WO2020029946A1 - 一种木质纤维素生物质原料的水解发酵方法 - Google Patents

一种木质纤维素生物质原料的水解发酵方法 Download PDF

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cellulase
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邵雄俊
虞方磊
田良
黄永和
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Definitions

  • the invention relates to a method for hydrolytic fermentation of lignocellulosic biomass raw materials.
  • Plant-derived lignocellulosic biomass (such as crop straw) is a renewable resource. Straw is produced through bio-transformation technology to produce bio-based products. The CO 2 released during use can be absorbed by the photosynthesis of plants, forming a complete and environmentally friendly ecological cycle. With an annual output of 900 million tons of various crop straws in China, bio-based products such as liquid biofuels, feeds, fertilizers and other bio-based products are produced through biotransformation, with an annual usable value of several trillion yuan.
  • Lignocellulosic biomass such as straw is rich in carbohydrates such as cellulose and hemicellulose.
  • Cellulose and hemicellulose need to be hydrolyzed by cellulase and hemicellulase to monosaccharides such as glucose, xylose, and arabinose, so that they can be more easily digested and absorbed by animals, plants, and microorganisms or further converted into other products.
  • Cellulases and hemicellulases can be purchased from companies such as Novozymes, or they can be produced locally.
  • Cellulase and hemicellulase are generally produced by aerobic fermentation using Trichoderma reesei and Aspergillus niger, etc., which consumes a large amount of electricity and has a high production cost.
  • a technical problem to be solved by the present invention is to overcome the shortcomings of the prior art and provide a method for hydrolyzing lignocellulosic biomass raw materials with low production cost and high hydrolysis rate.
  • An object of the present invention is to provide a method for hydrolyzing and fermenting a lignocellulosic biomass material, including the following steps:
  • step (2) Add another part of the lignocellulosic biomass raw material to the fermentation liquid obtained in step (1), and add cellulase, hemicellulase, cellulase and / or hemicellulase-producing strains One or more of them are hydrolyzed or hydrolyzed to obtain a bio-based product.
  • the bacterial species are one or more of the cellulase-producing strains, or one or more of the cellulase-producing strains and the hemicellulase-producing strains. Mixed strains of one or more of the strains, so as to facilitate the decomposition of cellulose and hemicellulose.
  • the cellulase-producing strain is a combination of one or more strains of Clostridium and / or one or more of Caldicellulosiruptor Combination of two kinds of bacteria;
  • the self-producing hemicellulase-producing strain is a combination of one or more strains of Thermoanaerobacterium and / or Thermoanaerobacter Combinations of one or more species in) and / or combinations of one or more species in Geobacillus and / or one or more in Anoxybacillus A combination of species.
  • the strains are Clostridium clariflavum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium phytofermentans, Clostridium thermothermum, and Clostridium striaminisolvens, Caldicellulosiruptor bescii, Caldicellulosiruptor acetigenus, Caldicellulosiruptors accharolyticus, Christo pyrolytic fiber Caldicellulosiruptor kristjanssonii, Caldicellulosiruptorowensensis, Caldicellulosiruptor lactoaceticus, Thermoanaerobacterium thermothermophilic anaerobic bacteria, New Zealand aerobic anaerobic bacteria Thermoanaerobacterium aotearoense, Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum, Thermoanaerobacterium zeae, Thermoanaerobacterium xylan
  • step (1) the fermentation is performed under anaerobic conditions.
  • the fermentation is liquid submerged fermentation.
  • the fermentation is batch fermentation, fed-batch fermentation or continuous fermentation.
  • the temperature of the fermentation is 30-95 ° C, and the pH is 4.5-9.5.
  • the temperature of the fermentation is 40-85 ° C, and the pH is 5-8.5.
  • the temperature of the fermentation is 50 to 80 ° C, and the pH is 5.5 to 8.
  • the present invention makes fermentation easier to perform, and the fermentation broth is beneficial to the next reaction.
  • the fermentation time is from 1 to 5 days, and more preferably from 2 to 4 days, so that the components of the fermentation broth are favorable for the next reaction.
  • the feed mass ratio of the lignocellulosic biomass material and the strain is 1: 0.001 to 0.05, and more preferably 1: 0.005 to 0.02, so as to ensure the fermentation effect. At the same time, reduce costs.
  • the fermentation in step (1) is performed in the presence of water, and the feed mass ratio of the lignocellulosic biomass raw material to the water is 1: 6-20, and more preferably 1: 7-18 , More preferably 1: 7 to 15, and most preferably 1: 7 to 14.
  • step (1) is: after mixing the lignocellulosic biomass raw material with water, sterilizing, adding yeast extract, and inserting the strain, The fermentation is carried out.
  • the feed mass ratio of the lignocellulosic biomass raw material to the yeast extract is 10 to 500: 1, more preferably 10 to 200: 1, and more preferably It is 12 to 20: 1, and most preferably 13 to 16: 1.
  • the sterilization temperature is ⁇ 80 ° C. and the time is ⁇ 24 hours.
  • the sterilization temperature is 100 to 130 ° C, and the time is 0.25 to 10 hours.
  • the temperature of the hydrolysis and / or fermentation is 25-95 ° C, and the pH is 3-9.5.
  • the temperature of the hydrolysis and / or fermentation is 25-85 ° C, and the pH is 3.5-8.
  • the temperature of the hydrolysis and / or fermentation is 25-65 ° C, and the pH is 4-7.
  • the temperature of the hydrolysis and / or fermentation is 28-55 ° C, and the pH is 4.5-5.5.
  • the amount of the lignocellulosic biomass material added in step (2) is more than 50% of the amount of the lignocellulosic biomass material added in step (1).
  • the amount of the lignocellulosic biomass material added in step (2) is less than 40 times the amount of the lignocellulosic biomass material added in step (1).
  • the amount of the lignocellulosic biomass material added in step (2) is less than 8 times the amount of the lignocellulosic biomass material added in step (1).
  • the mass ratio of the lignocellulosic biomass material added in step (1) and the lignocellulosic biomass material added in step (2) is 1: 1 to 25, and more preferably 1 : 1.5-20, more preferably 1: 2-15, and most preferably 1: 3-15.
  • the mass ratio of the lignocellulosic biomass material added in step (1) and the lignocellulosic biomass material added in step (2) is 1: 1 to 5, and more preferably 1: 1.5 to 4, more preferably 1: 2 to 3.5, and most preferably 1: 3 to 3.5.
  • the present invention makes cellulose, hemicellulose, lignin and the like completely degraded, and the production cost is low.
  • the lignocellulosic biomass raw material added in step (2) and the cellulase, hemicellulase, self-produced cellulase and / or hemicellulose added in step (2) The mass ratio of one or more of the enzyme strains is 100-2000: 1, and more preferably 200-1000: 1; thereby reducing the cost while ensuring the effect of hydrolytic fermentation.
  • the lignocellulosic biomass raw material added in step (2) and the cellulosic raw material added in step (2) The mass ratio of cellulase and / or hemicellulase is 300-1000: 1, more preferably 300-600: 1, and most preferably 350-500: 1.
  • the time of the hydrolysis or hydrolysis fermentation is 1 to 5 days, and more preferably 2 to 4 days.
  • step (2) is: adding lignocellulosic biomass raw materials to the fermentation broth obtained in step (1), and adding cellulase and / or hemicellulase to perform hydrolysis or Hydrolysis fermentation produces bio-based products.
  • the method for hydrolyzing and fermenting a lignocellulosic biomass raw material includes the following steps:
  • the said strain is subjected to liquid deep fermentation at 50 to 80 ° C under anaerobic conditions for 2 to 4 days to obtain said fermentation broth; wherein said lignocellulosic biomass raw material and said water
  • the ratio of the input mass of the lignocellulosic biomass material is 1: 7-14, and the ratio of the input mass of the lignocellulosic biomass material and the yeast extract is 13-16: 1;
  • the feeding quality ratio of the strains is 1: 0.005 to 0.02; the strains are one or more of the strains producing cellulase or one of the strains producing cellulase. Or a mixed strain with one or more of the strains producing hemicellulases;
  • step (2) adding the lignocellulosic biomass raw material to the fermentation liquid obtained in step (1), adding the cellulase, hemicellulase, self-produced cellulase and / or hemicellulose
  • the step added in step (1) is controlled
  • the mass ratio of the lignocellulosic biomass material and the lignocellulosic biomass material added in step (2) is 1: 3 to 3.5; the lignocellulosic biomass material and the cellulase
  • the feeding mass ratio of one or more of the hemicellulase, the self-producing cellulase, and / or the hemicellulase-producing strain is 200-1000: 1.
  • the lignocellulosic biomass raw materials are pretreated or untreated lignocellulosic biomass raw materials, for example, various cellulose-rich industrial by-products, agricultural by-products, office waste, and Domestic waste, including but not limited to fruit residue, bagasse, chaff, peanut seedlings, bean hulls, bean husks, corn husks, melons, lees, starch residues, bean residues, cassava residues, xylose residues, xylitol residues , Furfural residue, furfuryl alcohol residue, oil cake meal, cottonseed meal, pasture, trees, weeds, corn stalks, wheat stalks, rice stalks, loquat stalks, bean stalks, cotton stalks, rape stalks, waste paper, paper mill waste, leftovers Rice, etc.
  • various cellulose-rich industrial by-products including but not limited to fruit residue, bagasse, chaff, peanut seedlings, bean hulls, bean husks, corn husk
  • the pretreated lignocellulosic biomass raw material may be an acid pretreated or an alkali pretreated lignocellulosic biomass raw material.
  • the method for acid pretreatment or alkali pretreatment is: mixing untreated lignocellulosic raw materials with water, adding acid or alkali, and treating at 50 to 220 ° C for 3min to 24h to obtain pretreated lignocellulosic fibers.
  • Biomass raw materials in which the acid is sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, acetic acid, maleic acid, etc., and the base is sodium hydroxide, calcium hydroxide / calcium oxide, ammonia, etc.
  • the amount of acid or alkali added and untreated The mass ratio of lignocellulosic biomass raw materials is 0.1-15: 100, and the mass ratio of water and untreated lignocellulosic biomass raw materials is 100: 5-50.
  • Another object of the present invention is to provide a bio-based product prepared by the hydrolysis or hydrolysis fermentation method.
  • the bio-based product prepared by the invention can be used for preparing various feeds and fertilizers, and has high nutritional value.
  • the present invention has the following advantages compared with the prior art:
  • the invention firstly ferments a part of the lignocellulosic biomass raw materials by using cellulase and hemicellulase secreted by the bacteria, and then uses cellulase, hemicellulase, self-produced cellulase and / or hemicellulose Enzyme strains hydrolyze or ferment more lignocellulosic biomass raw materials.
  • the cellulase and hemicellulose required by the method of the present invention are processed.
  • the amount of enzymes and the like is significantly reduced to effectively reduce costs (the cost of producing ethanol per ton is reduced by 1400-4300 yuan), and the cellulose hydrolysis rate of the method of the present invention is higher.
  • Enzymatic hydrolysis temperature is controlled at about 50 degrees Celsius. After 3 days of hydrolysis, the cellulose hydrolysis rate was measured to be 60%. The cost of the additional enzyme raw material in this embodiment was 271-813 yuan / ton corn cob xylose residue.
  • 450 g of water was added to 225 g of corn stalk, and then 22.5 g of sodium hydroxide was added, and treated at 100 ° C for 1 hour to obtain alkali pretreated corn stalk; the alkali pretreated corn stalk was added to the fermentation broth obtained by fermentation, and added 450 mg cellulase (Source: Enzyme Preparation Company, Azure Blue, Uter, etc., 100-300 RMB / kg protein), 113 mg hemicellulase (Source: Enzyme Preparation Company, Azure Blue, Uter, etc. , 100-300 yuan / kg protein) and an appropriate amount of water to a total weight of 2000 grams, adjust the pH to about 5.0, and perform enzymatic hydrolysis.
  • cellulase Source: Enzyme Preparation Company, Azure Blue, Uter, etc., 100-300 RMB / kg protein
  • 113 mg hemicellulase Source: Enzyme Preparation Company, Azure Blue, Uter, etc. , 100
  • Enzymatic hydrolysis temperature is controlled at 50 degrees Celsius. After 3 days of hydrolysis, the cellulose hydrolysis rate was 80% and the hemicellulose hydrolysis rate was 85%.
  • the cost of the additional enzyme raw material in this embodiment is RMB191-573 yuan / ton corn straw.

Abstract

一种木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，采用自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种将木质纤维素生物质原料进行发酵；向发酵液中加入木质纤维素生物质原料，并加入纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种，进行水解或水解发酵制得生物基产品。该方法首先利用菌种自身分泌的纤维素酶、半纤维素酶对一部分木质纤维素生物质原料进行水解发酵，再利用纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种对更多的木质纤维素生物质原料进行水解或水解发酵，相比现有技术，处理同样量的木质纤维素生物质原料，该方法所需的纤维素酶、半纤维素酶等的用量显著降低从而有效降低成本，并且纤维素水解率更高。

Description

一种木质纤维素生物质原料的水解发酵方法 技术领域
本发明涉及一种木质纤维素生物质原料的水解发酵方法。
背景技术
中国经济快速发展的同时带来了资源及能源短缺问题和严重的环境破坏，因此，绿色可再生资源及能源的开发和利用变得愈感迫切。植物光合作用合成的木质纤维素类生物质(如农作物秸秆)是可再生资源。秸秆经生物转化技术路线生产生物基产品，使用过程释放的CO 2能够被植物光合作用吸收，形成一个完整的、对环境友好的生态循环。中国年产各类农作物秸秆9亿吨，经生物转化制取液体生物燃料、饲料、肥料等生物基产品，每年可利用价值达几万亿人民币。
秸秆等木质纤维素生物质富含纤维素、半纤维素等碳水化合物。纤维素、半纤维素需要经过纤维素酶、半纤维素酶水解成葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等单糖，从而更容易被动物、植物及微生物消化吸收或进一步转化成其它产品。纤维素酶、半纤维素酶可以从诺维信等公司购买，也可以就地生产。纤维素酶、半纤维素酶一般用里氏木霉及黑曲霉等经好氧发酵生产，耗电量大，生产成本高。
此外，目前用纤维素酶、半纤维素酶对木质纤维素生物质原料进行水解时，纤维素酶、半纤维素酶的添加量大，由于纤维素酶、半纤维素酶的生产成本高或者是购买价格高，从而使得酶的成本占去了由木质纤维素生物质原料制取生物基产品的生产成本中的很大部分。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低且水解率高的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法。
为解决上述技术问题，本发明采取的一种技术方案如下：
本发明的一个目的是提供一种木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，包括如下步骤：
(1)采用自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种对一部分木质纤维素生物质原料进行发酵，得到发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入另一部分木质纤维素生物质原料，并加入纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或 多种，进行水解或水解发酵制得生物基产品。
优选地，所述的菌种为自产纤维素酶的菌种中的一种或多种，或者是自产纤维素酶的菌种中的一种或多种与自产半纤维素酶的菌种中的一种或多种的混合菌种，从而更利于纤维素和半纤维素的分解。
具体地，所述的自产纤维素酶的菌种为梭菌属(Clostridium)中的一种或多种菌种的组合和/或热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)中的一种或多种菌种的组合；所述的自产半纤维素酶的菌种为好热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)中的一种或多种菌种的组合和/或嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)中的一种或多种菌种的组合和/或地芽孢杆菌属(Geobacillus)中的一种或多种菌种的组合和/或厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)中的一种或多种菌种的组合。
更具体地，所述的菌种为克莱弗雷梭菌(Clostridium clariflavum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、植酵梭菌(Clostridium phytofermentans)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、斯特米尼斯梭菌(Clostridium straminisolvens)、贝斯其热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii)、产醋酸热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor acetigenus)、解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorsaccharolyticus)、克里斯托热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor kristjanssonii)、欧文湖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor owensensis)、产乳酸醋酸热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor lactoaceticus)、热硫化氢好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)、新西兰好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoense)、解多糖好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum)、玉米好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium zeae)、解木聚糖好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium xylanolyticum)、解糖好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)、热解糖好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、热硫化氢嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)、产乙醇嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、伪产乙醇嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)、美氏兰尼嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)、布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、热南极地芽孢杆菌(Geobacillus thermantarcticus)、嗜热脂肪 地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、热解木糖地芽孢杆菌(Geobacillus caldoxylosilyticus)、黄热厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus flavothermus)、勘察加厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus kamchatkensis)中的一种或多种的组合。
优选地，步骤(1)中，所述的发酵在厌氧条件下进行。
优选地，步骤(1)中，所述的发酵为液态深层发酵。
进一步优选地，步骤(1)中，所述的发酵为间歇发酵、流加发酵或连续发酵。
优选地，步骤(1)中，所述的发酵的温度为30～95℃，pH为4.5～9.5。
进一步优选地，步骤(1)中，所述的发酵的温度为40～85℃，pH为5～8.5。
更为优选地，步骤(1)中，所述的发酵的温度为50～80℃，pH为5.5～8。
本发明通过对发酵条件和发酵方法的优化，使得发酵更易于进行，且发酵液利于进行下一步反应。
优选地，步骤(1)中，所述的发酵的时间为1～5天，进一步优选为2～4天，从而使得发酵液的成分利于进行下一步反应。
优选地，步骤(1)中，所述的木质纤维素生物质原料与所述的菌种的投料质量比为1:0.001～0.05，进一步优选为1:0.005～0.02，从而在保证发酵效果的同时，降低成本。
优选地，步骤(1)中的发酵在水的存在下进行，所述的木质纤维素生物质原料与所述的水的投料质量比为1:6～20，进一步优选为1:7～18，更优选为1:7～15，最优选为1:7～14。
根据一个优选实施方式，步骤(1)的具体实施方式为：将所述的木质纤维素生物质原料与水混合后，进行灭菌，然后加入酵母提取物，并接入所述的菌种，进行所述的发酵。
根据该优选实施方式，步骤(1)中，所述的木质纤维素生物质原料与所述的酵母提取物的投料质量比为10～500:1，进一步优选为10～200:1，更优选为12～20:1，最优选为13～16:1。
根据该优选实施方式，步骤(1)中，所述的灭菌的温度≥80℃，时间≤24小时。
进一步优选地，步骤(1)中，所述的灭菌的温度为100～130℃，时间为0.25～10 小时。
优选地，步骤(2)中，所述的水解和/或发酵的温度为25～95℃，pH为3～9.5。
进一步优选地，步骤(2)中，所述的水解和/或发酵的温度为25～85℃，pH为3.5～8。
更优选地，步骤(2)中，所述的水解和/或发酵的温度为25～65℃，pH为4～7。
最优选地，步骤(2)中，所述的水解和/或发酵的温度为28～55℃，pH为4.5～5.5。
优选地，步骤(2)中加入的木质纤维素生物质原料的量多于步骤(1)中加入的木质纤维素生物质原料的量的50％。
优选地，步骤(2)中加入的木质纤维素生物质原料的量少于步骤(1)中加入的木质纤维素生物质原料的量的40倍。
进一步优选地，步骤(2)中加入的木质纤维素生物质原料的量少于步骤(1)中加入的木质纤维素生物质原料的量的8倍。
优选地，步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:1～25，进一步优选为1:1.5～20，更优选为1:2～15；最优选为1:3～15。
进一步优选地，步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:1～5，进一步优选为1:1.5～4，更优选为1:2～3.5；最优选为1:3～3.5。
本发明通过控制两步木质纤维素生物质原料的投料比，使得纤维素、半纤维素、木质素等降解完全，且生产成本低。
优选地，步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种的质量比100～2000:1，进一步优选为200～1000:1；从而在保证水解发酵效果的同时，使得成本降低。
当步骤(2)中加入的为所述的纤维素酶和/或半纤维素酶时，步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的纤维素酶和/或半纤维素酶的质量比300～1000:1，更优选为300～600:1，最优选为350～500:1。
优选地，步骤(2)中，所述的水解或水解发酵的时间为1～5天，进一步优选为2～4天。
根据一个优选实施方式，步骤(2)的具体实施方式为：向步骤(1)得到的发酵液中加入木质纤维素生物质原料，并加入纤维素酶和/或半纤维素酶，进行水解或水解发酵制得生物基产品。
根据一个具体且优选实施方式，所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法包括如下步骤：
(1)将所述的木质纤维素生物质原料与水混合后，调节pH为5.5～8，选择性地在100～130℃灭菌0.25～10小时，然后加入酵母提取物，并接入所述的菌种，在50～80℃下，在厌氧条件下，进行液态深层发酵2～4天，得到所述的发酵液；其中，所述的木质纤维素生物质原料与所述的水的投料质量比为1:7～14，所述的木质纤维素生物质原料与所述的酵母提取物的投料质量比为13～16:1；所述的木质纤维素生物质原料与所述的菌种的投料质量比为1:0.005～0.02；所述的菌种为自产纤维素酶的菌种中的一种或多种，或者是自产纤维素酶的菌种中的一种或多种与自产半纤维素酶的菌种中的一种或多种的混合菌种；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入所述的木质纤维素生物质原料，加入所述的纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种，并加入水，调节pH为4.5～5.5，在28～55℃下进行水解或水解发酵制得生物基产品；其中，控制步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料与步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:3～3.5；所述的木质纤维素生物质原料与所述的纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种的投料质量比为200～1000:1。
本发明中，所述的木质纤维素生物质原料为经过预处理或未经过预处理的木质纤维素生物质原料，例如，各种富含纤维素的工业副产物、农业副产物、办公垃圾和生活垃圾等，包括但不限于水果渣、甘蔗渣、谷壳、花生秧、豆壳、豆皮、玉米皮、瓜藤、酒糟、淀粉渣、豆渣、木薯渣、木糖渣、木糖醇渣、糠醛渣、糠醇渣、油饼粕、棉籽粕、牧草、树木、杂草、玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、茭白秆、豆秆、棉秆、油菜秆、废纸、造纸厂废料、剩菜饭等。
其中，经过预处理的木质纤维素生物质原料可以为经过酸预处理或碱预处理 的木质纤维素生物质原料。所述的酸预处理或碱预处理的方法为：将未经处理的木质纤维素原料与水混合，加入酸或碱，在50～220℃下处理3min～24h，得到经过预处理的木质纤维素生物质原料，其中，酸为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸、醋酸、马来酸等，碱为氢氧化钠、氢氧化钙/氧化钙、氨等，酸或碱的加入量与未经处理的木质纤维素生物质原料的质量比0.1-15:100，水与未经处理的木质纤维素生物质原料的质量比100:5-50。
本发明的另一个目的是提供一种由所述的水解或水解发酵方法制得的生物基产品。
本发明中制得的生物基产品可用于制备各种饲料、肥料，营养价值高。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明首先利用菌种自身分泌的纤维素酶、半纤维素酶对一部分木质纤维素生物质原料进行发酵，再利用纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种对更多的木质纤维素生物质原料进行水解或水解发酵，相比现有技术，处理同样量的木质纤维素生物质原料，本发明方法所需的纤维素酶、半纤维素酶等的用量显著降低从而有效降低成本(吨乙醇生产成本降低1400-4300元人民币)，并且，本发明方法的纤维素水解率更高。
具体实施方式
实施例1
取70克玉米芯木糖渣添加适量水至1000克总重，调节pH至约7.0，在121摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入5克酵母提取物，然后接入0.7克克莱弗雷梭菌(Clostridium clariflavum，DSM 19732)，温度控制在约60摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天。发酵得到的发酵液(含纤维素酶、半纤维素酶、乙醇、醋酸、乳酸、氨基酸等)中，加入225克玉米芯木糖渣、450毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水至1500克总重，调节pH为约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在约50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率80％，本实施例的外加酶原料成本为153-458元人民币/吨玉米芯木糖渣。
实施例2
取70克玉米芯木糖渣添加适量水至1000克总重，调节pH至约7.0，在121 摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入5克酵母提取物，然后接入0.35克克莱弗雷梭菌(Clostridium clariflavum，DSM 19732)和0.35克贝斯其热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii，DSM 6725)，温度控制在约63摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天。发酵得到的发酵液(含纤维素酶、半纤维素酶、乙醇、醋酸、乳酸、氨基酸等)中，加入225克玉米芯木糖渣、450毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水至1500克总重，调节pH约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在约50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率83％，本实施例的外加酶原料成本为153-458元人民币/吨玉米芯木糖渣。
实施例3
取70克玉米芯木糖渣添加适量水至1000克总重，调节pH至约6.8，在121摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入5克酵母提取物，然后接入0.35克克莱弗雷梭菌(Clostridium clariflavum，DSM 19732)和0.35克热解糖好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum,DSM 571)，温度控制在约55摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天。发酵得到的发酵液(含纤维素酶、半纤维素酶、乙醇、醋酸、乳酸、氨基酸等)中，加入225克玉米芯木糖渣、450毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水至1500克总重，调节pH约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在约50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率82％，本实施例的外加酶原料成本为153-458元人民币/吨玉米芯木糖渣。
对比例1
将295克玉米芯木糖渣、1475毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水混合至1500克总重，调节pH约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在约50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率80％，本实施例的外加酶原料成本为500-1500元人民币/吨玉米芯木糖渣。
对比例2
取70克玉米芯木糖渣添加适量水至1000克总重，调节pH至约5.0，在121摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入350毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)，控制温度在约50摄氏度进行酶水解3天，然后加入225克玉米芯木糖渣、450毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水至1500克总重，调节pH约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在约50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率60％，本实施例的外加酶原料成本为271-813元人民币/吨玉米芯木糖渣。
实施例4
取70克玉米芯木糖渣添加适量水至1000克总重，调节pH至约7.0，在121摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入5克酵母提取物，然后接入0.7克热纤梭菌(Clostridium thermocellum，DSM 1313)，温度控制在约60摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天。发酵得到的发酵液(含纤维素酶、半纤维素酶、乙醇、醋酸、乳酸、氨基酸等)中，加入225克玉米芯木糖渣、450毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水至1500克总重，调节pH为约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在约50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率80％，本实施例的外加酶原料成本为153-458元人民币/吨玉米芯木糖渣。
实施例5
取70克玉米芯木糖渣添加适量水至1000克总重，调节pH至约6.7，在121摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入5克酵母提取物，然后接入0.35克热纤梭菌(Clostridium thermocellum，DSM 1313)和0.35克解糖好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum，DSM 8691)，温度控制在约55摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天。发酵得到的发酵液(含纤维素酶、半纤维素酶、乙醇、醋酸、乳酸、氨基酸等)中，加入225克玉米芯木糖渣、450毫克 纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水至1500克总重，调节pH为约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率82％，本实施例的外加酶原料成本为153-458元人民币/吨玉米芯木糖渣。
实施例6
取70克玉米芯木糖渣添加适量水至1000克总重，调节pH至约7，在121摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入5克酵母提取物，然后接入0.35克热纤梭菌(Clostridium thermocellum，DSM 1313)和0.35克美氏兰尼嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii，DSM 11426)，温度控制在约60摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天。发酵得到的发酵液(含纤维素酶、半纤维素酶、乙醇、醋酸、乳酸、氨基酸等)中，加入225克玉米芯木糖渣、450毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水至1500克总重，调节pH为约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率82％，本实施例的外加酶原料成本为153-458元人民币/吨玉米芯木糖渣。
实施例7
取70克玉米芯木糖渣添加适量水至1000克总重，调节pH至约7，在121摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入5克酵母提取物，然后接入0.35克热纤梭菌(Clostridium thermocellum，DSM 1313)和0.35克产乙醇嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus，DSM 2246)，温度控制在约60摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天。发酵得到的发酵液(含纤维素酶、半纤维素酶、乙醇、醋酸、乳酸、氨基酸等)中，加入225克玉米芯木糖渣、450毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水至1500克总重，调节pH为约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率82％，本实施例的外加酶原料成本为153-458元人民币/吨玉米芯木糖渣。
实施例8
向70克玉米秸秆加入700克水，然后加入7克硫酸，在140℃下处理40min，得到酸预处理玉米秸秆；向酸预处理玉米秸秆中添加适量水至1000克总重，调节pH至约7，加入5克酵母提取物，然后接入0.7克热纤梭菌(Clostridium thermocellum，DSM 1313)，温度控制在约60摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天，发酵得到发酵液(含纤维素酶、半纤维素酶、乙醇、醋酸、乳酸、氨基酸等)。向225克玉米秸秆加入450克水，然后加入4.5克硫酸，在140℃下处理40min，得到酸预处理玉米秸秆；将该酸预处理玉米秸秆加入到发酵得到的发酵液中，并加入450毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水至2000克总重，调节pH为约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率80％，本实施例的外加酶原料成本为153-458元人民币/吨玉米秸秆。
实施例9
向70克玉米秸秆加入700克水，然后加入7克氢氧化钠，在100℃下处理1h，得到碱预处理玉米秸秆；向碱预处理玉米秸秆添加适量水至1000克总重，调节pH至约7，在121摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入5克酵母提取物，然后接入0.7克热纤梭菌(Clostridium thermocellum，DSM 1313)，温度控制在约60摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天，发酵得到发酵液(含纤维素酶、半纤维素酶、乙醇、醋酸、乳酸、氨基酸等)。向225克玉米秸秆加入450克水，然后加入22.5克氢氧化钠，在100℃下处理1h，得到碱预处理玉米秸秆；将该碱预处理玉米秸秆加入到发酵得到的发酵液中，并加入450毫克纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)、113毫克半纤维素酶(来源：酶制剂公司，蔚蓝生物、尤特尔等，100-300元人民币/公斤蛋白)及适量水至2000克总重，调节pH为约5.0，进行酶水解。酶水解温度控制在50摄氏度。水解3天后测得纤维素水解率80％、半纤维素水解率85％，本实施例的外加酶原料成本为191-573元人民币/吨玉米秸秆。
实施例10
取70克玉米芯木糖渣添加适量水至1000克总重，调节pH至约6.8，在121摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入5克酵母提取物，然后接入0.35克热纤梭菌(Clostridium thermocellum，DSM 1313)，温度控制在约55摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天。发酵得到的发酵液(含纤维素酶、半纤维素酶、乙醇、醋酸、乳酸、氨基酸等)中，加入225克玉米芯木糖渣及适量水至1500克总重，然后接入1.125克热解糖好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum,DSM 571)，温度控制在约55摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵3天，测得纤维素水解率85％。
对比例3
取295克玉米芯木糖渣添加适量水至1500克总重，调节pH至约7.0，在121摄氏度蒸煮1小时灭菌，灭菌后加入21克酵母提取物，然后接入2.95克热纤梭菌(Clostridium thermocellum，DSM 1313)，温度控制在约60摄氏度，厌氧条件下，液态深层发酵6天。发酵6天后测得纤维素水解率40％。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (27)

  1. 一种木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：
    (1)采用自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种对一部分木质纤维素生物质原料进行发酵，得到发酵液；
    (2)向步骤(1)得到的发酵液中加入另一部分木质纤维素生物质原料，并加入纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种，进行水解或水解发酵制得生物基产品。
  2. 根据权利要求1所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(2)中加入的木质纤维素生物质原料的质量多于步骤(1)中加入的木质纤维素生物质原料的质量的50％。
  3. 根据权利要求1所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(2)中加入的木质纤维素生物质原料的质量少于步骤(1)中加入的木质纤维素生物质原料的质量的40倍。
  4. 根据权利要求3所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(2)中加入的木质纤维素生物质原料的质量少于步骤(1)中加入的木质纤维素生物质原料的质量的8倍。
  5. 根据权利要求1所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:1～25。
  6. 根据权利要求5所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:1.5～20。
  7. 根据权利要求6所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:2～15。
  8. 根据权利要求7所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:3～15。
  9. 根据权利要求1所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:1～5。
  10. 根据权利要求9所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:1.5～4。
  11. 根据权利要求10所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:2～3.5。
  12. 根据权利要求11所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:3～3.5。
  13. 根据权利要求1所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的木质纤维素生物质原料与所述的菌种的投料质量比为1:0.001～0.05，所述的发酵为液态深层发酵、在厌氧条件下进行，控制发酵温度为30～95℃，pH为4.5～9.5，发酵时间为1～5天。
  14. 根据权利要求13所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的木质纤维素生物质原料与所述的菌种的投料质量比为1:0.005～0.02，控制发酵温度为50～80℃，pH为5.5～8，发酵时间为2～4天。
  15. 根据权利要求1所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的水解或水解发酵的温度为25～95℃，pH为3～9.5。
  16. 根据权利要求15所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的水解或水解发酵的温度为28～55℃，pH为4.5～5.5。
  17. 根据权利要求1所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种的质量比100～2000:1。
  18. 根据权利要求17所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的 所述的纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种的质量比200～1000:1。
  19. 根据权利要求17所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料和步骤(2)中加入的所述的纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种的质量比300～1000:1。
  20. 根据权利要求1所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：所述的菌种为自产纤维素酶的菌种中的一种或多种，或者是自产纤维素酶的菌种中的一种或多种与自产半纤维素酶的菌种中的一种或多种的混合菌种；所述的自产纤维素酶的菌种为梭菌属中的一种或多种菌种的组合和/或热解纤维素菌属中的一种或多种菌种的组合；所述的自产半纤维素酶的菌种为好热厌氧杆菌属中的一种或多种菌种的组合和/或嗜热厌氧杆菌属中的一种或多种菌种的组合和/或地芽孢杆菌属中的一种或多种菌种的组合和/或厌氧芽孢杆菌属中的一种或多种菌种的组合。
  21. 根据权利要求20所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：所述的菌种为克莱弗雷梭菌、解纤维梭菌、植酵梭菌、热纤梭菌、斯特米尼斯梭菌、贝斯其热解纤维素菌、产醋酸热解纤维素菌、解糖热解纤维素菌、克里斯托热解纤维素菌、欧文湖热解纤维素菌、产乳酸醋酸热解纤维素菌、热硫化氢好热厌氧杆菌、新西兰好热厌氧杆菌、解多糖好热厌氧杆菌、玉米好热厌氧杆菌、解木聚糖好热厌氧杆菌、解糖好热厌氧杆菌、热解糖好热厌氧杆菌、热硫化氢嗜热厌氧杆菌、产乙醇嗜热厌氧杆菌、伪产乙醇嗜热厌氧杆菌、美氏兰尼嗜热厌氧杆菌、布氏嗜热厌氧杆菌、热葡糖苷酶地芽孢杆菌、热南极地芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、热解木糖地芽孢杆菌、黄热厌氧芽孢杆菌、勘察加厌氧芽孢杆菌中的一种或多种的组合。
  22. 根据权利要求1所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：
    (1)将所述的木质纤维素生物质原料与水混合后，进行灭菌，然后加入酵母提取物，并接入所述的菌种，进行所述的发酵，得到所述的发酵液；
    (2)向步骤(1)得到的发酵液中加入所述的木质纤维素生物质原料，并加 入所述的纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种，进行水解或水解发酵制得生物基产品。
  23. 根据权利要求22所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的木质纤维素生物质原料与所述的水的投料质量比为1:6～20，所述的木质纤维素生物质原料与所述的酵母提取物的投料质量比为10～500:1。
  24. 根据权利要求22所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的灭菌的温度≥80℃，时间≤24小时。
  25. 根据权利要求22所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的水解或水解发酵的时间为1～5天。
  26. 根据权利要求1所述的木质纤维素生物质原料的水解发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：
    (1)将所述的木质纤维素生物质原料与水混合后，调节pH为5.5～8，选择性地在100～130℃灭菌0.25～10小时，然后加入酵母提取物，并接入所述的菌种，在50～80℃下，在厌氧条件下，进行液态深层发酵2～4天，得到所述的发酵液；其中，所述的木质纤维素生物质原料与所述的水的投料质量比为1:7～14，所述的木质纤维素生物质原料与所述的酵母提取物的投料质量比为13～16:1；所述的木质纤维素生物质原料与所述的菌种的投料质量比为1:0.005～0.02；所述的菌种为自产纤维素酶的菌种中的一种或多种，或者是自产纤维素酶的菌种中的一种或多种与自产半纤维素酶的菌种中的一种或多种的混合菌种；
    (2)向步骤(1)得到的发酵液中加入所述的木质纤维素生物质原料，加入所述的纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种，并加入水，调节pH为4.5～5.5，在28～55℃下进行水解或水解发酵制得生物基产品；其中，控制步骤(1)中加入的所述的木质纤维素生物质原料与步骤(2)中加入的所述的木质纤维素生物质原料的质量比为1:3～3.5；所述的木质纤维素生物质原料与所述的纤维素酶、半纤维素酶、自产纤维素酶和/或半纤维素酶的菌种中的一种或多种的投料质量比为200～1000:1。
  27. 一种由权利要求1至26中任一项所述的水解或水解发酵方法制得的生物基产品。
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