WO2020022696A1 - Sdf1 프로모터 영역을 이용한 피부 미백제 스크리닝 방법 - Google Patents

Sdf1 프로모터 영역을 이용한 피부 미백제 스크리닝 방법 Download PDF

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박태준
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Definitions

  • the present invention relates to a skin whitening screening method using a promoter region of stromal cell-derived factor 1 (SDF1).
  • SDF1 stromal cell-derived factor 1
  • Melanin pigment is a phenolic polymer that has a complex form of black pigment and protein, and acts as a sunscreen.
  • a person who lacks melanin pigment is very sensitive to sunlight and is easily burned.
  • short-wave UV and carcinogens form harmful free radicals in the skin, and melanin removes these free radicals and plays a useful role in protecting proteins and genes. Therefore, high levels of melanin means that it has an effective response system that can protect the skin from physical or chemical toxic substances.
  • Melanin is produced through a complex process from tyrosine by the action of tyrosinase present in pigment cells.
  • the produced melanin is delivered to the skin cells and exhibits a circulating action in which the melanin is lost and disappeared along with the epidermal detachment.
  • This melanogenesis process is a naturally occurring phenomenon, and overproduction of melanin does not occur in normal skin.
  • the skin responds to external stimuli such as ultraviolet rays, environmental pollution, or stress, it produces too much melanin and cannot be discharged out of the skin, but it is delivered to keratinocytes and accumulates in the skin epidermis, causing severe freckles and senile surpluses.
  • cosmetic problems it also promotes skin aging and causes skin cancer.
  • Pigmentation is known to occur a lot in aging melanoma, and there is increasing interest in factors that can control it in relation to skin aging or pigmentation.
  • An object of the present invention is to contact a test substance to a cell transfected with a recombinant expression vector comprising an SDF1 promoter region and a reporter gene, and to measure the activity of the reporter gene. To provide a method.
  • the present invention comprises the steps of contacting a test substance to a cell transfected with a recombinant expression vector comprising a stromal cell-derived factor 1 (SDF1) promoter region and a reporter gene; Measuring the activity of a reporter gene in a cell in contact with the test substance; And it provides a skin whitening screening method comprising the step of selecting a test substance with increased activity of the reporter gene compared to the control sample.
  • SDF1 stromal cell-derived factor 1
  • the present invention comprises the steps of contacting the test substance to hyperpigmented skin cells; Measuring the methylation level of the SDF1 promoter region in hyperpigmented skin cells in contact with the test substance; And selecting a test substance having a reduced methylation level of the SDF1 promoter region compared to a control sample.
  • the present invention comprises the steps of contacting a test substance to a cell transfected with a recombinant expression vector comprising a SDF1 promoter region and a reporter gene; Measuring the activity of a reporter gene in a cell in contact with the test substance; And selecting a test substance having increased activity of the reporter gene compared to a control sample.
  • the present invention comprises the steps of contacting the test substance to hyperpigmented skin cells; Measuring the methylation level of the SDF1 promoter region in hyperpigmented skin cells in contact with the test substance; And selecting a test substance having a reduced methylation level of the SDF1 promoter region compared to a control sample.
  • the present invention relates to a method for screening skin whitening agents using a stromal cell-derived factor 1 (SDF1) promoter region, wherein the correlation between skin pigmentation and SDF1 promoter expression can be observed. It is anticipated that the system will be available for prescreening deposits and pigment reducing agents. In addition, the drugs screened through the present invention can be used to treat skin pigment related diseases.
  • SDF1 stromal cell-derived factor 1
  • Figure 1 is a result of measuring the expression of SDF1 in fibroblasts
  • Figure 1A is a real-time PCR analysis results
  • Figure 1B is an ELISA
  • Figure 1C is an immunochemical staining analysis results.
  • Figure 2 shows the activity of the SDF1 promoter through the Luciferase assay by infecting fibroblasts, aging fibroblasts and plasmids inserted with the pGF-1 vector with the SDF1 promoter inserted into the fibroblasts irradiated with UVA J / cm 2 . .
  • Figure 3 is a result of analyzing the methylation in fibroblasts
  • Figure 3A is a result of analyzing the methylation in fibroblasts and aging-induced fibroblasts
  • Figure 3B is a result of analyzing the methylation in the surrounding tissues and black spots .
  • FIG. 4 was infected with a vector virus (GFP vector virus) inserted with the SDF1 promoter to select only infected fibroblasts to make cell lines.
  • GFP vector virus a vector virus inserted with the SDF1 promoter to select only infected fibroblasts to make cell lines.
  • FIG. 4A was a luciferase assay. It is a result of measuring the activity of GFP.
  • the present invention comprises the steps of contacting a test substance with a cell transfected with a recombinant expression vector comprising a stromal cell-derived factor 1 (SDF1) promoter region and a reporter gene; Measuring the activity of a reporter gene in a cell in contact with the test substance; And it provides a skin whitening screening method comprising the step of selecting a test substance with increased activity of the reporter gene compared to the control sample.
  • the cells may be fibroblasts, but are not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of contacting the test substance to hyperpigmented skin cells; Measuring the methylation level of the SDF1 promoter region in hyperpigmented skin cells in contact with the test substance; And selecting a test substance having a reduced methylation level of the SDF1 promoter region compared to a control sample.
  • the SDF1 promoter region may be a CpG island region of an SDF1 transcription start site (TSS), and the SDF1 promoter region may be represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto. no.
  • TSS SDF1 transcription start site
  • the present invention comprises the steps of contacting a test substance to a cell transfected with a recombinant expression vector comprising a SDF1 promoter region and a reporter gene; Measuring the activity of a reporter gene in a cell in contact with the test substance; And screening a test substance having increased activity of the reporter gene compared to a control sample.
  • the cells may be fibroblasts, but are not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of contacting the test substance to hyperpigmented skin cells; Measuring the methylation level of the SDF1 promoter region in hyperpigmented skin cells in contact with the test substance; And selecting a test substance having a reduced methylation level of the SDF1 promoter region compared to a control sample.
  • the skin pigmentation disease may be a pigment, freckles, black spots, birthmarks, pigmentation by drugs, pigmentation after inflammation and hyperpigmentation occurring in dermatitis, but is not limited thereto.
  • the SDF1 promoter region may be a CpG island region of an SDF1 transcription start site (TSS), and the SDF1 promoter region may be represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto. no.
  • TSS SDF1 transcription start site
  • SDF1 gene or protein encoded by the gene is NCBI accession no. AY802782, but is not limited thereto.
  • SDF1 of the present invention may also be named "C-X-C motif chemokine 12 (CXCL12)".
  • vector refers to a DNA molecule that replicates itself that is used to carry a clone gene (or another piece of clone DNA).
  • expression vector refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary for expressing the coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • the expression vector may preferably comprise one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by a chemical method, which corresponds to all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include antibiotic resistance genes such as Ampicillin, Kanamycin, Geneticin (G418), Bleomycin, Hygromycin, Chloramphenicol, and the like. It does not need to be, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • a reporter is a protein or reporter that emits light in vivo, and includes a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), or a red fluorescent protein (RFP). ) And the like, but may preferably be the green fluorescent protein (GFP) described in Examples of the present invention, but is not limited thereto.
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • test material refers to an unknown candidate substance used in screening to examine whether it affects the expression level of a gene or affects the expression or activity of a protein. do.
  • the sample includes, but is not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNAs, small interference RNAs (siRNAs), and natural extracts.
  • DMEM high glucose content
  • UVA-induced aging fibroblasts fibroblasts were washed with PBS and newly cultured with PBS, followed by irradiation with 5 J / cm 2 UVA (wavelength 320-400 nm, maximum peak 350 nm) to induce aging. It was. LZC-1 photoreactor system (Luzchem Research Inc. Ontario, Canada) was used. Sham-irradiated fibroblasts are placed in the irradiator box without UV irradiation. After irradiation, the fibroblasts are cultured for 7 days before the experiment.
  • Real-time PCR was performed with primers corresponding to SDF1 using 2 ⁇ l of the cDNA of each experimental group prepared as a template.
  • the SDF1 primers used were (forward) 5'- TGCCAGAGCCAACGTCAAG-3 'and (reverse) 5'- CAGCCGGGCTACAATCTGAA-3', and the control group was subjected to PCR for the 18s gene of each cell line.
  • PCR conditions were repeated 39 cycles of 3 minutes at 95 ° C, 10 seconds at 95 ° C, 30 seconds at 60 ° C, followed by 10 seconds at 95 ° C, 5 seconds at 65 ° C, and 5 seconds at 95 ° C for final elongation. Reacted.
  • the secretion amount of SDF1 in the culture medium in which the cells were cultured was performed using the SDF1 ELISA kit (R & D Systems, Minneapolis, MN) as instructed.
  • the cells were cultured and harvested in culture for 48 hours, and the value was measured by correcting the total number of cells based on the number of cells of 1 ⁇ 10 5 at the time of harvest.
  • Immunohistochemical staining was performed with 4- ⁇ m thick paraffin treated tissue fragments.
  • SDF1 MAB350, R & D System
  • SDF1 was diluted 1: 100 in an antibody diluent.
  • the SDF1 promoter GFP vector was constructed by inserting the SDF1 promoter gene into pGF1-vector to express the SDF1 promoter gene.
  • the virus production system of lentivirus was used to produce the virus into which the constructed vector was inserted.
  • PVSV-G SystemBiosciences, USA
  • encoding the required structural protein, pGF1 vector and pGag-pol into which the SDF1 promoter gene was inserted were co-transfected into the HEK-293TN cells by liposome method. After 6 hours, the culture medium containing the virus was harvested after 48 hours of exchange with fresh medium, and the harvested virus was used for fibroblasts infection. Infected fibroblasts were tested by selecting only cells infected with Puromycin.
  • the expression level was observed by performing a Luciferase assay, which is an experiment capable of confirming the level of GFP.
  • PCR was performed on gDNA (1ug) treated with bisulfate. PCR at 94 ° C., 3 min; 94 ° C., 30s, 52 ° C., 40s, 72 ° C., 30 s ⁇ 35; 72 ° C., 3 min.
  • Primers were constructed with the SDF1 CpG island promoters (-741 to -477; SEQ ID NO: 1). The sequence of the primers is (forward) 5'-GTTTGTGATTAGTTTATTTTATTA-3 'and (reverse) 5'-CTAAATAAAAACCAATAAAAAAC-3'. PCR products were placed in blunt TOPO vectors (MGmed, Seoul, Korea), and CpG island methylation was analyzed by sequencing genes extracted from 10 colonies and 5 colonies from tissues.
  • the cells were incubated in 12 well plates in 1 ⁇ 10 3 volumes, and after 24 hours, 1ug, 10ng and 100ng of EGF and 1ug and 10ug of retinoic acid were treated. 24 hours after drug treatment, GFP activity was measured by Luciferase assay.
  • the activity of the SDF1 promoter was decreased when TPA, a pigmentation substance, was treated, and the activity of the SDF1 promoter was increased when the retinoic acid, a pigment inhibitor, was treated.
  • the basic expression level of SDF1 was markedly low in aged fibroblasts and also markedly low in aging pigmented lesions (FIG. 1).

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Abstract

본 발명은 기질세포 유래 인자 1(stromal cell-derived factor 1; SDF1) 프로모터 영역을 이용한 피부 미백제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 피부의 색소발현량과 SDF1 프로모터 발현의 상관관계를 관찰할 수 있고, 이를 통하여 색소침착물질과 색소감소물질을 사전에 스크리닝하는 시스템에 이용 가능할 것으로 예상된다. 또한, 본 발명을 통해 스크리닝된 약물은 피부색소 관련 질환에 대한 치료에 사용될 수 있다.

Description

SDF1 프로모터 영역을 이용한 피부 미백제 스크리닝 방법
본 발명은 기질세포 유래 인자 1(stromal cell-derived factor 1; SDF1)의 프로모터 영역을 이용한 피부 미백제 스크리닝 방법에 대한 것이다.
사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴, 헤모글로빈의 양에 따라 결정되며, 그 중 멜라닌이 가장 결정적인 요소로 작용한다. 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서 자외선 차단 역할을 하여, 멜라닌 색소가 부족한 사람은 햇빛에 매우 민감하여 화상을 입기 쉬우며 어린 나이에도 피부암의 발생 확률이 높다. 반면, 단파장의 자외선 및 발암물질은 피부에서 유해한 자유라디칼을 형성하는데 멜라닌은 이러한 자유 라디칼 등을 제거하여 단백질과 유전자들을 보호해 주는 유용한 역할을 한다. 따라서 멜라닌의 양이 많다는 것은 물리적 또는 화학적 독성 물질로부터 피부를 보호할 수 있는 효과적인 대응 체계를 가지고 있다는 것을 의미한다.
멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나아제의 작용에 의해 티로신으로부터 복잡한 과정을 거쳐 생성된다. 이때 생성된 멜라닌은 피부 세포에 전달되고 표피 박리와 함께 멜라닌이 상실되어 소멸되는 순환 작용을 보인다. 이러한 멜라닌생성 과정은 자연적으로 일어나는 현상으로서, 정상 상태의 피부에서는 멜라닌의 과다 생성이 일어나지 않는다. 그러나 피부가 외부의 자극, 예를 들면 자외선, 환경오염 또는 스트레스 등에 반응하면 멜라닌이 과다 생성되어 피부 밖으로 배출되지 못하고 각질형성세포(keratinocyte)로 전달되어 피부 표피층에 축적되어 기미 주근깨 및 노인성 흑자 등 심각한 미용상의 문제를 일으킬 뿐만 아니라, 피부노화를 촉진하며 피부암을 유발하기도 한다. 노화성 흑색종에서 색소침착이 많이 일어나는 것으로 알려져 있는데, 피부 노화 또는 색소 침착과 관련하여 이를 조절할 수 있는 인자에 대한 관심이 높아지고 있다.
본 발명의 목적은 SDF1 프로모터 영역 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 세포에 시험물질을 접촉시켜, 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 피부 미백제 스크리닝 방법 또는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 시험물질을 접촉한 과색소침착 피부세포에서 SDF1 프로모터 영역의 메틸화(methylation) 수준을 측정하는 단계를 포함하는 피부 미백제 스크리닝 방법 또는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기질세포 유래 인자 1(stromal cell-derived factor 1; SDF1) 프로모터 영역 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 세포에서 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 리포터 유전자의 활성이 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 미백제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 과색소침착 피부세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 과색소침착 피부세포에서 SDF1 프로모터 영역의 메틸화(methylation) 수준을 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 SDF1 프로모터 영역의 메틸화 수준이 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 미백제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 SDF1 프로모터 영역 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 세포에서 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 리포터 유전자의 활성이 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 과색소침착 피부세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 과색소침착 피부세포에서 SDF1 프로모터 영역의 메틸화(methylation) 수준을 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 SDF1 프로모터 영역의 메틸화 수준이 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 기질세포 유래 인자 1(stromal cell-derived factor 1; SDF1) 프로모터 영역을 이용한 피부 미백제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 피부의 색소발현량과 SDF1 프로모터 발현의 상관관계를 관찰할 수 있고, 이를 통하여 색소침착물질과 색소감소물질을 사전에 스크리닝하는 시스템에 이용 가능할 것으로 예상된다. 또한, 본 발명을 통해 스크리닝된 약물은 피부색소 관련 질환에 대한 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 섬유아세포에서 SDF1의 발현을 측정한 결과로, 도 1A는 실시간 PCR 분석결과이며, 도 1B는 ELISA, 도 1C는 면역화학염색법의 분석 결과이다.
도 2는 섬유 아세포와 노화된 섬유 아세포 및 UVA J/cm2가 조사된 섬유아세포에 SDF1 프로모터가 삽입된 pGF-1 벡터를 삽입한 플라스미드를 감염시켜 SDF1 프로모터의 활성을 Luciferase assay를 통해 관찰한 것이다.
도 3은 섬유아세포에서 메틸화를 분석한 결과로, 도 3A는 섬유 아세포와 노화를 유도한 섬유아세포에서의 메틸화를 분석한 결과이고, 도 3B는 주변조직과 흑색점에서의 메틸화를 분석한 결과이다.
도 4는 SDF1 프로모터가 삽입된 벡터 바이러스(GFP 벡터 바이러스)를 감염시켜 감염된 섬유아세포만 선별하여 세포주를 만들었다. 이 세포주에 색소침착물질로 알려진 TPA와 색소억제물질인 레티노익산(Retinoic acid), 그리고 피부기능과 관련된 EGF 등을 각각 처리하였을 때의 SDF1 프로모터의 발현정도를 관찰한 결과로 도 4A는 Luciferase assay로 GFP의 활성 정도를 측정한 결과이다.
본 발명은 기질세포 유래 인자 1(stromal cell-derived factor 1; SDF1) 프로모터 영역 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 세포에서 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 리포터 유전자의 활성이 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 미백제 스크리닝 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포는 섬유아세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 과색소침착 피부세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 과색소침착 피부세포에서 SDF1 프로모터 영역의 메틸화(methylation) 수준을 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 SDF1 프로모터 영역의 메틸화 수준이 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 미백제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 SDF1 프로모터 영역은 SDF1 전사 개시 사이트(Transcription start site; TSS)의 CpG 섬(island) 영역일 수 있으며, 상기 SDF1 프로모터 영역은 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 SDF1 프로모터 영역 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 세포에서 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 리포터 유전자의 활성이 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포는 섬유아세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 과색소침착 피부세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 과색소침착 피부세포에서 SDF1 프로모터 영역의 메틸화(methylation) 수준을 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 SDF1 프로모터 영역의 메틸화 수준이 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 색소 침착 질환은 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소침착 및 피부염에서 발생하는 과색소 침착일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다
본 발명에 있어서, 상기 SDF1 프로모터 영역은 SDF1 전사 개시 사이트(Transcription start site; TSS)의 CpG 섬(island) 영역일 수 있으며, 상기 SDF1 프로모터 영역은 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 "SDF1 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질"은 NCBI accession no. AY802782 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "SDF1"은 "C-X-C motif chemokine 12 (CXCL12)"으로 명명될 수도 있다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명에 있어서, "리포터"는 생체 안에서 빛을 내는 단백질 또는 리포터로서, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein; YFP) 또는 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP) 등을 포함하며, 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 기재한 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFP)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 섬유아세포에서 노화를 유도하여 SDF1의 발현 측정
섬유아세포를 배양하는데에 있어서 DMEM (글루코오스 함량이 높은) 배양액에 FBS를 10% 첨가하여 배양을 진행한다. 섬유아세포의 배증시간은 대략 24시간이고, 이를 배증시간이 14일 정도 되도록 지속적으로 배양하여 증식 노화 섬유아세포를 만들었다.
UVA로 유도된 노화 섬유아세포의 경우, 섬유아세포를 PBS로 세척하고 새로 PBS로 배양액을 갈아준 후, 5 J/cm2 UVA (wavelength 320-400 nm, maximum peak 350 nm)로 조사하여 노화를 유도하였다. LZC-1 photoreactor system (Luzchem Research Inc. Ontario, Canada)을 사용하였다. Sham-irradiated 섬유아세포는 UV를 조사하지 않고 irradiator box에 둔다. 조사 후에 섬유아세포를 7일간 배양한 후 실험을 진행한다.
2. SDF1의 발현량 관찰
(1) 실시간 PCR(Real-time PCR)
RNeasy Mini Kit(Qiagen Inc., USA)를 이용하여 각각의 벡터 바이러스에 감염된 멜라닌 세포에서 RNA를 추출하고, 추출된 총 RNA 1㎍을 이용하여 Superscript Ⅲ 역전사 시스템(Invitrogen, USA)으로 cDNA를 제작하였다.
상기 제작된 각 실험군의 cDNA 2㎕을 주형으로 사용하여 SDF1에 해당하는 프라이머로 실시간 PCR(Real-time PCR)을 수행하였다.
사용된 SDF1 프라이머는 (정방향) 5'- TGCCAGAGCCAACGTCAAG - 3' 및 (역방향) 5'- CAGCCGGGCTACAATCTGAA -3' 이며, 대조군으로는 각 세포주의 18s 유전자에 대하여 PCR을 수행하였다.
PCR 조건은 95℃에서 3분, 95℃에서 10초, 60℃에서 30초간 반응하는 사이클을 39회 반복 실시한 후 최종 신장을 위해 95℃에서 10초, 65℃에서 5초, 95℃에서 5초간 반응시켰다.
(2) ELISA
세포를 배양한 배양액에서 SDF1의 분비량을 SDF1 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 설명서의 지시대로 진행하였다. 세포는 배양하여 48시간 동안 배양된 배양액을 수확하였고, 수확할 때에 세포의 총 개수를 1×105의 세포수를 기준으로 보정하여 값을 측정하였다.
(3) 면역화학염색
면역화학염색기법은 4-μm 두께의 파라핀 처리된 조직 단편으로 수행되었다. 일차 항체로는 SDF1 (MAB350, R&D System)을 항체 희석액에 1:100으로 희석하여 사용하였다.
3. SDF1 프로모터 GFP 바이러스 및 GFP 바이러스 준비
SDF1 프로모터 유전자를 발현시키기 위해 pGF1-vector에 SDF1 프로모터 유전자를 삽입하여 SDF1 프로모터 GFP 벡터를 구축하였다. 상기 구축된 벡터가 삽입된 바이러스를 생산하기 위해 렌티 바이러스(lentivirus)의 바이러스 생산 시스템을 사용하였다. 필요한 구조 단백질을 코딩하는 pVSV-G(SystemBiosciences, USA), 상기 SDF1 프로모터 유전자가 삽입된 pGF1 벡터 및 pGag-pol을 동시에 HEK-293TN 세포에 리포좀(Liposome) 방법으로 코-트랜스펙션(cotransfection)하고 6시간 후 새 배지로 교환하여 48시간 배양한 후 바이러스가 포함된 배지를 수확하였으며, 수확된 바이러스를 섬유아세포(fibroblasts) 감염에 사용하였다. 감염된 섬유아세포는 Puromycin에 의하여 감염이 된 세포만 선별하여 실험을 진행하였다.
상기 제작된 SDF1 프로모터의 발현 확인을 위해 GFP의 레벨을 확인할 수 있는 실험인 Luciferase assay를 진행하여 발현량을 관찰하였다.
그 결과, 도 2와 같이 SDF1 프로모터 유전자가 삽입된 벡터 바이러스에 감염된 섬유아세포 및 노화가 유도된 섬유아세포의 발현 양을 Luciferase assay 실험을 통해 관찰할 수 있다.
4. 노화 섬유아세포 및 노화색소 침착 조직에서 SDF1 프로모터의 메틸화 분석
중아황산염(bisulfate)를 처리한 gDNA (1ug)에 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃, 3 min; 94℃, 30s, 52℃, 40s, 72℃, 30 s × 35; 72℃, 3min으로 수행하였다. 프라이머는 SDF1 CpG 섬 프로모터(-741 내지 -477; 서열번호 1)로 제작되었다. 프라이머의 서열은 (정방향) 5′-GTTTGTGATTAGTTTATTTTATTA-3′과 (역방향) 5′-CTAAATAAAAACCAATAAAAAAC-3′이다. PCR 생산물은 blunt TOPO vectors (MGmed, Seoul, Korea) 에 넣었고, 세포에서는 10개, 조직에서 5개의 콜로니에서 추출한 유전자에서 시퀀싱을 통하여 CpG 섬 메틸화를 분석하였다.
5. SDF1 프로모터를 이용한 색소 조절물질 스크리닝
세포를 1×103 개의 양으로 12 well plates에 배양하였고, 24시간 뒤에 TPA 1ug, EGF 10ng과 100ng 그리고 레티노익산을 1ug과 10ug으로 각각 처리하였다. 약물의 처리 후 24시간 뒤에 Luciferase assay를 통하여 GFP의 활성을 측정하였다.
그 결과 색소침착물질인 TPA를 처리한 경우에서는 SDF1 프로모터의 활성이 감소하였고, 색소억제물질인 레티노익산을 처리한 경우에서는 SDF1 프로모터의 활성이 증가하였다.
< 실시예 >
SDF1의 기본적인 발현량은 노화된 섬유아세포에서 현저하게 낮고, 노화 색소침착 병변에서 또한 현저하게 낮은 발현량을 보였다(도 1).
SDF1 프로모터를 pGF1 vector에 삽입하여 제작한 바이러스를 감염시킨 섬유아세포에서 발현량을 Luciferase assay를 통하여 측정해보았을 때, 노화된 섬유아세포에서 활성도가 낮음을 관찰하였다(도 2).
SDF1 프로모터 메틸화가 노화된 섬유아세포에서 현저히 증가되어 있음을 관찰하였고, 노화성 색소침착병변에서도 역시 SDF1 프로모터의 메틸화가 증가되어 있는 것을 관찰하였다(도 3).
SDF1 프로모터를 pGF1 vector에 삽입하여 섬유아세포에 감염시켜 만든 세포주를 통하여 약물의 스크리닝을 진행하였을 때, 색소침착물질인 TPA를 처리한 경우에서는 발현량이 감소하고 레티노익산에 의해서는 발현량이 증가하는 것을 관찰하였다(도 4).
이러한 결과를 토대로 피부의 색소발현량과 SDF1 프로모터의 발현의 상관관계를 관찰할 수 있고, 이를 통하여 색소침착물질과 색소감소물질을 사전에 스크리닝하는 시스템에 이용이 가능할 것으로 보여진다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 기질세포 유래 인자 1(stromal cell-derived factor 1; SDF1) 프로모터 영역 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    상기 시험물질을 접촉한 세포에서 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및
    대조구 시료와 비교하여 상기 리포터 유전자의 활성이 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 미백제 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP) 유전자인 것을 특징으로 하는 피부 미백제 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 피부 미백제 스크리닝 방법.
  4. 과색소침착 피부세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    상기 시험물질을 접촉한 과색소침착 피부세포에서 SDF1 프로모터 영역의 메틸화(methylation) 수준을 측정하는 단계; 및
    대조구 시료와 비교하여 상기 SDF1 프로모터 영역의 메틸화 수준이 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 미백제 스크리닝 방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 SDF1 프로모터 영역은 SDF1 전사 개시 사이트(Transcription start site; TSS)의 CpG 섬(island) 영역인 것을 특징으로 하는 피부 미백제 스크리닝 방법.
  6. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 SDF1 프로모터 영역은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 피부 미백제 스크리닝 방법.
  7. SDF1 프로모터 영역 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    상기 시험물질을 접촉한 세포에서 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및
    대조구 시료와 비교하여 상기 리포터 유전자의 활성이 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법.
  8. 과색소침착 피부세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    상기 시험물질을 접촉한 과색소침착 피부세포에서 SDF1 프로모터 영역의 메틸화(methylation) 수준을 측정하는 단계; 및
    대조구 시료와 비교하여 상기 SDF1 프로모터 영역의 메틸화 수준이 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 SDF1 프로모터 영역은 SDF1 전사 개시 사이트(Transcription start site; TSS)의 CpG 섬(island) 영역인 것을 특징으로 하는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 SDF1 프로모터 영역은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법.
  11. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 피부 색소 침착 질환은 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소침착 및 피부염에서 발생하는 과색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부 색소 침착 질환 치료제 스크리닝 방법.
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