WO2020049188A1 - Composition et procédé de conservation - Google Patents

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WO2020049188A1
WO2020049188A1 PCT/EP2019/073995 EP2019073995W WO2020049188A1 WO 2020049188 A1 WO2020049188 A1 WO 2020049188A1 EP 2019073995 W EP2019073995 W EP 2019073995W WO 2020049188 A1 WO2020049188 A1 WO 2020049188A1
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WO
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liquid composition
spores
bacteria
propylene glycol
composition
Prior art date
Application number
PCT/EP2019/073995
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English (en)
Inventor
Alexandre BRAME
Stéphane THEBAULT
Original Assignee
Nolivade
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Publication date
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Publication of WO2020049188A1 publication Critical patent/WO2020049188A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the invention relates to a composition and a method for preserving microorganisms.
  • Microorganisms are used in various fields of activity according to their particular properties. Thus, certain mushrooms are used in breweries for the fermentation of hops or in cheese factories. Some bacteria are used as lactic ferments in the food industry to make yogurts, others produce toxins that can be used in medicine. Among these microorganisms are bacteria which have the possibility of sporulating, the spore being a survival structure in the form of which the bacteria have reduced activity. This state offers bacteria much more stability and resistance to physical and chemical attack than the vegetative state. However, as soon as the spores are found in a favorable environment (in terms of humidity, temperature, nutrient supply ...), they can regain a vegetative form by germination and lose this stability.
  • the dry form in the form of a powder, allows better stability.
  • a liquid form of the ready-to-use solution type favors applications via drinking water or by spraying on a food for example, it also promotes the germination of spores. Obtaining a liquid and stable solution of spores then becomes advantageous in order to be able to conserve the bacterial strains before use.
  • compositions for preserving spores of bacteria which do not affect the viability of these and which do not alter their properties.
  • One of the aims of the invention is to overcome the drawbacks of the prior art.
  • Another object of the invention is to provide a method for preserving bacteria spores which is simple, rapid and economically inexpensive, but above all respectful of the environment.
  • Yet another object of the invention is to provide compositions which can be directly used in food.
  • the invention also relates to a method for preserving spores of bacteria, comprising a step of bringing at least one spore of bacteria into contact with a liquid composition, said liquid composition being essentially constituted, or consisting of:
  • the percentages being expressed by volume relative to the total volume of the liquid composition, said liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention is based on the surprising observation made by the inventors that the simple use of propylene glycol, possibly in the presence of water, has a preservative effect on the spores of bacteria (stable concentration of viable spores which can germinate), without it it is necessary to take special storage, temperature or light precautions.
  • the method according to the invention makes it possible to maintain the spores of bacteria in conditions where they will not germinate (as long as they are in the preservation liquid).
  • the aforementioned liquid composition makes it possible to maintain the spores in an environment where no bacterial or fungal contamination can develop, without taking special precautions, in particular in terms of temperature or brightness, and without the addition of antifungal or antibacterial compounds.
  • the liquid composition therefore comprises either propylene glycol alone, in which the bacteria spore (s) is found, or a mixture of propylene glycol and water (or propylene glycol diluted in water ).
  • pure propylene glycol used for dilution in order to obtain the ranges according to the invention is incompatible with the proliferation of bacteria or yeasts. It can therefore be considered sterile.
  • it is possible to decontaminate it before use in particular by filtration through a filter having pores of 0.45 ⁇ m or 0.22 ⁇ m in order to eliminate possible, but improbable, contaminations bacterial or fungal.
  • propylene glycol when we speak of propylene glycol, it is understood that propylene glycol can be non-sterile (that is to say it is not treated and used as it can be purchased from a supplier), or sterile, for example by filtration as mentioned above.
  • the invention relates to a method for preserving spores of bacteria, comprising a step of bringing into contact at least one spore of bacteria with a liquid composition, said liquid composition comprising, or essentially consisting of:
  • the percentages being expressed by volume relative to the total volume of the liquid composition, said liquid composition being devoid of biocidal agent, or devoid of germinating agent, or devoid of biocidal agent and germinating agent.
  • the liquid composition may contain other compounds, such as salts, minerals, or any other compound having no intrinsic preservative effect on bacteria spores.
  • the aforementioned liquid composition contains propylene glycol (PG) also called propane-1, 2-diol, 1, 2-dihydroxypropane, methyl glycol, alpha-propylene glycol, 1, 2-propanediol, dl-propylene glycol. It is a liquid diol used in many industrial and pharmaceutical or agropharmaceutical uses (pesticide solvent). Propylene glycol can also, in low doses, be used as a food additive. It comes from carbochemistry, and generally from petrochemicals. Propylene glycol is obtained from the reaction of propylene oxide with water to form monopropylene glycol (PG) and is identified by its CAS number: 57-55-6.
  • said at least one spore is brought into contact with the abovementioned liquid composition in a suitable container, this container possibly being that which will serve as a container throughout the preservation process. It is obviously possible, once the contacting of said at least one spore with said liquid composition to transfer the mixture into one or more other containers. This transfer step can also be repeated one or more times.
  • the composition comprises more than 14% by volume of polypropylene glycol. This means that the composition contains from 14% to 100% of propylene glycol, the value of 14% by volume of propylene glycol being excluded.
  • the inventors have demonstrated that a composition consisting of 86% water and 14% propylene glycol does not make it possible to limit the proliferation of bacteria or fungi, and therefore does not fill not one of the criteria for the liquid composition as described above.
  • liquid composition comprises more than 14% of propylene glycol by volume, the balance consists of water.
  • the following table therefore summarizes the different possible liquid compositions.
  • the method according to the invention is therefore suitable for the conservation of spores of bacteria, that is to say spores of bacteria capable of sporulation.
  • a spore is a cell or, more rarely, a multicellular reproductive formation which constitutes one of the stages in the life cycle of many bacteria, plants, algae, fungi, and even certain protozoa.
  • Spores (mitospores or meiospores) give birth by mitosis to a new individual without fertilization, which distinguishes them from gametes.
  • the spore which is the resistance form of the bacteria, can give back a vegetative form: it is germination.
  • Spores are only sensitive to sporicidal products, but are not sensitive to non-sporicidal antibacterial agents which act on vegetative forms.
  • bacteria spores only three bacterial genera are capable of sporulating: the genus Bacillus (aerobic bacteria with Gram + bacilli), the genus Clostridium (anaerobic bacteria with Gram + bacilli), and the genus Sporosarcina (non-pathogenic bacteria, present in the grounds).
  • the spores of bacteria are spores of Bacillus, spores of Clostridium or spores of Sporosarcina.
  • the most advantageous bacteria for which conservation of spores is sought are Bacillus spores.
  • Bacillus agri Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus altitudinis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus butanolivorans, Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus coausus , Bacillus endorhythmos, Bacillus firmus, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterus, Bacillus megaterus Bacillus mycoides, Bacillus natto, Bacillus nigrificans, Bacillus popill
  • Bacillus subtilis Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus megaterum, Bacillus mojavensis , Bacillus smithii, Bacillus vallismortis, Geobacillus stearothermophilus.
  • the liquid composition must also be free of biocidal compounds.
  • biocidal compound in accordance with European Regulation No. 528/2012, is meant in the invention any substance or any mixture, consisting of one or more active substances, containing or generating it, which is intended to destroy, repel or to make harmful organisms harmless, to prevent their action or to combat them in any other way by an action other than a simple physical or mechanical action.
  • active substance means any substance or any microorganism which exerts an action on or against harmful organisms; and by “microorganism”, any microbiological entity, cellular or non-cellular, capable of replicating or transferring genetic material, including lower fungi, viruses, bacteria, yeasts, molds, algae, protozoa and microscopic parasitic helminths.
  • the liquid composition does not contain Proxel GXL, a biocidal agent available from Arch Chemical of Norwalk, Connecticut USA.
  • the liquid composition must also be free of compounds such as germination agents.
  • germination agent is meant in the invention any substance or any mixture, consisting of one or more active substances, containing or generating which has the property of promoting the germination of spores.
  • the liquid composition does not contain any of the following germination agents or any of their mixtures: an amino acid including L-alanine, L-arginine, L-aspartate, L-glutamate, L-histidine, L -isoleucine, L-lysine, L-methionine, L-serine, L- tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-proline, L-leucine, L-cysteine, L - threonine, L-glutamine, L-asparagine, L-phenylalanine, and all their derivatives, a nucleoside purine including inosine and adenosine, a lactate, a carboxylic
  • the invention relates to the aforementioned process, wherein said propylene glycol represents from 15% to 60% by volume relative to the total volume of the liquid composition, in particular from 15% to 40% by volume relative to the total volume of the composition liquid, in particular from 20 to 30% by volume relative to the total volume of the liquid composition.
  • Propylene glycol is a compound which is more expensive to manufacture than some other compounds. Therefore, concentrations that are too high are not economically profitable for a process on an industrial scale.
  • the method in this advantageous aspect can comprise any of the solutions Sol # 10 to Sol # 100, advantageously any of the solutions Sol # 10 to Sol # 60, and even more advantageously any of the above Sol # 20 to Sol # 40 solutions.
  • the invention advantageously relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising a step of bringing at least one spore of bacteria into contact with a liquid composition, said liquid composition essentially consisting of, or consisting of:
  • the percentages being expressed by volume relative to the total volume of the liquid composition, said liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention advantageously relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising a step of bringing at least one spore of bacteria into contact with a liquid composition, said liquid composition essentially consisting , or consisting of:
  • the percentages being expressed by volume relative to the total volume of the liquid composition, said liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising a step of bringing at least one spore of bacteria into contact with a liquid composition, said liquid composition being essentially constituted, or being constituted:
  • the percentages being expressed by volume relative to the total volume of the liquid composition, said liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germinating agent, or devoid of biocidal agent and germinating agent, and organic solvent capable of killing spores, such as xylene or methanol.
  • the invention relates to the aforementioned method, further comprising a step of maintaining at room temperature of said at least one spore in contact with said liquid composition.
  • the method according to the invention therefore makes it possible to keep in a spore form a spore of bacteria, in particular of Bacillus, under non-restrictive conditions of temperature, pressure and brightness. Also, a spore of bacteria, in particular of Bacillus, can be kept for several months, even several years, at an atmospheric pressure varying from pressure at sea level to a reduced pressure at altitude, at temperatures varying from 4 ° C. at 40 ° C, in particular from 10 ° C to 30 ° C, and without pay particular attention to exposure to light, especially sunlight, especially direct sunlight.
  • the conservation of spores of bacteria as defined in the invention can be done in the light, or protected from light, and in particular in the dark (by covering the container in which the spores and the liquid composition, for example using a sheet of aluminum foil, or any material capable of covering a container and opaque).
  • the invention advantageously relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising
  • liquid composition essentially constituted, or being constituted:
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention advantageously relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising
  • liquid composition essentially constituted, or being constituted:
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention advantageously relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising
  • liquid composition being essentially constituted, or consisting of: - from 15% to 40% of propylene glycol, and
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising
  • liquid composition essentially constituted, or being constituted:
  • said liquid composition being devoid of biocidal agent, or devoid of germinating agent, or devoid of biocidal agent and germinating agent.
  • the invention relates to the abovementioned method, comprising a step of bringing at least one spore up to 10 14 spores of bacteria per ml of total composition into contact with a liquid composition, said liquid composition being essentially constituted, or being constituted:
  • the percentages being expressed by volume relative to the total volume of the liquid composition.
  • the term "at least one spore to 10 14 spores per ml_” means an amount of spores of bacteria varying from 1 spore in the total composition up to 10 14 spores in a ml_ of the total composition , and in particular 1 spore, one spore per ml_, 1.10 1 spore per ml_, 5.10 1 spore per ml_, 1.10 2 spores per ml_, 5.10 2 spores per ml_, 1.10 3 spores per ml_, 5.10 3 spores per ml_, 1.10 4 spores per ml_, 5.10 4 spores per ml_, 1.10 5 spores per ml_, 5.10 5 spores per ml_, 1.10 6 spores per ml_, 5.10 6 spores per ml_, 1.10 7 spores per ml_, 5.10
  • the terms “of at least one spore to 10 14 spores per ml” can be uniformly replaced by the words “of at least 10 1 spores to 10 14 spores per ml”, or by any expression in which "at least one spore” and replaced by a concentration from the list listed in the previous paragraph.
  • the invention advantageously relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising
  • liquid composition essentially constituted, or consisting of:
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising
  • liquid composition essentially constituted, or consisting of:
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention advantageously relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising
  • liquid composition essentially constituted, or consisting of: - from 15% to 40% of propylene glycol, and
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention relates to a method for preserving spores of bacteria, in particular of Bacillus, comprising
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention relates to the use of a liquid composition for the preservation, protected from fungal and bacterial contamination, at room temperature, of at least one spore of bacteria,
  • liquid composition as defined above, being essentially constituted, or being constituted:
  • the percentages being expressed by volume relative to the total volume of the liquid composition, said liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention relates to the aforementioned use of a liquid composition, said liquid composition being essentially constituted, or being constituted:
  • the percentages being expressed in volume relative to the total volume of the liquid composition, said liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and germination agent.
  • the invention relates to the aforementioned use of a liquid composition, said liquid composition being essentially constituted, or being constituted:
  • the percentages being expressed by volume relative to the total volume of the liquid composition, said liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention relates to the aforementioned use of a liquid composition, said liquid composition being essentially constituted, or being constituted:
  • the percentages being expressed by volume relative to the total volume of the liquid composition, said liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the invention advantageously relates to the abovementioned use, for the conservation of at least one spore with 10 14 spores of bacteria per ml of total composition, as defined above.
  • the invention also relates to an additive, in particular a food additive, comprising at least one spore of bacteria and a liquid composition, said at least one spore of bacteria being dispersed in said liquid composition,
  • liquid composition being essentially constituted, or being constituted:
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • One of the aspects of the invention therefore relates to an additive which can be combined with a food, a food composition or with a drink, so that said at least one spore of bacteria is consumable directly with the food or via water. drink.
  • food additive any substance which is not normally consumed as a foodstuff, nor normally used as a characteristic ingredient of a foodstuff, whether or not it has nutritional value, and the intentional addition of which to a foodstuff for technological (including organoleptic) purposes to a any stage of the manufacturing, processing, preparation, processing, conditioning, packaging, transport or storage of the said commodity results, or may, in all likelihood, result (directly or indirectly) its incorporation or that of its derivatives in this commodity or otherwise affect its characteristics.
  • This expression does not apply to contaminants or substances added to foodstuffs to preserve or improve their nutritional properties.
  • the additive according to the invention will be used in amounts determined by the skilled person according to the usual principles in animal nutrition, and taking into account the technological limits and the desired properties of said additive.
  • the foodstuffs envisaged are solid food in granules, fodder, powder, semolina with which said additive can be mixed or on which said additive can be sprayed. Said additive may also be added to liquid foods, soup foods or even drinks, including especially drinking water.
  • the spore will be able to germinate when it finds favorable conditions, therefore in particular when it is no longer in its preservation solution, and in particular when the propylene glycol is at a concentration less than or equal to 14% by volume relative to the weight of the additive. mixed in a food or dispersed on a food, or even less than or equal to 14% by volume relative to the total volume of a drink in which said additive is diluted. These conditions will be observed in particular after ingestion of the food, after mixing in certain moist foods such as soups, or after dilution in drinks, in particular in drinking water.
  • the invention relates to the aforementioned additive, where said propylene glycol represents from 15% to 40% by volume relative to the total volume of said liquid composition, in particular from 20 to 30% by volume relative to the total volume of said composition liquid.
  • the invention relates to the aforementioned additive, where said liquid composition is essentially made up, or is made up:
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent and or of germination agent.
  • the invention relates to the aforementioned additive, where said liquid composition is essentially made up, or is made up:
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent and or of germination agent.
  • the invention relates to the aforementioned additive, where said liquid composition is essentially made up, or is made up:
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent and or of germination agent.
  • Another aspect of the invention relates to an additive as mentioned above, for use in the context of the prophylaxis of viral, bacterial and parasitic infections of farm animals.
  • the viral, bacterial and parasitic pathologies or infections which can be prevented by the use of the additive according to the invention are the following: digestive pathologies in particular diarrhea, enteritis, salmonellosis, collibacilosis, ileitis; respiratory infections and in particular rhinitis, pasteurellosis, bordetellosis; skin infections and in particular ulcers, epidermitis, necrosis; and infections in the musculoskeletal system including lameness, and arthritis.
  • the additive in particular associated with one or more foods, or with a drink, therefore makes it possible to use spores of bacteria which have been stored for a long time under very simple conditions, and whose effectiveness will be the same or very close to the effectiveness of fresh spores, that is to say obtained within a very short time (a few hours to a few days) after the sporulation of the bacteria.
  • Such an additive can be used for farm animals, especially birds and poultry, cattle, sheep, pigs, crustaceans, fish and molluscs, as well as pets, including new animals. company.
  • Yet another aspect of the invention relates to a liquid product consisting essentially of, or consisting of
  • liquid composition said liquid composition being essentially constituted, or consisting of:
  • liquid composition being in particular devoid of biocidal agent, or devoid of germination agent, or devoid of biocidal agent and of germination agent.
  • the liquid product according to the invention comprises at least one spore and the liquid composition as essential elements for imparting its spore-preserving properties.
  • the liquid product may also contain salts, adjuvants, surfactants or any other compound intended to supplement the product, but these compounds have no effect on the conservation of spores.
  • the liquid product is devoid of biocidal agents, as they have been defined above, or also of germination agent, as they have been defined above.
  • said liquid composition consists essentially of, or consists of
  • compositions tested will be named from F1 to F16 depending on the ingredient I used and its concentration in the final composition: [Table 2]
  • control compositions will be named FO.
  • compositions made from ingredient 11 will be called F1
  • compositions made from ingredient I2 will be called F2, and so on.
  • the objective of this analysis is to assess the stability of the spores of Bacillus subtilis and B. licheniformis stored in different liquid compositions, at room temperature, for 1 and 2 months of storage.
  • Control composition (FO) This composition comprises
  • This suspension of bacterial spores comprises 20% by mass relative to the total volume of solution of a bacterial powder.
  • the bacterial powder consists of spores of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis (ratio 1: 1), concentrated at 3.2x10 12 spores per kilogram of powder, and a support.
  • compositions tested correspond to the control composition in which one of the ingredients 11 to 116 is added, where the volume of water is adapted up to 100%.
  • the macromethod is a count on large culture dishes, in contrast to the micromethod, which is a count in plates with wells:
  • Peptone-salt is an isotonic diluent for optimal recovery of microorganisms (ISO / DIS 6649), based on peptone and sodium chloride.
  • PCA agar is a recommended medium for standardized enumeration of bacteria in water.
  • a significant increase (> 0.3log) in the level of the population in a jar compared to the OJ witness should be confirmed by a second enumeration; if this result is confirmed, the analysis is stopped. This will mean bacterial growth (either from contamination, or from germination of a spore); the formulation will be considered unstable.
  • a change in the appearance of the formulation eg development of molds
  • poor resuspension of the spores results in the analysis being stopped; the formulation will be considered unstable.
  • compositions F2, F3, F7, F8 and F9 are considered stable after 1 month and 2 months of storage at room temperature.
  • ingredients I2, I3, I7, I8 and I9 make it possible to guarantee an acceptable stability of the spores of B. subtilis and licheniformis.
  • the objective of this analysis is to evaluate the anti-germinative activity of different compositions, after inoculation of Bacillus substilis and B. licheniformis, and incubation at 30 ° C in a nutritive broth.
  • Control composition (FO) This composition comprises
  • a suspension of bacterial spores in water This suspension of bacterial spores comprises 2% by mass relative to the total volume of solution of a bacterial powder.
  • the bacterial powder consists of spores of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis (ratio 1: 1), concentrated at 3.2x10 12 spores per kilogram of powder, and a support.
  • compositions tested correspond to the control composition in which one of the ingredients I2, I3, I7, I8 and I9 is added, where the volume of water is adapted up to 100%.
  • TSB or Tryptone Soy Nutrient Broth is a highly nutritious and general-purpose medium for the cultivation of bacteria and fungi. This highly nutritious medium allows the growth of most germs. The presence in the formula of tryptone and soya peptone allows a satisfactory development of the demanding germs without addition of serum or other nutritive elements.
  • the formulation will be considered anti-germinative in the absence of the appearance of a bacterial disorder and in the absence of a significant increase (> 0.3log) in the spore population over 30 days.
  • FT total flora
  • FS spore-forming flora
  • the deviations from JO are not significant, whether for the total flora or the spore-forming flora.
  • compositions F2, F3 do not have a biofilm and have been analyzed for their anti-germination activity on D30, activity which has been judged positive.
  • the objective of this analysis is to evaluate the bacteriostatic activity of different compositions, after inoculation of a bacterial cocktail consisting of the following bacteria: a gram-bacteria, namely: E.coli, a gram + bacteria, namely: Staphylococcus aureus, and a lactic acid bacteria, namely: Lactococcus lactis, and incubation at 30 ° C in a nutritious broth.
  • a gram-bacteria namely: E.coli
  • a gram + bacteria namely: Staphylococcus aureus
  • a lactic acid bacteria namely: Lactococcus lactis
  • compositions tested 50% of a nutritive TSB broth concentrated 2 times + 5% of a bacterial cocktail solution + one of the ingredients I2, I3, I7, I8 and I9 , supplemented with water up to 100%
  • the bacteria cocktail solution is prepared as below. For 100 mL of solution:
  • composition will be considered bacteriostatic as a minimum in the absence of the appearance of a bacterial disorder and in the absence of a significant increase (> 0.3log) in the bacterial population over 7 days.
  • Isolation spreading of 10 ⁇ l of the solution on the blood agar and observation of what grows by appearance of the colonies.
  • compositions F2, F3 do not have a biofilm and have been analyzed for their bacteriostatic activity on D7, activity which has been judged positive.
  • ingredients I2, I3, namely the PG at 20% and 30% make it possible to guarantee the non-proliferation of pathogenic or non-pathogenic bacteria.
  • the objective of this analysis is to evaluate the fungistatic activity of different compositions, after inoculation of molds and incubation at 30 ° C in a nutritive broth.
  • Control composition 50% of a nutritive broth TSB concentrated 2 times + 5% of a mycelial solution + water
  • compositions tested correspond to the formulas F2, F3, F7, F8 and F9 described above + 50% of a nutritive broth TSB concentrated 2 times + 5% of a mycelial solution + water
  • the mycelial solution is a culture of microscopic fungal mycelia of undetermined nature prepared as follows. For 100 mL:
  • Macroscopic observation Frequent observations from D1 to D30 on all the pots. Check if presence or absence of mycelial development. Microbiological analysis: On all pots FO, F2, F3, F7, F8 and F9 in the absence of appearance of mycelial development until D30, carry out spreading on PDA agar:
  • Glucose agar with potato extract is a selective yeast and mold medium, ready to liquefy, used for isolation, cultivation and enumeration of yeasts and molds in dairy products and other food products especially.
  • composition will be considered fungistatic as a minimum if there is no appearance of mycelial development over 30 days.
  • compositions F2, F3 do not have a biofilm and have been analyzed for their fungistatic activity on D30, activity which was judged to be particularly satisfactory.
  • the objective of this analysis is to assess the anti-germination activity of different compositions, after inoculation of Bacillus substilis and B. licheniformis, and incubation at 30 ° C in a nutritive broth.
  • Example 2 The same protocol as in Example 2 was used with the ingredients 11, I2 and from 117 to I20 and the tested compositions F1, F2 and from F17 to F20.
  • Example 2 The same method of analysis as in Example 2 was used with an observation period reduced to 2, 5 or 8 days.
  • the formulation will be considered as anti-germinative in the absence of appearance of a bacterial disorder over 2, 5 and 8 days or in the absence of a significant difference (> 0.3log) between the total flora and the spore-forming flora. at D6.
  • FT total flora
  • FS spore-forming flora
  • compositions F1, F17 and F18 a bacterial development is visible visible to the naked eye. No count was therefore made on these formulas.
  • compositions F2, F19 and F20 no disorder corresponding to bacterial development was observed with the naked eye. Counts were therefore carried out to check the stability of the spores: no significant difference was observed between the total flora and the spore flora. There is therefore no vegetative form in the solutions analyzed.
  • compositions F2, F19 and F20 do not have a biofilm and have been analyzed for their anti-germination activity on D6, activity which has been judged positive.
  • ingredients I2, 119 and I20 namely the PG at 20%, 16% and 18%, make it possible to guarantee the non-germination of the spores of B. subtilis and B. licheniformis.
  • the objective of this analysis is to assess the stability of Bacillus subtilis and B. licheniformis spores stored in different liquid compositions, at different propylene glycol (PG) concentrations, at room temperature, up to 10 or 15 months of storage .
  • PG propylene glycol
  • compositions PG10, PG20 and PG30 and a control composition F0 are prepared as described in example 1 point 11.1.
  • compositions are prepared as follows: [Table 9]
  • compositions include:
  • This suspension comprises 1% by mass relative to the total volume of solution of a bacterial powder.
  • the bacterial powder consists of spores of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis (ratio 1: 1), concentrated at 3.2x10 12 spores per kilogram of powder, and a support.
  • Microbiological analysis at T0, only for the control compositions F0 and PG0; at 1, 2, 4, 5, 8, 10 and / or 15 months of storage, for the other compositions.
  • a significant decrease (> 0.3log) in the population level in at least one jar compared to the corresponding control (FO or PGO) at T0 is confirmed by a second enumeration; if this result is confirmed, the analysis is stopped; the formulation is considered unstable from the previous point.
  • the average of the deviations observed on the 90% PG composition samples remains at the limit of the tolerance threshold. 2 of 3 samples PG90 show a decrease greater than tolerance. The 90% PG composition is therefore considered unstable after 4 months of storage.
  • the average of the deviations observed on the samples of the 80% PG composition remains within the tolerance zone. 1 of the 3 PG80 samples exceeds this tolerance threshold. After 10 months of storage, the 3 samples of PG80 leave the tolerance zone. The 80% PG composition is therefore considered unstable after 8 months of storage.
  • the average of the deviations observed on the samples of the composition at 70% of PG leaves the tolerance zone.
  • the tolerance threshold is exceeded for 2 of the 3 samples.
  • the composition at 70% PG is therefore considered unstable from 10 months of storage.
  • the average of the deviations observed on the samples of the 40%, 50% and 60% compositions remains within the tolerance zone as well as each of the individual deviations observed on the 3 samples for each of these compositions.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de conservation de spores de bactérie, comprenant une étape de mise en contact d'au moins une spore de bactérie avec une composition essentiellement constituée de propylène glycol, pour obtenir au moins une spore dans une composition de conservation.

Description

DESCRIPTION
Titre de l’invention : Composition et procédé de conservation
L’invention concerne une composition et un procédé de conservation de microorganismes.
Les microorganismes sont utilisés dans divers domaines d’activité selon leurs propriétés particulières. Ainsi, certains champignons sont utilisés en brasserie pour la fermentation du houblon ou encore en fromagerie. Certaines bactéries sont utilisées en tant que ferments lactiques en agroalimentaire pour la fabrication de yaourts, d’autres produisent des toxines pouvant être utilisées en médecine. Parmi ces micro-organismes, on trouve des bactéries qui ont la possibilité de sporuler, la spore étant une structure de survie sous la forme de laquelle les bactéries ont une activité réduite. Cet état offre aux bactéries une stabilité et une résistance aux agressions physiques et chimiques bien plus importante que l’état végétatif. Cependant, dès que les spores se retrouvent dans un milieu favorable (en termes d’humidité, de température, d’apports nutritifs...), elles peuvent retrouver une forme végétative par germination et perdre cette stabilité. Selon la galénique des produits bactériens, il est donc plus ou moins facile de conserver les spores. Ainsi, la forme sèche, sous la forme d’une poudre, permet une meilleure stabilité. En revanche, si une forme liquide de type solution prête à l’emploi favorise des applications via l’eau de boisson ou par pulvérisation sur un aliment par exemple, elle favorise également la germination des spores. Obtenir une solution liquide et stable de spores devient alors intéressant pour pouvoir conserver les souches bactériennes avant utilisation.
Des exemples de conservation des spores de bactéries ont déjà été proposés dans l’art antérieur. Par exemple le brevet US 5,215,747 décrit une composition de prémélange stable au stockage contenant des endospores de Bacillus subtilis et au moins un composant chimique fongicide. Ces prémélanges peuvent être sous forme liquide, mais malheureusement contiennent toutefois des solvants organiques tels que le xylène ou le méthanol qui, dans certains cas, peut être toxique pour la spore.
Aussi, est-il important de proposer des compositions de conservation des spores de bactéries, qui n’affectent pas la viabilité de celles-ci et qui n’altèrent pas leurs propriétés.
Un des buts de l’invention est de pallier les inconvénients de l’art antérieur.
Un autre but de l’invention est de fournir une méthode de conservation des spores de bactéries qui soit simple, rapide et économiquement peu onéreuse, mais surtout respectueuse de l’environnement.
Encore un autre but de l’invention est de proposer des compositions qui peuvent directement être utilisées en alimentation.
Aussi l’invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, comprenant une étape de mise en contact d’au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de plus de 14% de propylène glycol, et
- moins de 86% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
L’invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que la simple utilisation de propylène glycol, éventuellement en présence d’eau, a un effet conservateur sur les spores de bactéries (concentration stable en spores viables pouvant germer), sans qu’il soit nécessaire de prendre des précautions particulières de stockage, de température ou de luminosité. En outre, le procédé selon l’invention permet de maintenir les spores de bactéries dans des conditions où elles ne germeront pas (tant qu’elles sont dans le liquide de conservation). Enfin, la composition liquide susmentionnée permet de maintenir les spores dans un milieu où aucune contamination bactérienne ou fongique ne pourra se développer, sans prendre de précautions particulières, notamment en termes de température ou de luminosité, et sans ajout de composés antifongiques ou antibactériens.
La conservation des spores selon le procédé de l’invention reste optimale après 10 mois, voire plus selon les concentrations utilisées en propylène glycol.
Dans le procédé selon l’invention, la composition liquide comprend donc soit du propylène glycol seul, dans lequel se retrouve la ou les spores de bactéries, soit un mélange de propylène glycol et d’eau (ou du propylène glycol dilué dans l’eau).
En soi, le propylène glycol pur utilisé pour dilution afin d’obtenir les gammes selon l’invention est incompatible avec la prolifération de bactéries ou de levures. Aussi, peut- il être considéré comme stérile. Toutefois, dans le cadre de l’invention, il est possible de le décontaminer avant utilisation, notamment par filtration sur un filtre ayant des pores de 0,45 pm ou 0,22 pm afin d’éliminer d’éventuelles, mais improbables, contaminations bactériennes ou fongiques.
Aussi dans l’invention, lorsque l’on parle de propylène glycol, il est entendu que le propylène glycol peut être non stérile (c’est-à-dire qu’il n’est pas traité et utilisé tel qu’il peut être acheté chez un fournisseur), ou stérile, par exemple par filtration comme mentionné plus haut.
Dans un aspect avantageux, l’invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, comprenant une étape de mise en contact d’au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide comprenant, ou étant essentiellement constituée :
- de plus de 14% de propylène glycol, et
- moins de 86% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, ladite composition liquide étant dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination. Dans cet aspect, la composition liquide peut contenir d’autres composés, tel que des sels, des minéraux, ou tout autre composé n’ayant aucun effet intrinsèque conservateur des spores de bactéries.
La composition liquide susmentionnée contient du propylène glycol (PG) également appelé propane-1 ,2-diol, 1 ,2-dihydroxypropane, méthyl glycol, alpha-propylène-glycol, 1 ,2-propanediol, dl-propylène-glycol. Il s’agit d’un diol à l’état liquide utilisé dans de nombreux usages industriels et pharmaceutiques ou agropharmaceutiques (solvant de pesticides). Le propylène glycol peut également, à faible dose, être utilisé comme additif alimentaire. Il est issu de la carbochimie, et généralement de la pétrochimie. Le propylène-glycol est obtenu à partir de la réaction de l'oxyde de propylène avec l'eau pour former du monopropylène glycol (PG) et est identifié par son numéro CAS : 57-55- 6.
De manière pratique, ladite au moins une spore est mise en contact avec la composition liquide susmentionnée dans un récipient approprié, ce récipient pouvant être celui qui servira de récipient tout au long du processus de conservation. Il est bien évidemment possible, une fois la mise en contact de ladite au moins une spore avec ladite composition liquide de transvaser le mélange dans un ou plusieurs autres récipients. Cette étape de transvasement peut également être répétée un ou plusieurs fois.
Dans le procédé selon l’invention, la composition comprend plus de 14% en volume de polypropylène glycol. Cela signifie que la composition contient de 14% à 100% de propylène glycol, la valeur de 14% en volume de propylène glycol étant exclue. En effet, comme cela est démontré dans les exemples, les inventeurs ont démontré qu’une composition constituée de 86% d’eau et de 14% de propylène glycol ne permettait pas de limiter la prolifération de bactéries ou de champignons, et donc ne remplissait pas l’un des critères de la composition liquide telle que décrite ci-dessus.
Comme la composition liquide susmentionnée comprend plus de 14% de propylène glycol en volume, le complément consiste en de l’eau. Aussi, le tableau suivant résume- t-il les différentes compositions liquides possibles.
[Table 1]
Figure imgf000005_0001
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Le procédé selon l’invention est donc adapté à la conservation des spores de bactéries, c’est-à-dire des spores de bactéries capables de sporulation.
Une spore est une cellule ou plus rarement une formation pluricellulaire reproductive qui constitue une des étapes du cycle de vie de nombreuses bactéries, plantes, algues, champignons, voire de certains protozoaires.
Les spores (mitospores ou méiospores) donnent naissance par mitoses à un nouvel individu sans fécondation, ce qui les distingue des gamètes. Certaines spores, notamment celles de bactéries ou de champignons, présentent des caractéristiques remarquables de résistance : elles peuvent survivre pendant plusieurs milliers d'années, même dans des conditions défavorables, et permettre ainsi la dispersion de l'espèce, parfois à une grande distance de son point d'origine, ou longtemps après la disparition du « parent ». Lorsque les conditions redeviennent favorables, la spore, qui est la forme de résistance de la bactérie, peut redonner une forme végétative : c'est la germination.
Les spores sont seulement sensibles aux produits sporicides, mais ne sont pas sensibles aux agents antibactériens non sporicides qui agissent sur les formes végétatives.
Concernant les spores de bactéries, seuls trois genres bactériens sont capables de sporuler : le genre Bacillus (bactéries aérobies à bacilles Gram +), le genre Clostridium (bactéries anaérobies à bacilles Gram +), et le genre Sporosarcina (bactéries non pathogènes, présentes dans les sols).
Aussi, dans l’invention, les spores de bactéries sont des spores de Bacillus, des spores de Clostridium ou des spores de Sporosarcina. Les bactéries les plus avantageuses, pour lesquelles la conservation des spores est recherchée sont les spores de Bacillus.
En particulier, il est avantageux de conserver les spores de bactéries du genre Bacillus notamment des espèces Bacillus agri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus altitudinis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus butanolivorans, Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus, Bacillus endorhythmos, Bacillus firmus, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus médusa, Bacillus metiens, Bacillus mojavensis, Bacillus mycoides, Bacillus natto, Bacillus nigrificans, Bacillus popillae, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus simplex, Bacillus sphaericus, Bacillus spp., Bacillus subtilis, Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifagellatus, Bacillus vallismortis, Geobacillus stearothermophilus.
Il est d’autant plus avantageux de conserver les spores de bactéries des espèces Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus megaterium, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus smithii, Bacillus vallismortis, Geobacillus stearothermophilus.
Comme expliqué plus haut, il est important que la composition liquide soit dépourvue de tous composés sporicides, sans quoi la conservation ne sera pas possible puisque les spores seront détruites.
La composition liquide doit en outre être dépourvue de composés biocides. Par composé biocide, conformément au Règlement européen n° 528/2012, on entend dans l’invention toute substance ou tout mélange, constitué d’une ou plusieurs substances actives, en contenant ou en générant, qui est destiné à détruire, repousser ou rendre inoffensifs les organismes nuisibles, à en prévenir l’action ou à les combattre de toute autre manière par une action autre qu’une simple action physique ou mécanique. Dans cette définition, on entend par « substance active », toute substance ou tout microorganisme qui exerce une action sur ou contre les organismes nuisibles ; et par « microorganisme », toute entité microbiologique, cellulaire ou non cellulaire, capable de se répliquer ou de transférer du matériel génétique, y compris les champignons inférieurs, les virus, les bactéries, les levures, les moisissures, les algues, les protozoaires et les helminthes parasites microscopiques. Notamment, la composition liquide ne contient pas de Proxel GXL un agent biocide disponible chez Arch Chemical of Norwalk, Connecticut USA.
La composition liquide doit en outre être dépourvue de composés tels que des agents de germination. Par agent de germination, on entend dans l’invention toute substance ou tout mélange, constitué d’une ou plusieurs substances actives, en contenant ou en générant qui a la propriété de favoriser la germination des spores. Notamment, la composition liquide ne contient aucun des agents de germination suivants ou aucun de leurs mélanges : un acide aminé dont la L-alanine, la L-arginine, la L-aspartate, la L- glutamate, la L-histidine, la L-isoleucine, la L-lysine, la L-méthionine, la L-serine, la L- tryptophan, la L-tyrosine, la L-valine, la L-proline, la L-leucine, la L-cystéine, la L- thréonine, la L-glutamine, la L-asparagine, la L-phénylalanine, et tous leurs dérivés, , une purine nucléoside dont l’inosine et l’adénosine, un lactate, un acide carboxylique, un riboside... La composition liquide susmentionnée ne comprend pas non plus de solvant organique de type xylène ou méthanol qui peuvent affecter la survie des spores.
Avantageusement, l’invention concerne le procédé susmentionné, où ledit propylène glycol représente de 15% à 60%en volume par rapport au volume total de la composition liquide, notamment de 15% à 40% en volume par rapport au volume total de la composition liquide, notamment de 20 à 30% en volume par rapport au volume total de la composition liquide.
Le propylène glycol est un composé dont la fabrication est plus coûteuse que certains autres composés. Aussi, des concentrations trop élevées ne sont-elles pas économiquement rentables pour un procédé à l’échelle industrielle.
En référence au tableau 1 ci-dessus, le procédé dans cet aspect avantageux peut comprendre l’une quelconque des solutions Sol#10 à Sol#100, avantageusement l’une quelconque des solutions Sol#10 à Sol#60, et encore plus avantageusement l’une quelconque des solutions Sol#20 à Sol#40 susmentionnées.
En d’autres termes, l’invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spores de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant une étape de mise en contact d’au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 60% de propylène glycol, et
- de 40% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
En d’autres termes, l’invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant une étape de mise en contact d’au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 40% de propylène glycol, et
- de 60% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Encore plus avantageusement, l’invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant une étape de mise en contact d’au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 20% à 30% de propylène glycol, et
- de 70% à 80% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination, et de solvant organique susceptible de tuer les spores, tel que le xylène ou le méthanol.
Dans un mode de réalisation avantageux, l’invention concerne le procédé susmentionné, comprenant en outre une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide.
Le procédé selon l’invention permet donc de conserver dans un état sporulé une spore de bactérie, notamment de Bacillus, dans des conditions de température, de pression et de luminosité non contraignantes. Aussi, une spore de bactérie, notamment de Bacillus, peut être conservée pendant plusieurs mois, voire plusieurs années, à une pression atmosphérique variant de la pression au niveau de la mer à une pression réduite en altitude, à des températures variant de 4°C à 40°C, notamment de 10°C à 30°C, et sans particulièrement faire attention à l’exposition à la lumière, notamment la lumière du soleil, en particulier la lumière directe du soleil. Aussi, la conservation de spores de bactérie telle qu’elle est définie dans l’invention peut se faire à la lumière, ou à l’abri de la lumière, et en particulier dans le noir (par recouvrement du récipient dans lequel se trouve les spores et la composition liquide, par exemple à l’aide d’une feuille de papier d’aluminium, ou de tout matériau susceptible de recouvrir un récipient et opaque).
En d’autres termes, l’invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant
1- une étape de mise en contact d’au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de plus de 14% de propylène glycol, et
- de moins de 86% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, et
2- une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
En d’autres termes, l’invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant
1- une étape de mise en contact d’au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 60% de propylène glycol, et
- de 40% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, et
2- une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
En d’autres termes, l’invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant
1 - une étape de mise en contact d’au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : - de 15% à 40% de propylène glycol, et
- de 60% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide,
2 - une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Encore plus avantageusement, l’invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant
1- une étape de mise en contact d’au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 20% à 30% de propylène glycol, et
- de 70% à 80% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide,
2- une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide,
ladite composition liquide étant dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Dans un autre aspect avantageux, l’invention concerne le procédé susmentionné, comprenant une étape de mise en contact d’au moins une spore jusqu’à 1014 spores de bactéries par ml_ de composition totale, avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de plus de 14% de propylène glycol, et
- moins de 86% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide.
Dans l’invention, on entend par « d’au moins une spore à 1014 spores par ml_», une quantité de spores de bactéries variant de 1 spore dans la composition totale jusqu’à 1014 spores dans un ml_ de la composition totale, et en particulier 1 spores, une spore par ml_, 1 .101 spores par ml_, 5.101 spores par ml_, 1.102 spores par ml_, 5.102 spores par ml_, 1 .103 spores par ml_, 5.103 spores par ml_, 1.104 spores par ml_, 5.104 spores par ml_, 1 .105 spores par ml_, 5.105 spores par ml_, 1.106 spores par ml_, 5.106 spores par ml_, 1 .107 spores par ml_, 5.107 spores par ml_, 1.108 spores par ml_, 5.108 spores par ml_, 1.109 spores par ml_, 5.109 spores par ml_, 1.1010 spores par ml_, 5.1010 spores par mL, 1 1011 spores par mL, 5.1011 spores par mL, 1 1012 spores par mL, 5.1012 spores par mL, 1.1013 spores par mL, 5.1013 et 1.1014 spores par mL.
Aussi dans l’invention, les termes « d’au moins une spore à 1014 spores par mL», peuvent être uniformément remplacés par les termes « d’au moins 101 spores à 1014 spores par mL», ou par toute expression dans laquelle « au moins une spore » et remplacée par une concentration de la liste énumérée au paragraphe précédent.
En d’autres termes, l’invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant
1- une étape de mise en contact d’au moins une spore à 1014 spores de bactéries par mL de la composition totale avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de plus de 14% de propylène glycol, et
- de moins de 86% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, et possiblement
2- une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Avantageusement, l’invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant
1- une étape de mise en contact d’au moins une spore à 1014 spores de bactéries par mL de la composition totale avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 60% de propylène glycol, et
- de 40% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, et possiblement
2- une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Avantageusement, l’invention concerne avantageusement un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant
1- une étape de mise en contact d’au moins une spore à 1014 spores de bactéries par mL de la composition totale avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée : - de 15% à 40% de propylène glycol, et
- de 60% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, et possiblement
2- une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Encore plus avantageusement, l’invention concerne un procédé de conservation de spore de bactérie, notamment de Bacillus, comprenant
3- 1 - une étape de mise en contact d’au moins une spore à 1014 spores de bactéries par ml_ de la composition totale avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 20% à 30% de propylène glycol, et
- de 70% à 80% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, et possiblement
4- 2 - une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Dans un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation d’une composition liquide pour la conservation à l’abri de contaminations fongique et bactérienne, à température ambiante, d’au moins une spore de bactérie,
ladite composition liquide, telle que définie ci-dessus, étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de plus de 14% de propylène glycol, et
- moins de 86% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Avantageusement, l’invention concerne l’utilisation susmentionnée d'une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 60% de propylène glycol, et
- de 40% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Avantageusement, l’invention concerne l’utilisation susmentionnée d'une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 40% de propylène glycol, et
- de 60% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Encore plus avantageusement, l’invention concerne l’utilisation susmentionnée, d’une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 20% à 30% de propylène glycol, et
- de 70% à 80% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide, ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
L’invention concerne avantageusement l’utilisation susmentionnée, pour la conservation d’au moins une spore à 1014 spores de bactéries par mL de composition totale, telle que définie ci-dessus.
L’invention concerne en outre un additif, notamment alimentaire, comprenant au moins une spore de bactérie et une composition liquide, ladite au moins une spore de bactérie étant dispersée dans ladite composition liquide,
ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de plus de 14% de propylène glycol, et
- moins de 86% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Un des aspects de l’invention concerne donc un additif qui peut être associé à un aliment, une composition alimentaire ou à une boisson, de sorte que ladite au moins une spore de bactérie soit consommable directement avec l’aliment ou via l’eau de boisson.
Par additif alimentaire, on entend toute substance qui n’est pas normalement consommée en tant que denrée alimentaire, ni utilisée normalement comme ingrédient caractéristique d’une denrée alimentaire, qu’elle ait ou non une valeur nutritive, et dont l’addition intentionnelle à une denrée alimentaire dans un but technologique (y compris organoleptique) à une étape quelconque de la fabrication, de la transformation, de la préparation, du traitement, du conditionnement, de l’emballage, du transport ou de l’entreposage de ladite denrée entraîne, ou peut, selon toute vraisemblance, entraîner (directement ou indirectement) son incorporation ou celle de ses dérivés dans cette denrée ou en affecter d’une autre façon les caractéristiques. Cette expression ne s’applique ni aux contaminants, ni aux substances ajoutées aux denrées alimentaires pour en préserver ou en améliorer les propriétés nutritionnelles.
L’additif selon l’invention sera utilisé dans des quantités déterminées par l’homme du métier selon les principes usuels en nutrition animale, et tenant compte des limites technologiques et des propriétés recherchées dudit additif.
A titre d’exemple, il est avantageux de donner de l’additif susmentionné aux porcs, dans leur alimentation ou leur eau de boisson, de sorte qu’ils ingèrent l’équivalent de 25 mL dudit additif (contenant environ 3.1011 spores par mL) par jour.
Les aliments envisagés sont des aliments solides en granulé, fourrage, poudre, semoulette avec lesquels ledit additif pourra être mélangé ou sur lesquels ledit additif pourra être pulvérisé. Ledit additif pourra également être ajouté à des aliments liquides, des aliments en soupe ou encore à des boissons, dont notamment de l’eau de boisson.
La spore pourra germer quand elle retrouvera des conditions favorables donc notamment lorsqu’elle ne sera plus dans sa solution de conservation, et notamment lorsque le propylène glycol sera à une concentration inférieure ou égale à 14% en volume par rapport au poids de l’additif mélangé dans un aliment ou dispersé sur un aliment, ou encore inférieure ou égale à 14% en volume par rapport au volume total d’une boisson dans laquelle est dilué ledit additif. Ces conditions seront notamment observées après ingestion de l’aliment, après mélange dans certains aliments humides comme des soupes, ou après dilution dans des boissons, notamment dans de l’eau de boisson.
Avantageusement, l’invention concerne l’additif susmentionné, où ledit propylène glycol représente de 15% à 40 % en volume par rapport au volume total de ladite composition liquide, notamment de 20 à 30% en volume par rapport au volume total de ladite composition liquide.
En d’autres termes, avantageusement l’invention concerne l’additif susmentionné, où ladite composition liquide est essentiellement constituée, ou est constituée :
- de 15% à 60% de propylène glycol, et
- de 40% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide et ou d’agent de germination.
Avantageusement l’invention concerne l’additif susmentionné, où ladite composition liquide est essentiellement constituée, ou est constituée :
- de 15% à 40% de propylène glycol, et
- de 60% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide et ou d’agent de germination.
Avantageusement l’invention concerne l’additif susmentionné, où ladite composition liquide est essentiellement constituée, ou est constituée :
- de 20% à 30% de propylène glycol, et
- de 70% à 80% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide et ou d’agent de germination.
Un autre aspect de l’invention concerne un additif tel que mentionné précédemment, pour une utilisation dans le cadre de la prophylaxie des infections virales, bactériennes et parasitaires des animaux d’élevage.
Les pathologies ou infections virales, bactériennes et parasitaires qui peuvent être prévenues par l’utilisation de l’additif selon l’invention sont les suivantes : les pathologies digestives notamment les diarrhées, les entérites, la salmonellose, la collibacilose, l’iléite ; les infections respiratoires et en particulier la rhinite, la pasteurellose, la bordetellose ; les infections cutanées et en particulier les ulcères, les épidermites, les nécroses ; et les infections au niveau du système locomoteur notamment les boiteries infectieuses, et les arthrites.
Par l’utilisation de l’additif, notamment associé à un ou plusieurs aliments, ou à une boisson, permet donc d’utiliser des spores de bactéries qui ont été conservées à long terme dans des conditions très simples, et dont l’efficacité sera la même ou très proche de l’efficacité de spores fraîches, c’est-à-dire obtenues dans un délai très courts (quelques heures à quelques jours) après la sporulation des bactéries.
Un tel additif est utilisable pour les animaux d’élevages notamment les oiseaux et les volailles, les bovins, les ovins, les porcins, les crustacés, les poissons et les mollusques ainsi que les animaux de compagnie, y compris les nouveaux animaux de compagnie.
Encore un autre aspect de l’invention concerne un produit liquide constitué essentiellement de, ou constitué de
- au moins une spore de bactérie, et
- une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de plus de 14% de propylène glycol, et
- moins de 86% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide,
ladite composition liquide étant notamment dépourvue d’agent biocide, ou dépourvue d’agent de germination, ou dépourvue d’agent biocide et d’agent de germination.
Le produit liquide selon l’invention comprend comme éléments essentiels, pour conférer ses propriétés de conservation des spores, au moins une spore et la composition liquide.
Le produit liquide peut en outre contenir des sels, des adjuvants, des surfactants ou tout autre composé visant à compléter le produit, mais ces composés n’ont aucun effet sur la conservation des spores.
Par contre comme mentionné ci-dessus, le produit liquide est dépourvu d’agents biocides, tels qu’ils ont été définis ci-dessus, ou encore d’agent de germination, tels qu’ils ont été définis ci-dessus.
Notamment, dans le cadre du produit liquide susmentionné, ladite composition liquide est constituée essentiellement de, ou constituée de
- de 15% à 60% de propylène glycol, et
- de 40% à 85% d’eau,
Notamment,
- de 15% à 40% de propylène glycol, et
- de 60% à 85% d’eau,
et en particulier,
- de 20% à 30% de propylène glycol, et
- de 70% à 80% d’eau.
L’invention sera détaillée dans les exemples qui suivent.
EXEMPLES
INGREDIENTS et CONCENTRATIONS TESTES pour tous les exemples présentés ci-après
Dans les exemples ci-après, les compositions testées seront nommées de F1 à F16 en fonction de l’ingrédient I utilisé et de sa concentration dans la composition finale : [Table 2]
Figure imgf000019_0001
Les compositions témoins seront nommées FO.
Les compositions réalisées à partir de l’ingrédient 11 seront nommées F1 , les compositions réalisées à partir de l’ingrédient I2 seront nommées F2, et ainsi de suite.
EXEMPLE 1 - STABILITE DES SPORES BACILLUS à 1 et 2 MOIS des compositions F1 à F16
I - PROBLEMATIQUE
L’objectif de cette analyse est d’évaluer la stabilité des spores de Bacillus subtilis et B. licheniformis conservées dans différentes compositions liquides, à température ambiante, pendant 1 et 2 mois de conservation.
II - MATERIEL ET METHODE
11.1 - Protocole
Composition témoin (FO) : Cette composition comprend
- 50% d’une suspension de spores bactériennes dans l’eau. Cette suspension de spores bactériennes comprend 20% en masse par rapport au volume total de solution, d’une poudre bactérienne. La poudre bactérienne est constituée de spores de Bacillus subtilis et de Bacillus licheniformis (ratio 1 : 1 ), concentrées à 3.2x1012 spores par kilogramme de poudre, et d’un support.
- eau jusqu’à 100%
Compositions testées (F1 à F16) : ces compositions correspondent à la composition témoin dans laquelle est ajouté l’un des ingrédients 11 à 116, où le volume d’eau est adapté jusqu’à 100%.
1- Distribuer 100 ml_ de chacune de ces compositions de F0 à F16 par pot, dans 3 pots de 180 ml_ de type collecteur d’échantillon droit avec bouchon à vis
2- Stocker les 51 pots à température ambiante (effectuer un suivi de la température de la pièce)
II.2 - Analyse
Observation macroscopique : A 1 mois et 2 mois de conservation, évaluer l’aspect de la formulation (couleur, dépôt, trouble, consistance, développement de moisissures...) et la remise en suspension (floculation...)
Analyse microbioloaiaue : à J0, uniquement pour le témoin F0 ; à 1 mois et 2 mois de conservation, pour tous les pots de F0 à F16.
Pour chaque point d’analyse, réaliser une énumération par dénombrement en macrométhode sur tous les pots. La macrométhode est un dénombrement sur des boîtes de culture de grande taille, en opposition à la microméthode, qui est un dénombrement en plaques avec puits :
Pour chaque pot, réaliser les dilutions en double avec une solution de peptone-sel jusqu’à la dilution 10-6 ; bien agiter minimum 10s au Vortex avant de prélever ; déposer 0.5mL de la dilution 10-6 dans 2 boîtes de Pétri (facteur de dilution = 2.106)
Le peptone-sel est un diluant isotonique pour une récupération optimale des microorganismes (ISO/DIS 6649), à base de peptone et de chlorure de sodium.
Couler environ 18mL de gélose PCA (Plate Count Agar) en surfusion à 46-50°C dans chaque boîte de Pétri
La gélose PCA est un milieu recommandé pour le dénombrement standardisé des bactéries dans l’eau.
Incuber 24h +/-6h à 37°C
Après incubation, compter les colonies sur chaque boîte
II.3 - Interprétation des résultats
Une diminution significative (>0.3log) du niveau de la population dans un pot par rapport au témoin à J0 devra être confirmée par une seconde énumération ; si ce résultat est confirmé, l’analyse est stoppée ; la formulation sera considérée comme instable à partir du précédent point.
Une augmentation significative (>0.3log) du niveau de la population dans un pot par rapport au témoin à JO devra être confirmée par une seconde énumération ; si ce résultat est confirmé, l’analyse est stoppée. Cela signifiera une croissance bactérienne (soit d’une contamination, soit d’une germination d’une spore) ; la formulation sera considérée comme instable.
Une évolution de l’aspect de la formulation (ex : développement de moisissures) ou une mauvaise remise en suspension des spores entraîne l’arrêt de l’analyse ; la formulation sera considérée comme instable.
III - RESULTATS
Les résultats sont compilés dans le tableau 3 suivant :
[Table 3]
Figure imgf000021_0001
"Tolérance : écart < +/-0,3log
Observations :
Les 5 formules F2, F3, F7, F8 et F9 ne présentent pas de diminution significative de la population bactérienne d’un point à l’autre.
Avec le vinaigre, on observe une tendance à l’augmentation de l’écart, ce qui pourrait laisser présager une certaine instabilité sur une plus longue période (ex. 1 an).
Pour le vinaigre, un léger retard de croissance est observé pour une petite partie des spores.
IV - CONCLUSIONS
Sur les 16 compositions testées, seules les compositions F2, F3, F7, F8 et F9 sont jugées stables après 1 mois et 2 mois de conservation à température ambiante.
Ainsi, seuls les ingrédients I2, I3, I7, I8 et I9 permettent de garantir une stabilité des spores de B. subtilis et licheniformis acceptables.
EXEMPLE 2 - ACTIVITE ANTI-GERMINATIVE DES SPORES des compositions F2, F3, F7, F8 et F9
I - PROBLEMATIQUE
L’objectif de cette analyse est d’évaluer l’activité anti-germinative de différentes compositions, après inoculation de Bacillus substilis et B. licheniformis, et incubation à 30°C dans un bouillon nutritif.
II - MATERIEL ET METHODE
11.1 - Protocole
Composition témoin (FO) : Cette composition comprend
- 50% d’un bouillon nutritif TSB concentré 2 fois
- 5% d’une suspension de spores bactériennes dans l’eau. Cette suspension de spores bactériennes comprend 2% en masse par rapport au volume total de solution, d’une poudre bactérienne. La poudre bactérienne est constituée de spores de Bacillus subtilis et de Bacillus licheniformis (ratio 1 :1 ), concentrées à 3.2x1012 spores par kilogramme de poudre, et d’un support.
- eau jusqu’à 100%.
Compositions testées (F2, F3, F7, F8 et F9) : ces compositions correspondent à la composition témoin dans laquelle est ajouté l’un des ingrédients I2, I3, I7, I8 et I9, où le volume d’eau est adapté jusqu’à 100%.
Le bouillon nutritif TSB ou tryptone-soja est un milieu hautement nutritif et d’usage général pour la culture des bactéries et des champignons. Ce milieu hautement nutritif permet la croissance de la plupart des germes. La présence dans la formule de tryptone et de peptone de soja permet un développement satisfaisant des germes exigeants sans addition de sérum ou autres éléments nutritifs.
Composition du bouillon nutritif TSB (en g/L):
[Table 4]
Figure imgf000022_0001
Distribuer 100 mL de chacune des compositions F0, F2, F3, F7, F8 et F9 par pot, dans 3 pots de 180 mL de type collecteur d’échantillon droit avec bouchon à vis
Incuber les 18 pots à 30°C
II.2 - Analyse
Observation macroscopique : idem exemple 1. Observations fréquentes de J1 à J30 pour chacun des pots F0, F2, F3, F7, F8 et F9.
Analyse microbioloqique :
o à J0 uniquement pour le pot témoin F0 ; o à J30, pour tous les pots FO, F2, F3, F7, F8 et F9 en cas d’absence d’apparition de trouble bactérien jusqu’à J30.
A JO, effectuer une énumération des pots témoins :
o Réaliser les dilutions en double jusqu’à la dilution 10-4 ; bien agiter mini 10s au Vortex avant de prélever ; déposer 0.5ml_ de la dilution 10-4 dans 2 boîtes de Pétri (facteur de dilution = 2.104)
o Couler environ 18ml_ de PCA en surfusion à 46-50°C dans chaque boîte de Pétri
o Pour énumérer les formes sporulées, insérer les tubes de dilution 10-4 10min dans un Bain-Marie à 80°C ;
o Déposer ensuite 0.5ml_ de la dilution 10-4 dans 2 boîtes de Pétri (facteur de dilution = 2.104)
o Couler environ 18ml_ de PCA en surfusion à 46-50°C dans chaque boîte de Pétri
o Incuber 24h +/-6h à 37°C
o Après incubation, compter les colonies sur chaque boîte.
En cas d’absence d’apparition de trouble bactérien jusqu’à J30, réaliser une énumération par dénombrement en macrométhode :
o Réaliser les dilutions en double jusqu’à la dilution 10-4 ; bien agiter minimum 10s au Vortex avant de prélever ; déposer 0.5ml_ de la dilution 104 dans 2 boîtes de Pétri (facteur de dilution = 2.104)
o Couler environ 18ml_ de PCA en surfusion à 46-50°C dans chaque boîte de Pétri
o Pour énumérer les formes sporulées. insérer les tubes de dilution 10-4 10min dans un Bain-Marie à 80°C ;
o Déposer ensuite 0.5ml_ de la dilution 10-4 dans 2 boîtes de Pétri (facteur de dilution = 2.104)
o Couler environ 18ml_ de PCA en surfusion à 46-50°C dans chaque boîte de Pétri
o Incuber 24h +/-6h à 37°C
o Après incubation, compter les colonies sur chaque boîte
II.3 - Interprétation des résultats
La formulation sera considérée comme anti-germinative en cas d’absence d’apparition de trouble bactérien et d’absence d’une augmentation significative (>0.3log) de la population de spores sur 30 jours.
III - RESULTATS
[Table 5]
Figure imgf000024_0001
*Tolérance : écart <+/-0,3log
FT : flore totale ; FS : flore sporulée
Observations :
Pour les compositions Vinaigre F7, F8 et F9, on observe un développement de bactéries naturellement présentes dans le vinaigre. Aucune analyse n’a donc été réalisée sur ces formules en ce qui concerne les écarts sur flore totale et flore sporulée par rapport à JO.
Pour les compositions PG F2 et F3, les écarts par rapport à JO sont non significatifs que ce soit pour la flore totale ou la flore sporulée.
IV - CONCLUSIONS
Sur les 5 compositions testées, seules les compositions F2, F3 ne présentent pas de biofilm et ont été analysées pour leur activité anti-germinatives à J30, activité qui a été jugée positive.
Ainsi, seuls les ingrédients 12, 13, à savoir le PG à 20% et 30%, permettent de garantir la non germination des spores de B. subtilis et licheniformis. EXEMPLE 3 - ACTIVITE BACTERIOSTATIQUE des compositions F2, F3, F7, F8 et F9
I - PROBLEMATIQUE
L’objectif de cette analyse est d’évaluer l’activité bactériostatique de différentes compositions, après inoculation d’un cocktail bactérien constitué des bactéries suivantes : une bactérie gram- à savoir : E.coli, une bactérie gram+ à savoir : Staphylococcus aureus, et une bactérie lactique à savoir : Lactococcus lactis, et incubation à 30°C dans un bouillon nutritif.
Il - MATERIEL ET METHODE
11.1 - Protocole
Composition témoin (FO) : 50% d’un bouillon nutritif TSB concentré 2 fois + 5% d’une solution de cocktail bactérien + eau jusqu’à 100%
Compositions testées (F2, F3, F7, F8 et F9) : 50% d’un bouillon nutritif TSB concentré 2 fois + 5% d’une solution de cocktail bactérien + l’un des ingrédients I2, I3, I7, I8 et I9, complété par de l’eau jusqu’à 100%
La solution de cocktail bactéries est préparé comme ci-après. Pour 100 mL de solution :
o Inoculer 5mL de bouillon TSB avec une souche d’E.coli ; 5mL de TSB avec une souche de Staphylococcus aureus et 5mL de TSB avec Lactococcus lactis
o Incuber une nuit à 37°C
o Ajouter 0.5mL de chaque culture dans 98.5mL de diluant de type peptone- sel
Distribuer 100 mL de chacune des compositions F0, F2, F3, F7, F8 et F9 par pot, dans 3 pots de 180 mL de type collecteur d’échantillon droit avec bouchon à vis
Incuber les 18 pots à 30°C
II.2 - Analyse
Observation macroscopique : idem exemple 1 ; observations fréquentes de J1 à J7 Analyse microbioloaiaue :
o à J0 pour le témoin F0 ;
o à J7, pour tous les pots F0, F2, F3, F7, F8 et F9 en cas d’absence d’apparition de trouble bactérien à J7.
A J0, effectuer une énumération des pots témoins :
■ Réaliser les dilutions en double jusqu’à la dilution 10-4 ; bien agiter mini 10s au Vortex avant de prélever ; déposer 1 mL de la dilution 10-4 dans 2 boîtes de Pétri (facteur de dilution = 1.104)
■ Couler environ 18mL de PCA en surfusion à 46-50°C dans chaque boîte de Pétri
■ Incuber 24h +/-6h à 37°C
■ Après incubation, compter les colonies sur chaque boîte
En cas d’absence d’apparition de trouble bactérien jusqu’à J7, réaliser une énumération par dénombrement en macrométhode : ■ Réaliser les dilutions en double jusqu’à la dilution 10-4 ; bien agiter mini 10s au Vortex avant de prélever ; déposer 1 ml_ de la dilution 10-4 dans 2 boîtes de Pétri (facteur de dilution = 1.104)
■ Couler environ 18ml_ de PCA en surfusion à 46-50°C dans chaque boîte de Pétri
■ Incuber 24h +/-4h à 37°C
■ Après incubation, compter les colonies sur chaque boîte
II.3 - Interprétation des résultats
La composition sera considérée comme bactériostatique a minima en cas d’absence d’apparition de trouble bactérien et d’absence d’une augmentation significative (>0.3log) de la population bactérienne sur 7 jours.
III - RESULTATS
[Table 6]
Figure imgf000026_0001
"Tolérance : augmentation <0,3 log
FT : flore totale
Isolement : étalement de 10pL de la solution sur la gélose de sang et observation de ce qui pousse par aspect des colonies.
Observations :
Pas de croissance observée mais une diminution significative des 3 populations bactériennes sur toutes les compositions testées
Pour les compositions Vinaigre F7, F8 et F9, on observe le développement d’un biofilm.
IV - CONCLUSIONS Sur les 5 compositions testées, seules les compositions F2, F3 ne présentent pas de biofilm et ont été analysées pour leur activité bactériostatiques à J7, activité qui a été jugée positive.
Ainsi, seuls les ingrédients I2, I3, à savoir le PG à 20% et 30%, permettent de garantir la non-prolifération de bactéries pathogènes ou non pathogènes.
EXEMPLE 4 - ACTIVITE FONGISTATIQUE des compositions F2, F3, F7, F8 et F9 I - PROBLEMATIQUE
L’objectif de cette analyse est d’évaluer l’activité fongistatique de différentes compositions, après inoculation de moisissures et incubation à 30°C dans un bouillon nutritif.
Il - MATERIEL ET METHODE
11.1 - Protocole
Composition témoin : 50% d’un bouillon nutritif TSB concentré 2 fois + 5% d’une solution mycélienne + eau
Compositions testées : Les compositions testées correspondent aux formules F2, F3, F7, F8 et F9 décrites précédemment + 50% d’un bouillon nutritif TSB concentré 2 fois + 5% d’une solution mycélienne + eau
La solution mycélienne est une culture de mycéliums de champignons microscopique de nature indéterminée préparée comme suit. Pour 100 mL :
o Inoculer 5mL de TSB pH5 avec une souche de mycélium. Ce mycélium est obtenu par prélèvement dans une préparation liquide à base de spores de Bacillus subtilis et Bacillus licheniformis (ratio 1 :1 ). Cette préparation liquide à base de spores de Bacillus est constituée d’un mélange de spores de Bacillus à une concentration de 3.3x1011 de spores par mL, d’acide citrique à 10%, et d’eau qsp, ladite préparation liquide étant naturellement contaminée par ledit mycélium
o Incuber 3 à 7 jours à 30°C
o Ajouter la culture dans 95mL d’eau ; agiter très fortement
Distribuer 100 mL de chacune des compositions F0, F2, F3, F7, F8 et F9 par pot, dans 3 pots de 180 mL de type collecteur d’échantillon droit avec bouchon à vis.
Incuber les 18 pots à 30°C
II.2 - Analyse
Observation macroscopique : Observations fréquentes de J1 à J30 sur tous les pots. Vérification si présence ou absence de développement mycélien. Analyse microbioloaiaue : Sur tous les pots FO, F2, F3, F7, F8 et F9 en cas d’absence d’apparition de développement mycélien jusqu’à J30, réaliser un étalement sur gélose PDA :
o Prélever et étaler 1 ml_ sur une gélose PDA
o Incuber 72h à 30°C
o Après incubation, observer la présence ou l’absence de développement mycélien
La gélose glucosée à l'extrait de pomme de terre (PDA) est milieu sélectif de levures et moisissures, prêt-à-liquéfier, utilisé pour les isolements, culture et dénombrement des levures et des moisissures dans les produits laitiers et les autres produits alimentaires notamment.
II.2 - Interprétation des résultats
La composition sera considérée comme fongistatique a minima en cas d’absence d’apparition de développement mycélien sur 30 jours.
III - RESULTATS
[Table 7]
Figure imgf000028_0001
IV - CONCLUSIONS
Sur les 5 compositions testées, seules les compositions F2, F3 ne présentent pas de biofilm et ont été analysées pour leur activité fongistatique à J30, activité qui a été jugée particulièrement satisfaisante.
Ainsi, seuls les ingrédients testés I2 et I3, à savoir le PG à 20% et 30%, permettent de garantir la non-prolifération de champignons pathogènes ou non pathogènes.
EXEMPLE 5 - ACTIVITE ANTI-GERMINATIVE DES SPORES des compositions F1, F2 et F17 à F20
I - PROBLEMATIQUE
L’objectif de cette analyse est d’évaluer l’activité anti-germinative de différentes compositions, après inoculation de Bacillus substilis et B. licheniformis, et incubation à 30°C dans un bouillon nutritif.
II - MATERIEL ET METHODE
11.1 - Protocole
Le même protocole que l’exemple 2 â été utilisé avec les ingrédients 11 , I2 et de 117 à I20 et les compositions testées F1 , F2 et de F17 à F20.
11.2 - Analyse
La même méthode d’analyse que l’exemple 2 a été utilisée avec une période d’observation réduite à 2, 5 ou 8 jours.
II.3 - Interprétation des résultats
La formulation sera considérée comme anti-germinative en cas d’absence d’apparition de trouble bactérien sur 2, 5 et 8 jours ou en cas d’absence d’une différence significative (>0.3log) entre la flore totale et la flore sporulée à J6.
III - RESULTATS
[Table 8]
Figure imgf000029_0001
"Tolérance : écart < 0,3log
FT : flore totale ; FS : flore sporulée
Observations : Pour les compositions F1 , F17 et F18, on observe un développement bactérien visible à l’œil nu. Aucun dénombrement n’a donc été réalisé sur ces formules.
Pour les compositions F2, F19 et F20, aucun trouble correspondant à un développement bactérien n’a été observé à l’œil nu. Des dénombrements ont donc été réalisés pour vérifier la stabilité des spores : aucun écart significatif n’a été observé entre la flore totale et la flore sporulée. Il n’y a donc pas de forme végétative dans les solutions analysées.
IV - CONCLUSIONS
Sur les 6 compositions testées, seules les compositions F2, F19 et F20 ne présentent pas de biofilm et ont été analysées pour leur activité anti-germinative à J6, activité qui a été jugée positive.
Ainsi, seuls les ingrédients I2, 119 et I20, à savoir le PG à 20%, 16% et 18%, permettent de garantir la non germination des spores de B. subtilis et B. licheniformis.
CONCLUSIONS GENERALES
Parmi toutes les solutions testées F1 à F16, seules les solutions F2, F3, F19 et F20 à 20%, 30%, 16% et 18%, respectivement, de PG satisfont tous les critères recherchés à savoir :
- compatibilité avec l’alimentation animale,
- stabilité des spores bactériennes,
- absence de germination des spores bactériennes,
- absence de développement de bactéries ou champignons pathogènes ou non pathogènes.
EXEMPLE 6 - STABILITE DES SPORES DE BACILLUS conservées dans des compositions comprenant différentes concentrations de propylène glycol
I - PROBLEMATIQUE
L’objectif de cette analyse est d’évaluer la stabilité des spores de Bacillus subtilis et B. licheniformis conservées dans différentes compositions liquides, à différentes concentrations en propylène glycol (PG), à température ambiante, jusqu’à 10 ou 15 mois de conservation.
II - MATERIEL ET METHODE
11.1 - Protocole
Compositions testées :
Les compositions PG10, PG20 et PG30 et une composition témoin F0 sont préparées comme décrit dans l’exemple 1 point 11.1.
Les autres compositions sont préparées comme suit : [Tableau 9]
Figure imgf000031_0001
Toutes ces compositions comprennent :
10% d’une suspension de spores bactériennes dans l’eau.
Cette suspension comprend 1 % en masse par rapport au volume total de solution, d’une poudre bactérienne. La poudre bactérienne est constituée de spores de Bacillus subtilis et de Bacillus licheniformis (ratio 1 : 1 ), concentrées à 3.2x1012 spores par kilogramme de poudre, et d’un support.
à laquelle est ajouté 0%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de propylène glycol, en volume par rapport au volume total de la composition testée,
et où le volume d’eau est adapté jusqu’à 100%.
Protocole :
1- Distribuer 100 mL de chacune de ces compositions par pot, dans 3 pots de 180 mL de type collecteur d’échantillon droit avec bouchon à vis.
2- Stocker tous les pots à température ambiante (effectuer un suivi régulier de la température de la pièce).
II.2 - Analyse et interprétation des résultats
Analyse microbioloqique : à T0, uniquement pour les compositions témoins F0 et PG0 ; à 1 , 2, 4, 5, 8, 10 et/ou 15 mois de conservation, pour les autres compositions.
Pour chaque point d’analyse, réaliser une énumération par dénombrement en macrométhode sur tous les pots :
Pour chaque pot pour les compositions PG10, PG20 et PG30, réaliser les dilutions en double avec une solution de peptone-sel jusqu’à la dilution 106 ; bien agiter minimum 10s au Vortex avant de prélever ; déposer 0.5mL de la dilution 106 dans 2 boîtes de Pétri (facteur de dilution = 2.106)
Pour chaque pot, pour toutes les autres compositions, réaliser les dilutions en double avec une solution de peptone-sel jusqu’à la dilution 10-4 ; bien agiter minimum 10s au Vortex avant de prélever ; déposer 0.5mL de la dilution 10-4 dans
2 boîtes de Pétri (facteur de dilution = 2.104).
Couler environ 18mL de gélose PCA (Plate Count Agar) en surfusion à 46- 50°C dans chaque boîte de Pétri.
Incuber 24h +/-6h à 37°C. Après incubation, compter les colonies sur chaque boîte.
Interprétation des résultats :
Une diminution significative (>0.3log) du niveau de la population dans au moins un pot par rapport au témoin correspondant (FO ou PGO) à T0 est confirmée par une seconde énumération ; si ce résultat est confirmé, l’analyse est stoppée ; la formulation est considérée comme instable à partir du précédent point.
III - RESULTATS
Le tableau 10 suivant présente, pour chaque composition, :
la moyenne, calculée sur les 3 échantillons, de l’évolution du niveau de la population bactérienne observée par rapport à T0, et exprimée en log ;
en italique, le nombre d’échantillons présentant une diminution significative (>0.3log) du niveau de la population par rapport au témoin à T0.
[Table 10]
Figure imgf000032_0001
"Tolérance : écart < +/-0,3log
/ : non testé
Observations :
On observe une diminution de la quantité de spores viables dans la solution à 90% de PG après 1 et 2 mois ; les concentrations restent dans la zone de tolérance (diminution <0,3log) pour les 3 échantillons.
Après 4 mois de conservation, la moyenne des écarts observés sur les échantillons de la composition à 90% de PG reste à la limite du seuil de tolérance. 2 des 3 échantillons PG90 présentent une diminution supérieure à la tolérance. La composition à 90% de PG est donc jugée instable à 4 mois de conservation.
Après 8 mois de conservation, la moyenne des écarts observés sur les échantillons de la composition à 80% de PG reste dans la zone de tolérance. 1 des 3 échantillons PG80 dépasse ce seuil de tolérance. Après 10 mois de conservation, les 3 échantillons de PG80 sortent de la zone de tolérance. La composition à 80% de PG est donc jugée instable à partir de 8 mois de conservation.
Après 10 mois de conservation,
la moyenne des écarts observés sur les échantillons de la composition à 70% de PG sort de la zone de tolérance. Le seuil de tolérance est dépassé pour 2 des 3 échantillons. La composition à 70% de PG est donc jugée instable à partir de 10 mois de conservation.
la moyenne des écarts observés sur les échantillons des compositions à 40%, 50% et 60% reste dans la zone de tolérance ainsi que chacun des écarts individuels observés sur les 3 échantillons pour chacune de ces compositions.
Ceci démontre la stabilité de ces compositions sur 10 mois.
Après 15 mois de conservation, la moyenne des écarts observés sur les échantillons des compositions à 20% et 30% de PG reste dans la zone de tolérance pour chacun des 3 échantillons de ces 2 compositions. Ceci démontre la stabilité de ces compositions sur 15 mois.
IV - CONCLUSIONS
Ces analyses de stabilité confirment la bonne stabilité des spores de Bacillus subtilis et licheniformis dans les solutions testées à 20% et 30% de PG, après 15 mois de conservation à température ambiante ; de même pour les solutions testées à 40%, 50% et 60% de PG après 10 mois de conservation à température ambiante.
Ces analyses démontrent l’instabilité des spores bactériennes dans les solutions testées à 70%, 80% et 90% de PG, respectivement dès 10, 8 et 4 mois. Ces solutions ne répondent donc pas aux besoins de stabilité dans le temps, à température ambiante, d’un produit industriel de conservation de bactéries sporulées.
L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de conservation de spore de bactérie, comprenant une étape de mise en contact d’au moins une spore de bactérie avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 60% de propylène glycol, et
- de 40% à de 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide,
ladite bactérie étant une bactérie sporulante choisie parmi les bactéries du genre Bacillus, du genre Clostridium ou du genre Sporosarcina.
2. Procédé selon la revendication 1 , où ledit propylène glycol représente de 15% à 40 % en volume par rapport au volume total de la composition liquide, notamment de 20 à 30% en volume par rapport au volume total de la composition liquide.
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, comprenant en outre une étape de maintien à température ambiante de ladite au moins une spore en contact avec ladite composition liquide.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant une étape de mise en contact d’au moins 101 spores à 1014 spores de bactéries par ml_ de composition, avec une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 60% de propylène glycol, et
-de 40% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide.
5. Utilisation d’une composition liquide pour la conservation à l’abri de contamination fongique et bactérienne, à température ambiante, d’au moins une spore de bactérie,
ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 60% de propylène glycol, et -de 40% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide,
ladite bactérie étant une bactérie sporulante choisie parmi les bactéries du genre Bacillus, du genre Clostridium ou du genre Sporosarcina.
6. Utilisation selon la revendication 5, pour la conservation d’au moins 101 spores à 1014 spores de bactéries par ml_ de composition.
Additif comprenant une composition liquide et au moins une spore de bactérie, notamment de 101 spores à 1014 spores par ml_ de ladite composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 60% de propylène glycol, et
- de 40% à 85% d’eau,
les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide,
ladite bactérie étant une bactérie sporulante choisie parmi les bactéries du genre Bacillus, du genre Clostridium ou du genre Sporosarcina.
8. Additif selon la revendication 7, où ledit propylène glycol représente de 15% à 40 % en volume par rapport au volume total de ladite composition, notamment de 20 à 30%.
9. Additif tel que défini dans la revendication 7 ou la revendication 8, pour une utilisation dans le cadre de la prophylaxie des infections virales, bactériennes et parasitaires des animaux d’élevage.
10. Additif selon la revendication 9, où lesdites infections virales, bactériennes et parasitaires sont responsables de pathologies digestives notamment les diarrhées, les entérites, la salmonellose, la collibacilose, l’iléite ; d’infections respiratoires et en particulier la rhinite, la pasteurellose, la bordetellose ; d’infections cutanées et en particulier les ulcères, les épidermites, les nécroses ; et d’infections au niveau du système locomoteur notamment les boiteries infectieuses, et les arthrites.
11. Produit liquide constitué essentiellement de, ou constitué de :
- une composition liquide, ladite composition liquide étant essentiellement constituée, ou étant constituée :
- de 15% à 60% de propylène glycol, et
-de 40% à 85% d’eau,
et
- au moins une spore de bactérie, notamment de 101 à 1014 spores par ml_ de composition liquide les pourcentages étant exprimés en volume par rapport au volume total de la composition liquide.
12. Produit liquide selon la revendication 11 , où ledit propylène glycol représente de 15% à 40 % en volume par rapport au volume total de ladite composition, notamment de 20 à 30%.
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