaciones; o de la composición de la invención; para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal, la inflamación hepática y/o patologías derivadas como, por ejemplo, la cirrosis hepática.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a la cepa CECT 9720, o de los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas, o cualquiera de sus combinaciones para su uso en la prevención y/o tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal, la inflamación hepática y/o patologías derivadas como, por ejemplo, la cirrosis hepática.
Otra realización preferida de la presente invención se refiere a la cepa CECT 9720, o de los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas, o cualquiera de sus combinaciones para su uso en la prevención y/o tratamiento simultáneo de la enfermedad inflamatoria intestinal y la inflamación hepática.
En una realización preferida, la enfermedad inflamatoria intestinal o inflamación intestinal es seleccionada de la lista que comprende: enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada, colitis colágena y colitis linfocítica.
El término“tratamiento” tal como se entiende en la presente invención se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:
(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;
(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;
(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.
El término“prevención” tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica. En el ámbito de la invención, preferentemente el tratamiento y/o la prevención es efectivo contra más de una enfermedad, preferiblemente la enfermedad inflamatoria intestinal y cirrosis hepática.
El término“inflamación hepática” o“inflamación de hígado” se refiere a una respuesta inflamatoria del hígado que puede ser iniciada por lesiones físicas, infección o respuesta inmune local y puede incluir acumulación local de líquido, proteínas del plasma y glóbulos blancos, así como migración e infiltración de neutrófilos, linfocitos y otras células del sistema inmune en las regiones del hígado dañado.
El término“enfermedad inflamatoria intestinal” o“inflamación intestinal” se refiere a una respuesta inflamatoria del intestino que puede ser iniciada por lesiones físicas, infección o respuesta inmune local y puede incluir acumulación local de líquido, proteínas del plasma y glóbulos blancos, así como migración e infiltración de neutrófilos, linfocitos y otras células del sistema inmune en las regiones del intestino dañado.
El término "cirrosis hepática", "cirrosis de hígado” o simplemente“cirrosis” es el estadio final la enfermedad inflamatoria hepática y se refiere a una afección en la que el hígado se deteriora lentamente y funciona mal debido a que el tejido hepático se cambia por tejido cicatricial fibroso y nodulos regenerativos. Esto produce un bloqueo parcial en el flujo de sangre a través del hígado así como un deterioro de la capacidad del hígado de controlar infecciones, eliminar bacterias y toxinas de la sangre, procesar nutrientes, hormonas y fármacos, hacer proteínas que regulan la coagulación de la sangre y producir bilis para ayudar a absorber las grasas, incluyendo colesterol, y vitaminas liposolubles. La cepa de la presente invención es adecuada para el tratamiento de cirrosis de diferentes causas, incluyendo cirrosis relacionada con alcohol, hepatitis B, C o D crónica, esteatosis hepática no alcohólica (EHNA), hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria o secundaria, colangitis esclerosante primaria, enfermedades heredadas tal como fibrosis quística, deficiencia en alfa-1 antitripsina, hemocromatosis, enfermedad de Wilson, galactosemia y enfermedades del almacenamiento de glucógeno. La presente invención puede utilizarse para prevenir o tratar cirrosis hepática independientemente de su etiología.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 : Niveles séricos de citocinas (IL-6, IL-10, MCP-1 , TNF-a) en los animales con cirrosis inducida mediante BDL (ligadura del conducto biliar, del inglés Bile Duct Ligation), distribuidos por grupos de estudio: Sin tratar (0), Bifidobacteríum bifidum MT7 (MT7), Bifidobacteríum bifidum G1 (G1), Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 (CECT 9720) de acuerdo con el ejemplo de la invención.
FIG. 2: Niveles secretados de citocinas (IL-6, IL-10, MCP-1 , TNF-a) en los cultivos de macrófagos de hígado de animales con cirrosis inducida mediante BDL: Macrófagos sin tratar (MCF), Macrófago estimulados con lipopolisacárido (MCF+LPS), Macrófagos estimulados con Bifidobacteríum bifidum MT7 (MCF+MT7), Macrófagos estimulados con Bifidobacteríum bifidum G1 (MCF+G1), Macrófagos estimulados con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 , (MCF+16p1) de acuerdo al ejemplo de la invención.
FIG. 3: Muestra la comparación directa del uso de la cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 en células de Kupffer (macrófagos de hígado) de animales con cirrosis inducida mediante BDL, frente a lipopolisacárido (LPS) y células sin estimular en la producción de citocinas (IL-6, IL-10, MCP-1 , TNF-a) en los sobrenadantes de cultivo, descartando las cepas MT7 y G1 , de acuerdo al ejemplo de la invención. Macrófagos sin tratar (MCF), Macrófago estimulados con lipopolisacárido (MCF+LPS), y Macrófagos estimulados con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 , (MCF+16p1)
FIG. 4: Niveles secretados de citocinas (IL-6, IL-10, MCP-1 , TNF-a) en los cultivos de macrófagos de pared intestinal de animales tratados con DSS: Macrófagos sin tratar (MCF), Macrófagos estimulados con Bifidobacteríum bifidum MT7 (MCF+MT7), Macrófagos estimulados con Bifidobacteríum bifidum G1 (MCF+G1), Macrófagos estimulados con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 , (MCF+16p1) de acuerdo al ejemplo de la invención FIG. 5: Muestra la comparación del efecto de la estimulación de macrófagos de pared intestinal de animales tratados con DSS conla cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 , , con lipopolisacárido (LPS) y sin estímulo en la producción de citocinas (IL-6, IL-10, MCP-1 , TNF-a) en los sobrenadantes de cultivo, descartando las cepas MT7 y G1 , de acuerdo al ejemplo de la invención. Macrófagos sin tratar (MCF), Macrófago estimulados con lipopolisacárido (MCF+LPS), y Macrófagos estimulados con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 , (MCF+16p1)
FIG. 6: Niveles séricos de citocinas (IL-6, IL-10, MCP-1 , TNF-a) en los animales con inflamación intestinal inducida mediante el tratamiento con DSS, distribuidos por grupos de estudio: Sin tratar (0), Bifidobacteríum bifidum MT7 (MT7), Bifidobacteríum bifidum G1 (G1), Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 , (16p1) de acuerdo con el ejemplo de la invención.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1 : Tratamiento de ratones con cirrosis
Aislamiento e identificación de las cepas:
Se procedió al aislamiento de cepas del género Bifidobacteríum a partir de heces de lactantes sanos que no hubieran ingerido alimentos que contuvieran bifidobacterias durante al menos el mes anterior al análisis y que no hubieran sido sometidos a tratamientos con antibióticos. Las muestras se mantuvieron a 4°C y se analizaron sin que transcurrieran más de dos horas desde su recogida. Se diluyeron dos gramos de cada una de ellas en tampón fosfato 10 mM con un contenido de NaCI con una concentración de 130 mM (PBS) y se homogeneizaron en un digestor Lab-Blender 400 (Seward Medical, Londres, Reino Unido), durante 3 min y después se diluyeron en agua de peptona. Se inocularon alícuotas de 0, 1 mi de diversas diluciones decimales en MRS agar (de Man Rogosa and Sharpe; Scharlau, Barcelona) con un contenido de un 0,05% de cisteína (Sigma, St. Louis, MO; MRS-C), y 80 pg/ml de mupirocina. Tras una incubación de 48 h a 37°C en condiciones de anaerobiosis (AnaeroGen, Oxoid, Reino Unido), se seleccionaron colonias aisladas y su identidad se confirmó mediante un estudio de su morfología bajo tinción de Gram. La identidad de los aislados se confirmó mediante PCR específica de género, de acuerdo con la metodología descrita por Kaufman y col. (1997, Identification and quantification of Bifidobacterium species isolated from food with genus-specific 16S rRNA-targeted probes by colony hybridization and PCR. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1268-1273), utilizando los cebadores (LM26 y LM3) que amplifican un fragmento de 1 ,35 kb del gen del ARN ribosómico 16S. Su identificación a nivel de especie se realizó mediante secuenciación del gen del 16S rRNA (1.26 Kb) empleando los cebadores 27f (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID NO: 1) y 1401 r (5’- CGGT GT GT ACAAGACCC-3’ (SEQ ID NO: 2) por la tecnología Sanger en un secuenciador ABI 3730XL. Mediante comparación de las secuencias obtenidas con las de la base de datos de NCBI y el algoritmo BLASTn se obtuvo la identificación de las cepas aisladas y en particular de la que constituye objeto de la presente patente, obteniéndose un grado de identidad del 100% con Bifidobacterium longum subsp i nf antis. Secuencia del 16S rRNA de la Bifidobacterium longum subsp infantis CECT9720 (SEQ ID NO: 3):
TAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTT CAGGGATCCGCTCCGCGTCGCCGCGTCGCATCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGT GAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAA CCCCGGCGGTCCCCCGTGAGTTCCCGGCATAATCCGCTGGCAACACGGGGCGAGGGTTGC GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCAC CTGTGAACCCGCCCCGAAGGGAAGCCGTATCTCTACGACCGTCGGGAACATGTCAAGCCC AGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCC CCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGC GTTAGCTCCGACACGGAACCCGTGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGC GTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGT AACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCG TTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCCGCCCGTACCCGGCGCGGAT CCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACG CCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTT AGCCGGTGCTTATTCAACGGGTAAACTCACTCACGCTTGCTCCCCGATAAAAGAGGTTTA CAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGC AATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCC GGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGAAGCCACGGTGGGCCGTTACCCCGCCGTCAA GCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATACCGCGAAAGCTTTCCCAGCAAACCATGCGGAAA
GTTGGAGCATCCGGCATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGTATGGGGCAGGTC
GGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCACCAAGCAAAGCC Animales y Métodos:
Diseño del estudio:
En este estudio se incluyeron ratas macho Sprague-Dawley (Harían, Barcelona, España) con un peso de 100-150 g. Las ratas se alojaron individualmente a una temperatura ambiente constante de 21 °C y se expusieron a un ciclo de luz/oscuridad de
12:12. Los animales fueron alimentados con comida estándar a lo largo del protocolo de estudio. El protocolo abarco un total de 6 semanas. Tras una semana de cuarentena, los animales fueron sometidos a inducción de cirrosis experimental mediante doble ligadura del conducto colédoco (Bile Duct Ligation, BDL). Brevemente, las ratas fueron anestesiadas con ketamina y xilazina. Después de una laparotomía a través de la línea media, se ligó el conducto biliar común en dos niveles diferentes con suturas de seda 5- 0 y se seccionó el conducto entre las ligaduras. La pared abdominal se cerró con suturas de seda 5-0. Un subgrupo de animales actuó como controles y fue operado de manera simulada. a) Estudio in vivo:
Una semana previa a la laparotomía, los animales fueron distribuidos en 4 grupos de forma aleatoria:
- Sin tratar
- T ratados con Bifidobacteñum bifidum MT7
- Tratados con Bifidobacteñum bifidum G1
- Tratados con Bifidobacteñum longum subsp infantis 16p1
Cada animal incluido en los diferentes grupos recibió diariamente una cantidad establecida (109 CFU) de las cepas incluidas en el estudio. La administración se realizó mediante sondaje intragástrico y se prolongó durante 7 días.
Tras finalizar el tratamiento, todos los animales fueron sacrificados y se recogieron muestras de sangre procedente de la cava inferior en tubos de heparina. La sangre se centrifugó (10min a 3500 FCR (fuerza centrífuga relativa)) para obtener el suero, que fue alicuotado y almacenado a -20°C hasta su uso. b) Estudio in vitro\
Los animales sometidos a inducción de cirrosis experimental mediante doble ligadura del conducto colédoco (Bile Duct Ligation, BDL) fueron anestesiados con una mezcla de ketamina (75mg/kg) y xilacina (10mg/kg) para el desarrollo de las laparotomías. Una vez localizado el hígado, se procedió a su perfusión in situ con 50 ml_ de buffer de perfusión (HBSS 10% FBS, 1 mg/ml_ de colagenasa I, 0,2mg/ml_ de colagenasa IV, 20 pg/mL de DNasa I y 5 mM de MgC ) previamente atemperado a 37°C. A continuación se extrajo el hígado y se introdujo en un tubo con RPMI 1640 al 10% FBS, se cortó en trozos pequeños y se centrifugó a 1300 rpm durante 10min a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante con cuidado, se resuspendió el tejido en 50 ml_ de buffer de digestión (RPMI 1640, 1 mg/ml_ de colagenasa I, 0,2 mg/ml_ de colagenasa IV, 20 pg/mL de DNasa I y 5 mM de MgCh) y se incubó durante 1 h a 37 °C en agitación (400 rpms).
La mezcla resultante de la digestión se hizo pasar a través de una columna de tamices tras ser completamente disgregado de forma mecánica, lavándose todo con RPMI 1640 para recuperar el mayor número de células posible. A continuación se llevó a cabo una centrifugación muy suave (3min a 30 FCR (fuerza centrífuga relativa) y 4 °C) para eliminar los hepatocitos. Se descartó el pellet y el sobrenadante recogido se centrifugo 10min a 1300 rpms y 4 °C. El pellet resultante se separó mediante un gradiente de Percoll, que se centrifugó durante 10min a 1500 rpms y sin frenos. Tras recoger las células del percoll se resuspendieron en Red Blood Cell Lysing Buffer (Sigma Aldrich) y se dejaron lisar durante 10min a 4 °C para eliminar el resto de eritrocitos que quedan. Transcurrido el tiempo de Usado, se lavaron las células con RPMI 1640 y se contaron las células totales.
El aislamiento de las células de Kupffer se llevó a cabo mediante separación magnética, según su expresión del marcador de diferenciación de monocitos CD68. En primer lugar se realizó un mareaje (20min a 4°C) con anticuerpo CD68 unido a PE (Miltenyi Biotec) usando 5 pL por cada millón de células, seguido un lavado de 5min a 300gx para eliminar el resto de anticuerpo no unido a las células. A continuación se llevó a cabo un segundo mareaje (15min a 4°C) con anti- PE beads (Miltenyi Biotec) a razón de 2 pL por cada millón de células. Tras el consiguiente lavado para eliminar las bolas magnéticas sobrantes, se realizó una selección positiva de la muestra, haciendo pasar la suspensión de células marcadas por una columna LS (Miltenyi Biotec) para obtener una población pura de células de Kupffer. Las células obtenidas se resuspendieron en medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco BRL, Life Technologies) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino FBS. Se comprobó la viabilidad de las células mediante una tinción con“trypan blue” y se procedió a su recuento. Las células viables fueron plaqueadas a razón de (106 cel/mL) en 5 pocilios bajo las siguientes condiciones:
- Sin estimular
- Estimuladas con LPS
- En co-cultivo con Bifidobacteríum bifidum MT7 (5x105 UFCs/pocillo)
- En co-cultivo con Bifidobacteríum bifidum G1 (5x105 UFCs/pocillo)
- En co-cultivo con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 (5x105 UFCs/pocillo)
Tras 48 horas de cultivo se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -20 °C para el posterior análisis de la respuesta inflamatoria. El estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Animal de la Universidad Miguel Hernández (Alicante, España) con el código HA-RFG-001-15.
Condiciones de cultivo de las cepas.
Las cepas se cultivaron en caldo MRS (Scharlau, Barcelona, España) complementado con cisteína al 0,05% (p / v) (MRS-C Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) y se incubaron a 37° C durante 22 h (en fase de crecimiento estacionaria) en condiciones anaeróbicas (AnaeroGen, Oxoid, Basingstoke, Reino Unido). Las células se recogieron por centrifugación (6.000 g durante 15 min), se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS, cloruro de sodio 130 mM, fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4) y se resuspendieron en leche desnatada al 10% para su administración oral a ratas. Se congelaron alícuotas de estas suspensiones en nitrógeno líquido y se almacenaron a - 80° C hasta su uso. El número de células vivas se determinó mediante la unidad de formación de colonias (UFC) que cuenta con agar MRS-C (Biomerieux) después de una incubación de 48 h a 37° C. Para las cepas probadas, más del 90% de las células estaban vivas al descongelarse y no se encontraron diferencias significativas durante el tiempo de almacenamiento (2 meses). Se descongeló una alícuota fresca por cada nuevo experimento para evitar la variabilidad en la viabilidad de los cultivos.
ELISAS
Las respuesta inflamatoria en suero y sobrenadantes de los cultivos se llevaron a cabo mediante kits tipo ELISA según las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todas las muestras fueron medidas por triplicado en un lector de placas Sunrise Microplate Reader (Tecan) y se generaron curvas estándar para cada una de las placas, estableciéndose a su vez un valor cero estándar que se restó a los resultados de los estándares así como las muestras para obtener valores corregidos.
Análisis Estadístico
EL test de U-Mann-Whitney se utilizó para comparaciones pareadas entre los grupos de tratamiento, con la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. El nivel de significación fue 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron mediante el programa SPSS (versión 22.0).
Resultados:
Se incluyeron inicialmente un total de 28 animales en el estudio. La mortalidad en el grupo BDL fue del 23,1 % (6 de los 24 animales operados inicialmente). Ninguna de las ratas control (n=4) falleció durante el protocolo de estudio. Las ratas sometidas a cirugía BDL fueron distribuidas aleatoriamente para el estudio in vivo (n=12) o in vitro (n=6). Dentro del estudio in vivo, se distribuyeron también de forma aleatoria para pertenecer a cualquiera de los grupos de tratamiento con las diferentes cepas de bifidobacteria (n=4/grupo) la semana previa a la laparotomía. Se cuantifico la expresión de mediadores inflamatorios solubles tales como la IL-6, IL-10, MCP-1 y el TNF-a en el suero y el sobrenadante de los cultivos realizados. a) In vivo :
Los resultados de las mediciones realizadas en suero (Figura 1) reflejaron un claro descenso en la respuesta pro-inflamatoria. Cabe destacar que los niveles de TNF-a fueron diez veces menores en el grupo de animales tratados oralmente con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 con respecto a los animales no tratados. Así mismo, se observó un descenso significativo tanto en los niveles de IL-6 como de MCP-1.
Por el contrario, los niveles de IL-10, citocina reguladora de la respuesta inmune e inhibidora de moléculas pro-inflamatorias (entre ellas el TNF-a) se mantuvieron elevados con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 tal como ocurría en la situación basal. b) In vitro :
En la figura 2 se puede observar la producción in vitro de citocinas medidas en el sobrenadante de los cultivos. Al evaluar la respuesta directa de las células de Kupffer frente a cada una de las cepas estudiadas observamos que la expresión de los mediadores MCP-1 , e IL-6 se encontraba incrementada en todos los casos con respecto a las células que no fueron estimuladas, sin embargo, este incremento únicamente era similar al de los macrófagos estimuladas con LPS en los cultivos tratados con las cepas MT7 y G1. Las células tratadas con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 apenas incrementaron la producción de IL-6, a diferencia de lo que ocurría con el LPS o el resto de cepas estudiadas. Del mismo modo, en presencia de esta cepa, tampoco se vieron incrementados los niveles de TNF-a con respecto a las condiciones básales. Además, a estos resultados se sumó un descenso en la producción de la proteína quimiotáctica MCP-1 , implicada en el reclutamiento de monocitos y basófilos hacia zonas de inflamación.
La Figura 3 muestra la comparación directa del uso de la cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 en células de Kupffer frente a LPS y células sin estimular en la producción de citocinas en los sobrenadantes de cultivo, descartando las cepas MT7 y G1. Como se puede apreciar claramente, el uso de la cepa de la invención mantuvo los niveles de citocinas a concentraciones similares a las de las células no estimuladas. Es decir, la cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 no induce la secreción de mediadores inflamatorios en células de Kupffer.
Conclusión:
Con estos resultados se puede concluir que la cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 reduce los niveles periféricos in vivo de la citocina proinflamatoria TNF-a e IL-6 en un modelo de daño hepático. Además, dicha cepa ejerce su efecto sin inducir una respuesta proinflamatoria in vitro en células de Kupffer aisladas del hígado, lo cual es indispensable en cualquier cepa con potencial uso como probiótico. Todo esto hace que la cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 sea una cepa bacteriana de potencial interés para uso probiótico al reducir la inflamación inducida en un modelo experimental de daño hepático por colestasis.
Ejemplo 2: Tratamiento de ratones con inflamación intestinal Animales y Métodos:
Diseño del estudio:
Se incluyeron ratas macho Sprague-Dawley (Harían, Barcelona, España) con un peso de 100-150 g. Las ratas se alojaron individualmente a una temperatura ambiente constante de 21 °C y se expusieron a un ciclo de luz/oscuridad de 12: 12. Los animales fueron alimentados con comida estándar a lo largo del protocolo de estudio. El protocolo abarcó un total de 6 semanas. Tras una semana de cuarentena, los animales fueron sometidos a enfermedad inflamatoria intestinal mediante el tratamiento con DSS al 3 % en el agua de bebida. La laparotomía y toma de muestras se realizó bajo anestesia con Isofluorano una semana tras el comienzo del tratamiento
A) Estudio in vitro\ Se aisló el intestino y se cortó en piezas de 1 ,5cm, que se introdujeron en un tubo de 50mL precalentado con HBSS/FBS y EDTA 2mM, y se agitó dos veces a 250rpm durante 20 minutos a 37°C. Las piezas intestinales se pasaron entonces a una solución con colagenasa (1 ,5mg/mL de colagenasa VIII en HBSS/FBS con 40pg/mL de DNAsa I), y se agitaron a 200rpm durante 15 minutos a 37°C. Los restos de tejido se filtraron (100pm) a otro tubo de 50mL. La solución resultante se centrifugó de nuevo a 1500rpm durante 5 minutos a 4°C hasta obtener un pellet celular y eliminar el sobrenadante.
El aislamiento de los macrófagos intestinales se llevó a cabo mediante separación magnética, según su expresión del marcador de diferenciación de macrófagos CD45, F4/80+ y CD1 1c.
Los macrófagos extraídos se pusieron en cultivo durante 48 horas solos (106 cél/mL RPMI), con LPS, o con cada una de las tres cepas a analizar:
+ Bifidobacterium bifidum MT7 (5x105 UFCs/pocillo),
+ Bifidobacterium bifidum G1 (5- 105 UFCs/pocillo)
+ Bifidobacterium longum subsp infantis 16p1 (5- 105 UFCs/pocillo).
Tras 48 horas de cultivo, se guardaron los sobrenadantes a -20 °C hasta evaluar la respuesta inflamatoria mediante kits ELISA (IL-6, IL-10, MCP-1 ,
TNF-a).
B) Estudio in viva. Una semana previa a la laparotomía, coincidiendo con el tratamiento con DSS, los animales se distribuyeron en grupos y recibieron de forma aleatoria una de las cepas incluidas en el estudio (109 CFU/oral/día/7 días).
Los animales fueron distribuidos en 4 grupos: 1) sin tratar, 2) B. bifidum MT7, 3) B. bifidum G1 y 4) B. longum subsp infantis16p1. Todos los animales fueron sacrificados al finalizar el tratamiento y se tomaron
muestras de suero que fueron conservadas a -20 °C hasta realizar las mediciones para evaluar la respuesta inflamatoria mediante Kits ELISA (IL-6, IL-10, MCP-1 , TNF- a).
Las condiciones de cultivo de las cepas, la realización de los diferentes kits ELISA y el análisis estadístico se realizó de la misma manera que en el ejemplo 1.
Resultados:
Se incluyeron inicialmente un total de 22 animales en el estudio. Ninguna de las ratas tratadas con DSS (n=18) ni ninguna de las ratas control (n=4) falleció durante el protocolo de estudio. Las ratas fueron distribuidas aleatoriamente para el estudio in vivo (n=12) o in vitro (n=6). Dentro del estudio in vivo, se distribuyeron también de forma aleatoria para pertenecer a cualquiera de los grupos de tratamiento con las diferentes cepas de bifidobacteria (n=4/grupo) la semana previa a la laparotomía. Se cuantifico la expresión de mediadores inflamatorios solubles tales como la IL-6, IL-10, MCP-1 y el TNF-a en el suero y el sobrenadante de los cultivos realizados. a) In vitro\
En la figura 4 se puede observar la producción in vitro de citocinas medidas en el sobrenadante de los cultivos. Al evaluar la respuesta directa de los macrófagos intestinales frente a cada una de las cepas estudiadas observamos que la expresión de los mediadores MCP-1 , IL-6 y TNF-a se encontraba incrementada en todos los casos con respecto a las células que no fueron estimuladas, sin embargo, este incremento únicamente era similar al de los macrófagos estimuladas con LPS en los cultivos tratados con las cepas MT7 y G1. Las células tratadas con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 apenas incrementaron la producción de IL-6, a diferencia de lo que ocurría con el LPS o el resto de cepas estudiadas. Del mismo modo, en presencia de esta cepa, tampoco se vieron incrementados los niveles de TNF-a con respecto a las condiciones básales.
La Figura 5 muestra la comparación del efecto directo de la cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 en macrófagos intestinales comparado con el del LPS y células sin estimular en la producción de citocinas en los sobrenadantes de cultivo, descartando las cepas MT7 y G1. El uso de la cepa de la invención mantuvo los niveles de citocinas pro- inflamatorias a concentraciones similares a las de las células no estimuladas. Es decir, la cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 no induce la secreción de mediadores inflamatorios en macrófagos intestinales. b) In vivo :
Los resultados de las mediciones realizadas en suero (Figura 6) reflejaron un claro descenso en la respuesta pro-inflamatoria. Tanto los niveles de TNF-a, como los niveles de II-6 y MCP-1 fueron menores en el grupo de animales tratados oralmente con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 con respecto a los animales no tratados. Por el contrario, los niveles de IL-10, se mantuvieron elevados con Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 tal como ocurría en la situación basal.
Conclusión:
Con estos resultados se puede concluir que la cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 reduce los niveles periféricos in vivo de la citocina proinflamatoria TNF-a, IL-6 y MCP-1 en un modelo de inflamación intestinal. Además, dicha cepa ejerce su efecto sin inducir una respuesta proinflamatoria in vitro en macrófagos aislados de pared intestinal, lo cual es indispensable en cualquier cepa con potencial uso como probiótico. Todo esto hace que la cepa Bifidobacteríum longum subsp infantis 16p1 sea una cepa bacteriana de potencial interés para uso probiótico al reducir la inflamación inducida en un modelo experimental de inflamación intestinal.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Cepa de Bifidobacteríum longum subsp. infantis con número de depósito CECT 9720.
2. Cepa según la reivindicación 1 , donde dicha cepa está en la forma de células viables o en la forma de células no viables.
3. Componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas o cualquiera de sus combinaciones obtenidos a partir de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
4. Composición que comprende a la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas, o cualquiera de sus combinaciones, según la reivindicación 3.
5. Composición según la reivindicación 4, que adicionalmente comprende al menos un componente bioactivo.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, donde dicha composición es una composición farmacéutica.
7. Composición según la reivindicación 6, que adicionalmente comprende al menos un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, donde dicha composición se presenta en una forma adaptada a la administración oral, sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica, inhalada o parenteral.
9. Composición según la reivindicación 8, donde dicha composición se presenta en una forma adaptada a la administración oral.
10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, donde dicha composición es una composición nutritiva.
11. Composición según la reivindicación 10, donde la composición se selecciona de entre un alimento, un suplemento, un nutraceutico, un probiotico o un simbiótico.
12. Cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, para su uso como medicamento.
13. Cepa o composición para su uso según reivindicación 12 para la prevención y/o el tratamiento de la inflamación hepática.
14. Cepa o composición para su uso según reivindicación 12 para prevención y/o el tratamiento de la cirrosis hepática.
15. Cepa o composición para su uso según reivindicación 12 para la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.
16. Cepa o composición para su uso según reivindicación 12 para la prevención y/o el tratamiento simultáneo de la enfermedad inflamatoria intestinal y la inflamación hepática.
17. Cepa o composición para su uso según la reivindicación 12 para la prevención y/o el tratamiento simultáneo de la enfermedad inflamatoria intestinal y la cirrosis hepática.
18. Cepa o composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 donde la enfermedad inflamatoria intestinal se selecciona de la lista que comprende: enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada, colitis colágena, colitis linfocítica.
19. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 para la elaboración de un alimento.
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