WO2020069945A1 - Neue fluoreszenzfarbstoffe und neue analyseverfahren für die glycan-analytik - Google Patents

Neue fluoreszenzfarbstoffe und neue analyseverfahren für die glycan-analytik

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WO2020069945A1
WO2020069945A1 PCT/EP2019/075940 EP2019075940W WO2020069945A1 WO 2020069945 A1 WO2020069945 A1 WO 2020069945A1 EP 2019075940 W EP2019075940 W EP 2019075940W WO 2020069945 A1 WO2020069945 A1 WO 2020069945A1
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WO
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fluorescence
fluorescent
group
glycan
fluorescent marker
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Application number
PCT/EP2019/075940
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Daniel Berndt
Shamil NIZAMOV
Lars Kastrup
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Abberior GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
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    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
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    • C09B69/109—Polymeric dyes; Reaction products of dyes with monomers or with macromolecular compounds containing other specific dyes
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the invention relates to a fluorescent marker according to the following formula I.
  • the present invention relates to the use of the fluorescent markers according to the invention, in particular also as a standard in glycan analysis, conjugates of fluorescent markers and glycans, and a kit of parts containing the fluorescent markers according to the invention.
  • Glycans are generally defined as polymeric compounds from a large number of monosaccharide building blocks, which are connected to one another via a glycosidic bond.
  • glycoconjugates for example glycoproteins or glycolipids, which are often found in eukaryotes and less frequently in prokaryotes, also fall into this class.
  • These connections fulfill a multitude of different tasks in living organisms. These include, for example, the structural integrity of the cell membranes, the formation of the extracellular matrix, the signal transmission, protein folding and the intercellular information exchange. Based on the variety of structural designs and the variety of biological functions, glycan analysis has become increasingly important for the pharmaceutical and food industries in recent years.
  • glycans and their conjugates can be carried out, for example, by capillary electrophoresis (CE), which allows rapid and efficient separation of even the smallest sample volumes based on the molecular charge.
  • CE capillary electrophoresis
  • CGE capillary gel electrophoresis
  • the capillaries are filled with a gel former in addition to the electrolyte. Based on the gel component, the separation is also significantly increased via the size properties (molecular sieve effect) of the molecules to be examined, since larger molecules experience a significantly higher migration resistance through the gel network than smaller ones.
  • polymer gel thus allows a clear spreading of the physical influencing factors, which in this method is also a function of the molecular form in addition to the charge.
  • the latter extends the range of applications considerably and even enables the separation of macro-molecular structural isomers.
  • LIF laser-induced fluorescence spectroscopy
  • DNA leader DNA fragments labeled with fluorophores
  • the reference substances are placed on the capillaries either before or after the actual sample. This has the advantage that the sample / reference can work with the same fluorophores.
  • DNA references uniform elution distances can be provided over a very wide elution range.
  • EP 0 943 918 Al describes fluorescent labeling complexes with low molecular weight and with long wavelengths, shifts between the absorption of one dye in the complex and the emission of another dye in the complex. These complexes can be used, for example, for multiparameter fluorescence cell analyzes. ter using a single excitation wavelength. The low molecular weight of the complex allows the materials labeled with the complex to penetrate cell structures for use as probes.
  • the labeling complexes are synthesized by covalent linker linkage to form donor-acceptor complexes. The resonance energy transfer from an excited donor to a fluorescent acceptor delivers wavelength shifts of up to 300 nm.
  • the fluorescent labeling complexes preferably contain reactive groups for the labeling of functional groups on target compounds, such as derivatized oxy- and deoxynucleic acids, antibodies, enzymes, lipids, carbohydrates, proteins and other materials.
  • the complexes can contain functional groups which enable covalent bonding to materials which carry reactive groups.
  • WO 2009 078 970 A1 generally discloses fluorescent dyes according to the following formula
  • the publication also provides a wide range of fluorescent dyes and kits containing them, which can be used for labeling a large number of biomolecules, cells and microorganisms.
  • the document also provides various methods of using the fluorescent dyes for research and development, forensic identification, environmental studies, diagnosis, prognosis and / or treatment of disease states.
  • Fluo is selected from the group consisting of substituted or unsubstituted C10-C30 acridones, aminoacridines or pyrenes.
  • the fluorescent markers according to the invention have a large number of positive properties in the field of analysis and in particular in the field of capillary electrophoretic analysis of glycans. Due to their structure, the fluorescent markers are able to be coupled to glycans simply and reproducibly via reductive amination. This is most likely due to the amino group present, which has a pK a value of approximately 4-5.
  • the other structural components of the fluorescent marker are stable under usual coupling conditions, so that a reliable and highly efficient coupling can be obtained.
  • the fluorescent markers can have a high negative net charge and are therefore particularly suitable for rapid separations in conventional electrophoresis buffers, for example at a pH around 8.
  • the claimed structures have a high absorption in the commonly used wavelength ranges of Ar lasers around the 488 nm.
  • these fluorescent markers can be used with standard devices of gel electrophoresis.
  • the fluorescent markers are also characterized by high extinction coefficients and excellent quantum yields. It should be particularly emphasized that the emission of the claimed fluorescence markers lies outside the emission range of the fluorescence markers known from the prior art. This makes it possible for the first time that the reference and sample can be marked with different fluorescent markers and measured at the same time. The signals from both components, reference and sample, can be easily distinguished from one another using the different emission wavelengths.
  • the emission wavelengths of the structures claimed here are in a range around 560-600 nm, while the fluorescent markers used in the prior art provide an emission around 500 nm. The emission maxima are therefore far enough away to allow a significant assignment. Another advantage arises from the fact that the fluorescence properties of the claimed fluorophores do not change at all or only marginally as a result of coupling to glycans. In total, fluorescence markers were obtained, which are extremely advantageous due to the existing boundary conditions for the most modern CE and GCE methods.
  • the fluorescent markers according to the invention have a specific structure according to formula I.
  • the fluorescent markers have at least one fluorophore unit Fluo, which are covalently bound both to a functional group X and directly covalently to a nitrogen-containing group.
  • the functional group X is in turn covalently bound to a Finker group F, which is oxygen-linked to the terminal group R 2 .
  • the amino group Ri can be a primary (-H) or a secondary amine, which then carries a Cl - C6 alkyl group. This group can preferably be used as a binding site for coupling glycans.
  • the terminal group R 2 can be hydrogen or -PO (OH) 2 .
  • phosphoric acid derivatives or alcohols according to the invention at this point.
  • this group can of course also be present, for example as an alcoholate or phosphate. This configuration enables additional charges to be generated on the fluorescence marker, which can increase the migration rate of conjugates within the framework of the CE.
  • the bridging group X can be either -S0 2 - or -PO (OH) -. These groups have proven to be particularly efficient for changing the emission wavelength of the fluorescent marker. Through these groups, one is able to shift the emission wavelength in the direction of a longer wavelength, and fluorophores with high quantum yields are obtained via these substituents. By introducing this group, the reaction with glycans to conjugates is not adversely affected. Similar reaction rates are obtained without any significant side reactions.
  • the last res can be particularly preferred if higher charge densities on the fluorescent marker are desired.
  • the group Fluo can be selected from the group consisting of substituted or unsubstituted C10-C30 acridones, aminoacridines or pyrenes. This means that the fluorophore base, which is bound to the amino group and via the functional group X to the linker, belongs to one of the 3 classes of compounds mentioned.
  • these 3 basic bodies are particularly suitable for supplying fluorescent markers which have a specific emission wavelength range due to the structure according to the invention.
  • these three basic fluo bodies can have a very different structure.
  • the three different base bodies have very comparable electrical properties in the context of the construction according to the invention, which leads to a similar absorption and emission behavior.
  • the chemical stability of these groups is comparable, so that efficient coupling reactions with glycans can be obtained with very comparable kinetics and with a similar selectivity.
  • these groups show a comparable invariance with regard to the shift in the emission maximum after coupling. This may be due to the fact that the different fluo basic bodies also have a similar spatial structure in addition to the comparable electronic properties.
  • these compounds can be substituted at each binding position by further functional groups such as -OH, -COOH, OR, -NH 2 , -NHR, -NR 2 with R alkyl, halogens, -S0 3 H, -OPO 3 H 2 already have part or all of the groups X and NH-Ri.
  • further functional groups such as -OH, -COOH, OR, -NH 2 , -NHR, -NR 2 with R alkyl, halogens, -S0 3 H, -OPO 3 H 2 already have part or all of the groups X and NH-Ri.
  • Fluo can be selected from the group consisting of the fluorophores according to formulas II-IV
  • R 4 , R S each independently of one another -OPO (OH) 2 or -OH
  • o, p each independently 1, 2, 3
  • the fluo according to formulas II-IV can be connected to NH and X at any binding position. It is precisely these structures from the different classes that have proven particularly suitable as fluorescent markers in glycan analysis.
  • the comparable molecular weight, the comparable size and the comparable electronic properties seem to give rise to very similar suitability for fluorescent markers.
  • These compounds are stable under the conditions of the CE and can be coupled to glycans within very similar reaction times.
  • the conjugates obtained are chemically stable and show excellent shelf lives even in the presence of an aqueous buffer.
  • the connections are also compatible with the usual CE buffer systems and can cover a wide range of charges as a function of pH.
  • the connection to group X and the amino group can take place at any point on the fluorophore backbone. These can preferably be the aromatic structures of the fluorophore. These connection points have proven to be particularly stable.
  • the fluorophores Fluo can correspond to the formulas V-VII
  • X -S0 2 -.
  • fluorescent markers with the bridging unit shown have proven to be particularly suitable for fluorescence analysis.
  • the bridging S0 2 unit seems to be responsible for the strong shift in the fluorescence emission and provides a significantly different emission behavior compared to the prior art fluorescence marker. This is one of the fundamentals that one measurement can operate two different fluorescence markers with different emission windows.
  • This unit also provides a chemically very stable molecule, which remains stable even under the harsh coupling conditions to glycans.
  • LR 3 - (CH 2 ) -OPO (OH) 2 in the linker.
  • the basic shape of the fluorescence marker according to the invention is so flexible that even by connecting further functional subgroups, as shown above, the basic fluorescence properties change only insignificantly. In this way, one is able to increase the net charge of the fluorescent marker via further deprotonable groups, which can contribute to faster and more specific separation in the field of glycan analysis. Via the additional functional groups with a phosphorus central atom, these fluorescent markers can also be used flexibly with different solvents at different pH values. This can contribute to a significant flexibility in glycan analysis.
  • R 4 and Rs can each be -OPO (OH) 2 in the fluorophore of the formula III or VI.
  • the basic form of the fluorescence marker according to the invention is so flexible that even by connecting further functional subgroups in structures II and VI, as shown above, the fluorescence basic properties change only insignificantly. In this way, one is able to increase the net charge of the fluorescent marker via further deprotonatable groups, which can contribute to a faster and more specific separation in the field of glycan analysis. Via the additional functional groups with a phosphorus central atom, these fluorescence markers can also be used flexibly with different solvents at different pH values. This can contribute to a clear flexibility in the glycan analysis.
  • R 6 and R 7 can each be -PO (OH) -CH 2 -CHR 2 - (CH 2 ) -OPO (OH) 2 in the fluorophore of the formula IV and VII.
  • the basic shape of the fluorescence marker according to the invention is so flexible that even by connecting further functional subgroups in structures IV and VII, as shown above, the basic fluorescence properties change only insignificantly. That's how you are in the Able to increase the net charge of the fluorescent marker via further deprotonable groups, which can contribute to a faster and more specific separation in the area of glycan analysis.
  • these fluorescent markers can also be used flexibly with different solvents at different pH values. This can contribute to significant flexibility in glycan analysis.
  • the use of the fluorescence markers according to the invention is the standard in a glycan analysis.
  • the fluorescent markers according to the invention are particularly suitable as a standard for examining glycans. Based on the structure of the fluorescent markers, there are covalent binding sites to glycans, which can be easily and reproducibly implemented with functional groups of the glycans in the course of a controlled reaction. In this way, glycans or generally sugars with a specific molecular weight can easily be coupled to the fluorescent markers according to the invention. This gives labeled glycan samples with specific molecular weights and reproducible migration properties, which can also be used as MW reference samples in the CE or GCE. Due to the comparable chemical structure, these molecules are much better suited than DNA guides.
  • Another advantage results from the changed emission behavior and here in particular the changed emission wavelength.
  • the glycan standards used can usefully be standards as a function of the molecular weight of the glycans.
  • a conjugate of a fluorescence marker and a glycan is according to the invention, the glycan being covalently bound to at least one fluorescence marker according to the invention.
  • the fluorescence markers according to the invention can be efficiently coupled to glycans.
  • one or more fluorescent markers can be coupled to the glycans, making them accessible for fluorescence analysis.
  • the conjugates can carry a larger number of charges as a function of the pH value present. This can be done, for example, by deprotonating the acidic groups of the fluorescent marker. The conjugates can therefore carry a higher net charge and electrophoretic measurements in particular can be carried out more quickly.
  • the glycan can be selected from the group consisting of mono-, oligo-, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids, proteoglycans or mixtures thereof.
  • the above-mentioned group of glycans can be coupled quickly and without the formation of undesired by-products to the fluorescent markers according to the invention.
  • both the samples from the group of the glycans specified above and, for example, molecular weight standards can be measured within one experiment. This results in the advantages already discussed for the fluorescence marker.
  • the invention furthermore comprises a kit of parts which comprises at least one or more containers with one or more solvents and one or more containers each with the fluorescent marker according to the invention or the conjugates according to the invention.
  • a kit of parts which comprises at least one or more containers with one or more solvents and one or more containers each with the fluorescent marker according to the invention or the conjugates according to the invention.
  • sales packaging with one or more glycan-fluorescence marker conjugates can significantly facilitate the fluorescence analysis of unknown glycan samples.
  • the conjugates can already be in solution, for example a buffer, or as an isolated substance. The latter can then, for example, be processed together with a buffer provided in the kit shortly before the measurement to form a conjugate solution. This can be advantageous because the one to be used Amount can be set via the mixing ratio of buffer to conjugate. In addition, the amount can be adapted to the sensitivity of the experimental setup.
  • the kit can preferably have one, more preferably two or three conjugates with different molecular weights.
  • the use of several conjugates can contribute to a more reliable measurement via possible mathematical processing of the information obtained.
  • the kit can be a “labeling” kit for use in the labeling of glycans.
  • this labeling kit can contain further optional constituents such as one or more buffer solutions, one or more reducing agents (for example sodium cyanoborohydride, 2-picoline borane); Consumables for performing the staining (tubes, etc.) and staining instructions include.
  • reducing agents for example sodium cyanoborohydride, 2-picoline borane
  • Consumables for performing the staining (tubes, etc.) and staining instructions include.
  • glycan samples can be stained according to the invention.
  • the kit can be a glycan conductor kit for use as an internal standard.
  • the kit can optionally have a mixture of colored glycans, preferably dextrans, of different molecular weights, and these preferably have a lyophilized form.
  • the kit can also optionally include solvents or buffers, consumables for staining (containers etc.) and instructions for reconstitution and use. Using this kit, labeled glycans with known molecular weights can be provided as internal standards in the investigation of glycans with unknown molecular weights.
  • Fig. 2 absorption / emission spectra of the example compound 1 (in 0.05 M TEAB buffer with excitation at 488 nm) as an isolated fluorescent marker () and as a glucose conjugate (- -) in the wavelength range between 250 and 800 nm.
  • FIG. 1 shows a possible synthesis route for obtaining compound 1.
  • the individual synthesis steps and reaction conditions are described further below in the example section.
  • FIG. 2 shows the absorption and emission properties of a fluorescent marker according to the invention and a conjugate of a fluorescent marker and a single sugar.
  • the normalized absorption and emission spectra of 7 - [(3-phosphopropyl) sulfonyl] -2-aminoacridine-9 (lOH) -one (1) and its glucose conjugate are shown.
  • the absorption properties were measured in 0.05 M TEAB buffer (triethylammonium bicarbonate buffer) at a pH of 8.0.
  • the excitation took place at 488 nm.
  • the fluorescence emission with a maximum of approximately 585 nm can be clearly seen.
  • the emission maximum is only slightly shifted to higher wavelengths and is approximately 590 nm.
  • the fluorescence marker is particularly suitable for glycan analysis, the fluorescence marker alone or because of its emission maximum, in combination with a fluorescent marker from the prior art can be used.
  • the different emission windows allow two fluorescent markers to be detected independently of one another. Examples
  • FIG. 1 A possible synthetic route for obtaining compound (1) is shown in FIG. 1.
  • the reaction mixture is freeze-dried overnight and then dissolved in aq. TEAB buffer (pH 8).
  • the triethylammonium salt (1.5 eq.) Of compound 1 is obtained as a brown solid (13 mg, 31 mol, 86%).
  • the fluorescence marker is characterized by high quantum yields even in different solvents and shows an emission at wavelengths that differ from the wavelengths of conventional fluorescence markers, particularly in glycan analysis. It is therefore possible to work with two different fluorescent markers in parallel.
  • the sample and reference can thus be labeled differently and simultaneously detected in different wavelength ranges. In this way, a pre- or post-run with a separate molecular weight reference can be omitted.
  • Compound 1 can also be characterized using the following parameters:
  • the fluorescence marker is distinguished by high quantum yields in different solvents and shows an emission at wavelengths which differ from the wavelengths of conventional fluorescence markers, particularly in glycan analysis. It is therefore possible to work with two different fluorescent markers in parallel.
  • the sample and reference can thus be labeled differently and simultaneously detected in different wavelength ranges. In this way, a pre- or post-run with a separate molecular weight reference can be omitted.
  • Compound 2 can also be characterized using the following parameters: MS (ESI): m / z (positive mode): 333.1 [M + H] + , 355.1 [M + Na] + , 665.2 [2M + H] + , 687.2 [2M + Na ] + .
  • the fluorescence marker is characterized by high quantum yields in different solvents and shows an emission at wavelengths which differ from the wavelengths of conventional fluorescence markers, particularly in glycan analysis. It is therefore possible to work with two different fluorescent markers in parallel. The sample and reference can thus be labeled differently and simultaneously detected in different wavelength ranges. In this way, a pre- or post-run with a separate molecular weight reference can be omitted. It should also be pointed out that the spectroscopic properties of the fluorescent marker change only insignificantly due to the conjugate formation. This is an indication of a stable spectroscopic system.
  • the properties of the conjugate of compound 2 are as follows:
  • the fluorescence marker is characterized by high quantum yields in different solvents and shows an emission at wavelengths that differ from the wavelengths of conventional fluorescence markers, particularly in glycan analysis. It is therefore possible to work with two different fluorescent markers in parallel. The sample and reference can thus be labeled differently and simultaneously detected in different wavelength ranges. In this way, a pre- or post-run with a separate molecular weight reference can be omitted. It should also be pointed out that the spectroscopic properties of the fluorescent marker change only insignificantly due to the conjugate formation. This is an indication of a stable spectroscopic system.

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Fluoreszenzmarker nach der folgenden Formel I, wobei Fluo ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus den Fluorophoren nach den Formeln ll-IV L ein Linker und die Gruppe X entweder eine -SO2- oder eine -PO(OH)- Gruppe ist. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker insbesondere auch als Standard in der Glycan-Analyse, Konjugate aus Fluoreszenzmarker und Glycanen, sowie ein Kit-of-Parts enthaltend die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker.

Description

Neue Fluoreszenzfarbstoffe und neue Analyseverfahren für die Glycan-Analytik
Die Erfindung betrifft einen Fluoreszenzmarker nach der folgenden Formel I
Figure imgf000003_0001
Formel I, wobei Fluo aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder nicht substituierten C10-C30 Acridonen, Aminoacridinen oder Pyrenen ausgesucht, F ein Finker und die Gruppe X entweder eine -SO2- oder eine -PO(OH)- Gruppe ist. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker insbesondere auch als Standard in der Glycan- Analyse, Konjugate aus Fluoreszenzmarker und Glycanen, sowie ein Kit-of-Parts ent haltend die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker.
Die Untersuchung biologischer Makromoleküle stellt auch heutzutage immer noch eine analy tische Herausforderung dar. Zum einen handelt es sich bei den zu untersuchenden Proben meist um mehr oder minder inhomogene Gemische, deren physikalische und chemische Eigenschaf ten neben der chemischen Zusammensetzung als solche auch noch von anderen Faktoren, wie beispielsweise dem 3 -dimensionalen Aufbau der Moleküle, abhängt. Zum anderen kann es zwi schen den einzelnen Bestandteilen auch zu signifikanten Wechselwirkungen kommen, welche eine weitere Komplikation der Analytik und in der Interpretation der erhaltenen Ergebnisse darstellt. Das Gesagte trifft insbesondere für die Glycan-Analytik zu. Glycane werden dabei allgemein als polymere Verbindungen aus einer großen Anzahl an Monosaccharid-Bausteinen definiert, welche über eine glycosidische Bindung miteinander verbunden sind. In diese Klasse fallen auch die Glycokonjugate, beispielsweise Glycoproteine oder Glycolipide, welche häufig in Eu- karyoten, weniger häufig in Prokaryoten zu finden sind. Diese Verbindungen erfüllen in leben den Organismen eine Vielzahl unterschiedlicher Aufgaben. Darunter fallen beispielsweise die strukturelle Integrität der Zellmembranen, das Ausbilden der extrazellulären Matrix, die Sig nalübertragung, die Proteinfaltung und der interzellulare Informationsaustausch. Basierend auf der Vielfalt an strukturellen Ausgestaltungen und der Vielzahl an biologischen Funktionen hat die Glycan-Analytik für die pharmazeutische und die Nahrungsmittelindustrie in den letzten Jahren eine immer größere Bedeutung eingenommen.
Die Molmassenbestimmung der Glycane und deren Konjugate kann beispielsweise über Kapil lar-Elektrophorese (CE) erfolgen, welche auf Basis der Molekülladung eine schnelle und effi ziente Auftrennung selbst kleinster Probenvolumina erlaubt. Eine Abwandlung des CE-Prinzips wird in der Kapillar-Gelelektrophorese (CGE) verfolgt. In diesem Verfahren werden die Kapil laren zusätzlich zum Elektrolyten auch mit einem Gelbildner gefüllt. Basierend auf der Gel komponente erfolgt die Auftrennung deutlich verstärkt auch über die Größeneigenschaften (Molekularsiebeffekt) der zu untersuchenden Moleküle, da größere Moleküle einen deutlich höheren Migrationswiderstand durch das Gel-Netzwerk erfahren als kleinere. Der Einsatz des Polymergels erlaubt also eine deutliche Aufspreizung der physikalischen Einflussfaktoren, wel che in dieser Methode neben der Ladung auch eine Funktion der Molekülform ist. Letzteres erweitert das Anwendungsspektrum erheblich und ermöglicht selbst die Auftrennung makro molekularer Strukturisomere.
Zur Detektion der Glycane in der CE und der CGE hat sich verstärkt der Einsatz der Laser induzierten Fluoreszenz-Spektroskopie (LIF) durchgesetzt. Aufgrund der Tatsache, dass die Glycane in der Regel keine Fluorophore aufweisen, müssen zur Untersuchung der Substanzen zusätzliche Fluorophore ins Zielmolekül eingebracht werden. Letzteres ist insbesondere auch der Tatsache geschuldet, dass die optische Weglänge innerhalb der Kapillaren sehr kurz ist und die Proben nur eine sehr kleine Analytmengen aufweisen, so dass an die Nachweismethoden sehr hohe Sensitivitätsanforderungen zu stellen sind. Die Randbedingungen erfordern daher den Einsatz hocheffizienter Fluorophore und hocheffizienter optischer Komponenten. Ein„üb- licher“ Aufbau basiert dabei auf einem Argon-Laser mit Fluoreszenzanregungswellenlängen bei 488 nm und 514 nm und einem Photodetektor mit mehreren Detektionsfenstern.
Zur Bestimmung absoluter Größen des Molekulargewichts müssen die eingesetzten Systeme über den Einsatz von Referenzsubstanzen kalibriert werden. Als Standards werden häufig mit Fluorophoren gelabelte DNA-Fragmente („DNA-Leitem“) mit 35-500 Nukleotiden eingesetzt. Die Referenzsubstanzen werden dabei entweder vor oder nach der eigentlichen Probe auf die Kapillaren gegeben. Dies hat den Vorteil, dass Probe/Referenz mit denselben Fluorophoren arbeiten können. Mit den DNA-Referenzen können über einen sehr breiten Elutionsbereich gleichmäßige Elutionsabstände bereitgestellt werden. Nachteilig ist jedoch, dass sich der grund legende Aufbau der Polynukleotide von denen der Glycane unterscheidet. Aus diesem Grund werden analog zu den DNA- auch Dextran-Leitern als Referenzsubstanzen angeboten. Diese besitzen im Vergleich zu den Glycanen strukturähnliche Monomere und zeigen deshalb ein deutlich vergleichbareres Migrationsverhalten. Nachteilig ist jedoch, dass nur wenige geeignete Fluorophore existieren, welche den analytischen Randbedingungen der Methode genügen. Er schwerend kommt hinzu, dass diese zudem noch sehr ähnliche spektrale Eigenschaften zeigen.
Der Einsatz von Fluoreszenzmarkern in der Analytik wird auch in der Patentliteratur behandelt. So beschreibt beispielsweise die EP 0 943 918 Al Fluoreszenzmarkierungskomplexe mit nied rigem Molekulargewicht und mit großen Wellenlängen Verschiebungen zwischen der Absorp tion eines Farbstoffs in dem Komplex und der Emission eines anderen Farbstoffs in dem Kom plex. Diese Komplexe können zum Beispiel für Multiparameter-Fluoreszenz-Zellanalysen un- ter Verwendung einer einzelnen Anregungswellenlänge verwendet werden. Das niedrige Mo lekulargewicht des Komplexes erlaubt es den Materialien, die mit dem Komplex markiert sind, in Zellstrukturen zur Verwendung als Sonden einzudringen. Die Markierungskomplexe werden durch kovalente Bindung durch Linker unter Bildung von Donor- Akzeptor- Komplexen synthe tisiert. Der Resonanzenergietransfer von einem angeregten Donor zu einem fluoreszierenden Akzeptor liefert Wellenlängenverschiebungen von bis zu 300 nm. Die Fluoreszenzmarkie rungskomplexe enthalten vorzugsweise reaktive Gruppen für die Markierung von funktionellen Gruppen an Zielverbindungen, wie derivatisierte Oxy- und Deoxynukleinsäuren, Antikörper, Enzyme, Lipide, Kohlenhydrate, Proteine und andere Materialien. Die Komplexe können funk tionelle Gruppen enthalten, die eine kovalente Bindung zu Materialien ermöglichen, welche reaktive Gruppen tragen.
Des Weiteren offenbart die WO 2009 078 970 Al allgemein Fluoreszenzfarbstoffe nach der folgenden Formel
_ g - p
Zudem stellt die Schrift eine breite Palette von Fluoreszenzfarbstoffen und diese enthaltende Kits bereit, die zum Markieren einer Vielzahl von Biomolekülen, Zellen und Mikroorganismen anwendbar sind. Das Dokument stellt auch verschiedene Verfahren zur Verwendung der Fluo reszenzfarbstoffe für Forschung und Entwicklung, forensische Identifizierung, Umweltstudien, Diagnose, Prognose und / oder Behandlung von Krankheitszuständen bereit.
Trotz der schon im Bereich der Analytik bekannten Fluoreszenzmarker besteht weiterhin ein Interesse an neuen Verbindungen, welche selbst unter schwierigen Randbedingungen der je weiligen Analysemethode in der Lage sind, hoch genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu liefern. Diese Aufgabe wird durch die in den unabhängigen Ansprüchen beschriebenen Fluoreszenz marker, den Fluoreszenzmarker-Glycan-Konjugaten und den erfindungsgemäßen Kit-of-parts erfüllt. Bevorzugte Ausführungsformen derselben sind in den Unteransprüchen wiedergegeben.
Erfindungsgemäß ist ein Fluoreszenzmarker nach der folgenden Formel I
Figure imgf000007_0001
Formel I,
mit
Ri -H oder Cl - C6 Alkyl;
R2 -H oder -PO(OH)2;
X -S02- oder -PO(OH)-;
L = -(CH2)n-CHR3-CH2- mit n = 1, 2, 3 und R3 = -H oder -(CH2)-OPO(OH)2;
wobei Fluo ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder nicht substituierten C10-C30 Acridonen, Aminoacridinen oder Pyrenen.
Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker eine Vielzahl positiver Ei genschaften im Bereich der Analytik und insbesondere im Bereich der kapillarelektrophoreti schen Untersuchung von Glycanen aufweisen. Durch ihre Struktur sind die Fluoreszenzmarker in der Lage, einfach und reproduzierbar über eine reduktive Aminierung an Glycane gekoppelt zu werden. Dies hochwahrscheinlich durch die vorhandene Aminogruppe, welche einem pKa- Wert von ungefähr 4-5 aufweist. Die weiteren Strukturbestandteile des Fluoreszenzmarkers sind unter üblichen Kopplungsbedingungen stabil, sodass eine verlässliche und hoch effiziente Kopplung erhalten werden kann. Die Fluoreszenzmarker können eine hohe negative Nettola dung aufweisen und eignen sich dadurch insbesondere für schnelle Auftrennungen in üblichen Elektrophorese-Puffern, beispielsweise bei einem pH-Wert um die 8. Des Weiteren zeigen die beanspruchten Strukturen eine hohe Absorption in den üblicherweise verwendeten Wellenlän genbereichen von Ar-Lasern um die 488 nm. Dadurch können diese Fluoreszenzmarker mit Standardgeräten der Gelelektrophorese verwendet werden. Die Fluoreszenzmarker zeichnen sich zudem durch hohe Extinktionskoeffizienten und ausgezeichnete Quantenausbeuten aus. Besonders hervorzuheben ist, dass die Emission der beanspruchten Fluoreszenzmarker außer halb des Emissionsbereiches der aus dem Stand-der-Technik bekannten Fluoreszenzmarker liegt. Dadurch wird es zum ersten Mal möglich, dass Referenz und Probe mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarker markiert und zur selben Zeit vermessen werden können. Die Signale beider Komponenten, Referenz sowie Probe, können dabei einfach über die unterschiedlichen Emis sionswellenlängen auseinandergehalten werden. Die Emissionswellenlängen der hier bean spruchten Strukturen liegen in einem Bereich um die 560 - 600 nm, während die im Stand der Technik verwendeten Fluoreszenzmarker eine Emission um die 500 nm liefern. Die Emissions- maxima sind also weit genug entfernt, um eine signifikante Zuordnung zu erlauben. Ein weite rer Vorteil ergibt sich auch dadurch, dass die Fluoreszenzeigenschaften der beanspruchten Flu orophore sich gar nicht oder nur marginal durch Kopplung an Glycane verändern. In Summe wurden Fluoreszenzmarker erhalten, welche sich durch die existierenden Randbedingungen äu ßerst vorteilhaft für modernste CE- und GCE-Methoden eignen.
Die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker weisen eine spezifische Struktur nach der Formel I
Figure imgf000008_0001
Formel I,
auf. Dies bedeutet, dass die Fluoreszenzmarker mindestens eine Fluorophoreinheit Fluo auf weisen, welche kovalent sowohl an eine funktionelle Gruppe X als auch direkt kovalent an eine stickstoffenthaltende Gruppe gebunden sind. Die funktionelle Gruppe X ist wiederum kovalent an eine Finker-Gruppe F gebunden, welche sauerstoffverbrückt mit der terminalen Gruppe R2 verbunden ist. Die Aminogruppe Ri kann dabei erfindungsgemäß ein primäres (-H) oder ein sekundäres Amin sein, welches dann eine Cl - C6 Alkylgruppe trägt. Bevorzugt kann diese Gruppe als Bin dungsstelle zur Kopplung von Glycanen genutzt werden. Trotz der Nähe zum Fluorophor hat es sich gezeigt, dass sich auch nach Kopplung großer Glycanreste an die Aminogruppe in dieser Position sich die spektroskopischen Eigenschaften, und hier insbesondere die Lage des Emis sionsmaximums, nur unwesentlich ändern. Dies kann den apparativen Aufbau bei der Messung reduzieren und liefert sehr reproduzierbare Messwerte.
Die terminale Gruppe R2 kann Wasserstoff oder -PO(OH)2 sein. Es ergeben sich also erfin dungsgemäß Phosphorsäure-derivate oder Alkohole an dieser Stelle. Als Funktion des vorlie genden Puffersystems kann diese Gruppe natürlich auch geladen, beispielsweise als Alkoholat bzw. Phosphat, vorliegen. Durch diese Ausgestaltung können weitere Ladungen am Fluores zenzmarker erzeugt werden, welches die Migrationsgeschwindigkeit von Konjugaten im Rah men der CE erhöhen kann.
Die verbrückende Gruppe X kann entweder -S02- oder -PO(OH)- sein. Diese Gruppen haben sich zur Veränderung der Emissionswellenlänge des Fluoreszenzmarkers als besonders effi zient herausgestellt. Durch diese Gruppen ist man in der Lage, die Emissionswellenlänge in Richtung größerer Wellenlänge zu verschieben, und es werden über diese Substituenten Flu orophore mit hohen Quantenausbeuten erhalten. Durch das Einbringen dieser Gruppe wird zu dem die Umsetzung mit Glycanen zu Konjugaten nicht negativ beeinflusst. Es werden ohne nennenswerte Nebenreaktionen ähnliche Reaktionsgeschwindigkeiten erhalten.
Der Linker L kann ein reiner Kohlenwasserstoff (R3 = -H) sein oder aber auch noch eine wei tere, als Funktion des pH-Werte ionisierbare, Gruppe tragen (R3 = -(CH2)-OPO(OH)2). Letzte res kann besonders bevorzugt sein, falls höhere Ladungsdichten auf dem Fluoreszenzmarker gewünscht sind. Die Gruppe Fluo kann aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder nicht substituierten C10-C30 Acridonen, Aminoacridinen oder Pyrenen ausgesucht sein. Dies bedeutet, dass der Fluorophor-Grundköper, welcher an die Aminogruppe und über die funktionelle Gruppe X an den Linker gebunden ist, zu einer der 3 genannten Verbindungsklassen gehört. Überraschend wurde gefunden, dass sich insbesondere diese 3 Grundkörper eignen, durch den erfindungsge mäßen Aufbau Fluoreszenzmarker zu liefern, welche einen bestimmten Emissionswellenlän genbereich aufweisen. Dies ist umso überraschender, da diese drei Fluo-Grundkörper einen doch sehr unterschiedlichen Aufbau aufweisen können. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein weisen die drei unterschiedlichen Grundkörper im Rahmen des erfindungsgemäßen Auf baus sehr vergleichbare elektrische Eigenschaften auf, was zu einem ähnlichen Absorptions und Emissionsverhalten führt. Zudem ist die chemische Stabilität dieser Gruppen vergleichbar, sodass mit sehr vergleichbaren Kinetiken und mit einer ähnlichen Selektivität effiziente Kopp lung sreaktionen mit Glycanen erhalten werden können. Überraschend ist weiterhin, dass diese Gruppen eine vergleichbare Invarianz in Bezug auf die Verschiebung des Emissionsmaximums nach der Kopplung zeigen. Dies mag darin begründet liegen, dass die unterschiedlichen Fluo- Grundkörper zusätzlich zu den vergleichbaren elektronischen Eigenschaften auch eine ähnliche räumliche Struktur aufweisen.
Erfindungsgemäß fallen in die Gruppe der C10-C30 Acridone folgende Beispielverbindungen;
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Erfindungsgemäß fallen in die Gruppe der C10-C30 Aminoacridine folgende Beispiel Verbin dungen:
Figure imgf000011_0002
Erfindungsgemäß fällt in die Gruppe der C10-C30 Pyrene die folgende Verbindung:
Figure imgf000012_0001
Diese Verbindungen können zudem an jeder bindungsfähigen Stelle durch weitere funktionelle Gruppen wie -OH, -COOH, OR, -NH2, -NHR, -NR2 mit R Alkyl, Halogene, -S03H, -OPO3H2 substituiert sein oder schon einen Teil oder die ganzen Gruppen X und NH-Ri aufweisen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Fluoreszenzmarkers kann Fluo ausgesucht sein aus der Gruppe bestehend aus den Fluorophoren nach den Formeln II-IV
Figure imgf000012_0002
Formel IV, wobei R4, RS = jeweils unabhängig voneinander -OPO(OH)2 oder -OH; R6, R7 = jeweils unab hängig voneinander -S02-CH2-CHR2-(CH2)q-R4 oder -PO(OH)-CH2-CHR2-(CH2)q-R4 mit q = 1, 2, 3; o, p = jeweils unabhängig voneinander 1, 2, 3; und die Fluo nach den Formeln II-IV an jeder bindungsfähigen Stelle mit NH und X verbunden sein können. Gerade diese Strukturen aus den unterschiedlichen Klassen haben als Fluoreszenzmarker in der Glycan-Analytik als be sonders geeignet erweisen. Zusätzlich zu dem schon zu den unterschiedlichen Gruppen ausge führten, scheinen durch das vergleichbare Molekulargewicht, die vergleichbare Größe und die vergleichbaren elektronischen Eigenschaften, sich sehr ähnlich Fluoreszenzmarker-Eignungen herauszubilden. Diese Verbindungen sind unter den Bedingungen der CE stabil und lassen sich innerhalb sehr ähnlicher Reaktionszeiten an Glycane koppeln. Die erhaltenen Konjugate sind chemisch stabil und zeigen ausgezeichnete Haltbarkeiten selbst in Gegenwart eines wässrigen Puffers. Die Verbindungen sind zudem mit den üblichen Puffersystemen in der CE kompatibel und können als Funktion des pH-Wertes ein breites Ladungsspektrum abdecken. Die Anbin dung an die Gruppe X und die Aminogruppe kann dabei an jeder Stelle des Fluorophor-Grund- gerüstes erfolgen. Dies können bevorzugt die aromatischen Strukturen des Fluorophors sein. Diese Anbindungsstellen haben sich als besonders stabil erwiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform des Fluoreszenzmarkers können die Fluorophore Fluo den Formeln V - VII entsprechen
Figure imgf000013_0001
Formel V Formel VI
Figure imgf000014_0001
Formel VII. wobei die Fluorophore durch die geschlängelten Bindungen mit NH und X verbunden sind. Die Definition der weiteren Markush-Gruppen ist weiter oben definiert. Diese Strukturen mit den spezifischen Bindungs stellen zu den weiteren funktionellen Bestandteilen des Fluoreszenzmar kers haben sich als besonders geeignet erwiesen. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein ergeben sich durch diese spezifischen Bindungsstellen sterische Ausgestaltungen des Fluores zenzmarkers, welche eine besonders einfache und effiziente Wechselwirkung mit Glycan-Mak- romolekülen erlauben. Dadurch lassen sich die Kopplungsreaktionen schnell und effizient durchführen. Es werden innerhalb kurzer Reaktionszeiten stabile Konjugate erhalten, welche zudem in wässrigen Systemen sehr stabil sind.
Im Rahmen einer weiteren Charakteristik des Fluoreszenzmarkers kann X = -S02- sein. Insbe sondere Fluoreszenzmarker mit der dargestellten verbrückenden Einheit haben sich für die Flu- oreszenzanalytik als besonders geeignet erwiesen. Die verbrückende S02-Einheit scheint für den starken Shift in der Fluoreszenzemission mit verantwortlich zu sein und liefert im Vergleich zu Stand-der-Technik-Fluoreszenzmarker ein deutlich anderes Emissionsverhalten. Dies ist eine der Grundlagen, dass man im Rahmen einer Messung zwei unterschiedliche Fluoreszenz marker mit unterschiedlichen Emissionsfenstem betrieben kann. Diese Einheit liefert zudem ein chemisch sehr stabiles Molekül, welches auch im Rahmen der harschen Kopplungsbedin gungen an Glycane stabil bleibt. Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform des Fluoreszenzmarkers kann im Linker L R3 = -(CH2)-OPO(OH)2 sein. Die Grundform des erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarkers ist so fle xibel, dass selbst über das Anbinden weiterer funktioneller Teilgruppen, wie oben dargestellt, sich die Fluoreszenz-Grundeigenschaften nur unwesentlich ändern. Derart ist man in der Lage, die Nettoladung des Fluoreszenzmarkers über weitere deprotonierbare Gruppen zu erhöhen, welches zu einer schnelleren und spezifischeren Auftrennung im Bereich der Glycan -Analytik beitragen kann. Über die zusätzlichen funktionellen Gruppen mit einem Phosphor-Zentralatom können diese Fluoreszenzmarker auch flexibel mit unterschiedlichen Lösemitteln bei unter schiedlichen pH-Werten angewendet werden. Dies kann zu einer deutlichen Flexibilisierung in der Glycan- Analytik beitragen.
Innerhalb eines bevorzugten Aspektes des Fluoreszenzmarkers können in dem Fluorophor nach der Formel III oder VI R4 und Rs jeweils -OPO(OH)2 sein. Die Grundform des erfindungsge mäßen Fluoreszenzmarkers ist so flexibel, dass selbst über das Anbinden weiterer funktionellen Teilgruppen in den Strukturen II und VI, wie oben dargestellt, sich die Fluoreszenz-Grundei genschaften nur unwesentlich ändern. Derart ist man in der Lage, die Nettoladung des Fluores zenzmarkers über weitere deprotonierbare Gruppen zu erhöhen, welches zu einer schnelleren und spezifischeren Auftrennung im Bereich der Glycan-Analytik beitragen kann. Über die zu sätzlichen funktionellen Gruppen mit einem Phosphor-Zentralatom können diese Fluoreszenz marker auch flexibel mit unterschiedlichen Lösemitteln bei unterschiedlichen pH-Werten an gewendet werden. Dies kann zu einer deutlichen Flexibilisierung in der Glycan-Analytik bei tragen.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des Fluoreszenzmarkers können in dem Fluorophor nach der Formel IV und VII R6 und R7 jeweils -PO(OH)-CH2-CHR2-(CH2)-OPO(OH)2 sein. Die Grundform des erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarkers ist so flexibel, dass selbst über das Anbinden weiterer funktioneller Teilgruppen in den Strukturen IV und VII, wie oben darge stellt, sich die Fluoreszenz-Grundeigenschaften nur unwesentlich ändern. Derart ist man in der Lage, die Nettoladung des Fluoreszenzmarkers über weitere deprotonierbare Gruppen zu erhö hen, welches zu einer schnelleren und spezifischeren Auftrennung im Bereich der Glycan-Ana- lytik beitragen kann. Über die zusätzlichen funktionellen Gruppen mit einem Phosphor-Zent ralatom können diese Fluoreszenzmarker auch flexibel mit unterschiedlichen Lösemitteln bei unterschiedlichen pH-Werten angewendet werden. Dies kann zu einer deutlichen Flexibilisie rung in der Glycan- Analytik beitragen.
Des Weiteren erfindungsgemäß ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Fluoreszenzmar ker als Standard in einer Glycan-Analyse. Die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker eignen sich insbesondere als Standard zur Untersuchung von Glycanen. Basierend auf der Struktur der Fluoreszenzmarker ergeben sich kovalente Bindungsstellen zu Glycanen, welche im Zuge ge steuerter Reaktion einfach und reproduzierbar mit funktionellen Gruppen der Glycane umge setzt werden können. Derart lassen sich Glycane oder allgemein Zucker mit einem spezifischen Molekulargewicht einfach an die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker koppeln. Man erhält also gelabelte Glycan-Proben mit spezifischem Molekulargewicht und reproduzierbaren Mig rationseigenschaften, welche in der CE oder der GCE auch als MW-Referenzproben eingesetzt werden können. Durch den vergleichbaren chemischen Aufbau eignen sich diese Moleküle deutlich besser als DNA-Leitem. Ein weiterer Vorteil ergibt sich über das veränderte Emissi onsverhalten und hier insbesondere die veränderte Emissionswellenlänge. Diese führt dazu, dass man innerhalb einer Auftrennung sowohl die zu untersuchende Probe als auch die Referenz gleichzeitig in unterschiedlichen Emissionsfenstem detektieren kann, vorausgesetzt, dass die Probe mit ein Stand-der-Technik-Fluoreszenzmarker gelabelt ist. Da Probe und Referenz unter exakt gleichen Bedingungen aufgetrennt werden, sind diese Messung reproduzierbarer als Mes sungen, in denen die Referenz mit demselben Fluoreszenzmarker in einem pre- oder post-Ex- periment untersucht wird. Durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker kön nen also Analysenzeit und Kosten eingespart werden. Sinnvollerweise können die verwendeten Glycan-Standards Standards als Funktion des Molekulargewichts der Glycane sein. Des Weiteren erfindungsgemäß ist ein Konjugat aus einem Fluoreszenzmarker und einem Gly- can, wobei das Glycan an mindestens einen erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker kovalent gebunden ist. Bedingt durch den chemischen Aufbau lassen sich die erfindungsgemäßen Fluo reszenzmarker effizient an Glycane koppeln. Auf die Art und Weise können eine oder mehrere Fluoreszenzmarker an die Glycane gekoppelt und diese so einer Fluoreszenzuntersuchung zu gänglich gemacht werden. Vorteilhafterweise können die Konjugate als Funktion des vorlie genden pH-Wertes eine größere Anzahl an Ladungen tragen. Dies kann beispielsweise durch eine Deprotonierung der sauren Gruppen des Fluoreszenzmarkers erfolgen. Die Konjugate kön nen also eine höhere Nettoladung tragen und insbesondere elektrophoretische Messungen kön nen schneller durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Variante des Konjugats kann das Glycan ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus mono-, oligo-, Polysacchariden, Glycoproteinen, Glycolipiden, Proteoglycanen oder Mischungen daraus. Die oben genannte Gruppe an Glycanen lassen sich schnell und ohne die Bildung unerwünschter Nebenprodukte an die erfindungsgemäßen Fluoreszenzmarker kop peln. Dadurch können innerhalb eines Experimentes sowohl die Proben aus der Gruppe der oben angegebenen Glycane als auch beispielsweise Molekulargewichtsstandards vermessen werden. Es ergeben sich dabei die schon für den Fluoreszenzmarker diskutierten Vorteile.
Weiterhin erfindungsgemäß ist ein Kit-of-parts, welches mindestens ein oder mehrere Behälter mit einem oder mehreren Lösungsmitteln und ein oder mehrere Behälter mit jeweils den erfin dungsgemäßen Fluoreszenzmarker oder den erfindungsgemäßen Konjugaten umfasst. Insbe sondere eine Verkaufsverpackung mit einer oder mehreren Glycan-Fluoreszenzmarker-Konju- gaten, bevorzugt mit unterschiedlichen Molekulargewichten, kann die Fluoreszenzuntersu chung unbekannter Glycan-Proben deutlich erleichtern. Die Konjugate können dabei schon in Lösung, beispielsweise einem Puffer, oder als isolierte Substanz vorliegen. Letztere kann dann beispielsweise zusammen mit einem im Kit bereitgestellten Puffer kurz vor der Messung zu einer Konjugat-Lösung verarbeitet werden. Dies kann vorteilhaft sein, da die zu verwendende Menge über das Mischungsverhältnis von Puffer zu Konjugat eingestellt werden kann. Zudem kann die Menge auf die Empfindlichkeit des Versuchsaufbaus adaptiert werden. Bevorzugt kann das Kit eine, noch bevorzugter zwei oder drei Konjugate mit unterschiedlichen Moleku largewichten aufweisen. Der Einsatz mehrerer Konjugate kann über eine mögliche mathemati sche Weiterverarbeitung der erhaltenen Informationen zu einer verlässlicheren Messung beitra gen. Es ist aber auch möglich, ein Kit zur Färbung von Glycanen bereitzustellen.
Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform des Kits kann das Kit ein„Labeling“ Kit zur Verwendung in der Markierung von Glycanen sein. Dieses Labeling Kit kann neben dem erfin dungsgemäßen Farbstoff als fakultativen Bestandteil noch weitere optionale Bestandteile wie eine oder mehrere Pufferlösungen, ein oder mehrere Reduktionsmittel (beispielsweise Natri- umcyanoborhydrid, 2-Picolinboran); Verbrauchsmaterialien für die Durchführung der Färbung (Gefäße etc.) und eine Färbeanleitung umfassen. Mittels dieses Kits lassen sich Glycan-Proben erfindungsgemäß anfärben.
In Rahmen einer weiteren Ausgestaltung des Kits kann das Kit ein Glycan-Leiter-Kit zur Ver wendung als interner Standard sein. Das Kit kann dabei fakultativ eine Mischung gefärbter Glycane, bevorzugt Dextrane, unterschiedlichen Molekulargewichts und diese vorzugsweise in lyophilisierter Form aufweisen. Weiterhin optional kann das Kit Lösemittel oder Puffer, Ver brauchsmaterial für die Färbung (Gefäße etc.) und eine Anleitung zur Rekonstitution und Ver wendung umfassen. Mittels dieses Kits lassen sich gelabelte Glycane mit bekannten Moleku largewichten als interne Standards in der Untersuchung von Glycanen mit unbekannten Mole kulargewichten bereitstellen.
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Gegenstände wer den durch die Figuren veranschaulicht und nachfolgenden erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Figuren nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken. Es zeigen:
Fig. 1 einen Syntheseweg für einen phosphorylierten Acridon-Fluoreszenzmarker nach der Verbindung 1;
Fig. 2 Absorptions-/Emissionsspektren der Beispielverbindung 1 (in 0,05 M TEAB-Puffer mit Anregung bei 488 nm) als isolierter Fluoreszenzmarker ( ) und als Glucose-Konjugat (- - ) im Wellenlängenbereich zwischen 250 und 800 nm.
Die Figur 1 zeigt einen möglichen Syntheseweg zum Erhalt der Verbindung 1. Die einzelnen Synthesestufen und Reaktionsbedingungen sind weiter unten im Beispielteil beschrieben.
Die Figur 2 zeigt die Absorptions- und Emissionseigenschaften eines erfindungsgemäßen Flu oreszenzmarkers sowie eines Konjugats aus einem Fluoreszenzmarker und einem Einfachzu cker. Dargestellt sind die normierten Absorptions- und Emissionsspektren von 7-[(3-phosphop- ropyl)sulfonyl]-2-aminoacridin-9(lOH)-on (1) sowie dessen Glucose-Konjugats. Die Absorpti onseigenschaften wurden in 0,05 M TEAB-Puffer (Triethylammoniumbicarbonat-Puffer) bei einem pH-Wert von 8,0 gemessen. Die Anregung erfolgte bei 488 nm. Es ist deutlich die Flu oreszenzemission mit einem Maximum um ca. 585 nm zu erkennen. Durch Bildung des Kon jugats wird das Emissionsmaximum nur unwesentlich zu höheren Wellenlängen verschoben und liegt bei ca. 590 nm. Durch die spektroskopischen Eigenschaften eignet sich der Fluores zenzmarker insbesondere für die Glycan- Analytik, wobei der Fluoreszenzmarker alleine oder aufgrund seines Emissionsmaximums gleichzeitig in Kombination mit einem Fluoreszenzmar ker aus dem Stand der Technik verwendet werden kann. Durch die verschiedenen Emissions fenster lassen sich zwei Fluoreszenzmarker unabhängig voneinander detektieren. Beispiele
Synthese der Beispielverbindungen
Ein möglicher Syntheseweg zum Erhalt der Verbindung (1) ist in der Figur 1 dargestellt.
(I) 5-Nitro-N-phenyl-anthranilsäure (4)
Figure imgf000020_0001
2-chloro-5-nitrobenzoesäure (7,5 g, 38 mmol) werden in 50 mL n-butanol at 40 °C gelöst. Ani lin (7,7 mL, 83 mmol, 2,2 eq.) und DIEA (82,5 mmol, 14,4 mL, 2,2 eq.) werden hinzugefügt. Die Mischung wird unter Rückfluss (l20°C) für 3 Tage gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtem peratur werden die leicht flüchtigen Bestandteile im Vakuum abgedampft. Es wird ein braunes Öl erhalten. Der Rückstand wird in eine stark gerührte Mischung aus zerstoßenem Eis und Salzsäure (1 M, 100 mL) überführt. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit Wasser ge waschen und an der Luft getrocknet. Das Rohprodukt wird in Essigsäure rekristallisiert (180 mL), abfiltriert und mit Diethylether gewaschen. Nach Trocknen im Vakuum erhält man die Verbindung (4) (6,37 g, 24,7 mmol, 66 %) als gelben Rückstand.
MS (ESI):
m/z (positive mode) = 259,1 [M+H]+, 281,1 [M+Na]+.
HR-MS (ESI): C13H10N2O4: Calc. [M+H]+ 259,0713, gefunden 259,0714, [M+Na]+: Calc. 281,0533, gefunden: 281,0535.
1H-NMR (400 MHz, OMF-di): d [ppm] = 14,42 (s, 1H, COOH), 10,53 (s, 1H, NH), 8,87 (d, J = 2,8 Hz, 1H, 6-H), 8,25 (dd, J = 9,4, 2,8 Hz, 1H, 4-H), 7,56 - 7,49 (m, 2H, 3’-H), 7,47 - 7,42 (m, 2H, 2’-H), 7,32 (m,lH, 4’-H), 7,26 (d, J = 9,4 Hz, 1H, 3-H), 13C-NMR (101 MHz, DMF-A): d [ppm] = 170,2, 154,0, 139,7, 138,2, 131,0, 130,4, 129,7, 126,9, 125,2, 114,4, 112,3,
TLC: R/= 0,54 (Me0H/H20, 80/20)
(II) 2-Nitroacridin-9(10H)-on (5)
Figure imgf000021_0001
Verbindung 4 (0,51 g, 1,96 mmol) wird in POCI3 (5 mL) gelöst und die Reaktionsmischung wird unter Rückfluss (125 °C) für 3 Stunden gerührt. Das POCI3 wird im Vakuum abgedampft und zum Rückstand wird zerstoßenes Eis (50 g) und Salzsäure (1 M, 100 mL) gegeben. Die Mischung wird für eine Stunde unter Rückfluss gekocht bis ein gelbes Produkt ausfällt. Das Präzipitat wird gefiltert, mit Wasser, kalten Methanol und Diethylether gewaschen und an- schließend an der Luft getrocknet. Man erhält ein reines 2-Nitroacndin-9( 10 7)-on (0,40 g, 1,66 mmol, 85 %) als hellgelben Leststoff.
!H-NMR (400 MHz, DMSC )-d6): d [ppm] = 12,37 (s, 1H, NH), 8,99 (d, J = 2,7 Hz, 1H, l-H), 8,49 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H, 3-H), 8,26 (dd, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H, 8-H), 7,84 (ddd, J = 8,4, 7,0 Hz, 1H, 7-H), 7,69 (d, J= 9,2 Hz, 1H, 4-H), 7,61 (dd, J= 8,4, 1,5 Hz, 1H, 5-H), 7,39 (ddd, J= 8,1, 7,0 Hz, 1H, 6-H),
HPLC: tR = 9,87 min (ACN/H2O+ 0,1 % TLA; 30/70-^ 10/0 in 12 min; Detektion bei 254 nm)
(III) 7-Bromo-2-nitroacridin-9(10H)-on (6)
Figure imgf000021_0002
Verbindung 5 (0,4 g, 1,6 mmol) wird in Nitrobenzol (40 mL) suspendiert. Brom (140 pL, 2,5 mmol, 1,5 eq.) wird hinzugefügt und die Reaktionsmischung wird für 18 h bei 120 °C ge rührt. Nach Abkühlen auf 0 °C wird das ausgefallene Präzipitat abgefiltert und mit Diethylether gewaschen. Weiterer Diethylether (100 mL) wird zum Filtrat gegeben und die Mischung für eine Stunde auf 0 °C gekühlt. Das gebildete Präzipitat wird abgefiltert und mit Diethylether gewaschen. Die vereinigten Feststoffe werden im Vakuum getrocknet und man erhält die Ver bindung 6 (442 mg, 1,38 mmol, 86 %) als gelben Feststoff.
MS (ESI): m/z (positive mode): 341,0 [M+ Na]+, 660,9 [2M+Na]+,978,9 [3M+Na]+,
HR-MS (ESI): C13H7N2O3: calc. [M+H]+: 318,9713, gefunden: 318,9719, [M+Na]+: calc. 340,9532, gefunden: 340,9539.
!H-NMR (400 MHz, OMF-di): d [ppm] = 12,66 (s, 1H, NH), 9,08 (d, J = 2,7 Hz, 1H, l-H), 8,54 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H, 3-H), 8,39 (d, J = 2,4 Hz, 1H, 8-H ), 7,99 (dd, J = 8,8, 2,4 Hz, 1H, 6-H), 7,81 (d, J = 9,2 Hz, 1H, 4-H), 7,70 (d, J = 8,8 Hz, 1H, 5-H),
13C-NMR (101 MHz, DMSC ö): d [ppm] = 176,8, 146,0, 142,7, 141,2, 138,2, 129,4, 128,8, 124,2, 123,7, 121,8, 120,8, 120,5, 116,3;
HPLC: tR = 12,32 min (ACN/H2O+ 0,1 % TFA; 30/70
Figure imgf000022_0001
100/0 in 12 min; Detektion bei
254 nm)
(IV) 7-[(3-hydroxypropyl)thio]-2-nitroacridin-9(10H)-on (7)
Figure imgf000022_0002
Verbindung 6 (500 mg, 1,57 mmol) wird zu einer Suspension aus K2CO3 (433 mg, 2 eq.) in DMF (40 ml) gegeben. 3-Mercapto-l -propanol (216 mg, 2,35 mmol, 1,5 eq.) und Triethylamin (150 uL) warden hinzugegeben. Argon wird für 10 min. durch die Lösung geleitet und anschlie ßend werden Xantphos (308 mg, 530 pmol, 0,34 eq.) und Pd2(dba)3 (402 mg, 430 pmol, 0,28 eq.) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird für 23 h bei 105 °C unter Argon- Atmo sphäre bis zur vollständigen Umsetzung (HPLC) gerührt. Das Lösungsmittel wird unter redu ziertem Druck abgedampft, der Rückstand in ACN (+10% TFA) aufgelöst und auf ein Celite gegeben. Eine Flash-Chromatographie ( Reveleris (SiO2) 40 g cartridge, ACN/DCM, ACN: 8 % 66 %) liefert das reine Produkt 7 (229 mg, 0,69 mmol, 44 %).
MS (ESI): m/z (positive mode): 331,1 [M+H]+, 353,1 [M+ Na]+, 683,1 [2M+ Na]+,l l l3,2 [3M+ Na]+.
HR-MS (ESI): C16H14N2O4S: calc. [M+H]+: 331,0747, gefunden: 331,0751, [M+Na]+: calc. 353,0566, gefunden: 353,0566.
!H-NMR (400 MHz, DMF-<77): d [ppm] = 12,40 (s, 1H, NH), 8,95 (d, J = 2,7 Hz, 1H, l-H), 8,45 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H, 3-H), 8,08 (d, J = 2,3 Hz, 1H, 8-H), 7,78 (dd, J = 8,7, 2,3 Hz, 1H, 6-H), 7,65 (d, J = 9,2 Hz, 1H, 4-H), 7,56 (d, J = 8,7 Hz, 1H, 5-H), 3,52 (t, J = 6,1 Hz, 2H, 3’- H), 3,13 - 3,01 (m, 2H, l’-H), 1,83 - 1,66 (m, 2H, 2’-H),
13C-NMR (101 MHz, DMSO+fc): d [ppm] = 176,2, 144,9, 141,4, 139,4, 135,6, 131,6, 127,4, 125,4, 123,3, 121,8, 119,9, 119,4, 109,9, 60,0, 32,5, 30,3,
HPLC: tR = 9,67 min (ACN/H2O+ 0,1 % TFA; 30/70
Figure imgf000023_0001
100/0 in 12 min; Detektion bei
254 nm)
(V) 7-[(3-Hydroxypropyl)sulfonyl]-2-nitroacridin-9(10H)-on (8)
Figure imgf000023_0002
Verbindung 7 (255 mg, 0,77 mmol) wird in eine Mischung aus Essigsäure (10 mF) und Wasser (2,4 mF) suspendiert. Na2W04 · 2H20 (63 mg, 0,19 mmol, 0,25 eq) wird hinzugegeben und die Suspension auf 0 °C heruntergekühlt. Danach wird Wasserstoffperoxid (10 mF, 50 % (v/v)) über 10 Minuten zugetropft. Die Suspension wird auf Raumtemperatur erwärmt und unter Auf lösung des Feststoffs für weitere 5 h gerührt. Nach vollständiger Umsetzung des Eduktes (HPLC) wird die Reaktionsmischung über Nacht gefriergetrocknet. Das Rohprodukt wird in DMF (0,5 mL) aufgelöst und über eine Biotage SNAP Ultra 25 g cartridge gereinigt. Flash chromatography (ACN/DCM, ACN 10%
Figure imgf000024_0001
100%) resultiert in 8 (179 mg, 0,49 mmol, 64 %) als orangener Feststoff.
MS (ESI): m/z (positive mode): 363,1 [M+H]+, 385,1 [M+ Na]+, 747,1 [2M+ Na]+, 1109,2 [3M+ Na]+.
HR-MS (ESI): CIÖHRNIOÖS: calc. [M+H]+: 363.0645, gefunden: 363,0650, [M+Na]+: calc. 385,0465, gefunden: 385,0465.
!H-NMR (400 MHz, DMF-<77): d [ppm] = 12,86 (s, 1H, NH), 9,06 (d, J = 2,7 Hz, 1H, l-H), 8,79 (d, J = 2,1 Hz, 1H, 8-H), 8,58 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H, 3-H), 8,26 (dd, J = 8,7, 2,1 Hz, 6- H), 7,89 (d, J = 8,7 Hz, 1H, 5-H), 7,84 (d, J = 9,2 Hz, 1H, 4-H), 4,74 (bs, 1H, OH), 3,60 (t, J = 6,2 Hz, 2H, l’-H), 3,56 - 3,41 (m, 2H, 3’-H), 1,93 - 1,81 (m, 2H, 2’-H),
13C-NMR (101 MHz, DMF -di) d [ppm] = 177,5, 146,1, 145,15, 143,2, 134,5, 133,6, 129,2, 128,7, 124,0, 121,6, 121,5, 120,8, 120,8, 60,4, 53,9, 27,6,
HPLC: ίk = 7,68 min (ACN/H20+ 0,1 % TFA; 30/70-^ 100/0 in 12 min; Detektion bei 254 nm)
(VI) 7-[(3-hydroxypropyl)sulfonyl]-2-aminoacridin-9(10H)-on (2)
Figure imgf000024_0002
Pd/C (10%, in oxidierter Form, 8 mg) wird in einer Argon-Atmosphäre in 2-Propanol (5 mL) suspendiert. Verbindung 8 (20 mg, 55 m mol) wird hinzugefügt und eine Wasserstoffatmosphäre eingestellt. Die Suspension wird bei Raumtemperatur über Nacht unter teilweisem Auflösen des Feststoffes gerührt. Die gelb fluoreszierende Lösung wird zum Entfernen des Pd/C über Celite gefiltert und der Feststoff mit 2-Propanol gewaschen. Anschließend wird das Lösemittel unter reduziertem Druck entfernt. Man erhält die reine Verbindung 2 (HPLC, 12 mg, 37 m mol, 68 %). MS (ESI): m/z (positive mode): 333,1 [M+H]+, 355,1 [M+ Na]+, 665,2 [2M+ H]+,687,2 [2M+ Na]+.
HR-MS (ESI): CieHiöNiCFS: calc. [M+H]+: 333,0904, gefunden: 333,0911, [M+Na]+: calc. 355,0723, gefunden: 355,0730
!H-NMR (400 MHz, DMSO -de): d [ppm] = 12,03 (s, 1H, NH), 8,62 (d, J = 2,2 Hz, 1H, l-H), 7,98 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 1H, 3-H), 7,65 (d, J = 8,8 Hz, 1H, 4-H), 7,46 - 7,37 (m, 2H, 6-H, 8- H), 7,19 (dd, J = 8,8, 2,7 Hz, 1H, 5-H), 5,39 (s, 2H, NH2), 4,61 (t, J = 5,3 Hz, 1H, OH), 3,40 (q, J = 5,9 Hz, 2H, 3’-H), 3,35 - 3,27 (m, 1H, l’-H), 1,78 - 1,60 (m, 2H, 2’-H),
13C-NMR (101 MHz, DMSO -de): d [ppm] = 175,8, 144,6, 142,5, 132,4, 129,9, 129,4, 127,9, 123,8, 122,5, 118,7, 118,6, 117,9, 105,9, 58,7, 52,5, 26,2,
HPLC: tR = 4,2 min (ACN/H20 + 0,05 M TEAB pH ~ 8; 90/10-^50/0 in 12 min; Detektion bei 254 nm)
(VII) 7-[[3-(O,O-di-tert-butylphosphate)propyl]sulfonyl]-2-nitroacridin-9(10H)-on (9)
Figure imgf000025_0001
Verbindung 8 (58 mg, 162 m mol) wird unter Argonatmosphäre in einem trockenen Kolben in DMF (1 mL) aufgelöst. 1 7-Tetrazol (39 mg, 0,561 mmol, 4 eq.) wird in DMF (1 mF) gelöst und zusammen mit di-/e/7-butyl /V,/V-Diisopropylphosphoramidit (203 pF, d = 0,88 g/mF, 179 mg, 0,646 mmol, 4 eq.) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei 40 °C für 1.5 h gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird mCPBA (139 mg, 0,805 mmol, 5 eq.) in DCM (1 mF) gelöst hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wird für 1 h gerührt und eine HPFC zeigt die vollständige Umsetzung des Startmaterials an. Die Fösemittel werden unter reduzier tem Druck entfernt. Der Rückstand wird in DMF (300 pF) gelöst und in eine präparative HPFC (ACN/H20 + 0.1
Figure imgf000025_0002
70/30, in 20 min) gegeben. Man erhält die reine Verbindung
9 (59 mg, 106 pmol, 65 %). MS (ESI): m/z (positive mode): 577,1 [M+Na]+, 1131,3 [2M+ Na]+.
HR-MS (ESI): C24H31N2O9S: calc. [M+H]+: 555,1561, gefunden: 555,1565, [M+Na]+: calc. 577,1380, gefunden: 577,1380
3H-NMR (400 MHz, OMF-di): d [ppm] = 12,95 (s, 1H, NH), 9,05 (d, J = 2,7 Hz, 1H, l-H), 8,79 (d, J = 2,2 Hz, 1H, 8-H), 8,57 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H, 3-H), 8,27 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 1H, 6-H), 7,90 (d, J = 8,8 Hz, 1H, 5-H), 7,85 (d, J = 9,2 Hz, 1H, 4-H), 4,06 (m, 2H, 3’-H), 3,60 - 3,41 (m, 2H, l’-H), 2,12 - 2,00 (m, 2H, 2’-H), 1,41 (s, 18H, £Bu),
13C-NMR (101 MHz, DMF-J7): d [ppm] = 177,2, 145,9, 145,0, 143,0, 133,8, 133,3, 129,0,
128,6, 123,7, 121,4, 121,3, 120,7, 120,5, 82,5, 82,5, 65,4, 53,1, 30,0, 30,0, 25,1,
31P-NMR (162 MHz, DMF-<77) d [ppm] = -9,78,
HPLC: tR = 11,62 min (ACN/H2O+ 0,1 % TFA; 30/70^ 100/0 in 12 min; Detektion bei 254 nm)
(IIX) 7-[(3-phosphopropyl)sulfonyl]-2-aminoacridm-9(10H)-on (1)
Figure imgf000026_0001
Pd/C (10%, in oxidierter Form, 11 mg) wird in einer Argon- Atmosphäre in 2-Propanol (3 mL) suspendiert. Verbindung 9 (24 mg, 43 m mol) wird hinzugefügt und eine Wasserstoffatmosphäre eingestellt. Die Suspension wird bei Raumtemperatur über 21 h unter teilweisem Auflösen des Feststoffes gerührt. Die Lösung wird zum Entfernen des Pd/C über Celite gefiltert und das Lö semittel abgedampft. Eine HPLC zeigt die vollständige Umsetzung des Eduktes an. Das Roh produkt wird in Wasser (5 ml) suspendiert und auf 0 °C gekühlt. Anschließend gibt man TFA (10 mL) tropfenweise hinzu. Man erwärmt die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur und rührt für 3 h. HPLC zeigt eine vollständige Entschützung des Phosphates. Die Reaktionsmi schung wird über Nacht gefriergetrocknet und anschließend in aq. TEAB-buffer (pH 8) glöst. Das Rohprodukt wird über eine präparative HPLC (ACN/H2O (0,05% v/v TEAB Puffer pH 8, 5/95 27/73 %, in 10 min, IR = 8,3 min) aufgereinigt. Man erhält das Triethylammoni- umsalz (1,5 eq.) der Verbindung 1 als braunen Feststoff (13 mg, 31 m mol, 86 %).
MS (ESI): m/z (positive mode): 413,1 [M+H]+, 435,0 (M+H)+, 457,0 [M+ 2Na]+,
HR-MS (ESI): C16H17N2O7PS: calcd. [M+H]+: 413,0572, gefunden: 413,0567, [M+Na]+: calc. 435,0386, gefunden: 435,0393
3H-NMR (400 MHz, D20): d [ppm] = 8,37 (d, J = 2,1 Hz, 1H, l-H), 7,83 (dd, J = 8,9, 2,1 Hz, 1H, 3-H), 7,21 (d, J= 8,9 Hz, 1H, 4-H), 7,06 - 6,95 (m, 2H, 6-H, 8-H), 6,91 (d, J= 8,7 Hz, 1H,
5-H), 3,82 (q, J= 5,9 Hz, 2H, l '-H), 3,65 - 3,42 (m, 2H, 3'-H), 3,15 (q, J= 7,4 Hz, 10H, NEt3) 2,08 - 1,95 (m, 2H, 2'-H), 1,24 (t, J = 7,4 Hz ,15H, NEt3),
13C-NMR (100 MHz, D20): d [ppm] = 177,3, 142,2, 141,9, 133,9, 129,7, 128,7, 127,9, 126,1,
120,7, 118,9, 118,6, 117,3, 107,8, 61,9, 52,9, 46,6 (NEt3), 23,9, 8,2 (NEt3),
31P-NMR (162 MHz, D20): d [ppm] = 3,76.
(IX) Synthese der Glukose-Konjugate Synthese der Verbindung 1-GLU
Figure imgf000027_0001
Verbindung 17 (3 mg, 7 m mol) wird in einer Malonsäurelösung (0,36 mL, 1 M in DMSO) ge löst. Wässrige Glucoselösung (72 mE, 0,1 M, 1,1 eq.) und pic-BH3 (87 pL, 1 M, 12 eq., in DMSO) werden hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird bei 35 °C für 18 h auf einem Shaker inkubiert. Nach Hinzufügen von H20/ACN (3: 1) wird die Reaktionsmischung gefriergetrock net. Das Rohprodukt wird über präparative HPLC (ACN/H20 + 0,1
Figure imgf000027_0002
30/70, in
10 min) aufgereinigt. Man erhält reines 1-Glu als orangefarbenen Feststoff (2,1 mg, 3 m mol, 33 %).
MS (ESI): m/z (negative mode) = 575,1 [M]
Figure imgf000028_0002
Verbindung 2 (3,35 mg, 10 mihoΐ) wird in einer Malonsäurelösung (0,4 mL, 1 M in DMSO) ge löst. Wässrige Glukoselösung (90 pL, 0,1 M, 1,1 eq.) and pic-BH3 (108 pL, 1 M, 12 eq., in DMSO) werden hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird bei 35 °C für 18 h auf einem Shaker inkubiert. Nach Hinzufügen von H20/ACN (3: 1) wird die Reaktionsmischung gefriergetrock net. Das Rohprodukt wird über präparative HPLC (ACN/H20 + 0,1
Figure imgf000028_0001
30/70, in
10 min) aufgereinigt. Man erhält reines 2-Glu als orangefarbenen Feststoff (2 mg, 4 m mol, 40 %).
MS (ESI): m/z (negative mode) = 495,2 [M]
HR-MS (ESI): C22H28N2O9S: calc. [M+H]+: 497,1600, gefunden: 497,1588.
Fotophysikalische Eigenschaften der Fluoreszenzmarker
Die spektroskopischen Eigenschaften werden beispielhaft in den beiden folgenden Tabellen anhand der Verbindungen 1 und 2 aufgezeigt.
Für die Verbindung 1 ergeben sich als Funktion des Lösungsmittels die folgenden Eigenschaf ten:
Figure imgf000029_0001
Tabelle 1
Der Fluoreszenzmarker zeichnet sich durch hohe Quantenausbeuten auch in unterschiedlichen Lösungsmitteln aus und zeigt eine Emission bei Wellenlängen, welche sich von den Wellen längen üblicher Fluoreszenzmarker insbesondere in der Glycananalytik unterscheiden. Somit ist es möglich, dass parallel mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarker gearbeitet wird. Es können somit Probe und Referenz unterschiedlich gelabelt und gleichzeitig in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen detektiert werden. Auf diese Art und Wiese kann ein pre- oder post-run mit einer separaten Molekulargewichtsreferenz entfallen.
Die Verbindung 1 lässt sich zudem über die folgenden Parameter charakterisieren:
MS(ESI): m/z (positive mode): 413,1 [M+H]+ , 435,0 (M+H)+ , 457,0 [M+ 2Na]+
HR-MS (ESI): C16H17N207PS: calc. [M+H]+: 413,0572, gefunden: 413,0567,
[M+Na]+: calc. 435,0386, gefunden: 435,0393
!H-NMR (400 MHz, D20): 5[ppm] = 8.37 (d, J = 2,1 Hz, 1H l-H), 7,83 (dd, J = 8,9, 2,1 Hz, 1H 3-H), 7,21 (d, J = 8,9 Hz, 1H 4-H), 7,06 - 6,95 (m, 2H, 6-H, 8-H), 6,91 (d, J = 8.7 Hz, 1H 5-H), 3.82 (q, J = 5,9 Hz, 2H, l'-H), 3,65 - 3,42 (m, 2H, 3'-H), 3,15 (q, J = 7,4 Hz, 10H, NEt3) 2,08 - 1,95 (m, 2H, 2'-H), 1,24 (t, J = 7,4 Hz ,15H, NEt3). 13C-NMR (100 MHz, D20): 5[ppm] = 177,3, 142,2, 141,9, 133,9, 129,7, 128,7, 127,9, 126,1, 120,7, 118,9, 118,6, 117,3, 107,8, 61,9, 52,9, 46,6 (NEt3), 23,9, 8,2 (NEt3).
31P-NMR (162 MHz, D20): 5[ppm] = 3,76. Für die Verbindung 2 ergeben sich als Funktion des Lösungsmittels die folgenden Eigenschaf ten:
Figure imgf000030_0001
Tabelle 2
Der Fluoreszenzmarker zeichnet sich durch hohe Quantenausbeuten in unterschiedlichen Lö- sungsmitteln aus und zeigt eine Emission bei Wellenlängen, welche sich von den Wellenlängen üblicher Fluoreszenzmarker insbesondere in der Glycananalytik unterscheiden. Somit ist es möglich, dass parallel mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarker gearbeitet wird. Es kön nen somit Probe und Referenz unterschiedlich gelabelt und gleichzeitig in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen detektiert werden. Auf diese Art und Wiese kann ein pre- oder post-run mit einer separaten Molekulargewichtsreferenz entfallen.
Die Verbindung 2 lässt sich zudem über die folgenden Parameter charakterisieren: MS (ESI): m/z (positive mode): 333,1 [M+H]+, 355,1 [M+Na]+, 665,2 [2M+H]+, 687,2 [2M+Na] +.
HR-MS (ESI): C16H16N204S: calc. [M+H]+: 333,0904, gefunden: 333,0911, [M+Na]+: calc. 355,0723, gefunden: 355,0730
!H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 5[ppm] = 12,03 (s, 1H, NH), 8,62 (d, J = 2,2 Hz, 1H, l-H), 7,98 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 1H, 3-H), 7,65 (d, J = 8,8 Hz, 1H, 4-H), 7,46 - 7,37 (m, 2H, 6-H, 8- H), 7,19 (dd, J = 8,8, 2,7 Hz, 1H, 5-H), 5,39 (s, 2H, NH 2 ), 4,61 (t, J = 5,3 Hz, 1H, OH), 3,40 (q, J = 5,9 Hz, 2H, 3’-H), 3,35 - 3,27 (m, 1H, l’-H), 1,78 - 1,60 (m, 2H, 2’-H),
13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6): 5[ppm] = 175,8, 144,6, 142,5, 132,4, 129,9, 129,4, 127,9, 123,8, 122,5, 118,7, 118,6, 117,9, 105,9, 58,7, 52,5, 26,2.
HPLC: tr = 4,2 min (ACN/H20 + 0,05 M TEAB pH- 8; 90/10 -> 50/0 in 12 min; Detektion bei 254 nm)
Fotophysikalische Eigenschaften der Fluoreszenzmarker-Konjugate
Die spektroskopischen Eigenschaften der Fluoreszenzmarker-Konjugate mit einem Glucose- Molekül werden beispielhaft in den beiden folgenden Tabellen aufgezeigt.
Für das Konjugat der Verbindung 1 ergeben sich die folgenden Eigenschaften:
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Tabelle 3 Der Fluoreszenzmarker zeichnet sich durch hohe Quantenausbeuten in unterschiedlichen Lö sungsmitteln aus und zeigt eine Emission bei Wellenlängen, welche sich von den Wellenlängen üblicher Fluoreszenzmarker insbesondere in der Glycananalytik unterscheiden. Somit ist es möglich, dass parallel mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarker gearbeitet wird. Es kön nen somit Probe und Referenz unterschiedlich gelabelt und gleichzeitig in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen detektiert werden. Auf diese Art und Wiese kann ein pre- oder post-run mit einer separaten Molekulargewichtsreferenz entfallen. Es ist außerdem darauf hinzuweisen, dass sich die spektroskopischen Eigenschaften des Fluoreszenzmarkers aufgrund der Konjugat bildung nur unwesentlich ändern. Dies ist ein Indiz für ein stabiles spektroskopisches System. Für das Konjugat der Verbindung 2 ergeben sich die folgenden Eigenschaften:
Figure imgf000032_0002
Tabelle 4 Der Fluoreszenzmarker zeichnet sich durch hohe Quantenausbeuten in unterschiedlichen Lö sungsmitteln aus und zeigt eine Emission bei Wellenlängen, welche sich von den Wellenlängen üblicher Fluoreszenzmarker insbesondere in der Glycananalytik unterscheiden. Somit ist es möglich, dass parallel mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzmarker gearbeitet wird. Es kön nen somit Probe und Referenz unterschiedlich gelabelt und gleichzeitig in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen detektiert werden. Auf diese Art und Wiese kann ein pre- oder post-run mit einer separaten Molekulargewichtsreferenz entfallen. Es ist außerdem darauf hinzuweisen, dass sich die spektroskopischen Eigenschaften des Fluoreszenzmarkers aufgrund der Konjugat bildung nur unwesentlich ändern. Dies ist ein Indiz für ein stabiles spektroskopisches System.

Claims

Patentansprüche
1. Fluoreszenzmarker nach der folgenden Formel I
Figure imgf000034_0001
Formel I,
mit
RI = -H oder C1 - C6 Alkyl;
R2 = -H oder -PO(OH)2
X = -S02- oder -PO(OH)-;
L = -(CH2)n-CHR3-CH2- mit n = 1, 2, 3 und R3 = -H oder -(CH2)-OPO(OH)2; wobei Fluo ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder nicht substituierten C10-C30 Acridonen, Aminoacridinen oder Pyrenen.
2. Fluoreszenzmarker nach Anspruch 1, wobei Fluo ausgesucht ist aus der Gruppe beste hend aus den Fluorophoren nach den Formeln II- IV
Figure imgf000034_0002
Formel IV wobei
R4, RS = jeweils unabhängig voneinander -OPO(OH)2 oder -OH;
RÖ, R7 = jeweils unabhängig voneinander -S02-CH2-CHR2-(CH2)q-R4 oder -PO(OH)- CH2-CHR2- (CH2)q-R mit q = 1, 2, 3;
o, p = jeweils unabhängig voneinander 1, 2, 3;
und die Fluo nach den Formeln II-IV an jeder bindungsfähigen Stelle mit NH und X verbunden sein können.
3. Fluoreszenzmarker nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fluorophore Fluo den Formeln V - VII entsprechen
Figure imgf000035_0001
Formel VII. wobei die Fluorophore durch die geschlängelten Bindungen mit NH und X verbunden sind.
4. Fluoreszenzmarker nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei X = -S02- ist.
5. Fluoreszenzmarker nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im Linker L R3 = -(CH2)-OPO(OH)2 ist.
6. Fluoreszenzmarker nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in dem Fluoro phor nach der Formel III oder VI R4 und Rs jeweils -OPO(OH)2 sind.
7. Fluoreszenzmarker nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in dem Fluoro phor nach der Formel IV und VII R6 und R7 jeweils -PO(OH)-CH2-CHR2-(CH2)-OPO(OH)2 sind.
8. Verwendung eines Fluoreszenzmarkers nach einem der vorhergehenden Ansprüche als Standard in einer Glycan-Analyse.
9. Konjugat aus einem Fluoreszenzmarker und einem Glycan dadurch gekennzeichnet, dass das Glycan an mindestens einen Fluoreszenzmarker nach einem der Ansprüche 1-7 kovalent gebunden ist.
10. Konjugat nach Anspruch 9, wobei das Glycan ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus mono-, oligo-, Polysacchariden, Glycoproteinen, Glycolipiden, Proteoglycanen oder Mi schungen daraus.
11. Kit-of-parts mindestens umfassend ein oder mehrere Behälter mit einem oder mehreren Lösungsmitteln und
ein oder mehrere Behälter jeweils enthaltend Fluoreszenzmarker nach einem der An sprüche 1 - 7 oder Konjugate nach einem der Ansprüche 9 oder 10.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0943918A1 (de) 1995-06-07 1999-09-22 Carnegie-Mellon University Fluoreszierende Markierungskomplexe mit grossem Stokes-Shift die durch Verbindung von Cyanine und anderen resonanzenergieübertragungsfähigen fluorochromen zusammengestellt sind
WO2009078970A1 (en) 2007-12-14 2009-06-25 Biotium, Inc. Fluorescent compounds

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0906318D0 (en) * 2009-04-09 2009-05-20 Glysure Ltd Fluorophore and fluorescent sensor compound containing same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0943918A1 (de) 1995-06-07 1999-09-22 Carnegie-Mellon University Fluoreszierende Markierungskomplexe mit grossem Stokes-Shift die durch Verbindung von Cyanine und anderen resonanzenergieübertragungsfähigen fluorochromen zusammengestellt sind
WO2009078970A1 (en) 2007-12-14 2009-06-25 Biotium, Inc. Fluorescent compounds

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALICIA M. HITCHCOCK ET AL: "Improved workup for glycosaminoglycan disaccharide analysis using CE with LIF detection", ELECTROPHORESIS, vol. 29, no. 22, 1 November 2008 (2008-11-01), pages 4538 - 4548, XP055240561, ISSN: 0173-0835, DOI: 10.1002/elps.200800335 *
GARY B. HARLAND ET AL: "Fingerprinting of glycans as their 2-aminoacridone derivatives by capillary electrophoresis and laserinduced fluorescence", ELECTROPHORESIS, vol. 17, no. 2, 1 January 1996 (1996-01-01), pages 406 - 411, XP055659168, ISSN: 0173-0835, DOI: 10.1002/elps.1150170220 *

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