JP2007525978A - 細菌の同定で用いられる組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般に、細菌の遺伝子的同定の分野に関し、核酸組成物、および分子量分析と組み合わせた場合にこの目的に有用なキットを提供する。
本出願は、参照により本明細書にその各々のその全体を組み入れる、2004年2月18日に出願された米国特許仮出願第60/545,425号、2004年4月5日に出願された米国特許仮出願第60/559,754号、2004年12月3日に出願された米国特許仮出願第60/632,862号、2004年12月22日に出願された米国特許仮出願第60/639,068号、および2005年1月28日に出願された米国特許仮出願第60/648,188号に対する優先権の恩典を主張する。
本発明は、DARPA/SPO契約BAA00-09下で米国政府の援助の下でなされた。米国政府は本発明においてある種の権利を有することができる。
天然感染の発生またはバイオテロ攻撃の原因を突き止める際における問題は、ヒト病気を引き起こしかねない絶対的に種々の生物である。ヒトに対して感染性の1400を超える生物があり;これらの多くは、天然疫病において突然出現し、またはバイオテロリストによる悪意のある攻撃で用いられる能力を有する(Taylor et al. Philos.Trans.R.Soc.London B.Biol.Sci.,2001,356,983-989(非特許文献1))。この数は、植物または動物に感染する、多数の株変種、生物工学により作成されたバージョン、または病原体を含まない。
本発明は、プライマー、およびプライマーの対を含む組成物、および細菌の同定で用いるそれを含有するキットを提供する。プライマーは、例えば、16Sおよび23S rRNA、DNA依存性RNAポリメラーゼサブユニット(rpoBおよびrpoC)、バリル-tRNAシンテターゼ(valS)、延長因子EF-Tu(TufB)、リボソームタンパク質L2(rplB)、タンパク質鎖開始因子(infB)、および胞子タンパク質(sspE)のような生命に必須の遺伝子をコードするDNAのアンプリコンを同定する細菌生物剤を生じるように設計される。本発明は、さらに、ドリルダウンプライマー、プライマーの対を含む組成物、およびそれを含有するキットを提供し、それらは、細菌の亜種特徴付けを提供するように設計される。
本発明は、限定されるものではないが、16Sおよび23S rRNA、RNAポリメラーゼサブユニット、t-RNAシンテターゼ、延長因子、リボソームタンパク質、タンパク質鎖開始因子、細胞分裂タンパク質、シャペロニンgroEL、シャペロニンdnaK、ホスホグリセリン酸キナーゼ、NADHデヒドロゲナーゼ、DNAリガーゼ、代謝酵素およびDNAトポイソメラーゼを含む生命に必要な、例えば、タンパク質またはRNAをコードする遺伝子の核酸の保存された領域にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。これらのプライマーは、例えば、増幅条件下で細菌核酸と接触させた場合に、種レベルにて細菌の一般的同定用の、例えば、細菌生物剤同定アンプリコンを生じさせる機能を提供する。
実施例1:生物剤同定アンプリコンを規定するプライマーの選択
細菌生物剤同定アンプリコンを規定するプライマーの設計のために、例えば、GenBankからの関連配列を入手し、整列化させ、PCRプライマーの対が長さが約45〜約200のヌクレオチドの産物を増幅し、それらの分子量または塩基組成によって相互から種を区別するであろう領域についてスキャンする。図2に示された典型的なプロセスを使用する。
これらの人工参照配列は示された参照gi番号からの部分的遺伝子抽出の連結(concatenation)を表す。部分的配列を用いて、連結された配列を生じさせた。なぜならば、完全な遺伝子配列はプライマーの設計に必要なかったからである。任意の残基「N」のストレッチは、部分的遺伝子抽出の分離の便宜性のために加えた(SP101 SPET11については100N(配列番号:732);CJST CJについては50N(配列番号:745);およびAB MLSTについては40N(配列番号:763))。
培養試料またはスワブからのゲノム物質は、DNeasy(登録商標)96組織キット(Qiagen, Valencia,CA)を用いて調製した。全てのPCR反応は、Packard MPII液体取扱ロボットプラットフォームおよびMJ Dyad(登録商標)サーモサイクラー(MJ research, Waltham, MA)を用いて96ウェルマイクロタイタープレート様式にて50μl反応で組み立てる。PCR反応は4ユニットのAmplitaq Gold(登録商標)、1×緩衝液II(Applied Biosystems, Foster City, CA)、1.5mM MgCl2、0.4Mベタイン、800μM dNTPミックス、および250nMの各プライマーからなるものであった。
磁気ビーズに連結されたイオン交換樹脂での核酸の溶液捕獲のために、BioClonアミン末端超常磁気ビーズの25μlの2.5mg/mL懸濁液を、ほぼ10pMの典型的なPCR増幅産物を含有する25〜50μlのPCR反応に加えた。前記懸濁液を渦巻かせまたはピペッティング処理することによってほぼ5分間混合し、その後、磁性セパレーターを用いた後に液体を除去した。次いで、結合したPCR増幅産物を含有するビーズを、50mM炭酸水素アンモニウム/50%MeOHまたは100mM炭酸水素アンモニウム/50%MeOHで3回、続いて、50%MeOHで3回以上洗浄した。結合したPCRアンプリコンを25mMピペリジン、25mMイミダゾール、35%MeOH、+ペプチドキャリブレーション標準で溶出させた。
ESI-FTICRマススペクトロメーターは、能動的に遮蔽された7テスラ超電導磁石を使用するBruker Daltonics(Billerica,MA) Apex II 70e電子スプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴マススペクトロメーターに基づく。能動遮蔽は、超電導磁石からの漏れ磁場の大部分を比較的小さな容量に拘束する。従って、CRTモニター、ロボット構成要素、および他のエレクトロニクスのような漂遊磁場によって悪影響されるであろう構成要素は、FTICRスペクトロメーターに近接して操作することができる。パルス配列制御およびデータ獲得の全ての局面は、Windows NT 4.0操作システム下で、600 MHz Pentium IIデータステーションランニングBrukerのXmassソフトウェアで行った。試料アリコット、典型的には15μl、はFTICRデータステーションによってトリガーされるCTC HTS PALオートサンプラー(LEAP Technologies, Carrboro,NC)を用い、96ウェルマイクロタイタープレートから直接抽出した。試料は、100μl/hr流速をESI源に供給する流体取扱システムを一体化させた10μl試料ループに直接注入した。オフ軸、ガラス脱溶媒キャピラリーの金属化端部からほぼ1.5cmに位置する接地された電子スプレープローブを使用する修飾されたAnalytica(Branford,CT)源において電子スプレーイオン化を介してイオンを形成した。ガラスキャピラリーの雰囲気圧力端は、データ獲得の間、ESIニードルに対して6000Vにバイアスした。乾燥N2の向流を使用して、脱溶媒プロセスを補助した。そこで質量分析される補足されたイオンセルへの注入に先立って、rf-オンリー六極、スキマーコーン、および補助的ゲート電極からなる外部イオン貯蔵器にイオンは蓄積された。イオン化デューティーサイクル>99%が、イオン検出の間に、外部イオン貯蔵器にイオンを同時に蓄積させることによって達成された。各検出事象は、2.3秒にわたってデジタル化された1Mデータポイントからなるものであった。ノイズに対するシグナル比(S/N)を改良するために、32スキャンを、74秒の合計データ獲得時間の間に共に加えた。
4つの天然核酸塩基の分子量は比較的狭い分子量範囲を有する(A=313.058、G=329.052、C=289.046、T=304.046-表3参照)ので、塩基組成の帰属における曖昧性の執拗な源は以下のように起こり得る。異なる塩基組成を有する2つの核酸ストランドは、2つのストランドの間の塩基組成の相違がC<-->T(+15.000)と組み合わせたG<-->A(-15.994)である場合、約1 Daの差を有し得る。例えば、A27G30C21T21の塩基組成を有する1つの99-量体核酸ストランドは30779.058の理論分子量を有し、他方、A26G31C22T20の塩基組成を有するもう1つの99-量体核酸ストランドは30780.052の理論分子量を有する。分子量における1 Daの差は分子量測定の実験誤差内であり得、従って、4つの天然核酸塩基の比較的狭い分子量範囲は不確実性因子を課す。
生物剤同定アンプリコンのマススペクトルは、レーダーシグナル処理で広く用いられているように、最大尤度プロセッサーを用いて独立に分析される。GenXといわれるこのプロセッサーは、まず、入力データについての各塩基組成集合体についてマッチしたフィルターを実行することによって、各プライマーについてのマススペクトロメーターへの入力の最大尤度見積もりを行う。これは、各プライマーについての校正物質に対するGenX応答を含む。
この調査は、本明細書においては「監視プライマー組」と命名され、広い範囲のサーベイプライマー対、分類幅プライマー対および単一バチルスクレードプライマー対を含む16プライマー対の組を用いた。監視プライマー組を表4に示し、これは表1に元来列挙したプライマー対からなる。この監視組は、以下に同一列に示す元来選択されたプライマーに対する非鋳型アデニル化(前記参照)の防止に関する機能的改良を構成するT修飾を施したプライマーを含む(注意;プライマー名称においてはTMODと命名)。プライマー対449(非T修飾)は2回修飾されている。その前のものは、以下に同一列に示されたプライマー対70および357である。プライマー対360も2回修飾されており、その前のものはプライマー対17および118である。
実施例7の流行病監視調査の続きとして、化膿連鎖球菌の亜種特徴(遺伝子型分け)の決定を、多遺伝子座配列タイプ分け(MLST)の根拠に従って、株特異的シグニチャーを生じる戦略に基づいて行った。古典的なMLST分析においては、いくつかのハウスキーピング遺伝子の内部断片を増幅し、配列決定する(Enright et al. Infection and Immunity,2001,69,2416-2427)。古典的なMLST分析においては、いくつかのハウスキーピング遺伝子の内部断片を増幅し、配列決定する。本調査においては、ハウスキーピング遺伝子からの生物剤同定アンプリコンをドリルダウンプライマーを用いて生じさせ、質量分析法によって分析した。マススペクトル分析は、それから塩基組成を決定することができる分子量をもたらすので、挑戦は、化膿連鎖球菌の株のemm分類の分解を決定できるか否かを判断することであった。
本実施例は、広い監視組(表4)および炭疽菌ドリルダウン組(表5)のプライマーに対応する細菌生物剤同定アンプリコンに基づく19の校正物質ポリヌクレオチドの設計を記載する。
本実施例に記載されたプロセスは図7に示す。capC遺伝子は、炭疽菌のpX02プラスミドに存在するカプセル合成に関与する遺伝子である。プライマー対番号350(表9および10参照)は、細菌生物剤同定アンプリコンの作製を介して炭疽菌を同定するように設計された。既知量の実施例3に記載された組合せキャリブレーションポリヌクレオチドベクターを、炭疽菌のAmes株を含んだ微生物の混合物からの細菌生物剤核酸を含有する増幅混合物に加えた。細菌生物剤核酸および組合せキャリブレーションポリヌクレオチドベクターのプライマー対番号350での増幅に際して、細菌生物剤同定アンプリコンおよびキャリブレーションアンプリコンが得られ、質量分析法によって特徴付けた。増幅反応につき測定されたマススペクトルを図8に示す。生物剤同定アンプリコンの分子量は、それらが得られた生物剤(炭疽菌のAmes株)の同定のための手段を提供し、キャリブレーションアンプリコンの分子量は同様にそれらの同定のための手段を提供した。キャリブレーションアンプリコンシグナルと細菌生物剤同定アンプリコンシグナルの豊富さ(ピーク高さ)との間の関係は、炭疽菌のAmes株のpX02プラスミドのコピーの計算の手段を提供した。内部キャリブレーション手法に基づく分子の量を計算する方法は当業者に周知である。
一連のドリルダウンプライマーを、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)の異なる株の同定を目的として、実施例1に記載したように設計した。プライマーを表示「CJST CJ」と共に表11に列挙する。プライマーが生物剤同定アンプリコンにハイブリダイズし、それを生じるハウスキーピング遺伝子はtkt(トランスケトラーゼ)、glyA(セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ)、gltA(クエン酸シンターゼ)、aspA(アスパルテートアンモニアリアーゼ)、glnA(グルタミンシンターゼ)、pgm(ホスホグリセリン酸ムターゼ)、およびuncA(ATPシンターゼα鎖)を含んだ。
アシネトバクター種の同定における表4の広い範囲の監視および分類幅プライマー組の能力をテストするために、(US軍人、Walter Reed Army Institute of Research(WRAIR)におけるUS市民患者、医療スタッフ、イラクの市民および敵の捕虜を含む)Operation Iraqi Freedomに参加している、または参加している個人に接触した個人から183の臨床試料を得た。加えて、イラク、クウェート、ドイツ、米国およびUSNS Comfortにおける病院、病院船から34の環境試料を得た。
生物剤同定アンプリコンの高スループット質量分析法分析の能力をMax-Planck Institute for Infectious Biology (web.mpiib-berlin.mpg.de/mlst/dbs/Mcatarrhalis/documents/primersCatarrhalis html)におけるMLSTデータベースのMLST方法のような多遺伝子座配列タイプ分け(MLST)によって提供された亜種特徴的分解能と組み合わせるために、属アシネトバクターのハウスキーピング遺伝子の分析に基づいてさらに21のプライマー対を選択した。ドリルダウンMLST類似プライマーがハイブリダイズする、細菌生物剤同定アンプリコンの作製のための遺伝子はアントラニル酸シンターゼ成分I(trpE)、アデニル酸キナーゼ(adk)、アデニングリコシラーゼ(mutY)、フマル酸ヒドラターゼ(fumC)、およびピロホスフェートホスホヒドラターゼ(ppa)を含む。これらの21のプライマー対は、表13中の配列リストを参照して示される。プライマー対番号1151〜1154はtrpEのセグメントにハイブリダイズし、それを増幅する。プライマー対番号1155〜1157はadkのセグメントにハイブリダイズし、それを増幅する。プライマー対番号1158〜1164はmutYのセグメントにハイブリダイズし、それを増幅する。プライマー対番号1165〜1170はfumCのセグメントにハイブリダイズし、それを増幅する。プライマー対番号1171はppaのセグメントにハイブリダイズし、それを増幅する。表13に掲げるプライマーの名称は、プライマーが、遺伝子TrpE、efp(延長因子p)、adk、mutT、fumC、およびppaの連結を含む参照配列にハイブリダイズする座標を示す。例えば、プライマー対1151の順方向プライマーはAB MLST-11-OIF007 62 91 Fと命名される。なぜならば、それは、位置62〜91において、Operation Iraqi Freedom (OIF)の試料007における株タイプ11のアシネトバクター MLSTプライマー参照配列にハイブリダイズするからである。
Claims (16)
- 配列番号:97に対して70%〜100%の配列同一性を含む長さが21〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:451に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが20〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:127に対して70%〜100%の配列同一性を含む長さが19〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:482に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが14〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:174に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが19〜35核酸塩基のオリゴヌクレオプライマー、配列番号:530に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが21〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:310に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが21〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:668に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが19〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:313に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが21〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:670に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが21〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:277に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが17〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:632に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが21〜35核酸塩基のオリゴンクレオチドプライマー、配列番号:285に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが21〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:640に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが19〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:301に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが21〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:656に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが21〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号:308に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが18〜35核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号:663に対して70%〜100%配列同一性を含む長さが18〜35の核酸塩基のオリゴヌクレオチドプライマーからなる群より選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。
- 請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーの一つまたは複数を含む組成物。
- 請求項1記載のオリゴヌクレオチドプライマーの2つまたはそれ以上を含む組成物。
- オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかまたは双方が少なくとも1つの修飾された核酸塩基を含む、請求項3記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかまたは双方が5’末端に非鋳型T残基を含む、請求項3記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかまたは双方が少なくとも1つの非鋳型タグを含む、請求項3記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかまたは双方が少なくとも1つの分子量修飾タグを含む、請求項3記載の組成物。
- 請求項3記載の組成物を含むキット。
- 少なくとも1つのキャリブレーションポリヌクレオチドをさらに含む、請求項8記載のキット。
- 磁気ビーズに連結された少なくとも1つのイオン交換樹脂をさらに含む、請求項8記載のキット。
- 請求項3の組成物を用いて未知の細菌からの核酸を増幅して増幅産物を得る工程;
該増幅産物の分子量を測定する工程;
任意で、該分子量からの該増幅産物の塩基組成を決定する工程;および
該増幅産物の該分子量または塩基組成を公知の細菌生物剤同定アンプリコンの複数の分子量または塩基組成と比較する工程;
を含み、
該増幅産物の該分子量または塩基組成と該複数の分子量または塩基組成のメンバーの分子量または塩基組成との間のマッチが該未知の細菌を同定する、未知細菌を同定する方法。 - 分子量が質量分析法によって測定される、請求項11記載の方法。
- 請求項3の組成物を用いて試料からの核酸を増幅して増幅産物を得る工程;
該増幅産物の分子量を測定する工程;
任意で、該分子量からの該増幅産物の塩基組成を決定する工程;および
該増幅産物の該分子量または塩基組成を、一つまたは複数の公知のクレード、属、種、または亜種生物剤同定アンプリコンの公知の分子量または塩基組成と比較する工程;
を含み;
該増幅産物の該分子量または塩基組成と一つまたは複数の公知のクレード、属、種、または亜種生物剤同定アンプリコンの分子量または塩基組成との間のマッチが、該試料における該クレード、属、種、または亜種の存在を示す、試料中の特定のクレード、属、種または亜種の細菌の存在または非存在を決定する方法。 - 分子量が質量分析法によって測定される、請求項13記載の方法。
- 試料を請求項3の組成物、および既知量のキャリブレーション配列を含むキャリブレーションポリヌクレオチドと接触させる工程;
試料中の細菌からの核酸を請求項3の組成物を用いて同時に増幅し、請求項3の組成物を用いて該試料中の該キャリブレーションポリヌクレオチドからの核酸を増幅して、細菌生物剤同定アンプリコンを含む第一の増幅産物、およびキャリブレーションアンプリコンを含む第二の増幅産物を得る工程;
該細菌生物剤同定アンプリコンおよび該キャリブレーションアンプリコンの分子量および豊富さを測定する工程;および
分子量に基づいて該キャリブレーションアンプリコンからの該細菌生物剤同定アンプリコンを識別する工程;
を含み、
該細菌生物剤同定アンプリコンの豊富さおよびキャリブレーションアンプリコン豊富さの比較が該試料中における細菌の量を示す、試料中の未知の細菌の量を測定する方法。 - 細菌生物剤同定アンプリコンの塩基組成を決定する工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
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