WO2020066795A1 - 解析方法、分析方法および微生物の識別方法 - Google Patents

解析方法、分析方法および微生物の識別方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020066795A1
WO2020066795A1 PCT/JP2019/036594 JP2019036594W WO2020066795A1 WO 2020066795 A1 WO2020066795 A1 WO 2020066795A1 JP 2019036594 W JP2019036594 W JP 2019036594W WO 2020066795 A1 WO2020066795 A1 WO 2020066795A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peak
mass
type
microorganism
range
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/036594
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
美由紀 諸角
恵 佐久間
是嗣 緒方
圭介 島
慎治 船津
Original Assignee
学校法人慶應義塾
株式会社島津製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人慶應義塾, 株式会社島津製作所 filed Critical 学校法人慶應義塾
Priority to CN201980062766.3A priority Critical patent/CN112752846A/zh
Priority to JP2020548559A priority patent/JP7105454B2/ja
Priority to US17/280,302 priority patent/US20220034900A1/en
Publication of WO2020066795A1 publication Critical patent/WO2020066795A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56938—Staphylococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to an analysis method, an analysis method, and a microorganism identification method.
  • Group A hemolytic streptococci (Group A Streptococcus: GAS) are gram-positive cocci that cause various symptoms in infected individuals. GAS causes not only pharyngitis and tonsillitis, but also invades blood and tissues to cause invasive GAS infection. Invasive GAS infections with shock are termed lethal fulminant hemolytic streptococcal infections (STSS). In the STSS, after initial symptoms such as limb pain and fever, the disease progresses rapidly, causing tissue necrosis, multiple organ failure, etc., and may cause the death of the infected person in a short period of time such as tens of hours. .
  • STSS lethal fulminant hemolytic streptococcal infections
  • GAS is classified into 130 or more serotypes and M types depending on the antigenicity of M protein on the surface of bacterial cells.
  • M type an emm type based on the sequence at the 5 'end of the emm gene encoding the M protein has been used, and 234 types are currently registered.
  • the emm1 type was more frequent, and the emm12 type was detected at a lower frequency than the emm1 type. Identification of GAS types is important for proper treatment and accurate analysis of GAS infections.
  • Non-Patent Document 1 discloses an invasive GAS collected from a patient with gangrenous fasciitis and a non-invasive GAS collected from a patient with pharyngitis using mass spectrometry that does not require PCR or the like. Is described.
  • Non-Patent Document 1 cannot identify the emm type. If the emm type can be identified, diagnosis, analysis, and the like can be performed using information obtained for the emm type.
  • an analysis method includes obtaining data corresponding to a mass spectrum obtained by mass spectrometry of a sample containing a microorganism, and obtaining an m / z value of 10930 in the mass spectrum. Acquiring information on an emm1-type group A hemolytic streptococcus based on the presence or absence or size of a peak in the first range of 10945 or less.
  • an analysis method comprises mass-analyzing a sample containing microorganisms to generate data corresponding to a mass spectrum, and emm1-type group A hemolysis by the analysis method of the first aspect. Acquiring information on streptococci.
  • a method for identifying a microorganism comprises analyzing the microorganism by the analysis method of the second or third aspect, and performing the analysis based on the presence or absence or size of the peak in the first range. Identifying whether the microorganism is a group A hemolytic streptococcus of type emm1.
  • the emm12 is determined based on the presence or absence or the size of a peak in the second range where the value of m / z is 6908 or more and 6918 or less in the mass spectrum.
  • the method comprises obtaining information about a group A streptococcus.
  • an analysis method comprises the steps of mass spectrometric analysis of a sample containing microorganisms to generate data corresponding to a mass spectrum, and the emm12 type A group hemolysis by the analysis method of the fifth aspect. Acquiring information on streptococci.
  • a method for identifying a microorganism comprises analyzing the microorganism by the analysis method of the sixth or seventh aspect, and performing the analysis based on the presence or absence or size of the peak in the second range. Identifying whether the microorganism is an emm12 type group A hemolytic streptococcus.
  • the microorganism is an emm type such as an emm1 type or an emm12 type.
  • FIG. 1 is a flowchart showing the flow of the analysis method according to one embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram showing a range of m / z 2000 to 20000 of a mass spectrum obtained by mass analysis of an emm1 type microorganism.
  • FIG. 3 is a diagram showing a range of m / z 5500-7500 of a mass spectrum obtained by mass analysis of emm1 type microorganisms.
  • FIG. 4 is a diagram showing a range of m / z 10000-12000 of a mass spectrum obtained by mass spectrometry of an emm1 type microorganism.
  • FIG. 1 is a flowchart showing the flow of the analysis method according to one embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram showing a range of m / z 2000 to 20000 of a mass spectrum obtained by mass analysis of an emm1 type microorganism.
  • FIG. 3 is a diagram showing a range of m / z 5500-7500 of a
  • Embodiment- The analysis method of the present embodiment obtains information on the emm type based on the presence or absence of a peak in a predetermined m / z range in a mass spectrum obtained by mass analysis of a sample containing a microorganism. .
  • a blood sample of the patient as the subject is collected as a sample, or a pharyngeal swab obtained by wiping the pharynx of the subject with a cotton swab or the like is used as a sample. Preferably, it is collected.
  • GAS can be present in healthy humans, subjects are not particularly limited to patients infected with GAS.
  • Separate culture is performed on the sample containing the collected microorganism.
  • a sample is smeared on a blood agar medium containing 5% or the like of sheep defibrillated blood and cultured at 37 ° C. under 5% carbon dioxide gas.
  • colonies suspected of GAS are identified from the hemolytic rings of the colonies that have grown on the medium. For example, the majority of GAS exhibit ⁇ -hemolysis in 24 hours of culture.
  • Serogrouping of colonies may be performed using a grouping kit or the like as appropriate.
  • a sample for mass spectrometry is prepared from the GAS colony.
  • a sample for mass spectrometry may be prepared using a colony obtained by further culturing using a liquid medium. The values of the composition of the medium, the culture temperature, the culture time, and the like can be adjusted as appropriate.
  • the method for preparing the sample for mass spectrometry is not particularly limited.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • colonies obtained by culturing are collected, and a solution containing a matrix (hereinafter, referred to as a matrix solution) is added to the obtained sample. And drop it on the sample plate for MALDI to dry. After placing the sample on the MALDI sample plate, the matrix solution may be added.
  • the type of matrix is not particularly limited, but sinapinic acid or CHCA ( ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid) is preferable for performing accurate mass spectrometry.
  • sinapinic acid is used for high-mass molecules such as tens of kDa or more. More preferable for good detection.
  • a solvent for the matrix solution an aqueous solution containing an organic solvent such as acetonitrile of several tens volume% to which trifluoroacetic acid (TFA) is added in an amount of 0 to 3 volume% can be used.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • MALDI-TOFMS Time-of-flight mass spectrometry using MALDI
  • the m / z value has a peak (hereinafter, referred to as a first peak) in a range of 10930 or more, preferably 10934 or more, and 10945 or less, preferably 10940 or less (hereinafter, referred to as a first range). It is determined whether or not the microorganisms contained in the sample are emm1 type microorganisms based on whether or not there is an Emm1 type microorganism. It is preferable that the first range is narrow because the possibility of erroneously detecting an undesired peak such as a peak of an impurity is reduced.
  • the peak which is originally the first peak may be detected outside the first range, so the first range should be set so as not to be too narrow. Is preferred.
  • the microorganism contained in the sample can be identified as emm1-type GAS. If the first peak is not detected, the microorganism contained in the sample can be identified as not an emm1-type GAS.
  • the analysis method of the present embodiment can identify the emm1 type from the GAS of the emm1, type emm12, emm28, and emm89 types based on whether or not the first peak exists.
  • the microorganism contained in the sample can be identified as an emm12-type GAS. If the second peak is not detected, the microorganisms contained in the sample can be identified as not being emm12-type GAS.
  • the analysis method of the present embodiment can distinguish the emm12 type from the GAS of the emm1, emm12, emm28, and emm89 types based on whether or not the second peak exists.
  • the microorganism contained in the sample may be identified as not an emm12-type GAS. In other words, whether the type is the emm12 type may be identified based on the size of the peak in the second range.
  • both the first peak and the second peak are detected in the measured mass spectrum, it is determined that it is difficult to identify the emm type from the obtained mass spectrum, and that the identification is not performed. it can.
  • the first peak is detected in the measured mass spectrum, the microorganism contained in the sample is not identified as emm1 type GAS by the detection alone, but the emm1 is detected by detecting the first peak. It is assumed that the type of GAS is likely to be GAS, and the emm type may be identified in combination with another test or the like. The same applies to the identification of the emm12 type by the second peak.
  • the mass spectrum analysis method may be performed by an information processing device such as a personal computer or an analysis device (data analysis device) such as a processing device integrated with a mass spectrometer. May be performed by a human.
  • an analyzer When an analyzer is used, data indicating the detected intensity of ions is input from the detector of the mass spectrometer to the analyzer, data corresponding to the mass spectrum is generated, and the presence or absence of the first peak and the second peak in this mass spectrum Is determined.
  • data corresponding to the mass spectrum is input to the analyzer, and the presence or absence of the first peak and the second peak in this mass spectrum is determined.
  • Information on whether the microorganism is an emm1-type GAS or an emm12-type GAS obtained based on this determination is output, for example, displayed on a display device such as a liquid crystal monitor.
  • step S1009 it is determined whether the microorganism is an emm1-type GAS, an emm12-type GAS, or a GAS other than these two types based on the presence or absence of a peak in the first range and the second range of the mass spectrum.
  • step S1011 starts.
  • step S1011 information on the GAS obtained in step S1009 is output to a display device or the like.
  • step S1011 ends, the process ends.
  • the analysis method according to the present embodiment obtains data corresponding to a mass spectrum obtained by performing mass spectrometry on a sample containing a microorganism, and the m / z value in the mass spectrum is 10930 or more and 10945. Acquiring information on an emm1-type GAS based on the presence or absence or size of a peak in the following first range. Thereby, it is not necessary to perform PCR or the like, and it is possible to obtain information about the emm1 type using data obtained by mass spectrometry.
  • the analysis method of the present embodiment includes mass analysis of a sample containing microorganisms to generate data corresponding to a mass spectrum, and acquisition of information about an emm1 type GAS by the analysis method. As a result, information on the emm1 type can be quickly obtained by mass spectrometry.
  • the analysis method according to the present embodiment acquires information on an emm12-type GAS based on the presence or absence or size of a peak in the second range where the value of m / z is 6908 or more and 6918 or less in the mass spectrum. It is prepared. Thus, it is not necessary to perform PCR or the like, and it is possible to obtain information about the emm12 type using data obtained by mass spectrometry.
  • Emm12, Emm28 and Emm89 GAS were used as samples, and mass spectra were obtained by MALDI-TOFMS using an AXIMA microorganism identification system (Shimadzu Corporation). Sinapic acid was used as the matrix, and time-of-flight mass spectrometry was performed in a linear mode.
  • FIGS. 2, 3 and 4 show mass spectra of samples prepared from emm1 type (emm1.0) microorganisms in the range of m / z 2000-20000, m / z 5500-7500 and m / z 10000. It is a figure which shows the range of -12000, respectively.
  • the number assigned to the peak is m / z of the peak, and the ID for identifying the peak is described in parentheses. The same applies to the following figures.
  • FIGS. 5, 6 and 7 show mass spectra of samples prepared from emm12-type (emm12.0) microorganisms in the range of m / z 2000-20000, m / z 5500-7500 and m / zm10000. It is a figure which shows the range of -12000, respectively.
  • FIGS. 8, 9 and 10 show the mass spectra of samples prepared from emm28 type (emm28.0) microorganisms in the range m / z 2000-20000, m / z 5500-7500 and m / z 10000. It is a figure which shows the range of -12000, respectively.
  • FIGS. 11, 12 and 13 show mass spectra of samples prepared from microorganisms of the emm89 type (emm89.0) in the range m / z 2000-20000, m / z 5500-7500 and m / z 10000. It is a figure which shows the range of -12000, respectively.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

解析方法は、微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルに対応するデータを取得することと、このマススペクトルにおける、ｍ／ｚの値が１０９３０以上１０９４５以下の第１範囲のピークの有無または大きさに基づいて、ｅｍｍ１型のＡ群溶血性レンサ球菌に関する情報を取得することとを備える。

Description

解析方法、分析方法および微生物の識別方法
　本発明は、解析方法、分析方法および微生物の識別方法に関する。
　Ａ群溶血性レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ　Ａ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ：ＧＡＳ）は、グラム陽性球菌であり、感染者に様々な症状を引き起こす。ＧＡＳは、咽頭炎や扁桃炎等の原因となる他、血液や組織中に侵入し侵襲性ＧＡＳ感染症を引き起こす。侵襲性ＧＡＳ感染症においてショックを伴うものは致死性の劇症型溶血性レンサ球菌感染症（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｔｏｘｉｃ　ｓｈｏｃｋ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＳＴＳＳ）と呼ばれる。ＳＴＳＳでは、四肢の疼痛、発熱等の初期症状の後、急激に病状が進行し、組織の壊死、多臓器不全等を引き起こし、数十時間等の短期間で感染者を死に至らしめることもある。
　ＧＡＳは、菌体の表層にあるＭタンパクの抗原性の違いにより、１３０種類以上の血清型、Ｍ型に分類されている。最近ではＭ型に代わり、Ｍタンパクをコードするｅｍｍ遺伝子の５’末端側のシークエンスをもとにしたｅｍｍ型別が用いられており、現在、２３４種類が登録されている。ＳＴＳＳを引き起こした症例では、ｅｍｍ１型が多く、ｅｍｍ１２型もｅｍｍ１型より頻度は低いものの検出されている。ＧＡＳの型の識別は、ＧＡＳ感染症の適切な治療や正確な分析を行うために重要である。
　ＧＡＳのｅｍｍ遺伝子のＤＮＡ配列をシーケンシングすることによりｅｍｍ型型別が行われているが、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅等により時間がかかってしまう問題があった。非特許文献１には、ＰＣＲ等を必要としない質量分析を用いて、壊疽性筋膜炎の患者から採取された侵襲性のＧＡＳと、咽頭炎等の患者から採取された非侵襲性のＧＡＳとを識別する点が記載されている。
Moura H, Woolfitt AR, Carvalho MG, Pavlopoulos A, Teixeira LM, Satten GA, Barr JR. "MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for differentiation of invasive and noninvasive Streptococcus pyogenes isolates" FEMS Immunology & Medical Microbiology,(米国), Blackwell Publishing, 2008年8月1日、Volume 53, Issue 3, pp.333-342
　非特許文献１の方法は、ｅｍｍ型の識別を行うことができない。ｅｍｍ型を識別することができれば、ｅｍｍ型について得られている情報を用いた診断や分析等を行うことができる。
　本発明の第１の態様によると、解析方法は、微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルに対応するデータを取得することと、前記マススペクトルにおける、ｍ／ｚの値が１０９３０以上１０９４５以下の第１範囲のピークの有無または大きさに基づいて、ｅｍｍ１型のＡ群溶血性レンサ球菌に関する情報を取得することとを備える。
　本発明の第２の態様によると、分析方法は、微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルに対応するデータを生成することと、第１の態様の解析方法によりｅｍｍ１型のＡ群溶血性レンサ球菌に関する情報を取得することとを備える。
　本発明の第３の態様によると、第２の態様の分析方法において、前記質量分析では、シナピン酸またはＣＨＣＡをマトリックスとして、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法により前記試料をイオン化することが好ましい。
　本発明の第４の態様によると、微生物の識別方法は、第２または第３の態様の分析方法により微生物を分析することと、前記第１範囲のピークの有無または大きさに基づいて、前記微生物がｅｍｍ１型のＡ群溶血性レンサ球菌であるか否かを識別することとを備える。
　本発明の第５の態様によると、第１の態様の解析方法において、前記マススペクトルにおける、ｍ／ｚの値が６９０８以上６９１８以下の第２範囲のピークの有無または大きさに基づいて、ｅｍｍ１２型のＡ群レンサ球菌に関する情報を取得することを備えることが好ましい。
　本発明の第６の態様によると、分析方法は、微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルに対応するデータを生成することと、第５の態様の解析方法によりｅｍｍ１２型のＡ群溶血性レンサ球菌に関する情報を取得することとを備える。
　本発明の第７の態様によると、第６の態様の分析方法において、前記質量分析では、シナピン酸またはＣＨＣＡをマトリックスとして、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法により前記試料をイオン化することが好ましい。
　本発明の第８の態様によると、微生物の識別方法は、第６または第７の態様の分析方法により微生物を分析することと、前記第２範囲のピークの有無または大きさに基づいて、前記微生物がｅｍｍ１２型のＡ群溶血性レンサ球菌であるか否かを識別することとを備える。
　本発明によれば、質量分析により、微生物が、ｅｍｍ１型やｅｍｍ１２型等のｅｍｍ型のいずれの型であるかを識別する。
図１は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。 図２は、ｅｍｍ１型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　２０００－２００００の範囲を示す図である。 図３は、ｅｍｍ１型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　５５００－７５００の範囲を示す図である。 図４は、ｅｍｍ１型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　１００００－１２０００の範囲を示す図である。 図５は、ｅｍｍ１２型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　２０００－２００００の範囲を示す図である。 図６は、ｅｍｍ１２型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　５５００－７５００の範囲を示す図である。 図７は、ｅｍｍ１２型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　１００００－１２０００の範囲を示す図である。 図８は、ｅｍｍ２８型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　２０００－２００００の範囲を示す図である。 図９は、ｅｍｍ２８型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　５５００－７５００の範囲を示す図である。 図１０は、ｅｍｍ２８型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　１００００－１２０００の範囲を示す図である。 図１１は、ｅｍｍ８９型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　２０００－２００００の範囲を示す図である。 図１２は、ｅｍｍ８９型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　５５００－７５００の範囲を示す図である。 図１３は、ｅｍｍ８９型の微生物を質量分析して得られたマススペクトルのｍ／ｚ　１００００－１２０００の範囲を示す図である。
　以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。
－第１実施形態－
　本実施形態の分析方法は、微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルにおける所定のｍ／ｚの範囲にあるピークの有無等に基づいて、ｅｍｍ型に関する情報を取得するものである。
（試料について）
　試料は、Ａ群溶血性レンサ球菌（ＧＡＳ）であるか、ＧＡＳの可能性がある微生物を含むものであれば特に限定されない。試料は、人間等の動物から採取されることが好ましい。試料を人間から採取する場合、咽頭や扁桃に付着した液体、皮膚の創傷からの浸出液、血液、髄液、尿等のＧＡＳを含み得る任意の体液を試料として用いることができる。例えば、患者に感染したＧＡＳを識別する検査を行う場合、被検者である患者の血液を試料として採取したり、被検者の咽頭を綿棒等により拭って得られた咽頭拭い液を試料として採取することが好ましい。健康な人間にもＧＡＳが存在し得るため、被検者はＧＡＳに感染した患者に特に限定されない。
　採取された微生物を含む試料には、分離培養を実施する。分離培養は、ヒツジの脱繊維血液を５％等含む血液寒天培地上に試料を塗抹し、３７℃の温度で５％炭酸ガス条件下にて培養する。２４時間経過した後、培地上に発育したコロニーの溶血環等から、ＧＡＳを疑うコロニーを識別する。例えば、ＧＡＳの大多数は２４時間の培養でβ溶血を呈する。適宜群別用キット等を用いてコロニーの血清群別を行ってもよい。ＧＡＳのコロニーから質量分析用試料が調製される。液体培地を用いてさらに培養して得られたコロニーを用いて質量分析用試料を調製してもよい。
　なお、培地の組成、培養温度、培養時間等の各数値は適宜調整することができる。
　質量分析用試料の調製方法は特に限定されない。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（以下、ＭＡＬＤＩと呼ぶ）を用いる質量分析を行う場合、培養により得られたコロニーを回収し、得られた試料にマトリックスを含む溶液（以下、マトリックス溶液と呼ぶ）を加えてＭＡＬＤＩ用試料プレートに滴下して乾燥させる。試料をＭＡＬＤＩ用試料プレートに配置した後、マトリックス溶液を加えてもよい。マトリックスの種類は特に限定されないが、シナピン酸またはＣＨＣＡ（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）が精度よく質量分析を行う上で好ましく、特にシナピン酸が十数ｋＤａ以上等の高質量の分子を精度よく検出する上でより好ましい。マトリックス溶液の溶媒は、アセトニトリル等の有機溶媒を数十体積％含む水溶液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が０～３体積％添加されたもの等を用いることができる。
　なお、得られたコロニーに含まれる微生物からタンパク質を抽出した後、抽出物にマトリックス溶液を加えて質量分析用試料を調製してもよい。
（質量分析について）
　質量分析におけるイオン化の方法は、ＭＡＬＤＩを用いることが１価のイオンが生成しやすく解析が容易であるため好ましい。また、飛行時間型質量分析が、数ｋＤａ以上等の高質量の分子を精度よく検出する上で好ましい。ＭＡＬＤＩを用いた飛行時間型質量分析（以下、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳと呼ぶ）が、ＭＡＬＤＩと飛行時間型質量分析の利点を併せ持つため特に好ましい。しかし、質量分析の方法は、ｅｍｍ１型またはｅｍｍ１２型のＧＡＳを検出するためのｍ／ｚの範囲に夾雑物等によるピークが現れなければ、特に限定されない。例えば、エレクトロスプレー法等の任意のイオン化の方法を用いることができる。また、四重極マスフィルタやイオントラップ等の質量分析器を用いることができ、シングル質量分析計を用いる他、任意の複数の質量分析器を組み合わせて用い、多段階の質量分析を行ってもよい。質量分析では、イオン化された試料（試料イオン）の検出により得られたマススペクトル（以下、測定されたマススぺクトルと呼ぶ）に対応するデータが生成される。
（マススペクトルの解析について）
　測定されたマススペクトルにおいて、ｍ／ｚの値が１０９３０以上、好ましくは１０９３４以上、かつ、１０９４５以下、好ましくは１０９４０以下の範囲（以下、第１範囲と呼ぶ）にピーク（以下、第１ピークと呼ぶ）が有るか否かに基づいて、試料に含まれる微生物がｅｍｍ１型の微生物か否かが識別される。第１範囲が狭い方が夾雑物のピーク等、不所望のピークを誤って検出する可能性が低下するために好ましい。しかし、用いる質量分析計の精度が低い場合には、本来第１ピークとなるピークが第１範囲から外れて検出されてしまう場合もあるため、第１範囲は狭すぎないように設定されることが好ましい。第１ピークが検出されたら、試料に含まれる微生物はｅｍｍ１型のＧＡＳと同定することができる。第１ピークが検出されなかったら、試料に含まれる微生物はｅｍｍ１型のＧＡＳではないものと同定することができる。本実施形態の分析方法は、第１ピークが有るか否かに基づいて、特にｅｍｍ１型、ｅｍｍ１２型、ｅｍｍ２８型およびｅｍｍ８９型のＧＡＳからｅｍｍ１型を識別することができる。
　なお、第１範囲にピークが検出されたとしても、十分大きなピークが検出されなかった場合には、試料に含まれる微生物はｅｍｍ１型のＧＡＳではないものと同定してもよい。言い換えれば、第１範囲におけるピークの大きさに基づいてｅｍｍ１型か否かの識別を行ってもよい。
　測定されたマススペクトルにおいて、ｍ／ｚの値が６９０８以上、好ましくは６９１０以上、かつ、６９１８以下、好ましくは６９１４以下の範囲（以下、第２範囲と呼ぶ）にピークが有るか否かに基づいて、試料に含まれる微生物がｅｍｍ１２型のＧＡＳか否かが識別される。第２範囲が狭い方が夾雑物のピーク等、不所望のピークを誤って検出する可能性が低下するために好ましい。しかし、用いる質量分析計の精度が低い場合には、目的のピークが第２範囲から外れて検出されてしまう場合もあるため、第２範囲は狭すぎないように設定されることが好ましい。第２ピークが検出されたら、試料に含まれる微生物はｅｍｍ１２型のＧＡＳと同定することができる。第２ピークが検出されなかったら、試料に含まれる微生物はｅｍｍ１２型のＧＡＳではないものと同定することができる。本実施形態の分析方法は、第２ピークが有るか否かに基づいて、特にｅｍｍ１型、ｅｍｍ１２型、ｅｍｍ２８型およびｅｍｍ８９型のＧＡＳからｅｍｍ１２型を識別することができる。
　なお、第２範囲にピークが検出されたとしても、十分大きなピークが検出されなかった場合には、試料に含まれる微生物はｅｍｍ１２型のＧＡＳではないものと同定してもよい。言い換えれば、第２範囲におけるピークの大きさに基づいてｅｍｍ１２型か否かの識別を行ってもよい。
　測定されたマススペクトルにおいて、第１ピークおよび第２ピークの両方が検出されなかった場合には、試料に含まれる微生物はｅｍｍ１型のＧＡＳでもｅｍｍ１２型のＧＡＳでもないものとすることができる。
　測定されたマススペクトルにおいて、第１ピークと第２ピークとが両方検出された場合には、得られたマススペクトルからはｅｍｍ型別の識別が難しいものとして当該識別を行わないものとすることができる。
　なお、測定されたマススペクトルにおいて、第１ピークが検出された場合に、当該検出のみで試料に含まれる微生物がｅｍｍ１型のＧＡＳと同定するのではなく、第１ピークが検出されたことでｅｍｍ１型のＧＡＳである可能性が高くなったものとし、さらに他の検査等と組み合わせてｅｍｍ型を同定してもよい。第２ピークによるｅｍｍ１２型の識別についても同様である。
　マススペクトルの解析方法（データ解析方法）は、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置や質量分析計と一体的に構成された処理装置等の解析装置（データ解析装置）により行ってもよいし、分析者等の人間が行ってもよい。解析装置を用いる場合、質量分析計の検出器からイオンの検出強度を示すデータが解析装置に入力され、マススペクトルに対応するデータが生成され、このマススペクトルにおける第１ピークおよび第２ピークの有無が判定される。あるいは、マススぺクトルに対応するデータが解析装置に入力されて、このマススペクトルにおける第１ピークおよび第２ピークの有無が判定される。この判定に基づいて取得された、微生物がｅｍｍ１型のＧＡＳかｅｍｍ１２型のＧＡＳかについての情報は、液晶モニタ等の表示装置に表示される等して出力される。
　臨床検査として患者から採取された微生物の識別を行う場合、試料に含まれる微生物がｅｍｍ１型のＧＡＳかｅｍｍ１２型のＧＡＳかについての情報は、医師や医療従事者等に提示される。医師は当該情報を基に患者の診断や治療を行い、医療従事者は当該情報を共有することにより患者の病状を把握する。
　図１は、本実施形態の分析方法を含む微生物の識別方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、微生物を含む試料が用意される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。ステップＳ１００３において、試料が質量分析され、マススペクトルに対応するデータが生成される。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。
　ステップＳ１００５において、マススペクトルの第１範囲におけるピークの有無が判定される。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。ステップＳ１００７において、マススペクトルの第２範囲におけるピークの有無が判定される。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。
　ステップＳ１００９において、マススペクトルの第１範囲および第２範囲におけるピークの有無に基づいて、微生物がｅｍｍ１型のＧＡＳか、ｅｍｍ１２型のＧＡＳか、これら２つの型以外のＧＡＳかが識別される。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。ステップＳ１０１１において、ステップＳ１００９において得られたＧＡＳに関する情報が表示装置等に出力される。ステップＳ１０１１が終了したら、処理が終了される。
　上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態に係る解析方法は、微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルに対応するデータを取得することと、当該マススペクトルにおける、ｍ／ｚの値が１０９３０以上１０９４５以下の第１範囲のピークの有無または大きさに基づいて、ｅｍｍ１型のＧＡＳに関する情報を取得することとを備える。これにより、ＰＣＲ等を行う必要がなく、質量分析により得られたデータを用いてｅｍｍ１型についての情報を得ることができる。
（２）本実施形態の分析方法では、微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルに対応するデータを生成することと、上記解析方法によりｅｍｍ１型のＧＡＳに関する情報を取得することとを備える。これにより、質量分析により迅速にｅｍｍ１型についての情報を得ることができる。
（３）本実施形態の分析方法において、質量分析では、シナピン酸またはＣＨＣＡをマトリックスとして、ＭＡＬＤＩにより試料をイオン化する。これにより、１価イオンが生成しやすく、解析しやすいマススペクトルを得ることができる。
（４）本実施形態に係る微生物の識別方法は、上記分析方法により微生物を分析することと、第１範囲のピークの有無または大きさに基づいて、微生物がｅｍｍ１型のＧＡＳであるか否かを識別することとを備える。これにより、ＰＣＲ等を行う必要がなく、質量分析により微生物がｅｍｍ１型のＧＡＳか否かの識別をすることができる。
（５）本実施形態に係る解析方法は、マススペクトルにおける、ｍ／ｚの値が６９０８以上６９１８以下の第２範囲のピークの有無または大きさに基づいて、ｅｍｍ１２型のＧＡＳに関する情報を取得することを備える。これにより、ＰＣＲ等を行う必要がなく、質量分析により得られたデータを用いてｅｍｍ１２型についての情報を得ることができる。
（６）本実施形態の分析方法は、微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルに対応するデータを生成することと、上記解析方法によりｅｍｍ１２型のＧＡＳに関する情報を取得することとを備える。これにより、質量分析により迅速にｅｍｍ１２型についての情報を得ることができる。
（７）本実施形態に係る微生物の識別方法は、上記分析方法により微生物を分析することと、第２範囲のピークの有無または大きさに基づいて、微生物がｅｍｍ１２型のＧＡＳであるか否かを識別することとを備える。これにより、ＰＣＲ等を行う必要がなく、質量分析により微生物がｅｍｍ１２型のＧＡＳか否かの識別をすることができる。
　本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
　以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例における具体的な装置等に限定されるものではない。
　ｅｍｍ１型、ｅｍｍ１２型、ｅｍｍ２８型およびｅｍｍ８９型のＧＡＳのそれぞれを試料とし、ＡＸＩＭＡ微生物同定システム（島津製作所）を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによりマススペクトルを取得した。マトリックスはシナピン酸を用い、飛行時間型質量分析はリニアモードで行った。
　図２、図３および図４は、ｅｍｍ１型（ｅｍｍ１．０）の微生物から調製した試料のマススペクトルにおいて、ｍ／ｚ　２０００－２００００の範囲、ｍ／ｚ　５５００－７５００の範囲およびｍ／ｚ　１００００－１２０００の範囲をそれぞれ示す図である。ピークに対応して付された数字は当該ピークのｍ／ｚであり、ピークを識別するＩＤがかっこ内に記載されている。以下の図でも同様である。
　図５、図６および図７は、ｅｍｍ１２型（ｅｍｍ１２．０）の微生物から調製した試料のマススペクトルにおいて、ｍ／ｚ　２０００－２００００の範囲、ｍ／ｚ　５５００－７５００の範囲およびｍ／ｚ　１００００－１２０００の範囲をそれぞれ示す図である。
　図８、図９および図１０は、ｅｍｍ２８型（ｅｍｍ２８．０）の微生物から調製した試料のマススペクトルにおいて、ｍ／ｚ　２０００－２００００の範囲、ｍ／ｚ　５５００－７５００の範囲およびｍ／ｚ　１００００－１２０００の範囲をそれぞれ示す図である。
　図１１、図１２および図１３は、ｅｍｍ８９型（ｅｍｍ８９．０）の微生物から調製した試料のマススペクトルにおいて、ｍ／ｚ　２０００－２００００の範囲、ｍ／ｚ　５５００－７５００の範囲およびｍ／ｚ　１００００－１２０００の範囲をそれぞれ示す図である。
　図２～図１３に示されたように、ｅｍｍ１型のＧＡＳから調製した試料のマススペクトルでは上述の第１範囲に特異的なピークが観察され、ｅｍｍ１２型のＧＡＳから調製した試料のマススペクトルでは上述の第２範囲に特異的なピークが観察された。
　次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
　日本国特許出願２０１８年第１８５６３０号（２０１８年９月２８日出願）

Claims (8)

  1. 　微生物を含む試料を質量分析して得られたマススペクトルに対応するデータを取得することと、
    　前記マススペクトルにおける、ｍ／ｚの値が１０９３０以上１０９４５以下の第１範囲のピークの有無または大きさに基づいて、ｅｍｍ１型のＡ群溶血性レンサ球菌に関する情報を取得することとを備える解析方法。
  2. 　微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルに対応するデータを生成することと、
    　請求項１に記載の解析方法によりｅｍｍ１型のＡ群溶血性レンサ球菌に関する情報を取得することとを備える分析方法。
  3. 　請求項２に記載の分析方法において、
    　前記質量分析では、シナピン酸またはＣＨＣＡをマトリックスとして、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法により前記試料をイオン化する分析方法。
  4. 　請求項２または３に記載の分析方法により微生物を分析することと、
    　前記第１範囲のピークの有無または大きさに基づいて、前記微生物がｅｍｍ１型のＡ群溶血性レンサ球菌であるか否かを識別することとを備える微生物の識別方法。
  5. 　請求項１に記載の解析方法において、
    　前記マススペクトルにおける、ｍ／ｚの値が６９０８以上６９１８以下の第２範囲のピークの有無または大きさに基づいて、ｅｍｍ１２型のＡ群溶血性レンサ球菌に関する情報を取得することを備える解析方法。
  6. 　微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルに対応するデータを生成することと、
    　請求項５に記載の解析方法によりｅｍｍ１２型のＡ群溶血性レンサ球菌に関する情報を取得することとを備える分析方法。　
  7. 　請求項６に記載の分析方法において、
    　前記質量分析では、シナピン酸またはＣＨＣＡをマトリックスとして、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法により前記試料をイオン化する分析方法。
  8. 　請求項６または７に記載の分析方法により微生物を分析することと、
    　前記第２範囲のピークの有無または大きさに基づいて、前記微生物がｅｍｍ１２型のＡ群溶血性レンサ球菌であるか否かを識別することとを備える微生物の識別方法。
PCT/JP2019/036594 2018-09-28 2019-09-18 解析方法、分析方法および微生物の識別方法 WO2020066795A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980062766.3A CN112752846A (zh) 2018-09-28 2019-09-18 解析方法、分析方法以及微生物的识别方法
JP2020548559A JP7105454B2 (ja) 2018-09-28 2019-09-18 解析方法、分析方法および微生物の識別方法
US17/280,302 US20220034900A1 (en) 2018-09-28 2019-09-18 Analysis method, analytical method and microorganism identification method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-185630 2018-09-28
JP2018185630 2018-09-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020066795A1 true WO2020066795A1 (ja) 2020-04-02

Family

ID=69950582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/036594 WO2020066795A1 (ja) 2018-09-28 2019-09-18 解析方法、分析方法および微生物の識別方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220034900A1 (ja)
JP (1) JP7105454B2 (ja)
CN (1) CN112752846A (ja)
WO (1) WO2020066795A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007525978A (ja) * 2004-02-18 2007-09-13 アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 細菌の同定で用いられる組成物

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102317789B (zh) * 2008-10-31 2014-08-27 生物梅里埃公司 利用质谱法分离、表征和/或鉴定微生物的方法
EP2364447B1 (en) * 2008-10-31 2019-06-12 Biomerieux, Inc Method for the identification of microorganisms
JP2015121500A (ja) * 2013-12-25 2015-07-02 株式会社島津製作所 質量分析方法及び質量分析装置

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007525978A (ja) * 2004-02-18 2007-09-13 アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 細菌の同定で用いられる組成物

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Identification of emm1 strains of group A hemolytic streptococcus using MALDI-TOF MS and statistical analysis software eMSTAT Solution (TM", MALDI-TOF MS EMSTAT SOLUTION(TM) A EMM1 APPLICATION NEWS, January 2019 (2019-01-01) *
METZGAR, D. ET AL.: "Inference of Antibiotic Resistance and Virulence among Di verse Group A Streptococcus Strains Using emm Sequencing and Multilocus Genotyping Methods", PLOS ONE, vol. 4, no. 9, 2009, pages e6897, XP055700965 *
MOURA, H. ET AL.: "MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for differentiation of invasive and non invasive Streptococcus pyogenes isolates", FEMS IMMUNOLOGY AND MEDICAL MICROBIOLOGY, vol. 53, 2008, pages 333 - 342, XP055700954 *
SAKUMA, MEGUMI ET AL.: "Examination of emm1 type strain discriminability of group A hemolytic streptococcus using MALDI-TOF MS", PROGRAMS AND ABSTRACTS OF JOINT SOCIETY OF 67TH ANNUAL MEETING OF EASTERN JAPAN BRANCH OF THE JAPANESE ASSOCIATION FOR INFECTIOUS DISEASES AND THE 65TH ANNUAL MEETING OF EAST JAPAN BRANCH MEETING OF THE JAPANESE SOCIETY OF CHEMOTHERAPY, October 2018 (2018-10-01), pages 163 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2020066795A1 (ja) 2021-09-24
US20220034900A1 (en) 2022-02-03
JP7105454B2 (ja) 2022-07-25
CN112752846A (zh) 2021-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Strittmatter et al. Analysis of intact bacteria using rapid evaporative ionisation mass spectrometry
EP3264989B1 (en) Spectrometric analysis
Jarmusch et al. Detection of strep throat causing bacterium directly from medical swabs by touch spray-mass spectrometry
US11473122B2 (en) Mass spectrometric diagnosis of septicemia
Zhu et al. Detecting bacterial lung infections: in vivo evaluation of in vitro volatile fingerprints
Hamid et al. Rapid discrimination of bacteria by paper spray mass spectrometry
Sandrin et al. Characterization of microbial mixtures by mass spectrometry
JP5808398B2 (ja) 微生物の薬物耐性を判定するシステムおよび方法
Zhu et al. Secondary electrospray ionization-mass spectrometry (SESI-MS) breathprinting of multiple bacterial lung pathogens, a mouse model study
US9273339B2 (en) Methods for identifying bacteria
Juiz et al. A comparative study of two different methods of sample preparation for positive blood cultures for the rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS
US20100291617A1 (en) Rapid detection of volatile organic compounds for identification of mycobacterium tuberculosis in a sample
Cheng et al. Multicentre study evaluating matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry for identification of clinically isolated Elizabethkingia species and analysis of antimicrobial susceptibility
WO2013148162A1 (en) Novel methods of microorganism detection and identification
Liu et al. Detection of gastritis-associated pathogens by culturing of gastric juice and mucosa
JP2011506971A (ja) 創傷試料を解析する方法
Antezack et al. Rapid diagnosis of periodontitis, a feasibility study using MALDI-TOF mass spectrometry
Majchrzak et al. Sample preparation and recent trends in volatolomics for diagnosing gastrointestinal diseases
Ratiu et al. GC-MS application in determination of volatile profiles emitted by infected and uninfected human tissue
JP2015021960A (ja) インサイチュマルディトフ質量分析器を用いた胞子を形成するバチルス菌の同定方法および分析システム
Vautz et al. Exemplar application of multi-capillary column ion mobility spectrometry for biological and medical purpose
Graham Bacterial volatiles and diagnosis of respiratory infections
JP7105454B2 (ja) 解析方法、分析方法および微生物の識別方法
Lombardo et al. A rapid differential display analysis of nasal swab fingerprints to distinguish allergic from non‐allergic rhinitis subjects by mesoporous silica particles and MALDI‐TOF mass spectrometry
Chen et al. Human exhaled air diagnostic markers for respiratory tract infections in subjects receiving mechanical ventilation

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19867636

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020548559

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19867636

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1